專利名稱：：基于eiav減毒活疫苗的氨基酸突變而構(gòu)建的抗hiv疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，并具體涉及衍生自人類免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiencyVirus,HIV)包膜蛋白的抗原性多肽、包含編碼所述多肽的多核苷酸的DNA構(gòu)建體和重組病毒載體、針對(duì)所述抗原性多肽的抗體、以及它們?cè)陬A(yù)防和治療HIV感染中的用途。
背景技術(shù)：
：HIV是誘發(fā)人獲得性免疫缺陷綜合征(Acquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS)即艾滋病的病原微生物。聯(lián)合國(guó)艾滋病規(guī)劃署2007年發(fā)布的最新報(bào)告顯示，目前全球共有3300多萬人感染了艾滋病病毒；去年新發(fā)感染艾滋病病毒人數(shù)約為250萬，平均每天增加6800多人。從地區(qū)上看，撒哈拉以南非洲地區(qū)和亞洲不發(fā)達(dá)國(guó)家仍是受艾滋病影響最大的地區(qū)。HIV病毒在分類學(xué)上屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)慢病毒屬(Lentivirus)。迄今為止，行為干預(yù)僅減緩傳播速度而無法終止其流行；高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法也只能延緩病情發(fā)展，改善癥狀，不能完全清除病毒。而且，高昂的治療性藥物的應(yīng)用對(duì)廣大發(fā)展中國(guó)家來說并不可行。只有開發(fā)出廉價(jià)的保護(hù)性疫苗才能從根本上控制和解決艾滋病的傳播。目前，正在研究的抗HIV疫苗有減毒活疫苗、滅活疫苗、DNA疫苗、活載體疫苗、亞單位疫苗和蛋白疫苗等等?？v觀艾滋病疫苗發(fā)展史，可將其分為四個(gè)階段第一階段(20世紀(jì)80年代)是艾滋病疫苗研發(fā)的起始階段，主要特點(diǎn)是以單一的蛋白亞單位疫苗為主，以誘導(dǎo)中和抗體為主要目標(biāo)，忽視了細(xì)胞免疫的作用。該類疫苗的研究在2003年2月26日美國(guó)VaxGen公司名為AIDSVAX的艾滋病疫苗在5000多人接種的三期臨床試驗(yàn)失敗后結(jié)束。第二階段P0世紀(jì)90年代)的特點(diǎn)是過于強(qiáng)調(diào)細(xì)胞免疫而忽視了中和抗體的作用，該階段的疫苗形式以重組病毒載體疫苗為主。該類疫苗的研究以Merk公司研發(fā)的僅含gag免疫原的腺病毒載體疫苗的lib試驗(yàn)于2007年10月宣告失敗而結(jié)束。第三階段(2000-2005年)的特點(diǎn)是注重疫苗誘導(dǎo)的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)的均衡，DNA疫苗、活載體疫苗、多價(jià)蛋白疫苗全面發(fā)展，強(qiáng)調(diào)各類疫苗聯(lián)合免疫，顯著加快了疫苗臨床試驗(yàn)的步伐。第四階段(2005年至今)總結(jié)了前三個(gè)階段的經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)，疫苗設(shè)計(jì)更加注重抗原改造，以誘導(dǎo)針對(duì)保守表位的具有廣譜中和活性的高滴度的可持續(xù)性的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。目前，該階段疫苗尚處于研發(fā)階段。HIV-1包膜蛋白是中和抗體的主要作用靶位，因此成為抗HIV疫苗中不可缺少的組分。但是，HIV-1野生型包膜蛋白的表達(dá)量低(AndreS,etal.IncreasedimmuneresponseelicitedbyDNAvaccinationwithasyntheticgpl20sequencewithoptimizedcodonusage.JVI1998;72:1497-1503;余雙慶等，HIV-1B亞型gpl20密碼子優(yōu)化前后免疫原性的比較，病毒學(xué)報(bào)2004;20(3):214-217;馮霞等，含密碼子優(yōu)化型HIV-1gpl20基因重組腺病毒的構(gòu)建及其免疫原性研究，中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志2004;18(2):113-117)。包膜蛋白上與病毒吸附和侵入有關(guān)的保守的受體及輔助受體結(jié)合位點(diǎn)被可變區(qū)和寡聚糖鏈所遮蔽(KwongPD，etal.StructureofanHIVgpl20envelopeglycoprpteinincomplexwiththeCD4receptorandaneutralizinghumanantobody.Nature1998，393:648-659);包膜蛋白構(gòu)象多態(tài)性所產(chǎn)生的空間位阻，阻礙了保守區(qū)的提呈和B細(xì)胞對(duì)該保守區(qū)的識(shí)別(KwongPD，etal.HIV-levadesantibody-mediatedneutralizationthroughconformationalmaskingofreceptor-bindingsites.Nature2002.420:678-682);逆轉(zhuǎn)錄酶無校讀活性且病毒復(fù)制周期短，在免疫壓力作用下短時(shí)間內(nèi)即能產(chǎn)生大量免疫逃逸株，逃避宿主的細(xì)胞及體液免疫(EvansDT,etal.Virus-specificcytotoxicT畫lymphocyteresponsesselectforamino-acidvariationinsimianimmunodeficiencyvirusEnvandNef.Nat.Med.1999.5:1270-1276;ParrenPW,etal.TheneutralizingantibodyresponsetoHIV畫l:viralevasionandescapefromhumoralimmunity.AIDS1999.13(SupplA):S137-162);病毒侵入細(xì)胞過程中，構(gòu)象處于動(dòng)態(tài)變化中，中和表位暴露不充分或暴露時(shí)間太短。這些原因都致使HIV-1天然包膜蛋白激發(fā)的體液免疫反應(yīng)很難具有針對(duì)同源毒株的可持續(xù)的中和活性，更難具有對(duì)不同亞型HIV-l毒株的交叉中和活性。因此，需要對(duì)HIV-l的包膜蛋白的抗原進(jìn)行優(yōu)化改造。由于HIV在自然界缺乏合適的動(dòng)物模型，人體也無法進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，人們轉(zhuǎn)而應(yīng)用與HIV同科同屬的其他六種動(dòng)物慢病毒作為可供借鑒的動(dòng)物模型來進(jìn)行相關(guān)的研究。其中，馬傳染性貧血病毒(EIAV)在分類上與HIV同科同屬，兩者具有相同的基因組結(jié)構(gòu)、復(fù)制方式、和相似的蛋白種類及功能。己經(jīng)發(fā)現(xiàn)HIV-l的VI、V2區(qū)與EIAV的V3、V4區(qū)之間存在一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系(HotzelI.Conservationofthehumanimmunodeficiencyvirustypelgpl20VI/V2stem/loopstructureintheequineinfectiousanemiavirus(EIAV)gp90.AIDSResHumRetroviruses,2003,19:923-924;和HuiguangLi，etal.AConservativeDomainSharedbyHIVgpl20andEIAVgp90:ImplicationsforHIVVaccineDesign.AIDSResHumRetroviruses,2005，21:1057-1059)。但是，由于兩種病毒的致病機(jī)制存在明顯差異，且與HIV疫苗不同的是，EIAV減毒活疫苗的研制過程主要是減毒而非提高免疫原性，而后者則是HIV疫苗研發(fā)中所需要的。因此，通過研究EIAV減毒活疫苗而為改造HIV包膜抗原提供指導(dǎo)這一研究方向一直不被看好。基于對(duì)EIAV的致病株和疫苗株的包膜蛋白的氨基酸序列分析，并基于EIAV減毒活疫苗的特征性氨基酸突變，本發(fā)明人采用結(jié)構(gòu)和功能位點(diǎn)對(duì)應(yīng)方法，對(duì)HIV-1包膜蛋白的相應(yīng)氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行了改造。出乎預(yù)料的是，經(jīng)改造的HIV-1包膜蛋白的抗原性多肽以及基于所述多肽構(gòu)建的疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度的、廣譜性的、持續(xù)性的抗HIV中和抗體。
發(fā)明內(nèi)容在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種衍生自HIV-1包膜蛋白的抗原性多肽或其片段，其中所述多肽或片段包含一氨基酸序列，所述氨基酸序列在相當(dāng)于SEQIDNO:l的如下位點(diǎn)上包含突變，所述突變選自由以下突變組成的組52位的亮氨酸殘基被谷氨酸殘基或天冬氨酸殘基取代；138位的絲氨酸殘基缺失；139位的天冬酰胺殘基被谷氨酰胺殘基取代；166位的精氨酸殘基被谷氨酸殘基或天冬氨酸殘基取代；184位的絲氨酸殘基被谷氨酸殘基或天冬氨酸殘基取代；185位的谷氨酸殘基被賴氨酸殘基、精氨酸殘基或組氨酸殘基取代；188位的絲氨酸殘基被谷氨酰胺殘基或天冬酰胺殘基取代；235位的甘氨酸殘基被精氨酸殘基、賴氨酸殘基或組氨酸殘基取代；237位的甘氨酸殘基被谷氨酰胺殘基或天冬酰胺殘基取代；240位的組氨酸殘基被酪氨酸殘基取代；和上述突變的任意組合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽或片段的氨基酸序列至少包含如上所述的相當(dāng)于SEQIDNO:l的52位的亮氨酸殘基被谷氨酸殘基或天冬氨酸殘基取代的突變。在一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽或片段的氨基酸序列至少包含如上所述的相當(dāng)于SEQIDNO:l的52位的亮氨酸殘基被谷氨酸殘基或天冬氨酸殘基取代、138位的絲氨酸殘基缺失、和139位的天冬酰胺殘基被谷氨酰胺殘基取代的突變。在另一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽或片段的氨基酸序列包含如上所述的相當(dāng)于SEQIDNO:l中的全部IO個(gè)位點(diǎn)的突變。可用于本發(fā)明的HIV-1包膜蛋白包括來源于各種HIV-1毒株的gpl20、gpl28、gpl40、gpl40TM、gpl45、gpl50、gpl60、及其等價(jià)物。例如，所述HIV-1包膜蛋白是HIV-lCN54的gpl45，其具有SEQIDNO:2的氨基酸序列。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種衍生自HIV-1包膜蛋白的抗原性多肽或其片段，其中所述多肽或片段包含通過在SEQIDNO:2中引入突變而衍生自SEQIDNO:2的氨基酸序列，所述突變選自由以下突變組成的組42位的亮氨酸殘基被谷氨酸殘基取代；128位的絲氨酸殘基缺失；129位的天冬酰胺殘基被谷氨酰胺殘基取代；155位的精氨酸殘基被谷氨酸殘基取代；179位的絲氨酸殘基被谷氨酸殘基取代；180位的谷氨酸殘基被賴氨酸殘基取代；183位的絲氨酸殘基被谷氨酰胺殘基取代；230位的甘氨酸殘基被精氨酸殘基取代；232位的甘氨酸殘基被谷氨酰胺殘基取代；235位的組氨酸殘基被酪氨酸殘基取代；和上述突變的任意組合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽或片段包含衍生自SEQIDNO:2的氨基酸序列，所述氨基酸序列至少包含所述42位的亮氨酸殘基被谷氨酸殘基取代的突變。在一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述衍生自SEQIDNO:2的氨基酸序列至少包含所述42位的亮氨酸殘基被谷氨酸殘基取代、128位的絲氨酸殘基缺失、和129位的天冬酰胺殘基被谷氨酰胺殘基取代的突變。在另一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述衍生自SEQIDNO:2的氨基酸序列包含如上所述的全部IO個(gè)位點(diǎn)的突變。本發(fā)明的抗原性多肽或其片段還可進(jìn)一步包括一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的取代、缺失或添加，且所述多肽或片段能夠誘導(dǎo)保護(hù)性的免疫應(yīng)答。此外，本發(fā)明的抗原性多肽或其片段，其還可包括進(jìn)一步的修飾，例如糖基化位點(diǎn)缺失或添加、環(huán)區(qū)刪除或重排、CFI區(qū)刪除、及其組合。在另一方面，本發(fā)明提供一種多肽疫苗，其包含如前所說的本發(fā)明的抗原性多肽或其片段和藥用可接受的佐劑和/或載體。在另一方面，本發(fā)明還提供一種抗體，其特異性結(jié)合如前所說的本發(fā)明的抗原性多肽或其片段，且所述抗體與HIV-1的野生型包膜蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體相比具有更廣譜和更高的HIV-1病毒中和活性。本發(fā)明的抗體包括多克隆抗體、單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。在另一方面，本發(fā)明提供一種分離的多核苷酸，其包含編碼如前所說的本發(fā)明的抗原性多肽或其片段的核苷酸序列。本發(fā)明還提供一種DNA構(gòu)建體，其包含可操作地連接于啟動(dòng)子的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼如前所說的本發(fā)明的抗原性多肽或其片段的核苷酸序列。本發(fā)明也提供包含上述DNA構(gòu)建體和藥用可接受的佐劑的DNA疫苗。本發(fā)明還提供一種重組病毒載體疫苗，其包含攜帶一種多核苷酸的重組病毒載體和藥用可接受的佐劑，所述多核苷酸包含編碼如前所說的本發(fā)明的抗原性多肽或其片段的核苷酸序列。優(yōu)選地，所述重組病毒載體是復(fù)制型病毒載體，例如復(fù)制型重組痘苗載體，如復(fù)制型重組天壇株痘苗。此外，本發(fā)明還提供一種重組細(xì)菌載體疫苗，其包含攜帶一種多核苷酸的重組細(xì)菌載體和藥用可接受的佐劑，所述多核苷酸包含編碼如前所說的本發(fā)明的抗原性多肽或其片段的核苷酸序列。在其他方面，本發(fā)明還提供一種預(yù)防或治療HIV-1病毒感染的方法，其包括給有需要的個(gè)體施用本發(fā)明的多肽疫苗和/或DNA疫苗和/或重組病毒載體疫苗和/或重組細(xì)菌載體疫苗，或者給有需要的個(gè)體施用本發(fā)明的抗體。圖l:7個(gè)DNA疫苗酶切鑒定結(jié)果泳道1為pDRVISV145MlR酶切結(jié)果；泳道2為pDRVISV145M2R酶切結(jié)果；泳道3為pDRVISV145M3R酶切結(jié)果；泳道4為pDRVISV145M4R酶切結(jié)果；泳道5為pDRVISV145M5R酶切結(jié)果；泳道6為pDRVISV1452M酶切結(jié)果；泳道7為pDRVISV1455M酶切結(jié)果；如圖所示各個(gè)疫苗載體基因大小為5Kb，插入的目的基因大小為2.1Kb。圖2:7個(gè)DNA疫苗PCR鑒定圖泳道1為pDRVISV145MlRPCR產(chǎn)物；泳道2為pDRVISV145M2PCR產(chǎn)物；泳道3為pDRVISV145M3RPCR產(chǎn)物；泳道4為pDRVISV145M4RPCR產(chǎn)物；泳道5為pDRVISV145M5RPCR產(chǎn)物；泳道6為pDRVISV1452MPCR產(chǎn)物；泳道7為pDRVISV1455MPCR產(chǎn)物；如圖所示各插入目的基因大小為2.1Kb。圖3:各DNA疫苗免疫印跡鑒定圖泳道1為pDRVISV145MlR表達(dá)結(jié)果；泳道2為pDRVISV145M2R表達(dá)結(jié)果；泳道3為pDRVISV145M3R表達(dá)結(jié)果；泳道4為pDRVISV145M4R表達(dá)結(jié)果；泳道5為pDRVISV145M5R表達(dá)結(jié)果；泳道6為pDRVISV1452M表達(dá)結(jié)果；泳道7為陰性對(duì)照；泳道8為pDRVISV1455M表達(dá)結(jié)果。如圖所示各插入目的基因均可正確表達(dá)。圖4:重組痘苗載體PCR鑒定圖-泳道1為rTV145PCR結(jié)果；泳道2為rTV1455MPCR結(jié)果。如圖所示各插入目的基因?yàn)?.1Kb，大小正確。圖5:重組痘苗載體表達(dá)產(chǎn)物的免疫印跡鑒定圖泳道l為雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物，作為陰性對(duì)照；泳道2為野生型天壇株痘苗在CEF細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果，作為陰性對(duì)照；泳道3為rTV145在CEF細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果；泳道4為rTV1455M在CEF細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果；如圖所示目的基因表達(dá)產(chǎn)物大小為145KD，說明插入的目的基因可正確表達(dá)。圖6:ELISA法檢測(cè)特異性結(jié)合抗體滴度抗原1455M激發(fā)的平均特異性結(jié)合抗體滴度遠(yuǎn)高于由未改造的gpM5抗原激發(fā)的平均結(jié)合抗體滴度；其抗體滴度提高了3.5倍多(p=0.0020)(*表示p值小于0.05，統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在顯著差異；*女表示p值小于0.005，統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在極顯著差異)。1452M誘導(dǎo)的平均特異性結(jié)合抗體滴度可到2400，最高滴度可達(dá)9600，顯著高于未改造的gp145(p=0.0177)。145M1R誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)強(qiáng)度同樣顯著高于gpl45(p=0.0177)。圖7:第14周采集豚鼠血清1:10稀釋度下中和抗體檢測(cè)gpl45免疫組誘導(dǎo)的抗體表現(xiàn)出有限的中和活性，大約有1/4的豚鼠表現(xiàn)出可中和所有8個(gè)臨床分離株的能力；而1455M免疫組則可使至少3/4的豚鼠表現(xiàn)出對(duì)所有分離株的中和活性。圖8:第16周采集豚鼠血清1:10稀釋度下中和抗體檢測(cè)gpl45免疫組誘導(dǎo)的抗體譜變窄，有一半的B，亞型的病毒不被中和；而1455M免疫組血清仍然有3/4的豚鼠表現(xiàn)出對(duì)所有分離株的中和活性。圖9:第14周采集豚鼠血清中和抗體滴度檢測(cè)gpl45免疫組僅有少數(shù)豚鼠血清在1:10稀釋度下有中和活性;而1455M免疫組絕大多數(shù)豚鼠具有中和活性且滴度高于1:10。圖10:第16周采集豚鼠血清中和抗體滴度檢測(cè)1455M免疫組絕大多數(shù)豚鼠血清可完全中和所有的病毒，而且最高滴度高達(dá)1:270;而gpl45免疫組豚鼠血清僅有少數(shù)抗體滴度超過1:10。具體實(shí)施方案本發(fā)明人基于EIAV減毒活疫苗的特征性氨基酸突變，采用結(jié)構(gòu)和功能位點(diǎn)對(duì)應(yīng)方法，對(duì)HIV-1包膜蛋白的相應(yīng)氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行了改造。EIAV在分類上與HIV同禾斗同屬，兩者具有相同的基因組結(jié)構(gòu)、復(fù)制方式、和相似的蛋白種類及功能。因此，研究EIAV減毒活疫苗有可能為改造HIV包膜抗原提供指導(dǎo)。但兩種病毒在致病機(jī)制等方面也存在著明顯差異。同時(shí)，EIAV減毒活疫苗的研制過程主要是減毒而非免疫原性提高的過程。因此，這條改造途徑一直不被HIV疫苗研發(fā)界人士看好。中國(guó)研制的EIAV減毒活疫苗是世界上迄今為止唯一成功大規(guī)模應(yīng)用的慢病毒疫苗。自1979年以來在全國(guó)應(yīng)用，共免疫馬屬動(dòng)物6000多萬匹，控制了該病的流行。同時(shí)，在安全性方面，該疫苗經(jīng)受住了數(shù)十年的大規(guī)?，F(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用的考驗(yàn)。EIAV疫苗是由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所于上世紀(jì)七十年代研制出的減毒活疫苗，該疫苗是用傳統(tǒng)的方法研制成功的，現(xiàn)簡(jiǎn)單地介紹其研制過程及傳代過程中各毒株的命名野毒株為遼寧省一匹感染馬分離到的，稱馬傳貧遼毒株(LN)，遼毒株先在驢體內(nèi)經(jīng)100代傳代得到驢強(qiáng)毒(D510)，驢強(qiáng)毒隨后在驢白細(xì)胞上經(jīng)121代傳代后，得到減毒活疫苗株(稱為驢白細(xì)胞毒，DLV)，最后在驢胎皮膚細(xì)胞上適應(yīng)傳代10代得到驢胎皮膚細(xì)胞弱毒疫苗株(FDDV)(中國(guó)專利號(hào)CN99105852.6和CN99127532.2，美國(guó)專利號(hào)US6987020B1)。本發(fā)明人通過對(duì)EIAV減毒活疫苗(DLV(SEQIDNO:5)、FDDV(SEQIDNO:6))和致病毒株(LN(SEQIDNO:3)、D510(SEQIDNO:4))的包膜蛋白進(jìn)行全長(zhǎng)測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了EIAV減毒活疫苗包膜蛋白上存在10個(gè)特征性氨基酸突變位點(diǎn)，如表1所示。表1:EIAV減毒活疫苗包膜蛋白上存在的10個(gè)特征性氨基酸突變及位點(diǎn)EIAV包膜蛋白中的氨基酸編號(hào)469799102188189192235236320EIAV致病毒株的氨基酸殘基AGK(H)HKESDNKEIAV減毒活疫苗株的氨基酸殘基ERQYEKN-KN(E)-表示該氨基酸殘基缺失根據(jù)氨基酸一級(jí)序列、環(huán)區(qū)結(jié)構(gòu)排列、二硫鍵的構(gòu)成、保守性的氨基酸結(jié)構(gòu)、己知的功能性位點(diǎn)及糖基化位點(diǎn)的數(shù)目、排布等，本發(fā)明人基于EIAV減毒活疫苗的特征性氨基酸突變對(duì)HIV-1包膜蛋白進(jìn)行了改造，具體如表2所示。表2:EIAV包膜蛋白的特征性突變和改造后的HIV包膜蛋白的突變及位點(diǎn)EIAV包膜蛋白突變位點(diǎn)所處結(jié)構(gòu)域HIV包膜蛋白突變位點(diǎn)(3)所處結(jié)構(gòu)域致病毒株減毒活疫苗株改造前改造后"SHKAEMAE50"SH麵EMAE50(1)CI區(qū)"GATTTLFCA45"GATTTIFCA45CI區(qū)235sdnntw24ci235s||ntw240(2)V4區(qū)125ssnsndty132'25SSN適dty132vi區(qū)317TNIKRPDY3243,7tni|rpdy324V5區(qū)152TVVRDRK158'"TVVgDRK158V2區(qū)188LKENSSN194V3區(qū)'78YSENSSE184178YEKNSOE184V2區(qū)94WYEGQKHSHYI10494wyeHq1hsmyi104VI區(qū)227IFNGTGPCHNV237227IFNgTQPCXNV237C2區(qū)1:粗體和下劃線標(biāo)出的位點(diǎn)為突變位點(diǎn)；2:-表示該氨基酸殘基缺失；3:HIV包膜蛋白的氨基酸位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的是HIV-1CN54的gpl45的氨基酸序歹U(SEQIDNO:2)的位點(diǎn)。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種衍生自HIV-1包膜蛋白的抗原性多肽或其片段，其中所述多肽或片段包含一氨基酸序列，所述氨基酸序列在相當(dāng)于SEQIDNO:l的如下位點(diǎn)上包含突變，所述突變選自由以下突變組成的組52位(位于C1區(qū))的亮氨酸殘基被酸性氨基酸谷氨酸殘基或天冬氨酸殘基取代；138位(位于V1區(qū))的絲氨酸殘基缺失；139位(位于V1區(qū))的天冬酰胺殘基被谷氨酰胺殘基取代；166位(位于V2區(qū))的精氨酸殘基被谷氨酸殘基或天冬氨酸殘基取代；184位(位于V2區(qū))的絲氨酸殘基被谷氨酸殘基或天冬氨酸殘基取代；185位(位于V2區(qū))的谷氨酸殘基被賴氨酸殘基或精氨酸殘基或組氨酸殘基取代；188位(位于V2區(qū))的絲氨酸殘基被谷氨酰胺殘基或天冬酰胺殘基取代；235位(位于C2區(qū))的甘氨酸殘基被精氨酸殘基或賴氨酸殘基或組氨酸殘基取代；237位(位于C2區(qū))的甘氨酸殘基被谷氨酰胺殘基或天冬酰胺殘基取代；240位(位于C2區(qū))的組氨酸殘基被酪氨酸殘基取代；以及上述突變的任意組合。本文中所述的"多肽"一詞也包括蛋白質(zhì)。本文中所述的"多肽的片段"指的是所述多肽的具有免疫原性和/或抗原性的片段。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽或片段的氨基酸序列至少包含如上所述的相當(dāng)于SEQIDNO:l的52位的亮氨酸殘基被谷氨酸殘基或天冬氨酸殘基取代的突變。在一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽或片段的氨基酸序列至少包含如上所述的相當(dāng)于SEQIDNO:l的52位的亮氨酸殘基被谷氨酸殘基或天冬氨酸殘基取代、138位的絲氨酸殘基缺失、和139位的天冬酰胺殘基被谷氨酰胺殘基取代的突變。在另一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽或片段的氨基酸序列包含如上所述的相當(dāng)于SEQIDNO:l中的全部IO個(gè)位點(diǎn)的突變。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的多^:或片段的氨基酸序列在相當(dāng)于SEQIDNO:l的如下位點(diǎn)上包含突變，所述突變選自由以下突變組成的組52位的亮氨酸殘基被谷氨酸殘基或天冬氨酸殘基取代、138位的絲氨酸殘基缺失、139位的天冬酰胺殘基被谷氨酰胺殘基取代、166位的精氨酸殘基被谷氨酸殘基或天冬氨酸殘基取代、184位的絲氨酸殘基被谷氨酸殘基或天冬氨酸殘基取代、185位的谷氨酸殘基被賴氨酸殘基、精氨酸殘基或組氨酸殘基取代、188位的絲氨酸殘基被谷氨酰胺殘基或天冬酰胺殘基取代、和上述突變的任意組合；并任選地包含235位的甘氨酸殘基被精氨酸殘基、賴氨酸殘基或組氨酸殘基取代、237位的甘氨酸殘基被谷氨酰胺殘基或天冬酰胺殘基取代、240位的組氨酸殘基被酪氨酸殘基取代、或其組合。上述突變的位點(diǎn)是參照HIV-1國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株HXB2(GenBankAccessionNumberK03455)的gpl60的氨基酸序列(SEQIDNO:l)而定義的。本領(lǐng)域人員能夠理解，對(duì)于其他HIV-1病毒株的包膜蛋白，可通過將其與SEQIDNO:l進(jìn)行序列比對(duì)而確定在哪些位點(diǎn)引入相應(yīng)的突變。例如，通過以HIV-1國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株HXB2的gpl60的氨基酸序列作為參照序列，可確定在不同的HIV-1毒株的包膜蛋白gpl60中引入上述氨基酸突變的位點(diǎn)，由此對(duì)其加以改造?？捎糜诒景l(fā)明的所述包膜蛋白包括常見的gpl20、gpl28、gpl40、gpl40TM、gpl45、gpl50、gpl60、及其等價(jià)物(BimalK.etal.ModificationsoftheHumanImmunodeficiencyVirusEnvelopeGlycoproteinEnhanceImmunogenicityforGeneticImmunizationJOURNALOFVIROLOGY,June2002,p.5357-5368)。本領(lǐng)域人員能夠理解，對(duì)于上述不同形式的HIV-1包膜蛋白，也可采用類似的方式在其中引入上述氨基酸突變。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明所使用的包膜蛋白是HIV-1CN54包膜蛋白gpl45(GenbankAccessionNumberAX149771),其具有如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。因此，本發(fā)明提供一種衍生自HIV-1包膜蛋白的抗原性多肽或其片段，其中所述多肽或片段包含通過在SEQIDNO:2中引入突變而衍生自SEQIDNO:2的氨基酸序列，所述突變選自由以下突變組成的組42位(位于CI區(qū)的亮氨酸殘基被谷氨酸殘基取代；128位(位于VI區(qū))的絲氨酸殘基缺失；129位(位于VI區(qū))的天冬酰胺殘基被谷氨酰胺殘基取代；155位(位于V2區(qū))的精氨酸殘基被谷氨酸殘基取代；179位(位于V2區(qū))的絲氨酸殘基被谷氨酸殘基取代；180位(位于V2區(qū))的谷氨酸殘基被賴氨酸殘基取代；183位(位于V2區(qū))的絲氨酸殘基被谷氨酰胺殘基取代；230位(位于C2區(qū))的甘氨酸殘基被精氨酸殘基取代；232位(位于C2區(qū))的甘氨酸殘基被谷氨酰胺殘基取代；235位(位于C2區(qū))的組氨酸殘基被酪氨酸殘基取代；以及上述突變的任意組合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽或片段包含衍生自SEQIDNO:2的氨基酸序列，所述氨基酸序列至少包含所述42位的亮氨酸殘基被谷氨酸殘基取代的突變。在一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述衍生自SEQIDNO:2的氨基酸序列至少包含所述42位的亮氨酸殘基被谷氨酸殘基取代、128位的絲氨酸殘基缺失、和129位的天冬酰胺殘基被谷氨酰胺殘基取代的突變。在另一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述衍生自SEQIDNO:2的氨基酸序列包含如上所述的全部10個(gè)位點(diǎn)的突變。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽或片段包含通過在SEQIDNO:2中引入突變而衍生自SEQIDNO:2的氨基酸序列，所述突變選自由以下突變組成的組42位的亮氨酸殘基被谷氨酸殘基取代、128位的絲氨酸殘基缺失、129位的天冬酰胺殘基被谷氨酰胺殘基取代、155位的精氨酸殘基被谷氨酸殘基取代、179位的絲氨酸殘基被谷氨酸殘基取代、180位的谷氨酸殘基被賴氨酸殘基取代、183位的絲氨酸殘基被谷氨酰胺殘基取代、和上述突變的任意組合；并任選地包含230位的甘氨酸殘基被精氨酸殘基取代、232位的甘氨酸殘基被谷氨酰胺殘基取代、235位的組氨酸殘基被酪氨酸殘基取代、或其組合。可采用本領(lǐng)域人員已知的任何合適的方法制備本發(fā)明的衍生自HIV-1包膜蛋白的抗原性多肽或其片段。例如，在確定了意欲引入的突變位點(diǎn)和氨基酸殘基后，可利用重疊延伸PCR(genesplicingbyoverlapextensionPCR，簡(jiǎn)稱SOEPCR)(LiCH，etal.2004.Constructionofmiddlefragmentdeletionmutantwithimprovedgenesplicingbyoverlapextension;HeckmanKL，etal.2007.GenesplicingandmutagenesisbyPCR-drivenoverlapextension.)的方法在HIV-1包膜蛋白(例如CNMgpl45)的編碼序列的相應(yīng)位點(diǎn)引入所需的突變。重疊延伸PCR技術(shù)由于采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸，將不同的擴(kuò)增片段重疊拼接起來，從而得到編碼本發(fā)明的抗原性多肽或其片段多核苷酸。同樣，可以采用其它引入突變的方法來進(jìn)行相應(yīng)位點(diǎn)的改造，這些方法包括但不限于基因合成、基因重組、基因重排等。因此，本發(fā)明也提供分離的多核苷酸，其包含編碼上述本發(fā)明的抗原性多肽或其片段的核苷酸序列。在獲得了編碼本發(fā)明的衍生自HIV-1包膜蛋白的抗原性多肽或其片段的多核苷酸之后，可將其插入至合適的表達(dá)載體中，并轉(zhuǎn)染至合適的宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，最后回收得到本發(fā)明的抗原性多肽或其片段?？捎糜诒景l(fā)明制備本發(fā)明的多肽或其片段的表達(dá)系統(tǒng)包括但不限于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，如Condon菌株、Gold菌株；酵母表達(dá)系統(tǒng)；昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)；噬菌體展示表達(dá)系統(tǒng)；哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，如CHO細(xì)胞、Vero細(xì)胞。本領(lǐng)域人員能夠理解，可以通過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的取代、缺失或添加，例如保守性氨基酸的取代，而對(duì)本發(fā)明的抗原性多肽或其片段做進(jìn)一步的修飾，條件是修飾后的多肽或片段仍具有如上所述的氨基酸突變，并仍可誘導(dǎo)保護(hù)性的免疫應(yīng)答。此外，除了引入個(gè)別的氨基酸突變以外，還可對(duì)本發(fā)明的衍生自HIV-1包膜蛋白的抗原性多肽或其片段做進(jìn)一步的修飾，這些修飾包括但不限于，糖基化缺失或添加、環(huán)區(qū)刪除或重排、CFI區(qū)刪除(thecleavagesitesequence,thefUsiondomain,andapartofthespacerbetweenthetwoheptadrepeats)等。在另一方面，本發(fā)明提供一種多肽疫苗，其包含上述本發(fā)明的抗原性多肽或其片段和藥用可接受的佐劑。合適的佐劑包括但不限于不完全福氏佐劑、鋁佐劑、卡介苗(BCG)、油基乳劑(如MF59和MontanidelSA720)、免疫刺激劑(如單磷酰脂A)、CpG寡核苷酸、皂角苷(如QS21)、以及基于細(xì)菌外毒素的粘膜佐劑等。包含本發(fā)明的抗原性多肽或其片段的疫苗的形式可以是例如多肽疫苗、脂肽疫苗、二聚體或多聚體疫苗等形式。在另一方面，本發(fā)明還提供一種DNA構(gòu)建體，其包含可操作地連接于啟動(dòng)子的編碼上述本發(fā)明的抗原性多肽或其片段的多核苷酸。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供基于HIV-1CN54的gpl45的氨基酸序列(SEQIDNO:2)而構(gòu)建的編碼衍生自fflV-1包膜蛋白的抗原性多肽的DNA構(gòu)建體。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供如下DNA構(gòu)建體質(zhì)粒pDRVISV145MlR，其攜帶編碼42位的亮氨酸殘基被谷氨酸殘基取代的SEQIDNO:2的氨基酸序列的多核苷酸，其所編碼的抗原性多肽稱為"145M1R"，含有該質(zhì)粒的大腸埃希氏菌(Esc/ren'c;K'flco/f)于2008年5月22日保藏于CGMCC(中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，中國(guó)北京，朝陽區(qū)大屯路)，保藏號(hào)為CGMCCNo.2508;質(zhì)粒pDRVISV145M2R，其攜帶編碼128位的絲氨酸殘基缺失和129位的天冬酰胺殘基被谷氨酰胺殘基取代的SEQIDNO.2的氨基酸序列的多核苷酸，其所編碼的抗原性多肽稱為"145M2R"，含有該質(zhì)粒的大腸埃希氏菌于2008年5月22日保藏于CGMCC，保藏號(hào)為CGMCCNo.2509;質(zhì)粒pDRVISV145M3R，其攜帶編碼155位的精氨酸殘基被谷氨酸殘基取代的SEQEDNO:2的氨基酸序列的多核苷酸，其所編碼的抗原性多肽稱為"145M3R"，含有該質(zhì)粒的大腸埃希氏菌于2008年5月22日保藏于CGMCC，保藏號(hào)為CGMCCNo.2510;質(zhì)粒pDRVISV145M4R，其攜帶編碼179位的絲氨酸殘基被谷氨酸殘基取代、180位的谷氨酸殘基被賴氨酸殘基取代和183位的絲氨酸殘基被谷氨酰胺殘基取代的SEQIDNO:2的氨基酸序列的多核苷酸，其所編碼的抗原性多肽稱為"145M4R",含有該質(zhì)粒的大腸埃希氏菌于2008年5月22日保藏于CGMCC，保藏號(hào)為CGMCCNo.2511;質(zhì)粒pDRVISV145M5R，其攜帶編碼230位的甘氨酸殘基被精氨酸殘基取代、232位的甘氨酸殘基被谷氨酰胺殘基取代和235位的組氨酸殘基被酪氨酸殘基取代的SEQIDNO:2的氨基酸序列的多核苷酸，其所編碼的抗原性多肽稱為"145M5R",含有該質(zhì)粒的大腸埃希氏菌于2008年5月22日保藏于CGMCC，保藏號(hào)為CGMCCNo.2512;質(zhì)粒pDRVISV1452M，其攜帶編碼42位的亮氨酸殘基被谷氨酸殘基取代、128位的絲氨酸殘基缺失和129位的天冬酰胺殘基被谷氨酰胺殘基取代的SEQEDNO:2的氨基酸序列的多核苷酸，其所編碼的抗原性多肽稱為"1452M"，含有該質(zhì)粒的大腸埃希氏菌于2008年5月22日保藏于CGMCC，保藏號(hào)為CGMCCNo.2513;和質(zhì)粒pDRVISV1455M，其攜帶的多核苷酸編碼含有全部10個(gè)如前所述的突變(即，42位的亮氨酸殘基被谷氨酸殘基取代、128位的絲氨酸殘基缺失、129位的天冬酰胺殘基被谷氨酰胺殘基取代、155位的精氨酸殘基被谷氨酸殘基取代、179位的絲氨酸殘基被谷氨酸殘基取代、180位的谷氨酸殘基被賴氨酸殘基取代、183位的絲氨酸殘基被谷氨酰胺殘基取代、230位的甘氨酸殘基被精氨酸殘基取代、232位的甘氨酸殘基被谷氨酰胺殘基取代、235位的組氨酸殘基被酪氨酸殘基取代)的SEQIDNO:2的氨基酸序列，所編碼的抗原性多肽稱為"1455M"，含有該質(zhì)粒的大腸埃希氏菌于2008年5月22日保藏于CGMCC，保藏號(hào)為CGMCCNo.2514。如后面的實(shí)施例所示，分別攜帶編碼抗原性多肽1455M、1452M、145M1R、145M2R、145M3R、和145M4R的DNA構(gòu)建體均可在BALB/c小鼠模型誘導(dǎo)產(chǎn)生顯著提高的特異性結(jié)合抗體和廣譜的高滴度的中和抗體水平，其中含有全部IO個(gè)氨基酸突變的1455M抗原可激發(fā)最具廣譜性的中和抗體。從實(shí)施例中給出的結(jié)果可以看出，42位的亮氨酸殘基被谷氨酸殘基取代的突變似乎是所測(cè)試的10個(gè)突變中的關(guān)鍵位點(diǎn)，含有該突變的145M1R、1452M、1455M均可誘導(dǎo)高滴度的廣譜性中和抗體；但與1455M相比，145M1R誘導(dǎo)的中和抗體不能中和某些測(cè)試的HIV-1臨床分離株，如XJDC6371。其它突變位點(diǎn)M2R、M3R、M4R在增加中和抗體的廣譜性方面同樣有作用。無意于受理論的限制，但本發(fā)明人推測(cè)42位的突變?cè)黾恿税さ鞍字衋螺旋結(jié)構(gòu)。已有文獻(xiàn)報(bào)道，與疫苗的保護(hù)性相關(guān)的特異性細(xì)胞毒性殺傷反應(yīng)(CTL)表位高度集中于HIV-1各蛋白的a螺旋區(qū)域(Yusim,K.，etal.2002.ClusteringpatternsofcytotoxicT-lymphocyteepitopesinhumanimmunodeficiencyvirustype1(HTV-l)proteinsrevealimprintsofimmuneevasiononHIV_1globalvariation.Journalofvirology76:8757-8768)。a螺旋片段結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)了保護(hù)性的CTL反應(yīng)，同樣也可能誘導(dǎo)了有效的中和抗體反應(yīng)。另外，128位的絲氨酸殘基缺失及129位突變僅造成糖基化位點(diǎn)的缺失，并沒有引起二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，但也可以誘導(dǎo)廣譜性的中和抗體反應(yīng)。根據(jù)已有的文獻(xiàn)報(bào)道(Koch,M.,etal.2003.Structure-based,targeteddeglycosylationofHIV-1gpl20andeffectsonneutralizationsensitivityandantibodyrecognition.Virology313:387-400)，本發(fā)明人認(rèn)為，該糖基化位點(diǎn)的缺失可能導(dǎo)致包膜蛋白無法形成覆蓋抗原表位的寡聚糖苷鏈，這使得包膜蛋白的某些中和表位暴露，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生廣譜性的中和抗體反應(yīng)。本領(lǐng)域人員能夠制備含有所述突變的其他各種組合形式的抗原性多肽以及相應(yīng)的DNA構(gòu)建體并測(cè)試其保護(hù)作用。本發(fā)明還提供DNA疫苗，其包如上所述的本發(fā)明的DNA構(gòu)建體和藥用可接受的佐劑。本發(fā)明的DNA疫苗在施用至體內(nèi)后能夠表達(dá)上述本發(fā)明的抗原性多肽或其片段。此外，本發(fā)明還提供重組病毒載體疫苗，其包含攜帶如上所述的發(fā)明的多核苷酸的重組病毒載體和藥用可接受的佐劑。本發(fā)明的重組病毒載體疫苗在施用至體內(nèi)后能夠表達(dá)上述本發(fā)明的抗原性多肽或其片段?？捎糜谥苽浔景l(fā)明的重組病毒載體疫苗的病毒載體包括但不限于痘苗載體、腺病毒載體、腺病毒相關(guān)病毒載體、仙臺(tái)病毒載體、單純皰疹病毒載體、人乳頭瘤病毒載體、和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等病毒載體。優(yōu)選地，所述重組病毒載體是復(fù)制型病毒載體。優(yōu)選地，所述復(fù)制型病毒載體是復(fù)制型重組痘苗載體。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的重組病毒載體疫苗是復(fù)制型重組天壇株痘苗疫苗，其攜帶編碼抗原1455M的多核苷酸。如后面的實(shí)施例所示，利用該復(fù)制型重組天壇株痘苗疫苗，在BALB/c雌鼠和Huntley豚鼠模型進(jìn)行了抗原免疫原性評(píng)價(jià)，其結(jié)果顯示抗原1455M可顯著激發(fā)BALB/c小鼠和豚鼠機(jī)體的特異性體液免疫反應(yīng)，特別是其誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體不但抗體譜變廣、抗體滴度高，而且該保護(hù)性抗體在豚鼠體內(nèi)可至少持續(xù)六周。這是目前已知的在無添加佐劑條件下，獲得的最好的中和抗體反應(yīng)結(jié)果之一。本領(lǐng)域人員能夠理解，也可以將本發(fā)明的多核苷酸插入至減毒的病原菌或者共生菌中，從而制備重組細(xì)菌載體疫苗。這種疫苗施用于人體后能夠提呈、表達(dá)所編碼的抗原。因此，本發(fā)明也涉及一種重組細(xì)菌載體疫苗，其包含攜帶一種多核苷酸的重組細(xì)菌載體和藥用可接受的佐劑，所述多核苷酸包含編碼如前所說的本發(fā)明的抗原性多肽或其片段的核苷酸序列?？捎糜诒景l(fā)明的減毒細(xì)菌載體包括但不限于減毒的沙門氏菌、牛結(jié)核分枝桿菌(BCG)、單核李斯特菌、志賀氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、百日咳桿菌、和炭疽芽孢桿菌?？捎糜诒景l(fā)明的共生菌載體包括但不限于乳酸菌、格式鏈球菌、葡萄球菌。本發(fā)明還提供預(yù)防或治療HIV-1病毒感染的方法，其包括給有需要的個(gè)體施用本發(fā)明的多肽疫苗和/或DNA疫苗和/或重組病毒載體疫苗和/或重組細(xì)菌載體疫苗。本發(fā)明的疫苗可通過任何合適的免疫接種途徑而施用，如貼敷、皮下、皮內(nèi)、肌肉、靜脈注射、腹腔注射等。免疫策略包括例如如粘膜免疫策略、交叉免疫策略等。本領(lǐng)域人員能夠理解，本發(fā)明的多肽疫苗或DNA疫苗或重組病毒載體疫苗可與脂質(zhì)體、納米材料等旨在提高抗原提呈效率的物質(zhì)一起使用。在另一方面，本發(fā)明提供抗體，所述抗體特異性結(jié)合本發(fā)明的抗原性多肽或其片段，且所述抗體對(duì)HIV-1病毒的中和活性高于HIV-1野生型包膜蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體對(duì)HIV-1病毒的中和活性。給動(dòng)物施用包含本發(fā)明的多肽或其片段的疫苗或攜帶編碼這些多肽或片段的多核苷酸的DNA疫苗或重組病毒載體疫苗后可誘導(dǎo)廣譜的針對(duì)不同地區(qū)各亞型的HIV-1臨床分離株病毒的保護(hù)性免疫應(yīng)答，這說明誘導(dǎo)的抗體區(qū)別于以往大多數(shù)天然包膜蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體。通過雜交瘤等本領(lǐng)域人員已知的抗體制備技術(shù)，可以利用本發(fā)明的多肽或其片段或編碼這些多肽或片段的多核苷酸來制備單克隆抗體，其中所述抗體的HIV-1中和活性高于HIV-1野生型包膜蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體的HIV-1中和活性。例如可以制備諸如完整免疫球蛋白分子、鼠源抗體、人源化抗體、嵌合抗體、scFv、Fab片段、Fab，片段、F(ab，)2、Fv、和二硫鍵連的Fv等單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。這些抗體在HIV被動(dòng)免疫方面有著廣泛的應(yīng)用前景。因此，本發(fā)明還提供預(yù)防或治療HIV-1病毒感染的方法，其包括給有需要的個(gè)體施用本發(fā)明的抗體。以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述。實(shí)施例實(shí)施例l:構(gòu)建含突變的DNA疫苗1、PCR引入突變位點(diǎn)以重組質(zhì)粒pDRVISV145(pDRVISV145也稱為PT-gpl40TM/DH5a(CGMCCNo.1439))為模板PCR擴(kuò)增目的片段(GeneAmpPCRSystem9700擴(kuò)增儀(美國(guó)AppliedBiosystem公司))。使用如下引物對(duì)目的片段引物對(duì)引物序列145M1R145M1R位點(diǎn)上游引物gpl45下游引物gpl45上游引物145M1R位點(diǎn)下游引物SEQIDNO:9SEQIDNO:8SEQIDNO:7SE()IDNO:10145M2R145M2R位點(diǎn)上游引物gpl45下游引物gpl45上游引物145M2R位點(diǎn)下游引物SEQIDNO:11SEQIDNO:8SE(3IDNO:7SEQIDNO:12145M3R145M3R位點(diǎn)上游引物gpl45下游引物gpl45上游引物145M3R位點(diǎn)下游引物SEQIDNO:13SEQIDNO:8SEQIDNO:7SEQIDNO:14<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>反應(yīng)體系質(zhì)粒模板0.5u1，PyrobestTaq(5U/u1)0.5u1(Takara公司產(chǎn)品)，10XPyrobestTaqBuffer(添加了MgCl2)5iU，dNTP(2.5mM)4u1，上游引物1"1，下游引物1lU，力nddH20至50u1(200u1Axygen公司鼓蓋PCR管)。反應(yīng)條件94°C5分鐘預(yù)變性；94°C50秒，退火溫度50秒，72°C2分鐘，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；72。C延伸10分鐘。除gpl45上游引物145M3R位點(diǎn)下游引物退火溫度為6(TC;其余退火溫度均為65"C。膠回收所獲得目的基因(膠回收試劑盒為Omega公司E.Z.N.A.GelExtractionKitE.Z.N.ACycle-PureKit)。以各突變位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的兩個(gè)基因片段為模板，gpl45上游引物與gpl45下游引物作為引物，PCR擴(kuò)增目的基因。反應(yīng)體系質(zhì)粒模板各0.5u1，ExTaq(5U/U1)0.5u1，10XExTaqBuffer(MgC12added)5P1，dNTP(2.5mM)4lU，上游弓l物liU，下游引物1lU，加ddH2O至50tU。反應(yīng)條件94°C5分鐘預(yù)變性；94°C50秒，68°C50秒，72°C2分鐘，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；72。C延伸10分鐘。膠回收所獲得5個(gè)目的基因片段145M1R、145M2R、145M3R、145M4R和145M5R。以145M1R為模板，145M2R位點(diǎn)上游引物與gpl45下游引物，gpl45上游引物與145M2R位點(diǎn)下游引物作為引物對(duì)，PCR擴(kuò)增目的片段。條件同上。再以膠回收得到的兩個(gè)目的基因片段為模板，gpl45上游引物與gp145下游引物作為引物，PCR擴(kuò)增含第二個(gè)突變位點(diǎn)的目的基因。條件同上。膠回收所獲得的1452M片段(含145M1R和145M2R)。以1452M為模板，如上方法，進(jìn)一步PCR引入突變。如此，直至獲得完全引入10個(gè)突變的1455M片段。2、用內(nèi)切酶EcoRV和BamHI(Takara公司產(chǎn)品)對(duì)HIV-1CN54145M1R、145M2R、145M3R、145M4R、145M5R、1452M、1455M和DNA疫苗載體pDRVISVl.O(CN1560259(中國(guó)專利申請(qǐng)200410028280.3);和HaishanLi，etal.EnhancementofGag-SpecificImmuneResponsesInducedbyDNAVaccinationbyIncorporationofa72-bpelementfromSV40EnhancerinthePlasmidVector.ChineseMedicalJournal(English)2007;120(6):496-502)進(jìn)行酶切。酶切反應(yīng)體系為質(zhì)?；蚰康幕?0iU，EcoRV2iU，BamHI2ul,lOXBamHI緩沖液K5ul，加入ddH20至總體積50iU，37。C孵育4小時(shí)，進(jìn)行瓊脂糖(GIBCO公司產(chǎn)品)凝膠電泳分離，切割相應(yīng)長(zhǎng)度的片段(插入目的基因片段約為2.1kb，載體片段約為5kb)，瓊脂糖凝膠回收(膠回收試劑盒為Omega公司E.Z.N.A.GelExtractionKitE.Z.N.ACycle-PureKit)。3、連接反應(yīng)體系2XRapidLigationBuffer(NEB公司產(chǎn)品)5ul，合成目的基因片段的回收產(chǎn)物3ul，載體片段的回收產(chǎn)物lul，T4DNA連接酶(NEB公司產(chǎn)品)lul，4。C冰箱連接8小時(shí)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a的感受態(tài)細(xì)胞(Takara公司)，涂布于含硫酸卡那霉素(北京第二制藥廠產(chǎn)品)的平板(青島a醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品)，3^C培養(yǎng)16小時(shí)。挑取單克隆菌落接種于3ml含60ug/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基(Amersham公司產(chǎn)品配制)中，37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)(HZQ-X100振蕩培養(yǎng)箱為哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)有限公司產(chǎn)品)16小時(shí)。利用Omega公司的E.Z.N.A.PlasmidMiniprepKitI小量提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切、PCR鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒送Invitrogen公司進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)。經(jīng)鑒定好的質(zhì)粒分別命名為pDRVISV145MlR、pDRVISV145M2R、pDRVISV145M3R、pDRVISV145M4R、pDRVISV145M5R、pDRVISV1452M和pDRVISV1455M。酶切鑒定結(jié)果見圖1;PCR鑒定結(jié)果見圖2;由圖可知所構(gòu)建質(zhì)粒均正確插入了目的基因。4、免疫印跡檢測(cè)插入目的基因的表達(dá)1)10000rpm離心(離心機(jī)為Sigma公司產(chǎn)品)收集轉(zhuǎn)染后的M3T細(xì)胞(購自ATCC)，制備蛋白電泳樣品并進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳；((29:1)丙烯酰胺*雙丙粉劑為SIGMA公司產(chǎn)品；恒壓恒流電泳儀HoeferEPS2A200、垂直蛋白電泳儀PowerPAC1000均為Bio-Rad公司產(chǎn)品)；2)將Whatman濾紙(Whatman公司產(chǎn)品)剪成與凝膠大小相同，3張浸于正極液，3張浸于負(fù)極液；(10X電轉(zhuǎn)緩沖液母液0.2SMTris(Sigma公司產(chǎn)品)，1.92MGlycine(Sigma公司產(chǎn)品)，1°/。SDS(Sigma公司產(chǎn)品)，pH8.3;正極液7體積母液，2體積甲醇，l體積ddH20;負(fù)極液1體積母液，9體積ddH20);3)120伏穩(wěn)壓電泳45分鐘，結(jié)束后，將凝膠浸于負(fù)極液中；4)PVDF膜(Sigma公司產(chǎn)品)于甲醇中浸泡15秒，然后用去離子水漂洗4次，將PVDF膜置于正極液中浸泡10分鐘；5)按由負(fù)極到正極負(fù)極濾紙、凝膠、PVDF膜、正極濾紙的疊放順序置于電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad公司產(chǎn)品)上，注意趕走各層之間的氣泡，10mA穩(wěn)流轉(zhuǎn)膜45分鐘；6)取出PVDF膜放入去離子水中漂洗3遍；7)將膜放入用含5%脫脂奶的PBS溶液中4'C封閉12小時(shí)；8)將膜放入PBST中漂洗3遍，然后將其放入含1%HIV-1陽性血清的封閉液中，室溫反應(yīng)2小時(shí)，PBST洗滌5次；9)再將膜放入用含5%脫脂奶的PBS溶液按1:2000稀釋的羊抗人IgG-HRP(北京中杉金橋有限公司產(chǎn)品)中，室溫反應(yīng)l小時(shí)，PBST洗滌5次；10)加入顯色液(18mlddH20，2mlNiCl2，200u11MpH7.6Tris-HCl，DAB(Sigma公司產(chǎn)品)6mg,H2O230ul),室溫顯色10分鐘，蒸餾水沖洗終止反應(yīng)。DNA構(gòu)建體表達(dá)鑒定見圖3。結(jié)果表明7個(gè)抗原均可正確表達(dá)。實(shí)施例2:構(gòu)建含全部點(diǎn)突變的重組天壇株痘苗1、穿梭質(zhì)粒pSC65(保藏號(hào)是CGMCCNo.1097)的構(gòu)建用內(nèi)切酶XbaI和PmlI(Takara公司產(chǎn)品)將HIV-1CN54的gpl45和1455M基因分別由經(jīng)測(cè)序確認(rèn)的pDRVISV145和pDRVISV1455M上切下來，凝膠純化后，采用高保真Taq酶(Takara公司產(chǎn)品)延伸法補(bǔ)平末端；然后以平端連接的方式與經(jīng)SmaI(Takara公司產(chǎn)品)單酶切且經(jīng)去磷酸化的pSC65載體相連。高保真酶補(bǔ)平體系PyrobestTaq酶0.5ix1，dNTP(Takara公司產(chǎn)品)llU，10XPyrobestTaqBuffer(添加了MgCl2)lul，去離子水補(bǔ)加至lOu1。反應(yīng)條件72'C，5分鐘。CIP酶(NEB公司產(chǎn)品)去磷酸化體系CLPlnl，NEB緩沖液32ul，去離子水7ul。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ct的感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含青霉素(北京第二制藥廠產(chǎn)品)的平板(青島a醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品)，37'C培養(yǎng)16小時(shí)。挑取單克隆菌落接種于3ml含50ug/ml青霉素的LB培養(yǎng)基中，37'C，200rpm振蕩培養(yǎng)18小時(shí)。小量提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定、PCR鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒分別命名為pSC145和pSC1455M。含有質(zhì)粒pSC1455M的大腸埃希氏菌于2008年5月22日保藏于CGMCC，保藏號(hào)為CGMCCNo.2515。經(jīng)鑒定兩個(gè)穿梭質(zhì)粒構(gòu)建正確。2、天壇株重組痘苗的構(gòu)建、純化和擴(kuò)增1)痘苗病毒天壇株(購自北京生物制品所)以O(shè).lMOI(multiplicityofinfection)的劑量感染80%成片的143B細(xì)胞(購自ATCC)，37。C吸附1小時(shí)；2)在兩個(gè)Eppendorf管(Axygen公司)中各加入250ul無血清無抗生素的Eagle's培養(yǎng)基(購自中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病所)，其中一個(gè)管中加入8ug的質(zhì)粒pSC145或pSC1455M，混勻；另一個(gè)管中加10u1Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司)，混勻；室溫孵育5分鐘；3)將上述兩個(gè)Eppendorf管中的溶液混合，室溫放置30分鐘；4)將感染有痘苗病毒的細(xì)胞用5ml無血清無抗生素的Eagle's培養(yǎng)基洗細(xì)胞2次，再加入3ml的無血清無抗生素的Eagle's培養(yǎng)基；5)將DNA質(zhì)粒和Lipofectamin2000的混合液加入T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶(ComingCostar公司產(chǎn)品)中，置于37'C二氧化碳培養(yǎng)箱(SANYO公司產(chǎn)品)中培養(yǎng)；6)4小時(shí)后，用4mlEagle's維持培養(yǎng)基換液，再置于37'C二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在培養(yǎng)48小時(shí)利用低熔點(diǎn)瓊脂糖(Gibco公司產(chǎn)品)鋪斑；7)配制低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液2%低熔點(diǎn)瓊脂糖，加入相同體積的2XEagle's完全培養(yǎng)基(購自中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病所)，加入X-gal(Promega公司產(chǎn)品)至終濃度為200ug/ml，加入中性紅(購自中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病所)至終濃度50iig/ml，輕吹打混勻，避免氣泡產(chǎn)生；8)輕輕倒掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，緩慢加入40'C的鋪斑溶液，待溶液凝固將培養(yǎng)瓶放入37-C二氧化碳培養(yǎng)箱(SANYO公司產(chǎn)品)；9)培養(yǎng)4小時(shí)后觀察細(xì)胞病變部位是否出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)；10)挑取藍(lán)色斑點(diǎn)，加入到500u1Eagle's維持液中，反復(fù)凍融3次備用；11)吸取凍融3次挑斑液200u1加入到80%-90%匯合成片的143B細(xì)胞，置于37'C二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，觀察細(xì)胞病變情況，再次進(jìn)行鋪斑及挑斑，如此反復(fù)，進(jìn)行5代以上挑斑純化，獲得純化后的重組痘苗病毒rTV145和rTV1455M;12)將用于雞胚細(xì)胞培養(yǎng)的含10°/。小牛血清(Gibco公司產(chǎn)品)的Eagle's培養(yǎng)基棄掉，換用一半體積的含2%小牛血清的Eagle's維持培養(yǎng)基。以5MOI的劑量感染雞胚細(xì)胞，混勻后，置于37'C5MC02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；2小時(shí)后，再補(bǔ)加另一半體積的含2%小牛血清的Eagle's維持培養(yǎng)基，繼續(xù)于37。C5%(302的細(xì)胞培養(yǎng)箱(SANYO公司產(chǎn)品)中培養(yǎng)；13)48小時(shí)后，將細(xì)胞培養(yǎng)基棄去，用無菌PBS漂洗一遍后，用lml的PBS收毒，反復(fù)凍融兩次后混勻分裝，于-8(TC冰箱(SANYO公司產(chǎn)品)保存。純化好的重組病毒經(jīng)PCR和免疫印跡鑒定。結(jié)果見圖5、6。結(jié)果顯示，構(gòu)建的重組痘苗可正確表達(dá)插入的gpl45和1455M基因。實(shí)施例3:改造后的抗原的免疫原性比較實(shí)驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及免疫方案BALB/c雌鼠(H-2d)，6-8周齡，體重18-25克，購自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，置于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物技術(shù)所清潔級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)。Huntley雌性豚鼠，6-8周齡，180g-220g，購自中國(guó)藥品生物制品檢定所動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物所清潔級(jí)動(dòng)物房。BALB/c雌鼠每組7只，分別在0，2，4，6周進(jìn)行DNA疫苗免疫，在第9周摘眼球取血，全血37。C孵育1小時(shí)后，3000rpm離心分離血清進(jìn)行檢測(cè)。Huntley雌性豚鼠每組4只，分別在0，2，4周進(jìn)行DNA疫苗免疫，在第10周進(jìn)行痘苗加強(qiáng)免疫，第14、16周進(jìn)行心臟采血，全血37。C孵育1小時(shí)后，3000rpm離心分離血清進(jìn)行檢測(cè)。每只小鼠脛骨前肌肌注DNA疫苗100微克(濃度lmg/ml)，每個(gè)后肢各50微克。Huntley雌性豚鼠兩個(gè)后肢肌肉各注射250微克(濃度lmg/ml)，痘苗免疫劑量為1x107PFU(空斑形成單位)。2、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)特異性結(jié)合抗體1)用包被液(Na2C031.59克(Sigma公司產(chǎn)品)，NaHC032.93克(Sigma公司產(chǎn)品)，加去離子水定容至lOOOml，混勻后4。C保存)稀釋HIV-1CN54膜蛋白gpl20抗原(本科室自行表達(dá)、純化及制備，純度高達(dá)90%以上；制備方法參見馮劼碩士論文《重組HIV-1包膜糖蛋白gpl20和gp41的表達(dá)、純化及初步應(yīng)用》)至約5ug/ml，100ul/孔加入96孔板(ComingCostar公司產(chǎn)品)中，4。C包被12小時(shí)，1XPBS洗滌3次，每孔加入200ul封閉液(PBST配制5XBSA(Sigma公司產(chǎn)品))，37。C孵育1小時(shí)。3)1XPBST洗滌3次，免疫小鼠血清分別從1:100和1:200開始做雙系列2倍倍比稀釋，每孔加入IOOtU系列稀釋的血清，同時(shí)每板空白、陽性對(duì)照及陰性對(duì)照各設(shè)2L，37"C孵育1小時(shí)。4)1XPBST洗滌5次，加入100y11:2000稀釋的羊抗小鼠IgG-HRP抗體(北京中杉金橋有限公司產(chǎn)品)，37r孵育小時(shí)。5)1XPBST洗滌5次，加入OPD顯色底物(Sigma公司產(chǎn)品)100u1，室溫避光顯色15分鐘。6)每孔加入50ul2M硫酸(購自北京化學(xué)試劑公司)終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀(ThermoElectronCoporationMultiscanascentplatereader354)在492nm波長(zhǎng)檢測(cè)每孔吸光度(A)值。若實(shí)驗(yàn)孔吸光值/對(duì)照孔吸光值大于2:1，該孔判定為陽性孔。結(jié)果見圖6。結(jié)果顯示，單獨(dú)由1455MDNA疫苗激發(fā)的平均特異性結(jié)合抗體滴度遠(yuǎn)高于單獨(dú)由gpl45DNA疫苗激發(fā)的平均結(jié)合抗體滴度；其抗體滴度提高了3.5倍多(p=0.0020)。并且，在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，結(jié)合抗體的提高是由1452M所含的突變引起的；1452M疫苗可誘導(dǎo)產(chǎn)生顯著高于gpl45激發(fā)的平均結(jié)合抗體滴度，其平均抗體滴度可到2400，最高滴度可達(dá)9600。而其它疫苗如145M3R，145M4R，145M5R免疫后不但沒有提高抗體滴度，反而結(jié)合抗體反應(yīng)強(qiáng)度有所下降。第三次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，145M1R疫苗可誘導(dǎo)產(chǎn)生與1452M疫苗相類似的結(jié)合抗體滴度；經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩組特異性結(jié)合抗體滴度顯著高于為未改造的gpl45(p=0.0177，N=8;p=0.0083，N=8)。而且數(shù)據(jù)顯示145M1R疫苗誘導(dǎo)的抗體滴度略高于1452M疫苗組，其反應(yīng)強(qiáng)度與未改造的gpl45構(gòu)成非常顯著差異(p=0.0083，N=8)。兩項(xiàng)靈長(zhǎng)類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果和一項(xiàng)臨床試驗(yàn)結(jié)果提醒特異性結(jié)合抗體與免疫保護(hù)相關(guān)。我們改造后的抗原1455M(含全部10個(gè)氨基酸突變位點(diǎn))、1452M、145M1R均可顯著提高BALB/c小鼠的特異性結(jié)合抗體反應(yīng)強(qiáng)度。3、BALB/c雌鼠和血清的中和抗體檢測(cè)1)每組BALB/c血清等體積混合；待測(cè)小鼠血清與豚鼠血清56。C滅活半小時(shí)；2)取15n1血清加至135tU含l(iMindinavir的DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司產(chǎn)品)中；然后作2倍(小鼠血清)、3倍(豚鼠血清)梯度稀釋；3)每孔加入50200TCID50的病毒，(302孵箱37""C孵育一小時(shí)；4)每孔加入1X104TZM-bl細(xì)胞(購自ATCC)，032孵箱37。C孵育48小時(shí)；5)將每孔中培養(yǎng)基移棄，每孔加200微升PBS洗兩遍；每孔加入稀釋好的細(xì)胞裂解液(Promega公司產(chǎn)品貨號(hào)E1531)50ul;顯微鏡(1X70熒光顯微鏡日本OLYMPUS公司產(chǎn)品)下觀察細(xì)胞完全裂解后，將裂解液轉(zhuǎn)至96孑L讀數(shù)板(PerkinElmerLifeSciencesflat-bottomed96-wellplate)中。每孔加入配制好的100熒光素酶底物(Bright-Glosubstrateandbuffer)(Promega公司產(chǎn)品貨號(hào)El501)，5分鐘內(nèi)完成自發(fā)熒光檢測(cè)(Victor3luminometer為PerkinElmer公司產(chǎn)品)。6)按公式[l-(實(shí)驗(yàn)組RLU-細(xì)胞對(duì)照RLUy(對(duì)照組RLU-細(xì)胞對(duì)照RLU)]X100%計(jì)算RLU衰減值；如該值大于50%，則該稀釋度下該血清中和反應(yīng)判定為陽性。BALB/c雌鼠血清中和抗體檢測(cè)結(jié)果見表3表3:BALB/c雌鼠血清中和抗體檢測(cè)結(jié)果v3ccin6NeutralizationtiteragainstHIV國(guó)1isogroupsXJDC6371XJDC6431XJDC0793CBJB105CBJB248020101300pDRVISV145<6<6<6<6<612pDRVISV14S5M122424242412pDRVISV1452M<62424242424pDRVISV145M1R<62424242424pDRVISV145M2R<61212121212pDRVISV145M3R<6<6<61212pDRVISV145M4R<6<6<6<61212pDRVISV145M5R<6<6<6<6<6<6完全改造后的抗原1455M能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生最廣譜(可中和所有來自新疆、北京和安徽的B'和BVC亞型的臨床分離株)，并且可高滴度的中和所有病毒(針對(duì)所有分離株中和滴度均大于1:12);未改造的gpM5僅能中和一個(gè)B，亞型的病毒，對(duì)其它分離株均不具備任何中和能力。1452M、145M1R抗原誘導(dǎo)的抗體可廣譜有效地中和大多數(shù)的臨床分離株，但其光譜性不及1455M組。145M2R抗原能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生具有廣譜的中和活性抗體；該位點(diǎn)改造誘導(dǎo)的中和抗體強(qiáng)度在1:12左右。145M3R、145M4R抗原能夠誘導(dǎo)中和抗體譜變廣。結(jié)果顯示:含IO個(gè)氨基酸突變的抗原1455M可顯著提高中和抗體的廣譜性、反應(yīng)強(qiáng)度。通過進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)所誘導(dǎo)的該保護(hù)性反應(yīng)主要是由含前兩個(gè)突變區(qū)的1452M引起的，并最終確定主要是由第一個(gè)點(diǎn)突變145M1R引起的。其它位點(diǎn)如145M2R、145M3R、145M4R等位點(diǎn)突變后也有使其中和抗體譜變廣的效果。Huntley豚鼠第14、16周血清中和結(jié)果見圖7、8、9、10。圖7、圖8顯示1455M抗原誘導(dǎo)該組大多數(shù)豚鼠產(chǎn)生了廣譜性(針對(duì)所有8個(gè)HIV臨床分離株)的中和抗體，而且該反應(yīng)可至少持續(xù)6周。這意味著該抗原同樣會(huì)在人體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)眾多HIV亞型的廣譜性、長(zhǎng)時(shí)效的中和抗體保護(hù)。圖9、圖10顯示1455M抗原誘導(dǎo)該組大多數(shù)豚鼠產(chǎn)生了高滴度(針對(duì)所有8個(gè)HIV臨床分離株)的中和抗體，最強(qiáng)可達(dá)到1:270;而且該反應(yīng)可至少持續(xù)6周。這意味著該抗原同樣會(huì)在人體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)眾多HIV亞型的高滴度、長(zhǎng)時(shí)效的中和抗體保護(hù)。以上實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，其無意于對(duì)本發(fā)明的范圍做出任何限制。顯然，在不脫離本發(fā)明的精神和實(shí)質(zhì)的情況下，本領(lǐng)域人員可以對(duì)本發(fā)明做出多種改動(dòng)和變化，因此，這些改動(dòng)和變化同樣在本申請(qǐng)要求保護(hù)的范圍內(nèi)。序列表<110>中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心<120〉基于EIAV減毒活疫苗的氨基酸突變而構(gòu)建的抗HIV疫苗<130>I200801777CB<160>18<170〉Patentlnversion3.3<210〉1<211>856<212〉PRT<213>HIV-1HXB2株gpl60的氨基酸序列<400〉1MetArgValLysGluLysTyrGinHisLeuTrpArgTrpGlyTrpArg151015■TrpGlyThrMetLeuLeuGlyMetLeuMetlieCysSerAlaThrGlu202530LysLeuTrpValThrValTyrTyrGlyValProValTrpLysGluAla354045ThrThrThrLeuPheCysAlaSerAspAlaLysAlaTyrAspThrGlu505560ValHisAsnValTrpAlaThrHisAlaCysValProThrAspProAsn65707580ProGinGluValValLeuValAsnValThrGluAsnPheAsnMetTrp859095LysAsnAspMetValGluGinMetHisGluAsplielieSerLeuTrp100105110AspGinSerLeuLysProCysValLysLeuThrProLeuCysValSer115120125LeuLysCysThrAspLeuLysAsnAspThrAsnThrAsnSerSerSer130135140GlyArgMetlieMetGluLysGlyGlulieLysAsnCysSerPheAsn145150155160lieSerThrSerlieArgGlyLysValGinLysGluTyrAlaPhePhe165170175TyrLysLeuAsplielieProlieAspAsnAspThrThrSerTyrLys180185190LeuThrSerCysAsnThrSerVallieThrGinAlaCysProLysVal195200205SerPheGluProlieProlieHisTyrCysAlaProAlaGlyPheAla210215220lieLeuLysCysAsnAsnLysThrPheAsnGlyThrGlyProCysThr225230235240AsnValSerThrValGinCysThrHisGlylieArgProValValSer245250255ThrGinLeuLeuLeuAsnGlySerLeuAlaGluGluGluValVallie260265270ArgSerValAsnPheThrAspAsnAlaLysThrlielieValGinLeu275280285AsnThrSerValGlulieAsnCysThrArgProAsnAsnAsnThrArg290295300LysArglieArglieGinArgGlyProGlyArgAlaPheValThrlie305310315320GlyLyslieGlyAsnMetArgGinAlaHisCysAsnlieSerArgAla325330335LysTrpAsnAsnThrLeuLysGinlieAlaSerLysLeuArgGluGin340345350PheGlyAsnAsnLysThrlieliePheLysGinSerSerGlyGlyAsp355360365ProGlulieValThrHisSerPheAsnCysGlyGlyGluPhePheTyr370375380CysAsnSerThrGinUuPheAsnSerThrTrpPheAsnSerThrTrp385390395400SerThrGluGlySerAsnAsnThrGluGlySerAspThrlieThrUu405410415ProCysArglieLysGinlielieAsnMetTrpGinLysValGlyLys420425430AlaMetTyrAlaProProlieSerGlyGinlieArgCysSerSerAsn435440445lieThrGlyLeuLeuLeuThrArgAspGlyGlyAsnSerAsnAsnGlu450455460SerGluliePheArgProGlyGlyGlyAspMetArgAspAsnTrpArg465470475■SerGluLeuTyrLysTyrLysValValLyslieGluProLeuGlyVal485490495AlaProThrLysAlaLysArgArgValValGinArgGluLysArgAla500505510ValGlylieGlyAlaLeuPheLeuGlyPheLeuGlyAlaAlaGlySer515520525ThrMetGlyAlaAlaSerMetThrLeuThrValGinAlaArgGinLeu530535540LeuSerGlylieValGinGinGinAsnAsnLeuLeuArgAlalieGlu545550555560AlaGinGinHisLeuLeuGinLeuThrValTrpGlylieLysGinLeu565570575GinAlaArglieLeuAlaValGluArgTyrLeuLysAspGinGinLeu580585590LeuGlylieTrpGlyCysSerGlyLysLeulieCysThrThrAlaVal595600605ProTrpAsnAlaSerTrpSerAsnLysSerLeuGluGinlieTrpAsn610615620HisThrThrTrpMetGluTrpAspArgGlulieAsnAsnTyrThrSer625630635640LeulieHisSerUulieGluGluSerGinAsnGinGinGluLysAsn645650655GluGinGluLeuLeuGluLeuAspLysTrpAlaSerLeuTrpAsnTrp660665670PheAsnlieThrAsnTrpLeuTrpTyrlieLysLeuPhelieMetlie675680685ValGlyGlyLeuValGlyLeuArglieValPheAlaValUuSerlie690695700ValAsnArgValArgGinGlyTyrSerProLeuSerPheGinThrHis705710715720ArgSerlieArgLeuValAsnGlySer740745750LeuAlaLeulieTrpAspAspLeuArgSerLeuCysLeuPheSerTyr755760765HisArgLeuArgAspLeuLeuLeulieValThrArglieValGluLeu770775780LeuGlyArgArgGlyTrpGluAlaLeuLysTyrTrpTrpAsnLeuLeu785790795800GinTyrTrpSerGinGluLeuLysAsnSerAlaValSerLeuLeuAsn805810815AlaThrAlalieAlaValAlaGluGlyThrAspArgVallieGluVal820825830ValGinGlyAlaCysArgAlalieArgHislieProArgArglieArg835840845GinGlyLeuGluArglieLeuLeu850855<210〉2<211〉699<212>PRT<213>HIV-1CN54株gpl45的氨基酸序列〈400〉2MetAspArgAlaLysLeuLeuLeuLeuLeuLeuLeuLeuLeuLeuPro151015GinAlaGinAlaValGlyAsnLeuTrpValThrValTyrTyrGlyVal202530ProValTrpLysGlyAlaThrThrThrLeuPheCysAlaSerAspAla354045LysAlaTyrAspThrGluValHisAsnValTrpAlaThrHisAlaCys505560ValProAlaAspProAsnProGinGluMetValLeuGluAsnValThr65707580GluAsnPheAsnMetTrpLysAsnGluMetValAsnGinMetGinGlu85LeuProThrProArgGlyProAspArgProGluGlylieGluGluGlu725730735AspVallieSerLeuTrpAspGinSerLeuLysProCysValLysLeu100105110ThrProLeuCysValThrLeuGluCysArgAsnValSerSerAsnSer115120125AsnAspThrTyrHisGluThrTyrHisGluSerMetLysGluMetLys130135140AsnCysSerPheAsnAlaThrThrValValArgAspArgLysGinThr145150155160ValTyrAlaLeuPheTyrArgLeuAsplieValProLeuThrLysLys165170175AsnTyrSerGluAsnSerSerGluTyrTyrArgLeulieAsnCysAsn180185190ThrSerAlalieThrGinAlaCysProLysValThrPheAspProlie195200205ProlieHisTyrCysThrProAlaGlyTyrAlalieLeuLysCysAsn210215220AspLysliePheAsnGlyThrGlyProCysHisAsnValSerThrVal225230235240GinCysThrHisGlylieLysProValValSerThrGinLeuLeuUu245250255AsnGlySerLeuAlaGluGlyGlulielielieArgSerGluAsnLeu260265270ThrAsnAsnValLysThrlielieValHisLeuAsnGinSerValGlu275280285lieValCysThrArgProGlyAsnAsnThrArgLysSerlieArglie290295300GlyProGlyGinThrPheTyrAlaThrGlyAsplielieGlyAsplie305310315320ArgGinAlaHisCysAsnlieSerGluAspLysTrpAsnGluThrLeu325330335GinArgValSerLysLysLeuAlaGluHisPheGinAsnLysThrlie340345350LysPheAlaSerSerSerGlyGlyAspLeuGluValThrThrHisSer355360365PheAsnCysArgGlyGluPhePheTyrCysAsnThrSerGlyLeuPhe370375380AsnGlyAlaTyrThrProAsnGlyThrLysSerAsnSerSerScrlie385390395400lieThrlieProCysArglieLysGinlielieAsnMetTrpGinGlu405410415ValGlyArgAlaMetTyrAlaProProlieLysGlyAsnlieThrCys420425430LysSerAsnlieThrGlyLeuLeuLeuValArgAspGlyGlyThrGlu435440445ProAsnAspThrGluThrPheArgProGlyGlyGlyAspMetArgAsn450455460AsnTrpArgSerGluLeuTyrLysTyrLysValValGlulieLysPro465470475480LeuGlyValAlaProThrThrThrLysArgArgValValGluArgGlu485490495LysArgAlaValGlylieGlyAlaValPheLeuGlyPheLeuGlyVal500505510AlaGlySerThrMetGlyAlaAlaSerlieThrLeuThrValGinAla515520525ArgGinLeuLeuSerGlylieValGinGinGinSerAsnILeuLeuArg530535540AlalieGluAlaGinGinHisLeuLeuGinLeuThrValTrpGlylie545550555560LysGinLeuGinThrArgValLeuAlalieGluArgTyrLeuLysAsp565570575GinGinLeuLeuGlylieTrpGlyCysSerGlyLysLeulieCysThr580585590ThrAlaValProTrpAsnSerSerTrpSerAsnLysSerGinLysGlu595600605lieTrpAspAsnMetThrTrpMetGinTrpAspLysGlulieSerAsn610615620TyrThrAsnThrValTyrArgLeuLeuGluGluSerGinAsnGinGin625630635640GluArgAsnGluLysAspLeuLeuAlaLeuAspSerTrpLysAsnLeu645650655TrpSerTrpPheAsplieThrAsnTrpLeuTrpTyrlieLysliePhe660665670lielielieValGlyGlyLeulieGlyLeuArglieliePheAlaVal675680685LeuSerlieValAsnArgValArgGinGlyTyr690695<210>3<211>865<212>raT<213>EIAVLN株包膜蛋白的氨基酸序列<400>3MetValSerlieAlaPheTyrGlyGly15lieProGlyGlylieSerThr1015ProlieThrGinGinThrGluSerThrAspThrGinLysGlyAspHis202530MetValTyrGinProTyrCysTyrAsnAspSerHisLysAlaGluMet354045AlaGluAlaArgAspThrArgTyrGinGluGluMetAsnArgLysGlu505560GluLysGluAspAsnLysArgArgAsnAsnTrpTrpLyslieGlyMet65707580PheLeuLeuCysLeuLeuGlyThrThrGlyGlyPheLeuTrpTrpTyr859095GluGlyGinLysHisSerHisTyrlieGlyLeuValThrlieGlySer100105110ArgLeuAsnGlySerGlyMetThrSerAlalieGluCysTrpGlySer115120125PheProGlyCysArgProPheThrAsnTyrPheSerTyrGluThrAsn130135140ArgThrlieSerArgAspAsnAsnThrAlaThrLeuLeuAspAlaTyr145150155160GinArgGluValThrAsnlieTyrArgThrSerCysValAspSerAsp165170175HisCysGinGluTyrLysCysLysGinValGinLeuLysGluAsnSer180185190SerAsnlielieMetAsnAsnCysSerAsnAsnSerCysGluGluPhe195200205TrpGlyPheSerTrpLeuGluCysAsnGinThrGluAsnAlalieThr210215220lieLeuValProGluValGluMetGinGinSerAspAsnAsnThrTrp225230235240lieProLysArgCysAsnGluThrTrpAlaArgValLysHisCysPro245250255MetAspLeuLeuTyrGlylieAsnArglieArgMetCysValGinPro260265270ProPhePheLeuPheLysGinAsnAspThrSerAsnAsnThrSerlie275280285LeuSerAsnCysGlyProLeuValPheLeuGlylieLeuGluAspAsn290295300LysAlaAlalieGinAsnGlySerCysThrLeuHisArgThrAsnlie305310315320LysArgProAspTyrSerGlyPheTyrGinValProliePheTyrlie325330335CysAsnLeuThrGlyLeuGinSerCysAsnAsnGlySerlielieSer340345350lielieMetSerGluSerAsnAsnValGinTyrLeuLeuCysAsnThr355360365SerAsnThrAsnSerThrAsnAsnAlaThrValSerCysValValGin370375380SerPheGlyVallieGlyGinAlaHisValAlaUuProArgLysAsn385390395400LysArgLeuGinSerProLysPheAlaHisTyrAsnCysThrlieAsn405410415AsnLysThrGluUuArgGinTrpGinLeuValLysThrSerGlylie420425430ThrProLeuProlieSerSerThrAlaAsnThrGlyLeuValArgHis435440445LysArgAspPheGlylieSerAlalielieAlaAlalieValAlaAla450455460ThrAlalieAlaAlaSerValThrMetSerTyrlieAlaLeuThrAsp465470475480ValAsnLysLeuAspSerValGinAsnHisThrPheGluValGluAsn485490495AsnThrlieAsnGlyLeuGluLeuValGluGluGinlieHislieLeu500505510TyrAlaMetValLeuGinThrHisAlaAspValGinLeuLeuLysGlu515520525GinGinLyslieGluGluThrPheAsnLeulieGlyCyslieGluArg530535540SerHisThrPheCysHisThrGlyHisProTrpAsnGluSerTrpGly545550555560GinLeuAsnAspSerThrGinTrpAspAspTrpValAspLysMetGlu565570575AsnLeuAsnHisAsplieLeuThrThrLeuHisThrAlaArgAsnAsn580585590LeuGluGinSerMetlieThrPheAsnThrProAspSerlieAlaGin595600605PheGlyLysAsnlieTrpSerHislieAlaAsnTrplieProGlyLeu610615620GlyAlaSerlielieLysTyrlieValLeuLeuLeuLeuValTyrVal625630635640LeuLeuThrSerAlaProLyslieLeuArgGlyLeuLeuThrThrMet645650655SerGlyAlaGlySerSerAlaSerArgTyrLeuArgLysArgTyrHis660665670HisArgHisAlaSerArgGlyAsplieTrpAlaGinValGinTyrHis675680685AlaTyrLeuAla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rSerHisValThrMetProGinTyrAspVal850855860<210>.7<211〉44<212〉DNA<213〉gpl45上游引物<400>7gctctagagatatcgacaccatggacagggccaagctgctgctg44<210>8〈211〉41<212>DNA<213〉gpl45下游引物<400〉8gtgaacagggtgaggcagggctactgaggatccgtcgaccg41<210〉9<211>25<212>DNA<213〉145M1R位點(diǎn)上游引物<400〉9accaccgagttctgcgccagcgacg25<210>10<211〉36<212〉DNA<213〉145M1R位點(diǎn)下游引物<400〉10cgcagaactcggtggtggtggcgcccttccacacgg36<210>11<211>24<212〉DNA<213>145M2R位點(diǎn)上游引物<400〉11aaccaggacacctaccacgagacc24<210>12〈211〉39<212>DNA<213>145M2R位點(diǎn)下游引物〈400〉12ctcctcgtggtaggtgtcctggttgctgctcacgttcct39<210〉13<211〉26<212>DNA<213〉145M3R位點(diǎn)上游引物<400〉13accgtggtggaggacaggaagcagac26<210〉14<211>30<212>DNA<213>145M3R位點(diǎn)下游引物<400〉14ttcctgtcctccaccacggtggtggcgttg30<210〉15<211〉37<212>DNA<213〉145M4R位點(diǎn)上游引物<400>15ctacgagaagaacagccaggagtactacaggctgatc37<210〉16<211〉31<212>DNA<213>145M4R位點(diǎn)下游引物<400>16cctggctgttcttctcgtagttcttcttggt31<210〉17<211〉40<212>DNA<213>145M5R位點(diǎn)上游引物<400〉17atcttcaaccgcacccagccctgctacaacgtgagcaccg40<210〉18<211〉36<212〉DNA<213>145M5R位點(diǎn)下游引物<400>18gttgtagcagggctgggtgcggttgaagatcttgtc3權(quán)利要求1、一種衍生自HIV-1包膜蛋白的抗原性多肽或其片段，其中所述多肽或片段包含一氨基酸序列，所述氨基酸序列在相當(dāng)于SEQIDNO1的如下位點(diǎn)上包含突變，所述突變選自由以下突變組成的組52位的亮氨酸殘基被谷氨酸殘基或天冬氨酸殘基取代；138位的絲氨酸殘基缺失；139位的天冬酰胺殘基被谷氨酰胺殘基取代；166位的精氨酸殘基被谷氨酸殘基或天冬氨酸殘基取代；184位的絲氨酸殘基被谷氨酸殘基或天冬氨酸殘基取代；185位的谷氨酸殘基被賴氨酸殘基、精氨酸殘基或組氨酸殘基取代；188位的絲氨酸殘基被谷氨酰胺殘基或天冬酰胺殘基取代；235位的甘氨酸殘基被精氨酸殘基、賴氨酸殘基或組氨酸殘基取代；237位的甘氨酸殘基被谷氨酰胺殘基或天冬酰胺殘基取代；240位的組氨酸殘基被酪氨酸殘基取代；和上述突變的任意組合。2、權(quán)利要求1的抗原性多肽或其片段，其中所述氨基酸序列至少包含所述52位的亮氨酸殘基被谷氨酸殘基或天冬氨酸殘基取代的突變。3、權(quán)利要求l的抗原性多肽或其片段，其中所述氨基酸序列至少包含所述52位的亮氨酸殘基被谷氨酸殘基或天冬氨酸殘基取代、138位的絲氨酸殘基缺失、和139位的天冬酰胺殘基被谷氨酰胺殘基取代的突變。4、權(quán)利要求l的抗原性多肽或其片段，其中所述氨基酸序列包含以下'、52位的亮氨酸殘基被谷氨酸殘基或天冬氨酸殘基取代；138位的絲氨酸殘基缺失；139位的天冬酰胺殘基被谷氨酰胺殘基取代；166位的精氨酸殘基被谷氨酸殘基或天冬氨酸殘基取代；184位的絲氨酸殘基被谷氨酸殘基或天冬氨酸殘基取代；185位的谷氨酸殘基被賴氨酸殘基、精氨酸殘基或組氨酸殘基取代；188位的絲氨酸殘基被谷氨酰胺殘基或天冬酰胺殘基取代；235位的甘氨酸殘基被精氨酸殘基、賴氨酸殘基或組氨酸殘基取代；237位的甘氨酸殘基被谷氨酰胺殘基或天冬酰胺殘基取代；和240位的組氨酸殘基被酪氮酸殘基取代。5、權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的抗原性多肽或其片段，其中所述HIV-1包膜蛋白選自由gpl20、gpl28、gpl40、gpl40TM、gpl45、gpl50、gpl60、及其等價(jià)物組成的組。6、權(quán)利要求1的抗原性多肽或其片段，其中所述HIV-1包膜蛋白是HIV-1CN54的gpl45，其具有SEQIDNO:2的氨基酸序列。7、一種衍生自HIV-1包膜蛋白的抗原性多肽或其片段，其中所述多肽或片段包含通過在SEQIDNO:2中引入突變而衍生自SEQIDNO:2的氨基酸序列，所述突變選自由以下突變組成的組42位的亮氨酸殘基被谷氨酸殘基取代；128位的絲氨酸殘基缺失；129位的天冬酰胺殘基被谷氨酰胺殘基取代；155位的精氨酸殘基被谷氨酸殘基取代；179位的絲氨酸殘基被谷氨酸殘基取代；180位的谷氨酸殘基被賴氨酸殘基取代；183位的絲氨酸殘基被谷氨酰胺殘基取代；230位的甘氨酸殘基被精氨酸殘基取代；232位的甘氨酸殘基被谷氨酰胺殘基取代；235位的組氨酸殘基被酪氨酸殘基取代；和上述突變的任意組合。8、權(quán)利要求7的抗原性多肽或其片段，其中所述多肽或片段至少包含所述42位的亮氨酸殘基被谷氨酸殘基取代的突變。9、權(quán)利要求7的抗原性多肽或其片段，其中所述多肽或片段至少包含所述42位的亮氨酸殘基被谷氨酸殘基取代、128位的絲氨酸殘基缺失、和129位的天冬酰胺殘基被谷氨酰胺殘基取代的突變。10、權(quán)利要求7的抗原性多肽或其片段，其中所述多肽或片段包含以下突變42位的亮氨酸殘基被谷氨酸殘基取代；128位的絲氨酸殘基缺失；129位的天冬酰胺殘基被谷氨酰胺殘基取代；155位的精氨酸殘基被谷氨酸殘基取代；179位的絲氨酸殘基被谷氨酸殘基取代；180位的谷氨酸殘基被賴氨酸殘基取代；183位的絲氨酸殘基被谷氨酰胺殘基取代；230位的甘氨酸殘基被精氨酸殘基取代；232位的甘氨酸殘基被谷氨酰胺殘基取代；和235位的組氨酸殘基被酪氨酸殘基取代。11、權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的抗原性多肽或其片段，其進(jìn)一步包括一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的取代、缺失或添加，且所述多肽或片段能夠誘導(dǎo)保護(hù)性的免疫應(yīng)答。12、權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的抗原性多肽或其片段，其還包含選自以下一組的修飾糖基化位點(diǎn)缺失或添加、環(huán)區(qū)刪除或重排、CFI區(qū)刪除、及其組合。13、一種多肽疫苗，其包含權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的抗原性多肽或其片段和藥用可接受的佐劑和/或載體。14、一種抗體，其特異性結(jié)合權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的抗原性多肽或其片段，且所述抗體與HIV-1的野生型包膜蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體相比具有更廣譜和更高的HIV-1病毒中和活性。15、權(quán)利要求14的抗體，其是多克隆抗體或者是單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。16、權(quán)利要求15的抗體，其中所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段選自完整免疫球蛋白分子；嵌合抗體；人源化抗體；SCpV;Fab片段；Fab，片段；F(ab，)2;FV;禾口二硫鍵連的Fv。17、一種分離的多核苷酸，其包含編碼權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的抗原性多肽或其片段的核苷酸序列。18、一種DNA構(gòu)建體，其包含可操作地連接于啟動(dòng)子的權(quán)利要求17的多核苷酸。19、權(quán)利要求18的DNA構(gòu)建體，其選自pDRVISV145MlR(CGMCCNo.2508)、pDRVISV145M2R(CGMCCNo.2509)、pDRVISV145M3R(CGMCCNo.2510)、pDRVISV145M4R(CGMCCNo.2511)、pD謂SV145M5R(CGMCCNo.2512)、pD腿SV1452M(CGMCCNo.2513)、和pDRVISV1455M(CGMCCNo.2514)。20、一種DNA疫苗，其包含權(quán)利要求18或19的DNA構(gòu)建體和藥用可接受的佐劑。21、一種重組病毒載體疫苗，其包含攜帶權(quán)利要求17的多核苷酸的重組病毒載體和藥用可接受的佐劑。22、權(quán)利要求21的重組病毒載體疫苗，其中所述重組病毒載體選自痘苗載體、腺病毒載體、腺病毒相關(guān)病毒載體、仙臺(tái)病毒載體、單純皰疹病毒載體、人乳頭瘤病毒載體、和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。23、權(quán)利要求21或22的重組病毒載體疫苗，其中所述重組病毒載體是復(fù)制型病毒載體。24、權(quán)利要求23的重組病毒載體疫苗，其中所述復(fù)制型病毒載體是復(fù)制型重組痘苗載體。25、權(quán)利要求24的重組病毒載體疫苗，其中所述復(fù)制型重組痘苗載體是復(fù)制型重組天壇株痘苗。26、一種重組細(xì)菌載體疫苗，其包含攜帶權(quán)利要求17的多核苷酸的重組細(xì)菌載體和藥用可接受的佐劑。27、一種預(yù)防或治療HIV-1病毒感染的方法，包括給有需要的個(gè)體施用權(quán)利要求13的多肽疫苗和/或權(quán)利要求20的DNA疫苗和/或權(quán)利要求21至25中任一項(xiàng)的重組病毒載體疫苗和/或權(quán)利要求26的重組細(xì)菌載體疫苗。28、一種預(yù)防或治療HIV-1病毒感染的方法，包括給有需要的個(gè)體施用權(quán)利要求14至16中任一項(xiàng)的抗體。全文摘要本發(fā)明提供通過參考馬傳染性貧血病毒減毒活疫苗的特征性氨基酸突變，運(yùn)用結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)技術(shù)的指導(dǎo)而構(gòu)建的HIV包膜蛋白的抗原性多肽、包含編碼所述多肽的多核苷酸的DNA構(gòu)建體和重組病毒載體、針對(duì)所述抗原性多肽的抗體、以及它們?cè)陬A(yù)防和治療HIV感染中的用途。本發(fā)明的抗原性多肽和疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度的廣譜性、持續(xù)性的抗HIV中和抗體。文檔編號(hào)A61P31/18GK101591379SQ20081009747公開日2009年12月2日申請(qǐng)日期2008年5月27日優(yōu)先權(quán)日2008年5月27日發(fā)明者劉連興,沈榮顯,邵一鳴申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心