專利名稱：治療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以姜黃素及其衍生物作為治療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物，其有效成分包括姜黃素(curcumin)、去甲氧基姜黃素(demethoxycurcumin)、二去甲氧基姜黃素(bisdemethoxycurcumin)。
姜黃素及其衍生物具有抗氧化、抗炎、防癌等生物活性，1999年1月19日美國(guó)專利說明書(United States Patent 5861415)披露了姜黃素及其衍生物的制備方法，但未提及姜黃素及其衍生物用于治療慢性粒細(xì)胞白血病(CML)的作用，至今國(guó)內(nèi)外公開出版物也未見姜黃素及其衍生物用于治療慢性粒細(xì)胞白血病的報(bào)道。慢性粒細(xì)胞白血病是一種常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，目前臨床上對(duì)CML的治療仍以化療為主，長(zhǎng)期療效及預(yù)后較差，治療較困難。臨床上常用于治療CML的化療藥物如羥基脲(HU)、阿霉素等均是通過非特異地抑制腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的脫氧核糖核酸代謝發(fā)揮抗癌作用，而對(duì)CML發(fā)病的分子機(jī)理無特異的逆轉(zhuǎn)作用，故對(duì)腫瘤組織與正常組織的選擇性較差，毒性較大，療效欠佳。
本發(fā)明的目的是提供一種對(duì)CML發(fā)病的分子機(jī)理有逆轉(zhuǎn)作用的治療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物，它對(duì)人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞具有選擇性殺傷作用，而對(duì)人骨髓有核細(xì)胞影響較小。
本發(fā)明的藥物的特征在于以姜黃素(curcumin)、去甲氧基姜黃素(demethoxycurcumin)、二去甲氧基姜黃素(bisdemethoxycurcumin)或它們的混合物為其有效成分。
本發(fā)明藥物的作用機(jī)理及功效在CML患者中，約90％可檢出Ph染色體，即由22號(hào)染色體長(zhǎng)臂遠(yuǎn)端的一部分染色體缺失與9號(hào)染色體長(zhǎng)臂遠(yuǎn)端易位所致，所形成的bcr/abl融合基因編碼的P210蛋白具有很強(qiáng)的酪氨酸激酶(PTK)活性，可刺激粒細(xì)胞異常增殖，此即CML發(fā)病的分子學(xué)基礎(chǔ)。因此，抑制bcr/abl基因表達(dá)或拮抗P210蛋白的酪氨酸激酶活性是CML治療的有效新策略。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)姜黃素及其衍生物對(duì)治療人慢性粒白血病具有以下作用1、對(duì)人慢性粒白血病原代細(xì)胞及人正常骨髓有核細(xì)胞的選擇性作用以四氮唑試驗(yàn)法(MTT法)測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞的體外殺傷作用，試驗(yàn)結(jié)果顯示姜黃素、去甲氧基姜黃素、二去甲氧基姜黃素對(duì)從人慢性粒白血病患者外周血中分離的白血病原代細(xì)胞作用48小時(shí)，半數(shù)抑制濃度分別為4.3，6.8，10.3μg/ml。以從人骨髓穿刺標(biāo)本分離到的正常骨髓有核細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞毒試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，姜黃素對(duì)人正常骨髓有核細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度為23.05μg/ml，而且當(dāng)姜黃素濃度為10μg/ml時(shí)對(duì)人慢粒白血病原代細(xì)胞的抑制率超過95％，而此濃度對(duì)人正常骨髓有核細(xì)胞則幾無毒性。提示姜黃素對(duì)人正常骨髓有核細(xì)胞與人慢性粒細(xì)胞白血病原代細(xì)胞之間有一定的選擇性，對(duì)人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞的敏感性約為人正常骨髓有核細(xì)胞的5倍。
2、對(duì)人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞P210蛋白表達(dá)的抑制作用以人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562為試驗(yàn)對(duì)象，取藥物作用后的細(xì)胞，以1/15mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)洗滌兩遍，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml，加入1/10體積的鼠抗人BCR單抗(購(gòu)自Santa Cruz，1∶400稀釋)，混均后4℃放署30分鐘，加入等量熒光素標(biāo)記的二抗，4℃孵育30分鐘，以FACScan型流式細(xì)胞儀(BECTON DICKINSON生產(chǎn))進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)設(shè)不加一抗，只加熒光素標(biāo)記二抗的對(duì)照，以扣除非特異熒光背景。以CELL QuestTM軟件分析K562細(xì)胞P210蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞率。試驗(yàn)結(jié)果表明，姜黃素10μg/ml作用0-24小時(shí)，對(duì)K562細(xì)胞P210蛋白表達(dá)的抑制呈明顯的時(shí)效關(guān)系。姜黃素作用1小時(shí)P210蛋白抑制率為31.2％，作用3h抑制率為63.4％，作用24小時(shí)則抑制率大于90％，基本上達(dá)到坪值。可見姜黃素在短時(shí)間內(nèi)就可使K562細(xì)胞的P210蛋白含量減少。姜黃素0，5.0，10.0μg/ml對(duì)K562細(xì)胞作用12小時(shí)，K562細(xì)胞P210蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞率分別為92.31％，24.78％，2.03％?？梢娊S素0-10μg/ml作用12小時(shí)對(duì)K562細(xì)胞P210蛋白表達(dá)的抑制呈明顯的量效關(guān)系。
3、對(duì)人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞P210蛋白的酪氨酸激酶(PTK)活性的影響以人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562為試驗(yàn)對(duì)象，取藥物作用后的細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸緩沖液洗2次，按1×107/ml細(xì)胞密度加低強(qiáng)度蛋白提取液，超聲破碎后，10000×g離心10分鐘，取上清液，即為胞漿蛋白。胞漿蛋白進(jìn)行蛋白定量后，用免疫沉淀法，從總胞漿蛋白中分離P210蛋白。酪氨酸激酶活性測(cè)定試劑盒購(gòu)自寶靈曼公司，酪氨酸激酶活性測(cè)定方法按試劑盒說明書進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)設(shè)待測(cè)樣品中磷酸化酪氨酸蛋白及內(nèi)源性磷酸酶對(duì)照。試驗(yàn)結(jié)果表明，姜黃素10μg/ml作用3、6、12、24、48小時(shí)，對(duì)K562細(xì)胞P210蛋白的PTK活性抑制率分別為7％、47％、60％、71％、
73％，呈明顯的時(shí)效關(guān)系。姜黃素2.5、5.0、10.0μg/ml對(duì)K562細(xì)胞作用24小時(shí)，對(duì)K562細(xì)胞P210蛋白的PTK活性抑制率分別為30.1％、58.0％、70％，呈明顯的量效關(guān)系。
4.姜黃素及其衍生物對(duì)小鼠灌胃的半數(shù)致死量2g/kg，毒性很低。
綜上所述，本發(fā)明所涉及的姜黃素及其衍生物用于治療CML，能有效抑制CML細(xì)胞bcr/abl基因產(chǎn)物P210蛋白表達(dá)并拮抗P210蛋白的酪氨酸激酶活性，從而阻斷CML發(fā)病的信號(hào)通路，對(duì)CML細(xì)胞具有選擇性殺傷作用，而對(duì)骨髓有核細(xì)胞的影響較小。
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明予以具體描述。
本發(fā)明用于治療CML患者時(shí)，通?？蓪⒔S素或姜黃素衍生物或它們的混合物制成片劑、膠囊、混懸劑?？诜┝繛槊刻?50毫克至每天2克。
實(shí)例1片劑姜黃素.姜黃素衍生物或它們的混合物50-100mg/片，硬脂鎂0.65 mg/片，無水乳糖80mg/片，將姜黃素.姜黃素衍生物或它們的混合物過200目篩，與無水乳糖、硬脂鎂混勻，直接壓片。
實(shí)例2膠囊姜黃素、姜黃素衍生物或它們的混合物50-100mg/膠囊，淀粉150.00mg/膠囊，硬脂鎂1.00mg/膠囊，將姜黃素、姜黃素衍生物或它們的混合物過200目篩，與淀粉、硬脂鎂混勻，裝入2號(hào)硬空心膠囊。
實(shí)例3混懸劑姜黃素、姜黃素衍生物或它們的混合物50-100mg/5ml，單硬脂酸鋁75.00/5ml，椰子油5ml，根據(jù)需要加入適量的校味劑。將姜黃素、姜黃素衍生物或它們的混合物過200目篩，單硬脂酸鋁均勻分散于椰子油中加熱至攝氏115度，放冷后加入過篩后的姜黃素、姜黃素衍生物或它們的混合物及適量的校味劑。
權(quán)利要求
1.一種治療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物，其特征在于以姜黃素(curcumin)、去甲氧基姜黃素(demethoxycurcumin)、二去甲氧基姜黃素(bisdemethoxycurcumin)或它們的混合物為其有效成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述治療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物，其特征在于該藥物為片劑、膠囊或混懸劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述治療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物，其特征在于片劑的配制方法是姜黃素.姜黃素衍生物或它們的混合物50-100mg/片，硬脂鎂0.65mg/片，無水乳糖80mg/片，將姜黃素、姜黃素衍生物或它們的混合物過200目篩，與無水乳糖、硬脂鎂混勻，直接壓片。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述治療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物，其特征在于膠囊的配制方法是姜黃素.姜黃素衍生物或它們的混合物50-100mg/膠囊，淀粉150.00mg/膠囊，硬脂鎂1.00mg/膠囊，將姜黃素、姜黃素衍生物或它們的混合物過200目篩，淀粉、硬脂鎂混勻，裝入2號(hào)硬空心膠囊。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述治療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物，其特征在于混懸劑的配制方法是姜黃素.姜黃素衍生物或它們的混合物50-100mg/5ml，單硬脂酸鋁75.00/5ml，椰子油5ml，將姜黃素、姜黃素衍生物或它們的混合物過200目篩，單硬脂酸鋁均勻分散于椰子油中加熱至攝氏115度，放冷后加入過篩后的姜黃素或姜黃素衍生物及適量的校味劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1.2.3.4.或5所述治療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物其特征在于每天口服姜黃素(curcumin)、去甲氧基姜黃素(demethoxycurcumin).二去甲氧基姜黃素(bisdemethoxycurcumin)或它們的混合物劑量范圍為250毫克至2克。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物,其特征在于以姜黃素(curcumin)、去甲氧基姜黃素(demethoxycurcumin)、二去甲氧基姜黃素(bisdemethoxycurcumin)或它們的混合物為其有效成分。該藥物具有阻斷慢性粒細(xì)胞白血病發(fā)病的信號(hào)通路,對(duì)人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞具有選擇性殺傷作用,而對(duì)人骨髓有核細(xì)胞影響較小的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61K31/121GK1350845SQ0013110
公開日2002年5月29日 申請(qǐng)日期2000年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月26日
發(fā)明者許建華, 陳元仲 申請(qǐng)人:福建醫(yī)科大學(xué)