專利名稱：一種抗腫瘤及抗癌轉(zhuǎn)移的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥，特別是涉及一種治療腫瘤及抗癌轉(zhuǎn)移的中藥。
隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，抗癌藥物研究與開發(fā)進(jìn)入了新的階段，應(yīng)用傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療人類腫瘤已得到國內(nèi)外專家的廣泛關(guān)注。
侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本特征之一，約有80％以上腫瘤患者死于侵襲和轉(zhuǎn)移。目前腫瘤化學(xué)治療效果已經(jīng)進(jìn)入平臺期，且現(xiàn)有的治療方案主要針對原發(fā)癌、即使化療轉(zhuǎn)移癌的抗藥能力明顯高于原發(fā)癌，再加上這些病例往往是接受過放療、化療而失敗的，較難承受再次強力的化療，為此，開發(fā)針對轉(zhuǎn)移過程的抗癌轉(zhuǎn)移藥，是提高惡性腫瘤治愈率、延長患者生命的一個最主要的途徑。
目前雖已有許多種化合物對腫瘤細(xì)胞在動物體內(nèi)轉(zhuǎn)移有一定抑制作用的報道，也有些化合物已成功用于轉(zhuǎn)移的實驗治療。但至今尚在開發(fā)研究階段。眾所周知，在癌被診斷時往往已存在著轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，故抗轉(zhuǎn)移藥的目的是阻止轉(zhuǎn)移和阻止病灶的進(jìn)一步擴散、或作為手術(shù)切除原發(fā)灶預(yù)防術(shù)后轉(zhuǎn)移的輔助用藥。從這種意義上講，抗轉(zhuǎn)移藥應(yīng)該低毒，能夠長期服用而不帶來明顯的累積毒性，應(yīng)與抗癌化療藥，在概念上有所不同。鑒于中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)宿主組織各種病理性失衡，作用于多個環(huán)節(jié)，雙相性、無明顯毒副作用等方面具有特點。使其在抗轉(zhuǎn)移藥開發(fā)研究中具有明顯的優(yōu)勢。
本發(fā)明目的在于提供一種能治療腫瘤的中藥；本發(fā)明的目的還在于提供一種能治療抗癌轉(zhuǎn)移的中藥。
本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的按下述重量份稱取原料藥，黃芪150-900龜板150-900鱉甲150-900川芎100-600白術(shù)100-600益母草100-600焦山楂100-600，按常規(guī)制劑工藝將原料藥制成臨床上可接受的劑型。
根據(jù)中醫(yī)理論，大多數(shù)癌癥術(shù)后患者存在著氣陰兩虛或氣虛血瘀證候，再融合理代醫(yī)學(xué)對癌轉(zhuǎn)移認(rèn)識，綜合起來，我們構(gòu)思了一個“益氣養(yǎng)陰、行氣活血、扶正驅(qū)邪”的中藥抗癌術(shù)后轉(zhuǎn)移的思路，根據(jù)這個思路我們結(jié)合以往臨床經(jīng)驗，研制了本發(fā)明藥物“復(fù)方長必安膠囊”。經(jīng)動物實驗證實它有提高機體免疫功能，并對與轉(zhuǎn)移有關(guān)的腫瘤細(xì)胞粘附分子(CD44)，多藥耐藥基因(MDR)、β2-MG有顯著陽性變化，在流式細(xì)胞儀上顯示腸癌細(xì)胞G2+M期的細(xì)胞阻滯，并誘導(dǎo)腸癌細(xì)胞凋亡，對Lemis肺癌和B16黑色素瘤的血道轉(zhuǎn)移有一定抑制作用。實驗還顯示“長必安膠囊”協(xié)同順鉑在高轉(zhuǎn)移人卵巢癌裸鼠體內(nèi)抗腫瘤生長和抗轉(zhuǎn)移的作用。經(jīng)臨床近一年來試用觀察，“復(fù)方長必安膠囊”能明顯改善癌術(shù)后氣陰兩虛證候，能穩(wěn)定與提高患者免疫功能，無明顯毒副反應(yīng)，經(jīng)1年內(nèi)隨訪觀察無1例出現(xiàn)淋巴或血道轉(zhuǎn)移。因此，本發(fā)明藥物不僅有抗腫瘤和提高機體免疫功能的作用，而且具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。主要藥效學(xué)研究如下一.中藥長必安體外抗人大腸癌細(xì)胞的研究為了解中藥長必安的抗腸癌作用，發(fā)明人用自建的兩株人大腸癌細(xì)胞系HR-8348、Hce-8693，進(jìn)行了體外細(xì)胞實驗，探討中藥長必安的抗腸癌細(xì)胞作用。
1、細(xì)胞實驗方法人直腸低分化腺癌細(xì)胞系HR-8348和人盲腸未分化腺癌細(xì)胞系Hce-8693，由浙江省腫瘤醫(yī)院，分別于1985年和1987年建立，常規(guī)培養(yǎng)傳代。實驗時取對數(shù)生長期的細(xì)胞，分別制成1×105/ml細(xì)胞懸液，取1ml細(xì)胞懸液接種于25ml的培養(yǎng)瓶中，再加入1ml新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時，隨機分成6組。
1)A組陰性對照組，培養(yǎng)液中不加藥物；2)B組低濃度長必安組，培養(yǎng)液中加5％的灌胃長必安的小鼠血清(用5g/ml長必安藥液，灌喂每只小鼠2ml，2小時后取血，分離血清，所獲血清通過雙波長(530nm、700nm)薄層掃描，確證血液中黃芪甲甙含量較高的血清樣品，經(jīng)無菌過濾，56℃水浴滅活1小時后放4℃冰箱；備用)。
3)C組中濃度長必安組，培養(yǎng)液中加10％長必安小鼠血清；4)D組高濃度長必安組，培養(yǎng)液中加20％長必安小鼠血清；5)E組陽性對照組，培養(yǎng)液中加0.25mg/ml的5-FU(氟脲嘧啶)；6)F組聯(lián)合用藥組，10％長必安小鼠血清加0.25mg/ml的5-FU培養(yǎng)液。
各組培養(yǎng)72小時后進(jìn)行各生物學(xué)指標(biāo)的測定并重復(fù)3次以上，所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。
2、觀察指標(biāo)1.1細(xì)胞成活率測定實驗后的細(xì)胞用臺盼蘭染色法，計數(shù)各組活細(xì)胞數(shù)，每組計數(shù)5次求得平均值。
2.2細(xì)胞上清液中LDH檢測各組細(xì)胞實驗后取上清液，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100ul，再加100ulLDH反應(yīng)液，同時設(shè)最小釋放孔和最大釋放孔，每組設(shè)5個復(fù)孔，按照文獻(xiàn)的方法，在Clini Bi0128酶標(biāo)儀上用492nm波長測定LDH活性(OD值)。并按公式求得自然殺傷率。 2.3細(xì)胞上清液中CEA、β2-MG檢測各組實驗后的細(xì)胞取上清液，按3V診斷技術(shù)公司生產(chǎn)的放免藥盒說明書進(jìn)行檢測。
2.4細(xì)胞周期分析經(jīng)中藥長必安實驗后的細(xì)胞，用消化液消化收集細(xì)胞，經(jīng)Hank’s液洗一次，沉淀細(xì)胞用75％酒精固定，上機檢測前經(jīng)PI綜合染液染色30分鐘，在FACS Calibur流色細(xì)胞儀上作DNA含量測定，所得數(shù)據(jù)采用ModFitLT軟件計算各期細(xì)胞百分率。進(jìn)行細(xì)胞DNA含量分析。
2.5細(xì)胞凋亡的分析實驗后的細(xì)胞處理及上機前的PI染色同上，在FACSCalibur流色細(xì)胞儀上作DNA含量分析的同時，在DNA直方圖上，找出G0/1峰前出現(xiàn)的低DNA含量并呈左右對稱的細(xì)胞峰，進(jìn)行分析。
3、結(jié)果2.1細(xì)胞存活率，見表1。
表1長必安對人大腸癌細(xì)胞增殖抑制作用的影響 HR-8348*D組與E比較P＜0.05**F組與E組比較P＞0.05Hce-8693*D組與E比較P＞0.05**F組與E組比較P＞0.05結(jié)果顯示兩株細(xì)胞系各組細(xì)胞數(shù)與陰性對照組相比均有不同程度的減少，并隨長必安濃度的增加對細(xì)胞的增殖抑制成負(fù)相關(guān)，除HR-8348B組細(xì)胞經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理與A組比較無明顯差異外，其他單純用藥各組與A組比較P值均小于0.001，其中高濃度長必安組細(xì)胞抑制制作用更強，與5-Fu陽性對照組比較差異無顯著性，由此可見單用中藥長必安對大腸癌細(xì)胞有抑制細(xì)胞增殖作用，并隨劑量增加抑制作用增強。
3.2細(xì)胞上清液中LDH檢測結(jié)果見表2表2長必安對人大腸癌細(xì)胞LDH的影響 HR-8348*D組與E比較P＜0.001**F組與E組比較P＜0.001Hce-8693*D組與E比較P＜0.001**F組與E組比較P＜0.001從LDH檢測結(jié)果可見，兩株大腸癌細(xì)胞經(jīng)中藥長必安作用后的LDH含量隨長必安濃度的增加而增高，其中高濃度長必安作用后的LDH含量高出陽對照組的4倍，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，各實驗組與A組比較P值均小于0.001，其中D組與E組比較P＜0.001，顯示了高濃高長必安對大腸癌細(xì)胞有較強的殺傷作用，其殺傷作用較5-Fu強，從細(xì)胞自然殺傷率結(jié)果也證實了這一點，長必安濃度增高對細(xì)胞的殺傷率越高，其中高濃度組的細(xì)胞殺傷率高出陽性對照5-Fu組的5倍。
二、中藥長必安體內(nèi)抗腫瘤作用長必安對S180肉瘤及Lewis肺癌的抑制作用。雌性ICR小鼠，體重18-22g，用于接種S180肉瘤。雌性C57/6J小鼠，體重18-22g，用于接種Lewis肺癌。腫瘤均接種于前肢腋下，同時設(shè)高、中、低三個長必安組及CTX陽性對照和陰性對照組。結(jié)果見表3、表4。
表3長必安對S180肉瘤的抑制作用 表4長必安對Lewis肺癌的抑制作用 注*、**、***表示與水對照組比較P＜0.05，0.01，0.001從表3、表4可以看出，25.5g-6.3g/kg劑量的長必安對S180肉瘤及Lewis肺瘤均有明顯的抑制作用。
三、中藥長必安抗轉(zhuǎn)移作用的實驗研究1.長必安抗腫瘤血道轉(zhuǎn)移的實驗研究。
1.1對小鼠Lewis肺癌血道轉(zhuǎn)移的抑制作用。
取Lewis肺癌實體瘤，剪碎，200目尼龍網(wǎng)上研磨并過濾，生理鹽水調(diào)正細(xì)胞濃度至1×106/ml，每只0.2ml，注入C57/6J小鼠尾靜脈，次日分組并灌胃給長必安膠囊25.5g/kg，每日一次，連續(xù)20天，環(huán)磷酰胺組在接種腫瘤第7、14天腹腔注射100mg/kg的環(huán)磷酰胺。實驗第21處死動物，取肺計算Lewis肺癌肺轉(zhuǎn)移率。結(jié)果見表5。
表5長必安膠囊對Lewis肺癌血道轉(zhuǎn)移的影響 由表5可見，25g/kg劑量的長必安有對Lewis血道肺轉(zhuǎn)移產(chǎn)生一定的抑制作用。
1.2對小鼠B16黑色素瘤血道轉(zhuǎn)移的抑制作用。
取體外培養(yǎng)的B16黑色素瘤細(xì)胞株，調(diào)整到5×105/ml細(xì)胞濃度，取0.2ml/只，注入C57/6J小鼠的尾靜脈(即1×105/只小鼠)，次日分組，灌胃給藥20天，停藥次日處死小鼠，取肺、計數(shù)肺轉(zhuǎn)移率及轉(zhuǎn)移灶，動物分組，給藥劑量及結(jié)果見表6。
表6長必安膠囊對B16黑色素瘤血道肺轉(zhuǎn)移的影響(X±SD) 由表6可見，長必安膠囊二個劑量對B16黑色素瘤的血道轉(zhuǎn)移均有不同程度的抑制作用(抑制率為13-26％)，而環(huán)磷酰胺則促使血道肺轉(zhuǎn)移的增加。
四、“長必安膠囊”抗癌轉(zhuǎn)移56例臨床小結(jié)一般資料資料來源56例病例分布在浙江省腫瘤醫(yī)院25例、腫瘤醫(yī)院分院10例，省中研院門診部及附院20例，男40例、女16例、其中年齡最小45歲、最大年齡70歲、平均年齡56歲。
病理分布大腸癌術(shù)后30例，均為腺癌(DukesB期10例、C期20例)胃癌術(shù)后10例，均為腺癌，乳腺癌術(shù)后12例，均為腺癌。
觀察追綜時間，服藥后1年全部病例均經(jīng)門診復(fù)查。
治療方法經(jīng)病理確診作手術(shù)后7-12天開始服用“復(fù)方長必安膠囊”，每日三次，每次6丸。服三月為一療程。
觀察指標(biāo)(一)安全性觀察1.一般體檢項目2.血、尿、便常規(guī)化驗3.心、肝、腎功能檢查(二)療效性觀察1.中醫(yī)病證2.流式細(xì)胞儀檢測用藥前后免疫細(xì)胞亞型CD3、CD4、CD8、CD4/CD8、NK、總B細(xì)胞。
3.肺、肝、骨、腦等部位X線或B超檢查。
(三)付反應(yīng)觀察惡心、嘔吐、胃納下降、腹瀉等癥狀。療效判定標(biāo)準(zhǔn)(一)癥狀療效標(biāo)準(zhǔn)(根據(jù)衛(wèi)生部中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則標(biāo)準(zhǔn))1.臨床痊愈癥狀積分好轉(zhuǎn)90％以上；2.顯效癥狀積分好轉(zhuǎn)60％以上。
3.有效癥狀積分好轉(zhuǎn)30％以上。
4.無效癥狀積分好轉(zhuǎn)小于30％。
(二)半定量積分法將臨床主要癥狀分為輕、中、重三級、分級記分。無癥狀0分；輕癥癥狀轉(zhuǎn)變或偶爾出現(xiàn)為1分；中度癥狀時輕時重或間斷出現(xiàn)為2分；重癥癥狀嚴(yán)重或持續(xù)存在為3分。
(三)免疫功能分提高，穩(wěn)定、下降。
(四)術(shù)后生存期(五)轉(zhuǎn)移率結(jié)果(一)癥狀改善情況本組出現(xiàn)中醫(yī)癥狀共8種，均為中醫(yī)氣虛，陰虛證候，服藥后得到明顯改善，見表7。
表7中醫(yī)癥狀服藥前后情況表 (二)免疫功能情況本組對20例病人進(jìn)行了免疫細(xì)胞亞群FCM檢測，表明服藥后患者免疫功能基本穩(wěn)定，并有提高，見下表8。
表8免疫功以能服藥前后水平表
(三)術(shù)后生存期56例病人經(jīng)一年門診隨訪均存活。
(四)轉(zhuǎn)移情況56例術(shù)后病人一年隨訪無轉(zhuǎn)移病灶發(fā)現(xiàn)。
(五)本組無1例出現(xiàn)付反應(yīng)，也未出現(xiàn)心、肝，腎功能異常及白細(xì)胞等血象變化。
實施例原料藥黃芪450g龜板450g鱉甲450g川芎300g白術(shù)300g益母草300g焦山楂300g工藝1.白術(shù)粉碎，過100篩(備用)2.龜板、鱉甲加10倍量水先煎煮2h，濾過，濾渣同黃芪、川芎、益母草、焦山楂再加入10倍量水煎煮二次，每次2h，濾過，合并濾液，濃縮至相對密度為1.85(30℃測)稠膏，加入白術(shù)粉，混勻，噴霧干燥，混勻，套膠囊，配制1000粒每粒0.35g即得。
權(quán)利要求
1.一種具有抗腫瘤及抗癌轉(zhuǎn)移的藥物，其特征在于該藥物由下列重量份的原料藥制成黃芪150-900龜板150-900鱉甲150-900川芎100-600白術(shù)100-600益母草100-600焦山楂100-600
2.如權(quán)利要求1所述的藥物，其特征在于該藥物是由下列重量份的原料藥制成黃芪450龜板450鱉甲450川芎300白術(shù)300益母草300焦山楂300
3.如權(quán)利要求1或2所述的藥物，其特征在于該藥物可以制成臨床上可接受的劑型。
4.如權(quán)利要求1或2所述的藥物在制備抗大腸癌的藥物中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求1或2所述的藥物在制備抗癌轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗腫瘤及抗癌轉(zhuǎn)移的藥物,該藥物由黃芪150—900龜板150—900鱉甲150—900川芎100—600白術(shù)100—600益母草100—600焦山楂100—600組成。
文檔編號A61P35/00GK1286992SQ00124360
公開日2001年3月14日 申請日期2000年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月8日
發(fā)明者沈漢澄 申請人:沈漢澄