專利名稱：呼吸鏈泛醌抑制劑在克服溶栓再灌流損傷的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種呼吸鏈泛醌抑制劑在克服溶栓再灌流損傷方面的應(yīng)用。
人體吸入的氧90％以上在線粒體中被用掉，線粒體消耗氧分子主要是用于合成三磷酸腺苷(ATP)，ATP是供給機(jī)體能量需求的主要能源分子。線粒體制造ATP是氧化磷酸化過(guò)程的結(jié)果，氧化是指呼吸鏈將底物電子傳遞給氧的過(guò)程，磷酸化是指ATP酶催化ADP+P生成ATP的過(guò)程，兩個(gè)過(guò)程的偶聯(lián)就是氧化磷酸化過(guò)程。
近年來(lái)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)呼吸鏈傳遞電子并不是像一條絕緣很好的導(dǎo)線，而是像一條漏電的導(dǎo)線。在呼吸鏈的特定部位有電子漏出，漏出的電子沒有進(jìn)入合成ATP的氧化磷酸化過(guò)程，而是和氧分子直接反應(yīng)生成了超氧自由基。超氧自由基可以歧化成雙氧水并進(jìn)一步產(chǎn)生其他一些有害的活性氧分子，活性氧分子水平過(guò)高常導(dǎo)致生物分子的氧化損傷即所謂自由基損傷。
呼吸鏈漏電子的程度與呼吸鏈的還原狀態(tài)有關(guān)，電子充斥時(shí)的高還原狀態(tài)是呼吸鏈容易漏電的狀態(tài)。血管栓塞意味著病灶缺血，缺血即缺氧，缺氧使得呼吸鏈處于容易漏電的高還原態(tài)。溶栓意味著給易漏電的呼吸鏈充氧，有如火上澆油，加速了超氧自由基的生成，使溶栓瞬間造成嚴(yán)重的氧自由基損傷，這就是所說(shuō)的溶栓再灌流損傷的分子機(jī)制。
目前尚無(wú)有效的臨床手段克服溶栓時(shí)出現(xiàn)的再灌流損傷問題，文獻(xiàn)報(bào)道(楊衛(wèi)東等，“電子自旋共振直接檢測(cè)心肌缺血再灌流產(chǎn)生的氧自由基和復(fù)方丹參對(duì)氧自由基的清除作用”，中華心血管雜志，7，178-194(1989)，采用自由基消除劑的方法達(dá)到減少再灌流損傷的目的，但氧自由基一旦瞬間大量生成就很難用自由基清除劑的手段達(dá)到完全抵償它們的有害作用的目的。
本發(fā)明的目的是提出用具有抑制呼吸鏈泛醌反應(yīng)的抑制劑來(lái)克服溶栓再灌流損傷。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的基本原理體內(nèi)生成氧自由基的主要部位是線粒體，呼吸鏈漏電是線粒體生成氧自由基的基本方式。本發(fā)明提出用呼吸鏈底物端抑制劑限制電子漏出的數(shù)量以達(dá)到減少氧自由基生成和避免產(chǎn)生再灌流損傷的目的，實(shí)驗(yàn)證明，呼吸鏈泛醌抑制劑具有這種功能。
本發(fā)明提出的泛醌抑制劑包括硝基水楊酰類化合物和醌類化合物一．硝基水楊酸類，通式為 式中R為C1-20烷基。
具體化合物包括3-硝基-N-甲基水楊酰胺、5-硝基-N-甲基水楊酰胺、3-硝基-N-癸基水楊酰胺。
該類化合物的制備方法見《生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)》，15(2)308，1999。
二．醌類化合物包括下列化合物(1)鹵代醌，其通式為 式中，R2、R3、R5為甲基或氯、溴取代基；R6為C1-20烷基。
具體化合物包括2，3-二甲氧基-5-溴甲基-1，4-苯醌；2，3-二甲氧基-5-溴甲基-6-癸基-1，4-苯醌；2，3-二甲氧基-5-甲基-6-(1’-溴-癸基)-1，4-苯醌；2，3-二甲氧基-5-溴甲基-6-(1’-溴-癸基)-1，4-苯醌；2，3-二甲氧基-6-(1’-溴-癸基)-1，4-苯醌。它們的制備方法見“《生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)》，30(2)212-215，1998”。
(2)酰胺吡啶醌，其通式為 式中R為C1-20烷基。
具體化合物包括2-羥基-3-N-十二烷基酰胺吡啶，2-羥基-6-甲基-3-N十二烷基酰胺吡啶，3-羥基-2-N-十二烷基酰胺吡啶。它們的制備方法見“《生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，24(6)575-579，1992”。
(3)噻唑醌，其通式為 式中，R1為H、鹵素，R2為C1-20烷基或硫烷基，R3為C1-4烷基或硫氧基、羥基、鹵素。
具體化合物包括2-氯-5-正十二硫烷基-6-甲基-4，7-苯并噻唑醌(2-CL-DMMDBT)、2-氯-5-正丁烷氨基-6-甲基-4，7-苯并噻唑醌(2-CL-BAMDBT)。它們的制備方法見“《生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展》，22(6)536-540，1995”本發(fā)明的泛醌抑制劑可以注射使用。
為了說(shuō)明泛醌抑制劑減少再灌流損傷的效果，我們建立了大鼠腦栓塞模型。檢測(cè)了缺血再灌流(即栓塞一定時(shí)間后進(jìn)行溶栓)期間大鼠腦線粒體生成活性氧(以H2O2的生成為指標(biāo))、以及線粒體受到氧化損傷的情況(生成的脂過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)為指標(biāo))。觀察了呼吸鏈泛醌抑制劑限制病灶組織線粒體生成氧自由基的程度和減少氧化損傷的效果。表1給出了大鼠腦線粒體在缺血再灌注期間生成H2O2及MDA的情況。
表1缺血再灌注期間大鼠腦線粒體H2O2的產(chǎn)生量及MDA含量的變化
注缺血組1／2h和再灌注各組R／均與假手述組(Sham)相比較；*P＜0．05。
大鼠缺血后會(huì)出現(xiàn)缺血損傷，通常大鼠缺血兩小時(shí)(1／2h)H2O2的產(chǎn)生量(34．2±16．0)假手術(shù)組Sham(26．0±10．7)，說(shuō)明電子漏程度增高約30％。線粒體損傷程度1／2h(60．8±21．8)假手術(shù)組Sham(40．8±7．7)，氧化損傷程度高約49％。
溶栓后可發(fā)現(xiàn)再灌流損傷，再灌流一小時(shí)出現(xiàn)氧自由基產(chǎn)生的高峰值達(dá)39．0±8．1*，說(shuō)明電子漏程度比假手術(shù)組高出50％。線粒體損傷在再灌流2小時(shí)后明顯增高，R／2h達(dá)67．4±15．1*，比假手術(shù)組高出65％。再灌流4小時(shí)R／4h依然高達(dá)63．8±23．0*，比假手術(shù)組還高出56％。
如果在溶栓前先注射一定計(jì)量的泛醌反應(yīng)抑制劑，溶栓后就不再出現(xiàn)雙氧水生成量的高峰和MDA含量的增高，這說(shuō)明泛醌抑制劑具有減少或避免再灌流損傷的效果。
下面通過(guò)具體實(shí)例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明特點(diǎn)。
實(shí)例1本實(shí)例為硝基水楊酰胺類化合物對(duì)泛醌反應(yīng)的抑制作用，詳見

圖1-圖3，其中3-硝基-N-甲基水楊酰胺抑制劑(3-NSMA)和5-硝基-N-甲基水楊酰胺(5-NSMA)抑制劑對(duì)琥珀酸泛醌還原酶和泛醌細(xì)胞色素C還原酶均有50％的抑制作用(見圖1)。而長(zhǎng)側(cè)鏈的硝基-N-癸基水楊酰胺可以抑制接近完全(見圖2)。
圖1為3-硝基-N-甲基水楊酰胺(Ⅰ)和5-硝基-N-甲基水楊酰胺(Ⅱ)對(duì)泛醌-細(xì)胞色素C還原酶的抑制作用。圖中·-·曲線為3硝基-N-甲基水楊酰胺；0-0曲線為5-硝基-N-甲基水楊酰胺。
檢測(cè)條件(A)1．2ml反應(yīng)液中含0．1摩爾磷酸緩沖液(PH=7．4)、20毫摩爾琥珀酸鈉、0．3毫摩爾EDTA(乙二胺四乙酸鈉鹽)、0．1毫摩爾細(xì)胞色素C、30微摩爾Q2H2(還原型短鏈)和指定量的Ⅰ和Ⅱ。(注泛醌Q2為含兩個(gè)異戊二烯側(cè)鏈)。
圖2為3-硝基-N-癸基水楊酰胺對(duì)電子從琥珀酸到2，6-二氯酚吲哚酚的抑制效應(yīng)。圖中0-0曲線用琥珀酸-細(xì)胞色素C還原酶測(cè)定的；△-△曲線是用心肌制劑測(cè)定的。檢測(cè)條件反應(yīng)液含0．1摩爾磷酸緩沖液(PH=7．4)、20毫摩爾琥珀酸鈉、0．053毫摩爾2，6-二氯酚吲哚酚。
圖3為3-硝基-N-癸基水楊酰胺對(duì)電子從泛醌到細(xì)胞色素C傳遞的抑制效應(yīng)。圖中·-·曲線是用琥珀酸-細(xì)胞色素C還原酶測(cè)定的；▲-▲曲線是用心肌制劑測(cè)定的。檢測(cè)條件反應(yīng)液含0．1摩爾磷酸緩沖液(PH=7．4)、0．1毫摩爾細(xì)胞色素C、30微摩爾Q2H2。
實(shí)例2本實(shí)例是2，3-二甲氧基-5-溴甲基-1，4-苯醌(Ⅰ)、2，3-二甲氧基-5-溴甲基-6-癸基-1，4-苯醌(Ⅱ)、2，3-二甲氧基-5-甲基-6-(1’-溴-癸基)-1，4-苯醌(Ⅲ)、2，3-二甲氧基-5-溴甲基-6-(1’-溴-癸基-1，4-苯醌(Ⅳ)、2，3-二甲氧基-6-(1’-溴-癸基-1，4-苯醌(Ⅴ)對(duì)琥珀酸泛醌還原酶的抑制作用。檢測(cè)結(jié)果見表2和表3。
表2中數(shù)據(jù)檢測(cè)條件1毫升反應(yīng)液中含50毫摩爾磷酸緩沖液(PH為7．4)、20毫摩爾琥珀酸鈉、0．2毫摩爾EDTA、0．05毫摩爾2，6-二氯酚吲哚酚、0．3毫摩爾Q0C10H2(一種代替Q10作為底物的醌類似物，Q10為含十個(gè)異戊二烯側(cè)鏈)。加0．5克／升的酶制劑20微升啟動(dòng)反應(yīng)，600nm波長(zhǎng)監(jiān)測(cè)2，6-二氯酚吲哚酚的還原速率。
表3中數(shù)據(jù)檢測(cè)條件1毫升反應(yīng)液中含50毫摩爾磷酸緩沖液(PH為7．4)、20毫摩爾琥珀酸鈉、0．2毫摩爾EDTA、0．1毫摩爾細(xì)胞色素C和0．3毫摩爾Q0C10H2、加0．5克／升的泛醌-細(xì)胞色素C還原酶20微升啟動(dòng)反應(yīng)，550nm波長(zhǎng)監(jiān)測(cè)的細(xì)胞色素C還原速率。表2溴代醌類化合物對(duì)琥珀酸-泛醌還原酶的抑制作用
表3溴代醌類化合物對(duì)泛醌-細(xì)胞色素C還原酶的抑制作用
實(shí)例3本實(shí)例是酰胺吡啶類化合物2-羥基-3-N-十二烷基酰胺吡啶(A)、2-羥基-6-甲基-3-N-十二烷基酰胺吡啶(B)、3-羥基-2-N-十二烷基酰胺吡啶(C)對(duì)呼吸鏈酶反應(yīng)的抑制作用。檢測(cè)結(jié)果見表4。
檢測(cè)條件同實(shí)例1。表4中SCR代表琥珀酸細(xì)胞色素C還原酶，SQR代表琥珀酸泛醌還原酶，NCR代表NADH細(xì)胞色素C還原酶，NQR代表NADH泛醌還原酶，QCR代表泛醌細(xì)胞色素C還原酶。表4酰胺吡啶類化合物對(duì)呼吸鏈酶反應(yīng)的抑制作用
實(shí)例4本實(shí)例為苯并噻唑醌類化合物2-氯-5-正十二硫烷基-6-甲基-4，7-苯并噻唑醌(2-CL-DMMDBT)和2-氯-5-正丁烷基-6-甲基-4，7-苯并噻唑醌(2-CL-BAMDBT)對(duì)呼吸鏈的抑制作用。檢測(cè)結(jié)果見圖4。圖4為2-CL-DMMDBT和2-CL-BAMDBT對(duì)心肌制劑琥珀酸氧化酶活力的抑制濃度曲線。圖中0-0曲線為2-CL-DMMDBT抑制劑；X-X曲線為2-CL-BAMDBT抑制劑。
檢測(cè)方法同實(shí)例1。
實(shí)例5本實(shí)例選用3-硝基-N-甲基水楊酰胺(NSMA)考察了泛醌抑制劑減少或避免再灌流損傷的效果。在溶栓前注射泛醌抑制劑硝基水楊酰胺(NSMA)240 μg／100g大鼠體重，由表5可知，溶栓后沒有出現(xiàn)雙氧水生成量的高峰和MDA量的增高，這一結(jié)果說(shuō)明泛醌抑制劑具有減少或避免再灌流損傷的效果。
表5 NSMA對(duì)缺血后再灌注不同時(shí)間線粒體H2O2產(chǎn)生量及脂質(zhì)過(guò)氧化水平的(MDA含量)的影響
注D組分別與相對(duì)應(yīng)的S組比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P＞0．05。
權(quán)利要求
1．一種呼吸鏈泛醌抑制劑在克服溶栓再灌流損傷的應(yīng)用，其特征在于所述的抑制劑包括硝基水楊酰胺類化合物和醌類化合物。
2．按照權(quán)利要求1所述的呼吸鏈泛醌抑制劑在克服溶栓再灌流損傷的應(yīng)用，其特征在于所述的硝基水楊酰胺類化合物的通式為 式中R為C1-20烷基。
3．按照權(quán)利要求1所述的呼吸鏈泛醌抑制劑在克服溶栓再灌流損傷的應(yīng)用，其特征在于所述的醌類化合物包括鹵化醌、酰胺吡啶醌、噻唑醌，所述的鹵代醌通式為 式中，R2、R3、R5為甲基或氯、溴取代基，R6為C1-20烷基，所述的酰胺吡啶醌通式為 式中R為C1-20烷基，所述的噻唑醌通式為 式中，R1為H、鹵素，R2為C1-20烷基或硫烷基，R3為C1-4烷基或硫氧基、羥基、鹵素。
全文摘要
本發(fā)明是一種呼吸鏈泛醌抑制劑在克服溶栓再灌流損傷方面的應(yīng)用,所述的呼吸鏈泛醌抑制劑包括硝基水楊酰胺類化合物和醌類化合物。本發(fā)明的泛醌抑制劑可減少氧自由基的生成,從而達(dá)到使再灌流損傷減小或不再發(fā)生,它們可以作為篩選溶栓輔助藥物的原材料。
文檔編號(hào)A61P7/00GK1283460SQ0012346
公開日2001年2月14日 申請(qǐng)日期2000年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月17日
發(fā)明者徐建興 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所