專利名稱:利用牙本質(zhì)唾磷蛋白基因及其編碼產(chǎn)物診斷和治療牙本質(zhì)生成不全Ⅱ型的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及生物工程和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地,本發(fā)明涉及利用人DSPP基因及其編碼產(chǎn)物診斷和治療牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型的方法,以及含有DSPP基因和/或蛋白的藥物組合物。
牙齒發(fā)育期間和成熟牙齒內(nèi)的牙本質(zhì)由于成牙本質(zhì)細(xì)胞生成,牙本質(zhì)發(fā)生時(shí),成牙本質(zhì)細(xì)胞形成牙本質(zhì)小管,位于小管內(nèi)的牙本質(zhì)細(xì)胞突使得牙本質(zhì)成為一個(gè)活的組織。牙本質(zhì)形成的最初階段成牙本質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行牙本質(zhì)基質(zhì)成分的合成、分泌和重吸收。蛋白質(zhì)合成發(fā)生于細(xì)胞體內(nèi),胞吐作用和胞吞作用主要發(fā)生于細(xì)胞突內(nèi)。最先形成的是未礦化的罩牙本質(zhì)基質(zhì),主要為細(xì)胞分泌膠原和非膠原成分,成束的膠原纖維集合形成球狀結(jié)構(gòu)。由于新的纖維不斷增加,膠原變的越來越緊密,最后這些前期膠原纖維轉(zhuǎn)化為膠原纖維。這就形成了以膠原性基質(zhì)為特征的前期牙本質(zhì),隨后礦化晶體在離細(xì)胞一定距離處逐漸沉積最終形成牙本質(zhì)。
完全成熟的牙本質(zhì)無機(jī)礦化物質(zhì)含量比骨略高,占重量的65%,基本上是羥基磷灰石晶體形式。有機(jī)質(zhì)占20%,主要是膠原蛋白和非膠原蛋白(non-collagenousproteins,NCPs),其中膠原為羥基磷灰石(hydroxyapatite,HA)板狀晶體(plate likecrystalline)的沉積提供支架。
牙本質(zhì)中的膠原主要是I型膠原,其中10%~15%是I型膠原三聚體。I型膠原占膠原成分的97%。與其他結(jié)締組織不同,牙本質(zhì)之中缺乏III型膠原。牙本質(zhì)中還含有V型和VI膠原,但含量較少。牙本質(zhì)非膠原蛋白含量較少,但種類繁多。根據(jù)蛋白質(zhì)的來源不同,將牙本質(zhì)非膠原蛋白分為牙本質(zhì)特異性蛋白、礦化組織特異性蛋白、非特異性蛋白、血清來源蛋白(也稱牙本質(zhì)親和性蛋白)四大類。牙本質(zhì)特異性蛋白是指唯一由成牙本質(zhì)細(xì)胞合成和分泌,只在牙本質(zhì)中存在和發(fā)現(xiàn)的蛋白。礦化組織特異性蛋白是指既在牙本質(zhì)中又在牙骨質(zhì)和骨中存在和發(fā)現(xiàn),由這三種礦化組織中的細(xì)胞合成、分泌的蛋白。非特異性蛋白是指既在牙本質(zhì)中存在,又在其他組織包括軟組織中存在,既由成牙本質(zhì)細(xì)胞又由其他類型細(xì)胞合成、分泌的蛋白。血清來源蛋白是指由身體其他細(xì)胞(主要是肝細(xì)胞)合成并分泌進(jìn)入血清的蛋白,這些蛋白雖不由成牙本質(zhì)細(xì)胞合成,但對(duì)牙本質(zhì)有高度親和力,可由血液循環(huán)進(jìn)入牙本質(zhì)中,又稱為牙本質(zhì)親和性蛋白。蛋白多糖(proteoglycans,PGS)是牙本質(zhì)中另一類主要的非膠原蛋白質(zhì)。它是由許多的多糖側(cè)鏈與一個(gè)核心蛋白共價(jià)結(jié)合形成的大分子。其側(cè)鏈由重復(fù)的二糖鏈單位組成,每一個(gè)單位由一個(gè)糖醛酸和一個(gè)N-乙酰氨基乙糖組成。蛋白多糖在牙本質(zhì)發(fā)生中的功能之一就是可能影響甚至控制前期牙本質(zhì)中膠原骨架的組織化。固定在固態(tài)支架上的牙本質(zhì)蛋白多糖在體外生理PH和離子條件下以及在體內(nèi)均能誘導(dǎo)羥基磷灰石的形成。相反,液態(tài)的蛋白多糖卻在體外抑制礦物質(zhì)形成。蛋白多糖與鈣離子的結(jié)合是誘導(dǎo)羥基磷灰石形成的先決條件。
牙本質(zhì)生成不全(dentinogenesis imperfecta DGI)是一種常染色體顯性遺傳病,發(fā)病率為1/8000,臨床上將其分為3型(2)(注括號(hào)內(nèi)的數(shù)字表示文獻(xiàn)的編號(hào)),I型,牙本質(zhì)生成不全,又名DGI-I,患者除牙本質(zhì)生成不全外,常伴有成骨發(fā)育不全的癥狀,其病因?yàn)閺V泛的I型膠原基因突變(3);II型,DGI-II,又名遺傳性乳光牙本質(zhì)(hereditary opalescent dentin),外顯率近100%,其病因與牙本質(zhì)的礦化不良有關(guān)(4);III型,DGI-III,又名白蘭地型牙本質(zhì)生成不全(dentinogenesisimperfecta,Brandywine type)或稱為隔離群遺傳性乳光牙本質(zhì)(isolate hereditaryopalescent dentin),為孤立發(fā)生于美國(guó)馬里蘭州華盛頓DC的3個(gè)隔離民族群中特殊的遺傳性乳光牙本質(zhì),該病由Witkop 1956年最初報(bào)道(5),國(guó)內(nèi)未見報(bào)道。DGI-III有明顯的遺傳異質(zhì)性,其病因與礦化不良相關(guān)。由于DGI-I的致病基因已發(fā)現(xiàn),DGI-III只見于美國(guó)馬里蘭州的隔離居民群,因此DGI-II是牙體牙髓病學(xué)研究的重點(diǎn)。
DGI-II的臨床表現(xiàn)及病理改變。該病由于礦化失調(diào)、紊亂,導(dǎo)致牙本質(zhì)中胚層發(fā)育不良,患者乳、恒牙列皆可受累,但乳牙列病損更為嚴(yán)重。牙齒的顏色呈淺藍(lán)色至黃褐色改變,礦化不良的牙本質(zhì)較軟,牙冠易于磨損。此外,礦化不良的牙本質(zhì)基質(zhì)代償性生成增加,造成牙髓腔狹窄或閉塞。X線攝片可見牙冠呈球莖狀,頸部收縮,牙根細(xì)小,髓腔狹窄或閉塞,根管消失或呈線樣狹窄帶。病理顯示,釉質(zhì)外表正常,但約1/3患者可見到發(fā)育不良和鈣化不全。釉牙本質(zhì)界變異較大,有些牙齒的釉牙本質(zhì)界扇形結(jié)構(gòu)不明顯,而另一些卻特別顯著。牙本質(zhì)呈層板狀,外層牙本質(zhì)接近正常,有細(xì)分枝的牙本質(zhì)小管。其余部分的牙本質(zhì)明顯異常,一些短的、形態(tài)異常的小管紊亂地分布于牙本質(zhì)基質(zhì)之中。前期牙本質(zhì)帶非常寬,沿著層板見到被包埋的細(xì)胞殘余,類似于被包埋的造牙本質(zhì)細(xì)胞和血管。電鏡觀察表明,發(fā)育不良牙本質(zhì)微晶的形態(tài)和大小沒有變化,但數(shù)目少,間斷可見未鈣化或部分鈣化的膠原纖維橫束和大量結(jié)晶空隙。
牙本質(zhì)生成不全-II型的基因定位。早在1969年,Bixler等(7)企圖用一些蛋白多態(tài)標(biāo)記(如ABO、Rh、MNSs、Kell、Fy、JK、HP、ACP1、PGM1和PTC)對(duì)DGI-II家系進(jìn)行連鎖分析,但未能得到連鎖的證據(jù)。至1977年,Mikkelsen等(8)將維生素D結(jié)合蛋白一組特異性組分(GC)定位于4q11-q13。次年,Kühnl鑒定出GC有GC2/2、2/1+、2/1-、1+/1-、1+/1+和1-/1-6種表型。隨后Ball.S.P等(9)運(yùn)用GC的多態(tài)性標(biāo)記對(duì)其命名的Family MRC4000的DGI-II大家系進(jìn)行了連鎖分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)DGI-II與GC緊密連鎖(Lod值為+7.9,θ=0.13)。1992年,Crall等(10)將DGI-II定位于GC和干擾素誘導(dǎo)的細(xì)胞因子(Interferon-induciblecytokine INP-10)兩蛋白多肽標(biāo)記之間,染色體定位于4q12-21。上述初步結(jié)果只是將DGI-II的致病基因粗略定位,在當(dāng)時(shí)情況下,要想在此范圍內(nèi)克隆致病基因幾乎不可能。
1995年,Crosby A.H等(11)利用9個(gè)短串聯(lián)重復(fù)多態(tài)標(biāo)記(STRP)在收集的2個(gè)DGI-II大家系中進(jìn)行連鎖分析,結(jié)果致病基因被定位于4q21-23區(qū)域的D4S2691和D4S2692兩個(gè)STRP之間。多點(diǎn)連鎖分析提示致病基因可能在以SPP1為中心上下3.2cM的區(qū)域。最近,Aplin H.M等(12)應(yīng)用高密的5個(gè)STRP對(duì)Crosby A.H的2個(gè)大家系進(jìn)行了基因分型(genotyping),連鎖分析的結(jié)果表明,DGI-II致病基因位于GATA62A11和D4S1563兩STRP之間,其遺傳距離為2cM。此外,該研究小組構(gòu)建了該區(qū)域的YACs Contigs,且應(yīng)用PCR技術(shù)確定了DMP1、IBSP、SPP1和DSPP基因都位于該候選區(qū)域內(nèi)。
然而,迄今為止,尚沒有充分揭示牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型的確切原因,也沒有人揭示出牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型與某種蛋白存在直接的相關(guān)性。
此外,本領(lǐng)域還缺乏早期和/或產(chǎn)前診斷牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型疾病的有效方法以及非手術(shù)治療牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型的有效手段。
因此,本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的診斷和治療牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型的有效方法,以及相關(guān)的治療藥物,診斷技術(shù)和試劑。
本發(fā)明的一個(gè)目的就是提供一種新的診斷(尤其是產(chǎn)前和/或早期診斷)牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型(及伴耳聾)的方法及檢測(cè)試劑盒。
本發(fā)明的另一目的是提供一種新的治療牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型(及伴耳聾)的方法。
本發(fā)明的再一目的是提供一種治療牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型(及伴耳聾)的藥物組合物。
在本發(fā)明的第一方面,提供了一種對(duì)個(gè)體的牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型和/或牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型伴耳聾易感性進(jìn)行診斷的方法,它包括步驟檢測(cè)該個(gè)體的DSPP基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白,并與正常的DSPP基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白相比較,存在差異就表明該個(gè)體患牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型和/或牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型伴耳聾的可能性高于正常人群。
較佳地,被檢測(cè)的是DSPP的基因或轉(zhuǎn)錄本,并與正常DSPP核苷酸序列比較差異。更佳地,所述的差異選自下組外顯子3,第1位G1→T1;內(nèi)含子3,第1位的G1→A1。
在本發(fā)明的第二方面,提供了一種治療牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型和/或牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型伴耳聾的方法,它包括步驟給需要所述治療的病人施用安全有效量的正常DSPP和/或DSP蛋白。較佳地,DSPP和/或DSP蛋白被局部施用于牙周組織。
在本發(fā)明的第三方面,提供了一種藥物組合物,它含有安全有效量的DSPP和/或DSP蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體。較佳地,它是針劑。
在本發(fā)明的第四方面,提供了一種檢測(cè)牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型和/或牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型伴耳聾的試劑盒,它包括特異性擴(kuò)增DSPP基因或轉(zhuǎn)錄本的引物。較佳地,它還含有與突變部位結(jié)合的探針。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開,對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
在附圖中,
圖1A是DSPP基因組成的模式圖。該基因有5個(gè)外顯子、4個(gè)內(nèi)含子,總長(zhǎng)為8201bp。其中E1(7-98)、E2(2359-2437)、E3(3577-3660)、E4(3794-4780)和E5(5257-8201)編碼DSPP。而E1、E2、E3、E4以及E5的(5257-5520)部分共同編碼DSP,E5的(5521-7893)部分編碼DPP。
圖2顯示了牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型家系4q21區(qū)域STRP標(biāo)記的單體型。
圖3顯示了牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型并伴耳聾家系4q21區(qū)域STRP標(biāo)記的單體型。
圖4A和4B顯示了DSPP基因中的序列變化。圖4A顯示了在外顯子3中,第1位G1→T1,該位點(diǎn)的變化導(dǎo)致密碼子由GTT變?yōu)門TT(相應(yīng)氨基酸由Val→Phe);圖4B顯示了在內(nèi)含子3中,第1位的G1→A1,該位點(diǎn)的變化導(dǎo)致了剪切位點(diǎn)改變。
本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過多年研究,首次發(fā)現(xiàn)和證明了牙本質(zhì)唾磷蛋白(DSPP)和/或牙本質(zhì)唾蛋白(DSP)與牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型密切相關(guān),而且發(fā)現(xiàn)了它的新功能,牙本質(zhì)唾磷蛋白或牙本質(zhì)唾蛋白(DSP)的改變將直接導(dǎo)致牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
首先,本發(fā)明人利用收集的國(guó)內(nèi)牙本質(zhì)生成不全及牙本質(zhì)生成不全伴耳聾的遺傳性家系,通過微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行基因分型,運(yùn)用連鎖分析的方法將牙本質(zhì)生成不全的致病基因定位于第4號(hào)染色體的4q21-22區(qū)域。
然后,本發(fā)明人通過如下步驟確定了牙本質(zhì)生成不全的候選基因(1)找出定位于染色體4q21-22區(qū)域所有基因即繪制4q21-22區(qū)域的轉(zhuǎn)錄圖譜。
(2)了解染色體4q21-22區(qū)域所有基因在牙髓中的表達(dá)情況。
(3)位于染色體4q21-22區(qū)域所有基因且在牙髓中表達(dá)基因?yàn)檠辣举|(zhì)生成不全的候選基因。
結(jié)果表明,候選基因包括牙本質(zhì)基因蛋白(DMP1),胃唾蛋白(IBSP),唾磷蛋白(SPP1),牙本質(zhì)唾蛋白(DSP)和牙本質(zhì)磷蛋白(DPP)和牙本質(zhì)唾磷蛋白(DSPP)。
接著,本發(fā)明人對(duì)所有的候選基因進(jìn)行突變篩選,即確定的候選基因利用SSCP技術(shù)進(jìn)行突變篩選,最終發(fā)現(xiàn)DSPP的突變與牙本質(zhì)生成不全有直接因果關(guān)系,而其他基因不相關(guān)。
最后,通過序列分析確定了兩個(gè)遺傳家系中DSPP基因突變的方式和位置。其中,在一個(gè)牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型家系中,相關(guān)的突變情況為外顯子3的第1位G1→T1(SEQ ID NO1中第3577位),這一改變不僅導(dǎo)致氨基酸發(fā)生改變,還可能導(dǎo)致剪切位點(diǎn)的變化,從而可能造成內(nèi)含子被表達(dá)、翻譯提前中止、或譯碼等變化(圖4A),從而無法表達(dá)正常的DSPP(或DSP)蛋白。
在另一牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型并伴耳聾家系中,相關(guān)突變情況為內(nèi)含子3中的第1位的G1→A1(SEQ ID NO1中的第3661位)。這一改變預(yù)計(jì)導(dǎo)致剪切位點(diǎn)的變化,從而可能造成內(nèi)含子被表達(dá)、翻譯提前中止、或譯碼等變化(圖4B),從而無法表達(dá)正常的DSPP(或DSP)蛋白,還可能影響信號(hào)肽的翻譯而導(dǎo)致DSPP無法正確定位。令人意外的是,這一位點(diǎn)的變化,不僅造成了牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型,還導(dǎo)致了攜帶者患耳聾。這暗示DSPP的變化還與耳聾相關(guān)。通過檢測(cè)DSPP的正常與否,可以診斷耳聾(尤其是牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型伴耳聾)。
在本發(fā)明的基礎(chǔ)上,人們可以針對(duì)DSPP基因及其產(chǎn)物(轉(zhuǎn)錄本、蛋白等)以及相互作用的分子而進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)開發(fā)。此外,還可利用DSPP基因進(jìn)行體外牙齒再造,部分牙齒結(jié)構(gòu)重塑(如牙本質(zhì))。
人類的牙本質(zhì)唾磷蛋白(DSPP)的突變導(dǎo)致人類的牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型,可根據(jù)DSPP基因及其表達(dá)產(chǎn)物設(shè)計(jì)的藥物和診斷治療技術(shù),可用于診斷和治療人類的牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型。
人DSPP基因和蛋白關(guān)于人DSPP基因和蛋白的詳細(xì)序列,可參見基因庫(kù)中的登錄號(hào)AF163151,以及Gu,K.,Chang,S.,Ritchie,H.H.,Clarkson,B.H.and Rutherford,R.B.,Eur.J.OralSci.2000 Feb108(1)35-42等文獻(xiàn)。在序列表的SEQ ID NO1和SEQ ID NO2中分別列出了人DSPP的核苷酸序列和氨基酸序列。在圖1中顯示了人DSPP中各內(nèi)含子和外顯子。
外顯子1 7..98mRNA 合并的(7..98,2359..2437,3577..3660,3794..4780,5257..8201)外顯子2 2359..2437CDS 合并的(2387..2437,3577..3660,3794..4780,5257..7896)信號(hào)肽2387..2431成熟肽合并的(2432..2437,3577..3660,3794..4780,5257..7893)/產(chǎn)物="牙本質(zhì)唾磷蛋白"
成熟肽 合并的(2432..2437,3577..3660,3794..4780,5257..5520)/產(chǎn)物="牙本質(zhì)唾蛋白"外顯子33577..3660外顯子43794..4780外顯子55257..8201成熟肽 5521..7893其他調(diào)整 5596..5604/注="區(qū)域細(xì)胞結(jié)合域"polyA信號(hào) 7988..7993polyA信號(hào) 8171..8176DSPP和/或DSP蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療DSPP和/或DSP蛋白功能低下或喪失所致的疾病,和用于篩選促進(jìn)DSPP和/或DSP蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組人DSPP和/或DSP蛋白篩選多肽庫(kù)可用于尋找有治療價(jià)值的能刺激人DSPP和/或DSP蛋白功能的多肽分子。
另一方面,本發(fā)明還包括對(duì)人DSPP DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體,尤其是單克隆抗體。這里,“特異性”是指抗體能結(jié)合于人DSPP基因產(chǎn)物或片段。較佳地,指那些能與人DSPP基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人DSPP蛋白的分子,也包括那些并不影響人DSPP蛋白功能的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體,而且還包括具有免疫活性的抗體片段,如Fab′或(Fab)2片段;抗體重鏈;抗體輕鏈;遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人,美國(guó)專利No.4,946,778);或嵌合抗體,如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如,純化的人DSPP基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段,可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的,表達(dá)人DSPP蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人,Nature 256;495,1975;Kohler等人,Eur.J.Immunol.6511,1976;Kohler等人,Eur.J.Immunol.6292,1976;Hammerling等人,In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人DSPP蛋白功能的抗體以及不影響人DSPP蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人DSPP基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū),通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人DSPP基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生;與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽),可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。
抗人DSPP和/或DSP蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中,檢測(cè)活檢標(biāo)本中的人DSPP和/或DSP蛋白。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用人DSPP和/或DSP蛋白或多肽免疫動(dòng)物,如家兔,小鼠,大鼠等。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng),包括但不限于弗氏佐劑等。
利用本發(fā)明蛋白,通過各種常規(guī)篩選方法,可篩選出與DSPP和/或DSP蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì),如抑制劑、激動(dòng)劑或拮抗劑等。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、激動(dòng)劑、拮抗劑等,當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí),可提供不同的效果。通常,可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中,其中pH通常約為5-8,較佳地pH約為6-8,盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥,其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、或局部給藥。較佳地是在牙周組織局部給藥。
正常的DSPP和/或DSP多肽可直接用于疾病治療,例如,用于牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型方面的治療。在使用本發(fā)明DSPP和/或DSP蛋白時(shí),還可同時(shí)使用其他治療牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型的藥劑。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物,它含有安全有效量的本發(fā)明DSPP和/或DSP蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式,例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如針劑、片劑和膠囊之類的藥物組合物,可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量,例如每天約0.1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外,本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時(shí),是將安全有效量的DSPP和/或DSP蛋白或其拮抗劑、激動(dòng)劑施用于哺乳動(dòng)物,其中該安全有效量通常至少約0.1微克/千克體重,而且在大多數(shù)情況下不超過約10毫克/千克體重,較佳地該劑量是約0.1微克/千克體重-約100微克/千克體重。當(dāng)然,具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素,這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
人DSPP和/或DSP蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的?;蛑委熂夹g(shù)可用于治療由于DSPP和/或DSP蛋白的無表達(dá)或異常/無活性的DSPP和/或DSF蛋白的表達(dá)所致的細(xì)胞增殖、發(fā)育或代謝異常。構(gòu)建攜帶DSPP和/或DSP基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(xiàn)(Sambrook,et al.)。另外重組人DSPP和/或DSP基因可包裝到脂質(zhì)體中,然后再轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。
多聚核苷酸導(dǎo)入組織或細(xì)胞內(nèi)的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中;或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多聚核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中,再將細(xì)胞移植到體內(nèi)等。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測(cè)人DSPP和/或DSP蛋白水平的診斷試驗(yàn)方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的,且包括FISH測(cè)定和放射免疫測(cè)定。試驗(yàn)中所檢測(cè)的人DSPP和/或DSP蛋白水平,可以用作解釋人DSPP和/或DSP蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷DSPP和/或DSP蛋白起作用的疾病。
一種檢測(cè)樣品中是否存在DSPP和/或DSP蛋白的方法是利用DSPP和/或DSP蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè),它包括將樣品與DSPP和/或DSP蛋白特異性抗體接觸;觀察是否形成抗體復(fù)合物,形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在DSPP和/或DSP蛋白。
DSPP和/或DSP蛋白的多聚核苷酸可用于DSPP和/或DSP蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。在診斷方面,DSPP和/或DSP蛋白的多聚核苷酸可用于檢測(cè)DSPP和/或DSP蛋白的表達(dá)與否或在疾病狀態(tài)下DSPP和/或DSP蛋白的異常表達(dá)。如DSPPDNA序列可用于對(duì)活檢標(biāo)本的雜交以判斷DSPP和/或DSP蛋白的表達(dá)異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法,Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù),相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”上,用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。用DSPP和/或DSP蛋白特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測(cè)DSPP和/或DSP蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
檢測(cè)DSPP和/或DSPP蛋白基因的突變也可用于診斷DSPP和/或DSP蛋白相關(guān)的疾病。DSPP和/或DSP蛋白突變的形式包括與正常野生型DSPP DNA序列相比的點(diǎn)突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等??捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測(cè)突變。另外,突變有可能影響蛋白的表達(dá),因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
下面結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人,分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1DGI-II家系42人,DGI-II伴耳聾家系共14人。所有家系成員都由經(jīng)驗(yàn)豐富的口腔科醫(yī)師認(rèn)真檢查確診,并作詳細(xì)記錄。耳聾患者由五官科醫(yī)師認(rèn)真檢查,并得到電測(cè)聽和腦干誘發(fā)電位的資料進(jìn)一步證實(shí)。抽取家系成員5ml外周血,ACD血球保存液抗凝處理,DNA提取按如下方法進(jìn)行血樣DNA的制備血樣DNA抽提使用Qiagen試劑盒,方法按廠家的方案進(jìn)行,具體步驟如下a.于1.5ml的離心管中加入蛋白酶K(20μl)、抗凝血標(biāo)本(200μl)及緩沖液AL(200μl)。振蕩15秒混勻。
b.于56℃消化10分鐘后,加100%乙醇210μl,低速離心10秒。
c.將以上混合物移到QIAamp離心柱中,8000rmp離心1分鐘。
d.棄去濾過液并將QIAamp離心柱轉(zhuǎn)到新的2ml收集管中。
e.加500μl緩沖液AW1到QIAamp離心柱內(nèi),8000rmp離心1分鐘。
f.棄去濾過液并在QIAamp離心柱中加入500μl的AW2,14000rpm離心3分鐘。
g.棄去濾過液并將QIAamp離心柱轉(zhuǎn)移到新的1.5ml的離心管。
h.加200μl緩沖液AE到QIAamp離心柱內(nèi),室溫靜置5分鐘,8000rpm離心1分鐘,離心管內(nèi)收集的液體即為血液中抽取的DNA溶液。
i.1%瓊脂糖電泳檢查抽取的DNA質(zhì)量,然后用紫外分光光度計(jì)將DNA定量,-20℃保存?zhèn)溆谩?br>
實(shí)施例21、基因分型4q21區(qū)的高度多態(tài)的STR標(biāo)記(標(biāo)記A-G分別為D4s2691,D4s1534,GATA62A11,DSP,DMP1,SPP1,D4s451)的引物序列從GenomeDatabase中獲得。PCR擴(kuò)增在MJ-Research Inc.PTC-225型PCR儀中進(jìn)行。擴(kuò)增程序采用LI-COR公司的操作說明書中touchdown Program各項(xiàng)參數(shù)。PCR反應(yīng)體系為10μl,含20ng基因組DNA模板,2.0mM dNTP,1.0pM帶有M13尾巴正鏈引物和1.0pM反鏈引物,1.0pM熒光標(biāo)記的M13引物,1.5mM MgCl2,10mMTris-HCl,1U的Gold Taq酶(Perkin-Elmer Corp.)。反應(yīng)體系開始于95℃變性8分鐘,隨后95℃變性45秒,68℃退火2分鐘,每循環(huán)下降2℃,72℃延伸1分鐘,4循環(huán)后,95℃變性45秒,58℃退火1分鐘,72℃延伸1分鐘,2~4個(gè)循環(huán)后,退火溫度降至50~54℃,95℃變性30秒,50~54℃退火30秒,72℃延伸30秒,共20~30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸15分鐘。PCR產(chǎn)物和熒光標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)DNA marker在LICOR測(cè)序儀上進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,收集的資料由Base Image 4.1和Gene Image 3.12軟件分析,同時(shí)制作連鎖分析家系文件。該連鎖分析家系文件直接用于下一步的連鎖分析和單體型分析。
2、連鎖分析和單體型分析DGI-II遺傳方式定位常染色體顯性遺傳。等位基因外顯率為100%,疾病基因頻率設(shè)為0.0001,各個(gè)STR的等位基因頻率取平均值。運(yùn)用LINKAGE5.10版的MLINK和ILINK程序進(jìn)行2點(diǎn)連鎖分析,單體型構(gòu)建由SIMWALK2 Version 2.31和CYRILLIC2.02軟件分析。
數(shù)據(jù)如表1和2,以及圖2和3所示。
表1 DGI-II家系致病基因位點(diǎn)和4q21區(qū)STRP位點(diǎn)的兩點(diǎn)連鎖分析
表2 DGI-II伴耳聾家系致病基因位點(diǎn)和4q21區(qū)STRP位點(diǎn)的兩點(diǎn)連鎖分析
結(jié)果表明,收集的DGI-II家系以及DGI-II伴耳聾家系的致病基因與4q21的STRP標(biāo)記連鎖。
實(shí)施例3候選基因的突變篩選運(yùn)用Primer 5.0(http//www/PrimerBiosoft.com)軟件設(shè)計(jì)覆蓋DSP基因外顯子及外顯子和內(nèi)含子交界區(qū)的引物(具體序列如表3所示),利用PCR-SSCP技術(shù)對(duì)DSP基因進(jìn)行突變篩選,PCR產(chǎn)物在10%非變性的聚丙烯酰胺凝膠和含4%甘油的9.3%非變性聚丙烯酰胺凝膠兩種條件下電泳,然后按常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)方法銀染。
引物如下表3 DSPP編碼區(qū)的引物序列
PCR產(chǎn)物測(cè)序了解突變的類型及位置1、常規(guī)PCR擴(kuò)增經(jīng)SSCP篩選出電泳帶譜有特征性改變的基因序列。
2、Millipore柱純化PCR產(chǎn)物。
3、測(cè)序反應(yīng)(1)反應(yīng)體系反應(yīng)化合物 2ul引物(0.8uM) 2ul純化PCR產(chǎn)物 3ul(2)反應(yīng)條件96℃30秒96℃30秒50℃5秒60℃4分鐘60℃4分鐘35個(gè)循環(huán)(3)測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物的沉淀A.在測(cè)序反映產(chǎn)物中加入9倍體積的70%乙醇,4℃ 3minB.4℃,4000rpm離心30minC.4℃倒置離心,當(dāng)速度達(dá)到1300rpm時(shí)立即停止。
(5)上樣測(cè)序A.在沉淀的測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物中加入2ul上樣染料。
B.90℃變性2min,立即冰浴。
C.ABI PRISM 377測(cè)序儀上加樣,測(cè)序。
結(jié)果如圖4A和4B所示。其中,在牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型家系中,相關(guān)的突變情況為外顯子3的第1位G1→T1(SEQ ID NO1中第3577位),這一改變不僅導(dǎo)致氨基酸發(fā)生改變,還可能導(dǎo)致剪切位點(diǎn)的變化,從而可能造成內(nèi)含子被表達(dá)、翻譯提前中止、或譯碼等變化(圖4A),從而無法表達(dá)正常的DSPP(或DSP)蛋白。
在另一牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型并伴耳聾家系中,相關(guān)突變情況為內(nèi)含子3中的第1位的G1→A1(SEQ ID NO1中的第3661位)。這一改變預(yù)計(jì)導(dǎo)致剪切位點(diǎn)的變化,從而可能造成內(nèi)含子被表達(dá)、翻譯提前中止、或譯碼等變化(圖4B),從而無法表達(dá)正常的DSPP(或DSP)蛋白,還可能影響信號(hào)肽的翻譯而導(dǎo)致DSPP無法正確定位。令人意外的是,這一位點(diǎn)的變化,不僅造成了牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型,還導(dǎo)致了攜帶者患耳聾。這暗示DSPP的變化還與耳聾相關(guān)。通過檢測(cè)DSPP的正常與否,可以診斷耳聾(尤其是牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型伴耳聾)。
討論1、連鎖分析與單體型我們選用了4q21區(qū)域7個(gè)STR標(biāo)記對(duì)收集的DGI-II家系和DGI-II伴耳聾家系進(jìn)行了基因分型,連鎖分析和構(gòu)建的單體型表明DGI-II家系的致病基因與4q21連鎖,并在SPP1位點(diǎn)產(chǎn)生最大的Lod值為8.38(θ=0.00)(表1,圖2);DGI-II伴耳聾家系亦于4q21區(qū)域的STR位點(diǎn)連鎖,且產(chǎn)生最大的Lod值為2.71(θ=0.00)(表2,圖3)2、候選基因的突變篩選及測(cè)序驗(yàn)證設(shè)計(jì)了22個(gè)覆蓋DSPP基因的引物,對(duì)DSPP基因進(jìn)行突變篩選并測(cè)序驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)DGI-II家系的致病基因與4q21區(qū)域的STR連鎖,而DGI-II伴耳聾家系的致病基因亦與4q21區(qū)域的STR連鎖,而100個(gè)正常人無此變化。說明此變化與DGI-II有因果關(guān)系。
DPP和DSP是由DSPP編碼的單一轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)產(chǎn)物,分裂為兩個(gè)較小的具有特異性物理化學(xué)性質(zhì)的多肽。DSP、DPP都在牙髓組織中特異性表達(dá),另外,亦有可能在耳蝸組織中表達(dá)。DSP富含谷氨酸、絲氨酸和甘氨酸有眾多的磷酸化位點(diǎn),推測(cè)與牙齒的礦化有關(guān)。DPP在礦化的作用是雙響的。低濃度的DPP可結(jié)合于I型膠原纖維的間隙,啟動(dòng)板狀磷石晶體的沉積;高濃度的DPP可結(jié)合于生長(zhǎng)之中的晶體,影響其大小和形狀,減緩晶體生長(zhǎng)。DSPP基因的突變篩選牙本質(zhì)生成不全和耳聾的機(jī)理有待于進(jìn)一步的研究。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考,就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解,在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改,這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
文獻(xiàn)1.凌均 牙髓病學(xué) 北京,人民衛(wèi)生出版社。19982.Witkop CJ et al.Hereditary defects in enamel and dentin.Acta Genet1957;7236~2393.Cetta G et al.Third international conference on osteogenesis imperfecta.Ann NYAvad Sci.19984.Takagi Y et al.Matrix protein difference between human nomal anddentinogenesis imperfecta dentin.In the vhemistry and biology of mineralizedconnective tissues.VeisA,editor.New YorkElsevier/North-Holand.19815.Witkop CJ,et al.Medical and dental findings in the Brandywine isolate.AL JMed Sci 1966;3382~4036.陸可望 遺傳性口腔疾病 北京,科學(xué)出版社.19987.Bixler D,et al.Dentinogenesis imperfectagenetic variation in a six-generationfamily.J.Dent.Res.1968;481196~11998.Mikkelsen,M et al.Possible localization of Gc-system on chromosome 4.Lossof long arm 4 material associated with father-child incompatibility within the Gc-system.Hum.Hered.1988;27105~1079.Ball.SP,et al.Linkage between dentinogenesis imperfecta and Gc.Ann.Hum.Genet.1982;4635~4010.Crall MG.Genetic marker study of dentinogenesis imperfecta.Proc Finn DentSoc.1992;88285~29311.Crodby AH,et al.Genetic mapping of dentinogenesis imperfecta type II Locus.Am.J.Hm.Genet.1995;57832~83912.Aplin H.M,et al.Refinement of the dentinogenesis imperfecta type II locus toan interval of less than 2 centimorgans at chromosome 4q21 and the creation of a yeastartificial chromosome contig of the critical region.J.Dent.Res.1999;78(6)1270~1276
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人中國(guó)科學(xué)院上海生物工程研究中心(ii)發(fā)明名稱利用牙本質(zhì)唾磷蛋白基因及其編碼產(chǎn)物診斷和治療牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型的方法(iii)序列數(shù)目2(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度8201bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(iii)序列描述SEQ ID NO.1attgtcatgc aaaagtccag gacagtgggc cactttcagt cttcaaagag aaagataaga 60aattctggat tttcaaaatc cttttgaagc cttttaaggt aagatgaaat atccttttta 120ctcagaacca actgattcat ttagaaagaa ctttgaattt caaagatgaa gccagtttga 180ttttaagaag cgagtacccc ttaatgatta gattgtatgc ttcctttttg acttgtcata 240ttgatagtat gtataaaaga taacggacga ttacgaccta aggaagagat agattgggaa 300gaagaaagac ctcgtactga aaaattggcc aactgaggtg gaaatttgac aattaactat 360ctgggcactt tgattagttt tgataaaaaa tgagataact cagatttcaa aaatccacct 420tgggctttca aacaaggctt caattaggct ttgcttttta gtattttatt acttactatt 480acttattatt tattgtccca catgaaatga aatttagcaa tcactaatga tgccaaatct 540aattgctaaa tgaaatgaag ctaaatctca tttcattagt aacaataaat gaaataatct 600gatggagctt cacaaattct gaagtctttg tttcatgctg aggtcacctg ggccattttt 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SMNLHLLARS NVSVQDELNA SGTIKESGVL 60VHEGDRGRQE NTQDGHKGEG NGSKWAEVGG KSFSTYSTLA NEEGNIEGWN GDTGKAETYG 120HDGIHGKEEN ITANGIQGQV SIIDNAGATN RSNTNGNTDK NTQNGDVGDA GHNEDVAVVQ 180EDGPQVAGSN NSTDNEDEII ENSCRNEGNT SEITPQINSK RNGTKEAEVT PGTGEDAGLD 240NSDGSPSGNG ADEDEDEGSG DDEDEEAGNG KDSSNNSKGQ EGQDHGKEDD HDSSIGQNSD 300SKEYYDPEGK EDPHNEVDGD KTSKSEENSA GIPEDNGSQR IEDTQKLNHR ESKRVENRIT 360KESETHAVGK SQDKGIEIKG PSSGNRNITK EVGKGNEGKE DKGQHGMILG KGNVKTQGEV 420VNIEGPGQKS EPGNKVGHSN TGSDSNSDGY DSYDFDDKSM QGDDPNSSDE SNGNDDANSE 480SDNNSSSRGD ASYNSDESKD NGNGSDSKGA EDDDSDSTSD TNNSDSNGNG NNGNDDNDKS 540DSGKGKSDSS DSDSSDSSNS SDSSDSSDSD SSDSNSSSDS DSSDSDSSDS SDSDSSDSSN 600SSDSSDSSDS SDSSDSSDSS DSKSDSSKSE SDSSDSDSKS DSSDSNSSDS SDNSDSSDSS 660NSSNSSDSSD SSDSSDSSSS SDSSSSSDSS NSSDSSDSSD SSNSSESSDS SDSSDSDSSD 720SSDSSNSNSS DSDSSNSSDS SDSSDSSDSS NSSDSSDSSD SSNSSDSSDS SDSSDSSDSS 780NSSDSNDSSN SSDSSDSSNS SDSSNSSDSS DSSDSSDSDS SNSSDSSNSS DSSDSSNSSD 840SSDSSDSSDS SDSDSSNRSD SSNSSDSSDS SDSSNSSDSS DSSDSSDSNE SSNSSDSSDS 900SNSSDSDSSD SSNSSDSSDS SNSSDSSESS NSSDNSNSSD SSNSSDSSDS SDSSNSSDSS 960NSGDSSNSSD SSDSNSSDSS DSSNSSDSSD SSDSSDSSDS SDSSNSSDSS DSSDSSDSSN 1020SSDSSNSSDS SDSSDSSDSS DSSDSSNSSD SSDSSDSSDS SDSSGSSDSS DSSDSSDSSD 1080SSDSSDSSDS SDSSESSDSS DSSDSSDSSD SSDSSDSSDS SDSSDSSDSS NSSDSSDSSD 1140SSDSSDSSDS SDSSDSSDSS DSSDSSDSSD SSDSSDSSDS SDSNESSDSS DSSDSSDSSN 1200SSDSSDSSDS SDSTSDSNDE SDSQSKSGNG NNNGSDSDSD SEGSDSNHST SDD 125權(quán)利要求
1.一種對(duì)個(gè)體的牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型和/或牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型伴耳聾易感性進(jìn)行診斷的方法,其特征在于,它包括步驟檢測(cè)該個(gè)體的DSPP基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白,并與正常的DSPP基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白相比較,存在差異就表明該個(gè)體患牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型和/或牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型伴耳聾的可能性高于正常人群。
2.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,檢測(cè)的是DSPP的基因或轉(zhuǎn)錄本,并與正常DSPP核苷酸序列比較差異。
3.如權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于,所述的差異選自下組外顯子3,第1位G1→T1內(nèi)含子3,第1位的G1→A1。
4.一種治療牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型和/或牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型伴耳聾的方法,其特征在于,包括步驟給需要所述治療的病人施用安全有效量的正常DSPP和/或DSP蛋白。
5.如權(quán)利要求4所述的方法,其特征在于,所述的DSPP和/或DSP蛋白被局部施用于牙周組織。
6.一種藥物組合物,其特征在于,它含有安全有效量的DSPP和/或DSP蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體。
7.如權(quán)利要求6所述的組合物,其特征在于,它是針劑。
8.一種檢測(cè)牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型和/或牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型伴耳聾的試劑盒,其特征在于,它包括特異性擴(kuò)增DSPP基因或轉(zhuǎn)錄本的引物。
9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒,其特征在于,它還含有與突變部位結(jié)合的探針。
10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒,其特征在于,所述的突變選自下組外顯子3,第1位G1→T1內(nèi)含子3,第1位的G1→A1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種診斷牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型和/或牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型伴耳聾的方法,它包括檢測(cè)個(gè)體的DSPP基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白與正常相比是否存在變異,存在變異就表明該個(gè)體患牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型和/或牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型伴耳聾的可能性大于正常人群。本發(fā)明還公開了治療牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型和/或牙本質(zhì)生成不全I(xiàn)I型伴耳聾的方法和藥物組合物。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1341753SQ0012504
公開日2002年3月27日 申請(qǐng)日期2000年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月5日
發(fā)明者孔祥銀, 肖尚喜, 趙國(guó)屏, 于川, 胡蘭靛 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生物工程研究中心