專(zhuān)利名稱(chēng)：雙特異性單克隆抗體、其制備方法和用其制成的溶血栓劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及用單克隆抗體工程方法生產(chǎn)抗血栓藥物。
心血管類(lèi)疾病，是危害人類(lèi)健康的第一大類(lèi)疾病。而心肌梗塞，是心血管疾病的一個(gè)重要方面。一旦發(fā)生心肌梗塞，患者必須立即用溶栓藥物治療，血栓溶解所需的時(shí)間對(duì)患者的康復(fù)是至關(guān)重要的。
大多數(shù)的心肌梗塞，是由于冠狀動(dòng)脈血栓形成引起的，可以用溶解血栓劑治療。溶栓劑一般是纖維蛋白溶酶原激活劑，可以激活纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白溶酶，后者使血栓中的纖維蛋白溶解，從而使血栓溶解。
鏈激酶、尿激酶和組織型纖溶酶原激酶(tPA)是三種廣泛用于治療血栓癥的溶栓劑，已用于治療急性心血管疾病如心肌梗塞，腦卒中，肺栓塞，深度靜脈血栓癥，外周動(dòng)脈阻塞等。鏈激酶、尿激酶和tPA等，由于對(duì)纖維蛋白專(zhuān)一性不高，因此對(duì)纖維蛋白溶酶原的激活無(wú)選擇性，將使幾種凝血因子包括纖維蛋白原、因子Ⅴ和因子Ⅷ等不同程度地降解，從而造成出血等副作用，嚴(yán)重危害患者的康復(fù)。
為了增加溶栓劑對(duì)血栓的專(zhuān)一性，減少溶栓劑的副作用，有人將尿激酶通過(guò)化學(xué)反應(yīng)連接到抗纖維蛋白特異性抗體上，結(jié)果可明顯地增強(qiáng)尿激酶對(duì)血栓的溶解能力達(dá)100倍以上。因此，可利用單克隆抗體的高度專(zhuān)一性，制備一個(gè)雙特異性單克隆抗體，其一端專(zhuān)一性結(jié)合纖維蛋白，而另一端抗尿激酶等溶栓劑，從而開(kāi)發(fā)一個(gè)具有較強(qiáng)溶栓能力及較小副作用的導(dǎo)向性新型溶栓物質(zhì)。
應(yīng)用化學(xué)連接技術(shù)以及雜交瘤技術(shù)等均可制備雙特異性單克隆抗體。
Runge MS等人，通過(guò)二硫鍵，將抗纖維蛋白單克隆抗體的Fab’與抗單鏈tPA的單克隆抗體連接，得到雙特異性單克隆抗體，這種雙特異性單克隆抗體可使tPA的溶栓能力提高8.6倍。
Kurokawa T等人，將分泌抗尿激酶的單克隆抗體的小鼠雜交瘤細(xì)胞，與分泌抗人纖維蛋白的小鼠雜交瘤細(xì)胞融合，得到了分泌雙特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，將該雜交瘤細(xì)胞注射到小鼠腹腔，從小鼠腹水中收獲雙特異性單克隆抗體，該雙特異性單克隆抗體對(duì)人纖維蛋白的親合常數(shù)為2×10-7，對(duì)尿激酶親合常數(shù)為2×10-8，當(dāng)與尿激酶原和尿激酶結(jié)合時(shí)，對(duì)人血栓的溶栓能力可以分別提高20倍和5倍。
Harber等人，用雜交瘤技術(shù)制備雙特異性單克隆抗體，其一端抗血栓纖維蛋白，另一端是抗溶栓制劑tPA。該雙特異性單克隆抗體與纖維蛋白原沒(méi)有交叉反應(yīng)。將其注入體內(nèi)后，會(huì)迅速富集定位到體內(nèi)的血栓部位，并捕獲內(nèi)源性tPA，從而可降低tPA的劑量，增強(qiáng)溶解纖維蛋白能力和減輕tPA引起出血的副作用。
以化學(xué)的方法雙制備功能單克隆抗體，反應(yīng)難于控制，收率較低，實(shí)際意義不大。雙特異性單克隆抗體的制備方法主要是在富含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞而得到雙特異性單克隆抗體。但是，由于高濃度血清的存在，細(xì)胞密度難于提高，因而抗體的表達(dá)量不高；此外，培養(yǎng)基中大量血清的存在，勢(shì)必影響后續(xù)的抗體分離純化，從而提高單克隆抗體的制造成本。
降低培養(yǎng)基中的血清濃度，是獲得雙特異性單克隆抗體的一個(gè)理想方法。但是，分泌雙特異性單克隆抗體的雜交瘤必須同時(shí)保留四條表達(dá)四種抗體鏈的染色體，因此在降低血清的培養(yǎng)過(guò)程中有兩個(gè)嚴(yán)重問(wèn)題，一個(gè)是容易死亡，另一個(gè)是丟失產(chǎn)抗體鏈的染色體。所以，目前雙特異性抗體的獲得主要是以小鼠腹水方式，但這種方式由于存在人鼠共患疾病傳播的可能性，根本上制約了雙特異性單克隆抗體的實(shí)際應(yīng)用。
各種雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基都有一些基本一致的營(yíng)養(yǎng)成分，如氨基酸、無(wú)機(jī)鹽、維生素、葡萄糖及一些蛋白質(zhì)添加物，包括生長(zhǎng)因子、貼壁因子、激素、結(jié)合蛋白等。一些常規(guī)的培養(yǎng)基如MEM,DMEM,RPMI等基本上都含有這些成分。目前，細(xì)胞培養(yǎng)基主要還是以新生牛或胎牛血清作為主要成分。
血清培養(yǎng)存在許多缺點(diǎn)，首先各種血清必須廣泛篩選，費(fèi)時(shí)，代價(jià)高，而且無(wú)法保證一致，且潛在的血清細(xì)胞毒作用經(jīng)常被忽視；另外，血清成分復(fù)雜，易給細(xì)胞培養(yǎng)帶來(lái)污染，導(dǎo)致產(chǎn)物后處理困難。因此，無(wú)血清培養(yǎng)基的研究是細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域的一項(xiàng)重大課題。目前，已有用于雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)的商品化的無(wú)血清培養(yǎng)基。無(wú)血清培養(yǎng)基減少了操作費(fèi)用和過(guò)程不穩(wěn)定性，并去除了污染的可能性，但無(wú)血清培養(yǎng)基中添加的蛋白成分價(jià)格昂貴，而有的成分如BSZ等一般濃度較高，且雜質(zhì)較多，致使表達(dá)產(chǎn)物分離純化仍較困難。
雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)，主要方式有批培養(yǎng)、補(bǔ)料培養(yǎng)和灌注培養(yǎng)等。
對(duì)雜交瘤細(xì)胞實(shí)行補(bǔ)料培養(yǎng)，使細(xì)胞不斷接受新鮮營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)可降低某些抑制生長(zhǎng)的代謝廢物濃度，增加細(xì)胞密度，提高單克隆抗體產(chǎn)量，因此是細(xì)胞培養(yǎng)的一個(gè)很好的方法。然而，在補(bǔ)料培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞培養(yǎng)周期通常受到不斷補(bǔ)加料液而升高的滲透壓的限制。若補(bǔ)加10倍濃縮的培養(yǎng)基，則可使培養(yǎng)液滲透壓明顯升高，這對(duì)大多數(shù)雜交瘤細(xì)胞而言是致命的。Ryn JS等人用低滲透壓的培養(yǎng)基作為初始培養(yǎng)基，延緩了由于添加10倍補(bǔ)料濃縮液而導(dǎo)致的大量細(xì)胞死亡的啟動(dòng)時(shí)間，使獲得的抗體濃度達(dá)提高5倍多。
單克隆抗體的分離純化一般包括以下幾步鹽析分級(jí)，去除白蛋白、脂蛋白及一些培養(yǎng)基成分；離子交換層析；A蛋白或G蛋白親和層析；凝膠過(guò)濾或疏水層析。
目前，國(guó)內(nèi)外研制的抗纖維蛋白和抗溶栓制劑的雙特異性單克隆抗體大多是通過(guò)化學(xué)過(guò)程合成的，而用雜交瘤細(xì)胞制備抗纖維蛋白和抗溶栓制劑的雙特異性單克隆抗體，也都是通過(guò)小鼠腹水獲取的。一般腹水中單克隆抗體的產(chǎn)量較高，但小鼠無(wú)法避免病原體污染，而且每只小鼠產(chǎn)生的單克隆抗體含量及效價(jià)均有變化，因此后續(xù)提純比較困難。
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種分泌雙特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種雙特異性單克隆抗體。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供用細(xì)胞反應(yīng)器穩(wěn)定生產(chǎn)大量雙特異性單克隆抗體的方法。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種有較強(qiáng)溶血栓能力而副作用較小的導(dǎo)向性溶血栓凍干制劑。
本發(fā)明所提供的雜交瘤細(xì)胞株FZ01保藏于CCTCC，保藏號(hào)No.C200002，該細(xì)胞株分泌一種雙特異性單克隆抗體，所述雙特異性單克隆抗體一端抗尿激酶，另一端專(zhuān)一性抗纖維蛋白，而對(duì)纖維蛋白原無(wú)交叉反應(yīng)。
本發(fā)明所提供的雙特異性單克隆抗體為IgG1型抗體，分子量150KD，對(duì)纖維蛋白的親和常數(shù)為6.3×10-10，對(duì)尿激酶的親和常數(shù)為2.93×10-10，而對(duì)纖維蛋白原無(wú)親和性，系保藏于CCTCC、保藏號(hào)為No.C200002的雜交瘤細(xì)胞株FZ01所產(chǎn)生。
本發(fā)明所提供的雙特異性單克隆抗體的制備方法包括構(gòu)建雜交瘤細(xì)胞后將雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，再進(jìn)行補(bǔ)料培養(yǎng)，然后分離純化雙特異性單克隆抗體。
本發(fā)明所提供的溶血栓凍干制劑包含有效量的雙特異性單克隆抗體和尿激酶，其比例為2.5∶1-6∶1，及藥用賦形劑。
以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
本發(fā)明構(gòu)建了一株三源雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞株，所述細(xì)胞株分泌一種雙特異性單克隆抗體，該雙特異性單克隆抗體一端抗尿激酶，另一端專(zhuān)一性抗纖維蛋白，而對(duì)纖維蛋白原無(wú)交叉反應(yīng)。
本發(fā)明針對(duì)雜交瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)，開(kāi)發(fā)了適合細(xì)胞生長(zhǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基，實(shí)現(xiàn)了雜交瘤細(xì)胞從高血清培養(yǎng)基到無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的轉(zhuǎn)變，雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的能力保持不變。
本發(fā)明采用5L細(xì)胞培養(yǎng)罐，實(shí)現(xiàn)了對(duì)產(chǎn)抗纖維蛋白和抗尿激酶的雙特異性單克隆抗體的三源雜交瘤細(xì)胞的補(bǔ)料培養(yǎng)。為了避免補(bǔ)料液高滲透壓對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的影響，采取不同于一般補(bǔ)加10倍DMEM濃縮液的補(bǔ)料培養(yǎng)。在雜交瘤細(xì)胞批培養(yǎng)代謝研究的基礎(chǔ)上，配置了適合該細(xì)胞株的補(bǔ)料液，另外，為了避免細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中副產(chǎn)物，尤其是乳酸和氨的累積對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的影響，補(bǔ)料培養(yǎng)過(guò)程采用控制葡萄糖和谷氨酰胺濃度作為雙限制性因素，控制細(xì)胞合理的代謝途經(jīng)，最終實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的高密度，高產(chǎn)的目的。
本發(fā)明在補(bǔ)料培養(yǎng)后收集培養(yǎng)基，用親和層析的方法，獲得高純度、高親和力的雙特異性單克隆抗體。


圖1是本發(fā)明的流程圖。
本發(fā)明的具體實(shí)施方案如下1．分泌雙特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的構(gòu)建纖維蛋白原用凝血酶酶解，產(chǎn)生纖維蛋白，免疫BALB/c小鼠。分離免疫脾細(xì)胞，同骨髓瘤細(xì)胞株融合，得到雜交瘤，篩選產(chǎn)生抗纖維蛋白而與纖維蛋白原無(wú)交叉反應(yīng)抗體的雜交瘤。把該雜交瘤細(xì)胞株同以小分子尿激酶為抗原的BALB/c鼠免疫脾細(xì)胞融合，篩選分泌抗尿激酶及抗纖維蛋白的雜交瘤細(xì)胞株。所得雜交瘤細(xì)胞株，其分泌的抗體對(duì)纖維蛋白、血栓及尿激酶有高度親和性，是一種雙特異性單克隆抗體。
2．雜交瘤細(xì)胞株從血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化為無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)含15％小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞，采用連續(xù)穩(wěn)定的線路，將血清從15％-10％-5％-4％-3％-2％-1％逐漸降低，每一步降低血清濃度，均用有限稀釋的方法，選擇分泌抗體量變化不大的單克隆。細(xì)胞穩(wěn)定在添加1％小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基中后，換用添加1％無(wú)IgG的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，開(kāi)始無(wú)血清的適應(yīng)，同時(shí)用有限稀釋的方法，選擇分泌抗體量變化不大的單克隆。同上述方法，繼續(xù)以1％-0.5％-0.2％-0.1％-0.05％-0％，降低血清濃度。最后，細(xì)胞完全適應(yīng)在無(wú)血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，同時(shí)用有限稀釋的方法，選擇分泌抗體量變化不大的單克隆，制備種子庫(kù)，分裝凍存。
3．細(xì)胞反應(yīng)器補(bǔ)料培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞為了達(dá)到細(xì)胞高密度及高產(chǎn)的目的，避免細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)成分耗竭和代謝副產(chǎn)物尤其是乳酸和氨的累積，采用控制培養(yǎng)液中葡萄糖和谷氨酰胺濃度，即流加葡萄糖和谷氨酰胺的補(bǔ)料培養(yǎng)方法。
細(xì)胞反應(yīng)器補(bǔ)料培養(yǎng)包括以下步驟1)進(jìn)行無(wú)血清批培養(yǎng)，無(wú)血清培養(yǎng)基包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM/F12(1∶1)；基本添加劑ITES，即低內(nèi)毒素的胰島素(I)5-20mg/l、轉(zhuǎn)鐵蛋白(T)5-20mg/l、乙醇胺(E)1-10μmol/l、亞硒酸鈉(S)50-100nmol/l；和輔助添加劑地塞米松0.5-2ng/ml、腐胺10-15μmol/l、維生素E15-30μmol/l、維生素C15-30μmol/l和氫化可的松0.5-1μg/ml。
起始培養(yǎng)基的葡萄糖濃度為2.0g/L，谷氨酰胺4.0mM/L。
2)進(jìn)行補(bǔ)料培養(yǎng)，細(xì)胞接種密度為1～2.0×105個(gè)細(xì)胞/ml，培養(yǎng)初期采用表面通氣，葡萄糖濃度降至1.0g/L以下時(shí)開(kāi)始流加補(bǔ)料培養(yǎng)基，控制培養(yǎng)液中葡萄糖濃度為0.25-1g/L，谷氨酰胺濃度為0.5-2.0mM/L。當(dāng)細(xì)胞密度升高至1.0×106個(gè)細(xì)胞/ml以上時(shí)，改為深層通氣。培養(yǎng)過(guò)程中定時(shí)測(cè)細(xì)胞的氧耗率，以分析細(xì)胞的代謝情況。培養(yǎng)到120小時(shí)，細(xì)胞密度達(dá)最大5.0×107個(gè)/ml，細(xì)胞活性為90％以上。整個(gè)培養(yǎng)周期為312小時(shí)，分泌的雙特異性單克隆抗體濃度可達(dá)500mg/L以上。
在細(xì)胞反應(yīng)器補(bǔ)料培養(yǎng)過(guò)程中確定反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液葡萄糖和谷氨酰胺濃度的方法1)在轉(zhuǎn)瓶中進(jìn)行無(wú)血清批培養(yǎng)，起始培養(yǎng)基的葡萄糖濃度為2.0g/L，谷氨酰胺4.0mM/L。
2)在轉(zhuǎn)瓶中進(jìn)行補(bǔ)料培養(yǎng)，分別控制補(bǔ)料液葡萄濃度；根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)及雙特異性單克隆抗體的濃度最高，確定培養(yǎng)液中葡萄糖濃度為0.25-1g/L，最佳濃度控制為0.5g/L。
3)在轉(zhuǎn)瓶中進(jìn)行補(bǔ)料培養(yǎng)，培養(yǎng)液葡萄糖濃度控制在0.5g/L。分別控制培養(yǎng)液中谷氨酰胺濃度，根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)及雙特異性單克隆抗體的濃度最高，確定谷氨酰胺濃度為0.5-2.0mM/L，最佳濃度控制為1.0mM/L。
4、分離純化收獲的培養(yǎng)液，調(diào)pH2.5-3.0，以硫酸銨分級(jí)沉淀。離心收集沉淀，稱(chēng)重，加100～200倍緩沖液懸浮，調(diào)pH7.0-8.0，過(guò)纖維蛋白親和柱，洗滌，洗脫。比活大于10萬(wàn)IU/mgPr.的尿激酶，過(guò)經(jīng)pH7.2-7.6緩沖液平衡的苯甲脒親和柱，經(jīng)緩沖液洗滌后，將上述洗脫液過(guò)柱，洗滌后，洗脫。加硫酸銨沉淀，離心收集沉淀，加水懸浮，調(diào)pH4.0-4.5，過(guò)分子篩S-200，收集抗體洗脫峰。SDS-PAGE及RP-HPLC檢測(cè)，所得雙特異性單克隆抗體純度達(dá)95％以上，分子量為150KD。
5．雙特異性單克隆抗體的性質(zhì)1)以瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)及ELISA方法測(cè)定，本發(fā)明所述雙特異性單克隆抗體為IgG1型抗體。對(duì)纖維蛋白的親和常數(shù)為6.3×10-10，對(duì)尿激酶的親和常數(shù)為2.93×10-10，而對(duì)纖維蛋白原則無(wú)親和性。
2)本發(fā)明所述之單克隆抗體與尿激酶按克分子數(shù)3∶1的比例組成復(fù)合物，進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)。結(jié)果表明，對(duì)一定的溶栓效果，復(fù)合物中尿激酶的劑量可減少到單獨(dú)使用尿激酶的五分之一，而溶栓速度更快，血漿中纖維蛋白原的含量使用前后變化不大，提示復(fù)合物出血的危險(xiǎn)大大減少了。
3)本發(fā)明的雙特異性單克隆抗體對(duì)尿激酶原有較高的親和性，其親和常數(shù)與尿激酶相當(dāng)。
本發(fā)明所提供的溶血栓凍干制劑包含有效量的雙特異性單克隆抗體和尿激酶，其比例為2.5∶1-6∶1，及藥用賦形劑。所述雙特異性單克隆抗體和尿激酶的比例以3∶1為佳；藥用賦形劑可采用本領(lǐng)域常用的賦形劑，如0.5-2％甘露醇、0.0004％吐溫80、10mM PB和0.1M NaCl。
通過(guò)本發(fā)明的方法，實(shí)現(xiàn)了雜交瘤細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中、于細(xì)胞反應(yīng)器內(nèi)以補(bǔ)料方式培養(yǎng)，達(dá)到雙特異性單克隆抗體的高表達(dá)；用親和層析的方法進(jìn)行分離純化，從培養(yǎng)基中獲得了高純度、高親和力的雙特異性單克隆抗體。本發(fā)明的方法可用于穩(wěn)定地生產(chǎn)大量的雙特異性單克隆抗體。動(dòng)物試驗(yàn)表明，該雙特異性單克隆抗體使尿激酶的溶血栓能力提高5～10倍，而出血的副作用大大減小。
本發(fā)明的補(bǔ)料培養(yǎng)方法對(duì)其它雜交瘤細(xì)胞及一般動(dòng)物細(xì)胞的補(bǔ)料培養(yǎng)也有一定的借鑒作用。
以下用實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例說(shuō)明，它們旨在闡述本發(fā)明的最佳實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的啟示，結(jié)合本領(lǐng)域的常識(shí)所做的各種變更，均落在本申請(qǐng)權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
實(shí)施例1細(xì)胞降血清濃度適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基選擇細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，活性大于95％的細(xì)胞，添加15％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，于100ml的方瓶中培養(yǎng)。每天換液，去除懸浮于液體中的細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)一個(gè)月，始終保持95％以上活性，單克隆抗體濃度為20mg/l。
換添加10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，繼續(xù)每天換液，去除懸浮于液體中的細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)一個(gè)月，始終保持95％以上活性，以有限稀釋的方法，選擇分泌單克隆抗體濃度為20mg/l以上的單克隆細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。
換添加5％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，繼續(xù)每天換液，去除懸浮于液體中的細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)一周，始終保持95％以上活性，以有限稀釋的方法，選擇分泌單克隆抗體濃度為20mg/l以上的單克隆細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。按上述方法，依序5％-4％-3％-2％-1％將血清濃度降至1％。
將細(xì)胞用10ml離心管，1000rpm轉(zhuǎn)速，離心10min，將離心的細(xì)胞轉(zhuǎn)入添加1％無(wú)IgG胎牛血清的無(wú)血清培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)二周，細(xì)胞活性保持在90％以上，以有限稀釋的方法，選擇分泌單克隆抗體濃度為20mg/l以上的單克隆細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。
換添加0.5％無(wú)IgG胎牛血清的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，繼續(xù)每天換液，去除懸浮于液體中的細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)一周，恢復(fù)細(xì)胞活性達(dá)95％以上，以有限稀釋的方法，選擇分泌單克隆抗體濃度為20mg/l以上的單克隆細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。按上述方法，依序0.5％-0.2％-0.1％-0.05％將血清濃度降至0.05％。
將細(xì)胞用10ml離心管，1000rpm轉(zhuǎn)速，離心10min，將離心的細(xì)胞轉(zhuǎn)入添加無(wú)血清培養(yǎng)基中，細(xì)胞活性保持在90％以上，以有限稀釋的方法，選擇分泌單克隆抗體濃度為20mg/l以上的單克隆細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，使細(xì)胞活性恢復(fù)至95％以上，分泌單克隆抗體濃度為20mg/l以上。以無(wú)血清培養(yǎng)基分裝，凍存。
實(shí)施例2無(wú)血清培養(yǎng)基的選擇以化學(xué)成分明確的DMEM/F12作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。按1∶1的體積比配成溶液。
選擇ITES作為基本添加劑I低內(nèi)毒素的胰島素，10μg/mlT轉(zhuǎn)鐵蛋白，10μg/mlE乙醇胺，10μmol/lS亞硒酸鈉，100nmol/l細(xì)胞在100ml的方瓶中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞，細(xì)胞可在添加ITES的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，但活性和細(xì)胞密度不高細(xì)胞在50ml的小方瓶中做系列培養(yǎng)試驗(yàn)，分別添加地塞米松、氫化可的松、亞油酸、膽固醇、腐胺、對(duì)羥基苯甲酸、維生素E、維生素C、巰基乙醇等組分在方瓶中進(jìn)行批培養(yǎng)，以活細(xì)胞密度，存活率和抗體濃度為尋優(yōu)目標(biāo)，將優(yōu)化條件的細(xì)胞再進(jìn)行兩兩組合，最后選定四個(gè)組分作為另外添加劑。
分別以各添加劑的濃度梯度作系列實(shí)驗(yàn)，得到合適的濃度。
無(wú)血清培養(yǎng)基的確定標(biāo)準(zhǔn)為在500ml方瓶中裝液20ml，分別接入在含有5％血清RPM1640培養(yǎng)基和無(wú)血清培養(yǎng)基中適應(yīng)的細(xì)胞，接種密度為1.0×105cells/ml，每種條件各接種3個(gè)方瓶，每隔24小時(shí)取樣計(jì)數(shù)，最后一起測(cè)單克隆抗體濃度。細(xì)胞培養(yǎng)到第3天，在有血清和無(wú)血清條件下，細(xì)胞密度都達(dá)到最高，分別為1.0×106cells/ml和1.5×106cells/ml，單克隆抗體濃度分別為20mg/L和20-25mg/L。
實(shí)施例3流加補(bǔ)料液的選擇細(xì)胞活性為95％的細(xì)胞，以1×105cell/ml的密度，接種到150ml轉(zhuǎn)瓶中，培養(yǎng)基體積60ml，轉(zhuǎn)速60r/min。培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱CO2濃度為5％，培養(yǎng)溫度為36.8℃。每隔12小時(shí)取樣，計(jì)數(shù)。
用YS12700型選擇性生化分析儀測(cè)定葡萄糖濃度，乳酸脫氫酶法測(cè)定乳酸，日立835-50型氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定氨基酸濃度，尿素試劑盒測(cè)定氨濃度(不選用脲酶，而改用2.5mmol/l(NH4)2SO4作為標(biāo)準(zhǔn)液)。
培養(yǎng)到60小時(shí)細(xì)胞達(dá)到最大密度2×106cell/ml，細(xì)胞活性為90％。培養(yǎng)到120小時(shí)，細(xì)胞活性下降到10％，單克隆抗體濃度達(dá)最大40mg/l，批培養(yǎng)結(jié)束。
分析培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞生長(zhǎng)和各營(yíng)養(yǎng)成分的消耗及生成速率，得到流加補(bǔ)料液的配方。將補(bǔ)料液配成10倍濃縮液。
實(shí)施例4控制葡萄糖濃度的流加培養(yǎng)細(xì)胞活性為95％的細(xì)胞，以1×105cell/ml的密度，接種到四只150ml轉(zhuǎn)瓶中，培養(yǎng)基體積60ml，轉(zhuǎn)速60r/min。培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱CO2濃度為5％，培養(yǎng)溫度為36.8℃。
四只150ml轉(zhuǎn)瓶中，起始的谷氨酰胺濃度為4.0mM/L，起始的葡萄糖濃度分別為No.1 2.0g/L；No.2 1.5g/L；No.3 1.0g/L；No.4 0.5g/L每隔6小時(shí)取樣計(jì)數(shù)，測(cè)葡萄糖濃度，對(duì)No1-No4分別補(bǔ)加濃度為100g/L的葡萄糖濃縮液，使各轉(zhuǎn)瓶中的葡萄糖濃度分別控制在初始水平附近，同時(shí)補(bǔ)加10倍濃縮補(bǔ)料液，使其它成分不成為限制因素。
結(jié)果表明補(bǔ)料培養(yǎng)較批培養(yǎng)而言，葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸的摩爾得率系數(shù)明顯下降，抗體產(chǎn)量明顯上升，當(dāng)葡萄糖濃度為0.5g/L的條件最優(yōu)。
實(shí)施例5谷氨酰胺控制的流加培養(yǎng)細(xì)胞活性為95％的細(xì)胞，以1×105cell/ml的密度，接種到四只150ml轉(zhuǎn)瓶中，培養(yǎng)基體積60ml，轉(zhuǎn)速60r/min。培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱CO2濃度為5％，培養(yǎng)溫度為36.8℃。
四只150ml轉(zhuǎn)瓶中，起始的葡萄糖濃度為1g/L，谷氨酰胺濃度分別為No.1 4.0mM/L；No.2 2.0mM/L；No.3 1.5mM/L；No.4 1.0mM/L。
每隔6小時(shí)取樣計(jì)數(shù)，測(cè)葡萄糖濃度和谷氨酰胺濃度，對(duì)No1-No4分別補(bǔ)加濃度為100g/L的葡萄糖濃縮液和100mM/L的谷氨酰胺濃縮液，使各瓶培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度控制在0.5g/L水平附近，而各轉(zhuǎn)瓶中的谷氨酰胺濃度分別控制在初始水平附近，同時(shí)補(bǔ)加其它營(yíng)養(yǎng)成分，使之不成為限制因素。
結(jié)果表明，補(bǔ)料培養(yǎng)較批培養(yǎng)谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為氨的摩爾得率系數(shù)明顯下降，抗體產(chǎn)量明顯上升，當(dāng)葡萄糖濃度為1.0mM/L的條件最優(yōu)。
實(shí)施例6細(xì)胞反應(yīng)器補(bǔ)料培養(yǎng)將5L CelliGen Plus生物反應(yīng)器及配件安裝好后，用pH分別為4.003、6.86和9.18(25℃)的標(biāo)準(zhǔn)pH溶液標(biāo)定pH電極，然后在罐體中加入PBS至工作體積，連同pH、DO電極一起高壓滅菌(121℃,60min)。冷卻后，校正DO電極，將罐內(nèi)PBS壓出，接通氣體，整個(gè)系統(tǒng)準(zhǔn)備完畢，可接種細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。
PBS從罐中壓出后，分別將細(xì)胞種子和新鮮培養(yǎng)基壓入罐中，最終體積為2.5L。細(xì)胞接種密度為2.0×105cell/ml每隔12小時(shí)取樣、計(jì)數(shù)、測(cè)葡萄糖和谷氨酰氨濃度。在培養(yǎng)初期，通氣以表面通氣的形式進(jìn)入反應(yīng)器當(dāng)葡萄糖濃度降至1.0g/L以下時(shí)，開(kāi)始補(bǔ)加流加培養(yǎng)基。在培養(yǎng)初期，通氣以表面通氣的形式進(jìn)入反應(yīng)器；當(dāng)細(xì)胞密度大于1.0×106cell/ml時(shí)改為深層通氣。在反應(yīng)器培養(yǎng)中，每隔一段時(shí)間，測(cè)一次細(xì)胞的氧消耗速率，以分析細(xì)胞的代謝情況。
培養(yǎng)到120小時(shí)，細(xì)胞密度大于1.0×107cell/ml，細(xì)胞活性為90％。
整個(gè)培養(yǎng)周期為312小時(shí)，最終單克隆抗體濃度達(dá)850mg/L，收獲培養(yǎng)液5升。收獲的培養(yǎng)液立即以冰醋酸調(diào)pH2.5，攪拌30分鐘，加25％硫酸銨，攪拌三個(gè)小時(shí)以上。
實(shí)施例7雙特異性單克隆抗體的分離純化實(shí)施例6所得的硫酸銨沉淀，10000rpm離心，25分鐘，收集沉淀。
取沉淀5克，以500ml 50mM NaH2PO4,0.4M NaCl,pH7.4懸浮，攪拌1小時(shí)，10000rpm離心，25分鐘，收集上清。上清過(guò)經(jīng)50mM NaH2PO4,0.4M NaCl,pH7.4平衡的纖維蛋白-Sepharose 6B柱(20×30cm)，洗滌，以0.1MHAc,0.4M NaCL,pH3.0洗脫，收集洗脫峰。
0.5克比活大于10萬(wàn)IU/mgPr.的尿激酶，以100ml 50mM NaH2PO4,0.4M NaCl,pH7.4溶解，過(guò)經(jīng)50mM 50mM NaH2PO4,0.4M NaCl,pH7.4平衡的苯甲脒-Sepharose 6B(26×16cm)，經(jīng)50mM NaH2PO4,0.4M NaCl,pH7.4洗滌。將上述洗脫液調(diào)之pH7.4，過(guò)柱，50mM NaH2PO4,0.4M NaCl,pH7.4洗滌后，以0.1M HAc,0.4M NaCL,pH3.0洗脫。洗脫液加硫酸銨至30％沉淀，攪拌3小時(shí)以上，離心收集沉淀，加水懸浮，調(diào)pH4.0-4.5，過(guò)分子篩S-200(26×100cm)，收集抗體洗脫峰。總收率為22％。SDS-PAGE及RP-HPLC檢測(cè)，所得雙特異性單克隆抗體純度達(dá)95％以上，分子量為150KD。
實(shí)驗(yàn)例1含雙特異性單克隆抗體的溶血栓劑的藥效學(xué)研究按照江蘇醫(yī)藥1987,3:131-133和Drugs,1996,(52)4:589的方法，用家兔靜脈血栓模型進(jìn)行本發(fā)明的含雙特異性單克隆抗體(雙抗)溶血栓劑的藥效學(xué)研究。受試物為尿激酶和尿激酶-雙抗(1∶3,w/w)復(fù)合物，分別用注射用生理鹽水溶解，每2ml分別含以下劑量。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。
表1本發(fā)明的溶血栓劑的藥效學(xué)研究
上述結(jié)果表明，本發(fā)明的溶血栓劑(尿激酶+雙特異性單克隆抗體)的溶血栓作用為尿激酶的5倍以上，而引起出血的可能性比尿激酶小得多，即產(chǎn)生相同的溶栓效果時(shí)，本發(fā)明的溶血栓劑不會(huì)引起出血。
實(shí)驗(yàn)例2含雙特異性單克隆抗體的溶血栓劑的藥代動(dòng)力學(xué)研究采用Beagle狗進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究，受試物為尿激酶和(尿激酶+雙特異性單克隆抗體)復(fù)合物，其中尿激酶以125Ⅰ標(biāo)記，用注射用生理鹽水配制成溶液，按尿激酶0.2mg/kg的劑量于1分鐘內(nèi)進(jìn)行靜脈注射，以預(yù)定的時(shí)間間隔測(cè)定血漿中125Ⅰ的放射活性，測(cè)出半衰期。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果尿激酶t1/2=0.35小時(shí)；復(fù)合物t1/2=0.59小時(shí)。
上述結(jié)果提示，本發(fā)明的溶血栓劑(尿激酶+雙特異性單克隆抗體)半衰期比尿激酶長(zhǎng)，因此以一定劑量的尿激酶計(jì)，溶栓效果提高。
權(quán)利要求
1．三源雜交瘤細(xì)胞株，所述細(xì)胞株保藏于CCTCC，保藏號(hào)No.C200002，該細(xì)胞株分泌一種雙特異性單克隆抗體，所述雙特異性單克隆抗體一端抗尿激酶，另一端專(zhuān)一性抗纖維蛋白，而對(duì)纖維蛋白原無(wú)交叉反應(yīng)。
2．雙特異性單克隆抗體，所述雙特異性單克隆抗體為IgG1型抗體，分子量150KD，對(duì)纖維蛋白的親和常數(shù)為6.3×10-10，對(duì)尿激酶的親和常數(shù)為2.93×10-10，而對(duì)纖維蛋白原無(wú)親和性，系保藏于CCTCC、保藏號(hào)為No.C200002的雜交瘤細(xì)胞株所產(chǎn)生。
3．權(quán)利要求2所述雙特異性單克隆抗體的制備方法，其特征在于構(gòu)建雜交瘤細(xì)胞后將雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，再進(jìn)行補(bǔ)料培養(yǎng)，然后分離純化雙特異性單克隆抗體。
4．如權(quán)利要求3所述的方法，其中無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)是在無(wú)血清適應(yīng)后再用無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，所述無(wú)血清培養(yǎng)基包括(1)基本培養(yǎng)基DMEM/F12(1∶1)；(2)基本添加劑ITESI低內(nèi)毒素的胰島素，5-20μg/mlT轉(zhuǎn)鐵蛋白，5-20μg/mlE乙醇胺，1-10μmol/lS亞硒酸鈉，50-100nmol/l；(3)輔助添加劑地塞米松0.5-2ng/ml、腐胺10-15μmol/l、維生素E15-30μmol/l、維生素C15-30μmol/l和氫化可的松0.5-1μg/ml。
5．如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述無(wú)血清適應(yīng)包括如下步驟將雜交瘤細(xì)胞在含15％小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用有限稀釋法逐步降低血清濃度，直至血清濃度為1％，每步均選擇分泌抗體量變化不大的單克??；細(xì)胞穩(wěn)定在添加1％小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基中后，換用添加無(wú)IgG的1％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，用有限稀釋法逐步降低血清濃度，直至血清濃度為0％、細(xì)胞完全適應(yīng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
6．如權(quán)利要求5所述的方法，其中血清濃度的降低先從15％-10％-5％-4％-3％-2％-1％，換用添加1％無(wú)IgG胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基后以1％-0.5％-0.2％-0.1％-0.05％-0％降低血清濃度。
7．如權(quán)利要求3所述的方法，其中補(bǔ)料培養(yǎng)包括以下步驟1)進(jìn)行無(wú)血清批培養(yǎng)，起始培養(yǎng)基的葡萄糖濃度為2.0g/L，谷氨酰胺4.0mM/L；2)進(jìn)行補(bǔ)料培養(yǎng)，細(xì)胞接種密度為1～2.0×105個(gè)細(xì)胞/ml，培養(yǎng)初期采用表面通氣，葡萄糖濃度降至1.0g/L以下時(shí)開(kāi)始流加補(bǔ)料培養(yǎng)基，控制培養(yǎng)液中葡萄濃度為0.25-1g/L，谷氨酰胺濃度為0.5-2.0mM/L，當(dāng)細(xì)胞密度升高至1.0×106個(gè)細(xì)胞/ml上以上時(shí)，改為深層通氣，培養(yǎng)過(guò)程中定時(shí)測(cè)細(xì)胞的氧耗率。
8．如權(quán)利要求7所述的方法，其中補(bǔ)料培養(yǎng)基葡萄濃度為0.5g/L，谷氨酰胺濃度為1.0mM/L。
9．如權(quán)利要求3所述的方法，其中分離純化包括酸化、硫酸銨分級(jí)沉淀；纖維蛋白柱親和層析、尿激酶柱親和層析和分子篩S-200過(guò)濾。
10．溶血栓凍干劑，包含有效量的權(quán)利要求2所述雙特異性單克隆抗體和尿激酶，其比例為2.5∶1-6∶1，及藥用賦形劑。
11．如權(quán)利要求10所述的溶血栓凍干劑，其中雙特異性單克隆抗體和尿激酶的比例為3∶1。
12．如權(quán)利要求10所述的溶血栓凍干劑，其中藥用賦形劑為0.5-2％甘露醇、0.0004％吐溫80、10mM PB和0.1M NaCl。
全文摘要
提供分泌一種雙特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。所述雙特異性單克隆抗體為IgGl型抗體,分子量150KD,對(duì)纖維蛋白的親和常數(shù)為6.3×10
文檔編號(hào)A61P9/02GK1311257SQ0011178
公開(kāi)日2001年9月5日 申請(qǐng)日期2000年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月2日
發(fā)明者易進(jìn)華, 沈紅 申請(qǐng)人:上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥有限公司