專利名稱：用于甲殼類或魚類的飼料添加劑及飼料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甲殼類或魚類的飼料添加劑及添加有該飼料添加劑的飼料，特別是涉及對(duì)免疫激活、預(yù)防感染具有顯著效果的飼料添加劑以及以適當(dāng)比例添加該飼料添加劑的飼料，以及使用它們的預(yù)防方法和養(yǎng)殖方法。
對(duì)于這些疾病中的細(xì)菌性疾病，一般使用抗生素和合成抗菌藥作為治療藥，但是出現(xiàn)對(duì)抗菌物質(zhì)有耐藥性的細(xì)菌時(shí)，就不能得到充分的治療效果。另外，由于使用的藥物殘留在甲殼類、魚類上，會(huì)產(chǎn)生公共衛(wèi)生方面的問題，所以人們強(qiáng)烈希望有不依賴化學(xué)療法的預(yù)防對(duì)策。另一方面，對(duì)于甲殼類和魚類的病毒病，由于沒有開發(fā)出疫苗和治療藥，現(xiàn)況是疾病依然大量出現(xiàn)。
為了增強(qiáng)甲殼類和魚類的免疫機(jī)能和預(yù)防感染，已知可以利用來源于嗜熱雙歧桿菌(Bifidobacterium thermophi1um)的肽聚糖(特許第2547371號(hào)公報(bào))、芽胞桿菌屬(Bacillus)等革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁成分(特公平3-173826號(hào)公報(bào))、來源于裂褶菌屬(Schizophyllum)的β-1,3-聚糖(特公平6-65649號(hào)公報(bào))等多糖。另外，也有報(bào)告說高分子量的脂多糖能夠激活魚類的免疫機(jī)能(Salati,F.and R.Kusuda、日本水產(chǎn)學(xué)會(huì)志、53卷、201～204頁(yè)、1987年)(Odean,M.J.等、Infection and Immunity、58卷、427～432頁(yè)、1990年)。
本發(fā)明中使用的低分子量脂多糖(以下簡(jiǎn)稱為L(zhǎng)PS)與上述來源于革蘭氏陽(yáng)性菌的肽聚糖、細(xì)胞壁成分及來源于扇衣屬的β-1,3-聚糖的基本結(jié)構(gòu)和成分不同，它是由特異的脂類A和與其共價(jià)結(jié)合稱作R核的低聚糖、以及0特異多糖3種成分組成的物質(zhì)，它在增強(qiáng)腫瘤壞死因子(TNF)效果的基礎(chǔ)上作為動(dòng)物用的免疫機(jī)能激活劑是公知的，但是關(guān)于預(yù)防甲殼類和魚類感染的作用卻完全不知道。另外，已經(jīng)報(bào)道的研究中使用的高分子量脂多糖(LPS)的分子量為100萬(wàn)～1000萬(wàn)，具有非常強(qiáng)的毒性，所以長(zhǎng)期投給甲殼類和魚類，通常不可能激活免疫機(jī)能。另外，由于上述已知物質(zhì)的分子量大，難以從腸管吸收，所以必須大量口服給藥，如果長(zhǎng)時(shí)間給藥，大多會(huì)出現(xiàn)免疫機(jī)能低下的現(xiàn)象。
如上所述，甲殼類和魚類經(jīng)常出現(xiàn)各種感染，結(jié)果導(dǎo)致死亡，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在這種背景下，可以舉出這些甲殼類或魚類在有限環(huán)境中過密地養(yǎng)殖所引起的免疫機(jī)能低下。另外，為了激活低下的免疫機(jī)能，已經(jīng)使用了各種物質(zhì)，但是甲殼類沒有產(chǎn)生抗體的能力，確認(rèn)沒有脊椎動(dòng)物中可見的淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞等，而且魚類產(chǎn)生抗體的能力有限，同時(shí)由于是變溫動(dòng)物，水溫對(duì)抗體的產(chǎn)生有較大影響，這種免疫機(jī)能不可能很充分，兩者與哺乳動(dòng)物在生物體防御機(jī)構(gòu)上存在相當(dāng)大的差異(Fish Pathology,30(2),141-150,1995.6)；有時(shí)由于以往的LPS毒性強(qiáng)，在養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)不能使用；多數(shù)情況下與其長(zhǎng)時(shí)間給藥還不如就讓其免疫機(jī)能低下，因此沒有可以滿足防止甲殼類或魚類感染的物質(zhì)。
本發(fā)明的目的是提供一種用極微量就可以確實(shí)激活甲殼類和魚類本來具備的免疫機(jī)能，預(yù)防感染，不存在藥物殘留等公共衛(wèi)生方面的問題，安全的用于養(yǎng)殖甲殼類和魚類的飼料添加劑，添加有該飼料添加劑的飼料，以及使用它們的預(yù)防方法和養(yǎng)殖方法。
另外，本發(fā)明還涉及甲殼類或魚類用飼料添加劑，含有上述低分子量脂多糖以及甲殼類和魚類允許的載體。
另外，本發(fā)明還涉及上述低分子量脂多糖在制造甲殼類或魚類用飼料添加劑中的用途。
另外，本發(fā)明還涉及甲殼類或魚類的免疫激活、預(yù)防感染的方法，其特征在于將上述低分子量脂多糖的有效量投給甲殼類或魚類。
另外，本發(fā)明還涉及甲殼類或魚類的死亡預(yù)防劑，其特征在于含有上述低分子量脂多糖作為有效成分。
另外，本發(fā)明還涉及甲殼類或魚類的死亡預(yù)防劑，其特征在于含有上述低分子量脂多糖以及藥學(xué)上允許的載體。
另外，本發(fā)明還涉及上述低分子量脂多糖在制造甲殼類或魚類的死亡預(yù)防劑中的用途。
另外，本發(fā)明還涉及甲殼類或魚類的死亡預(yù)防方法，其特征在于將上述低分子量脂多糖的有效量投給甲殼類或魚類。
另外，本發(fā)明還涉及甲殼類或魚類用飼料添加劑，革蘭氏陰性的微生物菌體是屬于泛菌屬(Pantoea)的微生物菌體。
另外，本發(fā)明還涉及甲殼類或魚類用飼料添加劑，革蘭氏陰性的微生物菌體是成團(tuán)泛菌(Pentoea agglomerans)。
另外，本發(fā)明還涉及甲殼類或魚類用飼料，其特征在于添加上述飼料添加劑或死亡預(yù)防劑。
另外，本發(fā)明還涉及甲殼類或魚類的養(yǎng)殖方法，其特征在于將上述飼料投給甲殼類或魚類。
本發(fā)明是將按照特開平8-198902號(hào)公報(bào)中公開的方法由革蘭氏陰性的微生物菌體精制得到的物質(zhì)，即分子量為5000±2000的低分子量LPS添加到飼料中，投給甲殼類或魚類后，確認(rèn)可以激活甲殼類或魚類本來具備的免疫機(jī)能，預(yù)防病毒或細(xì)菌引起的感染，預(yù)防死亡，而且安全性非常高，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的低分子量LPS雖說如上所述是由革蘭氏陰性的微生物菌體按照特開平8-198902號(hào)公報(bào)中公開的方法得到的分子量為5000±2000的脂多糖，但是其特征與現(xiàn)有的高分子量LPS(分子量100萬(wàn)～1000萬(wàn))相比，對(duì)甲殼類和魚類的安全性高，具有顯著的免疫激活作用、預(yù)防感染的效果以及預(yù)防死亡的效果。
本發(fā)明中，實(shí)質(zhì)上不含有高分子量脂多糖是指不含有分子量為8000以上的物質(zhì)。
本發(fā)明中，革蘭氏陰性的微生物菌體例如屬于泛菌屬(Pantoea)、沙門氏菌屬(Salmonella)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、沙雷氏菌屬(Serratia)、腸桿菌屬(Enterobacter)的微生物菌體，其它特開平4-99481號(hào)公報(bào)中記載的革蘭氏陰性的微生物菌體等。優(yōu)選的微生物是屬于泛菌屬(Pantoea)的微生物，更優(yōu)選成團(tuán)泛菌(Pentoeaagglomerans)。
本發(fā)明的低分子量LPS可以按照常規(guī)方法培養(yǎng)革蘭氏陰性的微生物，從培養(yǎng)基收集菌體，按照公知的方法，例如熱酚法〔O.Westphal編，Methods in Carbohydrate Chemi stry，第5卷，第83頁(yè)，AcademicPress,1965年〕由收集的菌體提取，再用陰離子交換樹脂純化制造。也就是說，將微生物的菌體懸濁于蒸餾水中，將該懸濁液添加到蒸餾水以及等體積的熱酚混合液中攪拌，然后離心分離回收水層，透析該水層，除去酚，采用超濾法濃縮，收集粗LPS部分，采用常規(guī)的陰離子交換色譜法(例如使用單Q-瓊脂糖或-瓊脂糖)將該部分純化，按照常規(guī)方法脫鹽。
這樣得到的純化LPS實(shí)質(zhì)上相當(dāng)于與特開平4-187640號(hào)公報(bào)、特開平4-49240號(hào)公報(bào)、特開平4-99481號(hào)公報(bào)以及特開平5-155778號(hào)公報(bào)中公開的分子量為5000至6000的LPS。進(jìn)一步在脫氧膽酸鈉等表面活性劑的存在下將得到的純化LPS凝膠過濾，僅回收含有低分子量LPS的部分，除去混在其中的高分子量LPS，可以得到高度純化的本發(fā)明的低分子量LPS。這種在表面活性劑存在下的凝膠過濾步驟可以將特開平4-187640號(hào)公報(bào)、特開平4-49240號(hào)公報(bào)以及特開平5-155778號(hào)公報(bào)中公開的分子量為5000至6000的LPS進(jìn)一步高度純化，通過這一步驟可以完全除去混在其中的高分子量LPS。
成為本發(fā)明的對(duì)象的甲殼類包括對(duì)蝦(Penaeus japonicus)、牛蝦(Penaeus monodon)、高麗蝦(Penaeus chinensis)、香蕉蝦(Penaeusmorguiensis)等包括對(duì)蝦類在內(nèi)的所有蝦類(包括lobster,shrimp,prawn)，上海蟹、蝤蛑等所有的蟹類，優(yōu)選蝦類，更優(yōu)選對(duì)蝦類。魚類包括師魚、河豚、真鯛、比目魚、鰻鱺、虹鱒等所有的魚類。感染是指甲殼類的急性病毒血癥、弧菌病、Bpistylis sp.、Zoothamniumsp.等寄生蟲病，或Lagenidium sp.、Siropidium sp.等真菌病，魚類的虹膜病毒感染癥、桿狀病毒病、神經(jīng)壞死、傳染性造血器官壞死病、類結(jié)節(jié)病、鏈球菌癥、腸球菌癥、弧菌病、冷水病、假單胞菌病、滑走細(xì)菌病、水霉病等所有的病毒、支原體、細(xì)菌、真菌以及寄生蟲引起的感染，優(yōu)選甲殼類的急性病毒血癥，魚類的鏈球菌病、腸球菌病、弧菌病。
本發(fā)明中，低分子量LPS可以直接或加入公知的載體、穩(wěn)定劑等，必要時(shí)進(jìn)一步加入維生素、氨基酸類、礦物等各種養(yǎng)分、抗氧化劑、抗生素、抗菌劑以及其它添加劑等，制成甲殼類或魚類用飼料添加劑，其形狀只要制成粉體、顆粒、小丸、懸濁液等適當(dāng)?shù)男螒B(tài)即可。給予本發(fā)明的飼料添加劑時(shí)，對(duì)于甲殼類或魚類可以單獨(dú)給予，也可以與飼料混合后給予。給予的時(shí)期可以是為了預(yù)防疾病經(jīng)常給予，也可以是養(yǎng)殖后期添加。
另外，本發(fā)明的飼料沒有特別的限定，可以是粉末飼料、固體飼料、濕丸飼料、干丸飼料、EP(Extruder Pellet)飼料、生餌等任何一種飼料。
本發(fā)明中低分子量LPS在飼料添加劑或飼料中的含量可以在較寬范圍內(nèi)選擇，優(yōu)選相對(duì)于飼料添加劑或飼料為0.000001～0.001重量％，特別優(yōu)選0.00002～0.00005重量％，但是對(duì)此并沒有限定。低分子量LPS的給餌量可以適當(dāng)確定，例如相對(duì)于甲殼類或魚類的每1kg體重，1日投給1～100μg，優(yōu)選10～20μg，但是對(duì)此并沒有限定。
發(fā)明的最佳實(shí)施方式以下結(jié)合實(shí)施例說明本發(fā)明，但是并不受這些實(shí)施例的任何限定。另外，實(shí)施例中所使用的低分子量LPS是指分子量約5000的LPS，高分子量LPS是指分子量為8000～5萬(wàn)的LPS。參考例1(低分子量LPS的制備)將胰蛋白胨(Difuco公司生產(chǎn))10g、酵母提取物(Difuco公司生產(chǎn))5g、NaCl(和光純藥工業(yè)社生產(chǎn)，特級(jí))10g添加到蒸餾水1升中，用NaOH調(diào)節(jié)為pH7.5，用高壓釜滅菌，按照0.1％的比例添加另外滅菌的葡萄糖(和光純藥工業(yè)社生產(chǎn)，特級(jí))得到培養(yǎng)基(以下記作L-肉湯培養(yǎng)基)，由保存在-80℃的成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans)保存菌株分離單一菌落，接種在裝有100ml該培養(yǎng)基的500ml坡口燒瓶中，在35℃下振蕩1夜培養(yǎng)，將其全量直接接種在裝有L-肉湯培養(yǎng)基1000mL的3升坡口燒瓶中，同樣進(jìn)行培養(yǎng)。
再將培養(yǎng)得到的菌體接種在裝有7升L-肉湯培養(yǎng)基的10升臺(tái)式發(fā)酵器(丸菱生物工程社生產(chǎn))中，在相同條件下通氣培養(yǎng)，之后集菌，回收約70g的濕菌體，將其冷凍保存。將冷凍保存的菌體約++70g懸濁于500ml蒸餾水中，添加500ml的90％熱酚，在65～70℃下攪拌20分鐘，冷卻，在4℃下以10000G離心處理20分鐘，回收水層，對(duì)于酚層再重復(fù)1次與上述相同的操作，合并2次回收的水層，透析1夜除去酚，使用超濾裝置(Adovandeck Toyo公司生產(chǎn)，UK-200)通過分子量為20萬(wàn)的斷流膜在2個(gè)大氣壓的氮?dú)庀?，將透析?nèi)液超濾濃縮。
將得到的粗LPS冷凍干燥物溶解于蒸餾水，過濾器滅菌，添加緩沖液，用陰離子交換色譜法(Pharmasia公司生產(chǎn)，Q-瓊脂糖·快速·流動(dòng))處理，用含有10mM Tris-HCl(pH7.5)以及10mM NaCl的緩沖液使試樣溶液在柱中通液，用200～400mM NaCl/10mM Tris-HCl(pH7.5)洗脫出鱟活性部分。在與上述相同的條件下，將該洗脫液超濾，脫鹽并濃縮，冷凍干燥，由約70g的濕菌體得到約300mg的純化LPS。
將得到的純化LPS 100mg以5mg/m1的濃度溶解于可溶化緩沖液〔由3％脫氧膽酸鈉(和光純藥社生產(chǎn))0.2M氯化鈉、5mM EDTA-2Na和20mM Tris-鹽酸構(gòu)成，pH8.3〕，將純化LPS溶液20ml在SephakurylS-200HR柱(Pharmasia公司生產(chǎn))的上部靜靜地分為多層，用洗脫緩沖液〔由0.25％脫氧膽酸鈉(和光純藥社生產(chǎn))、0.2M氯化鈉、5mMEDTA以及10mM Tris-鹽酸構(gòu)成，pH8.3〕以16ml/小時(shí)的流速洗脫出800ml(50小時(shí))。
使用蠕動(dòng)移液泵PI(Pharmasia公司生產(chǎn))控制流速，同時(shí)用餾分收集器(Adobanteck公司生產(chǎn)，SF2120)分離得到的洗脫液，棄掉最初的240ml(24餾分)，之后以10ml/餾分分餾至80餾分。對(duì)于洗脫出的各餾分，用原液或稀釋液，通過酚/硫酸法(福井作藏，“還原糖果的定量法·第2版”，第50～52頁(yè)，學(xué)會(huì)出版中心，1990年)對(duì)糖進(jìn)行定量，考察洗脫狀態(tài)。根據(jù)所得洗脫狀態(tài)的結(jié)果預(yù)測(cè)存在LPS的餾分(餾分30～60)中，使用餾分37～55各餾分0.5ml進(jìn)行SDS-PAGE，考察LPS餾分圖形。
結(jié)果，確認(rèn)餾分45～55僅為低分子量(分子量約5000)LPS，餾分37～44包括高分子量和低分子量?jī)煞NLPS，因此對(duì)餾分45～55的低分子量LPS部分如下所述進(jìn)一步純化。
將各部分混合，冷凍干燥，懸濁于乙醇中，離心分離除去可溶于乙醇的脫氧膽酸，將低分子量LPS回收至不溶性部分。再反復(fù)用乙醇處理低分子量LPS部分2次，除去脫氧膽酸，再次懸濁于70％乙醇中，離心分離除去緩沖液成分，該操作再反復(fù)進(jìn)行3次，將低分子量LPS回收至不溶性部分，冷凍干燥，得到純化的低分子量LPS約20mg。實(shí)施例1(低分子量LPS對(duì)甲殼類的安全性)將平均體重為20g的對(duì)蝦分為5組，每組20尾，由第3腹節(jié)肌肉內(nèi)給藥，將本發(fā)明的低分子量LPS(分子量約5000)投給第1、2組蝦，相對(duì)于蝦的1kg體重第1組投給50mg，第2組投給100mg，另外將現(xiàn)有高分子量LPS(來源于大腸菌的LPS,E.co1i 0111,DIFCO公司生產(chǎn)，分子量約8000～5萬(wàn))投給第3、4組蝦，第3組投給10mg，第4組投給20mg。第5組投給不含有LPS的生理鹽水。確認(rèn)直到給藥后120小時(shí)的蝦的生死，求出死亡率。結(jié)果如表1所示。表1

由表1可知，高分子量LPS的10mg以及20mg組的死亡率分別為65、100％，與此相對(duì)低分子量LPS的50mg以及100mg組均沒有出現(xiàn)死亡的個(gè)體。因此，本發(fā)明的低分子量LPS與現(xiàn)有的高分子量LPS相比，是對(duì)蝦安全性極高的物質(zhì)。實(shí)施例2(低分子量LPS對(duì)魚類的安全性)將平均體重為85g的真鯛分為3組，每組40條，由背部肌肉內(nèi)給藥，將低分子量LPS投給第1組，相對(duì)于真鯛的1kg體重投給100mg，將高分子量LPS(E.Coli 0111,DIFCO公司生產(chǎn))投給第2組，投給20mg。第3組投給不含有LPS的生理鹽水。確認(rèn)直到給藥后120小時(shí)的真鯛的生死，求出死亡率。結(jié)果如表2所示。表2

由表2可知，高分子量LPS 20mg組的死亡率為85％，與此相對(duì)低分子量LPS 100mg組根本沒有出現(xiàn)死亡的個(gè)體。因此，本發(fā)明的低分子量LPS與現(xiàn)有的高分子量LPS相比，是對(duì)魚類安全性極高的物質(zhì)。實(shí)施例3(對(duì)甲殼類中血細(xì)胞的吞食能力的激活作用)將平均體重為20g的對(duì)蝦分為6組，每組20尾，對(duì)于本發(fā)明組的1、2、3組，相對(duì)于蝦的每1kg體重1日分別給予混有20、40、100μg低分子量LPS的飼料，另外對(duì)于第4組給予混有高分子量LPS 100μg的飼料，對(duì)于第5組給予混有高分子量LPS 1000μg的飼料，給予7天。對(duì)于第6組給予不含有LPS的飼料。給藥開始0、1、5、7天后，使用裝有含L-半胱氨酸作為抗凝固劑的K-199培養(yǎng)基的注射器，由蝦的胸洞取血，離心分離得到血細(xì)胞。將每1μl懸濁液中1×105細(xì)胞的血細(xì)胞與1×108個(gè)的乳膠顆粒(直徑1.986μm)混合，在25℃下反應(yīng)30分鐘后，用戊二醛固定后風(fēng)干。風(fēng)干后，用吉姆薩液(Giemsa)染色，用優(yōu)試劑盒(Eukit)固定在載玻片上，每1尾蝦制作5片這種標(biāo)本，使用反射熒光顯微鏡，隨機(jī)觀察每1片標(biāo)本上的200個(gè)血細(xì)胞，考察血細(xì)胞的乳膠顆粒吞食率、每1個(gè)血細(xì)胞攝取的顆粒數(shù)，按照下式求出吞食指數(shù)。
吞食率=〔攝取顆粒的血細(xì)胞數(shù)/觀察的血細(xì)胞總數(shù)〕×100平均攝取數(shù)=攝入到血細(xì)胞中的顆粒數(shù)/攝取顆粒的血細(xì)胞數(shù)吞食指數(shù)=〔攝取顆粒的血細(xì)胞數(shù)/觀察的血細(xì)胞總數(shù)〕×〔攝入到血細(xì)胞中的顆粒數(shù)/觀察的血細(xì)胞總數(shù)〕×100試驗(yàn)結(jié)果甲殼類的生物體防御機(jī)構(gòu)由細(xì)胞性因子和液性因子構(gòu)成，前者與血細(xì)胞對(duì)異物的吞食能力關(guān)系密切，因此是否激活了蝦的生物體防御能力可以通過考察血細(xì)胞對(duì)異物的吞食活性得知〔高橋幸則等，魚病研究30(2),141～150(1995)〕。因此，觀察本發(fā)明的低分子量LPS組與高分子量LPS組在給藥開始0、1、5、7天后的吞食指數(shù)，如表3所示。表3


*1與第6組之間存在顯著差異(P＜0.05)*2與第6組之間存在顯著差異(P＜0.01)由表3可知，投給低分子量LPS的蝦的血細(xì)胞吞食指數(shù)任何本發(fā)明組均比第6組高，存在顯著差異(P＜0.01、0.05)。但是，投給100μg現(xiàn)有高分子量LPS的蝦的血細(xì)胞的吞食指數(shù)在給藥1、5、7天后均未上升，1000μg組在給藥5、7天后也比第6組顯著升高(P＜0.05)。由以上可知，本發(fā)明的低分子量LPS與高分子量LPS相比，即使極微量也可以激活蝦血細(xì)胞的吞食活性等生物體防御能力。實(shí)施例4(對(duì)甲殼類中血細(xì)胞的酚氧化酶的激活作用)將平均體重為20g的對(duì)蝦分為6組，每組20尾，對(duì)于本發(fā)明組的1、2、3組，相對(duì)于蝦的每1kg體重1日分別給予混有20、40、100μg低分子量LPS的飼料，另外對(duì)于第4組給予混有高分子量LPS 100μg的飼料，對(duì)于第5組給予混有高分子量LPS 1000μg的飼料，給予7天。對(duì)于第6組給予不含有LPS的飼料。給藥開始0、1、5、7天后，使用裝有含EDTA的KHE培養(yǎng)基的注射器，由蝦的胸洞取血，離心分離得到血細(xì)胞。將得到的血細(xì)胞懸濁在Ca-Mg Hepes培養(yǎng)基中，達(dá)到1×106細(xì)胞/ml后，通過冷凍融解和超聲波破壞，離心分離，用膜濾器過濾得到的上清液。將該液900μl與作為基質(zhì)溶液的L-DOPA溶液100μl混合后，在60℃下反應(yīng)60分鐘，用分光光度計(jì)測(cè)定490nm處的吸光度，作為酚氧化酶(PO)的活性。
試驗(yàn)結(jié)果甲殼類的生物體防御機(jī)構(gòu)由細(xì)胞性因子和液性因子構(gòu)成，后者與血細(xì)胞的PO活性關(guān)系密切，因此是否激活了蝦的生物體防御能力可以通過考察PO活性得知。因此，觀察本發(fā)明的低分子量LPS組與高分子量LPS組在給藥開始0、1、5、7天后的PO活性，如表4所示。表4

*1與第6組之間存在顯著差異(P＜0.05)*2與第6組之間存在顯著差異(P＜0.05)由表4可知，投給低分子量LPS的蝦的血細(xì)胞PO活性任何本發(fā)明組均比第6組高，存在顯著差異(P＜0.01、0.05)。但是，投給100μg現(xiàn)有高分子量LPS的蝦的血細(xì)胞P活性直到給藥7天后都沒有上升，1000μg組在給藥5、7天后也比第6組顯著升高(P＜0.05)。由以上可知，本發(fā)明的低分子量LPS與高分子量LPS相比，即使極微量也可以激活蝦血細(xì)胞的吞食活性等生物體防御能力。實(shí)施例5(對(duì)于對(duì)蝦急性病毒血癥的預(yù)防效果)將平均體重為14g的對(duì)蝦分為5組，每組20尾，對(duì)于本發(fā)明組的1、2、3組，相對(duì)于蝦的每1kg體重1日分別給予混有20、40、100μg低分子量LPS的飼料，另外對(duì)于第4組給予混有高分子量LPS 1000μg的飼料，給予18天。對(duì)于第5組給予混有特許第2547371號(hào)公報(bào)記載的來源于嗜熱雙歧桿菌(Bifidobacterium thermophilum)的肽聚糖(PG)達(dá)到0.2mg/kg(200μg/kg)的飼料，對(duì)于第6組給予混有特公平6-65649號(hào)公報(bào)記載的來源于裂褶菌屬(Schizophyllum)的β-1,3-聚糖(1,3-G)達(dá)到50mg/kg(50000μg/kg)的飼料，給予18天。對(duì)于第7組的對(duì)照組給予不含有LPS的飼料。
開始給予LPS 8天后，使用引起對(duì)蝦急性病毒血癥的病毒PRDV(penaeid rod-shaoed DNA virus)急性感染試驗(yàn)。感染方法是將患這種病死亡的3尾對(duì)蝦的頭胸部甲皮剝掉后，在40ml的滅菌海水中勻化，離心分離(10000×g,10分鐘，4℃)，將得到的上清液10ml加入到20升海水中。通過將開始給予LPS 8天后的蝦在其中浸漬2小時(shí)的方法使之感染。觀察感染后10天的死亡狀況，對(duì)于死亡的蝦進(jìn)行病理學(xué)以及采用PCR(Polymerase chain reaction)法的檢查，確認(rèn)PRDV引起的死亡。
試驗(yàn)結(jié)果本發(fā)明的低分子量LPS組、高分子量LPS組以及LPS未添加組在PRDV感染后對(duì)蝦的累積死亡尾數(shù)和死亡率如表5～6所示。表5

*數(shù)字表示累積死亡只數(shù)(其它相同)表6

**與第7組之間有顯著差異(P＜0.05)***與第7組之間有顯著差異(P＜0.01)被PRDV感染后，投給未添加LPS飼料的對(duì)照組的蝦在9天以內(nèi)100％的死亡，與此相對(duì)本發(fā)明組的死亡率是低分子量LPS 20μg組為20％、40μg組為35％、100μg組為40％，都很低，與對(duì)照區(qū)之間有顯著差異(P＜0.01)。另一方面，投給高分子量LPS 1000μg的蝦的死亡率為55％，投給0.2mg PG的蝦的死亡率為50％，投給50mg1,3-G的蝦的死亡率為60％，與投給低分子量LPS的各組相比，大多數(shù)蝦死亡。從以上結(jié)果可以看出，本發(fā)明的低分子量LPS能夠預(yù)防蝦被病毒感染，其效果比現(xiàn)有高分子量LPS優(yōu)良。實(shí)施例6(對(duì)魚類免疫機(jī)能的激活作用)將平均體重為230g的師魚分成6組，每組20條，對(duì)于本發(fā)明組的1、2、3組，相對(duì)于師魚的每1kg體重1日分別給予混有20、40、100μg低分子量LPS的濕丸，另外對(duì)于第4組給予混有高分子量LPS100μg的濕丸，對(duì)于第5組給予混有高分子量LPS1000μg的濕丸，給予7天。對(duì)于第6組投給不含LPS的濕丸。在投給后的0、1、5、7天分別摘除5條師魚的頭腎，在裝有添加了0.25％NaCl的RPMI-1640-HAH培養(yǎng)基的塑料培養(yǎng)皿內(nèi)分離血細(xì)胞，通過細(xì)胞過濾器，得到細(xì)胞懸濁液。將該液體在percoll不連續(xù)密度梯度上分成多層，以1600rpm的速度，離心分離20分鐘(4℃)，得到白細(xì)胞層。
收集該層后，離心洗滌，懸濁在含有10％FBS(Fetal Bovire Serum)添加了0.25％NaCl的RPMI-1640-H培養(yǎng)基中，將白細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)調(diào)整至1×106細(xì)胞/ml。將該白細(xì)胞懸濁液500μl和在師魚血清中調(diào)理素化的酵母懸濁液(1×108細(xì)胞/ml)500μl裝入硅處理的玻璃試管中，每隔10分鐘攪拌1次，同時(shí)在25℃下培養(yǎng)60分鐘。培養(yǎng)結(jié)束后，每個(gè)師魚制作5片涂抹標(biāo)本，進(jìn)行瑞特氏染色，用優(yōu)試劑盒(Eukit)密封。再通過光學(xué)顯微鏡隨機(jī)觀察每片標(biāo)本的200個(gè)血細(xì)胞，研究白細(xì)胞的酵母吞食數(shù)，按照與實(shí)施例3同樣的計(jì)算公式求出吞食指數(shù)。結(jié)果如表7～8所示。表7

*1與第6組之間有顯著差異(P＜0.05)*2與第6組之間有顯著差異(P＜0.01)表8

*1與第6組之間有顯著差異(P＜0.05)*2與第6組之間有顯著差異(P＜0.01)由表7～8可以看出，投給低分子量LPS的師魚的白細(xì)胞的吞食指數(shù)，任何發(fā)明組都比第6組高，并且有顯著差異(P＜0.01、P＜0.05)。但是，投給現(xiàn)有高分子量LPS 100μg的師魚的白細(xì)胞的吞食指數(shù)直到投給7天后都沒有上升，1000μg組在投給5天以后比6組顯著增高(P＜0.01)。從以上可以看出，本發(fā)明的低分子量LPS與高分子量LPS相比，即使極微量也可以激活白細(xì)胞的吞食作用等魚類的免疫機(jī)能。實(shí)施例7(對(duì)師魚腸球菌癥的預(yù)防效果)
將平均體重為63g的師魚分成5組，每組30條，對(duì)于本發(fā)明組的1、2、3組，相對(duì)于蝦的每1kg體重1日分別給予混有20、40、100μg低分子量LPS的濕丸，另外對(duì)于第4組給予混有高分子量LPS 1000μg的濕丸，每天都給予。對(duì)于第5組的對(duì)照區(qū)，投給不含LPS的濕丸。在投給開始7天后，向每條師魚腹腔內(nèi)接種4.0×106個(gè)引起師魚腸球菌癥的Enterococcus seriolicida，求出接種后15天的死亡率。結(jié)果如表9～10所示。表9

*數(shù)字表示累積死亡條數(shù)(其它也相同)表10

**與第5組之間有顯著差異(P＜0.05)***與第5組之間有顯著差異(P＜0.01)接種E.Seriolicida15天后，投給未添加LPS的飼料的對(duì)照區(qū)的師魚73.3％死亡，與此相對(duì)本發(fā)明組的死亡率是低分子量LPS20μg組為13.3％、40μg組為26.7％、100μg組為23.3％，都很低，與對(duì)照區(qū)之間有顯著性差異(P＜0.05)。另一方面，投給高分子量LPS 1000μg的師魚的死亡率為36.7％，與低分子量LPS的各組相比顯示較高的死亡率。從以上結(jié)果可以看出，本發(fā)明的低分子量LPS能夠預(yù)防魚類被細(xì)菌感染，其效果比現(xiàn)有高分子LPS優(yōu)良。
工業(yè)實(shí)用性按照本發(fā)明，可以提供一種以極微量即可激活甲殼類和魚類的免疫機(jī)能，預(yù)防感染癥，并且預(yù)防甲殼類和魚類死亡，沒有藥物殘留等公共衛(wèi)生發(fā)明的問題，安全的用于養(yǎng)殖甲殼類和魚類的飼料添加劑和飼料。
權(quán)利要求
1.具有免疫激活、預(yù)防感染效果的甲殼類或魚類用飼料添加劑，其特征在于含有低分子量脂多糖為有效成分，該低分子量脂多糖由革蘭氏陰性的微生物菌體得到，用蛋白質(zhì)標(biāo)記物并采用SDS-PAGE法測(cè)定出的分子量為5000±2000，且實(shí)質(zhì)上不含有高分子量脂多糖。
2.甲殼類或魚類用飼料添加劑，含有如權(quán)利要求1所述的低分子量脂多糖以及甲殼類和魚類允許的載體。
3.權(quán)利要求1所述的低分子量脂多糖在制造甲殼類或魚類用飼料添加劑中的用途。
4.甲殼類或魚類的免疫激活、預(yù)防感染的方法，其特征在于將有效量的權(quán)利要求1所述的低分子量脂多糖投給甲殼類或魚類。
5.甲殼類或魚類的死亡預(yù)防劑，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的低分子量脂多糖作為有效成分。
6.甲殼類或魚類的死亡預(yù)防劑，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的低分子量脂多糖以及藥學(xué)上允許的載體。
7.權(quán)利要求1所述的低分子量脂多糖在制造甲殼類或魚類的死亡預(yù)防劑中的用途。
8.甲殼類或魚類的死亡預(yù)防方法，其特征在于將有效量的權(quán)利要求1所述的低分子量脂多糖投給甲殼類或魚類。
9.如權(quán)利要求1所述的甲殼類或魚類用飼料添加劑，革蘭氏陰性的微生物菌體是屬于泛菌屬的微生物菌體。
10.如權(quán)利要求9所述的甲殼類或魚類用飼料添加劑，革蘭氏陰性的微生物菌體是成團(tuán)泛菌。
11.甲殼類或魚類用飼料，其特征在于添加權(quán)利要求1所述的飼料添加劑。
12.甲殼類或魚類用飼料，其特征在于添加權(quán)利要求5所述的死亡預(yù)防劑。
13.甲殼類或魚類的養(yǎng)殖方法，其特征在于將權(quán)利要求11所述的飼料投給甲殼類或魚類。
14.甲殼類或魚類的養(yǎng)殖方法，其特征在于將權(quán)利要求12所述的飼料投給甲殼類或魚類。
15.如權(quán)利要求1所述的甲殼類或魚類用飼料添加劑，感染癥是甲殼類的急性病毒血癥、弧菌病、寄生蟲病、真菌病，魚類的桿狀病毒病、神經(jīng)壞死、傳染性造血器官壞死病、類結(jié)節(jié)病、鏈球菌癥、腸球菌癥、弧菌病、冷水病、假單胞菌病、滑走細(xì)菌病、水霉病。
16.如權(quán)利要求1所述的甲殼類或魚類用飼料添加劑，高分子量脂多糖是具有8000以上的分子量的物質(zhì)。
全文摘要
具有免疫激活、預(yù)防感染效果的甲殼類或魚類用飼料添加劑,其特征在于含有低分子量脂多糖為有效成分,該低分子量脂多糖由革蘭氏陰性的微生物菌體得到,用蛋白質(zhì)標(biāo)記物并采用SDS－PAGE法測(cè)定出的分子量為5000±2000,且實(shí)質(zhì)上不含有高分子量脂多糖;以及添加有它們的甲殼類或魚類用飼料。
文檔編號(hào)A61K31/739GK1306399SQ00800398
公開日2001年8月1日 申請(qǐng)日期2000年3月23日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月26日
發(fā)明者杣源一郎, 高橋幸則, 水野傳一 申請(qǐng)人:杣源一郎, 高橋幸則, 大鵬藥品工業(yè)株式會(huì)社