專利名稱：降低低密度脂蛋白膽固醇濃度的組合物和方法
技術領域：
本發(fā)明涉及降低血液中低密度脂蛋白膽固醇濃度和總膽固醇濃度的方法和組合物。具體地說，本發(fā)明涉及含有植物甾醇、大豆蛋白和異黃酮類，以及它們的混合物的組合物，該組合物用于降低血液LDL-膽固醇和總膽固醇的濃度，用于預防動脈粥樣硬化以及減緩動脈粥樣硬化的發(fā)展。
心血管疾病的發(fā)病率高，導致的死亡率也高，在美國和西歐國家中尤其如此。涉及心血管疾病發(fā)展的數(shù)種起因包括疾病的遺傳性、性別、生活方式因素(例如吸煙和飲食)、年齡、高血壓和高脂血癥，包括高膽固醇血癥。這些因素中的幾種，尤其是高脂血癥和高膽固醇血癥對動脈粥樣硬化的發(fā)展起著作用，是血管和心臟病的主要起因。
高血膽固醇濃度是人類血管病和冠心病的主要危險因素之一。高低密度脂蛋白膽固醇(下文稱“LDL-膽固醇”)和高總膽固醇與冠心病的危險性增高直接相關。膽固醇和死亡率Framinghan研究跟蹤30年，Anderson,Castelli,&Levy,JAMA,Vol257,pp.2176-80(1987)。
飲食中攝入的大豆蛋白與冠心病的危險性降低有關，這反映在血清膽固醇水平的降低。已知大豆蛋白降低動物血液中的總膽固醇和LDL-膽固醇水平。最近關于大豆蛋白的攝入對人血清中脂質的影響的代謝分析顯示飲食大豆蛋白與人血清總膽固醇和LDL-膽固醇濃度的降低明顯相關。大豆蛋白的攝入對人血清中脂盾影響的代謝分析，Anderson,Johnstone,和Cook-Newell,《新英格蘭醫(yī)學雜志》(N.Eng.J.Med.)，第333卷，第5期，276-82頁(1995)。
據(jù)報道，全大豆中發(fā)現(xiàn)的化合物-植物甾醇的攝入降低血液中循環(huán)的總膽固醇和LDL膽固醇水平。飲食植物甾醇代謝、益處和副作用的綜述，Ling&Jones，《生命科學》(Life Sci.),Vol.57:3,pp.195-206(1995)。植物甾醇是植物產生的甾醇化合物，它們在結構上與膽固醇非常類似，不同的是它們一般都在甾醇側鏈的C24位帶有一些取代基。普通的植物甾醇包括不飽和甾醇B-谷甾醇、菜油甾醇和豆甾醇(如附

圖1所示)和它們的飽和對應物谷甾烷醇(sitostanol)和菜油甾烷醇(campestanol)(如附圖2所示)。植物甾醇的飲食來源是玉米油、大豆油和其他植物油，它們含有相對疏水性的化合物。
附圖3和4中所示的植物雌激素性異黃酮是在全大豆中發(fā)現(xiàn)的另一類化合物，最近認為它們是使血液中LDL和總膽固醇濃度降低的主要因素。純化濃縮的異黃酮，尤其是染料木黃酮，能夠抑制膽固醇的生物合成并阻止LDL膽固醇的氧化，該氧化步驟是動脈粥樣硬化發(fā)展中的一個重要步驟。參見，例如韓國專利97-20103；在平滑肌細胞中氧化的低密度脂蛋白介導的磷酯酶D的活化在細胞增殖和動脈粥樣化形成中的可能作用，Natarajan等，J.Lipid Res.,36:9,pp.2005-16(1995年9月)。
在加工全大豆生產大豆油、大豆蛋白和藥品或食品添加劑組合物的常規(guī)過程中，植物甾醇、異黃酮和大豆蛋白被分離。采用機械和化學法提取去皮大豆，將植物甾醇與大豆蛋白和異黃酮分離，進入大豆油部分，該部分含有脂肪和脂溶性物質。將大豆油部分與其余的大豆物料——“脫脂大豆物料”分離用于豆油和植物油，還可進一步加工成起酥油、人造奶油和卵磷脂。
脫脂大豆物料，通常稱脫脂大豆餅，被用作生產含有大量大豆蛋白產品的原料，例如生產大豆蛋白濃縮物和大豆蛋白分離物。用于生產大豆蛋白產品的脫脂大豆物料也含有異黃酮。然而，在生產大豆蛋白物質，例如大豆蛋白濃縮物和大豆蛋白分離物的常規(guī)方法中，大量異黃酮卻通過用醇提取液或水提取液洗滌大豆蛋白物料而從大豆蛋白物料中分離。參見，例如大豆蛋白產品、特性、營養(yǎng)與利用，pp.3-6(Pub.Soy Protein Council,1987)。
在大豆蛋白物質的工業(yè)化生產中，人們的注意力在于從大豆蛋白物質中分離異黃酮，因為當大豆蛋白物質中存在異黃酮時，被認為與較差的滋味，氣味和/或顏色有關。例如美國專利5804234教導了一種通過將蛋白物質與吸附樹脂接觸從大豆物料中除去異黃酮，從而產生風味較佳的大豆蛋白物質的方法。特別優(yōu)選對大豆蛋白物質進行醇提取，因為醇提取比水提取產生的植物蛋白物的滋味更好，部分原因是由于醇可十分有效地從大豆蛋白物質中除去異黃酮。參見，例如日本專利63-245648A。
最近，人們的注意力也集中在從植物材料，尤其是大豆、紅花草中分離其中存在的異黃酮，以提供可用于保健的精制異黃酮物質。例如，下列專利公開了各種從植物材料中分離異黃酮的方法美國專利 4428876；5702752；5679806；4390559；4366248；4366082；4264509；4232122；4157984；日本專利1-258669A；5-170756A；41-90720A；62-126186A；和PCT專利申請WO93/23069。分離出的異黃酮化合物可用于藥物組合物或食品添加劑組合物，以預防或治療各種不良的健康狀況，包括降低高膽固醇水平。例如，分離出的異黃酮物質可用于藥品或食品添加劑組合物，如下列專利文獻中所述美國專利5516528；5424331；5569459；5654011和PCT專利申請WO93/23069。
仍然需要能夠明顯降低血液中LDL和總膽固醇水平，從而明顯降低動脈粥樣硬化和冠心病的危險性均利用大豆成分的新方法和組合物。
一方面，本發(fā)明是一種含有大豆蛋白物質、至少一種異黃酮和一種植物甾醇的組合物，所述大豆蛋白物質含至少占大豆蛋白物質干重49％的大豆蛋白，所述異黃酮選自染料木黃酮、黃豆苷原、黃豆黃素、雞豆黃素A、芒柄花素和它們各自天然存在的糖苷和糖苷綴合物，其中植物甾醇至少占組合物重量的0.49％。
另一方面，本發(fā)明是一種含有大豆蛋白物質和植物甾醇的組合物，所述大豆蛋白物質含至少占大豆蛋白物質于重49％的大豆蛋白，其中的植物甾醇至少占組合物重量的0.49％。
另一方面，本發(fā)明是一種含有至少一種異黃酮和一種植物甾醇的組合物，所述異黃酮選自染料木黃酮、黃豆苷原、黃豆黃素、雞豆黃素A、芒柄花素和它們各自天然存在的糖苷和糖苷綴合物，其中植物甾醇至少占組合物重量的0.49％。
另一方面，本發(fā)明是一種降低人血液中LDL和總膽固醇的濃度的方法，該方法包括給人聯(lián)合服用大豆蛋白物質、異黃酮和植物甾醇，所述大豆蛋白物質含至少占大豆蛋白物質干重49％的大豆蛋白，所述異黃酮選自染料木黃酮、黃豆苷原、黃豆黃素、雞豆黃素A、芒柄花素和它們各自天然存在的糖苷和糖苷綴合物，以降低人血液中的LDL和總膽固醇的濃度。聯(lián)合服用的植物甾醇至少占聯(lián)合服用的大豆蛋白物質、異黃酮和植物甾醇總重量的0.49％。在優(yōu)選的方案中，給人聯(lián)合服用植物甾醇、大豆蛋白物質和異黃酮，以預防人類動脈粥樣硬化和減緩動脈粥樣硬化的發(fā)展。
另一方面，本發(fā)明是一種降低人血液中低密度脂蛋白膽固醇和總膽固醇的濃度的方法，該方法包括給人聯(lián)合服用大豆蛋白物質和植物甾醇，所述大豆蛋白物質含至少占大豆蛋白物質干重49％的大豆蛋白，以降低人血液中的LDL和總膽固醇的濃度。聯(lián)合服用的植物甾醇至少占聯(lián)合服用的大豆蛋白物質和植物甾醇總重量的0.49％。在優(yōu)選的方案中，給人聯(lián)合服用植物甾醇和大豆蛋白物質，以預防人類動脈粥樣硬化和減緩動脈粥樣硬化的發(fā)展。
另一方面，本發(fā)明是一種降低人血液中LDL和總膽固醇的濃度的方法，該方法包括給人聯(lián)合服用植物甾醇和異黃酮，所述異黃酮選自染料木黃酮、黃豆苷原、黃豆黃素、雞豆黃素A、芒柄花素和它們各自天然存在的糖苷和糖苷綴合物，以降低人血液中的LDL和總膽固醇的濃度。聯(lián)合服用的植物甾醇至少占聯(lián)合服用的植物甾醇和異黃酮的總重量的0.49％。在優(yōu)選的方案中，給人聯(lián)合服用植物甾醇和異黃酮，以預防人類動脈粥樣硬化和減緩動脈粥樣硬化的發(fā)展。
另一方面，本發(fā)明是一種含有大豆下胚軸物質和植物甾醇的組合物，其中的植物甾醇至少占組合物重量的0.49％。
附圖1描述了不飽和植物甾醇β-谷甾醇、菜油甾醇和豆甾醇的分子結構。
附圖2描述了飽和植物甾醇谷甾烷醇和菜油甾烷醇的分子結構。
附圖3描述了本發(fā)明中使用的配基異黃酮的分子結構。
附圖4描述了代表性異黃酮糖苷和異黃酮糖苷綴合物的分子結構。
本文采用的“Mal”表示“丙二?；保癆c”表示“乙?；薄Ｐg語“減緩”或其派生詞包括完全或部分抑制特定的生物作用(由使用術語減緩的上下文可以清楚地理解)。當“異黃酮”或“植物雌激素”定義為選自一組異黃酮的至少一種時，本文采用的術語“異黃酮”或“植物雌激素”可以理解為一種異黃酮或植物雌激素，或者多種異黃酮或植物雌激素。術語“異黃酮糖苷”是指具有與其共價連接的糖單體的異黃酮。術語“異黃酮糖苷綴合物”是指具有與異黃酮糖苷的糖部分連接的另一個分子殘基如酯的異黃酮糖苷。本文采用的“藥物制劑”是由醫(yī)師處方的一種化合物或多種化合物的混合物與向人有效釋放所述化合物或化合物的混合物的賦形劑的混合物。非處方制劑是與對人有效釋放化合物或化合物混合物的賦形劑結合的一種或多種化合物的混合物，它們無需醫(yī)師處方即可給人服用。
本發(fā)明基于如下發(fā)現(xiàn)完成當以聯(lián)合服用的各成分降低膽固醇的有效量聯(lián)合服用植物甾醇與大豆蛋白物質和/或異黃酮時，能協(xié)同降低人血液中低密度脂蛋白膽固醇和總膽固醇的水平。因此，本發(fā)明涉及聯(lián)合應用植物甾醇(也稱為“phytosterols”)與大豆蛋白物質和/或選定的異黃酮降低血液中LDL和總膽固醇濃度的組合物和方法。另外，植物甾醇與大豆蛋白物質，以及尤其是與異黃酮聯(lián)合應用通過降低血液中LDL和總膽固醇的濃度以及通過抗氧劑作用和酪氨酸激酶抑制作用來有效預防動脈粥樣硬化或減緩動脈粥樣硬化的發(fā)展。因此，本發(fā)明還涉及預防動脈粥樣硬化或減緩動脈粥樣硬化的發(fā)展的組合物和方法。組合物在一個方案中，本發(fā)明的組合物包括聯(lián)合應用的植物甾醇和大豆蛋白物質或至少一種異黃酮，所述大豆蛋白物質含有至少占大豆蛋白物質干重的49％，所述異黃酮選自染料木黃酮、黃豆苷原、黃豆黃素、雞豆黃素A、芒柄花素和它們各自天然存在的糖苷和糖苷綴合物；或者聯(lián)合應用的植物甾醇、異黃酮和大豆蛋白物質。最優(yōu)選的組合物含有所有三種成分植物甾醇、大豆蛋白物質和異黃酮，因此，可協(xié)同利用各成分的LDL和總膽固醇降低作用。
在另一個方案中，本發(fā)明的組合物包括與大豆下胚軸物質聯(lián)合應用的植物甾醇，大豆下胚軸物質一般含有約37％-約44％(重量)的大豆蛋白。大豆下胚軸/植物甾醇組合物另外還可包括至少一種選自染料木黃酮、黃豆苷原、黃豆黃素、雞豆黃素A、芒柄花素和它們各自天然存在的糖苷和糖苷綴合物的異黃酮。
植物甾醇可用于本發(fā)明組合物的植物甾醇包括飽和和不飽和的植物甾醇?？捎糜诒景l(fā)明組合物的優(yōu)選的不飽和植物甾醇是附圖1所示的β-谷甾醇、菜油甾醇和豆油甾醇?？捎糜诒景l(fā)明組合物的優(yōu)選的飽和植物甾醇是附圖2所示的菜油甾烷醇和豆油甾烷醇。不飽和的甾醇β-谷甾醇和菜油甾醇是特別優(yōu)選的。
本發(fā)明組合物中的植物甾醇的量為組合物總重的至少0.49％，更優(yōu)選為組合物總重的約0.5％-約99.5％，最優(yōu)選為組合物總重的約1％-約60％。組合物中植物甾醇的相對量取決于該組合物是否含有大豆蛋白物質。如果組合物含有大豆蛋白物質，組合物中植物甾醇的量通常明顯低于不含大豆蛋白物質的組合物中的植物甾醇量(以占組合物總重的百分比計)。
大豆蛋白物質在一個方案中，可用于本發(fā)明組合物的大豆蛋白物質是含有至少占大豆蛋白物質干重49％的大豆蛋白的大豆蛋白物質。至少含49％大豆蛋白(干重)的優(yōu)選大豆蛋白物質是脫脂大豆粉和大豆片，它們含有49％～約65％(重量)的大豆蛋白；大豆蛋白濃縮物，它們至少含有65％～約90％(重量)的大豆蛋白；和大豆蛋白分離物，它們至少含有90％(重量)的大豆蛋白。大豆蛋白濃縮物和大豆蛋白分離物是特別優(yōu)選的。在另一個方案中，可用于本發(fā)明組合物中的大豆蛋白物質是大豆下胚軸材料。
本發(fā)明組合物中存在的大豆蛋白物質的量占組合物總重的0％～99.55％。當該組合物中包括大豆蛋白物質時，它優(yōu)選至少占組合物總重的主要部分，更優(yōu)選是組合物總重的約55％～約99.55％，尤其優(yōu)選是組合物總重的約75％～約99.55％，最優(yōu)選是組合物總重的約80％～約99.5％。如果組合物中不含異黃酮，則總是含有大豆蛋白物質。
異黃酮可用于本發(fā)明組合物中的異黃酮是附圖3中所示的配基異黃酮染料木黃酮、黃豆苷原、黃豆黃素、雞豆黃素A、芒柄花素和天然存在的這些配基異黃酮的糖苷和糖苷綴合物，包括附圖4所示的染料木苷、6”-O-Mal染料木苷、6”-O-Ac染料木苷、黃豆苷、6”-O-Mal黃豆苷、6”-O-Ac黃豆苷、glycitin和6”-O-Mal glycitin。組合物中可使用一種或多種異黃酮。配基異黃酮是特別優(yōu)選的，因為它們是生物活性最強的異黃酮。用于本發(fā)明組合物的最優(yōu)選異黃酮是染料木黃酮、黃豆苷原、雞豆黃素A和/或芒柄花素。
組合物中異黃酮的量占組合物總重的0％～約60％。當組合物中包括大豆蛋白物質時，組合物中異黃酮的量占組合物總重的約0％～約15％。異黃酮的含量最優(yōu)選占組合物總重的約0.0066％～約10％。如果組合物不含大豆蛋白物質，則總是含有異黃酮。
本發(fā)明的組合物可采用本領域熟知的方法和步驟通過獲得并混合上述成分來制備。
植物甾醇可通過從植物中提取和分離植物甾醇或者通過化學手段合成甾醇來獲得?；蛘?，組合物中可以以在組合物中足以提供所需水平的植物甾醇的量使用含植物甾醇的油，所述油是用提取植物油的常規(guī)方法從含植物甾醇的植物中提取的。
在一個優(yōu)選的方案中，植物甾醇是按照美國專利3993756(特別是實施例10)的方法從不可皂化的大豆油餾分中獲得的，該文獻在本文中引作參考。簡單地說，是從全大豆中獲取含有約40-50％(重量)植物甾醇的不可皂化的大豆油餾分。大豆油采用常規(guī)的粉碎、去皮、剝落、和提取方法從全大豆得到。大豆油通過常規(guī)的直至最后脫臭步驟的大豆油精制方法進行精制。大豆油的脫臭在2-3mmHg減壓下于225℃～235℃進行，以從大豆油中蒸餾和分離含植物甾醇的提取物。通過將提取物與甲醇和濃酸(重量比1克提取物∶1.72克甲醇0.019克硫酸)在65-70℃回流3-4小時將提取物中含有的游離脂肪酸轉化為甲酯。停止反應后，減壓除去甲醇，殘留的油狀物用80-100℃的水洗滌，除去硫酸。然后通過在20-30mm Hg于170-190℃蒸餾除去脂肪酸的甲酯。純化所得的殘留物，得到含40-50％植物甾醇的不可皂化的大豆油餾分。不可皂化餾分中的植物甾醇是β-谷甾醇、菜油甾醇和豆甾醇。不可皂化餾分可進一步通過HPLC純化，得到各植物甾醇單體，或者更優(yōu)選將不可皂化餾分直接作為本發(fā)明組合物的植物甾醇的來源。
β-谷甾醇也可按照已知方法從其他植物油中提取。按照Anderson等在《美國化學會志》(J.Am.Chem.Soc.)48,2897(1926)中描述的方法，可從麥胚油和玉米油中分離β-谷甾醇；按照Gloyer等在《美國化學會志》(J.Am.Chem.Soc.)61,1901(1939)中描述的方法，可從黑麥胚油中分離β-谷甾醇；Wallis在《有機化學雜志》(J.Org.Chem.),2,335(1937)中描述的方法，可從棉籽油中分離β-谷甾醇；以及按照Sandqvist等在Ber.64,2167(1931)中描述的方法，可從妥爾油中提取β-谷甾醇，這些文獻均在本文中引作參考。
菜油甾醇也可按照例如Fernholz等在《美國化學會志》63,1155(1941)中提供的已知方法從其他值物油中提取，該文獻在本文中引作參考。菜油甾醇也可通過Tarzia等在Gazz.Chim.Ital.,97,102(1967)和《化學文摘》(Chem Abstr.),67,32883q中描述的方法合成，這兩篇文獻在本文中引作參考。豆甾醇可從大豆或毒扁豆中分離。
飽和植物甾醇可從它們的不飽和對應物通過氫化獲得。利用常規(guī)的氫化方法，可將β-谷甾醇和豆甾醇轉化為谷甾烷醇，將菜油甾醇轉化為菜油甾烷醇。
一些植物甾醇有商品出售，購得后可直接摻入本發(fā)明的組合物中。例如，菜油甾醇和豆甾醇可從Aldrich Chemical Company,Inc.940 West SaintPaul Avenue,Milwaukee,Wisconisin購得，β-谷甾醇可從Sigma ChemicalCompany,3050 Spruce Street,St.Louis,Missouri購得。
在一個方案中，大豆蛋白物質是脫脂大豆蛋白粉或碎粒、大豆蛋白濃縮物或大豆蛋白分離物，它們各含至少49％(重量)的大豆蛋白。為獲得脫脂大豆粉或大豆碎粒，按照常規(guī)的大豆加工方法，將全大豆洗凈、粉碎、剝皮并脫脂以產生脫脂的大豆薄片、大豆片、大豆粉、或大豆餅，由此生產大豆粉和大豆碎粒。脫脂大豆薄片和大豆粉也有市售。脫脂大豆粉和脫脂大豆碎?？砂凑粘Ｒ?guī)方法由脫脂大豆薄片、大豆片、大豆粉或大豆餅通過粉碎制得。將脫脂大豆粉粉碎為粒徑為150μ或更小的顆粒(足以使顆粒通過美國100目篩)，將脫脂大豆碎粒粉碎為粒徑150μ至約2000μ的顆粒(足以使顆粒通過美國10-80目篩)。脫脂大豆粉和脫脂大豆碎粒含49％(重量)大豆蛋白至約65％(重量)大豆蛋白，大豆粉和大豆碎粒的其余成分主要包括糖、大豆纖維和灰分。脫脂大豆粉和大豆碎粒有市售，購得后可直接摻入本發(fā)明的組合物中。
用于本發(fā)明組合物中的優(yōu)選大豆蛋白物質是大豆蛋白濃縮物或大豆蛋白分離物，它們含有的大豆蛋白量明顯高于大豆粉或大豆碎粒。大豆蛋白濃縮物含約65％至約90％(重量)的大豆蛋白，大豆蛋白濃縮物的其余成分主要包括大豆纖維和其他多糖。用于本發(fā)明組合物中的大豆蛋白濃縮物可用生產大豆?jié)饪s物的常規(guī)方法制成，常規(guī)方法包括(ⅰ)用含水醇，優(yōu)選是含水乙醇或甲醇洗滌脫脂大豆薄片或大豆粉；(ⅱ)用約具有大豆蛋白等電點pH(pH4.4-4.6)的稀酸洗滌脫脂大豆片薄或大豆粉；或(ⅲ)蒸汽加熱脫脂大豆薄片或大豆粉使蛋白變性，然后用水洗滌大豆薄片或大豆粉。大豆蛋白濃縮物有市售，購得后可直接摻入本發(fā)明的組合物中。
用于本發(fā)明組合物中的最優(yōu)選大豆蛋白物質是大豆蛋白分離物(也稱為分離大豆蛋白)，在加工的大豆蛋白物質中，大豆蛋白分離物中的大豆蛋白含量最高。大豆蛋白分離物含至少90％(重量)大豆蛋白，大豆蛋白分離物中的其余成分主要包括灰分和水分。用于本發(fā)明組合物中的大豆蛋白分離物可用形成大豆蛋白分離物的常規(guī)方法制得，該方法為用pH為約6至約11的水溶液，優(yōu)選稀氫氧化鈉、氫氧化鈣或氫氧化銨溶液提取脫脂大豆薄片，并將含可溶性蛋白的提取物與不溶性物質，例如大豆纖維和其他不溶性多糖分離。將分離的提取液的pH調至約大豆蛋白的等電點，優(yōu)選約pH4.4-4.6，以沉淀蛋白。從提取物的液體部分中分離沉淀的蛋白，以使蛋白與可溶性糖分離。然后洗滌分離的蛋白，也可將其中和，得到大豆蛋白分離物。大豆蛋白分離物有市售，購得后可直接摻入本發(fā)明的組合物中。
在另一個方案中，大豆蛋白物質是大豆下胚軸物質，它含有約37％-約44％(重量)的大豆蛋白。為獲得大豆下胚軸物質，將全大豆去皮，按照常規(guī)大豆加工技術，切開大豆子葉。子葉切開后下胚軸分離，可通過將切開的大豆用具有足以選擇性除去小下胚軸之孔徑的篩過篩進行分離。粗制胚軸可被粉碎或研磨成粉或面。
本發(fā)明組合物中使用的異黃酮是天然存在的物質，它們可發(fā)現(xiàn)于植物，例如豆類、三葉草和葛根中。這些異黃酮的常見豆類來源包括大豆、雞豆和各種其他種類的大豆和豌豆。這些異黃酮化合物的三葉草來源包括紅三葉草和地下三葉草。大豆是特別優(yōu)選的異黃酮化合物來源(大豆中僅不存在雞豆黃素A和其苷類)。
異黃酮化合物可從天然存在異黃酮的植物來源獲得，一些異黃酮化合物可通過本領域已知的方法合成制得。例如黃豆苷原可按照Wong公開的方法(J.Sci.Food Agr.,Vol.13,p.304(1962))從紅三葉草中分離或者可按照Ganguly和Sarre給出的方法(Chem.&Ind.(London),p.201(1970))從霉菌Micromonospora halophytica中分離，這兩篇文獻在本文中均引作參考。黃豆苷原可通過下列已知方法合成制備Baker等(J.Chem.Soc.,p.274(1933)),Wesley等(Ber.Vol.66,p.685(1933)),Mahal等(J.Chem.Soc.,p.1769(1934)),Baker等(J.Chem.Soc.,p.1852(1953))，或Farkas(Ber.Vol.90,p.2940(1957))，這些文獻在本文均引作參考。異黃酮苷黃豆苷可通過Farkas等的方法(Ber.Bol.92,p.819(1959))合成制備，該文獻在本文引作參考。黃豆苷原異黃酮苷綴合物6’-O-Mal黃豆苷和6’-O-Ac黃豆苷可通過黃豆苷分別與丙二酸酐和乙酸酐的常規(guī)皂化制得。
染料木黃酮可通過下列文獻方法合成制備Baker等(J.Chem.Soc.,p.3115(1928))；Narasimhachari等(J.Sci.Ind.Res.,Vol.12,P.287(1953))；Yoder等(Proc.IowaAcad.Sci.,Vol.61,p.271(1954))；和Zemplen等(Acta.Chim.Acad.Sci.Hung.,Vol.19,p.277(1959))，這些文獻在本文均引作參考。異黃酮苷染料木苷可通過Zemplen等的方法(Ber.,Vol.76B,p.1110(1943))合成制備，該文獻在本文引作參考。染料木苷的異黃酮綴合物6’-O-Mal染料木苷、6’-O-Ac染料木苷可通過染料木苷分別與丙二酸酐和乙酸酐的常規(guī)皂化制得。
雞豆黃素A可通過Baker等的方法(Nature169:706(1952))合成制備，該文獻在本文引作參考。雞豆黃素A也可從紅三葉草中通過Pope等的方法(Chem. & Ind.(London)p.1092(1953))分離，該文獻在本文引作參考。芒柄花素可通過Wessely等(Ber.66:685(1933))和Kagel等(TetrahedronLetters,p.593(1962))公開的方法合成制備，這兩篇文獻在本文引作參考。芒柄花素也可從大豆粉通過Walz的方法(Ann.489:118(1931))分離或者可從三葉草屬中通過Bradbury等的方法(J.Chem.Soc.,p.3447(1951))分離，這兩篇文獻在本文均引作參考。
在最優(yōu)選的方案中，本發(fā)明組合物的異黃酮組分是從可用于本發(fā)明組合物的大豆蛋白物質中回收得到的。如上所述，異黃酮是天然存在于大豆中的化合物。在大豆蛋白粉、粗粉、濃縮物和分離物的生產中，大豆蛋白物質中仍保留有一些異黃酮。在如上述加工大豆蛋白物質生產大豆蛋白粉、粗粉、濃縮物或分離物的同時，利用適當?shù)募庸ぜ夹g將明顯增加大豆蛋白物質中的異黃酮量(與常規(guī)加工的大豆蛋白物質中的異黃酮量相比)。特別是應避免用醇洗滌和萃取大豆蛋白濃縮物，因為異黃酮高度溶于含水醇中，如果要在大豆蛋白物質中保留異黃酮，大豆蛋白濃縮物也不應用醇洗滌來生產。此外，水洗大豆蛋白物質的操作也應減至最少，因為水洗會從大豆蛋白中洗去異黃酮。如果進行洗滌，也應在較低溫度下進行(0℃-45℃)，以使異黃酮在水洗滌液中的不溶性最大，從而減少在洗滌中的異黃酮損失。大豆蛋白物質中的異黃酮應如按照下述轉化為其配基形式，以便在用水洗滌或萃取大豆蛋白物質前降低異黃酮在水中的溶解度。使用上述方法有助于使異黃酮保留在大豆蛋白物質中，從而使得到的大豆蛋白物質含有顯著量的異黃酮。
在另一個方案中，可從天然存在異黃酮的植物原料中分離一種或多種異黃酮，用于本發(fā)明的組合物中。從天然存在異黃酮的植物原料中分離異黃酮化合物的優(yōu)選方法是用醇，優(yōu)選甲醇或乙醇，或者用水溶液，優(yōu)選堿水溶液萃取植物原料，以從植物原料中萃取出異黃酮。優(yōu)選在萃取異黃酮化合物前粉碎植物原料，以最大限度地從植物原料中回收異黃酮化合物。可通過常規(guī)分離方法，例如反相高壓液相色譜法(“HPLC”)將異黃酮化合物從萃取物中分離出來。
在一個優(yōu)選方案中，異黃酮化合物染料木黃酮、染料木苷、6’-O-Mal染料木苷、6’-O-Ac染料木苷、黃豆苷原、黃豆苷、6’-O-Mal黃豆苷、6’-O-Ac黃豆苷、黃豆黃素、glycitin和6’-O-Mal glycitin可從大豆原料，優(yōu)選市售的大豆原料中分離?？蓮闹蟹蛛x異黃酮化合物的大豆原料包括大豆、去皮大豆、大豆粉、大豆面、大豆碎粒、大豆薄片(全脂和脫脂的)、大豆子葉、大豆下胚軸、大豆糖蜜、大豆蛋白濃縮物、大豆乳清、大豆乳清蛋白和大豆蛋白分離物。在一個方案中，用低分子量有機萃取劑，優(yōu)選醇、乙酸乙酯、丙酮或乙醚，更優(yōu)選乙醇或甲醇的水溶液從大豆、去皮大豆、大豆粉、大豆面、大豆碎粒、大豆薄片、大豆蛋白濃縮物、大豆乳清蛋白或大豆蛋白分離物，優(yōu)選大豆粉、大豆面、大豆碎?；虼蠖贡∑休腿‘慄S酮。最優(yōu)選的萃取劑具有約為大豆蛋白等電點的pH值(約pH4-pH5)，以減少萃取劑萃取的大豆蛋白的量。
將含有異黃酮的萃取劑與不溶性大豆原料分離形成富含異黃酮的萃取物。如果需要，可通過除去溶劑濃縮萃取液回收富含異黃酮的物質，從而得到固態(tài)的富含異黃酮的物質，該物質可用于本發(fā)明的組合物和方法中。
在一個更優(yōu)選的方案中，可進一步將異黃酮化合物與萃取物中的其他可溶性大豆物質分離純化。將含異黃酮的萃取物與吸附萃取物中異黃酮的物質接觸，用使異黃酮特異性地從吸附材料上洗脫下來的溶劑從吸附材料上洗脫被吸附的異黃酮。
在一個優(yōu)選的方案中，通過常規(guī)反相HPLC分離將異黃酮與萃取物中的雜質分離。從大豆原料中萃取異黃酮并將萃取物與不溶性大豆原料分離后，將萃取液過濾以除去可能堵塞HPLC柱的不溶性物質。用特定的吸附物質填充常規(guī)市售的HPLC柱制備HPLC柱，該吸附物質將以特異性方式可解吸附性地結合萃取物中的異黃酮和雜質。吸附物質可以是任何反相HPLC填料，但優(yōu)選的填料通過負荷容量、分離效率和成本標準進行選擇。一種優(yōu)選的填充材料是購自瑞典Eka Nobel,Nobel Industries的Kromasil C18 16un 100埃微珠。
使過濾后的萃取液通過填充HPLC柱直至柱上的所有結合位點都被異黃酮完全飽和，這可通過從柱中流出液中的異黃酮的出現(xiàn)進行檢測。然后用溶劑洗脫該HPLC柱以進行分離。在一個優(yōu)選的方案中，洗脫液是一種極性溶劑，例如乙醇、甲醇、乙酸乙酯或乙腈，優(yōu)選是醇含量為約30％-約90％，最優(yōu)選約50％的醇水溶液，最優(yōu)選的醇是乙醇。
從柱洗脫液中分開收集異黃酮化合物和雜質。按照常規(guī)HPLC和分析化學手段區(qū)分洗脫的異黃酮餾分和其他洗脫餾分?？蓮闹率占疵撘褐械漠慄S酮餾分，并通過蒸發(fā)除去揮發(fā)性溶劑(如，乙醇)。如果蒸發(fā)除去了所有的溶劑，可直接回收異黃酮化合物，或者可通過冷凝殘留的溶劑(如，水)并離心或過濾分離異黃酮和殘留溶劑，回收異黃酮化合物。
在特別優(yōu)選的方案中，可將從植物中回收的異黃酮苷綴合物和異黃酮苷轉化為它們相應的配基異黃酮形式。異黃酮苷綴合物和異黃酮苷向配基異黃酮的轉化可在從中可萃取植物雌激素異黃酮的底物上進行，或者可在與不溶性植物原料分離后的富含異黃酮的萃取物中進行。據(jù)信，配基異黃酮化合物在降低LDL和血液總膽固醇濃度以及阻止或減緩動脈粥樣硬化的發(fā)展中具有特別的活性。配基異黃酮較其相應苷的綴合物和苷形式更容易從含水萃取物中分離，因為配基更不溶于水。
異黃酮苷綴合物(如，6”-O-Mal染料木苷、6”-O-Ac染料木苷、6”-O Mal黃豆苷、6”-O-Ac黃豆苷和6”-O-Mal glycitin)可按如下轉化為其相應的苷(如，染料木苷、黃豆苷和glycitin)形成含異黃酮萃取物或底物的堿性水溶液pH約為6-約13，優(yōu)選約pH9-約pH11，在約2℃-約121℃，優(yōu)選在約25℃-約75℃將該堿性水溶液處理足以發(fā)生轉化的一段時間，優(yōu)選約30分鐘-約5小時，更優(yōu)選約30分鐘-約1.5小時。異黃酮苷(如，染料木苷、黃豆苷和glycitin)可如下轉化為其相應的配基形式(如，染料木黃酮、黃豆苷原和黃豆黃素)將異黃酮苷與可裂解1,4-β糖苷鍵的酶，優(yōu)選市售的β-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶或β-半乳糖苷酶、果膠酶、乳糖酶、葡糖淀粉酶，在酶具有活性的pH，一般是在約pH3-約pH9下于約25℃-約75℃，更優(yōu)選約45℃-約65℃下接觸足以發(fā)生轉化的一段時間，一般是約1小時-約24小時，優(yōu)選約1小時-約3小時。
配基異黃酮可采用常規(guī)分離方法從植物底物中分離。例如，可用低分子量醇從大豆或三葉草底物中分離配基異黃酮。可通過常規(guī)重結晶方法或HPLC從萃取物中分離配基異黃酮。在一個特別優(yōu)選的方案中，從大豆底物中分離并用于本發(fā)明組合物或方法中的異黃酮組分包含至少40％的染料木黃酮、至少15％的黃豆苷原和至少1％的黃豆黃素。在另一個特別優(yōu)選的本發(fā)明方案中，從大豆底物中分離并用于本發(fā)明組合物或方法中的異黃酮組分含有至少85％的染料木黃酮、至少5％的黃豆苷原和至少0.5％的黃豆黃素。
用于本發(fā)明組合物中的一些異黃酮化合物有市售，購得后可配入本發(fā)明的組合物或者用于本發(fā)明的方法中。例如，染料木黃酮、黃豆苷原和黃豆黃素有市售，它們可購自Indofine Chemical Company Inc.,P.0.Box473,Somerville,New Jersey08876。雞豆黃素A可購自Aldrich ChemicalCompany,Inc.,940 West Saint Paul Avenue,Milwaukee,Wisconsin53233。
植物甾醇和大豆蛋白物質和/或異黃酮可以一起加到本發(fā)明的組合物中，優(yōu)選將它們充分混合。例如，植物甾醇和大豆蛋白物質和/或異黃酮放入切割筒或攪拌筒中混合足夠的時間使它們充分混合。
優(yōu)選將各成分混合得到的組合物含有生物活性量的各種成分，但組合物中不限于含有生物活性量的各種成分，因為為獲得降低血液LDL和總膽固醇濃度的所需效果，可多次服用本發(fā)明的組合物。組合物優(yōu)選含有約500毫克-約50克植物甾醇，更優(yōu)選含有約1克-約10克植物甾醇。當組合物中含有大豆蛋白物質時，組合物中優(yōu)選存在約5克-約100克大豆蛋白物質，更優(yōu)選存在約10克-約40克大豆蛋白物質。當組合物中含有異黃酮時，組合物中優(yōu)選存在約10毫克-約1000毫克異黃酮，更優(yōu)選存在約25毫克-約200毫克異黃酮。
在一個優(yōu)選的方案中，將植物甾醇和大豆蛋白物質和/或異黃酮與適宜的賦形劑配制成藥物或非處方釋放系統(tǒng)。含植物甾醇和大豆蛋白物質和/或異黃酮的藥物或非處方制劑可通過本領域已知的常規(guī)方法制備。例如，本發(fā)明的成分可與常用的和普通的載體、粘合劑、稀釋劑和賦形劑配制成片劑、膠囊、粉末、懸浮劑和用于非胃腸給藥包括靜脈內、肌內和皮下給藥的溶液，以及配制成用于透皮用貼劑的溶液。
用于形成本發(fā)明的藥物或非處方制劑的惰性可藥用賦形劑包括淀粉、甘露醇、硫酸鈣、磷酸二鈣、硬脂酸鎂、硅衍生物和/或蔗糖，例如蔗糖、乳糖和葡萄糖。粘合劑包括羧甲基纖維素和其他纖維素衍生物；明膠；天然和合成的膠類，包括藻酸鹽，如藻酸鈉；聚乙二醇；和蠟等。用于本發(fā)明的稀釋劑包括適宜的油；鹽水；糖溶液，例如右旋糖水溶液或葡萄糖水溶液；以及甘醇類，例如聚乙二醇或聚丙二醇。其他賦形劑包括潤滑劑，例如油酸鈉、乙酸鈉、硬脂酸鈉、氯化鈉、苯甲酸鈉、滑石和硬脂酸鎂等；崩解劑包括瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈉、淀粉和黃原膠等；吸附性載體是例如膨潤土和高嶺土。藥物或非處方制劑中也可加入著色劑和芳香劑。
在另一個優(yōu)選的方案中，摻入了植物甾醇和大豆蛋白物質和/或異黃酮的食物補劑可如下制備將各種成分作為食品成分加到食品中，或者將各種成分的混合物作為食品成分加到食品中?？杉尤脒@些成分的食品包括幾乎所有的食品，但最優(yōu)選其中大豆蛋白物質或含有植物甾醇的植物油被用作功能性成分的食品。例如，植物甾醇和大豆蛋白物質和/或異黃酮可加到如下食品，包括，但不限于，肉類，例如碎肉、乳化肉和腌肉；飲料，例如營養(yǎng)飲料、運動飲料、蛋白強化飲料、果汁、牛奶、奶替代品和減肥飲料；奶酪，例如硬奶酪和軟奶酪、乳酪和鄉(xiāng)村奶酪；冰點，例如冰淇淋、冰奶、低脂冰點，以及非乳類冰點；酸奶；湯；布?。幻姘恐破?；沙拉醬；以及蘸醬和涂醬(dips和spreads)，例如蛋黃醬和薯條醬。最優(yōu)選植物甾醇、大豆蛋白物質和異黃酮或者植物甾醇和大豆蛋白物質在含水漿狀物中混合形成乳液，該乳液尤其可用于乳化食品和飲料，例如沙拉醬、酸奶、大豆奶酪、乳化肉和粉末飲料。
下列非限制性制劑說明了包含本發(fā)明組合物的和可用于本發(fā)明方法的植物甾醇和大豆蛋白和/或異黃酮化合物的藥物和食品。
制劑下列制劑1-4說明了包含用于本發(fā)明組合物的植物甾醇和大豆蛋白和/或異黃酮的藥物或非處方制劑。制劑1明膠膠囊用下列成分制備硬明膠膠囊異黃酮25-100毫克/膠囊；植物甾醇500-2000毫克/膠囊；淀粉，NF 0-1000毫克/膠囊；可流動淀粉粉末0-1000毫克/膠囊；聚硅氧烷液體350厘沲0-20毫克/膠囊。將各成分混合，過篩并填充到膠囊中。制劑2片劑用下列成分制備片劑植物甾醇250-500mg/片；大豆蛋白物質1000-2000mg/片；微晶纖維素20-300mg/片；淀粉0-50mg/片；硬脂酸鎂或硬脂酸0-15mg/片；二氧化硅，霧化的，0-400mg/片；二氧化硅，膠態(tài)的，0-1mg/片；和乳糖0-100mg/片。將各種成分混合并壓制成片。制劑3懸浮劑用下列成分制備懸浮劑異黃酮0.1-200mg/5ml；植物甾醇250-2000mg/5ml；大豆蛋白物質500-2000mg/5ml；羧甲基纖維素鈉50-700mg/5ml；苯甲酸鈉0-10mg/5ml；純水5ml；和按需的芳香劑和著色劑。制劑4非胃腸溶液將1.5％(重量)的活性成分(活性成分是重量比為5∶4∶1的大豆蛋白物質、植物甾醇和異黃酮)在10％(體積)的丙二醇水溶液中攪拌制備非胃腸組合物。用氯化鈉將該溶液調至等滲并滅菌。
下列制劑5-8說明了可用本發(fā)明組合物中使用的植物甾醇和富含異黃酮化合物的大豆蛋白分離物形成的食物補劑。下列實施例中的富含異黃酮的大豆蛋白分離物中每克大豆蛋白通常含有約1-約7毫克的異黃酮化合物。制劑5即用飲料即用飲料由下列成分形成成分 組成的重量百分比水 75-82富含異黃酮的大豆蛋白分離物 10-15植物甾醇 3-5蔗糖 5-8可可粉 0.1-1維生素/礦物質 0.1-1香精 0.1-1纖維素凝膠 0.1-0.5以每份8盎司使用的即用飲料含有約20克分離的大豆蛋白(包括約20-240毫克異黃酮化合物)和約6克植物甾醇。制劑6粉末飲料粉末飲料由下列成分形成成分 組成的重量百分比富含異黃酮的大豆蛋白分離物 75-85植物甾醇 5-10蔗糖 8-15麥芽糖糊精 1-5維生素/礦物質 0.5-2天冬甜素 0-0.5香精 0-0.5將30克粉末飲料制品加到水中形成含約23克大豆蛋白分離物(包括約23161毫克異黃酮化合物)和約2.5克植物甾醇的一份飲料。劑7食品棒食品棒由下列成分形成成分 組成的重量百分比富含異黃酮的大豆蛋白分離物 20-30植物甾醇 1-5玉米漿 30-45稻米漿固體 7-14甘油 1-5可可粉 2-7復合包衣 15-25以每份70克使用的食品棒含有約15克大豆蛋白分離物(包括約15-約105毫克異黃酮化合物)和約2克植物甾醇。制劑8大豆酸奶大豆酸奶由下列成分形成成分 組成的重量百分比水50-70富含異黃酮的大豆蛋白分離物5-15
植物甾醇 5-15蔗糖 3-8玉米淀粉 1-5糊精 0.3-1纖維素凝膠 1-3培養(yǎng)物(酸牛乳) 0.01-0.1水果 10-20維生素/礦物質0.05-0.3以每份170克使用的大豆酸奶含有約17克大豆蛋白分離物(含約17-約170毫克異黃酮化合物)和17克植物甾醇。方法本發(fā)明還涉及用植物甾醇和大豆蛋白物質和/或異黃酮化合物降低人類血液低密度脂蛋白膽固醇或總膽固醇的濃度的方法。為降低血液LDL膽固醇和總膽固醇的濃度，不間斷地有規(guī)律地，優(yōu)選每日給人聯(lián)合施用植物甾醇與大豆蛋白物質和/或異黃酮化合物。植物甾醇優(yōu)選是上述的β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、谷甾烷醇或菜油甾烷醇。基于大豆蛋白物質的干重，大豆蛋白物質是大豆下胚軸物質或含有至少49％大豆蛋白的大豆蛋白物質，例如大豆面、碎粒、濃縮物或分離物。異黃酮化合物選自一種或多種上述的染料木黃酮、黃豆苷原、黃豆黃素、雞豆黃素A、芒柄花素和它們的天然存在的糖苷和糖苷綴合物。植物甾醇和大豆蛋白物質和/或異黃酮優(yōu)選以上述的藥物或非處方組合物或作為食物補劑形式使用，這取決于哪種途徑更有效和/或易于接受。
植物甾醇和大豆蛋白物質和/或異黃酮化合物可同時或在特定的時間段內順序使用，優(yōu)選每日周期性施用。最優(yōu)選將植物甾醇和大豆蛋白物質和/或異黃酮化合物以上述本發(fā)明組合物的形式同時聯(lián)合施用?；蛘邔⒅参镧薮己痛蠖沟鞍缀?或異黃酮化合物作為獨立成分順序施用?！绊樞颉笔侵冈谔囟ǖ臅r間段，如一天內獨立施用各種成分，而并不限于即刻連續(xù)地施用各種成分。
植物甾醇和大豆蛋白物質和/或異黃酮化合物是以各組分有效降低人血膽固醇濃度的量施用于人。各組分有效降低血液膽固醇濃度的特定劑量取決于數(shù)種因素，包括被施用的人的體重、血液膽固醇濃度和施用途徑。降低血液膽固醇的植物甾醇施用劑量優(yōu)選為500毫克/天至50克/天，更優(yōu)選為1克/天至5克/天，不間斷地施用。如果施用大豆蛋白物質，則降低血液膽固醇的大豆蛋白物質施用劑量優(yōu)選為5克/天至100克/天，更優(yōu)選為10克/天至30克/天。如果施用異黃酮，則降低血液膽固醇的異黃酮化合物的施用劑量優(yōu)選為10毫克/天至1000毫克/天，更優(yōu)選為25毫克/天至200毫克/天。
當以各自有效降低LDL和總膽固醇濃度的量聯(lián)合施用時，植物甾醇和大豆蛋白物質和/或異黃酮協(xié)同降低人的這些膽固醇濃度。本發(fā)明方法中使用的植物甾醇、大豆蛋白物質和異黃酮通過不同的機制或不同機制的結合降低人的LDL和總血液膽固醇濃度，這些機制可能在一定程度上交叉重疊。據(jù)信這些物質中的各組分降低膽固醇的機制與其他物質的這類機制相互作用，加速了其他物質降低膽固醇機制的活性。降膽固醇之混合組分的降低膽固醇機制的加速作用導致血液中LDL和總膽固醇濃度的綜合性降低，這種降低作用大于各種成分單獨產生的血液LDL和總膽固醇濃度的降低作用。
例如，聯(lián)合施用植物甾醇、大豆蛋白物質和異黃酮可協(xié)同降低血液LDL和總膽固醇濃度的機理結合了所提出的每種物質降低膽固醇機理的幾個方面。已知植物甾醇具有通過阻止小腸對食物膽固醇的吸收影響膽固醇和膽酸間腸肝循環(huán)平衡的作用。這減少了腸肝膽固醇循環(huán)調節(jié)中的膽固醇反饋，造成肝臟中合成膽酸對膽固醇的需要。肝臟可通過肝細胞中的LDL膽固醇受體從血液中獲得必需的膽固醇，LDL膽固醇受體可通過施用植物甾醇得到上調，或者可合成所需的膽固醇。如果從血液中攝取肝臟所需的膽固醇，則血膽固醇濃度下降。
大豆蛋白降低血液中LDL和總膽固醇濃度的一種已知機制是增加糞便的膽酸排泄。糞便的膽酸排泄增加導致肝臟產生更多的膽酸，在膽酸的產生中需利用膽固醇作為底物。如上所述，肝臟可從血液中獲得膽固醇合成膽酸，從而降低血液膽固醇濃度。
按照本發(fā)明，聯(lián)合施用植物甾醇和大豆蛋白可協(xié)同調整腸肝膽固醇體內平衡，結果明顯降低血液中的LDL和總膽固醇濃度。植物甾醇對食物膽固醇的小腸吸收的抑制作用可產生肝臟膽固醇不足，這種不足可通過從血液中補充膽固醇得到部分緩解。大豆蛋白導致的糞便膽酸排泄的增加可加劇由植物甾醇通過增加以膽酸底物形式從肝臟消除膽固醇導致的肝臟膽固醇不足，這種不足通過從血液中汲取其他的膽固醇得到部分緩解。
本發(fā)明中使用的異黃酮聯(lián)合植物甾醇或者植物甾醇和大豆蛋白物質有效協(xié)同降低LDL和總膽固醇濃度，部分原因是異黃酮可上調或增加肝臟的LDL膽固醇-受體數(shù)量。本發(fā)明中使用的異黃酮是染料木黃酮、黃豆苷原、黃豆黃素、芒柄花素、雞豆黃素A和它們各自天然存在的糖苷和糖苷綴合物，它們是已知體內具有雌激素作用的植物雌激素。雌激素增加肝臟LDL膽固醇受體的數(shù)量，該受體提高了LDL膽固醇顆粒從血漿進入肝臟的清除率。依據(jù)本發(fā)明，通過一種或多種異黃酮的雌激素作用誘導的肝臟LDL膽固醇受體的上調或數(shù)量增加，與由植物甾醇和/或大豆蛋白物質誘導的肝臟對膽固醇的需求增加一起可明顯促進LDL膽固醇從血液中清除進入肝臟。
然而，本發(fā)明的方法不限于特定的作用機理，因為聯(lián)合施用的植物甾醇、一種或多種異黃酮，和/或大豆蛋白物質降低血液中LDL和總膽固醇濃度的機理可能有數(shù)種。例如大豆蛋白除通過增加膽酸排泄改變膽固醇體內平衡外，由于其高精氨酸含量，還可通過蛋白的7S貯存單元的特異性作用、通過改變血清胰高血糖素與血清胰島素的比例影響肝臟中膽固醇的代謝、或者通過增加血清中游離甲狀腺素的濃度降低血液中LDL和總膽固醇的濃度。植物甾醇也通過抑制小腸的膽固醇吸收以外的機制減少膽固醇，因為據(jù)顯示植物甾醇可通過直接注入血流來降低膽固醇水平。
本發(fā)明還涉及通過給人聯(lián)合施用植物甾醇和大豆蛋白物質和/或至少一種異黃酮阻止或減緩動脈粥樣硬化發(fā)展的方法，所述大豆蛋白物質是大豆下胚軸物質或含有至少49％(重量)大豆蛋白的大豆蛋白物質，所述異黃酮選自染料木黃酮、黃豆苷原、黃豆黃素、雞豆黃素A、芒柄花素和它們各自天然存在的糖苷。植物甾醇優(yōu)選是β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、谷甾烷醇或菜油甾烷醇中的一種。大豆蛋白物質優(yōu)選是大豆粉、大豆碎粒、大豆蛋白濃縮物或大豆蛋白分離物。優(yōu)選的施用方法和劑量與上面關于為降低血液的LDL和總膽固醇濃度施用植物甾醇和大豆蛋白物質和/或異黃酮所述相同。
如上所述，當給予人足以降低膽固醇活性量的各種化合物時，植物甾醇和大豆蛋白物質和/或異黃酮有效協(xié)同降低血液LDL和總膽固醇濃度。血液中LDL膽固醇水平的升高與動脈粥樣硬化的發(fā)展有關，因為LDL膽固醇是動脈粥樣硬化斑形成的關鍵成分。因此，降低LDL膽固醇的植物甾醇、大豆蛋白物質和/或異黃酮的聯(lián)合可有效阻止或緩解動脈粥樣硬化的發(fā)展。
在一個優(yōu)選的方案中，無論是否施用大豆蛋白物質，異黃酮總是與植物甾醇聯(lián)合施用用于阻止或減緩動脈粥樣硬化的發(fā)展，因為異黃酮除降低血液LDL膽固醇濃度外，還提供抗動脈粥樣硬化活性。尤其是，這些異黃酮對血管水平的動脈粥樣硬化提供有效的保護作用。異黃酮-尤其是配基異黃酮染料木黃酮、黃豆苷原、雞豆黃素A和芒柄花素抑制LDL膽固醇的氧化。LDL膽固醇的氧化是動脈粥樣硬化斑形成的關鍵步驟，因為LDL膽固醇的氧化可提高其動脈粥樣硬化的形成能力。某些異黃酮，尤其是染料木黃酮、黃豆苷原和雞豆黃素A還是酪氨酸激酶抑制劑，它們通過抑制酪氨酸激酶的活性抑制動脈粥樣硬化性損傷和凝血酶的形成。因此，依據(jù)本發(fā)明，聯(lián)合施用植物甾醇和至少一種異黃酮，或者聯(lián)合使用它們與大豆蛋白物質將通過協(xié)同降低血液中LDL和總膽固醇水平以及通過抑制動脈粥樣硬化斑形成和生長的機制阻止或緩解動脈粥樣硬化的發(fā)展。
實施例1挑選五至五十名男性進行臨床研究。這些男性被診斷為患中度或重度血膽固醇過多，例如總血膽固醇水平為250mg/dl或更高。這些男性被劃分為五組，第一組接受30克不含異黃酮的分離的大豆蛋白食物補劑(通過醇萃取除去其中的異黃酮)(“大豆”組)，第二組接受5克含有β-谷甾醇的植物甾醇食物補劑(“植物甾醇”組)，第三組接受75毫克含有異黃酮染料木黃酮和黃豆苷原的異黃酮食物補劑(“異黃酮”組)，第四組接受含30克分離的大豆蛋白、5克植物甾醇β-谷甾醇和75毫克異黃酮染料木黃酮和黃豆苷原的食物補劑(“聯(lián)合”組)，第五組不接受食物補劑(“對照”組)。選擇各組的飲食以便不包括其他異黃酮、植物甾醇和大豆蛋白來源，并且兩組都不使用包括雌激素來源的飲食。持續(xù)服用6個月。
在開始服用前，測定患者的總膽固醇和低密度脂蛋白血膽固醇基準水平。在各組服用各自的飲食6個月后，測量各組基準癥狀。比較各組成員和各成員在研究開始和結束時的結果。從聯(lián)合組中LDL和總血膽固醇水平的降低百分數(shù)高于大豆組、植物甾醇組、異黃酮組和對照組可以看出聯(lián)合施用植物甾醇、大豆蛋白物質和異黃酮提高了降低LDL或總血膽固醇水平的活性。
植物甾醇和大豆蛋白物質和/或異黃酮的聯(lián)合劑降低人的LDL和血液總膽固醇濃度的實用性通過上面的實施例得到了證實。
實施例2
選擇五至五十名女性進行臨床研究。這些女性是絕經(jīng)后的并且被診斷患有動脈粥樣硬化，即，被診斷為具有包括狹窄斑和閉合斑的動脈粥樣硬化斑。這些女性被劃分為五組，第一組接受30克不含異黃酮的分離的大豆蛋白食物補劑(通過醇萃取除去其中的異黃酮)(“大豆”組)，第二組接受5克含有β-谷甾醇的植物甾醇食物補劑(“植物甾醇”組)，第三組接受75毫克含有異黃酮染料木黃酮和黃豆苷原的異黃酮食物補劑(“異黃酮”組)，第四組接受含30克分離的大豆蛋白、5克植物甾醇β-谷甾醇和75毫克異黃酮染料木黃酮和黃豆苷原的食物補劑(“聯(lián)合”組)，第五組不接受食物補劑(“對照”組)。選擇各組飲食以便不包括其他異黃酮、植物甾醇和大豆蛋白來源，并且兩組也都不使用包括雌激素來源的飲食。持續(xù)服用6個月。
在開始服用前，測定患者的總血膽固醇基準水平；高密度和低密度脂蛋白血膽固醇水平；雌激素水平；和進行血管非浸入性反應性研究(例如使用高分辨率超聲波)的選定血管(例如股骨淺動脈和臂淺動脈)的狹窄和動脈粥樣硬化斑的程度。在各組服用各自的飲食6個月后，再測量各組基準癥狀。比較各組成員間和各成員在研究開始和結束時的結果。與β-谷甾醇、分離的大豆蛋白、異黃酮染料木黃酮和黃豆苷原、以及不使用它們的情況相比，化合物聯(lián)合劑的高抗動脈粥樣硬化活性，通過聯(lián)合組相對于大豆組、植物甾醇組、異黃酮組和對照組的動脈粥樣硬化斑和再狹窄的更大程度的減小，或動脈粥樣硬化斑和再狹窄最小程度的增大得以說明。
植物甾醇和大豆蛋白物質和/或異黃酮的聯(lián)合防止或緩解人動脈粥樣硬化斑的發(fā)展的實用性通過上面的實施例得到了證實。
權利要求
1.一種甾醇組合物，其特征在于它含有(A)占組合物重量至少0.49％的植物甾醇，和(B)下列成分(a)-(d)中的一種(a)一種大豆蛋白物質，所述大豆蛋白物質含占大豆蛋白物質干重至少49％的大豆蛋白；(b)至少一種異黃酮，所述異黃酮選自染料木黃酮、黃豆苷原、黃豆黃素、雞豆黃素A、芒柄花素和它們天然存在的糖苷和糖苷綴合物；(c)大豆下胚軸物質；(d)成分(a)和(b)。
2.權利要求1的組合物，其含有一種大豆蛋白物質，所述大豆蛋白物質含至少占大豆蛋白物質干重49％的大豆蛋白；至少一種異黃酮，所述異黃酮選自染料木黃酮、黃豆苷原、黃豆黃素、雞豆黃素A、芒柄花素和它們天然存在的糖苷和糖苷綴合物；和一種植物甾醇，其中所述植物甾醇占所述組合物重量的至少0.49％。
3.權利要求1的組合物，其含有一種大豆蛋白物質，所述大豆蛋白物質含至少占大豆蛋白物質干重49％的大豆蛋白；和一種植物甾醇，其中所述植物甾醇占所述組合物重量的至少0.49％。
4.權利要求1的組合物，其含有至少一種異黃酮，所述異黃酮選自染料木黃酮、黃豆苷原、黃豆黃素、雞豆黃素A、芒柄花素和它們天然存在的糖苷和糖苷綴合物；和一種植物甾醇，其中所述植物甾醇占所述組合物重量的至少0.49％。
5.權利要求1的組合物，含有大豆下胚軸物質；和一種植物甾醇，其中所述植物甾醇占所述組合物重量的至少0.49％。
6.權利要求2或3的組合物，其中所述大豆蛋白物質是一種大豆蛋白分離物。
7.權利要求2或3的組合物，其中所述大豆蛋白物質選自下組中的至少一種大豆蛋白濃縮物、大豆面或大豆碎粒。
8.權利要求1的組合物，其中所述植物甾醇是至少一種β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、谷甾烷醇或菜油甾烷醇。
9.權利要求2或4的組合物，其中所述異黃酮至少占所述組合物重量的0.0066％。
10.權利要求2、3或4的組合物，其還含有賦形劑，其中所述植物甾醇、所述大豆蛋白物質、所述異黃酮和所述賦形劑混合為藥物或非處方制劑。
11.權利要求10的組合物，其中所述藥物或非處方制劑是片劑、膠囊、粉末、懸浮劑或溶液劑。
12.權利要求2、3或4的組合物，其還含有水，其中所述植物甾醇、所述大豆蛋白物質、所述異黃酮和所述水混合形成含水乳劑。
13.權利要求12的組合物，其被摻入食物材料中。
14.權利要求5的組合物，其還含有至少一種異黃酮，所述異黃酮選自染料木黃酮、黃豆苷原、黃豆黃素、雞豆黃素A、芒柄花素和它們天然存在的糖苷和糖苷綴合物。
15.一種降低人血液總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的濃度或者阻止或減緩動脈粥樣硬化發(fā)展的方法，該方法包括以同時或順序施用各成分的方式施用權利要求1的組合物。
16.權利要求15的方法，其中所述各成分的聯(lián)合施用是同時進行的。
17.權利要求15的方法，其中所述各成分的聯(lián)合施用是順序進行的。
18.權利要求15的方法，其中所述植物甾醇以約500mg/天-約50g/天的劑量施用。
19.權利要求15的方法，其中施用權利要求2或3的組合物，并且所述大豆蛋白物質以約5g/天-約100g/天的量施用。
20.權利要求15的方法，其中施用權利要求2或4的組合物，并且所述異黃酮以約10mg/天-約1000mg/天的量施用。
21.權利要求15的方法，其中所述植物甾醇是至少一種β-谷甾醇菜油甾醇、豆甾醇、谷甾烷醇或菜油甾烷醇。
22.權利要求15的方法，其中施用權利要求2或3的組合物，并且所述大豆蛋白物質選自至少一種大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白分離物、大豆面和大豆碎粒。
23.權利要求15的方法，其中所述組合物或所述成分以食品的形式施用。
24.權利要求15的方法，其中所述組合物或所述成分以藥物或非處方制劑形式施用。
25.權利要求24的方法，其中所述藥物或非處方制劑是片劑、膠囊、粉末、懸浮劑或溶液劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有植物甾醇和大豆蛋白物質和/或異黃酮的組合物,所述異黃酮選自染料木黃酮、黃豆苷原、黃豆黃素、雞豆黃素A、芒柄花素和它們各自天然存在的糖苷,其中植物甾醇至少占組合物重量的0.49%。本發(fā)明還涉及一種降低人血液中LDL和總膽固醇的濃度的方法,該方法包括給人類聯(lián)合服用植物甾醇和大豆蛋白物質和/或異黃酮,所述植物甾醇占植物甾醇和大豆蛋白物質和/或異黃酮混合重量的至少0.49%。本發(fā)明還涉及一種阻止或減緩人類動脈粥樣硬化發(fā)展的方法,該方法包括給人類聯(lián)合服用植物甾醇、大豆蛋白物質和/或異黃酮,所述植物甾醇占植物甾醇和大豆蛋白物質和/或異黃酮混合重量的至少0.49%。
文檔編號A61K31/59GK1323544SQ0012036
公開日2001年11月28日 申請日期2000年5月13日 優(yōu)先權日2000年5月13日
發(fā)明者D·H·瓦格, S·M·波特, E·C·漢雷 申請人:蛋白質技術國際公司