專利名稱：一種流感病毒表位疫苗及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用生物工程技術制備的疫苗及其制備方法，特別是涉及一種流感病毒疫苗及其制備方法。
流感是一種常見、多發(fā)性、病毒性傳染疾病，對人類特別是對老人、兒童以及身體較弱的人有很大的威脅。已有的流感疫苗及其設計和制備技術如下1、流感病毒滅活疫苗，該疫苗目前在成人中廣泛使用，是利用流感病毒滅活后的病原體制成的。但是該疫苗株需要隨流感毒株抗原性變異而及時更換，否則免疫效果就無保證，甚至無效。由于流感病毒的變異性很強，所以這種疫苗很難確保其預防效果。
2、流感病毒減毒活疫苗，該疫苗于1960年開始大量用于人體，也是利用流感病毒減活后的病原體制成的。由于與第一種情況相同的原因，疫苗株需要隨流感毒株抗原性變異而及時更換，目前，國內外正在進行新的疫苗株的篩選實驗。
3、流感病毒亞單位疫苗，該疫苗是目前國外兒童正在使用的流感疫苗，是利用基因重組的病毒表面抗原誘導免疫防護，病毒表面抗原也需要隨流感毒株抗原性變異而及時更換，否則免疫效果就無保證，甚至無效。
上述3種正在使用的流感疫苗總的特點是不能對付流感病毒毒株的抗原性變異。然而，流感病毒的變異性很強，抗原性變異是不斷發(fā)生的。
另一方面，流感病毒胞膜蛋白HA上的幾個主要中和表位(例如HA92-105，KAYSNCYPYDVPDY；HA127-133，WTGVAQD；HA183-195，HHPITDSDQTRLY；HA31-341，ATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEG)能誘導很強的免疫防護(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1992，898995-8999；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1982，79569-573；Vaccine 1995，13927-932；Eur.J.Immunol.1997，273105-3114)。最新的研究結果證明流感病毒胞膜蛋白M2也能誘導廣泛的、長時期的、針對甲型流感病毒感染的免疫防護(Nature Medicine 1999，51157-1163)。
同時，本發(fā)明的發(fā)明人研究發(fā)現，多表位的表位多肽能夠誘導高滴度的、預先定義的、多中和表位特異性的中和抗體。
本發(fā)明的目的是提供一種不因流感病毒的變異而導致疫苗無效、能夠誘導多種高滴度中和抗體產生的流感病毒表位疫苗。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種生產上述流感病毒表位疫苗的方法。
為實現上述目的，本發(fā)明采取以下設計方案一種流感病毒表位疫苗，它包括至少一個耦聯到載體蛋白或載體多肽上形成耦聯物的含有至少一次重復的單表位或者至少一次重復的多表位的表位多肽，所述表位選自流感病毒胞膜蛋白HA或M2上的中和表位或變異表位。
所述中和表位和變異表位可以選自下列表位多肽中的一個或多個GLFGAIAGFIEWTGVAQDHHPITDSDQTRLYKAYSNCYPYDVPDYSLLTEVETVETPIRNERNEWGCRCEWGCRCNDGWTGVAQDGITDSDQTRGSTDKEQTDGSTDREQTKGKAYSNCYGKAFSNCYG疫苗中還包括可接受的藥用佐劑。
一種制備流感病毒表位疫苗的方法，基本上包括以下步驟(1)、人工合成含有選自流感病毒胞膜蛋白HA和M2上的單個中和或變異表位，或者含有多個中和或/和變異表位的表位多肽；所述中和表位及變異表位有至少一次的重復；(2)、將上述表位多肽分別耦聯到載體蛋白或載體多肽上形成耦聯物；(3)、將上述耦聯物配以可接受的佐劑制備成流感病毒表位疫苗。
其中，所述至少一次重復的單表位或者至少一次重復的多表位的表位多肽可選自CGLFGAIAGFIEGGLFGAIAGFIECGWTGVAQDGWTGVAQDGWTGVAQDCGHHPITDSDQTRLYGHHPITDSDQTRLYCGKAYSNCYPYDVPDYGKAYSNCYPYDVPDYCSLLTEVETGSLLTEVETGSLLTEVETCVETPIRNEGVETPIRNEGVETPIRNECRNEWGCRCGRNEWGCRCGRNEWGCRCCEWGCRCNDGSEWGCRCNDGSEWGCRCNDSCGWTGVAQDGWTGVTQNGWTGVAQSGWTGVTQCGITDSDQTRGSTDKEQTDGSTDREQTKGITDSDQTRGSTDKEQTDGSTDREQTKCGKAYSNCYGKAFSNCYGGKAYSNCYGKAFSNCYG
本發(fā)明的疫苗是依據本發(fā)明人提出的表位疫苗的理論，即表位疫苗抗變異能力強，能夠誘導高滴度的、預先定義的、多種中和表位特異性的中和抗體(Immunology Today，20588-589，1999年12月；Immunobiology，201323-331，1999年12月；Scand.J.Immunology.2000年，51497-501；Int.Arch.AllergyImmunology 2000年，12180-84)，巧妙地利用了流感病毒胞膜蛋白HA及M2上的中和表位能夠誘導人體產生較強，而且時間較長的免疫防護的特性，針對流感病毒變異較多的特點研制出的。本發(fā)明的流感疫苗是一種能刺激人體對流感病毒產生多種中和抗體的多聯疫苗，也就是說，當流感病毒的一個或幾個表位發(fā)生變異，注射了疫苗的人體中還存在著足以對付該變異流感病毒的對應于其它未變異表位的中和抗體。本發(fā)明的疫苗具有以下優(yōu)點1、該疫苗是一種能刺激產生多種中和抗體的高效多聯疫苗，能有效對付流感病毒的變異，進而克服已有流感疫苗預防效果不足甚至無效的缺點。2、該疫苗的有效成分是耦聯到載體蛋白或載體多肽上形成耦聯物的包含有流感病毒胞膜蛋白HA或M2上的中和表位或變異表位的表位多肽，這些表位多肽沒有流感病毒的遺傳物質及活性，不會產生因流感病毒的遺傳物質誘發(fā)的副作用，也沒有滅活疫苗或減毒疫苗在人體中有復性可能之虞。3、能誘導很強的針對特定中和表位的免疫應答，是相應的亞單位疫苗誘導的特定中和抗體水平的10-20倍，針對特定中和表位的抗體量為10-240微克/毫升血清。4、根據流感病毒的變異，可以很快生產出其相應類型的疫苗，不需進行長時間的試驗，降低生產成本。該技術將對世界預防醫(yī)學研究產生重大影響，將使流感病毒疫苗的制備技術產生革命性變化，并且將帶來巨大的經濟效益和社會效益。
下面結合非限定性實施例對本發(fā)明作進一步說明。
實施例1、制備以流感病毒胞膜蛋白HA為基礎的單表位流感疫苗，包括以下步驟(1)、人工合成HA蛋白上含有3次重復的一個主要中和表位的表位多肽CGWTGVAQDGWTGVAQDGWTGVAQD(2)、利用MBS(m-maleimidobenzlyl-N-hydroxy succinimide ester)將表位多肽與載體蛋白BSA耦聯；(3)、將耦聯物配以鋁佐劑制備成單表位流感疫苗。
實施例2、制備以流感病毒胞膜蛋白HA為基礎的單表位-多聯流感疫苗，包括以下步驟(1)、人工合成4條分別含有HA蛋白上主要中和表位的表位多肽，各中和表位有一次以上的重復CGLFGAIAGFIEGGLFGAIAGFIE
CGWTGVAQDGWTGVAQDGWTGVAQDCGHHPITDSDQTRLYGHHPITDSDQTRLYCGKAYSNCYPYDVPDYG KAYSNCYPYDVPDY(2)、利用戊二醛或者利用MBS將多肽分別與載體牛血清白蛋白耦聯；(3)、將4種耦聯物混合后配以鋁佐劑，制備成流感病毒多聯表位疫苗，其中，4種耦聯物的份數比可以根據不同年份統(tǒng)計學處理得出的各位點的變異機率進行調整。
實施例3、制備以流感病毒胞膜蛋白HA和M2蛋白為基礎的多表位流感病毒表位疫苗，包括以下步驟(1)、人工合成含有流感病毒胞膜蛋白HA和M2蛋白上各一個中和表位，并重復一次的1條表位多肽CWTGVAQDHHPITDSDQTRLYGWTGVAQDHHPITDSDQTRLY(2)、利用MBS(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxy sucinimide ester)將表位多肽與載體蛋白BSA耦聯；(3)、將耦聯物配以鋁佐劑制備成多表位流感病毒表位疫苗。
實施例4、制備以流感病毒胞膜蛋白HA和M2蛋白為基礎的單表位-多聯流感疫苗，包括以下步驟(1)、人工合成含有流感病毒胞膜蛋白HA和M2蛋白上主要中和表位，并有至少一次重復的8條表位多肽CGLFGAIAGFIEGGLFGAIAGFIECGWTGVAQDGWTGVAQDGWTGVAQDCGHHPITDSDQTRLYGHHPITDSDQTRLYCGKAYSNCYPYDVPDYGKAYSNCYPYDVPDYCSLLTEVETGSLLTEVETGSLLTEVETCVETPIRNEGVETPIRNEGVETPIRNECRNEWGCRCGRNEWGCRCGRNEWGCRCCEWGCRCNDGSEWGCRCNDGSEWGCRCNDS(2)、利用戊二醛或MBS將多肽分別與載體蛋白牛血清白蛋白耦聯；(3)、將8種耦聯物混合后配以鋁佐劑制備成流感疫苗，其中，8種耦聯物的份數比可以根據不同年份統(tǒng)計學處理得出的各位點的變異機率進行調整。
實施例5、制備以流感病毒胞膜蛋白HA和M2蛋白為基礎的多表位-多聯流感疫苗，包括以下步驟(1)、人工合成含有流感病毒胞膜蛋白HA和/或M2蛋白上主要中和表位，并有至少一次重復的4條表位多肽CGLFGAIAGFIEGWTGVAQDGLFGAIAGFIEGWTGVAQDCGWTGVAQDGGRNEWGCRCGWTGVAQDGGRNEWGCRCCVETPIRNEGRNEWGCRGVETPIRNEGRNEWGCRCSLLTEVETGGVETPIRNEGSLLTEVETGGVETPIRNE(2)、利用戊二醛或MBS將多肽分別與載體蛋白牛血清白蛋白耦聯；(3)、將4種耦聯物混合后配以鋁佐劑制備成流感疫苗，其中，4種耦聯物的份數比可以根據不同年份統(tǒng)計學處理得出的各位點的變異機率進行調整。
實施例6、制備以流感病毒胞膜蛋白HA和M2蛋白為基礎的抗變異的多表位-多聯表位流感疫苗，包括以下步驟(1)、人工合成含有HA和M2蛋白上中和表位和其變異表位的3條表位多肽CGWTGVAQDGWTGVTQNGWTGVAQSGWTGVTQCGITDSDQTRGSTDKEQTDGSTDREQTKGITDSDQTRGSTDKEQTDGSTDREQTKCGKAYSNCYGKAFSNCYGCGKAYSNCYGKAFSNCYG(2)、利用MBS(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimide ester)將上述表位多肽分別與載體蛋白牛血清白蛋白耦聯；(3)、將3種耦聯物混合后配以鋁佐劑制備成流感疫苗，其中，3種耦聯物的份數比可以根據不同年份統(tǒng)計學處理得出的各位點的變異機率進行調整。
權利要求
1.一種流感病毒表位疫苗，它包括至少一個耦聯到載體蛋白或載體多肽上形成耦聯物的含有至少一次重復的單表位或者至少一次重復的多表位的表位多肽，所述表位選自流感病毒胞膜蛋白HA或M2上的中和表位或變異表位。
2.根據權利要求1所述的流感病毒表位疫苗，其特征在于所述中和表位和變異表位選自下列表位多肽中的一個或多個GLFGAIAGFIEWTGVAQDHHPITDSDQTRLYKAYSNCYPYDVPDYSLLTEVETVETPIRNERNEWGCRCEWGCRCND
3.根據權利要求1或2所述的流感病毒表位疫苗，其特征在于所述中和表位和變異表位還可選自GWTGVAQDGITDSDQTRGSTDKEQTDGSTDREQTKGKAYSNCYGKAFSNCYG
4.根據權利要求1或2所述的流感病毒表位疫苗，其特征在于疫苗中還包括可接受的藥用佐劑。
5.根據權利要求3所述的流感病毒表位疫苗，其特征在于疫苗中還包括可接受的藥用佐劑。
6.一種制備流感病毒表位疫苗的方法，基本上包括以下步驟(1)、人工合成含有選自流感病毒胞膜蛋白HA和M2上的單個中和或變異表位，或者含有多個中和或/和變異表位的表位多肽；所述中和表位及變異表位有至少一次的重復；(2)、將上述表位多肽分別耦聯到載體蛋白或載體多肽上形成耦聯物；(3)、將上述耦聯物配以可接受的佐劑制備成流感疫苗。
7.根據權利要求6所述的一種制備表位流感疫苗的方法，其特征在于所述至少一次重復的單表位或者至少一次重復的多表位的表位多肽選自CGLFGAIAGFIEGGLFGAIAGFIECGWTGVAQDGWTGVAQDGWTGVAQDCGHHPITDSDQTRLYGHHPITDSDQTRLYCGKAYSNCYPYDVPDYGKAYSNCYPYDVPDYCSLLTEVETGSLLTEVETGSLLTEVETCVETPIRNEGVETPIRNEGVETPIRNECRNEWGCRCGRNEWGCRCGRNEWGCRCCEWGCRCNDGSEWGCRCNDGSEWGCRCNDS
8.根據權利要求6或7所述的一種制備流感病毒表位疫苗的方法，其特征在于所述至少一次重復的單表位或者至少一次重復的多表位的表位多肽可以選自CGWTGVAQDGWTGVTQNGWTGVAQSGWTGVTQCGITDSDQTRGSTDKEQTDGSTDREQTKGITDSDQTRGSTDKEQTDGSTDREQTKCGKAYSNCYGKAFSNCYGGKAYSNCYGKAFSNCYG
全文摘要
本發(fā)明涉及一種流感病毒表位疫苗,它包括至少一個耦聯到載體蛋白或載體多肽上形成耦聯物的含有至少一次重復的單表位或者至少一次重復的多表位的表位多肽,表位選自流感病毒胞膜蛋白HA或M2上的的特定中和表位或變異表位。制備疫苗的方法包括1.人工合成含有選自流感病毒胞膜蛋白HA和M2上的至少一次重復的單表位或者至少一次重復的多表位的表位多肽;2.將表位多肽分別耦聯到載體蛋白或載體多肽上形成耦聯物;3.將上述耦聯物配以佐劑制成疫苗。本發(fā)明能有效對付病毒的變異,具有廣泛的經濟及社會效益。
文檔編號A61K39/145GK1338307SQ00121290
公開日2002年3月6日 申請日期2000年8月10日 優(yōu)先權日2000年8月10日
發(fā)明者陳應華, 陸韻, 丁健 申請人:清華大學