專利名稱：預(yù)防或治療癌癥及與癌癥相關(guān)的骨損失的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及預(yù)防和/或治療與癌癥相關(guān)的骨損失的組合物和方法。更具體而言，本發(fā)明涉及包含OPG的組合物以及包含該組合物的預(yù)防和/或治療骨損失的方法。本發(fā)明還涉及OPG組合物治療多發(fā)性骨髓瘤的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
許多癌癥可以在遠(yuǎn)離腫瘤生長(zhǎng)初始位置的組織和器官內(nèi)建立。這種腫瘤，叫做轉(zhuǎn)移性腫瘤，可引起廣泛的并發(fā)癥，而這些并發(fā)癥經(jīng)常是致死性的。骨骼是實(shí)體腫瘤擴(kuò)散的一個(gè)好發(fā)部位，僅次于肝和肺。腫瘤細(xì)胞侵襲的結(jié)果是破骨細(xì)胞，促進(jìn)骨吸收的骨內(nèi)的主要吸收，被過(guò)度活化并開始加速破壞骨骼。破骨細(xì)胞被諸如甲狀旁腺激素相關(guān)的肽(PTHrP)和白細(xì)胞介素-1(IL-1)等物質(zhì)激活，這些物質(zhì)在骨的微環(huán)境中增加，也可由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生。作為破骨細(xì)胞活性增加的結(jié)果，患有骨癌的病人常發(fā)展為溶解性的骨損傷。這種情況叫做溶骨性骨轉(zhuǎn)移。骨溶解可導(dǎo)致病理性骨折、脊萎縮、高鈣血癥以及骨痛，是引發(fā)死亡率和發(fā)病率的一個(gè)主要原因。另外一種情況是，如在前列腺癌骨轉(zhuǎn)移中，破骨細(xì)胞性骨損傷的增加伴隨有骨形成的增加，但這種增加沒(méi)有組織性(Kylmaelae等，Brit.J.Cancer 71，1061-1064(1995))。原來(lái)的骨被去除了，被替代成網(wǎng)狀無(wú)結(jié)構(gòu)的骨，以至于骨結(jié)構(gòu)上的整合性損失。這也可導(dǎo)致骨痛和其它發(fā)病。
除此之外，破骨細(xì)胞活化可增加腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到骨然后在該環(huán)境下生長(zhǎng)的習(xí)性。已證實(shí)破骨細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，如IL-6，它是一些血液腫瘤細(xì)胞，如多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞，的生長(zhǎng)因子(O″Keefe等，Lab.Invest.76，457-465(1997))。此外，證實(shí)在骨吸收的過(guò)程中破骨細(xì)胞從骨基質(zhì)中釋放出生長(zhǎng)因子。它們包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β，已知它們促進(jìn)許多實(shí)體瘤的生長(zhǎng)。破骨細(xì)胞的活性就能以這種方式在骨內(nèi)給轉(zhuǎn)移性播種創(chuàng)造一個(gè)生育環(huán)境，并且隨著腫瘤細(xì)胞開始生長(zhǎng)以及促進(jìn)骨吸收，破骨細(xì)胞的活性能引起生長(zhǎng)因子從骨內(nèi)釋放以維持腫瘤擴(kuò)展。
目前可獲得的腫瘤治療劑可以減少或抑制腫瘤生長(zhǎng)，但對(duì)進(jìn)行性溶解性骨病的效果很小。據(jù)報(bào)道，一些化療方案實(shí)際上歸功于與血液系統(tǒng)惡性腫瘤相關(guān)的骨損失，如多發(fā)性骨髓瘤和何杰金氏疾病以及促性腺激素釋放的激素受體激動(dòng)劑情況下的骨損失。一但腫瘤擴(kuò)散到骨，就很難用目前的方案進(jìn)行治療。因此期望能早期預(yù)防骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生并治療骨轉(zhuǎn)移以預(yù)防骨損失。
骨抗吸收劑抑制破骨細(xì)胞的數(shù)目和/或活性，并減低骨破壞的速率。這些試劑也許可用于預(yù)防和/或治療與骨癌相關(guān)的骨吸收。據(jù)報(bào)道雙磷酸鹽(bisphosphonates)，如risedronate、ibandronate和pamidronate，它們是抗吸收的化合物，可以在小鼠腫瘤模型中以及患有乳腺癌和多發(fā)性骨髓瘤和其它腫瘤的骨轉(zhuǎn)移的病人中降低骨事件(如病理性骨折、脊萎縮、骨手術(shù)或放療)的嚴(yán)重性。此外有報(bào)道說(shuō)雙磷酸鹽可降低前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的骨痛和其它骨骼事件。但是，雙磷酸鹽的效果有限，即使輸入高劑量的雙磷酸鹽才在骨事件中產(chǎn)生少量的降低。當(dāng)口服時(shí)，雙磷酸鹽的效果降低，并能引起胃腸道刺激(如胃灼熱、消化不良和惡心)，如果施用不當(dāng)某些情況下可引起食道潰瘍。
Osteoprotegerin(OPG)在PCT WO97/23614中有過(guò)描述，并發(fā)現(xiàn)它體外和體內(nèi)負(fù)向調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的形成。在表達(dá)OPG多肽的轉(zhuǎn)基因小鼠中，OPG可提高骨密度，當(dāng)它用到卵巢切除的大鼠中時(shí)可減低骨損失的程度。OPG在體外破骨細(xì)胞形成中的活性分析表明OPG阻斷破骨細(xì)胞從單核/巨噬細(xì)胞前體的分化。OPG似乎在調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞形成的程度中有特異性。OPG是阻斷骨吸收的有效因子，并且可用于預(yù)防或治療骨質(zhì)的損失。同樣觀察到，包括OPG和一Fc功能區(qū)的融合蛋白體內(nèi)外均具有抑制破骨細(xì)胞形成和阻斷骨損失的活性。
因此本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)就是提供治療癌癥相關(guān)骨損失的其它方法和組合物，它能克服目前治療中存在的許多問(wèn)題。
本發(fā)明的再一個(gè)目標(biāo)是提供其它預(yù)防癌癥相關(guān)骨損失的方法和組合物，它是通過(guò)預(yù)防性治療來(lái)降低骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生和/或延遲骨轉(zhuǎn)移的發(fā)病。
本發(fā)明的再一個(gè)目標(biāo)是提供預(yù)防和/或治療多發(fā)性骨髓瘤的其它方法和組合物。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物溶解性骨疾病的方法，它包括施用治療有效量的OPG多肽。溶解性骨病在患有轉(zhuǎn)移性骨腫瘤的哺乳動(dòng)物中經(jīng)?？吹?。這種腫瘤的實(shí)例包括有乳腺癌，前列腺癌，甲狀腺癌，腎臟腫瘤，肺、食管、直腸、膀胱和官頸癌，以及胃腸道的腫瘤。也包括某些血液系統(tǒng)的惡性腫瘤，如多發(fā)性骨髓瘤，白血病和淋巴瘤，如何杰金氏疾病。還包括轉(zhuǎn)移性骨病，該疾病增加骨吸收和骨形成，從而導(dǎo)致與骨病相關(guān)的骨硬化性骨轉(zhuǎn)移或溶解性的和骨硬化性的混合性轉(zhuǎn)移，以及骨結(jié)構(gòu)整合性的損失，如同在前列腺癌中那樣。
本發(fā)明還提供一種預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移到骨骼的方法，它包括施用治療有效量的OPG多肽。
本發(fā)明還提供一種預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)移性骨疾病的方法，它包括施用治療有效量的OPG多肽，與腫瘤治療劑聯(lián)合應(yīng)用。腫瘤治療劑可以是常用的治療腫瘤生長(zhǎng)的任何一種，包括放療和化療劑。這些藥劑的例子包括蒽環(huán)類，紫杉酚，三苯氧胺，抗體，如抗Her2抗體或抗CD20抗體，受體激動(dòng)劑和拮抗劑，如黃體化激素釋放激素(LHRH)拮抗劑。OPG多肽組合物可先于腫瘤治療劑施用，或一起施用，或隨后應(yīng)用。
本發(fā)明還提供一種治療多發(fā)性骨髓瘤的方法，它包括施用治療有效量的OPG多肽。
本發(fā)明的多肽包括那些具有抑制骨吸收活性并可用于預(yù)防和/或治療骨質(zhì)損失或預(yù)防骨硬化性骨轉(zhuǎn)移(無(wú)組織的結(jié)構(gòu)缺陷骨替代了結(jié)構(gòu)完好的骨)的多肽。優(yōu)選的實(shí)施方案是，OPG多肽是包括OPG和一異源肽或蛋白質(zhì)的融合蛋白。這種融合蛋白具有較長(zhǎng)的循環(huán)半衰期和較短的清除時(shí)間，因此可提供更穩(wěn)定的抗吸收活性及較低的施用頻率。在一個(gè)方面，該異源蛋白是一免疫球蛋白Fc區(qū)，或其變異片段，或其衍生物。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了人IgGγ1 CH2區(qū)、CH3區(qū)和鉸鏈區(qū)的氨基酸序列。
圖2為OPG[1-401]的氨基酸序列。
圖3給出了OPG[22-194]-Fc的氨基酸序列。
圖4給出了OPG[22-201]-Fc的氨基酸序列。
圖5給出了OPG[22-194]-FcΔC的氨基酸序列。
圖6給出了OPG[22-201]-FcΔC的氨基酸序列。
圖7給出了OPG[22-194]-FcG10的氨基酸序列。
圖8給出了FcΔC-OPG[22-194]的氨基酸序列。
圖9顯示了在腫瘤轉(zhuǎn)移至骨的C26-DCT和MDA-MB-231模型中骨溶性骨破壞的預(yù)防。直接注射到小鼠的左心室后兩種細(xì)胞類型均造成局部的骨破壞(黃箭頭)。左邊的圖表明施用C26-DCT細(xì)胞10天后X光線照片上的損傷明顯，施用MDA-MB-231細(xì)胞28天后明顯。右邊的圖顯示用metFcΔC-OPG[22-194]治療(25mg/kg)，C26-DCT小鼠每3天一次，治療10天，MDA-MB-231小鼠每周3次共4周，對(duì)損傷形成的預(yù)防。
圖10顯示了注射了C26-DCT細(xì)胞的小鼠射線照相中骨溶灶數(shù)目的減少對(duì)metFcΔC-OPG[22-194]的劑量依賴性。
圖11A和11B顯示了在小鼠C26-DCT腫瘤模型中與惡性腫瘤相關(guān)的高鈣血癥的預(yù)防和逆轉(zhuǎn)。在預(yù)防性研究中，met FcΔC-OPG[22-194]每天皮下注射。在逆轉(zhuǎn)研究中，met FcΔC-OPG[22-194]通過(guò)單次靜脈內(nèi)注射施用。報(bào)告的是平均血鈣值±SEM。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供預(yù)防和治療腫瘤相關(guān)骨損失的組合物和方法。本發(fā)明也提供應(yīng)用抗骨吸收的制劑來(lái)預(yù)防和治療腫瘤的方法。本發(fā)明優(yōu)選的組合物和方法包括OPG和OPG融合多肽。更具體而言，本發(fā)明涉及應(yīng)用OPG融合蛋白組合物來(lái)預(yù)防和/或治療腫瘤，或者預(yù)防和/或治療腫瘤相關(guān)的骨損失。
出乎意料的是，我們發(fā)現(xiàn)Fc區(qū)與截短了的OPG多肽融合優(yōu)于未融合的截短了的OPG多肽或全長(zhǎng)的成熟OPG(如圖2所示(SEQ IDNO2)，全長(zhǎng)成熟OPG有380個(gè)氨基酸，從22-401)。還發(fā)現(xiàn)Fc區(qū)在OPG多肽的羧基端融合時(shí)，與在OPG多肽氨基端發(fā)生融合時(shí)相比，顯示出意料之外的優(yōu)勢(shì)。因此，下面對(duì)OPG多肽、其變異體、片段和其衍生物，以及相關(guān)的應(yīng)用和制備方法進(jìn)行更詳細(xì)地描述。
“OPG”或“OPG多肽”指包括圖2(SEQ ID NO2)中氨基酸序列的多肽及這里描述的相關(guān)多肽。相關(guān)多肽包括等位基因變異體，剪接變異體，片段，衍生物，替代、缺失和插入的變異體，融合多肽和非人類同源體。如這里定義的，OPG多肽可以是成熟多肽，它可以有或可以沒(méi)有氨基末端的甲硫氨酸殘基，這依賴于其制備方法。
“OPG融合蛋白”是指與一異源肽或蛋白連接的OPG蛋白或OPG多肽。本發(fā)明的OPG融合蛋白可以用該領(lǐng)域內(nèi)任何適宜的方法進(jìn)行制備，如通過(guò)遺傳的或化學(xué)方式將OPG和異源肽或多肽的部分融合。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，異源肽或多肽是免疫球蛋白的Fc區(qū)，優(yōu)選人類的免疫球蛋白。
“成熟的OPG多肽”或“成熟的OPG融合多肽”是指缺乏引導(dǎo)序列并也可包括其它修飾的多肽或融合多肽，其它修飾有，如氨基端(有或無(wú)引導(dǎo)序列)和/或羧基端的蛋白水解過(guò)程，從一大的前體上切下一小的多肽，N-連接和/或O-連接的糖基化等。
“Fc”指包括抗體的非抗原結(jié)合部分序列的分子或序列，無(wú)論是單體形式還是聚合物形式。Fc的起始來(lái)源優(yōu)選人源，可以來(lái)自任何一同工型，如IgG、IgA、IgM、IgE或IgD。制備獨(dú)立的Fc分子的一種方法包括用木瓜蛋白酶消化抗體，將抗體分成抗原結(jié)合部分和非抗原結(jié)合部分。制備獨(dú)立的Fc分子的另一種方法是由重組DNA表達(dá)產(chǎn)生，然后對(duì)表達(dá)的Fc分子進(jìn)行純化。一個(gè)全長(zhǎng)的Fc包括下列Ig重鏈區(qū)CH1、CH2和CH3，其中CH1和CH2區(qū)由一個(gè)可彎曲的鉸鏈區(qū)連接。在一實(shí)施方案中，F(xiàn)c具有如圖1所示的IgG1的氨基酸序列?！癋c蛋白”、“Fc序列”、“Fc分子”、“Fc區(qū)”和“Fc部分”與“Fc”意義相同。
當(dāng)“片段”與Fc或OPG多肽，或其融合蛋白關(guān)聯(lián)應(yīng)用時(shí)，它指包括小于Fc或OPG多肽全長(zhǎng)氨基酸序列的肽或多肽。這樣的片段可來(lái)自，例如，氨基端的截短，羧基端的截短，和/或氨基酸序列殘基的內(nèi)部缺失。OPG或Fc片段還可從RNA剪切或從體內(nèi)蛋白活性得到。
當(dāng)“變異體”與Fc或OPG多肽，或與其融合多肽用在一起時(shí)，它指的是一種多肽，該多肽包括的氨基酸序列與原本Fc或OPG多肽氨基酸序列比較時(shí)，包含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列的替代、缺失和/或添加。變異體可以是自然產(chǎn)生的或是人工構(gòu)建的。本發(fā)明的變異體可由編碼該變異體的相應(yīng)核酸分子制備，該核酸分子具有的DNA序列與原本Fc或OPG多肽的DNA序列不同。
當(dāng)“衍生物”與Fc或OPG多肽，或與其融合蛋白一起應(yīng)用時(shí)，它是指Fc或OPG多肽的變異體或其片段，它們被化學(xué)修飾過(guò)，例如，一個(gè)或多個(gè)聚合物的共價(jià)粘附，聚合物包括并限于水溶性聚合物，N-連接或O-連接的糖鏈，糖，磷酸鹽和/或其它類似分子。這些衍生物以不同于天然Fc或OPG的方式被修飾，屬于粘附到多肽的分子的類型或位于該分子中。衍生物還包括一個(gè)或多個(gè)天然粘附到Fc或OPG多肽的化學(xué)基團(tuán)的缺失。
“融合”是指不同的肽或蛋白段的連接，其中肽或蛋白段的連接末端可以直接彼此毗鄰，或被連接體(linker)或間隔子(spacer)部分，如氨基酸殘基分離，或被其它連接基團(tuán)分離。融合可通過(guò)遺傳學(xué)或化學(xué)手段，應(yīng)用該領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的程序來(lái)完成，但連接手段并不限于這里提到的這些。多肽本發(fā)明提供OPG融合多肽及其組合物，更具體而言，提供包括OPG和Fc部分的融合多肽。Fc區(qū)與OPG多肽的融合可在OPG的氨基端進(jìn)行，即Fc區(qū)的羧基端融合到OPG的氨基端。這里把這些融合蛋白(和編碼它們的核酸)標(biāo)記為FcOPG。OPG羧基端融合到Fc區(qū)的氨基端也是可行的。這里我們把這樣的融合蛋白(和編碼它們的核酸)記作OPGFc。
Fc或其變異體、片段或衍生物，可來(lái)自免疫球蛋白(Ig)類。一實(shí)施方案中，F(xiàn)c來(lái)自IgG，如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在另一實(shí)施方案中，F(xiàn)c來(lái)自IgG1。Fc還可包括任何兩種或多種Ig類合并所代表的氨基酸殘基，如IgG1和IgG2殘基或來(lái)自IgG1、IgG2和IgG3等的殘基。在一實(shí)施方案中，OPG融合蛋白的Fc區(qū)具有下圖1中的序列(SEQID NO)，包括人類IgG1CH2和CH3區(qū)的鉸鏈區(qū)(參見Ellison等，Nucleic Acids Res，10，4071-4079(1982))。
Fc區(qū)、Fc變異體、片段和衍生物中除有自然發(fā)生的變異外，也包含F(xiàn)c內(nèi)非自然發(fā)生的變化，這種變化通過(guò)，例如，在天然或自然產(chǎn)生的Fc中導(dǎo)入替代、添加、插入或缺失的殘基或序列，或通過(guò)化學(xué)修飾等手段修飾Fc部分?？傮w上講，F(xiàn)c變異體、片段和衍生物的制備原則是融合到OPG的Fc循環(huán)半衰期的增加能大大維持。
本發(fā)明還提供的是具有保守氨基酸替換的Fc和OPG變異體?！氨Ｊ氐陌被崽娲笔侵高@樣一種替代非天然氨基酸替代天然氨基酸殘基，而對(duì)該位置氨基酸殘基的極性或電荷的影響甚小或無(wú)。例如，用任何其它非極性殘基替代多肽中非極性殘基而產(chǎn)生的保守替換。保守氨基酸替換的普通原則列于表1。
表1保守的氨基酸替換原來(lái)的殘基 替換舉例優(yōu)選替換丙氨酸 纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸纈氨酸精氨酸 賴氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺 賴氨酸天冬酰胺谷氨酰胺，組氨酸，賴氨酸，精氨酸谷氨酰胺天冬氨酸谷氨酸 谷氨酸半胱氨酸絲氨酸 絲氨酸谷氨酰胺天冬酰胺天冬酰胺谷氨酸 精氨酸 精氨酸甘氨酸 脯氨酸，丙氨酸 丙氨酸組氨酸 天冬酰胺，谷氨酰胺，賴氨酸，精氨酸 精氨酸異亮氨酸亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、 亮氨酸苯丙氨酸，正亮氨酸亮氨酸 正亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、 異亮氨酸丙氨酸、苯丙氨酸賴氨酸 精氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺 精氨酸甲硫氨酸亮氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸 亮氨酸苯丙氨酸亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、 亮氨酸酪氨酸脯氨酸 丙氨酸 丙氨酸絲氨酸 蘇氨酸 蘇氨酸蘇氨酸 絲氨酸 絲氨酸色氨酸 酪氨酸、苯丙氨酸酪氨酸酪氨酸 色氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、絲氨酸苯丙氨酸纈氨酸 異亮氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、 亮氨酸丙氨酸、正亮氨酸保守性氨基酸也包含非自然發(fā)生的氨基酸殘基，它們典型地通過(guò)化學(xué)肽合成而整合入的，而非生物合成的。這些包括肽的模擬物，和其它反相或顛倒形式的氨基酸部位。氨基酸序列的保守性修飾(以及編碼核酸的相應(yīng)修飾)是希望使Fc和OPG分子(以及OPG融合蛋白)與那些未經(jīng)修飾的Fc、OPG和OPG融合蛋白具有功能上和化學(xué)上的相似性。
除表1中列出的替代外，在Fc區(qū)或OPG多肽(或在FcOPG融合蛋白)中的任何天然殘基均可被丙氨酸替代，如以前描述的“Alaninescanning mutagenesis”(Cunningham等，Science 244，1081-1085(1989))。
對(duì)Fc或OPG多肽(和OPG融合蛋白質(zhì))功能上和/或化學(xué)特性上的替代修飾可通過(guò)選擇性替換來(lái)完成，這種替換根據(jù)其發(fā)揮的效果而有顯著地差異，其效果為維持(a)替換區(qū)分子骨架的結(jié)構(gòu)，例如，片層或螺旋構(gòu)象；(b)目標(biāo)位置分子的電荷或疏水性，或者(c)側(cè)鏈的大小。根據(jù)其共同的側(cè)鏈特征，天然產(chǎn)生的殘基可分為幾組1)疏水性正亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸；2)中度嗜水半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸；3)酸性精氨酸、谷氨酸；4)堿性天冬氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、賴氨酸、精氨酸；5)影響鏈定向的殘基甘氨酸、脯氨酸；6)芳香的色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。
非保守性替換包括這些類中的一些成員換成其它類中的一些成員。這樣替換的殘基有可能被導(dǎo)入Fc或OPG分子與非人類Fc或OPG同源區(qū)域，或?qū)朐摲肿拥姆峭磪^(qū)。
Fc分子中的半胱氨酸可被去除掉或被其它氨基酸替代以預(yù)防二硫鍵交聯(lián)的形成。特別是圖1(SEQ ID NO1)位點(diǎn)5的半胱氨酸殘基可被一個(gè)或多個(gè)氨基酸，如丙氨酸或絲氨酸所替代。另外，該位置的半胱氨酸可被去除掉。
Fc片段的制備可通過(guò)去除掉圖1(SEQ ID NO1)中所示1，2，3，4，5位點(diǎn)上的任何一個(gè)或多個(gè)氨基酸進(jìn)行。在一Fc分子-FcΔC中，包括在位點(diǎn)1-5的氨基酸殘基被去除掉。也可在這些位點(diǎn)進(jìn)行替換并且替換要在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
也有可能制備的Fc變異體與Fc受體結(jié)合的能力下降，而這種結(jié)合作用可啟動(dòng)效應(yīng)功能，如抗體依賴細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)和補(bǔ)體的活化。這樣的變異體包括位點(diǎn)20的亮氨酸被去除，或被谷氨酰胺殘基替代；位點(diǎn)103的谷氨酸被去除或被丙氨酸殘基替代；位點(diǎn)105和107的賴氨酸被去除或被丙氨酸殘基替代(按圖1中所示的編號(hào))。期待有一個(gè)或多個(gè)這樣的替代。
在一實(shí)施方案中，與天然Fc相比，F(xiàn)c變異體展現(xiàn)與FcRn受體(“補(bǔ)救受體”)較強(qiáng)的結(jié)合及較長(zhǎng)的循環(huán)半衰期。這樣變異體的例子包括圖1(SEQ ID NO1)中33，35-42，59，72，75，77，95-98，101，172-174，215，220-223一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替換，其中替換使Fc變異體與FcRn受體的結(jié)合更牢固。
其它Fc變異體包括一個(gè)或多個(gè)酪氨酸殘基被諸如苯丙氨酸殘基所替代。此外，也期待其它不同氨基酸的插入、缺失和/或替代，它們也在本發(fā)明的范疇之內(nèi)。實(shí)例包括這里引用的在WO96/32478和WO97/34630中公開的Fc變異體。此外，改變也許以改變的氨基酸形式，如肽模擬物或D-氨基酸存在。
Fc蛋白也可借助間隔或連接片段連到OPG融合多肽的OPG部分。這些間隔子或連接體是蛋白樣的，即它們包括一或多個(gè)氨基酸，或者它們是化學(xué)連接體。這樣的化學(xué)連接體在該領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的。氨基酸連接體的序列包括但并不限于以下這些(a)ala-ala-ala；(b)ala-ala-ala-ala；(c)ala-ala-ala-ala-ala；(d)gly-gly；(e)gly-gly-gly；(f)gly-gly-gly-gly-gly；(g)gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly；(h)gly-pro-gly；(i)gly-gly-pro-gly-gly；(j)val；(k)ser-gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly；
(l)gly-gly-ser-gly-ser-gly-ala-gly-ser-gly-ser-gly-gly-gly-ser-gly-ser-gly-gly；(m)化學(xué)部分，和(n)(a)-(m)任何亞部分的組合。
OPG變異體、片段和衍生物也由本發(fā)明提供，如以上描述的Fc分子那樣，希望氨基酸殘基的修飾發(fā)生在特異的位點(diǎn)。OPG變異體、片段和衍生物在PCT WO97/23614中有所描述，在此引入作為參考。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，OPG融合蛋白的OPG部分是OPG截短狀態(tài)的羧基端。OPG截短形式的羧基端有一個(gè)或多個(gè)在圖2所示的186-401位點(diǎn)的氨基酸被去除掉。例如，OPG截短體包括氨基酸序列22-X，其中X是185-400的任一個(gè)殘基。在另一實(shí)施方案中，OPG截短體包括氨基酸序列22-X，其中X是185-278，或185-293，或194-278，或194-293的任一殘基。包括這里描述的OPG截短形式的多肽的融合蛋白包括OPG與異源肽或多肽的直接連接，或通過(guò)間隔分子或連接分子連接，其中間隔分子或連接分子適當(dāng)包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。這里描述的OPG截短體的變異體和衍生物也包括在本發(fā)明內(nèi)。
本發(fā)明中優(yōu)選的融合蛋白包括那些其中OPG部分包括氨基酸序列22-X的蛋白，其中的X是圖2(SEQ ID NO2)中所編碼194-201中的任何一個(gè)殘基。這樣的融合蛋白的實(shí)例包括以下這些OPG[22-194]-Fc (圖3和SEQ ID NO3)OPG[22-201]-Fc (圖4和SEQ ID NO4)OPG[22-194]-FcΔC(圖5和SEQ ID NO5)OPG[22-201]-FcΔC(圖6和SEQ ID NO6)OPG[22-194]-FcG10(圖7和SEQ ID NO7)FcΔC-OPG[22-194](圖8和SEQ ID NO8)對(duì)于優(yōu)選的多肽來(lái)說(shuō)，“Fc”是指圖1中所示人IgG1的序列；“FcΔC”是指圖1(SEQ ID NO1)中所示缺少氨基酸殘基1-5的序列；“FcG10”指缺少氨基酸殘基1-9，具有Ser-(gly)連接體的Fc部分。核酸分子編碼本發(fā)明的OPG融合蛋白或其衍生物、片段或變異體的核酸分子也由本發(fā)明所提供。本發(fā)明的核酸分子可通過(guò)該領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的重組DNA方法學(xué)制備。例如參照Sambrook等(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約(1989))，和Ausubel等(現(xiàn)代分子生物學(xué)方法，Wiley and Sons，N.Y.(1994))論述的論變技術(shù)。也可應(yīng)用由Engels等(Angew.Chem.Intl.Ed.28，716-734(1989))論述的化學(xué)合成方法來(lái)制備這些變異體。也可應(yīng)用其它的技術(shù)人員熟知的制備核酸分子的方法。
在某些實(shí)施方案中，核酸分子編碼具有上面曾定義的保守氨基酸替代的OPG融合蛋白變異體。例如，保守氨基酸替換發(fā)生在融合蛋白的OPG和/或Fc部分。還提供這樣的Fc或OPG變異體，它們包括一或多個(gè)N-連接或O-連接糖基化位點(diǎn)的缺失和/或添加，或包括上述的Fc或OPG多肽片段。本發(fā)明的核酸分子編碼Fc和/或OPG變異體、片段的任一種組合以及這里描述的融合蛋白。
在另一實(shí)施方案中，核酸分子包含為了OPG融合多肽在給定的宿主細(xì)胞內(nèi)最適表達(dá)而被改變了的密碼子。特異的密碼子改變將取決于OPG融合蛋白和選擇的用于表達(dá)的宿主細(xì)胞?！懊艽a子最適化”可通過(guò)各種不同的方法達(dá)到，例如通過(guò)選擇在給定的宿主細(xì)胞中高表達(dá)基因中優(yōu)選應(yīng)用的密碼子。也可應(yīng)用整合了密碼子機(jī)率表，如“Ecohigh.Cod”進(jìn)行高表達(dá)細(xì)菌基因密碼子優(yōu)先選擇的計(jì)算機(jī)運(yùn)算法則，它由威斯康星大學(xué)的軟件包Version 9.0，遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組，Madison，WI提供。其它有用的密碼子機(jī)率表包括“Celegans_high.cod”，“Celegans_low.cod”，“Drosophila_high.cod”，“Human_high.cod”，“Maize_high.cod”，和“Yeast_high.cod”。載體和宿主細(xì)胞應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的連接技術(shù)將編碼OPG融合多肽的核酸分子插入到合適的表達(dá)載體中。在應(yīng)用的特異宿主細(xì)胞內(nèi)有功能的宿主被代表性地選擇(即載體與宿主細(xì)胞的機(jī)制相匹配，這樣可進(jìn)行基因的擴(kuò)增和/或表達(dá))。編碼OPG蛋白的核酸分子可以在原核細(xì)胞、酵母、昆蟲(桿狀病毒系統(tǒng))和/或真核宿主細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增/表達(dá)。宿主細(xì)胞的選擇部分取決于OPG蛋白是否被翻譯后修飾(例如糖基化和/或磷酸化)。如果這樣，則優(yōu)選酵母、昆蟲或哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。
典型地，在任何宿主細(xì)胞中應(yīng)用的表達(dá)載體將包含質(zhì)粒保持和外源核苷酸序列克隆和表達(dá)的序列。這些序列，在某些實(shí)施方案中統(tǒng)稱為“側(cè)翼序列”，代表性地包括一個(gè)或多個(gè)下列核苷酸一個(gè)啟動(dòng)子，一或多個(gè)增強(qiáng)子序列，一擴(kuò)增的起點(diǎn)，一轉(zhuǎn)錄終止序列，包括一供體和受體剪切位點(diǎn)的完整內(nèi)含子，分泌的引導(dǎo)序列，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，多聚腺苷酸化序列，插入編碼多肽的核苷酸使之表達(dá)的多聚連接體區(qū)，和選擇性標(biāo)志元件。
側(cè)翼序列可以是同源(即與宿主細(xì)胞來(lái)自相同種和/或系)、異源的(即來(lái)自與宿主細(xì)胞不同的種或系)、雜交的(即多個(gè)來(lái)源的側(cè)翼序列的組合)或合成的，或通常調(diào)節(jié)OPG和/或Fc蛋白表達(dá)的天然序列。由此，側(cè)翼序列的來(lái)源可以是任何原核或真核有機(jī)體，任何脊椎或無(wú)脊椎有機(jī)體，或任何植物，只要該側(cè)翼序列在宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能，并且能被宿主細(xì)胞的機(jī)構(gòu)激活。
先導(dǎo)序列或信號(hào)序列用于指導(dǎo)OPG融合蛋白出宿主細(xì)胞。信號(hào)序列最常見的位置是直接位于OPG融合多肽編碼區(qū)的5′端。已鑒定出許多信號(hào)序列，其中在所選宿主細(xì)胞中發(fā)揮作用的任何一種均可與編碼OPG融合蛋白的核酸序列連接應(yīng)用。例如，信號(hào)序列可與OPG或Fc基因或cDNA同源(自然發(fā)生的)或異源。另外，信號(hào)序列也可用上述的方法進(jìn)行化學(xué)合成。大多數(shù)情況中，OPG多肽通過(guò)信號(hào)肽的存在而從宿主細(xì)胞分泌出來(lái)往往會(huì)導(dǎo)致信號(hào)肽與融合蛋白脫離。
信號(hào)序列可以是載體的一部分，或是插入到載體中的OPG DNA的一部分。例如，OPG DNA在蛋白的氨基端編碼一信號(hào)序列，它在分子的翻譯后加工過(guò)程中裂開以形成成熱的蛋白質(zhì)(見圖2)。具有原本的信號(hào)序列的OPG核苷酸以及原本的信號(hào)序列被去除并被異源信號(hào)序列替代的OPG核苷酸包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。所選的異源信號(hào)序列應(yīng)當(dāng)是被宿主細(xì)胞識(shí)別和處理，即被信號(hào)肽酶裂解的。在一實(shí)施方案中，異源信號(hào)序列是WO97/23614中描述的OPG信號(hào)序列。由于原核的宿主細(xì)胞不能識(shí)別和處理原本的OPG與信號(hào)序列，所以該信號(hào)序列被一原核的信號(hào)序列替代，例如被選自堿性磷酸酶、青霉素酶、或熱穩(wěn)定性腸毒素II引導(dǎo)序列的信號(hào)序列替代。對(duì)于酵母分泌來(lái)說(shuō)，原本的OPG信號(hào)序列被酵母逆轉(zhuǎn)錄酶、α因子或酸性磷酸酶的信號(hào)序列替代。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，原本的OPG信號(hào)序列是可以滿足的，盡管其它的哺乳類信號(hào)序列也可適用。
實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選的載體是那些與細(xì)菌、昆蟲和哺乳類宿主細(xì)胞相匹配的載體。這些載體包括inter alia，pCRII，pCR3，pcDNA3.1(Invitrogen Co.，San Diego，CA)，pBSII(Stratagene Co.，La Jolla，CA)，pET15b(Novagen，Madison，WI)，pGEX(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)，pEGFP-N2(Clontech，Palo Alto，CA)，pETL(BlueBac II；Invitrogen)，pDSRα2(PCT WO 90/14363)和pFast Bac Dual(Gibco/BRL，Grand Island，NY)。
其它可能的載體包括但并不限于柯斯質(zhì)粒，質(zhì)?；蛐揎椀牟《荆d體系統(tǒng)必須與選擇的宿主細(xì)胞相匹配。這樣的載體包括但不限于質(zhì)粒，如Bluescript質(zhì)粒衍生物(高拷貝數(shù)ColE1為基礎(chǔ)的噬菌粒，Stratagene Cloning Systems Inc.，La Jolla CA)，為克隆Taq-amplifiedPCR產(chǎn)物而設(shè)計(jì)的PCR克隆質(zhì)粒(如TOPOTM TA CloningKit，PCR2.1質(zhì)粒衍生物，Invitrogen，Carlsbad，CA)和哺乳動(dòng)物、酵母或病毒載體，如桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(pBacPAK質(zhì)粒衍生物，Clontech，PaloAlto，CA)。重組分子可通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染、電穿孔或其它已知的技術(shù)被導(dǎo)入宿主細(xì)胞。載體構(gòu)建和編碼OPG融合多肽的核酸分子被插入到載體的正確位置后，可將完整的載體插入到適宜的宿主細(xì)胞中以進(jìn)行擴(kuò)增和/或多肽表達(dá)。
宿主細(xì)胞可以是原核的宿主細(xì)胞(如E.coli)或是真核的(如酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或脊椎動(dòng)物細(xì)胞)。當(dāng)在適當(dāng)條件下培養(yǎng)時(shí)，宿主細(xì)胞合成OPG多肽，隨后可從培養(yǎng)基(如果宿主細(xì)胞將它分泌到培養(yǎng)基中)中收集多肽，或直接從制備它的宿主細(xì)胞中收集(如果不被分泌)。合適宿主細(xì)胞的選擇依賴于多種因素，如希望表達(dá)的水平，期望或活性必需的多肽修飾，如糖基化或磷酸化，以及折疊成生物學(xué)活性分子。
適宜的宿主細(xì)胞或細(xì)胞系可以是哺乳類細(xì)胞，如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)(ATCC#CCL61和Urlaub等，PNAS USA 77，4216-4220(1980))，人胚腎(HEK)293或293T細(xì)胞(ATCC#CRL1573)或3T3細(xì)胞(ATCC#CRL1658)。適宜哺乳類宿主細(xì)胞的選擇和轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、擴(kuò)增、篩選及產(chǎn)物制備和純化的方法是本領(lǐng)域由已知的。其它適宜的哺乳類細(xì)胞系為猴的COS-1和COS-7細(xì)胞系(ATCC#CRL1651)，以及CV-1細(xì)胞系(ATCC#CCL70)。其它的哺乳類細(xì)胞系的例證包括靈長(zhǎng)類細(xì)胞系和嚙齒類細(xì)胞系，其中包括轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。源自原代組織及原代移植物體外培養(yǎng)的細(xì)胞株、正常二倍體細(xì)胞也適用。候選細(xì)胞在選擇基因上存在基因型上的缺陷，或包含起決定作用的選擇基因。其它適宜的哺乳類細(xì)胞系包括但不限于小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤N2A細(xì)胞，HeLa，小鼠L-929細(xì)胞，來(lái)自Swiss，Balb-c或NIH小鼠的3T3系，BHK或HaK倉(cāng)鼠細(xì)胞系。其中的每一個(gè)細(xì)胞系都是本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員已知并可獲得的。
適于本發(fā)明的同樣可用作宿主細(xì)胞的為細(xì)菌細(xì)胞。例如，E.coli的不同菌株(例如HB101，DH5α，DH10，和MC1061)在生物技術(shù)領(lǐng)域是眾所周知的宿主細(xì)胞。枯草芽孢桿菌，假單胞菌類，其它芽孢桿菌類，鏈球菌類的各種菌株也可同樣用于該方法。
該領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的酵母細(xì)胞的許多細(xì)胞株也可用作本發(fā)明的多肽表達(dá)的宿主細(xì)胞。優(yōu)選的酵母細(xì)胞包括，例如釀酒酵母。
此外，我們期望昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)也可用于本發(fā)明的方法中。例如被Kitts等(Biotechniques，14，810-817(1993))，Lucklow(Curr.Opin.Biotechnol.，4，564-572(1993))和Lucklow等(J.Virol.，67，4566-4579(1993))描述過(guò)的系統(tǒng)。優(yōu)選的昆蟲細(xì)胞為Sf-9和Hi5(Invitrogen，Carlsbad，CA)。
將OPG多肽的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染所選宿主細(xì)胞可通過(guò)眾所周知的方法完成，這些方法包括如氯化鈣法，電穿孔法，顯微注射，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或DEAE-dextran方法。所選方法應(yīng)某種程度上是所用宿主細(xì)胞類型的一種功能。這些方法及其它適宜的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熱知的，并列于前面，例如在Sambrook等中，同上。多肽制備應(yīng)用技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基培養(yǎng)通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染而包括編碼OPG融合多肽的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。通常培養(yǎng)基中包含所有該細(xì)胞生存和生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。適于培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)基為，如LuriaBroth(LB)和/或Terrific Broth(TB)。培養(yǎng)真核細(xì)胞的適宜培養(yǎng)基為RPMI 1640、MEM、DMEM，根據(jù)培養(yǎng)的特殊細(xì)胞的要求可在所有類型的培養(yǎng)基中補(bǔ)添血清和/或生長(zhǎng)因子。適于昆蟲培養(yǎng)的培養(yǎng)基是Grace′s培養(yǎng)基，必需時(shí)可補(bǔ)充yeastolate，卵白蛋白水解產(chǎn)物和/或胎牛血清(Gibco Life Technologies，Gaithersburg，MD)。
經(jīng)典地，用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化細(xì)胞選擇性生長(zhǎng)的抗生素或其它化合物補(bǔ)加到培養(yǎng)基中。所用的化合物是由存在于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的質(zhì)粒中的選擇性標(biāo)志元件支配的。例如，當(dāng)選擇性標(biāo)志元件為卡那霉素抗性時(shí)，加入到培養(yǎng)基中的化合物就為卡那霉素；而當(dāng)選擇性標(biāo)志元件為氨芐青霉素抗性時(shí)，加入到培養(yǎng)基中的化合物就為氨芐青霉素。
宿主細(xì)胞產(chǎn)生的OPG融合多肽的量可用本領(lǐng)域內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)方法估價(jià)。這些方法包括Western bolt分析，SDS-PAGE，非變性凝膠電泳，HPLC分離，免疫沉淀和/或活性栓測(cè)方法，如DNA結(jié)合凝膠轉(zhuǎn)移方法。
當(dāng)OPG融合多肽沒(méi)有加標(biāo)簽，并且未得到抗體時(shí)，可用其它已知的程序進(jìn)行純化。這些程序包括，沒(méi)有限制，離子交換色譜，分子篩色譜，HPLC，原本的凝膠電泳與凝膠洗脫結(jié)合，制備型等電聚焦(“isoprime”機(jī)器/技術(shù)，Hoefer Scientific)。在一些情況下，可兩種或多種技術(shù)聯(lián)用以增加純度。
如果OPG融合多肽在胞內(nèi)產(chǎn)生，可應(yīng)用技術(shù)人員已知的任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從宿主細(xì)胞提取出胞內(nèi)物質(zhì)(包括革蘭氏陰性菌的包含體)。例如可通過(guò)French壓力，勻漿，和/或超聲后離心來(lái)裂解宿主細(xì)胞，使之釋放周質(zhì)/細(xì)胞質(zhì)的內(nèi)含物。
如果OPG融合蛋白在胞液中形成包含體，包含體常結(jié)合到胞膜的內(nèi)面和/或外面，于是離心后主要在團(tuán)塊物質(zhì)中發(fā)現(xiàn)包含體。然后用強(qiáng)pH或用離液劑處理團(tuán)塊，這些試劑有，如去污劑、胍、胍的衍生物、尿素或尿素衍生物，在還原劑如二硫蘇糖醇在堿性pH條件或Tris羧乙基膦酸性pH，存在時(shí)處理，以釋放、打碎、并使包含體可溶。溶解狀態(tài)的OPG融合多肽可用凝膠電泳、免疫沉淀等進(jìn)行分析。如果想分離OPG多肽，分離可應(yīng)用下面給出的方法和Marston等(Meth.Enz.，182，264-275(1990))的標(biāo)準(zhǔn)方法完成。
某些情況下，經(jīng)過(guò)分離OPG融合蛋白會(huì)沒(méi)有生物學(xué)活性?？蓱?yīng)用各種“重折疊”的方法或逆轉(zhuǎn)多肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)和產(chǎn)生二硫鍵連接的方法來(lái)修復(fù)生物學(xué)活性。這些方法包括將可溶性多肽暴露在pH通常高于7且存在特定濃度的離液劑的環(huán)境部。離液劑的選擇與包含體可溶化中選用的非常相似，但是離液劑通常在低濃度下應(yīng)用，并且不象可溶化中應(yīng)用離液劑那樣必要。大多數(shù)情況下折疊/氧化溶液還包括還原劑或還原劑加上它一定比例的氧化狀態(tài)的試劑，以產(chǎn)生特殊的氧化還原作用，好允許蛋白質(zhì)的半胱氨酸橋形成中發(fā)生二硫鍵拖引。常用的氧化還原對(duì)包括半胱氨酸/胱胺，谷胱甘肽(GSH)/二硫GSH，二硫蘇糖醇(DTT)/二噻烷DTT，二巰基乙醇(βME)/二硫-β(ME)。許多情況下，為了增加重折疊的效率，可應(yīng)用助溶劑或助溶劑是必需的。為了達(dá)到這一目的而應(yīng)用的通用試劑包括甘油，不同分子量的聚乙二醇，精氨酸等。衍生物本發(fā)明的OPG融合蛋白及其變異體和片段，是通過(guò)連接一或多個(gè)化學(xué)部分而產(chǎn)生的。例如，OPG和Fc多肽的融合可產(chǎn)生在或者OPG部分或者Fc部分，或二者。這些經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的衍生物還可進(jìn)一步調(diào)配成動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、靜脈、口腔、鼻、肺、局部或以下討論的其它途徑施用的衍生物。有人發(fā)現(xiàn)，生物活性蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾在某些條件下具有額外的優(yōu)勢(shì)，如提高治療性蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和循環(huán)時(shí)間，減低其免疫原性。參見U.S.專利號(hào)4,179,337。綜述見Abuchowski等，Enzymes as Drugs(J.S.Holcerberg和J.Roberts編著，pp.367-383(1981))；Francis等，同上。
適于這種衍化作用的化學(xué)部分可選自各種水溶性聚合物。基于這些考慮，如該聚合物/蛋白質(zhì)綴合物是否用于治療，如果可以的話，期望的劑量、循環(huán)時(shí)間、對(duì)蛋白水解的抵抗性和其它考慮，該領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)選擇到所期望的聚合物。對(duì)于本發(fā)明的蛋白質(zhì)來(lái)講，衍化作用的有效性可通過(guò)以期望的形式(即，滲透泵或更優(yōu)選地通過(guò)注射或輸入，或其它制劑，如用于口、肺或鼻施用的)施用衍生物，然后觀察這里所描述的生物學(xué)活性，來(lái)確定。
水溶性聚合物可選自，如聚乙二醇，乙二醇/丙二醇的共聚物，羧甲基纖維素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚1，3-二氧戊環(huán)，聚-1，3，6-三氧己烷，乙烯/馬來(lái)酸酐共聚物，聚氨基酸(或同源聚合物，或隨機(jī)聚合物)，葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇同源聚合物，聚氧化丙烷/氧化乙烷共聚物，聚氧乙烯化的多元醇和聚乙烯醇。由于它在水中的穩(wěn)定性，聚乙二醇丙醛在制作中有其優(yōu)勢(shì)。琥珀酸和苯乙烯也可應(yīng)用。此外，多聚氨基酸可選自血清白蛋白(如人血清白蛋白)或其它多聚氨基酸，如賴氨酸。
聚合物可以為任何分子量，可以為分支的或未分支的。對(duì)于聚乙二醇來(lái)講，優(yōu)選的分子量為大約2～100kDa(這里的“大約”表示在聚乙二醇的制備中，一些分子會(huì)重于或輕于所講的分子量)，因?yàn)檫@易于控制和操作。
連接到OPG融合多肽上的聚合物分子的數(shù)量不等，該領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠確認(rèn)對(duì)功能的效果。它可以是單體衍生物，或是具有相同或不同化學(xué)部位的二聚、三聚、四聚衍生物，或一些衍生物的結(jié)合(如不同分子量的聚乙二醇)。聚合物分子與蛋白質(zhì)(或肽)分子的比率不同，如同它們?cè)诜磻?yīng)混合物中的濃度不同一樣。通常，最佳比率(指反應(yīng)的有效率，即沒(méi)有過(guò)量的未反應(yīng)蛋白或聚合物)由一些因素決定，如所期望的衍化程度(例如單，二-，三-，等)，所選擇的聚合物的分子量，該聚合物是否分支或未分支，以及反應(yīng)條件。
化學(xué)部分與OPG融合蛋白的連接要考慮到對(duì)蛋白質(zhì)抗原決定簇或功能的影響。該領(lǐng)域的技術(shù)人員可獲得有許多連接方法(EP 0401384在此引入作為參考(偶聯(lián)PEG到G-CSF上)；Malik等，Exp.Hematol.20，1028-1035(1992))(報(bào)道用tresyl chloride對(duì)GM-CSF進(jìn)行pegylation)。例如，聚乙二醇通過(guò)具有游離氨基(如賴氨酸、精氨酸或N-端的氨基酸殘基)或游離羧基(如天冬氨酸，谷氨酸和C-末端的氨酸酸殘基)的氨基酸殘基而共價(jià)結(jié)合。也可應(yīng)用有游離巰基(如半胱氨酸)的氨基酸殘基。為了治療目的，優(yōu)選的是在氨基端連接，如在N-末端或賴氨酸氨基處連接。如果期望受體介導(dǎo)結(jié)合的話，就要避免在受體結(jié)合的主要?dú)埢庍B接。
也許有人特別期望N-末端化學(xué)修飾的OPG融合蛋白。以用聚乙二醇作化學(xué)部分為例，N末端聚乙二醇化OPG融合多肽的制備可通過(guò)在游離的氨基端誘導(dǎo)多肽，并從一群聚乙二醇化的蛋白分子中分離出N-末端聚乙二醇化的物質(zhì)，而獲得。另外，選擇性的N-末端化學(xué)修飾也可通過(guò)還原性烷基化作用來(lái)完成，它利用主要氨基(賴氨酸對(duì)N末端)不同類型的特異反應(yīng)性實(shí)現(xiàn)特殊蛋白質(zhì)中的衍化。在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下，可獲得含大量在具有羰基的N末端選擇性衍化的蛋白質(zhì)的聚合物。聚乙二醇丙醛，它含有一單個(gè)反應(yīng)性甲醛，也可應(yīng)用。
用易于制備治療性的產(chǎn)品，優(yōu)選N末端單聚乙二醇化衍生物。N-末端的聚乙二醇化的保證了同源產(chǎn)物，其特征為這種產(chǎn)物比相應(yīng)的二、三或其它多-聚乙二醇化的產(chǎn)物簡(jiǎn)單化。因易于商業(yè)化制作，優(yōu)選應(yīng)用上述還原性烷化作用來(lái)制備N-末端產(chǎn)物。多肽的應(yīng)用本發(fā)明的融合多肽用于預(yù)防和/或治療骨質(zhì)損失；預(yù)防和/或治療結(jié)構(gòu)完好的骨骼被結(jié)構(gòu)破壞的骨骼替代；或者預(yù)防向骨轉(zhuǎn)移。在包括以下情況在內(nèi)的多種情況下證明有骨損失骨質(zhì)疏松，如原發(fā)性骨質(zhì)疏松，內(nèi)分泌性骨質(zhì)疏松(甲狀腺功能亢進(jìn)癥，甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥，Cushing′s綜合征，和肢端肥大癥)，遺傳或先天形式的骨質(zhì)疏松(骨形成不全，高胱氨酸尿，門克士綜合征和賴?yán)?戴綜合征)，因肢端的不固定而造成的骨質(zhì)疏松癥；成年或幼年出現(xiàn)的骨的佩吉特納(骨炎)；骨髓炎，或?qū)е鹿菗p失的骨中的感染性損傷；由實(shí)體瘤(乳房、肺和腎)和血液系統(tǒng)的惡性腫瘤(多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤和白血病)導(dǎo)致的高鈣血癥，自發(fā)性高鈣血癥和與甲狀腺功能亢進(jìn)癥及腎功能失常相關(guān)的高鈣血癥；術(shù)后、由施用固醇類激素而造成的骨質(zhì)稀少，以及與大小腸紊亂、慢性肝病、腎臟疾病相關(guān)的骨質(zhì)稀少；與創(chuàng)傷性或非創(chuàng)傷性損傷相關(guān)的骨壞死或骨細(xì)胞死亡，與戈謝病、鐮刀細(xì)胞性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和其它情況相關(guān)的骨壞死；因類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎造成的骨損失；牙周的骨損失；骨關(guān)節(jié)炎；假肢疏松；和溶骨性轉(zhuǎn)移。在成人和幼年的骨佩吉特病(骨炎)，甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥，先天性骨疾病，如纖維性結(jié)構(gòu)不良，和骨硬化性骨轉(zhuǎn)移中可看到結(jié)構(gòu)完好的骨被結(jié)構(gòu)破壞不完全的骨所替代。
本發(fā)明的一實(shí)施方案中，本發(fā)明的OPG融合多肽由于活性和循環(huán)半衰期增加，所以可有益地用于治療骨損失，尤其是由惡性或轉(zhuǎn)移性腫瘤造成的骨溶性破壞所引起的骨損失。OPG多肽可用于治療與乳腺、前列腺、甲狀腺、腎、肺、食道、直腸、膀胱、宮頸、卵巢和肝臟腫瘤以及胃腸道腫瘤相關(guān)的骨損失。還包括與某些血液系統(tǒng)惡性腫瘤，如多發(fā)性骨髓瘤，象何杰金氏疾病這樣的淋巴瘤相關(guān)的骨損失。
本發(fā)明的OPG融合蛋白可單獨(dú)應(yīng)用或與其它治療劑聯(lián)合應(yīng)用，特別是與其它腫瘤治療劑聯(lián)合應(yīng)用。通常它們包括放療或化療?；煱☉?yīng)用一或多種以下試劑進(jìn)行治療蒽環(huán)類，紫杉酚，三氧苯胺，阿霉素，5-氟尿嘧啶和其它該領(lǐng)域的工作人員已知的藥物。在一實(shí)施方案中，腫瘤治療藥為促黃體素釋放激素(LHRH)拮抗劑，優(yōu)選肽類拮抗劑。更優(yōu)選的LHRH拮抗劑為包括以下結(jié)構(gòu)的十肽A-B-C-D-E-F-G-H-I-J其中A為pyro-glu，Ac-D-Nal，Ac-D-Qal；Ac-Sar，或Ac-D-Pal；B為His或4-Cl-D-Phe；C為Trp，D-Pal，D-Nal，L-Nal-D-Pal(N-O)，或D-Trp；D為Ser；E為N-Me-Ala，Tyr，N-Me-Tyr，Ser，Lys(iPr)，4-Cl-Phe，His，Asn，Met，Ala，Arg或Ile；F為 其中R和X是獨(dú)立地H和烷基；Y包括一小的極性部分；G為L(zhǎng)eu或Trp；H為L(zhǎng)ys(iPr)，Gln，Met或Arg；I為Pro；J為Gly-NH2或D-Ala-NH2；或其可用作藥用的鹽。
另一實(shí)施方案中，LHRH拮抗劑包括肽N-Ac-D-Nal-4-Cl-Phe-D-Pal-Ser-N-Me-Tyr-D-Asn-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2。
這里應(yīng)用的是標(biāo)準(zhǔn)的縮寫和規(guī)范，下面非標(biāo)準(zhǔn)的殘基和部分的縮寫如下Nal 3-(2-萘基)丙氨酰基4-Cl-Phe(4′-氯苯基)丙氨?；鵓al 3-(3′-吡啶基)丙氨?；鵓al(N-O)3-(3′-吡啶-N-氧)丙氨?；鵬Pr-Lys N-ε-2-丙基-賴氨?；鵔al 3-(2′-喹啉基)丙氨酰基LHRH拮抗劑十肽的其它形式也包括在本發(fā)明之內(nèi)。這樣的十肽在U.S.專利5,843,901中有所描述，在此引用。
治療性抗體，包括鼠，鼠-人嵌合的，CDR-移植的，人源化或完全人源的抗體，或者合成的抗體，如那些通過(guò)篩選抗體庫(kù)而選擇出的抗體也包括在內(nèi)。這些抗體的實(shí)例包括那些與細(xì)胞表面蛋白Her2、CDC20、CDC33、粘蛋白樣糖蛋白和腫瘤細(xì)胞上存在的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)結(jié)合并能選擇性誘導(dǎo)對(duì)展露這些蛋白的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞抑制和/或細(xì)胞毒效應(yīng)的抗體。這些抗體的實(shí)例包括治療乳腺癌的HERCEPTIN和治療非何杰金氏淋巴瘤的RITUXAN。腫瘤治療劑中還包括在腫瘤細(xì)胞內(nèi)選擇性誘導(dǎo)凋亡的多肽，如TNF相關(guān)的多肽TRAIL。OPG融合蛋白可先于腫瘤治療劑施用，或一起，或隨后應(yīng)用。OPG融合蛋白可預(yù)防性施用，以預(yù)防或抑制轉(zhuǎn)移性腫瘤造成的骨損失發(fā)生，或者用于治療已存在的由轉(zhuǎn)移造成的骨損失。
本發(fā)明的OPG融合多肽可用于預(yù)防和/或治療與多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)的骨損失，或者用于預(yù)防和/或治療該疾病自身。多發(fā)性骨髓瘤是B細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤，能導(dǎo)致明顯的發(fā)病率和死亡率。最顯著的共有臨床表現(xiàn)是由局部區(qū)域內(nèi)破骨細(xì)胞活化增加而引起的局部骨損失。大部分骨髓瘤患者(～95％)通常存在破壞性的骨損傷，通過(guò)X射線照片分析可以看到的，并且忍受極度的難以控制的骨痛?；加泄撬枇龅牟∪擞绕鋵?duì)患骨的病理性骨折敏感，這經(jīng)常自然發(fā)生或由于旅途受傷造成。骨髓瘤過(guò)程中發(fā)生的骨骼損傷不僅可導(dǎo)致骨折，而且可造成畸形，偶然會(huì)造成神經(jīng)壓迫，尤其是發(fā)生在脊椎動(dòng)物的脊柱時(shí)。在一些患者中發(fā)生血清中鈣病理性增加(高鈣血癥)，并且在疾病的治療過(guò)程中可引發(fā)顯著的問(wèn)題。OPG可施用給病人以阻斷骨吸收和鈣的釋放，由此減低骨折和脊柱變形的危險(xiǎn)。
骨髓瘤細(xì)胞不直接參與骨破壞，但是它產(chǎn)生細(xì)胞外信號(hào)導(dǎo)致破骨細(xì)胞分化和活化。然后破骨細(xì)胞在體內(nèi)制造最高水平的任何細(xì)胞類型的細(xì)胞因子IL-6，尤其是當(dāng)它們被活化時(shí)。IL-6是B細(xì)胞的生長(zhǎng)因子，體外小鼠和人骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)都需要它。TNF相關(guān)蛋白OPG配體(OPGL)負(fù)責(zé)誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化和活化(見WO98/46751)。骨髓瘤細(xì)胞直接地或間接地給破骨細(xì)胞制造該因子，導(dǎo)致包埋在骨髓內(nèi)的骨髓瘤細(xì)胞周圍的局部骨溶解。鄰近骨髓瘤細(xì)胞的正常破骨細(xì)胞依次產(chǎn)生IL-6，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的局部擴(kuò)展。骨髓瘤細(xì)胞以集落的方式擴(kuò)展并占據(jù)由不正常骨吸收而制造的骨骼空間。
已觀察到在嚙齒動(dòng)物中施用OPG會(huì)誘導(dǎo)破骨細(xì)胞群的快速死亡。破骨細(xì)胞的減少會(huì)消除破骨細(xì)胞引起的IL-6產(chǎn)生增加，并影響骨小梁內(nèi)骨髓細(xì)胞的生存和生長(zhǎng)。因此，OPG治療骨髓瘤患者不僅阻斷骨的高吸收，而且可影響腫瘤自身的生存和擴(kuò)展。已知B細(xì)胞表達(dá)OPGL受體，稱為破骨細(xì)胞分化和活化的受體，或ODAR。骨髓瘤細(xì)胞也表達(dá)ODAR，此外也產(chǎn)生OPGL。同一種細(xì)胞上共表達(dá)OPGL和ODAR會(huì)產(chǎn)生一種自分泌性刺激，這種刺激影響著骨髓瘤細(xì)胞的生存。因此，OPG治療可直接影響腫瘤細(xì)胞生存，由此減低或消除在骨髓瘤患者中見到的腫瘤負(fù)荷。藥物組合物本發(fā)明還提供包括OPG融合蛋白和其變異體、片段和衍生物的藥物組合物。該藥物組合物可注射施用，或經(jīng)口、肺、鼻、經(jīng)皮施用，或以其它形式施用?？傮w上講，本發(fā)明包括的藥物組合物包括有效量的本發(fā)明的OPG融合蛋白，還有藥學(xué)上可接受的稀釋劑，防腐劑，助溶劑，乳化劑，佐劑和/或載體。有效或治療有效量的OPG融合蛋白是用這里描述的方法或程序確定時(shí)，它的量足以減低骨損失率和/或程度。
本發(fā)明的藥物組合物包括不同緩沖體系(如Tris-HCl，醋酸，磷酸鹽)、pH和離子強(qiáng)度的稀釋劑；象去污劑和助溶劑(如吐溫80，聚山梨醇醋80)這樣的添加劑，抗氧化劑(如抗壞血酸，焦亞硫酸鈉)，防腐劑(如硫柳汞，芐基乙醇)和填充劑(如乳糖，甘露醇)；整合這些物質(zhì)到特殊聚合物化合物的制備中，如聚乳酸，聚羥基乙酸中，或整合到脂質(zhì)體中。也可應(yīng)用透明質(zhì)酸，它具有促進(jìn)在循環(huán)中保留過(guò)程的作用。這些組合物可影響本蛋白和衍生物的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)的釋放率和體內(nèi)的廓清率。參見，如Remington′s PharmaceuticalSciences，18th Ed.(1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA 18042)1435-1712。組合物可以制備成液體狀或制備成干粉，如冷凍干燥形式。也可考慮可植入的緩釋制劑，如經(jīng)皮制劑。
這里考慮應(yīng)用的為口服固體形式，這在Remington′sPharmaceutical Sciences，18th Ed.1990(Mack Publishing Co.，EastonPA 18042)，第89章中有整體論述。固體劑量形式包括片劑、膠囊、丸劑、錠劑或糖錠，扁囊劑或小丸。脂質(zhì)體或類蛋白質(zhì)的包裹也可用于配制本發(fā)明的組合物(例如，U.S.專利4,925,673中報(bào)道的類蛋白質(zhì)的微球)?？蓱?yīng)用脂質(zhì)體包裹，脂質(zhì)體可以與不同的聚合物修飾(如U.S.專利5,013,556)。用于治療的可能的固相劑量形式的描述由Marshall K.在Modern Pharmaceutics Edited by G.S.Banker和C.T.Rhodes，第10章，1979描述，在此引用作為參考?？傊?，制劑要包括OPG融合蛋白或其變異體、片段或衍生物，以及惰性成分，它們能在胃環(huán)境中保護(hù)并在腸中釋放生物活性物質(zhì)。
OPG融合蛋白可經(jīng)過(guò)選擇性地化學(xué)修飾，這樣衍生物的經(jīng)口給藥是有效的。通?？紤]的化學(xué)修飾是至少一部分連接蛋白質(zhì)(或肽)分子自身，這里所講的部分允許(a)抑制蛋白水解；(b)從胃或腸道攝取入血流。同時(shí)期望蛋白質(zhì)的整體穩(wěn)定性增加及在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間增加。這樣的實(shí)體實(shí)例包括聚乙二醇，乙二醇和丙二醇的共聚體，羧甲基纖維素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮和聚脯氨酸。Abuchowski和Davis，Soluble Polymer-Enzyme Adducts.于《Enzymesas Drugs》，Hocenberg和Roberts編輯，Wiley-Interscience，New York，NY，(1981)，pp 367-383；Newmark等，J.Appl.Biochem.4185-189(1982)?？蓱?yīng)用的其它聚合物為聚1，3-二氧雜環(huán)己烷，和聚1，3，6-三氧雜環(huán)己烷。如上所述，用于藥物時(shí)優(yōu)選聚乙二醇部分。
為了保證口服后能抵抗胃中的降解，至少在pH5.0不滲透的包衣是必要的。用作口服制劑腸衣的較常見的內(nèi)在成分有纖維素醋酸三苯六甲酸酯(CAT)，羥丙甲基纖維素酞酸酯(HPMCP)，HPMCP 50，HPMCP 55，聚乙烯醋酸酞酸酯(PVAP)，Eudragit L30D，Aquateric，纖維素乙酸酞酸酯(CAP)，Eudragit L，Eudragit S，和Shellac。這些包衣以混合的膜應(yīng)用。
OPG融合蛋白以大約1mm的?；蛐⊥桀w粒形式作為精細(xì)的多重顆粒包括在制劑中。用于制成膠囊施用的物質(zhì)的配方也可是粉末，經(jīng)壓上塞子或用作片劑。
本發(fā)明的藥物組合物包括稀釋劑，包括碳水化合物，尤其是甘露醇，α-乳糖，脫氫乳糖，纖維素，蔗糖，修飾過(guò)的葡聚糖和淀粉。一些無(wú)機(jī)鹽，包括三磷酸鈣，碳酸鎂和氯化鈉可用作添加物。商品性的稀釋劑有Fast-F10，Emdex，STA-Rx 1500，Emcompress和Avicell。
固體劑配方中可包括崩解劑。用作崩解劑的物質(zhì)有但并不限于淀粉，包括以淀粉為基礎(chǔ)的商品性崩解劑Explotab。Sodium starchglycolate，Amberlite，羧甲基纖維素鈉，ultramylopectin，藻酸鈉，明膠，橙皮，酸性羧甲基纖維素，天然海綿和皂土均可應(yīng)用。另一種形式的崩解劑為不溶性的陰離子交換樹脂。成粉狀的樹膠可用作崩解劑和粘合劑，它們可包括瓊脂、卡拉牙膠或西黃蓍膠樣的粉末狀樹膠。藻酸及其鈉鹽均可用作崩解劑。
粘合劑可用于形成硬的片劑，包括天然產(chǎn)物，如金合歡膠，西黃蓍膠，淀粉和明膠。其它的包括甲基纖維素(MC)，乙基纖維素(EC)和羧甲基纖維素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羧丙甲基纖維素(HPMC)均可用于醇溶液中使治療藥物成粒。
加入到配方中的潤(rùn)滑劑包括但并不限于包括其鎂鹽和鈉鹽的硬脂酸，聚四氟乙烯(PTFE)，液態(tài)石蠟，植物油和蠟?？扇苄缘臐?rùn)滑劑，如十二烷基硫酸鈉，十二烷基硫酸鎂，各種分子量的聚乙二醇，Carbowax 4000和6000也可應(yīng)用。
促滑劑在制劑過(guò)程中可提高藥物的流動(dòng)特性，并在加壓過(guò)程中幫助重排。促滑劑可包括淀粉、滑石粉、致熱的硅石和水合的硅鋁酸鹽。
為了幫助OPG融合蛋白的溶解，可加入表面活性劑作為加濕劑。表面活性劑可包括陰離子去污劑，如十二烷基硫酸鈉，二辛基磺基琥珀酸鈉，二辛基磺酸鈉。可應(yīng)用陽(yáng)離子去污劑，它包括苯扎氯銨或氯芐乙銨。非離子去污劑的清單中有表面活性劑Lauromacrogol 400，聚乙二醇40硬脂酸酯，聚氧乙烯氫化蓖麻油10，50，60，甘油單硬脂酸酯，聚山梨醇酯40，60，65和80，蔗糖脂肪酸酯，甲基纖維素和羧甲基纖維素。這些表面活性劑可單獨(dú)和以不同比率的混合物存在于蛋白質(zhì)或衍生物的制劑中。
大大增加蛋白攝取的添加劑是，例如脂肪酸，油酸，亞油酸和亞麻酸。
期望一控制釋放的制劑。OPG融合蛋白可被整合到一惰性基質(zhì)中，這允許它以擴(kuò)散或浸瀝機(jī)制釋放，如樹膠。緩慢降解的基質(zhì)也可被包含到制劑中，如藻酸鹽、多糖。另一種控制該治療劑釋放的形式是通過(guò)以O(shè)ros治療系統(tǒng)(Alza Corp.)為基礎(chǔ)的一種方法，即藥物被包到一半滲透性膜中，它能允許水進(jìn)入，通過(guò)滲透壓作用將藥物從單個(gè)小孔中擠出。一些腸衣也具有緩釋效果。
其它包被物可用于制劑中。如，膜包被的片劑可包括2組不同的物質(zhì)。第一組物質(zhì)包括非腸溶性物質(zhì)，如甲基纖維素，乙基纖維素，羥乙基纖維素，甲羥乙基纖維素，羥丙基纖維素，羥丙甲基纖維素，羧甲基纖維素鈉，Proridone和聚乙二醇。第二組包括通常為酞酸酯的腸溶物質(zhì)?？蓱?yīng)用這些物質(zhì)的混合物以提供最佳的包衣。膜包被可在一盤狀包被儀中進(jìn)行，或在液化床中，或通過(guò)壓力包被。
同樣需要這里考慮的是OPG融合蛋白或多肽在肺中輸送。蛋白通過(guò)吸入傳輸?shù)椒危瑱M穿肺上皮細(xì)胞進(jìn)入血流。(其它報(bào)道有Adjei等，Pharmaceutical Res.，7565-569(1990)；Adjei等，Int.J.Pharmaceutics 63135-144(1990)(leuprolide acetate)；Braquet等，J.Cardiovascular Pharmacology，13(suppl.5)s.143-146(1989)(內(nèi)皮素-1)；Hubbard等，Annals of Internal Medicine3206-212(1989)(α1-抗胰蛋白酶)；Smith等，J.Clin.Invest.841145-1146(1989)(α1-蛋白酶)；Oswein等“Aerosolization of Proteins”，Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II，Keystone，Colorado，March，1990(重組人類生長(zhǎng)激素)；Debs等，J.Immunology1403482-3488(1988)(IFNα和TNFα)和U.S.專利5,284,656(G-CSF)。
實(shí)施本發(fā)明應(yīng)用的是為治療藥物的肺傳輸而設(shè)計(jì)的大范圍的儀器設(shè)備，它們包括但不限于噴霧器，計(jì)量化的劑量吸入器，粉末吸入器，所有這些都是該領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉的。適于實(shí)施本發(fā)明的商品化裝置的一些特殊例子為Ultravent噴霧器，Mallinckrodt Inc.生產(chǎn)，St.Louis，Missouri；Acorn II噴霧器，Marquest Medical Products生產(chǎn)，Englewood，Colorado；Ventolin儀表控制劑量的吸入器，Glaxo Inc.生產(chǎn)，Research Triangle Park，North Caroliua；Spinhaler粉末吸入器，F(xiàn)isons Corp生產(chǎn)，Bedford，Massachusetts。
所有這些裝置要求應(yīng)用適于OPG融合蛋白及其變異體、片段或衍生物調(diào)配的制劑。傳統(tǒng)地，每一種制劑對(duì)所用的儀器類型特異，除應(yīng)用治療中應(yīng)用的稀釋劑、佐劑和/或載體外，也可用到適宜的推進(jìn)劑。
要將OPG融合蛋白最有利地制備成平均值小于10μm(或微粒)的顆粒，最優(yōu)選的是0.5～5μm大小，因?yàn)檫@樣能最有效地輸送到肺遠(yuǎn)端。
載體包括碳水化合物，如海藻糖、甘露醇、木糖醇、蔗糖、乳糖和山梨醇。制劑中應(yīng)用的其它成分包括DPPC、DOPE、DSPC和DOPC?？蓱?yīng)用天然的或合成的表面活性劑?？蓱?yīng)用聚乙二醇(不同于在誘導(dǎo)蛋白質(zhì)或類似物衍化中的應(yīng)用)。葡聚糖，如環(huán)葡聚糖也可應(yīng)用。膽汁鹽和其它相關(guān)的增強(qiáng)物可應(yīng)用?？蓱?yīng)用纖維素和纖維素衍生物?？蓱?yīng)用氨基酸，如在緩沖液配方中應(yīng)用、也可考慮應(yīng)用脂質(zhì)體、微膠囊或微球，包含體，或其它類型的載體。
也可考慮鼻腔輸送OPG融合蛋白。鼻腔輸送允許將治療性產(chǎn)物施用給鼻后，蛋白直接入血流，而不需要將產(chǎn)物吸入到肺中。用于鼻腔輸送的制劑包括那些應(yīng)用葡聚糖或環(huán)葡聚糖的。也考慮通過(guò)其它粘膜進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。劑量施以治療有效量的本發(fā)明的OPG融合多肽來(lái)預(yù)防和/或治療與轉(zhuǎn)移性骨疾病相關(guān)的骨損失?！爸委熡行Я俊钡腛PG融合多肽是指可減少骨質(zhì)損失的量。骨質(zhì)的檢測(cè)可通過(guò)各種已知的方法進(jìn)行，如單光子吸收儀(SPA)，雙光子吸收儀(DPA)，雙能量X射線吸收儀(DEXA)，定量的計(jì)算機(jī)體層掃描(QCT)和超聲波檢查儀(參見Johnston等，于《Primer on the Metabolic Bone Disease and Disorders of MineralMetabolism》第2版，M.J.Favrus編輯，Raven Press，pp.237-146)。該領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)用這些方法可確定OPG融合多肽的治療有效量。也可通過(guò)檢測(cè)骨中化學(xué)性標(biāo)記物的改變來(lái)確定，如血清中的骨鈣素，血清堿性磷酸酶，血清I型原膠原延展肽，尿或血清中膠原的C末端或N末端端肽，尿鈣，羥脯氨酸和尿吡啶啉和脫氧吡啶啉。人們認(rèn)識(shí)到前面提到的化學(xué)性標(biāo)志物水平的降低提示骨吸收降低且骨損失正在減少。另外可通過(guò)測(cè)定骨強(qiáng)度的增加，尤其是骨扭轉(zhuǎn)強(qiáng)度的增強(qiáng)來(lái)確定OPG融合多肽的治療有效量。
總體而言，OPG融合多肽的治療有效量從大約0.1mg/kg到10mg/kg，優(yōu)選從1mg/kg到10mg/kg。由于OPG融合多肽的半衰期增加，尤其是OPG融合到免疫球蛋白Fc區(qū)的融合蛋白，所以它們的施用不象未經(jīng)修飾的OPG多肽那么頻繁，其施用頻率為大約每月一次，或者每?jī)蓚€(gè)月一次，或每三個(gè)月一次。該領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)贊同其準(zhǔn)備的劑量和施用頻率要取決于幾個(gè)因素，包括劑型，施用途徑，被治療的病情等等，工作人員會(huì)很容易地確定。
所施用的OPG融合蛋白的量可應(yīng)用融合蛋白的診斷性檢測(cè)方法來(lái)確定。這樣的診斷性檢測(cè)方法可以為抗體檢測(cè)形式，如抗體夾心法，其中抗體與OPG融合蛋白特異性結(jié)合，而不與內(nèi)源的天然循環(huán)著的OPG或與OPG融合也可自然循環(huán)著的異源蛋白，如自然循環(huán)著的抗體的Fc區(qū)結(jié)合?？蓱?yīng)用該領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的多種以抗體為基礎(chǔ)的檢測(cè)模式進(jìn)行OPG融合蛋白水平的測(cè)定。
提供以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更全面地闡述，但本發(fā)明并不僅限于其范圍。
實(shí)施例1OPG融合多肽的構(gòu)建及表達(dá)用于制備相應(yīng)OPG融合多肽的編碼OPG[1-194]-Fc、OPG[1-201]-Fc、OPG[1-194]-FcΔC、OPG[1-201]-FcΔC、OPG[1-194]-FcG10和metFcΔC-OPG[22-194]的質(zhì)粒構(gòu)建大體按WO 97/23614和共同未決的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)＿＿，申請(qǐng)日1999 9月＿。二者中論述的。二者在此均作為參考。多肽的序列分別示于圖3-8。
OPG融合多肽哺乳類和細(xì)菌宿主細(xì)胞的表達(dá)大體按WO97/23614進(jìn)行。
實(shí)施例2在乳腺癌模型中OPG活性對(duì)溶解性骨病的作用將人MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞(1.0×105細(xì)胞/鼠，ATCC#HTB-26)直接通過(guò)左心室注入到7-8周齡雌性Balb/c nu/nu小鼠的全身循環(huán)中。腫瘤接種之后立即給小鼠靜脈注射磷酸鹽生理鹽水緩沖液(PBS)或met FcΔC-OPG[22-194](25 mg/kg)，每周3次，共4周。通過(guò)X光照來(lái)估計(jì)損傷數(shù)/鼠。按下面描述的那樣用組織學(xué)方法來(lái)評(píng)價(jià)骨、心臟、肺、肝、腎、腎上腺、卵巢、大腦、胰腺和脾臟中存在的腫瘤灶。
如圖9所示，接種MDA-MB-231細(xì)胞4周后在長(zhǎng)骨出現(xiàn)明顯的放射線照片上的損傷。接種的同時(shí)靜脈內(nèi)施用劑量為25mg/kg的metFcΔC-OPG[22-194]，每周3次，可完全抑制相關(guān)的骨破壞(6.2±0.8vs 0.0±0.0損傷/鼠，p＜0.001)。
實(shí)施例3OPG在小鼠腺癌模型中對(duì)溶解性骨病的活性將鼠C26-DCT腺癌細(xì)胞(來(lái)自國(guó)立癌癥研究所的腫瘤儲(chǔ)存庫(kù)，1.0×105細(xì)胞/鼠)從左心室直接注入到7-8周齡雌性CDF1小鼠的全身循環(huán)系統(tǒng)。腫瘤接種后立即靜脈內(nèi)注射或者PBS或者met FcΔC-OPG[22-194](25mg/kg)，每3天1次，共9天。在第10天給小鼠進(jìn)行X射線照片，取組織樣進(jìn)行組織學(xué)評(píng)估。
如圖9所示，心內(nèi)接種C26-DCT細(xì)胞后10天射線照片性損傷很明顯(3.1±0.6損傷/鼠)并且骨破壞被靜脈內(nèi)注射FcdC-OPG[22-194]抑制。
在另一研究中，如上給小鼠接種C26-DCT細(xì)胞，靜脈內(nèi)注射PBS或met Fc-OPG[22-194]，劑量為3，1，0.3，或0.1mg/kg，每3天1次共9天。在第10天對(duì)小鼠進(jìn)行X線照片。對(duì)X線片進(jìn)行分析，對(duì)組織進(jìn)行如下處理。經(jīng)靜脈內(nèi)met FcΔC-OPG [22-194]治療X線攝影的損傷以劑量依賴性方式減輕。(圖10)。
實(shí)施例4OPG在小鼠腺癌模型中對(duì)高鈣血癥的活性10-12周齡的雄性Balb/c×DBA/2(DCF1)小鼠購(gòu)自HarlanSprague Dawley(San Diego，CA)或Charles River(Wilmington，MA)。
C-26腫瘤，最初是通過(guò)直腸內(nèi)反復(fù)滴注N-亞硝基-N-甲基烏拉坦(NMU)而在雌性Balb/c小鼠中誘導(dǎo)的(Corbett等，Cancer Res，35，2434-2439(1975))。以組織碎片的形式獲自國(guó)立癌癥研究所的腫瘤儲(chǔ)存庫(kù)。機(jī)械性破碎組織碎片，在標(biāo)準(zhǔn)的組織培養(yǎng)條件(37℃、5-6％CO2)下培養(yǎng)，這樣產(chǎn)生能不斷繁殖的貼壁細(xì)胞系，隨后凍存。體外傳代用的培養(yǎng)基是DMEM，加10％FCS，1×青鏈霉素/谷氨酰胺和1×非必須氨基酸。所有實(shí)驗(yàn)的開始應(yīng)用公共儲(chǔ)存的獨(dú)立凍存管的細(xì)胞。復(fù)蘇培養(yǎng)后，用胰化消化后收集細(xì)胞，然后洗幾次，重懸在沒(méi)有添加物的DMEM中，使?jié)舛冗_(dá)2.5×106細(xì)胞/ml。在剃毛了的右側(cè)區(qū)給動(dòng)物皮下(SQ)注射0.2cc(0.5×106細(xì)胞)。可以發(fā)現(xiàn)在這些情況下腫瘤生長(zhǎng)非常一致，差異最小。
治療在第8天(預(yù)防研究)開始或者當(dāng)血離子鈣水平達(dá)到＞1.60mmol/L時(shí)(治療研究)開始。在預(yù)防性研究中治療持續(xù)8天，在治療性研究中持續(xù)4天。在預(yù)防性研究中met FcΔC-OPG[22-194]每天施用，它以PBS為載體，皮下注射到腹側(cè)區(qū)。治療研究中，met FcΔC-OPG [22-194]在PBS中單次靜脈內(nèi)注射施用。在兩組研究中正常和荷瘤對(duì)照動(dòng)物均接受同樣的PBS注射。
在研究過(guò)程中，給小鼠每天稱重(治療時(shí))，在預(yù)防研究中隔天監(jiān)測(cè)血離子鈣水平(當(dāng)天施用藥物以前)，在治療組中每天監(jiān)測(cè)。球后取血，應(yīng)用血離子鈣/pH分析儀(Chiron Diagnostics#634，Norwood，MA)測(cè)定血清離子鈣。組織學(xué)評(píng)估在研究結(jié)束的時(shí)候從每一動(dòng)物收集一條腿(股骨和脛骨連接的)。骨頭在磷酸緩沖的鋅溶液配制的福爾馬林中固定，蟻酸中脫鈣，石蠟包埋。在股骨遠(yuǎn)端和脛骨近端的中間區(qū)域進(jìn)行切片，反應(yīng)以證明酒石酸抗性的酸性磷酸酶活性(TRAP)，用蘇木素復(fù)染。在染色過(guò)程中，破骨細(xì)胞被染成紅色，而其它類型的細(xì)胞、骨和軟骨被染成不同程度的蘭色。
計(jì)算是應(yīng)用Osteomeasure骨分析程序(Osteometrics Inc.，Decatur，GA)，在剛好遠(yuǎn)離脛骨近端生長(zhǎng)盤(在主要的骨松質(zhì)區(qū))的區(qū)域，以及與第一次測(cè)量區(qū)域2mm遠(yuǎn)的脛骨皮層體區(qū)測(cè)量。選擇脛骨兩個(gè)不同的區(qū)域進(jìn)行測(cè)量以準(zhǔn)確測(cè)定腫瘤誘導(dǎo)的骨吸收增加。測(cè)量的范圍在每一部位均包括1mm×1mm平方面積，但在第一次測(cè)量區(qū)內(nèi)不包括生長(zhǎng)盤。測(cè)量的指標(biāo)是破骨細(xì)胞和骨表面的數(shù)目和活性表面。結(jié)果記錄為破骨細(xì)胞數(shù)目(OcN)，破骨細(xì)胞周長(zhǎng)(活化的破骨細(xì)胞表面)(OcPm)，骨周長(zhǎng)(骨表面)(BPm)。破骨細(xì)胞要被計(jì)算在內(nèi)的話它必須是TRAP陽(yáng)性并且與骨表面連接。所有的計(jì)算是在安裝在顯微鏡上的轉(zhuǎn)寫器的幫助下，將切片中的圖像轉(zhuǎn)變成數(shù)碼平臺(tái)進(jìn)行的。結(jié)果OPG治療緩和C-26腺癌對(duì)體重?fù)p失的作用。每天接受2.5mg/kgOPG治療的小鼠損失的體重平均為5.2g，而未經(jīng)治療的荷瘤鼠平均損失6.2g。PBS荷瘤鼠的腫瘤為3.47±0.72％而OPG 2.5mg/kg的為3.42±0.82％。重量為PBS 0.75±0.14g，OPG 2.50.79±0.16g。OPG預(yù)防并逆轉(zhuǎn)C-26腫瘤誘導(dǎo)的血離子鈣水平增高當(dāng)腫瘤移植后9天開始治療時(shí)，OPG劑量依賴性地抑制腫瘤誘導(dǎo)的全血離子鈣水平的增加(見圖11A)。在OPG開始治療前，荷瘤鼠全血離子鈣水平輕微增加(1.34±0.06mmol/L對(duì)1.25±0.02mmol/L)。在溶劑治療組，其水平在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中持續(xù)增長(zhǎng)，最大值為1.84±0.12mmol/L，在第13和15天達(dá)到，在第16天輕微下降。OPG治療組證實(shí)在整個(gè)治療階段，它劑量依賴性地抑制全血離子鈣水平的增加，在2.5mg/kg組，第15天的離子鈣水平最高達(dá)1.38±0.06mmol/L。這種鈣離子中度但明顯高于非荷瘤對(duì)照鼠的水平。OPG治療在非荷瘤小鼠中對(duì)鈣水平無(wú)效。
當(dāng)在治療前允許小鼠自然發(fā)展為高鈣血癥時(shí)，單獨(dú)5.0mg/kg的OPG能快速降低鈣水平，12小時(shí)證明有顯著下降，治療24h內(nèi)達(dá)到血鈣正常(見圖11B)。在持續(xù)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)研究中，OPG維持血鈣在正常水平。OPG預(yù)防并逆轉(zhuǎn)C-26腫瘤誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞在線的骨表面和破骨細(xì)胞增加破骨細(xì)胞在線的表面和破骨細(xì)胞數(shù)目在荷C26腫瘤的高鈣血癥小鼠中也進(jìn)行了顯著性評(píng)估。用2.5mg/kg的OPG蛋白治療，無(wú)論先于高鈣血癥發(fā)生或是發(fā)生之后進(jìn)行治療，均能引起破骨細(xì)胞的幾乎徹底消失。破骨細(xì)胞表面測(cè)量，是骨吸收量的指示，在荷瘤動(dòng)物中顯著增加，為8.9±2.1％，非荷瘤對(duì)照為3.91±1.01％。高鈣血癥形成以前每天施用2.5mg/kg的OPG可劑量依賴性地將之降為0.13±0.07％，這甚至比非荷瘤對(duì)照動(dòng)物的均低。
每mm骨表面積的破骨細(xì)胞數(shù)也進(jìn)行了估計(jì)，荷瘤鼠為4.41±1.03mm，而非荷瘤對(duì)照組為2.00±0.52mm。每天應(yīng)用2.5mg/kg OPG劑量依賴性地將破骨細(xì)胞數(shù)降到每mm為0.12±0.06mm，這甚至明顯低于非荷瘤動(dòng)物的。OPG治療劑量依賴性地降低破骨細(xì)胞的大小和數(shù)目破骨細(xì)胞表面占骨表面百分率的測(cè)量以及每mm骨表面的破骨細(xì)胞數(shù)在荷瘤動(dòng)物和非荷瘤動(dòng)物中進(jìn)行了顯著性比較，荷瘤對(duì)照組的分別是8.95±1.64％和4.12±0.72破骨細(xì)胞/mm，而非荷瘤對(duì)照組的分別是3.66±1.01％和1.83±0.54破骨細(xì)胞/mm。每天施用2.5mg/kg的OPG能將這些數(shù)值明顯降到甚至比正常范圍還低的水平-1.26±0.93％和0.73±0.05破骨細(xì)胞/mm。
* * *盡管本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案方面進(jìn)行了描述，但該領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)對(duì)其進(jìn)行變化和修飾。因此，希望附加的權(quán)利要求覆蓋了所有屬于本發(fā)明權(quán)利要求范圍之內(nèi)的同等變異體。
序列表<110>AMGEN INC.<120>預(yù)防或治療癌癥及與癌癥相關(guān)的骨損失的組合物和方法<130>A-605<140>09/389，545<141>1999-09-03<160>8<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>232<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>1Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala1 5 10 15Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro20 25 30Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val35 40 45Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val50 55 60Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln65 70 75 80Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln85 90 95Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala100 105 110Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro115 120 125Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr130 135 140Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser145 150 155 160Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr165 170 175Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr180 185 190Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe195 200 205Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys210 215 220Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys225 230<210>2<211>401<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>2Met Asn Lys Trp Leu Cys Cys Ala Leu Leu Val Leu Leu Asp Ile Ile1 5 10 15Glu Trp Thr Thr Gln Glu Thr Leu Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp20 25 30Pro Glu Thr Gly His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Ala Pro Gly Thr35 40 45Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Val Arg Arg Lys Thr Leu Cys Val Pro50 55 60Cys Pro Asp His Ser Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys65 70 75 80Val Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Ser Val Lys Gln Glu85 90 95Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys Glu Cys Glu Glu Gly Arg Tyr100 105 110Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Ser115 120 125Gly Val Val Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Lys130 135 140Cys Pro Asp Gly Phe Phe Ser Gly Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys145 150 155 160Ile Lys His Thr Asn Cys Ser Thr Phe Gly Leu Leu Leu Ile Gln Lys165 170 175Gly Asn Ala Thr His Asp Asn Val Cys Ser Gly Asn Arg Glu Ala Thr180 185 190Gln Lys Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg195 200 205Phe Ala Val Pro Thr Lys Ile Ile Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val210 215 220Asp Ser Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile225 230 235 240Lys Arg Arg His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys Leu245 250 255Trp Lys His Gln Asn Arg Asp Gln Glu Met Val Lys Lys Ile Ile Gln260 265 270Asp Ile Asp Leu Cys Glu Ser Ser Val Gln Arg His Leu Gly His Ser275 280 285Asn Leu Thr Thr Glu Gln Leu Leu Ala Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly290 295 300Lys Lys Ile Ser Pro Glu Glu Ile Glu Arg Thr Arg Lys Thr Cys Lys305 310 315 320Ser Ser Glu Gln Leu Leu Lys Leu Leu Ser Leu Trp Arg Ile Lys Asn325 330 335Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu Met Tyr Ala Leu Lys His Leu340 345 350Lys Thr Ser His Phe Pro Lys Thr Val Thr His Ser Leu Arg Lys Thr355 360 365Met Arg Phe Leu His Ser Phe Thr Met Tyr Arg Leu Tyr Gln Lys Leu370 375 380Phe Leu Glu Met Ile Gly Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys385 390 395 400Leu<210> 3<211> 407<212> 蛋白質(zhì)<213> 人<400> 3Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr reu His Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His1 5 10 15Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His20 25 30Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr35 40 45Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro50 55 60Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His65 70 75 80Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe85 90 95Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala100 105 110Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe115 120 125Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn130 135 140Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr His145 150 155 160Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ala Ala165 170 175Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala180 185 190Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro195 200 205Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val210 215 220Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val225 230 235 240Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln245 250 255Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln260 265 270Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala275 280 285Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro290 295 300Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr305 310 315 320Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser325 330 335Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr340 345 350Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr355 360 365Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe370 375 380Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys385 390 395 400Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly405<210>4<211>413<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>4Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His1 5 10 15Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His20 25 30Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr35 40 45Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro50 55 60Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His65 70 75 80Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe85 90 95Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala100 105 110Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe115 120 125Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn130 135 140Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr His145 150 155 160Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys Cys Gly Ile165 170 175Asp Val Thr Ala Ala Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr180 185 190Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe195 200 205Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro210 215 220Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val225 230 235 240Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr245 250 255Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val260 265 270Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys275 280 285Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser290 295 300Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro305 310 315 320Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val325 330 335Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly340 345 350Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp355 360 365Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp370 375 380Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His385 390 395 400Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly405 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權(quán)利要求
1.一種預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物溶解性骨疾病的方法，它包括施用治療有效量的OPG多肽。
2.一種預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移到骨骼的方法，它包括施用治療有效量的OPG多肽。
3.一種預(yù)防骨硬化性骨轉(zhuǎn)移的方法，它包括施用治療有效量的OPG多肽。
4.權(quán)利要求1或2或3的方法，它還包括施用治療有效量的腫瘤治療劑。
5.權(quán)利要求1或2或3或4的方法，其中OPG多肽包括如圖2中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO2)或其截短了的多肽。
6.權(quán)利要求4的方法，其中OPG多肽包括如圖2(SEQ ID NO2)所示氨基酸殘基186-401部分或整個(gè)的羧基末端截短物。
7.權(quán)利要求4的方法，其中OPG多肽包括圖2所示(SEQ ID NO2)的氨基酸殘基22-194。
8.權(quán)利要求5，6或7的方法，其中OPG多肽是一種OPG融合多肽。
9.權(quán)利要求8的方法，其中OPG融合多肽包括Fc區(qū)向OPG多肽N-末端或C-末端的融合。
10.權(quán)利要求9的方法，其中OPG融合多肽包括一融合到圖2(SEQID NO2)中氨基酸殘基22-194的Fc區(qū)。
11.權(quán)利要求10的方法，其中OPG融合多肽包括圖5或圖8(SEQID NO5或SEQ ID NO8)中所示的氨基酸序列。
12.權(quán)利要求1或2或3的方法，其中OPG多肽先于癌癥治療劑施用，或同時(shí)、或其后施用。
13.權(quán)利要求1或3的方法，其中溶解性骨病與轉(zhuǎn)移到骨的癌癥相關(guān)。
14.權(quán)利要求13的方法，其中癌癥選自乳腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、腎臟癌、肺癌、食管癌、直腸癌、膀胱癌、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、胃腸道癌、多發(fā)性骨髓瘤和淋巴瘤。
15.權(quán)利要求1，2或3的方法，其中癌癥治療劑選自放射、化療、抗體或非抗體多肽。
16.權(quán)利要求15的方法，其中化療包括蒽環(huán)類、紫杉酚、三苯氧胺、阿霉素和5-氟尿嘧啶。
17.權(quán)利要求15的方法，其中抗體與腫瘤細(xì)胞表面的Her2，CDC20，CDC33，粘蛋白樣糖蛋白或表皮生長(zhǎng)因子結(jié)合。
18.權(quán)利要求15的方法，其中腫瘤治療劑包括促黃體素釋放激素(LHRH)的拮抗劑。
19.權(quán)利要求18的方法，其中LHRH拮抗劑包括以下結(jié)構(gòu)A-B-C-D-E-F-G-H-I-J其中A為pyro-glu，Ac-D-Nal，Ac-D-Qal；Ac-Sar或Ac-D-Pal；B為His或4-Cl-D-Phe；C為Trp，D-Pal，D-Nal，L-Nal-D-Pal(N-O)，或D-Trp；D為Ser；E為N-Me-Ala，Tyr，N-Me-Tyr，Ser，Lys(iPr)，4-Cl-Phe，His，Asn，Met，Ala，Arg或Ile；F為 其中R和X獨(dú)立地為H和烷基，Y包括一小的極性部分；G為L(zhǎng)eu或Trp；H為L(zhǎng)ys(iPr)，Gln，Met或Arg；I為Pro；J為Gly-NH2或D-Ala-NH2；或其可藥用的鹽。
20.權(quán)利要求18的方法，其中LHRH拮抗劑包括該肽N-Ac-D-Nal-4-Cl-Phe-D-Pal-Ser-N-Me-Tyr-D-Asn-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2。
21.權(quán)利要求1，2，3或8的方法，其中治療有效量的OPG多肽或OPG融合多肽為0.1mg/kg～10mg/kg。
22.一種預(yù)防或治療多發(fā)性骨髓瘤的方法，它包括施用治療有效量的OPG多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及預(yù)防和/或治療腫瘤相關(guān)骨損失的組合物和方法。更具體地講,本發(fā)明涉及OPG組合物及包括應(yīng)用該組合物來(lái)預(yù)防和/或治療骨損失的方法。本發(fā)明還涉及OPG組合物治療多發(fā)性骨髓瘤的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1345246SQ00802472
公開日2002年4月17日 申請(qǐng)日期2000年8月18日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月3日
發(fā)明者C·R·敦斯坦 申請(qǐng)人:安姆根有限公司