專(zhuān)利名稱(chēng)：一種青霉素類(lèi)抗生素多殘留酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類(lèi)抗生素殘留檢測(cè)方法，更具體的說(shuō)是用酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)檢測(cè)動(dòng)物性食品中青霉素類(lèi)抗生素的多殘留，屬于免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景青霉素類(lèi)抗生素是屬于(3-內(nèi)酰胺類(lèi)的抗生素，是指化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有P-內(nèi)酰 胺環(huán)的一類(lèi)抗生素,其作用特點(diǎn)是能夠抑制細(xì)菌黏肽轉(zhuǎn)肽酶的活性，從而阻止細(xì) 菌細(xì)胞壁的合成，呈現(xiàn)殺菌活性。在畜類(lèi)動(dòng)物詞養(yǎng)中，青霉素類(lèi)抗生素廣泛用 于控制奶牛的乳房炎，治療動(dòng)物尿道、胃腸道和呼吸道感染等。但由于其使用 方法不當(dāng)或不遵守休藥期規(guī)定及非法及超量添加等原因，均可造成它在畜產(chǎn)品 中的殘留，給人類(lèi)健康帶來(lái)嚴(yán)重危害。該類(lèi)抗生素由于具有抗菌譜廣等優(yōu)點(diǎn)被 廣泛用于人畜疾病的防治?，F(xiàn)有的微生物檢測(cè)法和儀器檢測(cè)法很難實(shí)現(xiàn)對(duì)所有 青霉素類(lèi)抗生素進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、定量的檢測(cè)。青霉素類(lèi)抗生素種類(lèi)繁多，目 前為止，現(xiàn)有的微生物檢測(cè)法和儀器檢測(cè)法很難實(shí)現(xiàn)對(duì)所有青霉素類(lèi)抗生素進(jìn) 行快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)，有必要研究快速、靈敏免疫檢測(cè)技術(shù)。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種定量檢測(cè)動(dòng)物源食品中青霉素類(lèi)抗生素含量的酶 聯(lián)免疫檢測(cè)方法，在于彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，滿(mǎn)足對(duì)該種抗生素進(jìn)行快速篩選 的要求，提供一種快速、靈敏度高，檢測(cè)成本低廉的檢測(cè)動(dòng)物源食品中青霉素 類(lèi)抗生素的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法。本發(fā)明的技術(shù)方案 一種青霉素類(lèi)抗生素多殘留酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，利用合成的6-氨基青霉垸酸-BSA免疫原免疫得到多克隆抗體，以青霉素類(lèi)抗生素為 標(biāo)準(zhǔn)品，以6-氨基青霉烷酸與OVA的偶聯(lián)物作為包被抗原，建立動(dòng)物性食品中 的青霉素類(lèi)抗生素的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫方法；步驟為(1) 用碳酸鹽緩沖液將包被原梯度稀釋?zhuān)尤朊笜?biāo)板中，每孔100pL， 4'C 孵育過(guò)夜，然后用含0.1%明膠的上述碳酸鹽緩沖液作為封閉液，封閉2h;(2) 用PBS將青霉素類(lèi)抗生素稀釋成0.01、 0.1、 1、 2、 10、 100ng/mL系 列濃度，及處理好的樣品，分別加入到各自的酶標(biāo)孔中，加5(VL/孔；將多克 隆抗體以抗體稀釋液梯度稀釋?zhuān)缓竺靠准尤?(HiL稀釋好的多克隆抗體，于 37。C溫育lh，然后以PBST洗漆液洗滌3~5次；(3) 將辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔GAR-HRP用抗體稀釋液以 1:4000 1:5000進(jìn)行稀釋?zhuān)缓竺靠准尤?00fiL， 37""C作用lh后以PBST洗滌液洗滌3~5次；(4) 加入顯色液100pL， 37。C顯色15 30min;加入終止液2M硫酸溶 液，酶標(biāo)儀450nm測(cè)吸光值A(chǔ)450，與所作標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比算出待測(cè)樣品的青霉素 類(lèi)抗生素含量。配置顯色液A液配方為每100 mL水中加入0.933 g檸檬酸，3.68 g Na2HP(V 12H20， 18 (^L30%H2O2;B液配方為60mg四甲基聯(lián)苯胺溶于100mL乙二醇； 使用前將A液與B液以5:1體積比混合。動(dòng)物性食品的樣品前處理方法為牛奶樣品脫脂牛奶直接檢測(cè)，對(duì)于全 酯牛奶則離心去除脂肪后進(jìn)行檢測(cè)；動(dòng)物組織樣品將動(dòng)物組織樣品用勻漿器搗碎，均質(zhì)，取適量均質(zhì)后樣品加入O.OIM、 pH7.4 PBS萃取液，3-5。C低溫離 心，取上清液稀釋后用于ELISA測(cè)定。 更詳細(xì)的步驟為1) 配制磷酸鹽(PBS)緩沖液Na2HP04 12H20 3.12 gNaH2P04 2H20 1.76 g加超純水稀釋至1000 mL;2) 配制碳酸鹽(CBS)緩沖溶液(0.05M) pH9.6Na2C03 1.59g NaHC03 2.93g 加超純水稀釋至1000 mL。3) 配置PBST溶液含0.05% Tween—20的PBS溶液。4) 配制封閉液含0.1Q/^明膠的碳酸鹽緩沖液。5) 配制抗體稀釋液含0.1c/。明膠的PBST溶液。6) 顯色液A液0.933 g檸檬酸，3.68 gNa2HP04'12H20， 18 ^30%1^02用超純水定 容至100 mL;B液60 mg3，3^5,5C四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶于100 mL乙二醇中； 使用前將A液與B液以5:1體積比混合。7) 終止液2M的H2SQ4。間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)方法的步驟如下預(yù)先將青霉素類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品配制成lmg/mL的工作母液，在4'C保存待用。配制 PBS溶液(O. 01mol/L，pH7.4，0.15mol/LNaCl)，以此為基礎(chǔ)配制系列反應(yīng)液，用 以稀釋競(jìng)爭(zhēng)物標(biāo)準(zhǔn)液。a、 包被用設(shè)定濃度的包被原包被酶聯(lián)反應(yīng)板，100jxL/ L， 4'C過(guò)夜。b、 洗滌:用PBST洗滌反應(yīng)板三次，每次3min,200i^L/孔，然后甩干反應(yīng)板。c、 封閉含0.1。/。明膠的CBS， 200pL/孔，37。C封閉2h。d、 洗滌同b。e、 競(jìng)爭(zhēng)用PBS將青霉素類(lèi)抗生素稀釋成O.Ol、 0.1、 1、 2、 10、 100ng/mL系列濃度，及處理好的樣品，分別加入到各自的酶標(biāo)孔中，另設(shè)一個(gè)PBST空白 對(duì)照，50pL/孔。然后每孔加入50iiL稀釋好的抗血清，于37"溫育lh。f、 洗滌:同b。g、 加酶標(biāo)二抗(羊抗兔GAR-HRP， 1:5000), 100pL/孔，37C反應(yīng)lh。h、 洗漆同b。i、 顯色加顯色液10(VL/孔，顯色15-30min。 j、終止加終止液IOOiiL/孔。k、測(cè)定用酶標(biāo)儀檢測(cè)A45Cnm，與所作標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比算出待測(cè)樣品的青霉素類(lèi)抗生素含量。本發(fā)明的有益效果以6-氨基青霉烷酸(6-APA)與OVA的偶聯(lián)物作為包 被抗原，建立了動(dòng)物性食品中青霉素類(lèi)抗生素的間接ELISA方法，為青霉素類(lèi) 抗生素在動(dòng)物性食品中的殘留檢測(cè)提供了快速高效的檢測(cè)手段，由于采用的是 多克隆抗體，費(fèi)用較低并且穩(wěn)定性和重復(fù)性較好。


圖1氨芐青霉素的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。 具體實(shí)施方案以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。一 、 儀器TGL — 40B臺(tái)式低速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；KFLO純水機(jī) 佛隆公司；ZD-9556水平搖床 太倉(cāng)科教器材廠；Costar96孔8><12可拆酶標(biāo)板 上海吉泰生物科技有限公司；MuLtiska Mks酶標(biāo)儀 Thermo Labsystems公司；可調(diào)i式移》夜器 Thermo Labsy stems公司；FA25勻質(zhì)器 Fluka公司； 渦旋混合器 上海滬西儀器分析廠。二、試齊!J:辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔GAR-HRP康成生物工程公司； 四甲基聯(lián)苯胺(TMB) 華美生物工程公司；其他試劑均為分析純?cè)噭６?步驟1.免疫原和包被原的合成合成免疫原和包被原(6-APA的半抗原與牛血清白蛋白BSA或6-APA的半 抗原與卵清蛋白OVA偶聯(lián)物)用MBS法偶聯(lián)，具體歩驟如下(1) 6-氨基青霉垸酸的?；?0|imol 6-APA溶于3mL PBS(0.05 mol/L,pH7.0)，加入到含有70jimolMBS (22mg)、 2mL四氫呋喃的25mL燒杯中?；旌弦涸?7。C下反應(yīng)3小時(shí)，冷凍 干燥，得到白色固體，用乙醚和二氯甲垸(體積比2:1)混合溶劑洗滌五次，洗 去未反應(yīng)的MBS。MBS的監(jiān)測(cè)硅膠薄層板的制作，稱(chēng)取硅膠12g，溶解在40mL 0.5%質(zhì)量 濃度的羥甲基纖維素鈉溶液中，用玻璃棒充分?jǐn)嚢璩珊隣?，超聲波振蕩l分鐘， 均勻涂布在玻璃板上，置于陰涼處自然干燥后，放入105。C的烘箱中活化lh， 最后放入干燥箱中備用。薄層層析法檢測(cè)硅膠薄板下端lcm處作一水平線，吸取反應(yīng)液lpL點(diǎn)于 線上，點(diǎn)樣結(jié)束后吹干，將薄板放入層析缸中，層析液為乙醚:二氯甲烷，體積 比為2:1，展開(kāi)至薄板3/4處，取板，吹干溶劑。將薄板置于紫外分析儀中，在 254nm波長(zhǎng)觀察，在Rf為0.95處觀察不到顯色點(diǎn)作為洗滌終點(diǎn)。(2) BSA或OVA的巰基化稱(chēng)取2-亞氨基硫烷13.6mg溶于lmL的0.05mol/L PBS (pH8.0,含有0.01 mol/LEDTA)中，加入到5mL含有67mg牛血清蛋白(或45mgOVA)的0.05mol/L 的PBS (pH8.0，含有O.Ol mol/LEDTA)溶液中，在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。(3) 6-氨基青霉烷酸與蛋白的偶聯(lián)制備A液巰基化的蛋白質(zhì)溶液用0.2mol/LNaH2PO4調(diào)pH至7.2，低溫保存。制備B液?；?-氨基青霉烷酸溶于2mL的0.05mol/L PBS (pH7.2)中，低溫保存。A液加入到B液中室溫反應(yīng)2小時(shí)，即得6-APA的BSA或OVA偶聯(lián)物混合液。將偶聯(lián)物混合液移入透析袋中，用2x2L的0.01M的PBS溶液和2x2L的去 離子水透析3天。得偶聯(lián)物，備用。6-APA- BSA偶聯(lián)物作為免疫原，6-APA- OVA 偶聯(lián)物作為包被原。2. 抗血清的制備用6-APA-BSA偶聯(lián)物作為免疫原免疫獲得多克隆抗體。3. ELISA反應(yīng)過(guò)程1) 將包被原用包被緩沖液作系列稀釋包被96孔酶標(biāo)板，100 |aL/ L，于4 °C 冰箱過(guò)夜。次日取出酶標(biāo)板回至室溫，每孔注入200pLPBST溶液，搖床上振 蕩3min，用力甩掉洗滌液，在吸水紙上拍干，繼續(xù)洗滌2次。以下洗滌方 法相同。2) 充分洗滌后，用封閉緩沖液封閉酶標(biāo)板，200 pL/孔，于37'C溫育箱 內(nèi)溫育2h后取出烘干待用。3) 將陽(yáng)性血清系列稀釋對(duì)應(yīng)加入到酶標(biāo)板的前7行列，第8行加入陰性血 清，100pL/孔，37匸孵育lh后洗滌、拍干。4) 每孔加入100 |iL， 1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG， 37 。C孵育1 h 后洗滌、拍干。5) 每孔加入100 pL顯色液(TMB與底物液比例為1:5)，暗處37 。C反應(yīng)15 min，取出后每孔加入100 終止液(2 mol/L的硫酸)，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值A(chǔ)45()。樣品提取方法牛奶樣品脫脂牛奶直接檢測(cè)，對(duì)于全酯牛奶則離心出去脂肪后進(jìn)行檢測(cè)。 動(dòng)物組織樣品將樣品用勻漿器搗碎，均質(zhì)，取適量均質(zhì)后樣品加入萃取液， 3-5TM氐溫離心，取上清液用0.01MpH7.4的PBS稀釋用于ELISA測(cè)定。靈敏度是所得90%最大吸光值所對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，即IC9Q為0.0126 ng/mL 。
權(quán)利要求
1、一種青霉素類(lèi)抗生素多殘留酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，其特征在于利用合成的6-氨基青霉烷酸免疫原免疫得到多克隆抗體，以青霉素類(lèi)抗生素為標(biāo)準(zhǔn)品，以6-氨基青霉烷酸與OVA的偶聯(lián)物作為包被抗原，建立動(dòng)物性食品中的青霉素類(lèi)抗生素的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫方法；步驟如下(1)用碳酸鹽緩沖液將包被原梯度稀釋?zhuān)尤朊笜?biāo)板中，每孔100μL，4℃孵育過(guò)夜，然后用含0.1％明膠的上述碳酸鹽緩沖液作為封閉液，封閉2h；(2)用PBS將青霉素類(lèi)抗生素稀釋成0.01、0.1、1、2、10、100ng/mL系列濃度，及處理好的樣品，分別加入到各自的酶標(biāo)孔中，加50μL/孔；將多克隆抗體以抗體稀釋液梯度稀釋?zhuān)缓竺靠准尤?0μL稀釋好的多克隆抗體，于37℃溫育1h，然后以PBST洗滌液洗滌3～5次；(3)將辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔GAR-HRP用抗體稀釋液以1∶4000～1∶5000進(jìn)行稀釋?zhuān)缓竺靠准尤?00μL，37℃作用1h后以PBST洗滌液洗滌3～5次；(4)加入顯色液100μL，37℃顯色15～30min；加入終止液2M硫酸溶液，酶標(biāo)儀450nm測(cè)吸光值A(chǔ)450，與所作標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比算出待測(cè)樣品的青霉素類(lèi)抗生素含量。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的青霉素類(lèi)抗生素多殘留酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，其特征在于配置顯色液A液配方為每100 mL水中加入0.933 g檸檬酸，3.68 gNa2HP(V12H20， 18 ^iL30%H2O2;B液配方為60mg四甲基聯(lián)苯胺溶于100mL乙二醇； 使用前將A液與B液以5:1體積比混合。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的青霉素類(lèi)抗生素多殘留酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，其特 征在于動(dòng)物性食品的樣品前處理方法為牛奶樣品脫脂牛奶直接檢測(cè)，對(duì)于 全酯牛奶則離心去除脂肪后進(jìn)行檢測(cè)；動(dòng)物組織樣品將動(dòng)物組織樣品用勻漿 器搗碎，均質(zhì)，取適量均質(zhì)后樣品加入O.OIM、 pH7.4 PBS萃取液，3-5'C低溫 離心，取上清液稀釋后用于ELISA測(cè)定。
全文摘要
一種青霉素類(lèi)抗生素多殘留酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，屬于免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用6-氨基青霉烷酸合成的免疫原免疫得到多克隆抗體，以青霉素類(lèi)抗生素為標(biāo)準(zhǔn)品，以6-氨基青霉烷酸與OVA的偶聯(lián)物作為包被抗原，建立了動(dòng)物性食品中青霉素類(lèi)抗生素的間接ELISA方法。本發(fā)明為青霉素類(lèi)抗生素在動(dòng)物性食品中的殘留檢測(cè)提供了快速高效的檢測(cè)手段，由于采用的是多克隆抗體，費(fèi)用較低并且穩(wěn)定性和重復(fù)性較好；具有樣品前處理簡(jiǎn)單，靈敏度高，精確度高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/543GK101403750SQ20081019552
公開(kāi)日2009年4月8日 申請(qǐng)日期2008年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月16日
發(fā)明者彭池方, 徐麗廣, 李灼坤, 胥傳來(lái), 偉 馬 申請(qǐng)人:江南大學(xué)