專(zhuān)利名稱(chēng)：Il6/il2融合蛋白誘導(dǎo)慢性粒細(xì)胞白血病分化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用IL6/IL2融合蛋白對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病(CML)腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)和分化作用，以達(dá)到治療慢性粒細(xì)胞白血病的方法。涉及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LhIL6/IL2的構(gòu)建，IL6/IL2融合蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞系增殖，分化調(diào)控作用的研究。
目前，在治療慢性粒細(xì)胞白血病中，異基因骨髓移植是最有效的方法，其移植后無(wú)病存活率可達(dá)70％，復(fù)發(fā)率較低。但由于存在HLA配型困難，及移植物抗宿主病(GVHD)，老年慢粒患者的GVHD尤為嚴(yán)重，且在進(jìn)行骨髓移植化療預(yù)處理中耐藥現(xiàn)象產(chǎn)生，故尋求一種有效治療慢性粒細(xì)胞白血病的途徑十分重要。本發(fā)明在構(gòu)建的人重組IL6/IL2融合蛋白基礎(chǔ)上，以IL6/IL2融合基因轉(zhuǎn)染慢性粒細(xì)胞白血病以達(dá)到對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖抑制及誘導(dǎo)分化作用，以達(dá)到治療慢性粒細(xì)胞白血病。
本發(fā)明的目的是在國(guó)際上首次提出利用IL6/IL2融合蛋白誘導(dǎo)分化CML腫瘤細(xì)胞的方法，以達(dá)到對(duì)CML的治療的目的。
本發(fā)明的目的是通過(guò)下述方法實(shí)現(xiàn)的一.IL6/IL2融合蛋白載體的構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LhIL6/IL2包含IL6/IL2融合基因和一個(gè)新霉新霉素抗性基因，經(jīng)內(nèi)切酶EcoRI和BamHI消化pfIL6/2質(zhì)粒進(jìn)行回收獲得IL6/IL2。后將IL6信號(hào)肽結(jié)合在IL6/IL2基因上游獲得SP-IL6/IL2全序，如

圖1所示(其中1LhIL6/IL2 2LN6；3LTR；4EcoR I；5BamHI；6SP-IL6-Linker-IL2；7SV40；8Neo)二.LhIL6/IL2轉(zhuǎn)染建立PA317細(xì)胞系將LhIL6/IL2轉(zhuǎn)染GP+E86細(xì)胞通過(guò)穿梭方式到PA317細(xì)胞中。被轉(zhuǎn)染的PA317細(xì)胞在含有20％FCS和1.2mg/mlG418的RPMI中培養(yǎng)，兩周后收獲單個(gè)集落。篩選出的細(xì)胞集落進(jìn)行培養(yǎng)、擴(kuò)增，以NIH3T3細(xì)胞檢測(cè)PA317-L16/IL2病毒滴度。
三.檢測(cè)IL6/IL2融合基因?qū)β粤＜?xì)胞白血病(CML)腫瘤細(xì)胞增殖抑制的作用情況以包含LhIL6/IL2培養(yǎng)上清液轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，在IMDM中(含10％FCS和1.2mg/mlG培養(yǎng)2周、后篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性細(xì)胞集落。
細(xì)胞生長(zhǎng)分析培養(yǎng)IL6/IL2融合基因、LN6基因轉(zhuǎn)染慢性粒細(xì)胞白血病(CML)腫瘤細(xì)胞，計(jì)數(shù)經(jīng)1～5天內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)。轉(zhuǎn)染LhIL6/IL2載體后的腫瘤細(xì)胞SCL和GATA-1基因表達(dá)明顯降低，而與IL6加IL2培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速度輕微降低。
細(xì)胞周期分析以10％乙醇固定細(xì)胞，以PI染色，對(duì)照分析IL6/IL2融合基因、LN6基因轉(zhuǎn)染慢性粒細(xì)胞白血病(CML)腫瘤細(xì)胞的G0/G1、S及G2/M期，以FACS儀分析。細(xì)胞表面抗原FACS檢測(cè)結(jié)果顯示，LhIL6/IL2轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞CD15水平較LN6轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞明顯增高，CD14，CD33，CD34，CD41，CD71和glycophorin A表達(dá)未見(jiàn)明顯改變。
細(xì)胞凋亡分析培養(yǎng)IL6/IL2融合基因、LN6基因轉(zhuǎn)染慢性粒細(xì)胞白血病(CML)腫瘤細(xì)胞，檢測(cè)經(jīng)1～5天內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞中凋亡細(xì)胞。轉(zhuǎn)染LhIL6/IL2載體后的腫瘤細(xì)胞部分阻斷在G0/G1期，如圖2所示(其中1INIL6；2IL6/IL2；3G0/G1；4S；5G2/M；)。經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)后，LhIL6/IL2轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)明顯較LN6轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞低，如圖3所示[其中1:K562-LNL6；2:K562-IL6/IL2；3:細(xì)胞數(shù)(×106)]四.檢測(cè)IL6/IL2融合基因?qū)β粤＜?xì)胞白血病腫瘤細(xì)胞向髓/單核系分化誘導(dǎo)的作用情況用聯(lián)苯胺檢測(cè)IL6/IL2融合基因、LN6基因轉(zhuǎn)染慢性粒細(xì)胞白血病腫瘤細(xì)胞血紅蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，以計(jì)數(shù)細(xì)胞中與聯(lián)苯胺反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行。聯(lián)苯胺染色結(jié)果顯示，LhIL6/IL2轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞聯(lián)苯胺染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與LN6轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞聯(lián)苯胺染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)相似。RT-PCR檢測(cè)γ_珠蛋白基因表達(dá)結(jié)果表明，LhIL6/IL2轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞和LN6轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞其表達(dá)水平均較低。
γ_珠蛋白基因表達(dá)分析以RT-PCR檢測(cè)IL6/IL2融合基因、LN6基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞中γ_珠蛋白mRNA，以β-actinmRNA作檢測(cè)內(nèi)參照，進(jìn)行半定量分析。SCL和GATA-1mRNART-PCR檢測(cè)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染LhIL6/IL2載體后的腫瘤細(xì)胞上述基因表達(dá)明顯降低。
GATA-1、SCLmRNA表達(dá)RT-PCR檢測(cè)以β-actinmRNA作檢測(cè)內(nèi)參照。分別檢測(cè)IL6/IL2轉(zhuǎn)染融合基因、LN6轉(zhuǎn)染基因和加入IL6+IL2進(jìn)行腫瘤培養(yǎng)后上述基因表達(dá)，進(jìn)行半定量分析。SCL和GATA-1mRNART-PCR檢測(cè)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染LhIL6/IL2載體后的腫瘤細(xì)胞上述基因表達(dá)明顯降低。
c-myc基因表達(dá)蛋白產(chǎn)物分析以WesternBlot方法進(jìn)行，同時(shí)檢測(cè)IL6/IL2融合基因、LN6基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞。以Western-blot檢測(cè)C-myc蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，LhIL6/IL2轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞C-myc蛋白表達(dá)水平降低，相關(guān)細(xì)胞表面分化抗原分析包括CD15，CD14，CD33，CD41，CD45 and CD71同時(shí)檢測(cè)IL6/IL2融合基因、LN6基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，以FACS儀分析，細(xì)胞表面抗原FACS檢測(cè)結(jié)果顯示，LhIL6/IL2轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞CD15水平較LN6轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞明顯增高，CD14，CD33，CD34，CD41，CD71和glycophorin A表達(dá)未見(jiàn)明顯改變。五.IL6/IL2融合蛋白對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞系的誘導(dǎo)和分化作用及其應(yīng)用的例作細(xì)胞生長(zhǎng)分析培養(yǎng)IL6/IL2融合基因、LN6基因轉(zhuǎn)染慢性粒細(xì)胞白血病(CML)腫瘤細(xì)胞，計(jì)數(shù)經(jīng)1～5天內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)。轉(zhuǎn)染LhIL6/IL2載體后的K562細(xì)胞SCL和GATA-1基因表達(dá)明顯降低，而與IL6(10ng-200ng)加IL2(25-50U)培養(yǎng)的K562細(xì)胞生長(zhǎng)速度輕微降低。所使用PCR引物如表1所示。
表1GATA-1、SCLmRNA表達(dá)RT-PCR檢測(cè)用引物及產(chǎn)物mRNA 引物PCR產(chǎn)物(bp)GATA-1 5′primer 5′-CAGGTACTCAGTGCACCAAC-3′ 3343′primer5′-TGGTAGAGATGGGCAGTACC-3′SCL 5′primer 5′-GTTCTTTGGGGAGCCGGATG-3′ 1593′primer 5′-ACATTCTGCTGCCGCCATCG-3γ_珠蛋白基因表達(dá)分析以RT-PCR檢測(cè)IL6/IL2融合基因、LN6基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞中γ_珠蛋白mRNA，以β-actinmRNA作檢測(cè)內(nèi)參照，進(jìn)行半定量分析。SCF和GATA-1mRNART-PCR檢測(cè)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染LhIL6/IL2載體后的K562細(xì)胞上述基因表達(dá)明顯降低。
用聯(lián)苯胺檢測(cè)IL6/IL2融合基因、LN6基因轉(zhuǎn)染慢性粒細(xì)胞白血病腫瘤細(xì)胞血紅蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，以計(jì)數(shù)細(xì)胞中與聯(lián)苯胺反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行聯(lián)苯胺染色結(jié)果顯示，記數(shù)200個(gè)LhIL6/IL2轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞，其中聯(lián)苯胺染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占5％，LN6轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞聯(lián)苯胺染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與之相似。RT-PCR檢測(cè)γ_珠蛋白基因表達(dá)結(jié)果表明LhIL6/IL2轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞和LN6轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞其表達(dá)水平均較低。
c-myc基因表達(dá)蛋白產(chǎn)物分析以WesternBlot方法進(jìn)行，同時(shí)檢測(cè)IL6/IL2融合基因、LN6基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞。以Western-blot檢測(cè)C-myc蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，LhIL6/IL2轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞C-myc蛋白表達(dá)水平降低。
相關(guān)細(xì)胞表面分化抗原分析包括CD15，CD14，CD33，CD41，CD45 andCD71同時(shí)檢測(cè)IL6/IL2融合基因、LN6基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，以FACS儀分析細(xì)胞表面抗原FACS檢測(cè)結(jié)果顯示，LhIL6/IL2轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞CD15水平較LN6轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞明顯增高，CD14，CD33，CD34，CD41，CD71和glycophorin A表達(dá)未見(jiàn)明顯改變。結(jié)果顯示IL6/IL2融合蛋白抑制K562細(xì)胞向紅系的分化，誘導(dǎo)K562細(xì)胞向髓/單核細(xì)胞系分化。
IL6/IL2融合蛋白能夠增強(qiáng)IL6、IL2和它們受體亞單位間的結(jié)合而形成高親和力結(jié)合位點(diǎn)，IL6/IL2能夠改變IL6/IL2受體的代謝，且其空間結(jié)構(gòu)較IL6和IL2更有利于加強(qiáng)信號(hào)傳導(dǎo)，誘導(dǎo)gp130蛋白再通過(guò)激活STAT-3酪氨酸殘基對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制，細(xì)胞分化發(fā)揮作用。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1IL6/IL2是受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)并對(duì)細(xì)胞有調(diào)控作用的一種分子量為37Kda的重組細(xì)胞因子。
2IL6/IL2融合蛋白能夠誘導(dǎo)慢性粒細(xì)胞白血病腫瘤細(xì)胞分化。
3IL6-IL2融合蛋白能夠有效抑制慢性粒細(xì)胞白血病腫瘤細(xì)胞增殖的作用。
權(quán)利要求
1.一種建立IL6/IL2融合蛋白對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病(CML)腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化的方法，其特征在于IL6/IL2融合蛋白是一種分子量為37Kda的對(duì)細(xì)胞有獨(dú)特調(diào)控作用的重組細(xì)胞因子，IL6/IL2融合蛋白能夠誘導(dǎo)慢性粒細(xì)胞白血病腫瘤細(xì)胞分化且有抑制增殖的作用，能夠在有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)分化。IL6/IL2融合蛋白可應(yīng)用于白血病的治療。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于IL6/IL2融合蛋白對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用。1)降調(diào)節(jié)SCL和GATA-1基因表達(dá)。2)誘導(dǎo)慢性粒細(xì)胞白血病腫瘤細(xì)胞向髓/單核細(xì)胞系分化。。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于IL6/IL2融合蛋白抑制增殖作用是通過(guò)部分阻斷慢性粒細(xì)胞白血病腫瘤細(xì)胞在G0/G1期，能夠在有效抑制細(xì)胞增殖。1)降調(diào)節(jié)慢性粒細(xì)胞白血病腫瘤細(xì)胞的增殖。2)誘導(dǎo)G0/G1期慢性粒細(xì)胞白血病腫瘤細(xì)胞的蓄積。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于IL6/IL2融合蛋白是一種分子量為37Kda的對(duì)細(xì)胞有獨(dú)特調(diào)控作用的重組細(xì)胞因子，對(duì)白血病進(jìn)行有效的誘導(dǎo)分化的治療。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于IL6/IL2融合蛋白是一種由IL6及IL2分子經(jīng)生物高技術(shù)重組的細(xì)胞因子，它具有更強(qiáng)的增強(qiáng)免疫，促進(jìn)造血的作用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用IL6/IL2融合蛋白對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病(CML)腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)和分化作用,以達(dá)到治療慢性粒細(xì)胞白血病的方法。涉及了具有更強(qiáng)的增強(qiáng)免疫,促進(jìn)造血的作用的IL6/IL2融合蛋白逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LhIL6/IL2的構(gòu)建,IL6/IL2融合蛋白能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖,對(duì)白血病腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用。
文檔編號(hào)A61P35/02GK1342493SQ00126540
公開(kāi)日2002年4月3日 申請(qǐng)日期2000年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月13日
發(fā)明者趙春華 申請(qǐng)人:趙春華