專利名稱：抗基質(zhì)金屬蛋白酶單抗Fab'藥物偶聯(lián)物及抗腫瘤作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以一種單克隆抗體作為載體，偶聯(lián)攜帶抗腫瘤藥物進(jìn)行抗腫瘤治療的方法。
單克隆抗體(單抗)3D6是以IV型膠原酶免疫BALB/c小鼠后取其脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞融合，經(jīng)篩選，克隆后所得雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗體。
據(jù)報(bào)道，惡性腫瘤細(xì)胞分泌多種基質(zhì)金屬蛋白酶，降解胞外基質(zhì)，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移。IV型膠原酶是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員，可降解細(xì)胞外基質(zhì)主要成分IV型膠原，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移(Journal of theNational Cancer Institute 1997，891260)。抑制基質(zhì)金屬蛋白酶產(chǎn)生及其活性的小分子藥物在體內(nèi)有明顯的抗腫瘤作用(Trends in Molecular Medicine1999，3134)。但針對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶的單克隆抗體及其與藥物偶聯(lián)物的研究較少。力達(dá)霉素(Lidamycin，LDM又稱C1027)是我國(guó)自行研制的一種抗腫瘤抗生素，在體內(nèi)外有明顯的抗腫瘤作用(Journal of Antibiotics 1989，421294)，其結(jié)構(gòu)具有可拆分和重建的特點(diǎn)(藥學(xué)學(xué)報(bào)1992，27486)。力達(dá)霉素與大鼠抗人肝癌BEL-7402細(xì)胞單抗3A5 Fab片段的偶聯(lián)物(藥學(xué)學(xué)報(bào)1993，28260)以及力達(dá)霉素與抗IV型膠原酶單抗3D6偶聯(lián)物(國(guó)外醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)分冊(cè)1998，568)在體內(nèi)外均有明顯抗腫瘤作用。但3D6的活性片段及其與力達(dá)霉素偶聯(lián)物尚未見(jiàn)報(bào)道。平陽(yáng)霉素(Pingyangmycin，PYM)是臨床常用的一種抗腫瘤抗生素，平陽(yáng)霉素與單抗3A5偶聯(lián)物體外對(duì)肝癌BEL-7402細(xì)胞具有選擇性殺傷作用(中華微生物與免疫學(xué)雜志1991，11230)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明該偶聯(lián)物腔內(nèi)給藥可明顯延長(zhǎng)動(dòng)物生存時(shí)間(藥學(xué)學(xué)報(bào)1997，32669)，但平陽(yáng)霉素與抗基質(zhì)金屬蛋白酶單克隆抗體及其活性片段偶聯(lián)物未見(jiàn)報(bào)道。綜上所述，迄今為止，抗基質(zhì)金屬蛋白酶單克隆抗體活性片段及其與力達(dá)霉素和平陽(yáng)霉素偶聯(lián)物國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。本項(xiàng)發(fā)明的研究表明，以適當(dāng)?shù)姆椒梢垣@得有活性的小鼠抗IV型膠原酶單克隆抗體3D6 Fab′片段，其與力達(dá)霉素和平陽(yáng)霉素偶聯(lián)物在體內(nèi)外有顯著抗腫瘤作用，有可能成為新的腫瘤治療藥物。
本發(fā)明的目的是以合適的方法制備單抗3D6 Fab′片段，并將此片段與力達(dá)霉素及平陽(yáng)霉素偶聯(lián)，獲得偶聯(lián)物，用于臨床治療腫瘤。本發(fā)明的內(nèi)容與要點(diǎn)是1.單抗3D6 Fab′的制備利用抗基質(zhì)金屬蛋白酶單抗3D6 Fab′片段作為藥物導(dǎo)向載體。首先以適當(dāng)方法制備單抗3D6 Fab′片段。單抗3D6以0.05mol/LTris-HCL緩沖液，pH7.2(含2mmol/L EDTA)充分透析后以相同緩沖液調(diào)整為4mg/ml。按0.06單位酶/毫克抗體加入預(yù)先溶于相同緩沖液的無(wú)花果蛋白酶，再以1mmol/L半胱氨酸激活反應(yīng)，37℃反應(yīng)6小時(shí)，產(chǎn)物經(jīng)Sephadex G-150層析純化獲得F(ab)′2。6-10mg/ml F(ab)′2在pH7.5時(shí)以β-巰基乙醇還原，產(chǎn)物經(jīng)0.05mol/L磷酸鹽緩沖液(PB)，pH6.8充分透析后立即與力達(dá)霉素交聯(lián)或以N-乙基順丁烯二酰亞胺(NEMI)封閉巰基后經(jīng)Sephadex G-75層析純化獲得Fab′用于與平陽(yáng)霉素偶聯(lián)。經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)，F(xiàn)ab′保持
2. Fab′與力達(dá)霉素偶聯(lián)物制備2毫克力達(dá)霉素與適量N-羥基琥珀酰亞胺基-間-(N-馬來(lái)酰亞胺基)苯甲酸酯(MBS)混合，室溫避光反應(yīng)40分鐘，以PD-10柱脫鹽后立即與巰基化的3D6 Fab′混合，室溫避光反應(yīng)過(guò)夜。加入N-乙基順丁烯二酰亞胺(NEMI)，繼續(xù)反應(yīng)1小時(shí)。經(jīng)Sephadex G-75層析純化獲得Fab′-LDM直接偶聯(lián)物。Fab′-LDM直接偶聯(lián)物加倍量發(fā)色團(tuán)，混合過(guò)夜后以Sephadex G-25層析獲得Fab′-LDM強(qiáng)化偶聯(lián)物。
3. Fab′與平陽(yáng)霉素偶聯(lián)物制備將葡聚糖T-40(dextran T-40)以高碘酸鈉氧化，透析，冷凍干燥，得多醛基葡聚糖(PAD)。按重量比1∶2取PAD與平陽(yáng)霉素共溶于適量磷酸鹽緩沖液(PBS)中，4℃避光反應(yīng)12小時(shí)，加入與PAD等摩爾數(shù)的3D6 Fab′，繼續(xù)反應(yīng)12小時(shí)。以適量硼氫化鈉還原2小時(shí)。產(chǎn)物經(jīng)Sephadex G-100層析純化，收集既有抗體活性又有抑菌活性部分，即為偶聯(lián)物。
4. Fab′-LDM及Fab′-PYM偶聯(lián)物與腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)性以ELISA法進(jìn)行。Fab′-LDM及Fab′-PYM偶聯(lián)物保持了與IV型膠原酶、人口腔鱗癌KB以及肺癌PG細(xì)胞免疫反應(yīng)性，與人肝癌BEL-7402細(xì)胞無(wú)反應(yīng)(圖2，圖3)。
5.偶聯(lián)物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用用克隆形成法測(cè)定偶聯(lián)物對(duì)體外培養(yǎng)的人體肝癌細(xì)胞BEL-7402和口腔鱗癌KB細(xì)胞的殺傷作用，藥物作用1小時(shí)。結(jié)果力達(dá)霉素對(duì)兩種細(xì)胞均有殺傷作用，抑制50％克隆形成的濃度(IC50)分別為2.0×10-15mol/L和2.21×10-15mol/L；Fab′-LDM偶聯(lián)物對(duì)兩種細(xì)胞IC50分別為1.04×10-13mol/L和1.99×10-15mol/L。表明Fab′-LDM對(duì)靶細(xì)胞KB具有一定選擇性殺傷作用。Fab′-LDM及力達(dá)霉素對(duì)肺癌PG細(xì)胞的殺傷作用以四氮唑藍(lán)法測(cè)定，力達(dá)霉素及Fab′-LDM對(duì)肺癌PG細(xì)胞的IC50分別為3.7×10-10mol/L和4.2×10-10mol/L(圖4，圖5，表1)。與此相似，PYM對(duì)KB細(xì)胞和BEL-7402細(xì)胞生長(zhǎng)均有殺傷作用，抑制50％克隆形成的濃度(IC50)分別為0.42μmol/L和0.17μmol/L；Fab′-PYM對(duì)兩種細(xì)胞IC50分別為0.012μmol/L和0.48μmol/L(圖6，圖7)。
表1MTT法測(cè)定力達(dá)霉素和Fab′-LDM在體外對(duì)肺癌PG細(xì)胞的殺傷作用藥物 濃度(mol/L×10-10)A560(％對(duì)照)力達(dá)霉素88.16 21.978.816 34.890.882 67.950.088 77.000.009 101.82Fab′-LDM 88.16 22.308.816 39.090.882 75.640.088 79.390.009 93.416. Fab′-LDM偶聯(lián)物靜脈注射對(duì)小鼠肝癌22的療效取體內(nèi)傳代的肝癌22腹水，以生理鹽水稀釋成7.5×106細(xì)胞/ml，按0.2ml/只接種于昆明小鼠腋窩皮下；接種24小時(shí)后靜脈注射(iv)給藥，對(duì)照組給予生理鹽水，每3天給藥一次，共3次。實(shí)驗(yàn)第10天處死動(dòng)物，取腫瘤稱重，計(jì)算抑瘤率。結(jié)果表明，3D6 Fab′-LDM對(duì)肝癌22有明顯療效，0.05mg/kg，0.1mg/kg和0.2mg/kg劑量，抑瘤率分別為86％，89％和91％，而0.1mg/kg力達(dá)霉素抑瘤率為77％，明顯低于等劑量偶聯(lián)物(表2)。
表2 3D6 Fab′-LDM靜脈注射給藥對(duì)小鼠肝癌22的抑制作用藥物 劑量 動(dòng)物數(shù) 體重(g)瘤重(mg) 抑瘤率(mg/kg×次數(shù)) 開始/結(jié)束開始/結(jié)束 x±SD(％)對(duì)照10/10 19.4/27.4 1400±373力達(dá)霉素0.1×3 10/10 20.0/26.9329±9777**Fab′-LDM 0.05×3 10/10 19.7/27.3203±5686**，Δ0.1×3 10/10 18.8/26.9155±3489**，ΔΔ0.2×3 10/10 19.4/27.1129±2591**，ΔΔ皮下接種腫瘤，靜脈注射給藥，三天一次；**P＜0.01與對(duì)照比較ΔP＜0.05與力達(dá)霉素組比較ΔΔP＜0.01與力達(dá)霉素組比較7. Fab′-LDM偶聯(lián)物靜脈注射給藥(iv)對(duì)小鼠Lewis癌肺轉(zhuǎn)移的療效取C57/BL6小鼠皮下傳代的Lewis癌組織，以1∶3加生理鹽水制成勻漿，C57/BL6小鼠按0.2ml/只腋窩皮下接種瘤液。接種第8天和第15天各靜脈注射給藥一次。實(shí)驗(yàn)第21天處理動(dòng)物，剝?nèi)∑は履[瘤稱重，取肺臟，以Bouin氏液固定，計(jì)數(shù)肺表面瘤結(jié)，計(jì)算肺轉(zhuǎn)移抑制率。結(jié)果表明，3D6 Fab′-LDM對(duì)皮下瘤的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響，但對(duì)Lewis癌肺轉(zhuǎn)移有明顯抑制作用，0.05mg/kg和0.1mg/kg劑量，抑制率分別為91％和94％，而0.1mg/kg力達(dá)霉素抑制率為88％，明顯低于等劑量偶聯(lián)物(表3)。
表3偶聯(lián)物靜脈注射對(duì)皮下接種小鼠Lewis癌肺轉(zhuǎn)移的抑制作用組別劑量動(dòng)物數(shù) 體重(g)皮下瘤重(g)肺轉(zhuǎn)移灶總數(shù)抑制率(mg/kg×次數(shù)) 開始/結(jié)束開始/結(jié)束 x±SD x±SD(％)對(duì)照10/10 18.9/22.18.53±1.2120.1±2.2力達(dá)霉素 0.1×2 10/9 18.6/21.46.63±1.172.4±0.7 88**Fab′-LDM 0.05×2 10/9 18.5/20.97.71±1.411.9±0.7 91**0.1×2 10/10 18.2/22.07.53±0.631.2±0.4 94**，ΔΔ皮下接種腫瘤，靜脈給藥，七天一次；**P＜0.01 與對(duì)照比較ΔΔP＜0.01 與力達(dá)霉素組比較本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與積極效果是確定了抗基質(zhì)金屬蛋白酶單克隆抗體3D6Fab′片段制備方法并為抗基質(zhì)金屬蛋白酶單抗與力達(dá)霉素及平陽(yáng)霉素偶聯(lián)物用于治療腫瘤提供了必要的依據(jù)。平陽(yáng)霉素是臨床常用的抗腫瘤抗生素，3D6Fab′-PYM在體外對(duì)靶細(xì)胞有較平陽(yáng)霉素更強(qiáng)的殺傷作用；力達(dá)霉素是一種迄今為止報(bào)道的細(xì)胞毒作用最強(qiáng)并有明顯體內(nèi)抗腫瘤作用的肽類抗腫瘤抗生素，作為抗腫瘤藥物有極大的發(fā)展?jié)摿?，而力達(dá)霉素與3D6 Fab′偶聯(lián)物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤具有明顯優(yōu)于等劑量游離力達(dá)霉素的療效，預(yù)計(jì)單抗3D6 Fab′片段與平陽(yáng)霉素及力達(dá)霉素偶聯(lián)物將可能開發(fā)成為新型抗腫瘤導(dǎo)向藥物用于臨床腫瘤治療，并取得良好的效果。


圖1單抗3D6 Fab′與IV型膠原酶、KB、PG、BEL-7402細(xì)胞免疫反應(yīng)性其中橫坐標(biāo)為抗體濃度(μg/ml)縱坐標(biāo)為490nm吸光值1為IV型膠原酶2為KB細(xì)胞3為PG細(xì)胞4為BEL-7402細(xì)胞圖2單抗3D6 Fab′-LDM與IV膠原酶、KB、PG、BEL-7402細(xì)胞免疫反應(yīng)性其中橫坐標(biāo)為抗體濃度(μg/ml)縱坐標(biāo)為490nm吸光值1為IV型膠原酶2為KB細(xì)胞3為PG細(xì)胞4為BEL-7402細(xì)胞圖3單抗3D6 Fab′-PYM與IV膠原酶、KB、PG、BEL-7402細(xì)胞免疫反應(yīng)性其中橫坐標(biāo)為抗體濃度(μg/ml)縱坐標(biāo)為490nm吸光值1為IV型膠原酶2為KB細(xì)胞3為PG細(xì)胞4為BEL-7402細(xì)胞圖4力達(dá)霉素及3D6 Fab′-LDM偶聯(lián)物對(duì)KB細(xì)胞的殺傷作用其中橫坐標(biāo)為藥物濃度(mol/L)縱坐標(biāo)為克隆形成率(％)1為力達(dá)霉素2為3D6 Fab′-LDM偶聯(lián)物圖5力達(dá)霉素及3D6 Fab′-LDM偶聯(lián)物對(duì)BEL-7402細(xì)胞的殺傷作用其中橫坐標(biāo)為藥物濃度(mol/L)縱坐標(biāo)為克隆形成率(％)1為力達(dá)霉素2為3D6 Fab′-LDM偶聯(lián)物圖6平陽(yáng)霉素及3D6 Fab′-PYM偶聯(lián)物對(duì)KB細(xì)胞的殺傷作用其中橫坐標(biāo)為藥物濃度(μmol/L)縱坐標(biāo)為克隆形成率(％)1為平陽(yáng)霉素2為3D6 Fab′-PYM偶聯(lián)物圖7平陽(yáng)霉素及3D6 Fab′-PYM偶聯(lián)物對(duì)BEL-7402細(xì)胞的殺傷作用其中橫坐標(biāo)為藥物濃度(μmol/L)縱坐標(biāo)為克隆形成率(％)1為平陽(yáng)霉素2為3D6 Fab′-PYM偶聯(lián)物
權(quán)利要求
1.抗基質(zhì)金屬蛋白酶單克隆抗體Fab′與藥物偶聯(lián)物及其抗腫瘤作用，其特征是所說(shuō)的抗腫瘤作用的實(shí)施包括以下步驟A.單克隆抗體3D6 Fab′活性片段的制備；B. 3D6 Fab′-力達(dá)霉素偶聯(lián)物的制備；C. 3D6 Fab′-平陽(yáng)霉素偶聯(lián)物的制備；D. 3D6 Fab′-力達(dá)霉素偶聯(lián)物的抗腫瘤作用的檢測(cè)；E. 3D6 Fab′-平陽(yáng)霉素偶聯(lián)物的抗腫瘤作用的檢測(cè)；
2.按照權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物及其抗腫瘤作用，其特征是利用抗基質(zhì)金屬蛋白酶單抗3D6制備Fab′片段。
3.按照權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物及其抗腫瘤作用，其特征是Fab′-力達(dá)霉素偶聯(lián)物的制備是將力達(dá)霉素先以異型雙功能試劑N-羥基琥珀酰亞胺基-間-(N-馬來(lái)酰亞胺基)苯甲酸酯(MBS)修飾，再加入巰基化的Fab′及發(fā)色團(tuán)，經(jīng)純化得到產(chǎn)物。
4.按照權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物及其抗腫瘤作用，其特征是Fab′-平陽(yáng)霉素偶聯(lián)物的制備是將葡聚糖T-40先與平陽(yáng)霉素混合，再與3D6 Fab′反應(yīng)，經(jīng)純化得到產(chǎn)物。
5.按照權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物及其抗腫瘤作用，其特征是體外培養(yǎng)人體肝癌細(xì)胞BEL-7402、口腔鱗癌KB細(xì)胞以及肺癌PG細(xì)胞，用克隆形成法或四氮唑藍(lán)法檢測(cè)游離力達(dá)霉素或平陽(yáng)霉素及與3D6 Fab′偶聯(lián)物的細(xì)胞殺傷作用。
6.按照權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物及其抗腫瘤作用，其特征是動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)，昆明小鼠皮下接種肝癌22或C57/BL6小鼠皮下接種Lewis癌，通過(guò)靜脈注射給藥判斷游離力達(dá)霉素及其偶聯(lián)物對(duì)腫瘤生長(zhǎng)或腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制率。
全文摘要
抗基質(zhì)金屬蛋白酶單抗3D6,以適當(dāng)方法獲得Fab’片段,以N－羥基琥珀酰亞胺基－間－(N－馬來(lái)酰亞胺基)苯甲酸酯或葡聚糖T－40作中介體,將Fab’與力達(dá)霉素(LDM)或平陽(yáng)霉素偶聯(lián),獲得兩種偶聯(lián)物Fab’－LDM及Fab’－PYM,以克隆形成法和四氮唑藍(lán)法檢測(cè)偶聯(lián)物體外對(duì)腫瘤細(xì)胞BEL－7402、KB和PG細(xì)胞的殺傷作用,結(jié)果表明偶聯(lián)物對(duì)體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)殺傷作用,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)用肝癌22和Lewis癌,Fab’－LDM抑制肝癌生長(zhǎng)和Lewis癌肺轉(zhuǎn)移效果優(yōu)于等劑量游離力達(dá)霉素,為單抗Fab’與力達(dá)霉素及平陽(yáng)霉素偶聯(lián)物用于治療腫瘤提供了依據(jù)。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1268377SQ0010349
公開日2000年10月4日 申請(qǐng)日期2000年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月15日
發(fā)明者甄永蘇, 劉小云, 徐琳娜, 尚伯揚(yáng) 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所