專利名稱：含硒環(huán)糊精及其在制備治療白內(nèi)障藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于高活性人工酶領(lǐng)域，特別涉及用環(huán)糊精制備具有谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)活性的含硒環(huán)糊精。
在分子水平上模擬酶活性部位的微環(huán)境，吸收酶中對催化起主導(dǎo)作用的因素，設(shè)計(jì)和合成較天然酶簡單得多的非蛋白分子，作為人工模擬酶是當(dāng)今自然科學(xué)領(lǐng)域中的前沿課題之一。生物學(xué)家一直在利用化學(xué)模擬方法來闡明自然界中酶的催化行為。鑒于人工酶分子可能具有與天然酶相媲美的專一性和催化功能，而本身又相當(dāng)穩(wěn)定，預(yù)示著它在化工、酶學(xué)、醫(yī)藥學(xué)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。為此，美國和歐洲國家都把對酶的人工模擬列入未來研究的發(fā)展規(guī)劃。近年來，人們已建立起許多小分子仿酶體系，如環(huán)糊精、冠醚、環(huán)番，環(huán)芳烴和卟啉等。
谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)是生物體內(nèi)重要的含硒酶。由于它具有優(yōu)良的抗氧化性，對治療和預(yù)防白內(nèi)障、克山病、心血管病、炎癥及癌癥等具有很大潛力。但由于該酶不穩(wěn)定，來源有限，分子量大會引起人體免疫反應(yīng)等缺點(diǎn)，極大限制了此酶在醫(yī)藥學(xué)方面的開發(fā)和應(yīng)用。而含硒人工酶可克服天然酶的弱點(diǎn)，因此，對此酶進(jìn)行人工模擬越來越受到科學(xué)工作者的重視。稱為“小分子硒酶”的GPX模擬物Ebselen(PZ51)，是人工酶的突出代表，其催化機(jī)制及生物學(xué)活性已被詳細(xì)研究過。動物實(shí)驗(yàn)表明，PZ51具有廣譜抗炎活性，對糖尿病、腫瘤、心血管疾病均有療效(文獻(xiàn)1、2)，目前在國外已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。但作為藥物，PZ51最大缺點(diǎn)是活性較低、水溶性差，為了克服PZ51的弱點(diǎn)，解決其水溶性差，進(jìn)一步提高其活性，我們選用環(huán)糊精來模擬GPX。
本發(fā)明的目的在于提供一種工藝簡單、產(chǎn)率高、穩(wěn)定性和活性高的GPX人工酶。
本發(fā)明的原理是利用環(huán)糊精的疏水空腔作為酶的底物結(jié)合部位，用化學(xué)法活化環(huán)糊精上的羥基，再以NaHSe取代，則將羥基變成硒氫基，從而在環(huán)糊精上引入酶的催化基團(tuán)，再經(jīng)氧化得到具有GPX活性的產(chǎn)品——含硒環(huán)糊精(見合成路線圖)。
環(huán)糊精有三種α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精。無論哪一種都可用上述原理(合成路線)制成含硒環(huán)糊精。但是，環(huán)糊精上被活化的羥基的位置不同，最后所制得的含硒環(huán)糊精的GPX活性也不同。我們發(fā)現(xiàn)，活化β-環(huán)糊精的2位羥基所得到的含硒環(huán)糊精的GPX活性較高。
下面以β-環(huán)糊精的2位羥基制備含硒環(huán)糊精來舉例說明制備過程1．雙硒橋聯(lián)環(huán)糊精的合成路線1)將β-環(huán)糊精的2位羥基用對甲苯基磺酰氯活化制成β-環(huán)糊精-2位羥基苯基磺酸酯；2)β-環(huán)糊精-2位羥基苯基磺酸酯的硒化用硒氫基取代苯基磺酸酯基；3)硒氫基在空氣中氧化硒氫基在空氣氧化生成雙硒橋聯(lián)環(huán)糊精。2．雙硒橋聯(lián)環(huán)糊精的制備過程是合成路線如圖所示 (1)NaHSe制備(參照文獻(xiàn)3)將81.1mg(2.15mmole)NaBH4溶解在裝有1ml水的小瓶中，再將79mg(1mmole)硒粉緩慢加入到NaBH4的溶液中，蓋上一插有針頭的膠蓋，此時可以看到水中產(chǎn)生大量氣體，并伴隨有熱量放出。由于反應(yīng)過于劇烈，所以需在冰浴中進(jìn)行，以控制反應(yīng)速度，其反應(yīng)方程式如下由于NaBH4與H+反應(yīng)，還伴有少量H2Se氣體產(chǎn)生，為防中毒，必須在通風(fēng)櫥中反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，有大量鹽析出。NaHSe極易氧化，故應(yīng)通入N2保存。(2)β-CD 2位磺?；?參照文獻(xiàn)4)產(chǎn)物為β-CD-2-位羥基苯磺酸脂，簡稱2-OTs-β-CD。將2.0g(1.76mmole)β-CD溶于80ml NaOH(0.15mol/L)溶液中，室溫滴加含2.0g(9.66mmole)p-TsCl的乙腈溶液5ml，滴加過程中不斷加入1mol/L NaOH使溶液pH＞12.5,3h滴加完畢再攪拌1h，加入1mol/L HCl中和至中性，加入100ml甲醇，濾去不溶物，減壓蒸去甲醇和大部分水至20ml，放入5℃冰箱一周后有鹽析出，過濾后以水為洗脫劑經(jīng)Bio-gel P-2柱層析，收集第一峰，凍干，得產(chǎn)物1.38g，產(chǎn)率為65％。(3)雙硒橋聯(lián)環(huán)糊精的制備將100mg(0.075mmole)2-OTs-β-CD溶于50mM磷酸緩沖液中，通高純氮去氧，加入100μl 1mol/L NaHSe(0.10mmole),60℃反應(yīng)36h，然后使反應(yīng)體系充分暴露在空氣中氧化，離心除硒，上清液經(jīng)Bio-gel P-2柱(5.0×50cm)分離純化，以蒸餾水為洗脫液，流速為1ml/min,254nm紫外監(jiān)測收集第一峰，凍干，用丙酮洗三次，真空烘干得淡黃色粉末狀雙硒橋聯(lián)環(huán)糊精79mg，產(chǎn)率為80％。3．雙硒橋聯(lián)β-CD的結(jié)構(gòu)表征(1)元素分析表1．雙硒橋聯(lián)β-CD的元素分析
合成的2位雙硒橋聯(lián)β-CD的元素分析結(jié)果列于表1中。
從表1看出對2-SeCD的元素分析實(shí)驗(yàn)值與理論值基本符合，證明化合物的分子式為C84H138Se2·6H2O。(2)紅外光譜分析紅外光譜分析(KBr壓片)結(jié)果如表2所示。
表2．雙硒橋聯(lián)β-CD的紅外光譜
從表2分析，紅外光譜出現(xiàn)了磺酸酯的特征吸收峰1177,1364cm-1和苯環(huán)的特征吸收峰1598,1496,845和815cm-1而在SeCD中磺酸酯和苯環(huán)的特征吸收消失，說明磺酸酯已被硒氫基(-SeH)置換下來，而CD的結(jié)構(gòu)特征未變化。(3)核磁共振分析表3雙硒橋聯(lián)環(huán)糊精的1HNMR、13CNMR譜
利用D2O為溶劑測定了雙硒橋聯(lián)環(huán)糊精的。1H NMR和13C NMR，其結(jié)果列于表3中，所得數(shù)據(jù)表現(xiàn)出2位羥基取代的結(jié)構(gòu)特征，結(jié)果表明硒氫基被引入環(huán)糊精的2位。(4)質(zhì)譜分析雙硒橋聯(lián)環(huán)糊精的分子量由激光質(zhì)譜測定為2393.7(理論值C84H138Se2.2393)，與計(jì)算值十分吻合，進(jìn)一步證明合成的化合物是以硒橋聯(lián)形式存在。(5)硒價態(tài)及含量分析利用X-射線光電子能譜技術(shù)，以鎂(MgKα)作靶，測定了模擬物中硒的價態(tài)為-1價。標(biāo)準(zhǔn)物硒代胱氨酸(Se-Cyss)的電子能譜圖的Se(3d,5/2)電子結(jié)合能為55.1eV，模擬物的電子結(jié)合能為54.9eV，表明硒的價態(tài)與標(biāo)準(zhǔn)物很接近。進(jìn)一步確證了模擬物的硒結(jié)合形式與硒代胱氨酸一致，為硒橋聯(lián)形式。
綜合上述結(jié)構(gòu)分析，確定雙硒橋聯(lián)環(huán)糊精的結(jié)構(gòu)如下
4．雙硒橋聯(lián)環(huán)糊精酶活性及穩(wěn)定性(1)硒橋聯(lián)環(huán)糊精的GPX活力[5]測活體系700μL，含50mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH7.0,1mmol/L疊氮鈉，1mmol/L谷胱甘肽，0.25mmol NADPH,1U谷胱甘肽還原酶，加入0.5mmol/L H2O2啟動反應(yīng)，在340nm處監(jiān)測NADPH被氧化的吸光度的變化。測定酶活力時，以蒸餾水代替人工酶為空白對照。模擬酶活力單位定義為每分鐘每微摩爾人工酶消耗1微摩爾NADPH為一個活力單位。
表4雙硒橋聯(lián)環(huán)糊精的酶活力
(2)雙硒橋聯(lián)環(huán)糊精的穩(wěn)定性雙硒橋聯(lián)環(huán)糊精在pH7.0,50mmol/L PBS溶液中保存半年活力保持92％，干粉酶活力保持不變。5．雙硒橋聯(lián)環(huán)糊精治療白內(nèi)障的效果取32只患先天性白內(nèi)障的大鼠，分兩組治療組和對照組，每組16只。治療組每天滴眼0.33U(GPX活性單位)的雙硒橋聯(lián)環(huán)糊精，15天后，14只鼠眼的白內(nèi)障消逝，另兩只鼠眼的白內(nèi)障也有很大程度的減輕。對照組每天用同樣量的未硒化的環(huán)糊精滴眼，15天后，白內(nèi)障程度沒有減輕。經(jīng)15天試驗(yàn)后的大鼠，反應(yīng)靈敏、健康狀況良好。由此可見，雙硒橋聯(lián)環(huán)糊精可有效治療白內(nèi)障。
本發(fā)明有如下特點(diǎn)1．制備方法簡單，合成步驟少，產(chǎn)率高，可擴(kuò)大生產(chǎn)。
2．人工酶模型簡單，以環(huán)糊精空腔為底物結(jié)合部位，以雙硒橋?yàn)榇呋鶊F(tuán)。
3．本發(fā)明制備的含硒環(huán)糊精GPX活力高，為世界上最好的小分子GPX模擬物PZ51的7倍。
4．雙硒橋聯(lián)環(huán)糊精作為藥物可克服天然GPX不穩(wěn)定，來源有限，分子量大會引起人體免疫反應(yīng)，不易過膜等缺點(diǎn)。
5．雙硒橋聯(lián)環(huán)糊精穩(wěn)定。
6．它具有優(yōu)良的抗氧化性，對治療和預(yù)防白內(nèi)障、心血管病、炎癥及癌癥等具有非常大的應(yīng)用潛力。
綜上所述，本發(fā)明所述的含硒環(huán)糊精制備工藝簡單，產(chǎn)率高，可大量生產(chǎn)，且含硒環(huán)糊精GPX活性高、穩(wěn)定性好、能有效治療白內(nèi)障。同時可克服天然酶用作藥物產(chǎn)生的免疫原性大，過膜困難，不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。因此，在醫(yī)藥上具有巨大的應(yīng)用潛力。
參考文獻(xiàn)1)Parnharn MJ,Leyck S,Graf E,Dowling EJ.Blake DR,Agents andActions,1991,32:4-9.
2)Sies H,Masumoto H,Advancesin Pharmacology,1997,38:229-246.
3)Klaymen DL,Girffin TS,J.Am.Chem.Soc.1973,95:197-199.
4)郝愛友，童林薈，張宏偉，金道森，有機(jī)化學(xué)，1991,11:265-268.
5)Wilson SR,Zucker PA,Spcetor AR,J.Am.Chem.Soc.,1989,111:593權(quán)利要求
1.一種由合成路線(1)所制取的含硒環(huán)糊精，其特征在于所述的環(huán)糊精可以為α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精中的任何一種，用化學(xué)法活化環(huán)糊精上的羥基，再以NaHSe取代羥基變成硒氫基，在環(huán)糊精上引入酶的催化基團(tuán)，經(jīng)氧化得到具有GPX活性的含硒環(huán)糊精； (1)
2.一種如權(quán)利要求1所述的含硒環(huán)糊精，其特征在于活化β-環(huán)糊精的2位羥基所得到的含硒環(huán)糊精結(jié)構(gòu)式如(2)所示； (2)
3.如權(quán)利要求1或2所述的含硒環(huán)糊精，其特征在于具有較高的谷胱甘肽過氧化物酶活性；
4.權(quán)利要求1或2或3所述的含硒環(huán)糊精在制備治療白內(nèi)障藥品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含硒環(huán)糊精。采用簡單的化學(xué)合成法,以環(huán)糊精疏水空腔作為酶的底物結(jié)合部位,以雙硒橋?yàn)榇呋鶊F(tuán),將催化基團(tuán)與結(jié)合部位配置在一起,成功制備出具有較高谷胱甘肽過氧化物酶活性的小分子含硒環(huán)糊精。本發(fā)明所述含硒環(huán)糊精具有制備工藝簡單、產(chǎn)率高、可大量生產(chǎn)、谷胱甘肽過氧化物酶活性高、穩(wěn)定性好等特點(diǎn),在治療白內(nèi)障等方面具有巨大的應(yīng)用潛力。
文檔編號A61P27/00GK1306009SQ00133040
公開日2001年8月1日 申請日期2000年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月17日
發(fā)明者羅貴民, 劉俊秋, 任曉君, 閻崗林, 牟穎, 楊同書, 沈家驄 申請人:吉林大學(xué)