專利名稱：一種溶栓藥物,其制備方法及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于藥物技術領域，具體地說，涉及一種以葉下珠或者同屬植物越南葉下珠或余甘子或珍珠草或蜜柑草為原料制成的抗血栓藥物，該藥物的制備方法，及其在制藥領域中的用途。
統(tǒng)計數據表明由血栓及動脈粥樣硬化引起的心血管系統(tǒng)疾病是人類主要的死亡原因和疾病之一。血栓病(腦、心、四肢梗塞等)發(fā)病率高，腦中風、心肌梗塞成為人類死亡的主要因素。腦中風中70％是腦血栓。近億病人需抗凝、溶栓、活血化瘀治療的高效、低價藥物。血栓的形成和消除關鍵在于tPA(組織纖溶酶原激活物，tissue-type plasminogen activator)和PAI-1(纖溶酶原激活物的抑制劑，Plasminogen activator inhibitor-1)間的平衡。通過這兩者之間的相互作用，血漿中PAI-1的活性高低調節(jié)著整個纖溶過程(Dawson etal．，Atherosclerosis 1992，95105)。臨床和實驗數據顯示血漿中PAI-1的活性升高是一個非常危險的因子，會導致血纖維蛋白降解作用的降低，從而引發(fā)一系列的心血管疾病，如心肌梗塞、冠狀動脈血栓形成等(Charlton，Drug of theFuture 1997，2245)。因此，抑制PAI-1的活性是一個非常重要的治療靶點。尋找低分子量的PAI-1抑制劑將會發(fā)現新型高效的溶栓藥。目前臨床上使用的溶栓藥都有一個共同的缺陷即出血并發(fā)癥，同時治療費用高、半衰期短，并且由于是大分子常常易導致過敏。由于其獨特的作用機理，高選擇性的PAI-1抑制劑將有可能避免此副作用。對此領域近年來歐美一些發(fā)達國家的大制藥集團十分感興趣，然而至今為止已發(fā)現的小分子量PAI-1抑制劑屈指可數，英國Xenova公司有一個微生物來源的化合物已完成動物體內和體外試驗，現已進入臨床(Xenova)?；谝陨?，開發(fā)新的天然小分子PAI-1抑制劑，并將其作為新型溶栓藥用于血栓栓塞性疾病的治療、預防和恢復，用于心肌梗塞、高血壓、心絞痛、中風、腦血栓、肺栓塞和四肢動靜脈栓塞以及視網膜動靜脈栓塞等疾病是一新的研制抗血栓藥物的途徑。迄今為止，現有技術還沒有以葉下珠(Phyllanthusurinaria)或者其同屬植物越南葉下珠或余甘子或珍珠草或蜜柑草為原料提取的乙醇提取物作為有效部位或有效成分制成溶栓藥物的報道。
本發(fā)明的目的在于提供一種以葉下珠(Phyllanthus urinaria)、或同屬植物越南葉下珠(Phyllanthus cochinchinensis)或余甘子(P.emblica)或珍珠草(P.simplex)或蜜柑草(P.matsumurae)的乙醇提取物作為有效部位制成溶栓藥物，同時提供該藥物的制備方法，及其在制備抗血栓栓塞藥物、抗心肌梗塞藥物、抗高血壓藥物、治療心絞痛疾病藥物、治療中風病藥物、抗腦血栓藥物、抗肺栓塞藥物、抗四肢動靜脈栓塞藥物以及抗視網膜動靜脈栓塞藥物中的應用。
為了實現本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了如下的技術方案一種溶栓藥物，以葉下珠或越南葉下珠或余甘子或珍珠草或蜜柑草為原料按照下述方法制成的藥物取葉下珠或越南葉下珠或余甘子或珍珠草或蜜柑草，干燥、粉碎得干粉，用甲醇、工業(yè)酒精、含水丙酮任其一種溶劑在室溫下提取2-4次，提取液在30℃-40℃下減壓濃縮至干得浸膏，將浸膏用正丁醇、乙酸乙酯或含少量有機酸的正丁醇混懸，用水分次萃取，合并水層，40℃減壓濃縮至小體積，然后進行噴霧干燥得干粉，按干粉與可藥用載體和／或賦形劑重量比為0．1∶99．9-99∶1的比例配制成固體制劑；或按常規(guī)液體制劑制備方法配制成液體制劑。
本發(fā)明還提供了上述溶栓藥物的制備方法，取葉下珠或越南葉下珠或余甘子或珍珠草或蜜柑草，干燥、粉碎得干粉，用甲醇、工業(yè)酒精、含水丙酮任其一種溶劑在室溫下提取2-4次，提取液在30℃-40℃下減壓濃縮至干得浸膏，將浸膏用正丁醇、乙酸乙酯或含少量有機酸的正丁醇混懸，用水分次萃取，合并水層，40℃減壓濃縮至小體積，然后進行噴霧干燥得干粉，按干粉與可藥用載體和／或賦形劑重量比為0．1∶99．9-99∶1的比例配制成固體制劑。
本發(fā)明同時提供了上述溶栓藥物的另一種制備方法，取葉下珠或越南葉下珠或余甘子或珍珠草或蜜柑草，干燥、粉碎得干粉，用甲醇、工業(yè)酒精、含水丙酮任其一種溶劑在室溫下提取2-4次，提取液在30℃-40℃下減壓濃縮至于得浸膏，將浸膏用正丁醇、乙酸乙酯或含少量有機酸的正丁醇混懸，用水分次萃取，合并水層，40℃減壓濃縮至小體積，然后進行噴霧干燥得干粉，然后按常規(guī)液體制劑制備方法配制成液體制劑。
本發(fā)明還提供了上述溶栓藥物在制備抗血栓栓塞、抗心肌梗塞藥物、抗高血壓藥物、治療心絞痛疾病藥物、治療中風病藥物、抗腦血栓藥物、抗肺栓塞藥物、抗四肢動靜脈栓塞藥物以及抗視網膜動靜脈栓塞藥物中的應用。
上述植物的有效部位用作藥物時，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。該藥物組合物含有0．1~99％，優(yōu)選為0．5~90％的有效部位，其余為藥物學上可接受的，對人和動物無毒和惰性的可藥用載體和／或賦形劑。
所述的載體是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料以及藥物制品輔劑，將所述的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明的藥物可經口服和注射(靜注、肌注)兩種形式給藥。
口服可服用其固體或液體制劑，如粉劑、片劑、糖衣劑、膠囊、粒劑浮液、糖漿、滴丸劑型等。
注射可用其固體或液體制劑，如粉針劑、溶液型注射劑等。
為了更好地理解本發(fā)明的實質，下面用本發(fā)明的制備方法得到的上述植物的乙醇提取物提取的有效部位(以下簡稱PUW)及其與藥用載體或賦形劑組成的藥物的藥理作用結果來說明它在醫(yī)藥領域中的應用。
1．PAI-1抑制活性篩選試驗r-PAI-1為美國Molecular lnnovations Inc．出品，尿激酶為Sigma產品，Chromozym U為德國Boehringer Mannheim出品。將所試樣品按一定濃度溶于DMSO，先與r-PAI-1孵化10分鐘，然后加入尿激酶和底物Chromozym U，反應開始，45分鐘后用32％醋酸中斷反應，405nm波長處測定底物分解產物的吸收值。根據試驗測定Corilagin的IC50為10μg／ml。
2．小鼠急性毒性試驗A．口服給藥ICR小鼠，雌雄各半，體重18-22g，禁食12小時后，PUW以0．4mL／10g灌胃，由于求不出半數致死量，故按最大賴受量實驗要求進行實驗，連續(xù)觀察14天，無一只動物死亡，其最大賴受量(MTD)為5．6g／kg。A．靜脈注射ICR小鼠，雌雄各半，體重18-22g，禁食12小時后，PUW以0．2ml／10g從尾靜脈注射，于20秒內注射完畢。連續(xù)觀察14天，其半數致死量為259．6mg／kg(95％可信區(qū)間222．4-303．1mg／kg)。
3．大鼠尾尖出血試驗PUW 10mg／kg從雄性SD大鼠股靜脈一次性注入后，動物尾尖出血時間從生理鹽水組的14．6±0．6min略延長到16．9±1．3min，而肝素100U／kg靜注后，出血時間則明顯延長到37．1±1．3min。表明PUW在產生更強的抗栓作用時，其對出血的影響更小。
4．PUW對花生四烯酸引起小鼠血栓形成的影響A．口服給藥從雄性小鼠尾靜脈注入一定量的花生四烯酸(AA)，觀察30min內小鼠死亡情況，以死亡率的高低評價藥物對清醒動物體內血栓形成的作用。從以75mg／kg尾靜脈注射，顯著性用X2檢驗處理，結果顯示PUW 10mg／kg即具有與20mg／kg的阿司匹林相當的作用，死亡率從對照組的80％降低至53．3％。A．靜脈注射PUW 2．5mg／kg靜注后，明顯降低動物死亡數(P＞0．05)，5mg／kg的PUW靜注后其作用與10mg／kg的阿司匹林相當，死亡率從對照組的80％降低到40％。
5．PUW對電刺激大鼠頸動脈血栓形成的影響雄性SD大鼠，體重250-300g。暴露左頸總動脈并用銀制電極刺激(正負電極間距為1cm)以1．5mA刺激7min，頸動脈血流量用血流量儀探測，從刺激開始到血流量為零的時間為血栓形成時間(Occlusion time，OT)。A．口服給藥生理鹽水組的OT為18．1±1．6 min，阿司匹林20 mg／kg組為34．2±2．3min，PUW 10，20mg／kg組的OT分別為27．0±2．6和35．0±3．6min。A．靜脈注射生理鹽水組的OT為17．7±0．8min，20mg／kg阿司匹林組為27．8±1．6min，PUW 5，10和20mg／kg組的OT分別為27．2±1．7，31．2±2．1和36．7±1．9min。結果表明5mg／kg的PUW即具有明顯的抗電刺激大鼠頸動脈血栓形成作用，其強度與20mg／kg阿司匹林相當。
6．靜脈血栓形成作用雄性SD大鼠體重200-250g。用40mg／kg戊巴比妥鈉麻醉，沿腹中線打開腹腔，游離下腔靜脈并于左腎靜脈水平結扎之，關閉腹腔。1小時后，灌胃或從股靜脈給藥；再過1小時，打開腹腔，收集下腔靜脈內的栓子，稱其濕重，然后置60℃烤廂烘烤20小時后稱其干重。A．口服給藥生理鹽水組血栓的干濕重分別為4．1±0．8和9．9±2．0mg。20mg／kg阿司匹林組分別為1．0±0．9和2．2±2．3mg。20mg／kg PUW組的血栓干濕重各為1．3±0．9和2．9±2．0mg。A．靜脈注射生理鹽水組血栓的干濕重分別為4．1±0．5和9．9±1．8mg。10mg／kg阿司匹林組血栓的干濕重分別為2．9±0．5和6．1±1．3mg。5，10和20mg／kg PUW組血栓的干重分別是2．8±0．6，2．2±0．7和1．7±0．6mg，PUW上述劑量組的血栓濕重各為6．0±1．1，5．2±0．9和3．7±1．0mg。
7．PUW的溶栓作用雄性SD大鼠，體重200-300g，改良Peter方法，左頸總動脈以2mA刺激5min，用血流量儀連續(xù)探測頸動脈血流量。以刺激結束后至血流量為刺激前的50％為血栓形成時間。血栓形成后20min，PUW，生理鹽水及尿激酶均一次性靜脈注射。給藥后1h，觀察血管再通情況，若出現再通，則繼續(xù)觀察血管開放狀態(tài)1h。以≥50％或≤25％刺激前血流量者判定為再通或繼后的再栓塞，血管開放程度分別為無再通(PO)，再通與再栓塞交錯出現(CR)，和再通后持續(xù)開放(PP)三種狀態(tài)，結果表明，PUW呈劑量相關性溶栓效應5mg／kg，其再通率與2000U／kg尿激酶相當；l0mg／kg，其再通率為50％，低于2000U／kg尿激酶的60％再栓率；生理鹽水組無一動物出現再通，再通后血管開放狀態(tài)表現為，生理鹽水組均持續(xù)栓塞；2000U／kg尿激酶開放狀態(tài)與5mg／kg的PUW相似10mg／kgPUW組，其持續(xù)再通率高于2000U／kg的尿激酶(血管開放狀態(tài)，見表1)。上述結果揭示，一次性靜注后，PUW有較強的溶栓和防止溶栓后再栓塞作用。
表1 一次性靜注PUW溶栓后1h動脈開放狀態(tài)
<p>表2 PUW對動脈血栓的溶栓作用
上述藥效學結果表明，口服和靜脈注射PUW在多種血栓模型中均具有很強的溶栓和抗血栓形成作用。
8．作用機制PUW在體外顯著提高血漿中組織型纖溶酶原激活物(tissue-typeplasminogen activator，tPA)活性，降低血漿1-型纖溶酶原激活物抑制物(type-1 plasminogen activator inhibitor，PAI-1)活性。體內試驗大鼠麻醉后，靜脈注射PUW 1．0mg／kg／min 20分鐘，明顯降低血漿和血小板內PAI-1活性，升高tPA活性，提示PUW是通過抑制PAI-1活性并升高tPA活性來發(fā)揮抗血栓作用的。
綜上所述，PUW作為一種新型溶栓藥。有以下優(yōu)勢1)源于葉下珠(Phyllanthus urinaria)及其同屬植物越南葉下珠(Phyllanthus cochinchinensis)、余甘子(P．emblica)、珍珠草(P．simplex)，蜜柑草(P．matsumurae)，資源豐富，價格低廉。提取及加工工藝簡便，可批量生產。
2)口服和靜脈注射均可，溶栓藥效肯定，作用強。
3)克服了目前臨床常用的溶栓藥易致出血的副作用。
4)口服及靜脈注射后基本無毒性。
5)其溶栓機制是在體內外直接抑制PAI-1活性而升高tPA活性，是迄今唯一的植物來源的天然小分子PAI-1抑制劑。
6)為心肌梗塞、高血壓、心絞痛、中風、腦血栓、肺栓塞和四肢動靜脈栓塞以及視網膜動靜脈栓塞等疾病的預防、治療和恢復提供了新型溶栓藥。
下面結合實施例進一步對本發(fā)明的實質內容進行說明，但本發(fā)明的內容并不局限于此。
實施例1將采集的新鮮葉下珠(Phyllanthus urinaria)地上部分涼干、粉碎得干粉15．42Kg。然后用93％以上的工業(yè)酒精室溫下提取4次，提取液在40℃下減壓濃縮至干得浸膏1365g。將浸膏用正丁醇-醋酸-水(4∶1∶5)的正丁醇層溶解、懸浮。用水層萃取，合并水層，40℃減壓濃縮至小體積，然后進行噴霧干燥得干粉(PUW)401．7g。通過高壓液相色譜(HPLC)檢查其干粉(PUW)，主要含兩個成分，其中Corilagin含量大于60％(用純corilagin作為標準品對照，按常規(guī)用HPLC方法測定含量)。按干粉與賦形劑重量比為9∶1的比例加入賦形劑，制成膠囊。
實施例2按實施例1的方法先制得葉下珠干粉(PUW)，按干粉與賦形劑重量比為5∶1的比例加入賦形劑，制成粉劑。
實施例3按實施例1的方法先制得葉下珠干粉(PUW)，按干粉與賦形劑重量比為5∶1的比例加入賦形劑，制成糖衣劑。
實施例4按實施例1的方法先制得葉下珠干粉(PUW)，按干粉與賦形劑重量比為2∶1的比例加入賦形劑，制粒壓片。
實施例5將采集的新鮮葉下珠(Phyllanthus urinaria)地上部分涼干、粉碎得干粉15．42Kg。然后用93％以上的工業(yè)酒精室溫下提取3次，提取液在35℃下減壓濃縮至干得浸膏1365g。將浸膏用正丁醇-醋酸-水(4∶1∶5)的正丁醇層溶解、懸浮。用水層萃取，合并水層，40℃減壓濃縮至小體積，然后進行噴霧干燥得干粉(PUW)401．7g。通過高壓液相色譜(HPLC)檢查其干粉(PUW)，主要含兩個成分，其中Corilagin含量大于60％(用純corilagin作為標準品對照，按常規(guī)用HPLC方法測定含量)，將干粉溶于無菌注射用水中，攪拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于2ml安瓿中，低溫冷凍干燥后無菌熔封得粉針劑。
實施例6按實施例1或5的方法先制得葉下珠干粉(PUW)，按常規(guī)口服液制法制成口服液。
實施例7按實施例1或5的方法先制得葉下珠干粉(PUW)，將干粉溶于水溶液中，按常規(guī)制糖漿方法制成糖漿。
實施例8按實施例1或5的方法先制得葉下珠干粉(PUW)，然后按常規(guī)滴丸劑的方法制成滴丸劑。
實施例9按實施例1或5的方法先制得葉下珠干粉，然后按常規(guī)加注射用水，精濾，灌封滅菌制成注射液。
實施例10將采集的新鮮葉下珠越南葉下珠Phyllanthus cochinchinensis地上部分涼干、粉碎得干粉1Kg。然后用93％以上的工業(yè)酒精室溫下提取4次，提取液在40℃下減壓濃縮至干得浸膏90g。將浸膏用正丁醇-醋酸-水(4∶1∶5)的正丁醇層溶解、懸浮。用水層萃取，合并水層，40℃減壓濃縮至小體積，然后進行噴霧干燥得干粉25g。通過高壓液相色譜(HPLC)檢查其干粉(PUW)，主要含兩個成分，其中Corilagin含量大于60％(用純corilagin作為標準品對照，按常規(guī)用HPLC方法測定含量)。按干粉與賦形劑重量比為9∶1的比例加入賦形劑，制成膠囊。
實施例11將采集的新鮮同屬植物余甘子P．emblica枝葉涼干、粉碎得干粉5Kg。然后用93％以上的工業(yè)酒精室溫下提取4次，提取液在40℃下減壓濃縮至干得浸膏450g。將浸膏用正丁醇-醋酸-水(4∶1∶5)的正丁醇層溶解、懸浮。用水層萃取，合并水層，40℃減壓濃縮至小體積，然后進行噴霧干燥得干粉(PUW)150g。通過高壓液相色譜(HPLC)檢查其干粉，主要含兩個成分，其中Corilagin含量大于60％(用純corilagin作為標準品對照，按常規(guī)用HPLC方法測定含量)。按干粉與賦形劑重量比為9∶1的比例加入賦形劑，制成膠囊。
實施例12將采集的新鮮珍珠草P．simplex地上部分涼干、粉碎得干粉10Kg。然后用93％以上的工業(yè)酒精室溫下提取4次，提取液在40℃下減壓濃縮至干得浸膏985g。將浸膏用正丁醇-醋酸-水(4∶1∶5)的正丁醇層溶解、懸浮。用水層萃取，合并水層，40℃減壓濃縮至小體積，然后進行噴霧干燥得干粉280g。通過高壓液相色譜(HPLC)檢查其干粉，主要含兩個成分，其中Corilagin含量大于60％(用純corilagin作為標準品對照，按常規(guī)用HPLC方法測定含量)。按干粉與賦形劑重量比為9∶1的比例加入賦形劑，制成膠囊。
實施例13將采集的新鮮同屬植蜜柑草P．matsumurae全草1公斤，涼干、粉碎加水煎提2次，水液經大孔吸附樹脂處理得總甙，總甙經硅膠短柱層析粗分，再經純化得化合物1-酰-3，6-六羥基聯苯二甲酰基葡萄糖(Corilagin)5．07g。按Corilagin與賦形劑重量比為9∶1的比例加入賦形劑，制成膠囊。
權利要求
1.一種溶栓藥物，其特征是以葉下珠或越南葉下珠或余甘子或珍珠草或蜜柑草為原料按照下述方法制成的藥物取葉下珠或越南葉下珠或余甘子或珍珠草或蜜柑草，干燥、粉碎得干粉，用甲醇、工業(yè)酒精、含水丙酮任其一種溶劑在室溫下提取2-4次，提取液在30℃-40℃下減壓濃縮至干得浸膏，將浸膏用正丁醇、乙酸乙酯或含少量有機酸的正丁醇混懸，用水分次萃取，合并水層，40℃減壓濃縮至小體積，然后進行噴霧干燥得干粉，按干粉與可藥用載體和／或賦形劑重量比為0．1∶99．9-99∶1的比例配制成固體制劑；或按常規(guī)液體制劑制備方法配制成液體制劑。
2.權利要求1所述溶栓藥物的制備方法，其特征是取葉下珠或越南葉下珠或余甘子或珍珠草或蜜柑草，干燥、粉碎得干粉，用甲醇、工業(yè)酒精、含水丙酮任其一種溶劑在室溫下提取2-4次，提取液在30℃-40℃下減壓濃縮至干得浸膏，將浸膏用正丁醇、乙酸乙酯或含少量有機酸的正丁醇混懸，用水分次萃取，合并水層，40℃減壓濃縮至小體積，然后進行噴霧干燥得干粉，按干粉與可藥用載體和／或賦形劑重量比為0．1∶99．9-99∶1的比例配制成固體制劑。
3.權利要求1所述溶栓藥物的制備方法，其特征是取葉下珠或越南葉下珠或余甘子或珍珠草或蜜柑草，干燥、粉碎得干粉，用甲醇、工業(yè)酒精、含水丙酮任其一種溶劑在室溫下提取2-4次，提取液在30℃-40℃下減壓濃縮至干得浸膏，將浸膏用正丁醇、乙酸乙酯或含少量有機酸的正丁醇混懸，用水分次萃取，合并水層，40℃減壓濃縮至小體積，然后進行噴霧干燥得干粉，按常規(guī)液體制劑制備方法配制成液體制劑。
4.權利要求1所述藥物在制備抗血栓栓塞藥物中的應用。
5.權利要求1所述藥物在制備抗心肌梗塞藥物中的應用。
6.權利要求1所述藥物在制備抗高血壓藥物中的應用。
7.權利要求1所述藥物在制備治療心絞痛疾病藥物中的應用。
8.權利要求1所述藥物在制備治療中風病藥物中的應用。
9.權利要求1所述藥物在制備抗腦血栓藥物中的應用。
10.權利要求1所述藥物在制備抗肺栓塞藥物中的應用。
11.權利要求1所述藥物在制備抗四肢動靜脈栓塞藥物中的應用。
12.權利要求1所述藥物在制備抗視網膜動靜脈栓塞藥物中的應用
全文摘要
本發(fā)明涉及以葉下珠或者同屬植物越南葉下珠、余甘子、珍珠草、蜜柑草為原料制成的溶栓藥物,該藥物的制備方法,及其在制藥領域中的用途,如作為新型溶栓藥用于血栓栓塞性疾病的治療、預防和恢復,用于心肌梗塞、高血壓、心絞痛、中風、腦血栓、肺栓塞和四肢動靜脈栓塞以及視網膜動靜脈栓塞等疾病的治療、預防和恢復。
文檔編號A61P9/10GK1278433SQ0011289
公開日2001年1月3日 申請日期2000年4月26日 優(yōu)先權日2000年4月26日
發(fā)明者劉吉開, 沈志強, 董澤軍, 陳志和, 譚建文 申請人:中國科學院昆明植物研究所, 昆明醫(yī)學院