專利名稱：高肝素結(jié)合力的多肽變異體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多肽變異體，它能增強(qiáng)與肝素的結(jié)合力。此外，它也與編碼這些變異體的核酸分子，包含有這些核酸分子的宿主細(xì)胞，以及制備多肽變異體和重組的多肽變異體的方法有關(guān)。同時(shí)，本發(fā)明也涉及運(yùn)用這些多肽變異體刺激軟骨生成、骨生成、傷口愈合，治療炎癥和腫瘤。另外，該發(fā)明還涉及包含這些變異體的誘導(dǎo)骨生成的藥物組合物。
許多生物學(xué)因子影響人和動(dòng)物的細(xì)胞、組織和器官的生長(zhǎng)和再生。迄今，人們對(duì)其中許多因子知之甚少，對(duì)其調(diào)控過(guò)程不甚了解。骨生成過(guò)程就是其中一例，它可被區(qū)分成為數(shù)個(gè)連續(xù)的單個(gè)過(guò)程，如趨化、有絲分裂和分化過(guò)程等。趨化在這里是指主要包含不溶性的I型膠原在內(nèi)的不溶性的脫礦物質(zhì)的骨基質(zhì)釋放的信號(hào)連接產(chǎn)生的化學(xué)梯度引起細(xì)胞的直接遷移。不溶性的I型膠原可與血漿纖維結(jié)合蛋白結(jié)合，后者結(jié)構(gòu)中有與膠原，纖維蛋白和肝素結(jié)合的部位。
骨生成的調(diào)控主要包括兩組生物學(xué)活性因子，即全身性活性因子和局部性活性因子。
全身性活性因子包括PTH(甲狀旁腺素)和1、25-二羥維生素D3。兩者可調(diào)節(jié)內(nèi)源性鈣濃度。此外降鈣素也參與成骨過(guò)程，它可抑制骨吸收。雌激素、雄激素、生長(zhǎng)激素、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、甲狀腺素和糖皮質(zhì)激素均為全身性活性因子，參與成骨過(guò)程。
局部活性因子包括(1)影響骨分解的細(xì)胞因子有IL-1、腫瘤壞死因子(TNF)、IL-6、IL-11和ODF(破骨分化因子，TRANCE)；(2)抑制骨分解的細(xì)胞因子有IL-4、IL-13、IL-18、OPG(OSTEOPROTEGERIN)、IFN(干擾素)和IL-1ra(白介素-1受體拮抗劑)(3)集落刺激因子M-CSF(巨噬系集落刺激因子)和GM-CSF(粒巨集落刺激因子)；(4)前列腺素、白三烯和一氧化氮；
(5)生長(zhǎng)因子IGF(胰島素樣生長(zhǎng)因子)，decapentaplegic-Vg-related(DVR)家族中的蛋白，包括TGF-β(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β)超家族蛋白，其包括活化/抑制劑家族的各種蛋白、MIS(苗勒抑制底物)、GDF(生長(zhǎng)/分化因子)、nodal和dorsalin；FGF(纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子)，PDGF(血小板衍化生長(zhǎng)因子)，和PTHrP(PTH相關(guān)蛋白或者甲狀旁腺素相關(guān)蛋白)在本發(fā)明中，TGF-β超家族非常重要。
到目前為止，各種生物體中除尚未得到公認(rèn)的Orthologs外，TGF-β超家族包括20余種蛋白質(zhì)，除TGF-βs外，還包括BMPs(骨形態(tài)生成蛋白)，GDFs(生長(zhǎng)分化因子)的抑制素/活化素以及其它蛋白(Kingsley，1994)均由兩個(gè)亞單位構(gòu)成。這兩個(gè)亞單位是由兩個(gè)完全相同的單體形成的同源二聚體，由一個(gè)二硫共價(jià)鍵相連。
迄今發(fā)現(xiàn)TGF-β超家族蛋白結(jié)構(gòu)中的一個(gè)顯著特點(diǎn)是存在″TGF-β/BMP結(jié)構(gòu)″，它包含一個(gè)半胱氨酸結(jié)，一個(gè)α螺旋，每個(gè)單體至少有4股β鏈，在二聚體中構(gòu)成一個(gè)單體獨(dú)特的結(jié)構(gòu)(MC Donald andHendrickson，1993)。氨基酸序列顯著不同，有時(shí)有最高可達(dá)40％的同源率。袢區(qū)和N端序列變化較大，雖然如此，在進(jìn)化過(guò)程中，TGF-β超家族的所有成員的結(jié)構(gòu)和功能仍顯示出令人驚訝的保守程度。它們均含有一個(gè)結(jié)構(gòu)要素稱作″半胱氨酸結(jié)″，它由3個(gè)二硫共價(jià)健形成三環(huán)結(jié)構(gòu)域，在所有TGF-β超家族蛋白中此種結(jié)構(gòu)得以保留并完全相同。除TGF-βs外，其它被深入研究的代表系BMPs中的成員，如BMP-2和BMP-7，以及GDFs成員中的GDF-5，它們均可影響骨和軟骨的發(fā)育和再生。如BMP-2在異位或常位植入中均顯示誘導(dǎo)骨生成的特性。
TGF-β超家族的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)合成，由較大的蛋白前體水解后形成成熟的蛋白。通過(guò)對(duì)蛋白前體Arg××Arg序列的識(shí)別切除，釋放出C端大約100到140個(gè)氨基酸殘基序列，就是所謂的成熟蛋白。
在信號(hào)傳導(dǎo)方面，TGF-β超家族中的細(xì)胞因子與兩種靶細(xì)胞膜受體的胞外肽段結(jié)合，即可誘導(dǎo)的骨髓干細(xì)胞。2型亞單位胞內(nèi)肽段內(nèi)包含一個(gè)蛋白絲氨酸激酶，在與I型亞單位中的配體結(jié)合時(shí)可磷酸化絲氨酸殘基，同時(shí)它也激活1型亞單位內(nèi)的一個(gè)絲氨酸蛋白激酶，后者可磷酸化和激活胞內(nèi)信號(hào)蛋白如SMADS。有證據(jù)提示1、2型亞單位均以二聚體形式存在。最近，激活素受體2型亞單位(Act-RII)的胞外段功能域晶體狀結(jié)構(gòu)已得到確認(rèn)。BMP-2作為TGF-β家族中研究得最深入的蛋白，它通過(guò)半胱氨酸結(jié)中的第一個(gè)半胱氨酸下游的高度保守區(qū)域與受體亞單位結(jié)合。BMP-2中半胱氨酸結(jié)的第一個(gè)胱氨酸上游的高度變異的N端序列并不直接與受體亞單位起反應(yīng)。TGF-β超家族的蛋白與1、2型受體亞單位的相互作用在一定程度上是隨機(jī)的，缺乏特異性。目前對(duì)受體亞單位的通用程度或受體活化機(jī)理差異的程度研究均不明了，特別是目前文獻(xiàn)尚未揭示究竟是此蛋白質(zhì)的哪個(gè)結(jié)構(gòu)域決定其特異性功能，如促骨生成活性。
除受體亞單位外，TGF-β超家族成員還可與其它一系列蛋白相互作用來(lái)調(diào)節(jié)或抑制自身活性。Fetuin/α 2-HS糖蛋白和其衍生的多肽(TRH1)可與BMP-2和TGF-β結(jié)合，而與BMP-2的結(jié)合力更高，它可與受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。哺乳類頭蛋白(NOGGIN PROTEIN)與受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合BMP-2，而它的結(jié)合力更高。有爪蟾蜍卵母細(xì)胞顯示Chordin是BMP-4的抑制劑。Follistatin與激活素有高結(jié)合力，而BMP-7和BMP-2被證明可與肝素結(jié)合。
鑒于其生理學(xué)特性，TGF-β超家族成員顯然在治療運(yùn)用中很有潛力可挖，特別是那些重組蛋白，因?yàn)樗鼈兛纱笈可a(chǎn)，而且，編碼它的核酸在基因治療中也是一項(xiàng)有力工具。
因此，所有TGF-β超家族成員及其生物學(xué)特性改變的變異體引起了人們的普遍重視。Kubleret等(1999)描述了一個(gè)BMP的類似物EHBMP-2的一級(jí)結(jié)構(gòu)，它與人類天然BMP-2的差異在于BMP-2的頭12個(gè)氨基酸被人類IL-2的頭13個(gè)氨基酸序列取代，而被取代的部位正是BMP-2與肝素的高親和部位。這種基因突變的BMP-2類似物在大腸桿菌中重組并表達(dá)。例如體外研究發(fā)現(xiàn)，EHBMP-2在不同細(xì)胞培養(yǎng)中顯示出極低的肝素結(jié)合力和高度生物學(xué)活性。變異體的體內(nèi)活性與天然BMP-2相比，在老鼠體內(nèi)4μM濃度的BMP-2可使所用樣本產(chǎn)生異位骨誘導(dǎo)生成，而EHBMP-2濃度須達(dá)到40μM才能產(chǎn)生同樣效果。此外，在同樣蛋白濃度條件下，BMP-2誘導(dǎo)的新骨生成的最終程度顯著地高于EHBMP-2。
本發(fā)明的目的在于提供在體內(nèi)與野生型相同或更有效的多肽變異體。進(jìn)一步的目標(biāo)在于提供編碼這些多肽變異體的核酸，以及含有這些核酸的載體和宿主細(xì)胞，更進(jìn)一步的目標(biāo)是提供制備多肽的方法。最后還可提供包含這些多肽變異體的藥物組合物并在臨床運(yùn)用。
根據(jù)本發(fā)明，我們將通過(guò)構(gòu)造一個(gè)高肝素結(jié)合力的多肽變異體來(lái)達(dá)到目的，具體描述如下<1>將至少一個(gè)包含氨基酸序列X1X2X3X4X5X6的寡肽加在低肝素結(jié)合力的多肽氨基酸序列中；和/或<2>將至少一個(gè)包含氨基酸序列X1X2X3X4X5X6的寡肽插入一個(gè)多肽的氨基酸序列中；和/或<3>用一個(gè)包含氨基酸序列X1X2X3X4X5X6的寡肽替換多肽的氨基酸序列中至少一個(gè)天然存在的寡肽序列其中X1＝K，R或H；X2＝K，R或H；X3＝K，R，H或無(wú)氨基酸；X4＝非K，R，H的其它任何氨基酸X5＝非K，R，H的其它任何氨基酸，或無(wú)氨基酸X6＝非K，R，H的其它任何氨基酸，或無(wú)氨基酸(序列表中序列1)或者X1＝K，R或H；X2＝非K，R，H的其它任何氨基酸X3＝K，R或H；X4＝非K，R，H的其它任何氨基酸X5＝非K，R，H的其它任何氨基酸或無(wú)氨基酸X6＝非K，R，H的其它任何氨基酸或無(wú)氨基酸(序列表中序列2)下面將詳細(xì)解釋一些術(shù)語(yǔ)以便理解本申請(qǐng)的來(lái)龍去脈。
″多肽″是指包含5個(gè)或5個(gè)以上氨基酸的肽或蛋白，而且至少有一種生物學(xué)活性。該術(shù)語(yǔ)包括多肽的具有生物學(xué)活性的片段，其突變體和融合蛋白。
″高肝素結(jié)合力的多肽變異體″是指與未變異的多肽相比較，它具有與肝素有更高結(jié)合力的多肽變異體。通常與肝素的結(jié)合能力可被檢測(cè)出來(lái)，如在肝素包被載體幫助下的血漿共振分析。具體的實(shí)驗(yàn)條件參見Ruppert等，1996。
″體內(nèi)效率″意味著靶部位預(yù)想效果的實(shí)現(xiàn)度。″體內(nèi)效率″通過(guò)蛋白的生物學(xué)活性和靶部位的蛋白利用率來(lái)檢測(cè)，通過(guò)最后的分析計(jì)算出靶部位的效果。這些方法均已建立。例如BMP-2變異體誘導(dǎo)異位骨生成的方法被公認(rèn)為有用的，這些方法均已建立(參見Kubler&Urist，1991和Kubler等，1999)。
″生長(zhǎng)因子″指可調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和/或分化的具有生物學(xué)活性的多肽。
有關(guān)特異性多肽，它們的氨基酸序列的參考文獻(xiàn)均可獲得。例如可通過(guò)下述網(wǎng)址進(jìn)入公用數(shù)據(jù)庫(kù)(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/)獲得。
″同源率″是指通過(guò)已知的計(jì)算機(jī)程序，例如“計(jì)算機(jī)輔助序列比較”，比較兩個(gè)或更多多肽中氨基酸序列，而獲得的他們之間的相關(guān)程度。(基本的局部校直搜索工具，S.F.Altschul等，J.Mol.Biol.215(1990)，403-410)根據(jù)兩個(gè)或兩個(gè)以上序列中完全相同的區(qū)域所占的百分率來(lái)測(cè)定“同源率”，同時(shí)還須考慮差異或其它序列的獨(dú)特性。通常我們運(yùn)用帶有運(yùn)算規(guī)則的電腦系統(tǒng)來(lái)滿足特定的需要。有關(guān)序列之間產(chǎn)生高度一致來(lái)判斷同源率的更好的方法正在研究中。判斷兩個(gè)序列同源率的程序包括GCG程度包裹和其它一系列程序GAP(Devereux.J等。NucleicAcids Research 12(12)387(1984)；Genetics Computer Group University ofWisconsin，Madison，(WI)；BLASTP，BLASTIN和FASTA(Altschul.S等，J.Mol.Biol.215403-410)(1990))。其中BLASTX程序可以從國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)處和其它途徑(BLAST Mannal，Altshul，S等，NCBNLM NIH Bethesda，MD 20894；Akschul，S等，Mol.Bio.215403-410(1990))獲得。著名的Smith-Waterman演繹法可用于判斷同源率。
比較氨基酸序列差異的相關(guān)參數(shù)包括AlgorithmNeedleman and Wansch，J.Md.Biol.48443-(1970)Comparsion matrixBlosum 62 from Henikolf and Henikolf，PNAS USA89(1992)，10915-10919)Gap Penalty12Gap length Penalty4
Threshold of Similarity0GAP程序適合計(jì)算上述參數(shù)。當(dāng)兩端有裂隙并不減少同源率數(shù)值時(shí)，上述指標(biāo)是氨基酸序列比較時(shí)的預(yù)設(shè)指標(biāo)。對(duì)于與對(duì)照序列有關(guān)的非常短的序列，有必要增加預(yù)期值至1,000,000，而在某些情況下減少到2。其它樣本算法，如間隙開放處罰(gap opening penalties)、間隙延伸處罰(gap extension penalies)，比較基質(zhì)(comparison matrices)，包括程序手冊(cè)中所命名的(Wisconsin package，第9版，1997年9月)均可運(yùn)用。選擇取決于所要做的比較，根據(jù)兩個(gè)序列之間的差異來(lái)選擇，GAP或Best Fit似乎更適用；比較一段序列與延伸序列的資料庫(kù)，F(xiàn)ASTA或BLAST更適用。
運(yùn)用上述方法檢測(cè)出60％的一致性，在本申請(qǐng)中說(shuō)明具有60％的同源率，更高的同源率也根據(jù)此法。
″組氨酸標(biāo)記″指通過(guò)適當(dāng)克隆得到一段含有至少6個(gè)組氨酸氨基酸序列與一段可表達(dá)的序列融合，使產(chǎn)生的融合蛋白在NH2端至少含有6個(gè)組氨酸，它可通過(guò)與Ni2+柱形成配合物而容易被純化提取。
″異源性基因″指結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)，它在同源啟動(dòng)子調(diào)控下不表達(dá)或在其來(lái)源的生物體內(nèi)不表達(dá)，或在非自身啟動(dòng)子調(diào)控下或非本身本源的生物體內(nèi)表達(dá)。
″克隆″指所有現(xiàn)有技術(shù)中運(yùn)用的克隆方法。這些方法均能運(yùn)用于此。此處并未全部詳細(xì)描述。它是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員常用的標(biāo)準(zhǔn)方法。
″適當(dāng)宿主細(xì)胞內(nèi)重組表達(dá)″指所有現(xiàn)有技術(shù)中已知的在已知的表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)方法。這些方法均能運(yùn)用于此，此處并未全部詳細(xì)描述。
令人驚奇的是由于至少一個(gè)包含有本發(fā)明所指出的氨基酸序列的寡肽被增加或/和插入到多肽中，或/和取代了多肽中的一部分氨基酸，如本發(fā)明提供的多肽變異體與多肽原型相比具有更高的肝素結(jié)合力。它與肝素結(jié)合力較強(qiáng)，與其解離度較小。因?yàn)轭惛嗡亟Y(jié)構(gòu)系骨結(jié)構(gòu)的整合性成份，所以多肽變異體與骨結(jié)構(gòu)結(jié)合的能力顯著提高。這個(gè)特性對(duì)骨結(jié)構(gòu)的再生過(guò)程來(lái)說(shuō)顯得很有意義。上述多肽變異體可參與骨的形態(tài)生成(成骨)。該發(fā)明產(chǎn)生的多肽變異體可提高10到30倍與肝素結(jié)合的能力。如圖8所示，肝素結(jié)合力的增加導(dǎo)致體內(nèi)效率的顯著增加。
如上所述，多肽與可誘導(dǎo)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞膜表面的受體共同參與成骨過(guò)程，由形態(tài)發(fā)生蛋白或脫礦質(zhì)骨基質(zhì)發(fā)出的誘導(dǎo)信號(hào)作用于基質(zhì)干細(xì)胞使之分化形成骨細(xì)胞。研究表明高肝素結(jié)合力的多肽，特別是骨誘導(dǎo)的多肽可增加局部成骨部位附近各種成骨蛋白的濃度。然而，肝素可與細(xì)胞膜受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合多肽變異體。運(yùn)用多肽變異體被認(rèn)為可減少多肽特異性受體所需的多肽用量，并消弱其信號(hào)傳導(dǎo)。
令人驚奇的是我們發(fā)現(xiàn)變異體多肽生物學(xué)利用率不受肝素自發(fā)性親和力升高的影響，而是與特異性受體所需的多肽局部濃度的增高有關(guān)。
此外，多肽變異體誘生的體內(nèi)骨生成，其質(zhì)量?jī)?yōu)于未經(jīng)改變的多肽。
優(yōu)選方案中，本發(fā)明將氨基酸序列加入、插入或替換到成熟多肽的N端頭20個(gè)氨基酸內(nèi)，最好在頭5個(gè)氨基酸序列內(nèi)。
屬于TGF-β超家族的多肽，比如BMP-2這樣的成熟多肽可通過(guò)下述方法確認(rèn)用關(guān)鍵詞″BMP-2″查尋″Swiss-Prot″數(shù)據(jù)庫(kù)(當(dāng)前網(wǎng)址http//expasy.hcuge.ch/cgibin/sprot-search-de)，在編號(hào)P12643下可找到人類BMP-2整個(gè)前蛋白的氨基酸序列，爾后可在″骨形態(tài)發(fā)生蛋白2″下選出成熟蛋白的序列，即283至396位氨基酸殘基。為鑒別TGF-β超家庭中其它蛋白，可將283-396位氨基酸序列提交至EMBent-CH的″BLAST2″(Lansanne，Switzerland)，在Swiss-Prot+TrEMBL+TrEMBL-New數(shù)據(jù)庫(kù)中用程序″blastp″查尋。運(yùn)用對(duì)比基質(zhì)Blosum 62，可獲得該蛋白250個(gè)高度相關(guān)蛋白，程序提供相應(yīng)的″Swiss-Prot″數(shù)據(jù)庫(kù)的序號(hào)，可依此序號(hào)找出整個(gè)前蛋白的氨基酸序列。每個(gè)成熟蛋白的序列段均有提示。因?yàn)槌墒斓鞍资峭ㄟ^(guò)RXXR識(shí)別序列被正常切割的，所以其序列均能從此獲得。(X代表任何氨基酸)如前所述，TBF-β超家族中的多肽均包含″半胱氨酸結(jié)″的結(jié)構(gòu)單位(McDonald和Hendrickson，1993)對(duì)于超家族中的蛋白，其半胱氨酸結(jié)的上游均為N端區(qū)域。本發(fā)明所插入的氨基酸序列最好在半胱氨酸結(jié)上游。
更具體地說(shuō)，包含氨基酸序列的寡肽在本發(fā)明中可1到4次通過(guò)加入、插入或替換的方式進(jìn)入多肽中。該寡肽的復(fù)制物也可插入1個(gè)或多個(gè)多肽位點(diǎn)。
在特別優(yōu)選方案中，具體來(lái)說(shuō)該寡肽包含RKRA(序列表中序列3)或RKRAKHKQ(序列表中序列4)序列。進(jìn)而言之，多肽變異體的N端包含一段M或MZ序列以便于重組表達(dá)，M指蛋氨酸，Z指一個(gè)或多個(gè)所需氨基酸。如MZ可代表普通技術(shù)人員已知的一段為信號(hào)序列，表達(dá)許多原核或真核蛋白。它可為一段適合于所用表達(dá)系統(tǒng)的信號(hào)序列，或″同源″信號(hào)序列，即一個(gè)蛋白的自然附屬物，最后成為一個(gè)有插入蛋白水解酶切割位點(diǎn)的信號(hào)序列的復(fù)合物。
該多肽變異體優(yōu)選包含有一個(gè)組氨酸標(biāo)記，多肽變異體NH2端的組氨酸標(biāo)記有利于蛋白的純化，如前所述通過(guò)鎳柱配合作用純化提取蛋白。
多肽變異體具有生物學(xué)活性，原則上來(lái)說(shuō)，當(dāng)帶有負(fù)電荷胞內(nèi)和胞外結(jié)構(gòu)的擴(kuò)散限制了多肽的生物學(xué)活性時(shí)其生物學(xué)活性是重要的。因胞外基質(zhì)包含有蛋白多糖和葡糖胺聚糖而使其結(jié)構(gòu)帶有負(fù)電荷，如肝素、硫酸軟骨素，硫酸角質(zhì)素和硫酸皮膚素。在優(yōu)選的方案中，生物學(xué)活性調(diào)控人或動(dòng)物細(xì)胞、組織器官的發(fā)育和分化。
在此更重要的是多肽變異體可調(diào)控骨生成(成骨活性)。成骨活性可測(cè)量，如通過(guò)35SO4標(biāo)記的生長(zhǎng)因子依賴的雞胚肢芽的蛋白多糖結(jié)構(gòu)可檢測(cè)骨形態(tài)生成活性。選擇BMVP蛋白的敏感濃度范圍可確定最大細(xì)胞反應(yīng)和EC50(50％最大反應(yīng)的濃度)。檢測(cè)所需條件參見Ruppert等1996。
另外，小鼠成纖細(xì)胞株C2C12可用于檢測(cè)BMP依賴的堿性磷酸酶的誘生(katagiri等，1994)，此法也能檢測(cè)最大細(xì)胞反應(yīng)和EC50。
優(yōu)選方案是在激素、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子中選擇多肽，其中特別優(yōu)選的是甲狀旁腺素(PTH)、降鈣素、生長(zhǎng)激素，胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)；影響溶骨的細(xì)胞因子，如IL-1，腫瘤壞死因子(TNF)，IL-6，IL-11和ODF(破骨細(xì)胞分化因子，TRANCE)；抑制骨分解的細(xì)胞因子，IL-4，IL-13，IL-18，IFN(干擾素)，OPG(Osteoprotegerin)和IL-1ra(白介素-1受體拮抗劑)；集落刺激因子有M-CSF(巨噬系集落刺激因子)和GM-CSF(粒巨系集落刺激因子)；生長(zhǎng)因子有1GF(胰島素樣生長(zhǎng)因子)；DVR家族蛋白包括TGF-β超家族(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β)的蛋白，它包括活化素/抑制素家族，MIS(苗勒抑制底物)，GDF(生長(zhǎng)/分化因子)家族，nodal和dorsalin；FGF(纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子)；PDGF(血小板衍化生長(zhǎng)因子)和PTHrP(甲狀旁腺素相關(guān)蛋白)。
特別優(yōu)選的多肽是TGF-β超家族成員中活化素/抑制素家族，MIS，GDF家族，nodal和dorsalin；BMP家族成員，尤其是BMP-2、BMP-4、BMP-5，BMP-6，BMP-7/OP-1，或BMP-8/OP-2，同樣還有BMP-9，BMP-10，BMP-11，BMP-12，BMP-13，BMP-14和BMP-15。
根據(jù)此發(fā)明上述生長(zhǎng)因子的選擇尤為重要，因?yàn)樗鼈冊(cè)诠切螒B(tài)生成中的作用已清楚(Reddi，1998)。這些因子變異體的運(yùn)用可提高其與肝素的結(jié)合力，并不影響其誘生骨特性。
若為TGF-β超家族中的多肽則包含上述″半胱氨酸結(jié)″結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)的氨基酸序列會(huì)插入在多肽序列中的半胱氨酸結(jié)的上游，如在BMP-2中，插入位置可選在成熟蛋白氨基酸殘基第2至3，6-7，10-11，13-14位氨基酸間。因?yàn)門GF-β家族成員的同源率，特別是半胱氨酸的保守結(jié)構(gòu)，操作者可熟練地判斷上述蛋白的位置，并以此類推運(yùn)用于TGF-β家族中其它成員。
所選用的多肽還可以是經(jīng)添加、替換、插入、轉(zhuǎn)換或缺失的激素，細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子，同時(shí)可具有10％，優(yōu)選50％，最好90％的生物活性。比如在骨形態(tài)生成中，骨形態(tài)生成多肽與原始多肽比較，其骨形態(tài)生成多肽的活性可達(dá)到上述指標(biāo)。多肽生物學(xué)活性的檢測(cè)已有公認(rèn)的生物學(xué)活性檢測(cè)方法。
在附加的優(yōu)選方案中，與原型多肽相比，經(jīng)加入、替換、插入、轉(zhuǎn)換或缺失獲得的變異多肽可達(dá)50％或75％或90％的同源率。在某些情況下至少10％的生物活性與最小50％、75％或90％同源率相關(guān)。同樣也適用于50％或90％最小生物學(xué)活性。
具有序列表中序列5(T3)和序列表中序列6(T4)的多肽變異體尤為適合。實(shí)驗(yàn)顯示這些變異體可在穩(wěn)定濃度下增強(qiáng)其效率及改善誘生骨的質(zhì)量。這意味著增加骨基質(zhì)的密度提高骨承受重力的生物機(jī)械能力。
該發(fā)明生產(chǎn)的多肽變異體可被修飾，包括將單體底物二聚化、寡聚化及多聚化。例如與雙環(huán)己基碳化二亞胺交聯(lián)，PEGYLATIN或締合(自我組裝)，所得二聚體、寡聚體和多聚體，可通過(guò)凝膠過(guò)濾分離。進(jìn)一步的修飾包括側(cè)鏈修飾，包括多肽變異體ε-氨基-賴氨酸殘基，氨基端或羧基端修飾，還包括翻譯后水平修飾如蛋白的糖基化或部分/全部脫糖基化。
另外，這項(xiàng)發(fā)明也提供了核酸分子。這些核酸分子含有編碼多肽變異體的核酸序列。
根據(jù)本發(fā)明，包含在核酸分子中的核酸序列可以是來(lái)源于基因組DNA，cDAN或者合成DNA，而合成DNA包括修飾了核苷間鍵的合成DNA。另外，核酸序列也可是RNA序列，但它可能需要經(jīng)重組RNA載體系統(tǒng)后表達(dá)。
優(yōu)選的核酸分子包含了編碼一個(gè)多肽變異體T3或T4的一個(gè)核酸。這種核酸在序列表中的序列7(T3)和序列8(T4)中列舉出來(lái)。所列舉序列7或序列8中的氨基酸替換，人們可以使用基于基因編碼突變的序列來(lái)解釋，這是不言而愈的。在本發(fā)明中，理想的核酸序列是那些適合于宿主密碼子使用的，能提供挑選的，并在宿主某一特定器官特定表達(dá)的一段序列。這發(fā)明也適用于與上面提到的序列互補(bǔ)的序列。
在優(yōu)選方案中，適合于這項(xiàng)發(fā)明的核酸分子包括一個(gè)適于啟動(dòng)子參與核酸序列的表達(dá)的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的選擇依賴于表達(dá)系統(tǒng)?？傮w來(lái)講，可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子如小分子金屬結(jié)合蛋白啟動(dòng)子較好，但基本的啟動(dòng)子也可用。
更優(yōu)選的方案中，核酸分子最少應(yīng)包括部分載體，特別是調(diào)控區(qū)。載體可從噬菌體中選擇，如λ-衍生體，腺病毒，牛痘病毒，桿狀病毒，SV40病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，質(zhì)粒，如腫塊型土壤桿菌菌屬(Agrobacterium tumefaciens)T1質(zhì)粒，YAC載體，BAC載體。理想的載體為PRTSPRC109(Weigel等，1989)和pRBSIIPN25X/O。(Stueber，1994)。
進(jìn)一步，本發(fā)明提供含有核酸分子，并表達(dá)該核酸分子的宿主細(xì)胞。在現(xiàn)有技術(shù)中有許多原核和真核的表達(dá)系統(tǒng)，例如宿主細(xì)胞選自原核細(xì)胞，如大腸桿菌(E.Coli)或枯草桿菌(B.subtilis)，和選自真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞，植物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞和哺乳細(xì)胞，如CHO、COS或Hela細(xì)胞以及衍生物。從現(xiàn)有技術(shù)看，CHO衍生細(xì)胞株的糖基化方式與CHO細(xì)胞本身糖基化方式不同。如果多肽有生物活性，那么由宿主細(xì)胞通過(guò)充分糖基化或消減糖基化得到的多肽變異體，較單純糖基化的多肽變異體有更高的生物學(xué)活性，因?yàn)榍罢叩娜S結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。
本發(fā)明還提供制備高肝素結(jié)合力的多肽的方法。該方法包括如下步驟在多肽的氨基酸序列中加入最少一個(gè)包含從序列表中序列1或2中挑選出來(lái)的氨基酸序列的寡肽，和/或插入最少一個(gè)包含從序列表中序列1或2中挑選出來(lái)的氨基酸序列的寡肽，和/或用包含了從序列表中序列1或序列2中挑選出來(lái)的氨基酸序列的寡肽替換多肽氨基酸序列中自然存在的最少一個(gè)寡肽。
這個(gè)步驟可通過(guò)著名的Menifield合成或酶促合成來(lái)進(jìn)行部分或全部化學(xué)合成的方式來(lái)完成。進(jìn)而言之，這過(guò)程也可通過(guò)基因技術(shù)，如重組表達(dá)來(lái)完成。這項(xiàng)發(fā)明也可以通過(guò)化學(xué)/酶和基因技術(shù)組合的方式來(lái)完成。
在優(yōu)選的方案中，制備方法包括如下步驟1)編碼一個(gè)多肽的核酸體外誘變?nèi)缦?1)在編碼多肽的核酸中增加至少一個(gè)編碼一個(gè)寡肽的核酸；在該寡肽中包含有一個(gè)從序列表中序列1或者序列表中序列2篩選的氨基酸的序列；和/或(2)在編碼多肽的核酸中插入至少一個(gè)編碼一個(gè)寡肽的核酸；在該寡肽中包含有一個(gè)從序列表中序列1或者序列表中序列2篩選的氨基酸的序列；和/或(3)在編碼多肽的核酸的天然存在的序列中，至少一個(gè)核酸序列被一個(gè)編碼一個(gè)寡肽的核酸替換；該寡肽中包含有一個(gè)從序列表中序列1或者序列表中序列2篩選的氨基酸的序列；2)在合適的表達(dá)載體中克隆突變的核酸；3)用獲得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染適合的宿主細(xì)胞；4)在合適的表達(dá)條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞；5)分離，必要時(shí)復(fù)性表達(dá)產(chǎn)物。
眾所周知，DNA序列的表達(dá)方法很多(參看Recombination GeneExpression Protocols in Methods in Molecular Biology.Vol.62 Humana PressTotowa，NEW JERSEY 1995)。表達(dá)過(guò)程是基本的，用普通技術(shù)人員已知的誘導(dǎo)劑，如IPTG，Zn2+，均可誘導(dǎo)的。
編碼有生物活性多肽所需的誘變的核酸序列可以通過(guò)標(biāo)記的核酸探針，在表達(dá)多肽的組織建立cDNA文庫(kù)或基因組DNA文庫(kù)中找到。陽(yáng)性cDNA文庫(kù)或基因組DNA文庫(kù)的確立有一標(biāo)準(zhǔn)程序(參看Maniatis等，分子克隆，1989，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版)。編碼含有本發(fā)明氨基酸序列的多肽的核酸序列，可以通過(guò)盒式誘變或重組PCR插入到雙鏈DNA中，(相應(yīng)方法參看Wang等，1997；Ruppert等，1996)。然后將得到的突變雙鏈DNA插入到表達(dá)載體中。
前已述及常用的載體和宿主細(xì)胞。如果在大腸桿菌中表達(dá)，可通過(guò)鹽酸胍鹽從細(xì)胞不溶部分分離蛋白質(zhì)(Ruppert等，1996)，然后通過(guò)層析法復(fù)性和純化多肽。純化TGF-β超家族蛋白的優(yōu)選條件PH＝8，高鹽濃度(1M，NaCl)，低去污劑和氧化還原劑。
另一方面，如果應(yīng)用了一個(gè)合適的載體的話，可使得有分泌信號(hào)序列的多肽變異體得到恰當(dāng)表達(dá)，這樣，就可從培養(yǎng)基中富集多肽變異體。
本發(fā)明還提供了包括至少一個(gè)多肽變異體和現(xiàn)有技術(shù)中已知的符合生理要求的添加劑的藥物組合物。這種多肽變異體最好從具有生物活性的多肽轉(zhuǎn)化而來(lái)。例如從細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子，特別推薦參與骨形成的激素、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子。多肽變異體和肝素結(jié)合能力增強(qiáng)，可以減少治療用活性多肽變異體從脫礦質(zhì)的骨基質(zhì)的肝素成份中擴(kuò)散損失，從而提高了局部治療活性物的濃度。
細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞表面結(jié)合能力增加也已經(jīng)觀察到了。這樣具有治療性的活性的多肽變異體就可以被用于預(yù)防和治療累及與損害到細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞表面引起的疾病。
如果多肽變異體屬于于DVR家族，他們就適合于促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)和修復(fù)。已經(jīng)觀察到GDF-5參與軟骨的形成，且為韌帶發(fā)育所必需。這樣，從GDF-5衍生的多肽變異體適合于修復(fù)軟骨和韌帶。BMP-7/OP-1抑制GDF-5的生成，兩者可能代表了平衡軟骨和韌帶形成的機(jī)制。已證明BMP-7衍生的多肽變異體在骨和軟骨形成中具有調(diào)節(jié)功能。
BMP-7參與腎和眼的形成；BMP-6參與皮膚形成；BMP-2參與心臟的形成，這樣根據(jù)本發(fā)明，從BMP衍生的多肽變異體可用于調(diào)節(jié)腎、眼、皮膚和心臟的發(fā)育。
另外，GDF-5誘導(dǎo)血管形成，所以，從GDF-5衍生的多肽變異體可以在調(diào)節(jié)血管生成方面起重要作用。
如果制備多肽變異體的多肽屬于TGF-β家族，則具有治療性的多肽變異體適合于免疫抑制、抑制炎癥、刺激骨和軟骨的形成。因其可增加細(xì)胞外基質(zhì)成份(如膠原、纖維結(jié)合蛋白、葡糖胺聚糖、蛋白聚糖)的沉積，它們?cè)诖龠M(jìn)傷口愈合方面是有用的。
另外，以TGF-β家族為基礎(chǔ)的多肽變異體用于預(yù)防視網(wǎng)膜剝離。它也能被用于由于腫瘤化療導(dǎo)致的口腔黏膜炎癥。因TGF--β有普遍抑制細(xì)胞生長(zhǎng)效果，它們可被用于抑制癌細(xì)胞，如乳癌細(xì)胞等。
已經(jīng)知道垂體激素、激活素、抑制素能調(diào)節(jié)女性的月經(jīng)周期。激活素誘導(dǎo)垂體激素FSH和LH的合成，而抑制素則抑制其合成。建議依據(jù)本發(fā)明的多肽變異體調(diào)節(jié)月經(jīng)周期。抑制素抑制性腺腫瘤的生長(zhǎng)，所以由抑制素衍生的多肽變異體可用于預(yù)防和治療性腺腫瘤。
激活素被認(rèn)為參與傷口的愈合，因此本發(fā)明提供了應(yīng)用激活素衍生的多肽變異體生產(chǎn)促傷口愈合的藥物。
激活素可能參與了軟骨到骨的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)變，這樣，激活素衍生的多肽變異體將適用于調(diào)節(jié)軟骨和骨的生長(zhǎng)。
激活素促進(jìn)造血過(guò)程中原始細(xì)胞形成亞單位和集落形成亞單位的擴(kuò)大，而抑制素抑制這些功能，所以這些蛋白衍生的多肽變異體被建議用于造血的調(diào)控。
MIS和GDNF(膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)參與胚胎發(fā)育，可在所制備多肽變異體中特別重要。
在另一具體應(yīng)用中，本發(fā)明提供了一個(gè)包括至少一個(gè)多肽變異體和載體，可用于骨誘導(dǎo)的基質(zhì)。故而，建議在體外的骨誘導(dǎo)過(guò)程中使用該基質(zhì)。
現(xiàn)有技術(shù)提出了包含生長(zhǎng)因子的骨誘導(dǎo)基質(zhì)。例如Integra LifeScience公司生產(chǎn)一種膠原基質(zhì)，包含了重組人BMP-2(Hollinger等，1998)。Sofamor-Danek公司正在開發(fā)包含重組BMP-2的鈦盒。最后，有一種Creative Biomolecules公司制造的名為“NOVOSTM”的裝置。它包含了骨誘導(dǎo)1型骨膠原和重組OP-1(BMP-7)。Stryker公司正在對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)。這種裝置目前在美國(guó)用于三期臨床。它的應(yīng)用包括矯形損傷、上頜面的修復(fù)和無(wú)血管壞死。BMP-7也被建議用于軟骨損傷、腎衰、腦部、骨髓和心臟的損傷以及骨質(zhì)疏松癥。
通常，基質(zhì)物含有骨誘導(dǎo)生長(zhǎng)因子，然后通過(guò)外科手術(shù)將基質(zhì)植入。在這種情況下，基質(zhì)不僅僅是生長(zhǎng)因子的載體，它還提供了一個(gè)穩(wěn)定的物理環(huán)境，阻止軟組織對(duì)骨骼損傷部位的侵入。加入生長(zhǎng)因子可加速新骨對(duì)植入物的替換。
已知基質(zhì)的一個(gè)重要問(wèn)題就是基質(zhì)所包含的蛋白質(zhì)很快從植入部位流失。因?yàn)榧词褂猩L(zhǎng)因子的存在，骨骼修復(fù)也是一個(gè)相對(duì)緩慢的過(guò)程。所加入的蛋白的留置時(shí)間短的，限制了其作用的發(fā)揮。
既然骨誘導(dǎo)生長(zhǎng)因子的生物效應(yīng)是誘導(dǎo)多潛能間質(zhì)細(xì)胞的遷移，從而形成軟骨祖細(xì)胞和成骨祖細(xì)胞，并激發(fā)它們的活性，因此必需使生長(zhǎng)因子局限在需修復(fù)部位。一方面，從修復(fù)部位擴(kuò)散的生長(zhǎng)因子可造成治療的失敗，另一方面有導(dǎo)致異位骨形成的危險(xiǎn)。
根據(jù)本發(fā)明多肽變異體較原多肽具有增強(qiáng)的肝素結(jié)合力，這種特點(diǎn)可通過(guò)使用肝素或肝素樣結(jié)構(gòu)作為基質(zhì)材料，或作為基質(zhì)材料的一部分來(lái)利用，以防止多肽變異體從載體過(guò)快地?cái)U(kuò)散的。這樣，多肽變異體被保持在應(yīng)用部位。在優(yōu)選方案中，載體應(yīng)由肝素、羥磷灰石、透明質(zhì)酸、合成聚合物和膠原構(gòu)成。載體物質(zhì)可以重吸收或不被重吸收。
現(xiàn)有技術(shù)公開了制備藥理上可接受的基質(zhì)的方法。這些基質(zhì)的例子已被Wagner等，(1996)和Fischgrund等(1997)所描述?；|(zhì)可采取塊、膠、羊毛狀物、球或粒的形態(tài)。
基質(zhì)內(nèi)多肽變異體的分配可以是或不是同質(zhì)的，但最好是同質(zhì)的。多肽變異體的分配可被以有利的方式確定，這依賴于傷口的大小和愈合的時(shí)間。載體內(nèi)的多肽變異體的濃度范圍為約100ug/cm3-2mg/cm3，優(yōu)選濃度為250ug/cm3-750ug/cm3，更優(yōu)選濃度450ug/cm3----550ug/cm3。濃度500ug/cm3作為常規(guī)應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明，骨誘導(dǎo)基質(zhì)可用于矯形損傷、上頜面修復(fù)和無(wú)血管壞死。此外，它推薦用于軟骨損傷、腎衰、腦、骨髓、心臟的損傷和骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療。
根據(jù)本發(fā)明，如果在骨誘導(dǎo)基質(zhì)中使用重組方法制備得到的多肽變異體，可使它免于污染。動(dòng)物來(lái)源的生長(zhǎng)因子中常常發(fā)現(xiàn)病毒污染。
根據(jù)本發(fā)明提供的骨誘導(dǎo)基質(zhì)可用于體外使骨祖細(xì)胞和/或軟骨細(xì)胞組織培養(yǎng)使其集落化富集成為可能。這種方法構(gòu)建的骨誘導(dǎo)基質(zhì)可通過(guò)外科手段，自體或異體植入(Kubler等，1997；Kubler等，1998；Chen等，1998)以下圖表和實(shí)施例的目的是為了解釋本發(fā)明，向本領(lǐng)域技術(shù)人員揭示它的進(jìn)一步應(yīng)用，而不是僅局限于這些實(shí)施例。
圖面說(shuō)明

圖1類似于肝素結(jié)構(gòu)的典型葡糖胺聚糖的一些結(jié)構(gòu)示意圖；圖2在大腸桿菌中表達(dá)和分離的T3、T4變異體經(jīng)SDS聚丙烯酰胺電泳分離后，卡馬斯亮藍(lán)染色示意圖；同時(shí)包括氧化型BMP-2和EHBMP-2(上)及還原型BMP-2和EHBMP-2(下)。左邊是分子量標(biāo)準(zhǔn)(15、20、30、35、68和94kD)。從左至右的上柱順序是第1--4道分別為濃度為2umol的BMP-2、EHBMP-2，T3(序列表中序列5)和T4(序列表中序列6)；第5--8道分別為濃度為5umol的BMP-2、EHBMP-2、T3、T4。
圖3用Pharmacia BIA2000系統(tǒng)記錄的T3和T4(序列表中序列5和6)以及BMP-2變異體的肝素結(jié)合力的感應(yīng)測(cè)定值示意圖。
圖4用BIA2000系統(tǒng)記錄的T3和T4(序列表中序列5和6)以及BMP-2變異體與受體BMPR-1A的胞外功能區(qū)的結(jié)合力的感應(yīng)測(cè)定值示意圖。
圖5在用35SO4標(biāo)記的雞胚肢體芽細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中BMP-2、T3變異體、T4變異體的量效曲線。
圖6應(yīng)用C2C12細(xì)胞株進(jìn)行堿性磷酸酶誘生實(shí)驗(yàn)中BMP-2、T3變異、T4變異的量效曲線圖7 7a、7b為BMP-2植入在小鼠誘生骨組織的組織學(xué)圖象，由HE染色。表現(xiàn)為紫色區(qū)域環(huán)繞白色和暗紫色區(qū)域。暗紫色區(qū)域?yàn)楣撬?，白色?xì)胞為存在于正常骨髓中的脂肪組織。周圍的肌肉組織為深紅色。
圖8 T3在小鼠上誘生骨組織的組織學(xué)圖象，HE染色圖9 T3在小鼠上誘生骨組織的X線影象圖10 T3在小鼠上誘生骨組織的組織學(xué)圖象方法肝素結(jié)合的測(cè)定為了檢測(cè)肝素的結(jié)合力，用氨基生物素標(biāo)記肝素6000(Mach等，1993)并固定到鏈親和素包被的生物感應(yīng)器CM5(Pharmacia BiosensorAB)上。多肽和本發(fā)明提供的多肽變異體對(duì)用肝素涂布的生物傳感器的結(jié)合，由BIA2000儀器來(lái)測(cè)量。具體的實(shí)驗(yàn)條件已有報(bào)道(Ruppert等，1996)測(cè)定與受體EMPR-IA的結(jié)合BMPR-IA受體的外功能區(qū)由氨基生物素標(biāo)記(Shen等，1996)，并固定于鏈親和素包被的生物感應(yīng)器CM5(Pharmacia Biosensor AB)上。多肽和本發(fā)明提供的多肽變異體對(duì)用肝素涂布的生物傳感器的結(jié)合，由BIA2000儀器來(lái)測(cè)量。
測(cè)定誘導(dǎo)成骨生物活性如下的細(xì)胞培養(yǎng)體系用來(lái)測(cè)定生物學(xué)活性細(xì)胞從雞胚肢體芽上分離，并用于測(cè)量用35SO4標(biāo)記的BMP依賴的蛋白多糖(Ruppert等，1996)。調(diào)節(jié)BMP蛋白的濃度，使達(dá)到最大的細(xì)胞應(yīng)答及EC50(達(dá)到最大摻入量50％的濃度)。鼠的成肌細(xì)胞株C2C12被用來(lái)確定BMP依賴的堿性磷酸酶誘生(Katagiri等，1994)，并能確定最大細(xì)胞應(yīng)答和EC50的濃度。
實(shí)施例1T3的表達(dá)和鑒定編碼成熟人類BMP-2的cDNA(NIH數(shù)據(jù)庫(kù)Entrez/Swiss-ProtNoP12643)和5′末端的ATGGCT(蛋氨酸-丙氨酸)是主要的誘發(fā)突變部位(Wang等，1997)。在Ncol和Af/ll的單一切點(diǎn)之間插入如下的雙鏈DNA5′CATGGCTCAAGCCAAACACAAACAGCGGAAACGCGCTCGTAAACGTC3′序列表中序列93′CGAGTTCGGTTTGTGTTTGTCGCCTTTGCGCGAGCATTTGCAGAATT5′序列表中序列10因此，精氨酸-賴氨酸-精氨酸-丙氨酸(序列表中序列。3)被插入到人蛋氨酸-丙氨酸-BMP-2分子上第8位的谷氨酰胺和第九位的精氨酸之間。突變的cDNA已作為Ncol/BamH1片段被整合到pRBSIIPN25X/O(Stueber等，1984)表達(dá)載體上。此突變體經(jīng)測(cè)序證實(shí)。
T3變異體經(jīng)表達(dá)和產(chǎn)物分離后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳證實(shí)，與預(yù)期的相同，此法制備的T3具有較BMP-2大的表觀分子量。這與預(yù)計(jì)的相同。T3在生物感應(yīng)實(shí)驗(yàn)中與BMP-2受體BMPR-IA的胞外功能區(qū)可非特異性結(jié)合(解離常數(shù)Kd約為200PM)，而與肝素的結(jié)合能力比BMP-2略強(qiáng)，解離能力下降。
在不同的測(cè)試體系中其生物活性有所改變。雞胚肢體芽細(xì)胞用硫酸鹽標(biāo)記方法測(cè)定的蛋白聚糖合成表明T3較BMP-2有更高的EC50?？勺畲髶饺肓坎蛔儭Ｔ贑2C12細(xì)胞株中進(jìn)行的堿性磷酸酶活性表明T3較BMP-2有更高的EC50值。
實(shí)施例2T4的表達(dá)和鑒定T4的突變部位同T3基本相同，但在BMP-2的cDNA中插入的雙鏈DNA序列有所不同，其插入序列如下5′CATGGCTCAAGCCAAACACAAACAGCGGAAACGCCTAAGCATAAGCAACGTAAGCGTC3′3′CGAGTTCGGTTTGTGTTTGTCGCCTTTGCGCGATTCGTATTCGTTGCATTCGCAGAATT5′上一序列為序列表中序列11，下一序列在序列表為序列表中序列12。
因此，在BMP-2分子的第八位的谷氨酰胺和第九位的精氨酸之間插入序列為精氨酸-賴氨酸-精氨酸-丙氨酸-賴氨酸-組氨酸-賴氨酸-谷氨酰胺。
T4變異體表達(dá)產(chǎn)物分離后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳證實(shí)其表觀分子量較T3和BMP-2稍大。T4與BMP-2受體BMPR-IA胞外功能區(qū)結(jié)合的解離常數(shù)約為340pM，這和BMP-2與其受體的結(jié)合力相關(guān)(Kd320pM)。但是T4和肝素結(jié)合能力比BMP-2強(qiáng)，解離減慢。T4從肝素上釋放的速度比T3還慢。
相對(duì)BMP-2而言T4的生物學(xué)活性的變化表現(xiàn)為在雞胚肢體芽細(xì)胞的蛋白聚糖合成期，硫酸鹽摻入試驗(yàn)，T4有高的EC50值(甚至比T3還高)。同樣，在C2C12細(xì)胞株中進(jìn)行誘導(dǎo)堿性磷酸酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)T4比BMP-2有較高的EC50值實(shí)施例3多肽變異體體內(nèi)效率的研究此處所選用的方法為在鼠的大腿肌肉中誘生異位骨組織。異位骨形成即在不與骨組織接觸的其他組織中形成骨骼。這個(gè)實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)在于有很強(qiáng)的說(shuō)服力。因?yàn)椋慌c任何骨組織接觸，不會(huì)發(fā)生自然再生骨組織的過(guò)程。因此，可排除由于手術(shù)時(shí)骨損傷引起的假陽(yáng)性結(jié)果。
在ICR小鼠誘生異位骨的方法已由KBLER和URIST在1991年詳細(xì)報(bào)道。
BMP-2和T3變異體以不同的濃度混合溶于牛血清白蛋白中，植入到ICR小鼠的股四頭肌中，三周后可由X線攝片或組織學(xué)檢查檢測(cè)到新生骨。
單純牛血清白蛋白植入后不能觀察到新骨形成。在BMP-2和T3組中均無(wú)炎癥或其他損傷后副作用發(fā)生。圖7表示BMP-2能誘生骨基質(zhì)和骨髓形成；圖8表示T3的相應(yīng)的處理結(jié)果。同BMP-2的作用相比，T3誘生以骨基質(zhì)為主。
圖9表示T3植入后誘生小骨的X線影象。同樣條件下，T3誘生的小骨與常規(guī)的BMP-2誘生的小骨，在大小上無(wú)明顯差異圖10顯示T3誘生小骨的組織學(xué)圖象。用Masson-Trichrome染色，這種染色方法可以區(qū)分不同分化階段的骨組織。紅色區(qū)域?yàn)橥耆只墓墙M織，藍(lán)綠色區(qū)域?yàn)檎谶M(jìn)行骨化的組織，在某些地方可在藍(lán)染組織中發(fā)現(xiàn)白色圓形細(xì)胞，稱為軟骨形成細(xì)胞，因?yàn)锽MP-2誘導(dǎo)成骨包括軟骨內(nèi)骨化(一時(shí)性軟骨形成)。
圖7-10的實(shí)驗(yàn)中重組人BMP-2或T3(序列表中序列5)的量為10umol。下表比較了BMP-2和重組T3的體內(nèi)效率。
表1由BMP-2和T3誘導(dǎo)的骨形成比較
以上的比較說(shuō)明低濃度的T3有著比BMP-2更高的骨誘生效率。lug的BMP-2植入后，9個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)象均未觀察到骨組織的形成；而相同量的T3植入后，4個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中全部可觀察到骨組織的形成。即使T3的量?jī)H為0.4ug，在4個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中也有3個(gè)可觀察到誘生骨的形成。
以上結(jié)果表明與高肝素結(jié)合力的多肽變異體能在體內(nèi)誘導(dǎo)骨組織形成，且無(wú)炎癥反應(yīng)和其他耐受現(xiàn)象發(fā)生。與常規(guī)的BMP-2相比，T3誘生的骨組織含有較高的骨基質(zhì)。由于骨基質(zhì)維持骨的機(jī)械穩(wěn)定性，密度高的骨更牢固，承重功能更好。因此，T3誘生的骨的質(zhì)量?jī)?yōu)于BMP-2誘生骨。與BMP-2相比，低濃度的T3在體內(nèi)即可發(fā)揮生物學(xué)作用，減少生長(zhǎng)因子的必須使用量。這是多肽變異體具有令人滿意的優(yōu)點(diǎn)。
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SequenzKünstlicheSequenzWO 00/477362 PCT/EP00/00637<400> 1Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5<210> 2<211> 6<212> PRT<213> Künstliche Sequenz<220><223> Beschreibung der künstlichen SequenzKünstlicheSequenz<220><221> MUTAGEN<222> (1)<223> K，R oder H<220><221> MUTAGEN<222> (2)<223> Kein K，R，H，sonst beliebige Aminosure<220><221> MUTAGEN<222> (3)<223> K，R oder H<220><221> MUTAGEN<222> (4)<223> Kein K，R，H，sonst beliebige Aminosure<220><221> MUTAGEN<222> (5)<223> Kein K，R，H，sonst beliebige oder keineAminosure<220><221> MUTAGEN<222> (6)<223> Kein K，R，H，sonst beliebige oder keineAminosure<400> 2Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5<210> 3<211> 4<212> PRT<213> Künstliche Sequenz<220><223> Beschreibung der künstlichen SequenzWO 00/47736 3 PCT/EP00/00637Heparin-Bindungssequenz<400> 3Arg Lys Arg Ala1<210> 4<211> 8<212> PRT<213> Künstliche Sequenz<220><223> Beschreibung der künstlichen SequenzHeparin-Bindungssequenz<400> 4Arg Lys Arg Ala Lys His Lys Gln1 5<210> 5<211> 120<212> PRT<213> Künstliche Sequenz<220><223> Beschreibung der künstlichen SequenzT3<400> 5Met Ala Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Ala Arg Lys Arg Leu1 5 10 15Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val20 25 30Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr35 40 45Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr50 55 60Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile65 70 75 80Pro Lys AlaCys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu85 90 95Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met100 105 110Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg115 120<210> 6<211> 124<212> PRT<213> Künstliche SequenzWO 00/47736 PCT/EP00/006374<220><223> Beschreibung der künstlichen SequenzT4<400> 6Met Ala Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Ala Lys His Lys Gln1 5 10 15Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Val Asp20 25 30Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr35 40 45His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His50 55 60Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val65 70 75 80Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala85 90 95Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn100 105 110Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg115 120<210> 7<211> 374<212> DNA<213> Künstliche Sequenz<220><223> Beschreibung der künstlichen SequenzT3(Nukleinsuresequenz)<400> 7ccatggctca agccaaacac aaacagcgga aacgcgctcg taaacgtctt aagtccagct 60gtaagagaca ccctttgtac gtggacttca gtgacgtggg gtggaatgac tggattgtgg 120ctcccccggg gtatcacgcc ttttactgcc acggagaatg cccttttcct ctggctgatc 180atctgaactc cactaatcat gccattgttc agacgttggt caactctgtt aactctaaga 240ttcctaaggc atgctgtgtc ccgacagaac tcagtgctat ctcgatgctg taccttgacg 300agaatgaaaa ggttgtatta aagaactatc aggacatggt tgtggagggt tgtgggtgtc 360gctagtaagg atcc 374<210> 8<211> 386<212> DNA<213> Künstliche Sequenz<220><223> Beschreibung der künstlichen SequenzT4(Nukleinsuresequenz)<400> 8ccatggctca agccaaacac aaacagcgga aacgcgctaa gcataagcaa cgtaagcgtc 60WO 00/47736 5 PCT/EP00/00637ttaagtccag ctgtaagaga caccctttgt acgtggactt cagtgacgtg gggtggaatg 120actggattgt ggctcccccg gggtatcacg ccttttactg ccacggagaa tgcccttttc 180ctctggctga tcatctgaac tccactaatc atgccattgt tcagacgttg gtcaactctg 240ttaactctaa gattcctaag gcatgctgtg tcccgacaga actcagtgct atctcgatgc 300tgtaccttga cgagaatgaa aaggttgtat taaagaacta tcaggacatg gttgtggagg 360gttgtgggtg tcgctagtaa ggatcc 386<210> 9<211> 47<212> DNA<213> Künstliche Sequenz<220><223> Beschreibung der künstlichen Sequenzkünstlich<400> 9catggctcaa gccaaacaca aacagcggaa acgcgctcgt aaacgtc 47<210> 10<211> 47<212> DNA<213> Künstliche Sequenz<220><223> Beschreibung der künstlichen Sequenzkünstlich<400> 10ttaagacgtt tacgagcgcg tttccgctgt ttgtgtttgg cttgagc 47<210> 11<211> 59<212> DNA<213> Künstliche Sequenz<220><223> Beschreibung der künstlichen Sequenzkünstlich<400> 11catggctcaa gccaaacaca aacagcggaa acgcgctaag cataagcaac gtaagcgtc 59<210> 12<211> 59<212> DNA<213> Künstliche Sequenz<220><223> Beschreibung der künstlichen Sequenzkünstlich<400> 12ttaagacgct tacgttgctt atgcttagcg cgtttccgct gtttgtgttt ggcttgagc 59
權(quán)利要求
1.一種具有高肝素結(jié)合力的多肽變異體，其特征在于<1>將至少一個(gè)包含氨基酸序列X1X2X3X4X5X6的寡肽加在低肝素結(jié)合力的多肽氨基酸序列中；和/或<2>將至少一個(gè)包含氨基酸序列X1X2X3X4X5X6的寡肽插入一個(gè)多肽的氨基酸序列中；和/或<3>用一個(gè)包含氨基酸序列X1X2X3X4X5X6的寡肽替換多肽的氨基酸序列中至少一個(gè)天然存在的寡肽序列其中X1＝K，R或H；X2＝K，Ror或H；X3＝K，R，H或無(wú)氨基酸；X4＝非K，R，H的其它任何氨基酸X5＝非K，R，H的其它任何氨基酸，或無(wú)氨基酸X6＝非K，R，H的其它任何氨基酸，或無(wú)氨基酸(序列表中序列1)或者X1＝K，R或H；X2＝非K，R，H的其它任何氨基酸X3＝K，R或H；X4＝非K，R，H的其它任何氨基酸X5＝非K，R，H的其它任何氨基酸或無(wú)氨基酸X6＝非K，R，H的其它任何氨基酸或無(wú)氨基酸(序列表中序列2)
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述多肽變異體，其特征在于所說(shuō)的寡肽的1至4份拷貝被插入到多肽的1至4個(gè)位點(diǎn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述多肽變異體，其特征在于所說(shuō)的寡肽包含有氨基酸序列RKRA(序列表中序列3)或RKRAKHKQ(序列表中序列4)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述多肽變異體，其特征在于所說(shuō)的寡肽被加入到N端區(qū)和/或插入到N端區(qū)，和/或替換N端區(qū)的一部分。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述多肽變異體，其特征在于所說(shuō)的多肽變異體的氨基酸序列進(jìn)一步包含一段序列，該序列與在N端的重組表達(dá)有關(guān)；所說(shuō)的與重組表達(dá)相關(guān)的序列是M或MZ，其中M代表蛋氨酸，而Z代表一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4或5所述的多肽變異體，其特征在于所說(shuō)的多肽包含有一個(gè)組氨酸標(biāo)記。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5或6所述的多肽變異體，其特征在于所說(shuō)的多肽具有生物活性。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的多肽變異體，其特征在于所說(shuō)的多肽具有骨生成活性。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的多肽變異體，其特征在于所說(shuō)的多肽是從激素、細(xì)胞因子、和生長(zhǎng)因子中選取的，或者從經(jīng)添加、替換、插入、轉(zhuǎn)換和/或缺失變化的激素、細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子；所說(shuō)的被改變的多肽具有至少10％原多肽生物學(xué)活性，和/或至少50％的同源率。
10.根據(jù)權(quán)利要求7、8或9所述的多肽變異體，其特征在于所說(shuō)的多肽是從包括TGF-β超家族在內(nèi)的DVR家族中選取的。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的多肽變異體，其特征在于所說(shuō)的多肽是BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7/OP-1或BMP-8/OP2。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的多肽變異體，其特征在于所說(shuō)的寡肽被插入到半胱氨酸結(jié)的上游。
13.根據(jù)權(quán)利要求10、11或12所述的多肽變異體，其特征在于所說(shuō)的多肽變異體具有如序列表中序列5(T3)或序列6(T4)所示的序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13所述的多肽變異體，其特征在于所說(shuō)的多肽變異體是上述權(quán)利要求中所述的多肽變異體的二聚體、寡聚體或多聚體。
15.一種核酸分子，含有編碼權(quán)利要求1至14中之一的多肽變異體的核酸序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的核酸分子，其特征在于所說(shuō)的核酸序列來(lái)源于基因組DNA或cDNA，或者是合成的DNA。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的核酸分子，其特征在于包含有適合于調(diào)控表達(dá)的啟動(dòng)子，所說(shuō)的核酸序列是在該啟動(dòng)子的控制下編碼多肽變異體的。
18.根據(jù)權(quán)利要求15、16或17所述的核酸分子，其特征在于所說(shuō)核酸分子至少包含一個(gè)載體的一部分。
19.包含有如權(quán)利要求15至18中所說(shuō)的任何一種核酸分子的宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞是適合于所說(shuō)的核酸分子表達(dá)的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
20.制備如權(quán)利要求1至14之一所述的具有高肝素結(jié)合力的多肽變異體的方法在多肽的氨基酸序列中增加至少一個(gè)寡肽，該寡肽含有從序列表中序列1或序列2選取的氨基酸序列；和/或在多肽的氨基酸序列中插入至少一個(gè)寡肽，該寡肽含有從序列表中序列1或序列2選取的氨基酸序列；和/或用一個(gè)寡肽替換多肽的氨基酸序列中至少一個(gè)天然存在的寡肽序列，該寡肽含有從序列表中序列1或序列2選取的氨基酸序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的制備方法，其特征在于所說(shuō)的方法包含化學(xué)的和/或酶學(xué)的方法的綜合過(guò)程。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的制備方法，其特征在于所說(shuō)的方法包含基因工程方法。
23.根據(jù)權(quán)利要求20、21或22所述的制備方法，其特征在于所說(shuō)的方法包括1)編碼一個(gè)多肽的核酸體外誘變?nèi)缦?1)在編碼多肽的核酸中增加至少一個(gè)編碼一條寡肽的核酸；在該寡肽中包含有一個(gè)從序列表中序列1或者序列表中序列2篩選的氨基酸的序列；和/或(2)在編碼多肽的核酸中插入至少一個(gè)編碼一條寡肽的核酸；在該寡肽中包含有一個(gè)從序列表中序列1或者序列表中序列2篩選的氨基酸的序列；和/或(3)在編碼多肽的核酸的天然存在的序列中，至少一個(gè)核酸序列被一個(gè)編碼一個(gè)寡肽的核酸替代；該寡肽中包含有一個(gè)從序列表中序列1或者序列表中序列2篩選的氨基酸的序列；2)在合適的表達(dá)載體中克隆突變的核酸；3)用獲得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染適合的宿主細(xì)胞；4)在合適的表達(dá)條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞；5)分離，必要時(shí)復(fù)性表達(dá)產(chǎn)物。
24.根據(jù)權(quán)利要求20、21、22或23所述的制備方法，其特征在于所說(shuō)的制備方法是在原核宿主細(xì)胞，如大腸桿菌中完成的。
25.根據(jù)權(quán)利要求20、21、22或23所述的制備方法，其特征在于所說(shuō)的制備方法是在真核宿主細(xì)胞中完成的，優(yōu)選酵母、植物或昆蟲細(xì)胞，或CHO或COS細(xì)胞。
26.一種藥物組合物，含有如權(quán)利要求1至14之一所述的多肽變異體和任意的生理學(xué)上合適的添加劑。
27.權(quán)利要求1至14之一所述的多肽變異體在刺激骨生成，或傷口愈合，或治療炎癥或癌癥中的應(yīng)用。
28.用于骨誘導(dǎo)的組合物，含有權(quán)利要求1至14之一所述的多肽變異體和載體，該載體選自肝素、羥磷灰石、透明質(zhì)酸、合成聚合物和膠原。
29.一種骨誘導(dǎo)基質(zhì)，其特征在于含有或包被有肝素或肝素樣物質(zhì)，和權(quán)利要求1至14之一所述的多肽變異體，該多肽變異體被吸附在所說(shuō)的肝素或肝素樣物質(zhì)上。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有高肝素結(jié)合力的多肽變異體。它是通過(guò)將一氨基酸序列X1X2X3X4X5X6(序列表中序列1或2)增加、插入和/或替代到原多肽中得到的。本發(fā)明提供的多肽變異體適用于刺激軟骨生成、骨生成和傷口愈合。本發(fā)明也涉及編碼所說(shuō)的多肽變異體的氨基酸分子,包含所說(shuō)的核酸分子的宿主細(xì)胞以及制備多肽變異體的方法。
文檔編號(hào)A61K47/48GK1340102SQ00803718
公開日2002年3月13日 申請(qǐng)日期2000年1月27日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月13日
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