專利名稱：海水魚二聯(lián)弧菌滅活疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人工養(yǎng)殖海水魚疾病的預(yù)防用疫苗，具體說(shuō)涉及海水魚二聯(lián)弧菌滅活疫苗的制備方法。
已有技術(shù)系用藥物防治，由于長(zhǎng)期使用藥物會(huì)使魚類產(chǎn)生耐藥性，因而防治效果不佳。海水魚養(yǎng)殖是我國(guó)海水養(yǎng)殖的第四次浪潮，為了防止疾病危害，必需及早研制養(yǎng)殖海水魚的防病疫苗和實(shí)現(xiàn)疫苗的現(xiàn)場(chǎng)投予。研究發(fā)現(xiàn)，付溶血弧菌和鰻弧菌是引起海水魚皮膚潰瘍、眼球混濁及其它多種疾病的病原。
本發(fā)明的目的是提供一種能預(yù)防上述海水魚疾病的二聯(lián)弧菌滅活疫苗的制備方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種將滅活疫苗合理應(yīng)用、即現(xiàn)場(chǎng)投予的方法。
本發(fā)明的制備方法是先從病魚體內(nèi)分離出致病的付溶血弧菌和鰻弧菌兩種病原，之后將上述病原菌在生物反應(yīng)器中依一定的條件大量培養(yǎng)，再用福爾馬林滅活，靜置一天后離心收集，分別收到相應(yīng)的菌體，使用時(shí)以1∶1比例將上述兩種菌體混合，即為二聯(lián)弧菌滅活疫菌。也就是將引起上述疾病的兩種病原菌滅活，消除其對(duì)受免魚的毒性，同時(shí)利用上述兩種病原菌的抗原，使魚類產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，從而達(dá)到預(yù)防疾病發(fā)生的目的?，F(xiàn)場(chǎng)投予則靈活選擇投喂免疫或浸泡免疫。
本發(fā)明是生物技術(shù)與魚類免疫技術(shù)學(xué)的結(jié)合，方法簡(jiǎn)單、安全，產(chǎn)生的疫苗為滅活疫苗，免疫效果明顯。而疫苗的現(xiàn)場(chǎng)投予合理方便，采用投喂和浸泡兩種皆可。
本發(fā)明的制備方法，包括兩種弧菌的分離、接種、斜面培養(yǎng)和利用生物反應(yīng)器擴(kuò)大培養(yǎng)及菌體滅活與收集，然后將兩種滅活菌體按1∶1比例混合制成二聯(lián)弧菌滅活疫苗使用。
本發(fā)明的具體方法如下(1)首先選擇2216-E作為培養(yǎng)基。將從病魚體內(nèi)分離的鰻弧菌和付溶血弧菌，分別接種到2216-E固體培養(yǎng)基斜面上，并在溫度28±0.2℃下培養(yǎng)3-4天，待菌落生長(zhǎng)旺盛時(shí)，即可用于生物反應(yīng)器的擴(kuò)大培養(yǎng)。
(2)先將高壓滅菌后的2216-E液體培養(yǎng)基注入無(wú)菌的生物反應(yīng)器中，鰻弧菌和付溶血弧菌分別培養(yǎng)，即將兩種菌分別從前述斜面培養(yǎng)基上取菌落接種入生物反應(yīng)器內(nèi)。反應(yīng)溫度保持30±0.2℃，攪拌速度為600rpm，通氣量為4L/min，培養(yǎng)24小時(shí)左右，即當(dāng)反應(yīng)器內(nèi)溶氧量趨于平衡時(shí)，菌體生長(zhǎng)達(dá)到高峰，停止反應(yīng)。
(3)取出菌液，加入0.5％(v/v)福爾馬林液，靜置24小時(shí)。
(4)靜置后，以4000rpm離心15分鐘，分別收集沉積的、滅活后的付溶血弧菌和鰻弧菌菌體。
(5)最后將兩種滅活菌按1∶1比例混合制成二聯(lián)弧菌滅活疫苗使用。
在制備中還應(yīng)考慮安全性檢查以及滅活疫苗的保存。用滅菌生理鹽水，將滅活后的上述兩種菌體洗凈、去除福爾馬林。再用白金耳挑取少許菌體，在2216-E固體平板培養(yǎng)基上劃線，在溫度為28±0.2℃下培養(yǎng)3-4天，若無(wú)菌落出現(xiàn)，則證明滅活徹底。
該疫苗的保存方法系將二種滅活的菌體分別置于-20下冷凍保存。
作為其應(yīng)用，可將制成的疫苗，即將滅活的鰻弧菌和付溶血弧菌二聯(lián)疫苗進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)投放，其方法有兩種A、投喂免疫將兩種滅活疫苗各1克，加入每千克魚體重所需的飼料中混勻，連續(xù)投喂10天。
B、浸泡免疫將凍結(jié)的疫苗融化后，用海水稀釋1000倍，用25升稀釋后的疫苗浸泡50尾成魚(幼魚可浸泡80尾)，浸泡時(shí)間為5分鐘左右。
疫苗免疫使用中，可根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)具體情況選擇A或B。顯然本發(fā)明制備的滅活疫苗實(shí)用性強(qiáng)，制作和投予使用都簡(jiǎn)單合理，且免疫效果好，將廣泛使用于海水養(yǎng)魚場(chǎng)中，為我國(guó)海水魚養(yǎng)殖事業(yè)的發(fā)展、尤其魚類疾病防治做出新貢獻(xiàn)。
權(quán)利要求
1.海水魚二聯(lián)弧菌滅活疫苗的制備方法是(1)將從病魚體內(nèi)分離的鰻弧菌和付溶血弧菌，分別接種到2216-E固體培養(yǎng)基斜面上，并在28±0.2℃下培養(yǎng)3-4天；(2)然后將高壓滅菌后的2216-E液體培養(yǎng)基注入無(wú)菌的生物反應(yīng)器中，鰻弧菌和付溶血弧菌分別培養(yǎng)，反應(yīng)溫度保持30±0.2℃，攪拌速度為600rpm，通氣量為4L/min，培養(yǎng)24小時(shí)左右，反應(yīng)器內(nèi)溶氧趨于平衡時(shí)，菌體量達(dá)到高峰，停止反應(yīng)；(3)取出菌液，加入0.5％(v/v)福爾馬林液，靜置24小時(shí)；(4)靜置后，以4000rpm離心15分鐘，分別收集沉積的、得到滅活后的付溶血弧菌和鰻弧菌；(5)將兩種滅活的菌體按1∶1比例混合制成二聯(lián)弧菌滅活疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用方法，其特征是可將制成的疫苗，即將滅活的鰻弧菌和付溶血弧菌二聯(lián)疫苗進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)的投喂免疫將兩種滅活疫苗各1克，加入每千克魚體重所需的飼料中混勻，連續(xù)投喂10天。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用方法，其特征還在于可以是浸泡免疫將凍結(jié)的疫苗融化后，用海水稀釋1000倍，用稀釋后的疫苗25升浸泡50尾成魚或80尾幼魚，浸泡時(shí)間為5分鐘左右。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種海水魚二聯(lián)弧菌滅活疫苗的制備方法。它是從病魚體內(nèi)分離出鰻弧菌和付溶血弧菌并在一定條件下進(jìn)行分別培養(yǎng),再以生物反應(yīng)器擴(kuò)大培養(yǎng)并進(jìn)行滅活處理、等量混合后得到相應(yīng)的二聯(lián)滅活疫苗。現(xiàn)場(chǎng)可進(jìn)行投喂或浸泡免疫,其制作和投予方便安全且免疫效果好,能有效防治魚類的皮膚潰瘍、眼球混濁及由該二種病原引起的其它疾病?？蓮V泛用于海水魚養(yǎng)殖中。
文檔編號(hào)A61K39/106GK1360948SQ0012946
公開日2002年7月31日 申請(qǐng)日期2000年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月29日
發(fā)明者孫修勤, 張進(jìn)興, 曲凌云 申請(qǐng)人:國(guó)家海洋局第一海洋研究所