專利名稱：殼聚糖/明膠網(wǎng)絡(luò)支架材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程。
組織工程學(xué)是運用工程科學(xué)與生命科學(xué)的基本原理和方法，研究與開發(fā)生物學(xué)替代物來恢復(fù)、維持和改進組織功能的一門新興學(xué)科。其基本思路是在體外分離、培養(yǎng)細胞，將一定量的細胞種植到具有一定形狀的三維生物材料骨架內(nèi)，并加以持續(xù)培養(yǎng)，最終形成具有一定結(jié)構(gòu)的組織和器官并回植體內(nèi)達到修復(fù)或重建的目的。殼聚糖為一種天然聚陽離子多糖(pKa＝6.3)。它具有良好的生物相容性且可生物降解，在生物醫(yī)學(xué)方面應(yīng)用廣泛，如用作透析膜、傷口愈合促進劑及藥物釋放載體等。醫(yī)用殼聚糖可以有效減輕關(guān)節(jié)軟骨的退變，降低關(guān)節(jié)手術(shù)后創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率。明膠為膠原蛋白的變性衍生物，而膠原蛋白為細胞外基質(zhì)的重要成分，且緩沖擠壓的關(guān)節(jié)軟骨的基質(zhì)主要由II型膠原組成。明膠的結(jié)構(gòu)單元為甘氨酸-脯氨酸和羥脯氨酸與賴氨酸(Gly-Pro-Hyp-Hyl)，系柔性兩性電解質(zhì)，等電點pHiso＝4.7。以往的工作多以合成材料，尤其是聚酯類為基材作支架材料，如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)等，它們?nèi)狈毎Y(jié)合位點。[Rouhi A M，Contemporary Biomaterials，Unverstanding surfaces is key to the design of clinically useful materials，Science/technlogy，1998，18，51-59]且其降解產(chǎn)物呈酸性，產(chǎn)物的pH脈沖作用在一定程度上造成無菌炎癥[Kyriacos A.A.，Gabriele G.Niederauer and C.Maul；Agrawal Sterilization，toxicily，Biocompatibility and Clinical.Application ofPoly(lactic acid)/poly(glycolic acid)copolymer，Biomaterials，1996，1793-102]；曾有報道采用殼聚糖或殼聚糖/膠原、殼聚糖/硫酸軟骨素為支架材料基材。雖然殼聚糖本身即有對軟骨等器官生長的促進作用[Jan Xi Lu，F(xiàn)lorence Prudhommeaux，Alain Meunier，Laurent Sedel，Genevieve Guillemin，Effects of chitoan on rat kneecartilages，Biomaterials，1999，201937-1944]但殼聚糖本體結(jié)構(gòu)單一，可調(diào)節(jié)性差，不能滿足細胞特異性要求[Sundararajan X Madihally，Howard W T Matthew，Biomaterials，1999，20(12)1133-1142]；而膠原不但較明膠昂貴許多，其抗原性問題一直是學(xué)者爭議的焦點。文獻也證實殼聚糖/硫酸軟骨素復(fù)合體支架作為載體，其性能并不優(yōu)于殼聚糖多孔材料[Denuziere A.，F(xiàn)errier D.，Damour O.et al.，Chitosan-chondroitin sulfate and chitosan-hyaluronate polyelectrolyte complesesbiological properties，Biomaterials，1998，191275-1285]。明膠從膠原水解而得，很大程度上保留了膠原的生物相容性等優(yōu)點，無抗原性。明膠亦被用作組織工程用支架材料使用，但其強度太低，難于實際應(yīng)用[Hye Won Kang，YasuhikoTabata，Yoshito Ikada，F(xiàn)abrication of porous gelatin scaffolds for tissue engineering，Biomaterials，1990，201339-1344，Young Seon Choi，Sung Ran Hong，Young MooLee，Kang Won Song，Moon Hyang Park，Young Soo Nam，Studies on gelatin-containing artificial skinpreparation and characterization of cross-linked gelatin-hyaluronate sponge，J Biomed Mater Res，1999，48631-639]。
本發(fā)明的目的是采用細胞相容性良好的天然可降解生物材料制備組織工程用細胞培養(yǎng)支架、且親/疏水平衡等性質(zhì)可調(diào)，避免交聯(lián)劑產(chǎn)生的細胞毒性作用，能夠適應(yīng)不同類型細胞的需要。
本發(fā)明采用殼聚糖和明膠為基材制備組織工程用多孔支架材料。制備步驟如下配制0.5～10ml 2～7(wt)％的殼聚糖或殼聚糖/明膠水溶液，將溶液轉(zhuǎn)移至與溶液不反應(yīng)且耐低溫的平底容器中形成1～10mm高度的液面，置入低溫冰箱(-30℃～-70℃)中預(yù)凍8～24小時；將冷凍干燥機干燥室溫度降至較低溫度(-30℃～-40℃)，將培養(yǎng)皿移入干燥室；溫度平衡后密閉干燥室開啟抽氣泵，維持干燥室氣壓小于5000帕斯卡24～72小時，然后升至常壓后加熱至40℃熱烘1～3小時，即得多孔材料粗產(chǎn)品。粗產(chǎn)品精制過程如下以5～20％氫氧化鈉溶液洗滌多孔基材；用去離子水清洗5～10次；采用5％戊二醛溶液50℃下浸泡2～5小時進行交聯(lián)；常溫下用2％硼氫化納浸泡進行脫醛處理；用去離子水沖洗5～10次；降低凍干機溫度至-40℃，將多孔基材連同培養(yǎng)皿一起移入凍干機，抽真空至干燥室氣壓小于5000帕斯卡并保存8～24小時；將多孔基材取出后采用γ射線進行2～10小時，累計10～80萬拉德劑量的照射以達到滅菌；聚乙烯薄膜將多孔基材密封后待用。
本發(fā)明的殼聚糖/明膠網(wǎng)絡(luò)支架材料價格低廉，生物相容性好，親/疏水平衡性可調(diào)，能夠適應(yīng)不同類型細胞的需要，同時保證了多孔材料的力學(xué)強度和生物(細胞)親和性。該支架材料非常適于軟骨細胞附著生長。
實施例取精制后的脫乙酰化度80％殼聚糖2g和明膠2g放入80ml濃度2％的醋酸水溶液，40℃下靜置4小時，達完全溶解將溶液轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶，添加醋酸溶液，得到100ml殼聚糖/明膠溶液(A)。取液(A)20ml轉(zhuǎn)移至90mm聚苯乙烯培養(yǎng)皿，置入-70℃低溫冰箱中預(yù)凍24小時；控制冷凍干燥機干燥室溫度至-40℃，將含預(yù)凍體的培養(yǎng)皿移入干燥室；溫度平衡后密閉干燥室并開啟抽氣泵，維持干燥室氣壓小于50μatm，保持48h；減壓取出后40℃下熱烘2小時，初步獲得多孔材料(B)。取基材(B)浸入10％的氫氧化鈉溶液中和多孔基材中的醋酸；用去離子水反復(fù)清洗，除去殘留醋酸根等離子；將基材浸入0.5％戊二醛溶液交聯(lián)5min；用2％硼氫化納溶液浸泡30分鐘脫醛；用去離子水反復(fù)清洗；置入凍干基進行復(fù)凍，采用Co-60輻射滅菌后密封保存，即得到組織工程用殼聚糖/明膠網(wǎng)絡(luò)支架材料。
權(quán)利要求
1一種殼聚糖/明膠網(wǎng)絡(luò)支架材料，其特征在于配制0.5～10(wt)％的殼聚糖或殼聚糖/明膠水溶液，將溶液轉(zhuǎn)移至與溶液不反應(yīng)且耐低溫的平底容器中形成1～10mm高度的液面，置入低溫冰箱(-30℃～-70℃)中預(yù)凍8～24小時，將培養(yǎng)皿移入溫度為(-30℃～-40℃)的冷凍干燥機干燥室中，溫度平衡后密閉干燥室開啟抽氣泵，維持干燥室氣壓小于5000帕斯卡24～72小時，然后升至常壓后加熱至40℃熱烘1～3小時，即得多孔材料粗產(chǎn)品，以5～20％氫氧化鈉溶液洗滌該多孔基材粗產(chǎn)品，用去離子水清洗5～10次，再用5％戊二醛溶液50℃下浸泡2～5小時進行交聯(lián)，常溫下用2％硼氫化納浸泡進行脫醛處理，再用去離子水沖洗5～10次，降低凍干機溫度至-40℃，將多孔基材連同培養(yǎng)皿一起移入-40℃的凍干機中，抽真空至干燥室氣壓小于5000帕斯卡并保存8～24小時，多孔基材取出后采用γ射線進行2～10小時，累計10～80萬拉德劑量的照射以達到滅菌，然后用聚乙烯薄膜將多孔基材密封后待用。
全文摘要
一種用于生物醫(yī)學(xué)的殼聚糖/明膠網(wǎng)絡(luò)支架材料及其制備方法。采用相分離法制備的殼聚糖/明膠多孔支架材料,材料價格低廉,生物相容性好,親/疏水平衡性可調(diào),適用于軟骨組織細胞附著生長和不同類型細胞的需要,可避免交聯(lián)劑產(chǎn)生的細胞毒副作用。同時保證了多孔材料的力學(xué)強度和生物(細胞)親和性。
文檔編號A61L27/00GK1272384SQ0010628
公開日2000年11月8日 申請日期2000年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月9日
發(fā)明者姚康德, 沈鋒, 尹玉姬, 成國祥 申請人:天津大學(xué)