專利名稱：雞貧血病毒疫苗及診斷方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼小雞貧血病毒相關(guān)多肽的核酸序列，一種含上述核酸序列的重組核酸分子，一種含所述核酸序列的載體病毒，一種用上述核酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，一種雞貧血病毒的相關(guān)多肽和與之發(fā)生反應(yīng)的抗體，一種雞貧血病毒的突變體和一種抗雞貧血病毒傳染的疫苗。
本發(fā)明也涉及一種免疫化學(xué)試劑和一套含所述試劑的檢測(cè)藥盒。
小雞貧血病毒(CAV)在小雞中引起傳染性貧血。盡管CAV顯而易見地能傳染所有年齡的雞，但是據(jù)報(bào)道只在年輕的雞中有發(fā)病的跡象。CAV也是免疫抑制性的。在正常健康的雞中，胸腺在年輕的雞中產(chǎn)生T-細(xì)胞，法氏腔上囊產(chǎn)生B-細(xì)胞，骨髓除產(chǎn)生紅細(xì)胞外，還產(chǎn)生白細(xì)胞。當(dāng)雞受到CAV感染時(shí)，上述細(xì)胞發(fā)生毀壞。在7-14天內(nèi)會(huì)發(fā)生機(jī)能衰退，貧血和免疫抑制。特別是幾周齡的小雞會(huì)表現(xiàn)嚴(yán)重的貧血和免疫抑制。在自然感染的小雞群中死亡率一般達(dá)到30%，并且幸存的通常在感染后經(jīng)24-32天完全恢復(fù)。
二次感染，特別是病毒和細(xì)菌感染是常見的，并且加重了由CAV引起的癥狀，在這種情況下的死亡率上升超過30%。較大的雞可以被感染但不會(huì)發(fā)病，但是這些未表現(xiàn)出的臨床跡象被認(rèn)為是小雞功能活動(dòng)下降的原因。
血清學(xué)資料表明，90%以上的測(cè)試種雞群中當(dāng)時(shí)或曾經(jīng)出現(xiàn)循環(huán)的CAV抗體，由此證明感染上了病毒，CAV的普遍存在已有充分的報(bào)告。
顯而易見地，能夠橫向地和垂直地(從母體到卵中小雞)傳播CAV。病毒顆粒是很穩(wěn)定的，并且不被各種化合物，如氯仿或加熱到60℃持續(xù)30分鐘所破壞。已經(jīng)描述CAV是一種直徑為24nm的裸露的，球形病毒，并包含一個(gè)約2300bp的環(huán)狀單鏈DNA基因組。
由于CAV的普遍存在與幼齡雞的死亡率和較大雞的功能活動(dòng)下降有關(guān)，因此需要一種安全有效的疫苗來防止CAV感染或發(fā)病。
傳統(tǒng)疫苗包括用化學(xué)方法失活的病毒疫苗或修飾過的活病毒疫苗。但是，失活的疫苗需要另外進(jìn)行免疫接種，不利之處是含有佐劑，生產(chǎn)費(fèi)用昂貴，并且使用麻煩。進(jìn)一步說，一些感染性的病毒顆粒在失活過種中可能幸存，給動(dòng)物服用后可以引起疾病。
通常，減弱的活病毒疫苗是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兛杉せ畛Ｒ泽w液和細(xì)胞反應(yīng)為基礎(chǔ)的免疫應(yīng)答。到目前為止，上述的以CAV菌株為基礎(chǔ)的疫苗只能通過在組織培養(yǎng)基中有毒性菌株的連續(xù)傳代培養(yǎng)制備。但是，由于這種處理將不可控制的突變引入病毒基因組，而導(dǎo)致大量病毒顆粒在其毒性和免疫特性方面的異源性。另外，公知上述傳統(tǒng)的減弱活病毒疫苗能夠恢復(fù)其毒性，從而導(dǎo)致接種的動(dòng)物患病，并可能將病原體傳播給其它動(dòng)物?？梢愿鶕?jù)重組DNA技術(shù)構(gòu)建一種改進(jìn)的疫苗，這種疫苗只包含能激發(fā)抗CAV病原體免疫應(yīng)答所必需和相關(guān)的CAV致免疫性物質(zhì)，或編碼所述物質(zhì)的遺傳信息，并且沒有活的或失活疫苗的上述缺點(diǎn)。
根據(jù)本發(fā)明，提供一種編碼CAV相關(guān)多肽的核酸序列，它能用于家禽抗CAV免疫疫苗的制備以及用于診斷測(cè)試品的制備。
本文中所用的“核酸序列”是指任何長度的聚合形式的核苷酸，包括核糖核酸序列和脫氧核糖核酸序列。在理論上，該術(shù)語涉及分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，這一術(shù)語包括雙鏈的和單鏈DNA，也包括雙鏈和單鏈RNA，以及其修飾物。
通常，術(shù)語“多肽”是指一有生物活性的氨基酸分子鏈，而不是指產(chǎn)物的特定長度，如果需要這種多肽可以在體內(nèi)或體外被修飾，例如通過糖基化作用，酰胺化作用，羧化作用或磷酸化作用進(jìn)行修飾;因此，除了其它的以外，特別是多肽，單肽和蛋白質(zhì)都包括在其中。
特別是，根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)識(shí)別和特征化了三個(gè)核酸序列，這三個(gè)序列各含有一個(gè)編碼區(qū)，它能編碼分別被命名為ORF1-3的CAV相關(guān)多肽。
編碼ORF-1多肽的區(qū)域位于從核苷酸876到2225(SEQ ID NO1，圖2)并編碼長度為約449個(gè)氨基酸的多肽。由ORF-1基因編碼的多肽的氨基酸序列表示在SEQ ID NO2，在核苷酸1657和2185探測(cè)到一些序列的異源。這些序列變化導(dǎo)致保留氨基酸改變，因此不認(rèn)為能顯著地影響多肽的生物活性。
編碼ORF-2多肽的區(qū)域位于基因組第二閱讀框架上從核苷酸101到502(SEQ ID NO1，圖2)，并編碼長度為約133個(gè)氨基酸的多肽。由ORF-2基因編碼的多肽的氨基酸序列以SEQ ID NO3表示。
編碼ORF-3多肽的區(qū)域位于基因組第三閱讀框架上從核苷酸403到1053(SEQ ID NO1圖2)，并編碼長度為約216個(gè)氨基酸的多肽，由ORF-3基因編碼的多肽的氨基酸序列以SEQ ID NO4表示。
因此，本發(fā)明提供了一種編碼ORF-1多肽，ORF-2多肽或ORF-3多肽的核酸序列，上述三種多肽分別有以SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO4表示的氨基酸序列。
在現(xiàn)有技術(shù)中已知，通常不是基因組的每個(gè)部分都存在于被轉(zhuǎn)錄的成熟的mRNA中?？梢栽隗w內(nèi)通過RNA拼接的方法將數(shù)個(gè)ORFS的片斷結(jié)合在一起得到成熟的有生物功能的蛋白質(zhì)。在準(zhǔn)備轉(zhuǎn)錄的成熟mRNA產(chǎn)生之前，可能在RNA水平進(jìn)行修飾的例子是在小病毒(Parvoviridea)中對(duì)RNA轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行處理。如由Berns等人(J.Gen.Virol.68，601-614，1987)綜述的，小病毒(Parvoviridea)在其結(jié)構(gòu)方面與CAV相似，都是很小的，無被膜的，單鏈的DNA病毒。需要對(duì)RNA進(jìn)行處理，以便對(duì)由數(shù)個(gè)翻譯框架中的數(shù)個(gè)ORFs所編碼的細(xì)小病毒殼蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行裝配。
為了繪制基因組轉(zhuǎn)錄區(qū)域的位置圖譜，要使用數(shù)個(gè)常規(guī)技術(shù)(如Maniatis等人所述，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，U.S.A，1989)，例如制備分離CAV mRNA的cDNA，在體外操作CAV mRNA的翻譯，轉(zhuǎn)錄定位的幾種方法，象S1，核酸酶保護(hù)測(cè)定試驗(yàn)以及引物延長分析。
這些技術(shù)使CAV基因組的轉(zhuǎn)錄圖譜的構(gòu)建成為可能，并使人們對(duì)于轉(zhuǎn)錄的相對(duì)豐度有所了解，這種方法能夠?qū)⒕幋aCAV相關(guān)多肽的實(shí)際基因定位。
所以，含有從不同的ORFs衍生的核苷酸序列的核酸序列也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
編碼與所述ORF-1，ORF-2或ORF-3多肽有相同免疫學(xué)特性的該多肽功能等同物核酸序列也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
應(yīng)當(dāng)指出的是對(duì)于本文所包括的從26P4CAV菌株得到的特定ORF1-3多肽來說，因雞貧血病毒的菌株和個(gè)體病毒不同而有變化。這些變異可以通過在全部序列中一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的差異或通過在所述序列中一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的缺失，取代，插入，倒位或增加證明。已經(jīng)對(duì)被認(rèn)為基本上不改變生物和免疫活性的氨基酸取代有所描述。在相關(guān)氨基的之間的取代或在進(jìn)化中經(jīng)常發(fā)生的取代，除其他取代外，特別是Ser/Ala，Ser/Gly，Asp/Gly，Asp/Asn，Ile/Val(見Dayhof，M.D.，Atlas of Protein Sequence and structure，Nat.Biomed.Res.Found.，Washington D.C.，1978，Vol.5，Suppl.3)。以這一資料為基礎(chǔ)，Lipman和Pearson建立了一種迅速而敏感的蛋白質(zhì)比較方法(Science 227，1435-1441，1985)和測(cè)定在同源多肽間功能相似的方法。編碼這種同源的功能等同物的核酸序列包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此外，人們還可以使用重組DNA技術(shù)制備編碼這種各種功能等同物的核酸序列。
根據(jù)本發(fā)明可以從CAV菌株如Cuxhaven-1，TK-5803或Gifu-1的分離物中得到核酸序列。
根據(jù)以SEQ ID NO1-4提供的資料，可以使本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員分離和識(shí)別那些能編碼上述與本文公開的ORF1-8多肽有相應(yīng)免疫特性的各種功能等同物的核酸序列。為了達(dá)到上述目的，通常使用Southern印跡分析技術(shù)或菌落雜交(Experiments in Molecular Biology ed，R.J.Slater，Clifton，U.S.A.，1986;Siger-Sam，J.et al，Proc.Natl.Acad.Sci.80，802-806，1983;Maniatis T.et al.，Molecular Cloning，A laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，USA，1989)。例如，將限制酶消化的得自特定CAV菌株的DNA進(jìn)行電泳，之后，將其轉(zhuǎn)移或“點(diǎn)樣”在一張硝化纖維濾紙上。這樣在能夠使探針與濾紙上的同源DNA序列雜交的特定鹽濃度和溫度條件，通過在濾紙上與確定的標(biāo)記DNA片段或“探針”雜交則能夠認(rèn)別CAV相關(guān)序列。其中所說的探針是一種含有以SEQ ID NO2-4所示氨基酸序列推斷的序列的合成寡聚核苷酸。沖洗濾紙后，可以通過放射自顯影技術(shù)檢測(cè)出已雜交的物質(zhì)?，F(xiàn)在則能夠從瓊脂糖凝膠上洗脫相應(yīng)的DNA限制片段，并用來合成與在SEQ ID NO2-4中公開的多肽功能上等同的多肽。
例如，pCA1，pCA3或其片段應(yīng)該包含一與CAV的其它菌株基因組相比高度保留的序列結(jié)構(gòu)，并被用在雜交實(shí)驗(yàn)中。以這種方法獲得有關(guān)動(dòng)物或特定物質(zhì)的CAV感染情況的定量及定性資料。所要檢查的樣品是血液(特別是淋巴細(xì)胞)，器官組織(如肝，腎)，胚勻漿，或與這些樣品中的一種保溫培養(yǎng)的MDCC-MSB1細(xì)胞(Akigama等人，Biken J.17，105-117，1974)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Berger and Kimmel，eds;Methods in Enzymology 152，181，1987)做粗DNA制品。在硝化纖維膜上印跡每種樣品的系列稀釋液，并用標(biāo)記的pCA1，pCA3或其片斷探測(cè)(Maniatis等人，1989，ibid)。探測(cè)后，通過與由同樣實(shí)驗(yàn)中的標(biāo)準(zhǔn)量CAV DAN系列稀釋液得到的信號(hào)相比進(jìn)行信號(hào)定量，用通常不超過每ml CAV DNA2皮摩爾的檢測(cè)限度檢測(cè)，那些沒有(可檢測(cè)出的)信號(hào)標(biāo)志的是負(fù)樣品。
用另一種方法，CAV相關(guān)的DNA可以克隆到λgt11噬菌體中并在細(xì)菌宿主中表達(dá)。然后，可以用抗純ORF1-3多肽的多克隆血清篩選重組噬菌體，確定變異多肽的相應(yīng)免疫區(qū)域的存在。本文所用的抗ORF1-3的多克隆血清的生產(chǎn)在下文描述。
正如本領(lǐng)域中所公知的，遺傳密碼的簡(jiǎn)并可以使一個(gè)密碼子中的堿基發(fā)生取代，產(chǎn)生另一個(gè)密碼子，但它仍編碼同一氨基酸，例如，谷氨酸的密碼子是GAT和GAA。結(jié)果，很清楚，為了表達(dá)一種帶有SEQ ID NO2-4所示氨基酸序列的多肽，可以使一種具有與所述的SEQ ID所示核酸序列不同的這種可變性密碼子組成的衍生核酸序列(功能等同物)。
根據(jù)本發(fā)明，提供一種含有CAV基因組或其片段的核酸序列。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的核酸序列的特征是，該序列至少包含SEQ ID NO1表示的一部分脫氧核糖核酸序列。
所說脫氧核糖核酸序列的特別有用片段是那些編碼多肽的片段。
特別是，本發(fā)明包括一種含有至少部分以SEQ ID NO1表示的定位在CAV基因組位置876到2225，101到502或403到1053的ORF的核酸序列。
另外，定位在與核苷酸1到870相連的病毒基因組中的2230到2298位的核苷酸包含一控制順序，當(dāng)異源基因置于該順序控制之下時(shí)，該順序可以用來控制異源基因的表達(dá)。進(jìn)一步說，本發(fā)明也包括編碼ORF1-3多肽或其上述的功能等同物的核酸序列片段。
本文中所用的術(shù)語“片段”意思是含有本發(fā)明的一個(gè)核酸序列或多肽的亞序列的DNA或氨基酸序列。所述片段是編碼一種多肽，該多肽具有CAV相關(guān)的多肽的一個(gè)或多個(gè)免疫反應(yīng)性和/或抗原決定簇，也即有一個(gè)或多個(gè)能在小雞中激發(fā)免疫應(yīng)答和/或能夠特異地結(jié)合到互補(bǔ)抗體上的抗原決定簇。測(cè)定有用多肽片段的方法在下文描述。除了其它方法外，還可以通過前體分子的酶切割來生產(chǎn)片段，對(duì)DNA用限制性核酸內(nèi)切酶而對(duì)多肽則使用蛋白酶。其它方法包括片段的化學(xué)合成法或者通過DNA片段的多肽片段表達(dá)。
只要ORF-1，OFR-2或ORF-3多肽的免疫特性在本質(zhì)上保持不變，則產(chǎn)生ORF1-3多肽的這種功能等同物的全部修飾物都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明，一種核酸序列還含有在體外合成的或者經(jīng)例如pCR技術(shù)得到的核酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的一種核酸序列能夠連接到在自然界中與之不相聯(lián)系或連接的各種能有效復(fù)制的DNA序列上，該DNA序列還可以包含編碼融合蛋白序列，如B-半乳糖苷酶的部分DNA，得到一種能用于轉(zhuǎn)化合適宿主的所謂重組核酸分子。上述的雜交DNA分子優(yōu)選地得自，如質(zhì)粒，或來源于噬菌體、粘性質(zhì)?；虿《局械暮怂嵝蛄?，能夠用于克隆本發(fā)明的核酸序列的特異性載體在本領(lǐng)域中是已知的，并包括特別是質(zhì)粒載體如PBR322，各種pUC，pGEM和Bluescript質(zhì)粒，噬菌體，如λgt-Wes-λB，Charon 28及M13衍生的噬菌體，或者病毒載體例如SV40，腺病毒或多形瘤病毒(也見Rodriquez，R.L.和D.T.Denhardt，ed，VectorA Survey of molecular cloning vectors and their uses，Butterworths，1988;Lenstra J.A.et al，Arch.Virol.110 1-24 1990)。
用于構(gòu)建本發(fā)明的重組核酸分子的方法對(duì)于本領(lǐng)域的普通熟練技術(shù)人員是已知的，并且，特別是在Maniatis，T.等人發(fā)表的文章中有記載(Molecular Cloning A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory 1982)。例如，當(dāng)用與制備互補(bǔ)DNA末端所用的相同限制酶切割基因和所需的克隆載體時(shí)，就很容易插入到一個(gè)克隆載體中。
或者說，修飾限制性位點(diǎn)產(chǎn)生平整末端是必需的，要么通過消化單鏈DNA，要么通過在單鏈末端用一種適當(dāng)?shù)腄NA聚合酶填平產(chǎn)生。隨后，用一種酶如T4DNA連接酶可以完成平整末端連接。
如果需要，通過將連接接頭連接到DNA末端上可以產(chǎn)生任何限制性位點(diǎn)。上述連接接頭可以含有編碼限制性位點(diǎn)序列的特異性寡核苷酸序列。也可以通過同聚物加尾修飾限制酶切割的載體和核酸序列。
在本文所用的“轉(zhuǎn)化”是指不論使用何種方法，如直接加入或轉(zhuǎn)導(dǎo)，將異源核酸序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，異源核酸序列也可以結(jié)合到宿主基因組中。如果需要，重組DNA分子可裝有與所說的宿主相容的控制序列，該序列能調(diào)節(jié)插入的核酸序列的表達(dá)。
本發(fā)明的優(yōu)選重組核酸分子包含一個(gè)或更多的可以用于篩選所需的轉(zhuǎn)化體的標(biāo)記活性成份，如pBR322中的抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素成份，pUC8中的抗氨芐青霉素成份和β-半乳糖苷酶活性成分。
合適的宿主細(xì)胞是一種能夠被編碼一種多肽的核酸序列或者含有上述核酸序列的重組核酸分子所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，如果需要該細(xì)胞可以用來表達(dá)由所述核酸序列編碼的多肽，宿主細(xì)胞可以是原核的，如細(xì)菌，如大腸桿菌，枯草芽孢桿菌和假單孢桿菌屬;或者真核的，如酵母，如啤酒酵母或較高的真核細(xì)胞，如昆蟲、植物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括Hela細(xì)胞和中國倉鼠(CHO)細(xì)胞。昆蟲細(xì)胞包括Spodoptera.frugiperda的Sf9細(xì)胞系(Luckow et al。Bio-teehnology 6，47-55 1988)。關(guān)于本發(fā)明的核酸序列在真核克隆系統(tǒng)中的克隆和表達(dá)的資料見Esser，K.等人(Plasmids of Eukaryotes Spring-verlag，1986)。
為獲得一定量的CAV編碼的多肽，可以在象桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(BVES)類似的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)CAV基因組或其片段。在此系統(tǒng)中，象Spodoptera frugiperda(sfIPLB-sf21)細(xì)胞這樣的昆蟲細(xì)胞可以在細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，以用作桿狀病毒，如Autographa califorica核多角體病毒(AcNPV)的宿主。AcNPV中的一些基因被高水平的表達(dá)，但對(duì)病毒感染環(huán)來說并不是必需的。這些基因是轉(zhuǎn)染細(xì)胞中桿狀一轉(zhuǎn)換質(zhì)粒如PAcAS3和野生型(wt)AcNPV DNA之間同源重組的靶目標(biāo)。在pAcAS3中(J.Vlak等人，Virology 179，P312-320，1990)異源基因是插入到p10啟動(dòng)子的下游以代替非必需的p10基因。被作用于重組過程的wt AcNPV的序列包圍。為了便于重組體的篩選，pAcAS3也包含Lac Z基因，致使當(dāng)X-半乳糖加到介質(zhì)上時(shí)，重組斑變蘭。
特別是，用rul消化從MSB1感染細(xì)胞中分離的CAV基因組DNA。
我們將BamHI人工接頭連到2.3kb的分子末端，并且將它再連到BamHI消化的、脫磷酸的pAcAS3質(zhì)粒中。我們用新構(gòu)建的pAcAS3轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞挑選出單個(gè)菌落，測(cè)試并培養(yǎng)到100ml。我們通過CsCl梯度密度離心分離純化質(zhì)粒DNA，并以1μg/ml的濃度在TE緩沖液中于4℃保存純化的DNA。我們用在100μl水中的2μgwt AcNPV和30μg的Lipofectin試劑(BRL，Bethesda，Maryland，USA)與10μg的pAcA3結(jié)合。在一個(gè)裝有5ml無血清的培養(yǎng)基的6cmφ培養(yǎng)盤中，向此混合物中加入5×106個(gè)sf21細(xì)胞。在37℃培養(yǎng)3小時(shí)后，加入新鮮培養(yǎng)基，并在37℃培養(yǎng)。次日，用1.5%的低熔瓊脂糖在培養(yǎng)基中復(fù)蓋細(xì)胞。并在37℃培養(yǎng)5天。加入新的瓊脂糖，使X-半乳糖的最后濃度為200μg/ml。在重組病毒的原料被生產(chǎn)前，蘭斑塊須經(jīng)三次斑塊純化。
篩選感染細(xì)胞并由此培養(yǎng)上清液，以通過Western印跡法用重組的桿狀病毒進(jìn)行重組CAV多肽的表達(dá)。選擇重組CAV多肽表達(dá)的最高水平的斑塊，和/或在Weste印跡試驗(yàn)中最易認(rèn)別的多肽，以生產(chǎn)用于制備疫苗的CAV多肽。
一般地說最好選用原核生物用于構(gòu)建本發(fā)明所用載體過程中DNA序列的克隆。例如，大腸桿菌K12是最有用的。其它可用的微生物菌株包括E.coli菌株，例如DH5α或TM101。
為了進(jìn)行表達(dá)，將本發(fā)明的核酸序列人工操作連接到表達(dá)控制序列上。上述控制序列可以含有啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，操縱子，誘導(dǎo)物，核糖體結(jié)合位點(diǎn)等。
當(dāng)宿主細(xì)胞是細(xì)菌時(shí)，有代表性的有用表達(dá)控制序列包括Trp啟動(dòng)子和操縱子(Goeddel，等人，Nucl.Acids Res.84057，1980);Lac啟動(dòng)子和操縱子(chang等人，Nature 275，615，1978);外膜蛋白啟動(dòng)子(Nakamura，K.和Inouge，M.，EMBOJ，1，771-775，1982);噬菌體λ啟動(dòng)子和操縱子(Remut，E.等人，Nucl.Acid Res.11 4677-4688，1983);α-淀粉酶(B.Subtilis)啟動(dòng)子和操縱子，終止序列和其他與選擇的宿主細(xì)胞相容的表達(dá)增強(qiáng)和控制序列。當(dāng)宿主細(xì)胞是酵母時(shí)，有代表性的有用表達(dá)控制序列包括，如α-接合因子。對(duì)于昆蟲細(xì)胞可用桿狀病毒的多角蛋白(polyhedin)或p10啟動(dòng)子(smith，G.E.等人，Mol.Cell.Biol.3，2156-65，1983)。當(dāng)宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，有代表性的有用表達(dá)控制序列包括，如SV-40啟動(dòng)子(Berman，P.W.等人，Science 222 524-527，1983)或如金屬硫因(metallothionein)啟動(dòng)子(Brinster，R.L.，Nature 296，39-42 1982)或熱休克啟動(dòng)子(Voellmy et al Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82 4949-53，1985)。另外，也可以使用CAV中的表達(dá)控制序列，特別是那些調(diào)節(jié)ORF1-3表達(dá)的控制序列，對(duì)于最大程度的基因表達(dá)，也參見Roberts和Lauer的文章(Methods in Enzymology 68，473，1979)。
本發(fā)明還包括一種表現(xiàn)出CAV相關(guān)抗原之免疫特性的多肽，也即，該多肽含有一種或多種CAV相關(guān)抗原的免疫反應(yīng)性和/或抗原決定簇，本質(zhì)上與整個(gè)病毒或其它通常聯(lián)系在一起的蛋白質(zhì)是游離的。
尤其是，本發(fā)明提供一些含有至少部分ORF-1，ORF-2或者ORF-3的多肽，ORF-1，ORF-2或ORF-3分別有以SEQ ID NO2，SEQ ID NO3和SEQ ID NO4表示的氨基酸序列。
當(dāng)然，在本質(zhì)上表現(xiàn)出同樣的免疫特性的所述的氨基酸的衍生物，即，免疫學(xué)等同物也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
另外，本發(fā)明也包括一種含有ORF1-3多肽片段或其功能等同物的多肽，該多肽能用于免疫家禽以抵抗CAV感染或用于診斷目的。用于探測(cè)這種已知氨基酸序列中的有用多肽片段的各種方法是已知?？梢酝ㄟ^以所謂的肽掃描方法為基礎(chǔ)的，描述在專利申請(qǐng)WO 86/06487和Geysen，H.M.等人(Prod.Natl.Acad.Sci.81 3998-4002，1984)，Geysen，H.M.等人(J.Immunol.Meth.102 259-274，1987)文章中的方法尋找到有一個(gè)或幾個(gè)抗原決定簇的本發(fā)明多肽的合適免疫化學(xué)活性多肽片段，并且合成一系列與所考慮的完整多肽的部分序列相應(yīng)的部分重疊多肽，并研究其與抗體的反應(yīng)活性。
另外根據(jù)理論上的推論和其結(jié)構(gòu)上與已知抗原決定簇的一致性，可以將一些具有所述氨基酸序列的多肽區(qū)命名為抗原決定簇。根據(jù)Hopp和Woods的親水性標(biāo)準(zhǔn)(Proc.Natl.Acad.Sei.78，3824-3828，1981)以及chou和Fasman(Advances in Enzymology 47，45-148，1987)的二級(jí)結(jié)構(gòu)理論來確定這些區(qū)域。
也可以借助Berzofsky′s的親水脂標(biāo)準(zhǔn)(Science 235，1059-62，1987)根據(jù)理論基礎(chǔ)得到必需的T-細(xì)胞抗原決定簇。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，使用了一個(gè)具有被上述核酸序列編碼的氨基酸序列的多肽。
可以通過給動(dòng)物使用一種本發(fā)明的多肽而達(dá)到家禽抗CAV感染的免疫，這種多肽是作為所謂的亞單位疫苗在免疫相關(guān)過程中使用的。本發(fā)明的亞單位疫苗可以含有一種純的多肽，也可以含有一種藥物學(xué)上可接受的載體。多肽也可以與非相關(guān)蛋白共價(jià)結(jié)合，最好是融合產(chǎn)物的純化形式。有代表性的是β-半乳糖苷酶，蛋白質(zhì)A，凝乳酶原，血液凝集因子Xa，等。
在某些情況下，產(chǎn)生抗這些多肽本身的中和抗體的能力并不高。為了升高其免疫原性，最好將小片段連接到載體分子上。適合于這種目的的載體是大分子，例如天然多聚物(蛋白質(zhì)，如主孔
形血蘭蛋白，清蛋白，毒素)，合成多聚物如聚氨基酸(聚賴氨酸，聚丙氨酸)，或親水脂化合物的分子團(tuán)如皂苷。換句話說，這些片段可以制成其多聚物，優(yōu)選的是線性多聚物。
用在上述亞單位疫苗中的多肽可以通過本領(lǐng)域已知的方法制備，如從CAV中分離所說的多肽，通過重組DNA技術(shù)或化學(xué)合成方法。
如果需要，根據(jù)本發(fā)明用在疫苗中的多肽可以在體外或體內(nèi)被修飾，例如，通過糖基化作用，酰胺化作用，羧化作用，磷酸化作用進(jìn)行修飾。
另一種亞單位疫苗是活載體疫苗。通過重組DNA技術(shù)將本發(fā)明的核酸序列導(dǎo)入微生物內(nèi)(如細(xì)菌或病毒)，以致于重組的微生物由此仍能通過表達(dá)由插入的核酸序列編碼的多肽而進(jìn)行復(fù)制。
例如可以使用體內(nèi)同源重組技術(shù)將異源的核酸序列，如本發(fā)明的核酸序列導(dǎo)入到載體微生物的基因組內(nèi)。
首先，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)，將一個(gè)相應(yīng)于載體基因組插入?yún)^(qū)域的DNA片段，即一個(gè)能夠用于異源序列的摻入而不影響那些感染或復(fù)制所必需的載體的主要功能區(qū)域，插入到克隆載體中。已有大量的有關(guān)微生物插入?yún)^(qū)域的報(bào)告(如EP80，806，EP110，385，EP83，286，EP314，569，WO88/02022和WO88/07088)。
其次，如果需要，可以在從第一步中得到的重組DNA分子的插入?yún)^(qū)域中導(dǎo)入一個(gè)缺失。可以通過例如對(duì)第一步得到的重組DNA分子進(jìn)行適當(dāng)?shù)暮怂嵬馇忻涪笙蛳拗泼柑幚矶瓿蛇@一步驟。
第三，將異源核酸序列插入到第一步的重組DNA分子中的插入?yún)^(qū)域中或代替從所述的重組DNA分子缺失的DNA。插入?yún)^(qū)域的DNA序列應(yīng)有適當(dāng)?shù)拈L度以便允許與載體基因組發(fā)生同源重組。此后，可以在含有插入序列的重組DNA分子存在的條件下，用載體基因DNA轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)募?xì)胞，在該插入序列兩側(cè)有適當(dāng)?shù)妮d體DNA序列，從而，在重組DNA分子和載體基因組的相應(yīng)區(qū)域之間發(fā)生重組。可以在細(xì)胞培養(yǎng)基中生產(chǎn)重組載體子代并可以根據(jù)基因和表型挑選，例如，通過雜交，檢測(cè)由一個(gè)與異源核酸序列整合的基因編碼的酶活性，或者通過免疫方法檢測(cè)由重組載體表達(dá)的抗原異源多肽。
下一步，給小雞服用該重組微生物進(jìn)行免疫，此后，它保持一段時(shí)間，或者甚至在接種動(dòng)物體內(nèi)復(fù)制。在體內(nèi)表達(dá)由本發(fā)明的插入核酸序列編碼的多肽，從而激發(fā)了接種動(dòng)物的免疫系統(tǒng)，適用于摻入本發(fā)明核酸序列的載體可以得自病毒，如(鳥類的)痘病毒，如，牛痘病毒或鳥痘病毒(EP314，569和WO88/02022)，皰疹病毒如HVT(WO88/07088)，腺病毒，或流感病毒，或者細(xì)菌的，如E.Coli或特殊的沙門氏菌屬。有這種類型的重組微生物，在宿主細(xì)胞內(nèi)合成的多肽可以作為表面抗原顯露。在這個(gè)意義上，所述多肽與OMP蛋白，或E.coli的毛蛋白或可被有機(jī)體識(shí)別的錨序列和信號(hào)的合成物進(jìn)行融合是可能的。所說的免疫原性多肽，如果需要也可以以整體的一部分在被免疫的動(dòng)物體內(nèi)釋放。在所有這些的情況下，一種或多種免疫產(chǎn)物還可以進(jìn)行表達(dá)，該表達(dá)產(chǎn)生抗各種病原體和/或抗各種所給病原體抗原的保護(hù)作用。
根據(jù)本發(fā)明，可以通過培養(yǎng)用一種載體病毒感染的宿主細(xì)胞而制備一種疫苗，該載體病毒含有一種本發(fā)明核酸序列，此后，收集含病毒的細(xì)胞和/或在細(xì)胞中生長的載體病毒，也可以以純的形式收集，并形成一種疫苗，或者制備成凍干形成的疫苗。
也可以在利于由所述核酸序列編碼的多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)含有本發(fā)明核酸序列的上述宿主細(xì)胞。雖然在另一實(shí)施例中可以根據(jù)它的用途由更純化的本發(fā)明多肽制成疫苗，但也可以使用粗培養(yǎng)物的樣品，宿主細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物或宿主細(xì)胞提取物制備疫苗。為了純化生產(chǎn)的多肽，將包含本發(fā)明核酸序列的宿主細(xì)胞進(jìn)行足量的培養(yǎng)，并以上述細(xì)胞中或者如果分泌蛋白質(zhì)就以培養(yǎng)基中分離所產(chǎn)生的多肽。分泌到培養(yǎng)基中的多肽可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離和純化，如鹽分級(jí)分離，離心，超過濾，層析，凝膠過濾或免疫親合層析，相對(duì)而言，分離細(xì)胞內(nèi)的多肽，首先收集所述細(xì)胞，破碎細(xì)胞，如通過聲處理或其它如Frech壓力法等機(jī)械破碎方法，跟著將多肽與其它胞內(nèi)組分分離并將多肽制成一種疫苗。也可以通過化學(xué)法(如EDTA處理)或者酶法如溶菌酶消化而破碎細(xì)胞。
如前所述，傳統(tǒng)的減弱病毒的方法有一些缺點(diǎn)。常規(guī)地是通過導(dǎo)入特異的突變體完成，可以通過化學(xué)物質(zhì)處理或在異源宿主動(dòng)物或組織培養(yǎng)液中的連續(xù)傳代培養(yǎng)而完成，在病毒基因組中發(fā)生的不規(guī)則突變是這些技術(shù)的一個(gè)重要方面，在自然回復(fù)突變體發(fā)生的情況下，很難將突變定位或重復(fù)。隨著重組DNA技術(shù)的發(fā)展，有可能以很精確的方法控制病毒基因組。如由Murphy等人描述的(Immunization against viruses，inFields，B.N.等人eds，Virology 2nd ed.Raven Press，N.Y.1990)通過其基因組的突變?cè)跍p弱病毒方面數(shù)個(gè)可能性，例如在非必需基因或其一部分中進(jìn)行缺失，插入或者取代，或者在調(diào)節(jié)區(qū)域插入，取代或缺失等。
下面描述了一個(gè)使用重組DNA技術(shù)制備一種自然界中不存在的減毒CAV突變體的典型方法。
首先，確定突變可定位的CAV基因區(qū)域。這些可以是編碼或非編碼區(qū)域，例如在調(diào)節(jié)區(qū)域中，或編碼部分病毒粘著蛋白的區(qū)域，或者是確定宿主特異的因子。
其次，為建立重組載體，根據(jù)上述方法，可以將突變，如缺失和/或插入和/或取代導(dǎo)入病毒基因組。
因此，通過重組DNA技術(shù)在其基因組中導(dǎo)入突變的且在自然界中不存在的一種減毒CAV也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的多肽的抗體或抗血清在被動(dòng)免疫療法，診斷免疫測(cè)定法和制備抗個(gè)體基因型抗體方面有潛在的用途。
上述的CAV相關(guān)多肽ORF1-3可用于生產(chǎn)多克隆的單特異的和單克隆的抗體。如果需要多克隆抗體，生產(chǎn)和加工多克隆血清技術(shù)是本領(lǐng)域已知的(如，Mayer和Walter，eds，Immunochemical Methods in Cell and Moleculav Bioeogy，Academil Press，London，1987)。簡(jiǎn)言之，用上述一種免疫原給所選的哺乳動(dòng)物，如兔子多次注射，每次免疫接種約20μg到80μg蛋白。與一種可接受的佐劑一起，進(jìn)行免疫接種，通常免疫原與佐劑的用量相同。可接受的佐劑包括Freund′s完全佐劑，F(xiàn)reund′s非完全佐劑，明礬沉淀劑或油包水乳劑，F(xiàn)reund′s完全佐劑對(duì)于初免疫接種是優(yōu)選的。Freund′s非完全佐劑對(duì)于全部加強(qiáng)免疫接種是優(yōu)選的。初免疫接種包括在兔的背部上多處皮下位點(diǎn)注射1ml的乳劑。用等體積的免疫原在大約一個(gè)月后進(jìn)行加強(qiáng)免疫接種，且一直持續(xù)到在個(gè)體兔血清中的抗體達(dá)到足夠的水平。收集血液并通過本領(lǐng)域已知的方法分離血清。
對(duì)每個(gè)免疫原的單特異性抗體是通過改進(jìn)的Hall等人的方法(Nature 311，379-387;1984)從通過用上述純蛋白免疫兔子而制備的多特異性抗血清中親和純化的。本文所用的單特異性抗體定義為與相關(guān)抗原具有同源結(jié)合特性的單抗體類或多抗體類物質(zhì)。本文所用的同源結(jié)合是指抗體物質(zhì)與特異性抗原或抗原決定簇結(jié)合的能力。
抗每一CAV免疫原的單克隆抗體可以通過用適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)免疫近親交配的小鼠，優(yōu)選是Bal b/c而制備。用與可接受佐劑等體積的每0.5ml約100ng到約10ng的免疫原腹膜內(nèi)免疫小鼠。上述可接受的佐劑包括Freund′s完全佐劑，F(xiàn)reund′s非完全佐劑，明礬沉淀劑和油包水的乳劑。初次免疫接種后約14，21和63天時(shí)，給小鼠靜脈注射不含佐劑的等量的免疫原以進(jìn)行免疫強(qiáng)化。在最后一次強(qiáng)化免疫接種之后三天，檢測(cè)個(gè)體小鼠血清中的抗免疫原抗體。從產(chǎn)生抗體的小鼠中分離脾細(xì)胞，并通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)(Kohler和Milstein，Nature 256;495-497，1975)與鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，通過在含有次黃嘌呤、胸苷和氨喋呤的適合的細(xì)胞培養(yǎng)基如Dulbecco′s Modified Eagle′s培養(yǎng)基(DMEM)中生長挑選雜交瘤細(xì)胞。克隆產(chǎn)生抗體的雜交瘤，優(yōu)選的是使用Macpherson的軟瓊脂技術(shù)(Soft Agar Techniques，Tissue Culture Methods and Applications，Kruse and Paterson，eds，Academic Press，276，1973)，為了在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)，將分散的菌落轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)盤的各個(gè)并孔中，通過用適當(dāng)?shù)拿庖咴Y選來識(shí)別產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)保存免疫原陽性雜交瘤細(xì)胞。通過在體外培養(yǎng)雜交瘤或通過現(xiàn)有技術(shù)已知的方法注射雜交瘤后在小鼠中制備腹水而生產(chǎn)特異的抗-單克隆抗體。
抗一個(gè)體基因型的抗體是一種免疫球蛋白，它攜帶有所要保護(hù)予防的病原體抗原的“內(nèi)部圖像”并且在疫苗中可用作免疫原(Dreesman等人J.Infect.Disease 151，761，1985)。制備抗個(gè)體基因型抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域已知(MacNamara等人，Science 226，1325，1984)。
可以以傳統(tǒng)的活性免疫程序使用本發(fā)明的疫苗以一種與劑量配方相匹配的方式單一的或重復(fù)的給藥，上述給藥劑量是在予防和/或治療上是有效的，并且是免疫性的。疫苗給藥可以通過如真皮下，表皮下，肌肉內(nèi)，腹膜內(nèi)，靜脈內(nèi)或鼻內(nèi)給藥。另外，疫苗也可以包含一種液體介質(zhì)或含水的懸浮液，常常與其它成分混合使用，例如，以便提高活性和/或延長貯存期限。這些成分可以是鹽，PH緩沖液，穩(wěn)定劑(如脫脂牛奶或酪蛋白水解產(chǎn)物)，提高免疫應(yīng)答的乳化佐劑(如油，胞壁酰二肽，氫氧化鋁，皂苷，聚陰離子和兩親性的物質(zhì))和防腐劑。
顯然，根據(jù)本發(fā)明的疫苗也可以包含與其它家禽病源體相關(guān)的免疫原或可以包含編碼這些免疫原的核酸序列，這些免疫源可以是產(chǎn)生多價(jià)疫苗的傳染性支氣管炎病毒，新城病病毒，傳染性粘液囊病病毒或雞馬立克(Marek′s)病病毒的抗原。
本發(fā)明也涉及一種“免疫化學(xué)試劑”，該試劑至少含有一種根據(jù)本發(fā)明的多肽或其抗原片段。
術(shù)語“免疫化學(xué)試劑”表示本發(fā)明的多肽已經(jīng)與一種合適的支持物相結(jié)合或者已經(jīng)與標(biāo)記物一起被提供。
可以用的支持物是，例如微小試驗(yàn)孔或小杯，試管或毛細(xì)管的內(nèi)壁，膜，濾紙，試驗(yàn)片條或顆粒的表面，如，乳膠顆粒，紅血球，著色溶膠，金屬溶膠或制成溶膠顆粒的金屬化合物。
可以用的標(biāo)記物是，尤其是，放射性同位素，熒光性化合物，酶，著色溶膠，金屬溶膠或制成溶膠顆粒的金屬化合物。
本發(fā)明的核酸序列可用于設(shè)計(jì)特異性探針，該探針是用于雜交試驗(yàn)，以探測(cè)在任意組織中的CAV相關(guān)核酸序列。
本發(fā)明也提供了一種含有用于診斷CAV感染的所述核酸序列的實(shí)驗(yàn)藥盒。
本發(fā)明還涉及一種免疫測(cè)定中所用的探測(cè)藥盒，該檢測(cè)藥盒含有至少一種本發(fā)明的免疫化學(xué)試劑。
使用檢測(cè)藥盒所發(fā)生的免疫化學(xué)反應(yīng)優(yōu)選的是夾層反應(yīng)，凝集反應(yīng)，競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)或抑制反應(yīng)。
為了完成夾層反應(yīng)，該檢測(cè)藥盒可以含有例如，結(jié)合到固體支持物，例如微小試驗(yàn)孔內(nèi)壁上的多肽，以及本發(fā)明的標(biāo)記多肽或者標(biāo)記的抗-抗體。
實(shí)施例1CAV菌種26P4的來源在Interet America(Millsboro，DEL)將8月齡的前哨SPE小雞(對(duì)CAV是血清陰性的)與對(duì)CAV感染有血清轉(zhuǎn)換跡象的雞放在一起。兩周后，在這些前哨雞肝的RPMI中制備20%v/v的勻漿液，并用0.2μm的過濾器進(jìn)行過濾。該濾物與MDCC-MSB1 細(xì)胞(Akiyama等人，Biken J.17，105-117，1974)一起在組織培養(yǎng)瓶中保溫培養(yǎng)，這種MDCC-MSB1對(duì)CAV來說是適宜的宿主細(xì)胞(Goryo等人Avian Pathology 16，149-163，1987)。根據(jù)由USDA提供的陽性抗-CAV-血清表現(xiàn)出的陽性免疫熒光和CPE，一種標(biāo)為26P4的分離物被識(shí)別為CAV。
26P4的培養(yǎng)根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的說明(Goryo等人，ibid)，在組織培養(yǎng)瓶中的MDCC-MSB1上進(jìn)行26P4的培養(yǎng)。
病毒基因組的克隆為了分離CAV的26P4菌株的復(fù)制型(RF)病毒DNA，制備500ml的濃度為106細(xì)胞/ml的MSB1細(xì)胞培養(yǎng)物并用約106TCID50/ml的病毒滴定度感染。使用標(biāo)準(zhǔn)的Hirt提取法制備病毒DNA(McMaster等人，J.Virol.38，317-326，1981)。感染后進(jìn)行了30個(gè)小時(shí)的周期實(shí)驗(yàn)，找到了感染后獲得最大量RF病毒DNA的時(shí)間點(diǎn)。
在0.8%的瓊脂糖/溴化3.8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶嗡凝膠上分析來自感染細(xì)胞的DNA，并且根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Maniatis等人，1989，ibid)使用NA45DEAE膜(Schleicher and Schull)從瓊脂凝膠上分離代表環(huán)狀病毒RF DNA的1.7kb帶。
用25μl的20U的HindⅢ或者BamHⅠ限制核酸內(nèi)切酶消化500ng的病DNA，也用HindⅢ或BamHⅠ消化2μg的細(xì)菌質(zhì)粒PGEM7zf+(Promega Corp.)使之去磷酸化，并與蛋白酶K一起保溫培養(yǎng)(Maniatis等人，1989，ibid)。用苯酚/氯仿提取載體和插入DNA制備物，并用2體積的96%的乙醇和1/10體積的PH為6.0的3M乙酸鈉沉淀。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法用T4DNA連接酶進(jìn)行載體和插入DNA的連接(Maniatis等人1989，ibid)，用連接的混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α的活性細(xì)胞(Clontech corp.)，然后放在含100μg/ml氨芐青霉素(AP)的LB-瓊脂培養(yǎng)盤中。從抗AP的菌落分離質(zhì)粒DNA，用限制酶分析法篩選2.3kb的插入物。
識(shí)別出了兩個(gè)質(zhì)粒pCA1，含HindⅢ消化的2.3kb CAV RF DNA，和pCA3，它具有BamHⅠ消化的，與pCA1相比在相反方向插入的CAV RF DNA。兩個(gè)質(zhì)粒都描述在

圖1中，給出了它們的限制方式。
實(shí)施例2DNA序列分析為了確定CAV基因組的DNA序列，根據(jù)Henikoff(Gene 28，351，1984)生產(chǎn)累積缺失片段5μg的pCA1和5μg pCA3與SphⅠ一起保溫培養(yǎng)，并且然后與ClaⅠ限制酶一起培養(yǎng)。與蛋白酶K培養(yǎng)后，苯酚/氯仿處理，并乙醇沉淀，樣品與核酸外切酶Ⅲ一起以逐漸增加的時(shí)間間隔保溫保養(yǎng)。用S1核酸酶和Klenow聚合酶將DNA片段做成平整末端，并且最后用T4DNA連接酶成環(huán)，轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α的感受態(tài)細(xì)胞中并放在氨芐青霉素盤上。分析來自抗性菌落的質(zhì)粒DNA的插入序列的大小。
如由Sanger等人發(fā)表的(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74，5463，1977)，進(jìn)行DNA序列分析，在小制備物的雙鏈質(zhì)粒DNA上直接使用雙脫氧鏈末端技術(shù)。使用T7和SP6啟動(dòng)子引物，直接雜交在PGEM7zf+多克隆位點(diǎn)的上游和下游。
收集序列數(shù)據(jù)并使用Gene Master程序在IBM PC上分析和裝配。
實(shí)施例3將含有ORF1的CAV DNA插入到火雞疤疹病毒(HVT)的病毒基因組中如實(shí)施例1中所述，分離CAV RF DNA。為了制備ORF1以便插入到HVT中并有效表達(dá)，特別是在第一ATG密碼子之前的序列得修飾到一最小的前導(dǎo)序列。因此，用限制酶ApaⅠ和MroⅠ消化2μg的CAV RF DNA，得到一線性的CAV RF DNA分子，ORF1在其中部，并且ORF1的第一ATG密碼子在MroⅠ位點(diǎn)的邊上。失活后，苯酚提取并乙醇沉淀，將這些片段與核酸外切酶Ⅲ一起以增加的時(shí)間間隔保溫培養(yǎng)，并產(chǎn)生平整末端，如在實(shí)施例2中所述，由于核酸外切酶不能消化3′具垂位點(diǎn)，如來自ApaⅠ的，因此，從MroⅠ位點(diǎn)，以O(shè)RF1的第一ATG的方向消化RFCNA片段。平整片段通過T4連接酶與已磷酸化的超過50倍摩爾的EcoRⅤ人工接頭(B.Mannheim Corp.)連接，所有這些均按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。人工接頭連接混合物用EcoRⅤ消化，并在65℃失活10分鐘。該混合物與500ng的EcoRⅤ消化的和脫磷酸化的pGEM5zf+載體(Promega Corp.)連接。該連接混合物轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α的感受態(tài)細(xì)胞并放在AP盤上。分析抗性菌落的微量DNA分離物中ApaⅠ和SpeⅠ兩次消化后插入質(zhì)粒的大小。通過限制分析研究約1.9kb大小的插入物的方向，并用Sp6或T7引物。通過Sanger序列分析法檢測(cè)。
通過這種方法建立的質(zhì)粒pCA4，有一1.9kb的CAV插入物。該插入物由以SEQ ID NO1表達(dá)的，并在1到475中繼續(xù)從核苷酸860到2298的序列組成，它被連接到EcoRV人工接頭上，并插入到EcoRV消化的pGEM5zf+中。特別是通過Sanger分析法被證實(shí)在插入序列的第一ATG之前的短前導(dǎo)序列中不包含任何其它的ATG密碼子。
以由Igarashi T.等人發(fā)表的(Virology 157，351，1987)HVT的基因組結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，選擇病毒的唯一的短序列單位(us)中的一個(gè)區(qū)域用來插入外源基因。從通過部分的消化來自HVT感染的CEF的全部DNA而構(gòu)建的λEMBL3基因庫中篩選出相應(yīng)的DNA片段。以不存在任何BamHⅠ限制位點(diǎn)為特征的λ一分離物之一的插入物被命名為λHVTO4，并詳細(xì)地通過物理圖譜(圖3)分析。在17.5kb插入片段中的序列代表了包括部分顛倒重復(fù)結(jié)構(gòu)在內(nèi)的US區(qū)域的主要部分(Igarashi，T.等人，1987，ibid)來自λHVTO4的一個(gè)1.2kb XhoⅠ限制片段被次克隆在用SatⅠ消化的pGEM3Z中，產(chǎn)生了質(zhì)粒pMD07，該質(zhì)粒包含唯一的在DNA片段的插入中可以應(yīng)用的BglⅡ位點(diǎn)。
從勞氏肉瘤病毒(RSV)的LTR序列中選出一個(gè)強(qiáng)的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子在外源基因插入到HVT病毒的基因組后，可以直接控制外源基因的表達(dá)。已經(jīng)在來自pRSVcat的580bp的NdeⅠ/HindⅢ限制片段上作出了該啟動(dòng)子的圖譜(Gorman等人，Proc.Natl.Acad.Sei.79，6777，1982)并通過在片段的兩個(gè)位點(diǎn)上雙鏈人工接頭將其插入到PGEM3Z(Promega)的HindⅢ和PstⅠ位點(diǎn)之間。來自載體pGEM3Z的HindⅢ位點(diǎn)和帶有LTR′啟動(dòng)子的RSV片段的NdeⅠ位點(diǎn)之間的連接是用一個(gè)30bp的人工接頭完成的，該人工工接頭含有與一方的HindⅢ，和與另一位置的NekeⅠ相匹配的粘性末端。但是，由于6個(gè)堿基對(duì)識(shí)別序列的外核苷酸中的予先修飾，所以在連接之后，兩個(gè)限制位點(diǎn)不會(huì)復(fù)原。另外，除了這兩個(gè)位點(diǎn)的消除，在相應(yīng)的位置產(chǎn)生了一個(gè)新的在人工接頭自身內(nèi)的限制性位點(diǎn)(BamHⅠ)。合成第二個(gè)連接來自LTR片段的HindⅢ位點(diǎn)和來自pGEM3Z的PstⅠ位點(diǎn)的20bp的人工接頭，在這種情況下，在兩個(gè)末端的任一個(gè)上都沒有識(shí)別序列的破壞，并且把3個(gè)有利的唯一限制性位點(diǎn)BglⅡ，XhoⅠ和EcoRV加到已經(jīng)在pGEM3Z的多人工接頭中存在的那些位點(diǎn)上，如PstⅠ，SalⅠ，XhoⅠ和BamHⅠ，所得的pGEM3Z衍生物，稱為pVECO1，因此包含一攜帶LTR啟動(dòng)子順序的650bp限制性片段，之后緊接著是可用于插入外源基因的七個(gè)限制位點(diǎn)。
650bp的片段在兩側(cè)帶有BamHⅠ限制位點(diǎn)，并已經(jīng)被轉(zhuǎn)移到來自pMD07的1.2kb HVT插入物中的唯一BglⅡ位點(diǎn)上。通過這兩種酶產(chǎn)生的粘性末端是相容的，但是連接后不會(huì)恢復(fù)到任何一個(gè)BglⅡ或BamHⅠ的原始識(shí)別序列。一種在朝TRS的方向上帶LTR的所得結(jié)構(gòu)，被命名為PVEC04，并用限制性圖譜(圖4)檢查。該全部HVT重組載體的結(jié)構(gòu)允許外源基因正好插入到LTR啟動(dòng)子的下游，并隨后通過體內(nèi)重組將完全的表達(dá)盒整合到HVT基因組中。對(duì)LTR下游不同限制位點(diǎn)的位置特別是BglⅡ，XhoⅠ，和EcoRV酶的那些位置進(jìn)行設(shè)計(jì)以致于使得甚至多基因的插入也是可以設(shè)想的。
通過EcoRV消化從質(zhì)粒中除去來自pCA4的CAV DNA插入物，并插入到EcoRV消化的和去磷酸化的pVECO4中。再次檢查插入片段的方向，則有正確方向的質(zhì)粒命名為pCA5。
將來自pCA5的線性化DNA與從HVT感染細(xì)胞制備的全部DNA一起，通過以依據(jù)Graham，F(xiàn).和V.d.Eb.A.的磷酸鈣DNA沉淀法(Virology 52，456，1973)，為基礎(chǔ)的方法導(dǎo)入CEF中。來自該結(jié)構(gòu)的2微克質(zhì)粒DNA與來自HVT線些感染細(xì)胞的15微克DNA，在最后約體積560μl的水中混合，并加入到750μl的HBSP中(20mM KCl，560mM NaCl，24mM果糖，3mM Na2HPO4，100mM HEPES，PH.7.0)，通過緩慢加入190μl的1M CaCl2溶液形成沉淀，并在室溫保溫培養(yǎng)混合物30分鐘。同時(shí)，以每m15×105個(gè)細(xì)胞的濃度，將15ml來源于10天齡胚胎的第二CEF培養(yǎng)基6/B8懸浮液在直徑10cm的平盤中接種，6/B8培養(yǎng)基的組成是以Glasgow′s修改的Eagle′s最低限度基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，另加有2%的胎牛血清。將磷酸鈣沉淀的DNA緩慢加到細(xì)胞懸浮液中，并將盤在含5%CO2的潮濕空氣的保溫箱中于37℃保溫培養(yǎng)。5小時(shí)后，除去培養(yǎng)基，并將含等體積HBSP和30%甘油的10ml的溶液復(fù)蓋在細(xì)胞上層，在1到2分鐘培養(yǎng)后，除去溶液，用培養(yǎng)基6/B8沖洗細(xì)胞并用新鮮的培養(yǎng)基將盤保溫培養(yǎng)3到5天，直到有病毒CPE產(chǎn)生。通過使用特異性單價(jià)或多價(jià)的抗這些CAV抗原的血清進(jìn)行免病熒光染色來檢測(cè)表達(dá)CAV相關(guān)多肽的HVT重組體的存在。
圖注圖1代表質(zhì)粒pCA1和pCA3的核酸內(nèi)切酶圖譜。
A質(zhì)粒pCA1是通過HindⅢ消化而線性化的分子。
B質(zhì)粒pCA3是通過BamHⅠ消化而線性化的分子。
圖2陰影部分代表存在于CAV26P4菌株RF DNA的DNA序列中的開放閱讀框架(ORF)。ORFs從上到下編號(hào)為ORF1，ORF2和ORF3。
CAV RF DNA是由DraⅠ消化而線性化的分子。
圖3基本上相應(yīng)于HVT基因組的Us區(qū)域的DNA片段的限制酶圖譜，指明了位于其間的由四個(gè)開放閱讀框架和非編碼序列組成的插入?yún)^(qū)的相對(duì)位置。
圖4pVECO4的限制酶圖譜，表明了LTR啟動(dòng)子被插入到來自pMDO7的1.2kb XhoⅠ HVT片段的唯一BglⅡ位點(diǎn)上。
序列目錄(1)一般資料(ⅰ)申請(qǐng)人A，名稱AKZO NVB，街道Velperweg 76C，城市ArnhemE，國家荷蘭F，郵政編碼(ZIP)6824BM(ⅱ)發(fā)明題目雞貧血病毒疫苗和診斷(ⅲ)序列數(shù)量4(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式不適用的。
(2)有關(guān)序列1的資料(ⅰ)序列特征A，長度2298堿基對(duì)B，類型核酸C，鏈單鏈D，結(jié)構(gòu)環(huán)狀(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅵ)來源
A，機(jī)體雞貧血病毒C，個(gè)體分離26P4(ⅸ)特征A，名稱/關(guān)鍵詞CDSB，定位876-2225D，其它資料/標(biāo)記＝ORF1(ⅸ)特征A，名稱/關(guān)鍵詞CDSB，定位101-502D，其它資料/標(biāo)記＝ORF2(ⅸ)特征A，名稱/關(guān)鍵詞CDSB，定位403-1053D，其它資料標(biāo)記＝ORF3(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1
(2)有關(guān)SEQ ID NO2的資料ⅰ)序列特征A)長度449個(gè)氨基酸B)類型氨基酸D)結(jié)構(gòu)線性的ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)ⅹⅰ)序列說明SEQ ID NO2
(2)有關(guān)SEQ ID NO3的資料ⅰ)序列特征A)長度133氨基酸B)類型氨基酸D)結(jié)構(gòu)線性的ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)ⅹⅰ)序列說明SEQ ID NO3
(2)有關(guān)SEQ ID NO4的資料ⅰ)序列特征(A)長度216個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)結(jié)構(gòu)線性ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)ⅹⅰ)序列說明SEQ ID NO權(quán)利要求
1.一種編碼CAV相關(guān)多肽的核酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的核酸序列，特征在于所述序列編碼至少部分選自下列的多肽a有以SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的ORF1;b有以SEQ ID NO3表示的氨基酸序列的ORF2;c有以SEQ ID NO4表示的氨基酸序列的ORF3;和其功能等同物。
3.一種含有至少部分CAV基因組的核酸序列，
4.根據(jù)權(quán)利要求3的核酸序列，特征在于所述的序列至少包含以SEQ ID NO1表示的脫氧核糖核酸序列的部分。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的核酸序列，特征在于所述序列包含至少部分以SEQ ID NO1表示的位于876到2225，101到502或403到1053的DNA順序。
6.一種含有根據(jù)權(quán)利要求1-5的核酸序列的重組核酸分子。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的重組核酸分子，其特征在于該核酸序列可以人工操作與一表達(dá)控制序列連接。
8.一種包含根據(jù)權(quán)利要求1-5的核酸序列的載體病毒。
9.一種用根據(jù)權(quán)利要求1-5的核酸序列或根據(jù)權(quán)利要求6-7的重組核酸分子轉(zhuǎn)化的或者包含有權(quán)利要求8的載體病毒的宿主細(xì)胞。
10.一種有CAV相關(guān)抗原的免疫特征的多肽。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的多肽，其特征在于它包含至少部分選自下列一組的氨基酸序列a，有以SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的ORF1;b，有以SEQ ID NO3表示的氨基酸序列的ORF2;c，有以SEQ ID NO4表示的氨基酸序列的ORF3;和其功能等價(jià)物。
12.一種由根據(jù)權(quán)利要求1-5的核酸序列編碼的CAV相關(guān)多肽。
13.一種可以與權(quán)利要求10-12的多肽的發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體或抗血清。
14.一種自然界中不存在的減弱的CAV，其特征在于它是由于通過重組DNA技術(shù)而在CAV基因組中導(dǎo)入突變而得到的。
15.一種保護(hù)家禽抗CAV感染的疫苗，其特征在于它含有一種根據(jù)權(quán)利要求7的重組核酸分子，根據(jù)權(quán)利要求8的一種載體病毒，根據(jù)權(quán)利要求9的一種宿主細(xì)胞，根據(jù)權(quán)利要求10-12的一種多肽或根據(jù)權(quán)利要求14的一種CAV。
16.一種CAV疫苗的制備方法，其特征在于培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求9的宿主細(xì)胞，此后，收集包含CAV的物質(zhì)，并加工成一種具有免疫活性的藥物制品。
17.一種CAV疫苗的制備方法，其特征在于根據(jù)權(quán)利要求10-12的一種多肽被加工成一種具有免疫活性的藥物制品。
18.一種保護(hù)家禽的抗CAV感染的方法，其特征在于給動(dòng)物使用有效量的根據(jù)權(quán)利要求15的疫苗。
19.一種含有根據(jù)權(quán)利要求10-12的多肽的免疫試劑。
20.一種可用于進(jìn)行免疫測(cè)定的檢測(cè)藥盒，含有權(quán)利要求9的免疫化學(xué)試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種包含小雞貧血病毒(CAV)的遺傳信息的核酸序列。特別是，鑒定了編碼病毒多肽的三個(gè)基因區(qū)域。所述的區(qū)域或多肽可以被用于抗CAV感染疫苗的制備或診斷目的。本發(fā)明也涉及用于檢測(cè)CAV感染的小雞的檢測(cè)藥盒。
文檔編號(hào)C07K16/00GK1062168SQ91111520
公開日1992年6月24日 申請(qǐng)日期1991年10月30日 優(yōu)先權(quán)日1990年10月31日
發(fā)明者保羅斯·J·A·桑德梅杰, 約翰尼斯·A·J·科拉瑟斯 申請(qǐng)人:阿克佐公司