專利名稱：通過皮膚的非侵入性接種的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及預(yù)防或治療接種目的用于非侵入性透皮給予和超級可變形性載體相連的抗原的新的疫苗。該疫苗包含(a)一種透皮載體，該載體是以微小液滴形式懸浮或分散于水性溶劑中的穿透劑，該液滴被一層或數(shù)層具有聚集趨勢的至少兩種不同物質(zhì)或物質(zhì)的兩種不同形式的膜狀包衣包圍，所述物質(zhì)或物質(zhì)形式在較佳的水性液體介質(zhì)中的溶解度相差至少10倍，從而使溶解度較大的物質(zhì)或物質(zhì)形式的均相團(tuán)聚體平均直徑、或由所述兩種物質(zhì)或所述物質(zhì)兩種形式組成的非均相團(tuán)聚體的平均直徑小于溶解度較小的物質(zhì)或物質(zhì)形式的均相團(tuán)聚體的平均直徑，和/或其中溶解度較大的組分有使穿透性液滴增溶的趨勢，且其中這些組分的含量高達(dá)使液滴增溶所需濃度的99％(摩爾)或?qū)?yīng)于非增溶液滴的飽和濃度的99％(摩爾)，無論哪一個更高，和/或其中在膜狀包衣周圍的液滴的彈性變形能量比血紅細(xì)胞或具有液體脂族鏈的磷脂雙層低至少5倍，更佳的低至少10倍，理想的是低10倍以上；(b)特異性釋放或誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子或抗細(xì)胞因子活性或本身發(fā)揮該活性的化合物；和(c)抗原或變應(yīng)原。本發(fā)明還涉及哺乳動物的相應(yīng)治療性或預(yù)防性疫苗接種的方法。
在本說明書整個篇幅中引述了數(shù)篇文獻(xiàn)。本文引用的每一份文獻(xiàn)(包括生產(chǎn)商說明書等)均納入本文作為參考；然而，這并不是承認(rèn)所有引用的文獻(xiàn)的確是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。另外納入本文作為參考的還有以IDEA AG名義提交的名稱為“經(jīng)鼻輸送/用高適應(yīng)性載體免疫”的待批申請的全部公開內(nèi)容。
皮膚是微生物最容易接近的，但是由于角質(zhì)層的存在，也最難進(jìn)入體內(nèi)。皮膚角質(zhì)層是進(jìn)化產(chǎn)生的一種優(yōu)化的屏障，它很象血管壁，因為它含有松弛的、緊密充塞的且橫向重疊的細(xì)胞，從而使角質(zhì)層中的基礎(chǔ)細(xì)胞瓦片狀基元重復(fù)20-30次。而且，皮膚中細(xì)胞之間的接觸部分被密集而組織良好的脂類混合物密封。因此，角質(zhì)層不僅保護(hù)生物體以防感染，而且還阻止通過皮膚有效地吸收抗原。這一事實(shí)從過敏角度來看是有利的，但卻使目前通過完整皮膚進(jìn)行免疫或接種不能成功。
市場上任何透皮輸藥裝置中最大的藥物小于350Da(Cevc，G.“通過皮膚輸送藥物”，Exp.Opin.Invest.Drugs(1997)61887-1937)，因為只有這樣的分子能通過皮膚中自身密封的細(xì)微孔。后者在親水性時寬度通常小于1納米，或當(dāng)呈疏水性時寬度更窄。因此，諸如蠕蟲等生物利用它們“鉆孔”通過器官的生化機(jī)理來穿過皮膚進(jìn)入體內(nèi)。皮膚中天然存在的微小損傷和支路(皮脂單位)也被可利用。然而，它們僅占皮膚表面的0.1％-0.5％，因此對透皮輸送沒有很大貢獻(xiàn)，但細(xì)菌通常利用該途徑來進(jìn)行局部感染(Strange，P.，Skov，L.Lisby，S.，Nielsen，P.L.，Baadsgard，O.″施加在完整的正常皮膚和特應(yīng)性皮膚上的葡萄球菌腸毒素B引起皮炎″，Arch.Dermatol.(1996)13227-33)。
只有少數(shù)半抗原在皮膚上引起皮膚免疫應(yīng)答。這證實(shí)大量局部沉積的半抗原的足夠小的分子能大量進(jìn)入皮膚。然后，這些半抗原首先刺激器官，最終可能引起過敏和接觸性皮炎(Kondo，S.，Sauder，D.N“變應(yīng)性接觸性皮炎中的表皮細(xì)胞因子”J.Am.Acad.Dermato1.(1995)33786-800；Nasir，A.，Gaspari，A.A.“接觸性皮炎，臨床展望和基礎(chǔ)機(jī)理”Clin.Rev.Allergy and Immunol.(1996)14151-184)。對于低分子量化學(xué)物質(zhì)或與皮膚刺激物(如皮膚滲透增強(qiáng)劑)組合的藥物，該問題最嚴(yán)重(Cevc，1997，同上)。大分子很少對皮膚有變應(yīng)原性，因為它們通過該屏障的能力有限。對高度免疫原性卵白蛋白(Wang，L-F.，Lin，J.-Y.，Hsieh，K，-H.，Lin，R.-H.“表皮接觸蛋白質(zhì)抗原在小鼠中主要誘導(dǎo)產(chǎn)生Th2樣應(yīng)答和IgE產(chǎn)生”J.Immunol.(1996)1564079-4082)或?qū)魜y毒素(Glenn，G.M.，Rao，M.Matyas，(1998)391851；Glenn，G.M.，Scharton-Karsten T，Vasell R，Mallet C.P.，Hale T.L.和Alving C.R.“用霍亂毒素透皮免疫保護(hù)小鼠抵抗致死性粘膜毒素攻擊”，J.Immunol(1998)1613211-3214)的Th2應(yīng)答只有在表皮(epicutanous)接觸大量此類蛋白質(zhì)后才有可能發(fā)生，而且相當(dāng)弱。而且，除去皮膚角質(zhì)層是分別在96％或43％的表皮經(jīng)處理的C57BL/6小鼠中產(chǎn)生針對編碼人癌胚抗原或人GM-CSF基因的腺病毒的可檢測量特異性抗體的先決條件(Deng，H，Qun，L.，Khavari，P.A.“可持續(xù)的皮膚基因輸送”Nature Biotechnology(1997)151388-1390)。
至今未報道過針對上述或其它用于表皮的抗原的保護(hù)作用。白喉毒素或破傷風(fēng)毒素以及牛血清白蛋白(通過將抗原與霍亂毒素施加到BALB/c小鼠皮膚上產(chǎn)生(Glenn等人，1998同上))在沒有佐劑時只能產(chǎn)生非常微弱的免疫應(yīng)答抗體。即使在加入霍亂毒素(CT)后，白喉及破傷風(fēng)抗原的特異性抗體平均滴度也比霍亂毒素本身引起的分別低大約50倍和70-4000倍(取決于所包含的單個數(shù)據(jù)點(diǎn))(Glenn，等人，1998，同上)。對應(yīng)的滴度絕對值分別為14±17和8±16；抗BSA滴度約為11±11(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，從公開的圖計算出)。這些低滴度沒有預(yù)防或治療效果，這表明簡單的非侵入性疫苗接種途徑并非是直截了當(dāng)?shù)?。同一研究組出版的最近的論文(Glenn等人，1998b)證實(shí)經(jīng)鼻攻擊后的抗CT保護(hù)作用，但不能得到通過透皮疫苗接種可獲得保護(hù)力的結(jié)論。
較早的出版物報道了將蛋白質(zhì)輸送通過皮膚的方法，根據(jù)滴度判斷，它比上述研究更有效高數(shù)個數(shù)量級，該方法采用了力學(xué)敏感的(mechanosensitive)和水敏感(hydrosensitive)的自調(diào)節(jié)性載體(Transfersomes)(綜述見Ceve，1997，同上)。對于強(qiáng)效抗原，其誘導(dǎo)的抗體滴度與皮下照射蛋白質(zhì)引起的滴度相當(dāng)；在BSA情況下，兩種例子中的IgG滴度絕對值均約為200(Paul，A.，Cevc，G.“非侵入性給予蛋白質(zhì)抗原，用牛血清白蛋白表皮免疫”Vaccine Res.(1995)4145-164)，對于間隙連接蛋白，測得滴度在15000-100000之間(Paul，A.，Ceve，G.，Bachhawat，B.K.“利用超變形藥物載體用大的蛋白質(zhì)透皮免疫”Eur.J.Immunol.(1995)253521-3524；Paul，A.，Cevc，G.，Bachhawat，B.K.“利用超變形藥物載體Transfersomes用整合膜組分間隙連接蛋白來透皮免疫”Vaccine(1997)16188-195)。另外，這些出版物中也沒有表明產(chǎn)生了保護(hù)性免疫應(yīng)答。
迄今已知，Th1或Th2細(xì)胞活性在免疫應(yīng)答中起重要作用Th1細(xì)胞還在小鼠中主要促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力、吞噬細(xì)胞介導(dǎo)的宿主防御，而且還產(chǎn)生抗原特異性IgG2a。相反，Th2優(yōu)先支持不依賴于吞噬細(xì)胞的宿主應(yīng)答、IgG1、IgE和IgA免疫球蛋白的產(chǎn)生。
免疫應(yīng)答的Th1或Th2基礎(chǔ)(即Th細(xì)胞亞類的分化)不僅取決于細(xì)胞因子以及其它調(diào)節(jié)分子的活性(Luger，T.A.，Schwarz，T.“細(xì)胞因子和神經(jīng)內(nèi)分泌激素在皮膚免疫力和發(fā)炎中的作用”Allergy(1995)50292-302；Lohoff，M.，Gessner，M.，Bogdan，C.，Roellinghoff，M.“Th1/Th2示范和實(shí)驗鼠立什曼病”Arch Allergy Immunol.(1998)115191-202)，而且抗原呈遞細(xì)胞的性質(zhì)和抗原用量也起著重要的作用。幾乎所有真核細(xì)胞都短時產(chǎn)生細(xì)胞因子并通過特異性細(xì)胞表面受體起作用。實(shí)際上，皮膚中的每個細(xì)胞在適當(dāng)刺激后都能釋放出這樣的(糖)蛋白因子或表達(dá)它們的受體。大多數(shù)細(xì)胞因子是多能性的，能相互誘導(dǎo)或影響有關(guān)受體的表達(dá)。這使得細(xì)胞因子在所謂的細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)框架中以協(xié)同、附加或拮抗方式起作用(Luger & Schwarz，1995；同上)。
不同細(xì)胞在皮膚上施加抗原后免疫激活中的作用還未被完全了解(Luger &Schwarz，1995；同上；Lohoff等人，1998，同上)。認(rèn)為在上基部皮膚區(qū)域中的朗格罕斯細(xì)胞在免疫呈遞中起主要作用。這些細(xì)胞首先結(jié)合并加工抗原，然后攜帶著消化的抗原從表皮遷移到淋巴管中，進(jìn)而進(jìn)入鄰近的引流淋巴結(jié)中。在該過程中，朗氏細(xì)胞經(jīng)歷了表型和功能上的改變，分化成(淋巴類)樹突細(xì)胞，該樹突細(xì)胞最終向通過內(nèi)皮小靜脈進(jìn)入淋巴結(jié)的原初CD4+T細(xì)胞提供抗原。相反，皮膚中的其它兩種主要類型的抗原呈遞細(xì)胞(巨噬細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞)首先需要激活，以便呈遞抗原和刺激T細(xì)胞。抗體可通過小靜脈內(nèi)皮細(xì)胞呈遞給T細(xì)胞，可能也可通過皮膚中的某些基底細(xì)胞呈遞給T細(xì)胞。
例如，已知角質(zhì)細(xì)胞可通過產(chǎn)生過多的促炎性細(xì)胞因子(包括IL-1α，GM-CSF和TNFα)加強(qiáng)局部炎癥(Pastore，S.，F(xiàn)anales-Belaso，E.，Abbanesi，C.，Chinni，L.M.，Giannetti，A.，Girolomoni，G.“在特應(yīng)性皮炎中角質(zhì)細(xì)胞過量產(chǎn)生粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子皮膚中樹突細(xì)胞持續(xù)激活的暗示”J.Clin.Invest.(1997)993009-3017)。角質(zhì)細(xì)胞衍生的細(xì)胞因子對于朗氏細(xì)胞成熟變成強(qiáng)效抗原呈遞細(xì)胞(Nasir & Gaspari，1996，同上)也非常關(guān)鍵。角質(zhì)細(xì)胞直接參與抗原呈遞的程度還不知道(Kondo & Sauder，1995，同上)，但是角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生抑制性細(xì)胞因子(如IL-10，無功能的IL-12和TGFβ)是已知的事實(shí)(Nasir & Gaspari，1996，同上)。
皮膚中的成纖維細(xì)胞群也含有參與抗原呈遞的細(xì)胞亞組。例如，在硬皮病中，成纖維細(xì)胞的一個亞組受到炎性部位細(xì)胞因子選擇性地募集(Fries，K.M.，Blieden，T.，Looney，R.J.，Sempowski，G.D.，Silvera，M.R.，Willis，R.A.，Phipps，R.P.“成纖維細(xì)胞異質(zhì)性的證據(jù)和成纖維細(xì)胞亞群在纖維變性中的作用”Clin.Immuno.Immunopathol.(1994)72283-292)。
以前已有報道說，表皮施加抗原產(chǎn)生了與通過口腔或鼻常規(guī)給藥途徑不同的免疫應(yīng)答。例如，在皮膚表皮反復(fù)接觸卵白蛋白后，產(chǎn)生了顯著的抗卵白蛋白IgE(Wang等人，1996，同上)。在皮膚上用牛血清白蛋白作為模型抗原，以前已經(jīng)觀察到有異常強(qiáng)烈的IgA產(chǎn)生(Paul等人，1997，同上)，但是至今還沒有表皮抗原呈遞詳情與所致免疫應(yīng)答之間相互關(guān)系的一致性描述。
有眾多不同的細(xì)胞參與抵抗通過皮膚輸送的大分子的免疫應(yīng)答。如上所述，目前采用的方法還沒有建立起令人信服的產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的策略。這可能是因為現(xiàn)有技術(shù)策略(如注射抗原)不能幫助仔細(xì)分析抗原施加到皮膚上所獲得的免疫應(yīng)答以設(shè)計出定向的保護(hù)性免疫應(yīng)答。例如，已知抗原注射(作為損傷或其它種類的皮膚干擾，包括存在化學(xué)刺激物)使皮膚(皮膚不僅是機(jī)體中最重的器官，而且也構(gòu)成了機(jī)體免疫系統(tǒng)的主要部分)釋放出各種細(xì)胞因子。這使得皮膚免疫應(yīng)答(該免疫應(yīng)答對所用抗原的性質(zhì)也敏感)的強(qiáng)度達(dá)到最大，但是阻止了對免疫應(yīng)答的微調(diào)。高沖擊疫苗輸送得益于該效果。
用超變形性載體將物質(zhì)輸送通過皮膚與所述高沖擊輸送方法正好相反，因為據(jù)報道它對皮膚沒有影響。認(rèn)為這是由于這種水敏感性超變形體(也稱為TransfersomesTM(Cevc，1997，同上)通過被調(diào)節(jié)成細(xì)胞形狀的角質(zhì)細(xì)胞(comeocyte)之間的“有效通道”穿透角質(zhì)層(Schtzlein，A.，Ceve，G.“不均勻的角質(zhì)層細(xì)胞堆積和完整皮膚的滲透屏障功能用高度可變形性載體(Transfersomes)的高分辨率共焦激光掃描顯微鏡研究”Br.J.Dermatol.(1998)138538-592)。據(jù)稱，Transfersomes在該過程中優(yōu)先在最薄弱的接觸處將皮膚中的細(xì)胞與細(xì)胞間脂質(zhì)推開。這樣就產(chǎn)生了看上去平均約20-30納米寬的通道。它們覆蓋了幾個百分?jǐn)?shù)(約4％)的皮膚表面(Schtzlein &Cevc，1998，同上)，相鄰表面的引流未包括在內(nèi)。這比正常的支路面積(約0.1％)大得多，從而解釋了與超變形性載體一起給予抗原(Paul & Cevc，1995，同上)或用霍亂毒素作為佐劑(Glenn等人，1998a，b，同上)后測得的抗BSA滴度之間量的差別。
載體在皮膚中打開的有效通道看來寬得足以使載體和它們結(jié)合的材料通過屏障而不明顯干擾器官。然而，用超變形性載體反復(fù)將胰島素輸送通過皮膚沒有誘導(dǎo)出抗該蛋白質(zhì)的抗體(Cevc，G.，Gebauer.D.，Schtzlein，A.Blume，G.“超柔性泡囊Transfersomes具有極低的滲透阻力，可將治療量的胰島素輸送通過完整的哺乳動物皮膚”Biochim.Biophys.Acta(1998)1368201-215)。
因此，本發(fā)明背后的技術(shù)問題是建立一種方法來成功地誘導(dǎo)產(chǎn)生醫(yī)學(xué)上有用的透皮免疫應(yīng)答。本文通過提供權(quán)利要求中定義的實(shí)施方案，解決了所述技術(shù)問題。
因此，本發(fā)明涉及一種透皮疫苗，它包含(a)一種透皮載體，該載體是以微小液滴形式懸浮或分散于水性溶劑中的穿透劑，該液滴被一層或數(shù)層具有聚集趨勢的至少兩種不同物質(zhì)或物質(zhì)的兩種不同形式的膜狀包衣包圍，所述物質(zhì)或物質(zhì)形式在較佳的水性液體介質(zhì)中的溶解度相差至少10倍，從而使溶解度較大的物質(zhì)或物質(zhì)形式的均相團(tuán)聚體的平均直徑、或由所述兩種物質(zhì)或所述物質(zhì)兩種形式組成的非均相團(tuán)聚體的平均直徑小于溶解度較小的物質(zhì)的均相團(tuán)聚體的平均直徑，和/或其中溶解度較大的組分有使穿透性液滴增溶的趨勢，且其中這些組分的含量高達(dá)使液滴增溶所需濃度的99％(摩爾)或?qū)?yīng)于非增溶液滴的飽和濃度的99％(摩爾)，無論哪一個更高，和/或其中在膜狀包衣周圍的液滴的彈性變形能量比血紅細(xì)胞或具有液體脂族鏈的磷脂雙層低至少5倍，更佳的低至少10倍，理想的是低10倍以上；(b)特異性釋放或特異性誘導(dǎo)產(chǎn)生具有細(xì)胞因子或抗細(xì)胞因子活性的分子或發(fā)揮這種活性的化合物，兩種任一均產(chǎn)生了所需的醫(yī)學(xué)上有用的免疫應(yīng)答；和(c)抗原、變應(yīng)原、抗原混合物和/或變應(yīng)原混合物。
對于上述高達(dá)99％的數(shù)值，應(yīng)注意通常采用低于前一相對濃度的50％的數(shù)值。更佳的是選擇低于40相對％或甚至大約30相對％及以下的數(shù)值，而對于不能用溶解度較高的組分來增溶的液滴，相對濃度宜超過上述濃度2倍。
在本發(fā)明中，術(shù)語“病原體”指其存在于機(jī)體內(nèi)或機(jī)體上將導(dǎo)致或促進(jìn)病理狀態(tài)而該病理狀態(tài)理論上是可受控或受益于預(yù)防性、治療性或輔助性免疫治療的病原體。它包括導(dǎo)致微生物疾病的病原體，如胞外細(xì)菌，包括形成膿的球菌，如葡萄球菌屬和鏈球菌屬、革蘭陰性菌如腦膜炎球菌和淋球菌屬、奈瑟氏菌屬、革蘭陰性菌，包括腸微生物如大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、假單胞菌、白喉桿菌、百日咳博德特氏菌和革蘭陽性菌(如鼠疫耶爾森氏菌，BCG)，尤其是厭氧菌，如梭菌屬(破傷風(fēng)梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、諾氏梭菌、腐爛梭菌)；在宿主細(xì)胞內(nèi)存活并復(fù)制的許多細(xì)菌和所有病毒；后一類包括分支桿菌(如結(jié)核桿菌)和單核細(xì)胞增生李斯特菌，逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒，包括但不局限于肝炎病毒、(人)免疫缺陷病毒、皰疹病毒、天花(禽痘)、流感、麻疹、腮腺炎和脊髓灰質(zhì)炎病毒、巨細(xì)胞病毒、鼻病毒等，在宿主細(xì)胞內(nèi)繁殖的各種真菌；寄生蟲，包括動物寄生蟲，如原生動物和蠕蟲，以及外寄生物，如蜱和螨。病原體還包括布魯氏菌屬(如馬爾他布魯氏菌、流產(chǎn)布魯氏菌、豬布魯氏菌、狗布魯氏菌、木鼠布魯氏菌、羊布魯氏菌)、霍亂病原體(例如霍亂弧菌)、嗜血菌屬如伴放線菌素嗜血菌、大葉性肺炎嗜血菌以及引發(fā)副傷寒、鼠疫、狂犬病、破傷風(fēng)和風(fēng)疹疾病的病原體。本發(fā)明中的病原體另外假定還包括，但不局限于，引起動物或人體各種腫瘤形成、自身免疫疾病和其它病理學(xué)狀況(并非由微生物感染引起)的真核細(xì)胞或其部分。某些病原體部分，尤其是各種微生物毒素，具有孔蛋白樣性質(zhì)，因此具有一定的通過粘膜或增加穿透劑膜柔性的能力。
與“釋放”或“誘導(dǎo)”聯(lián)合的術(shù)語“特異性”指化合物與能釋放細(xì)胞因子的細(xì)胞相互作用，通過受體介導(dǎo)觸發(fā)該細(xì)胞因子釋放或誘導(dǎo)。特異性釋放或誘導(dǎo)與非特異性釋放或誘導(dǎo)(例如皮內(nèi)注射獲得)相反。
在本發(fā)明中，術(shù)語“變應(yīng)原”用來描述內(nèi)源或異源、動物或植物來源的物質(zhì)，該物質(zhì)導(dǎo)致接觸該變應(yīng)原的機(jī)體產(chǎn)生不良的免疫應(yīng)答，通常是產(chǎn)生急性過敏反應(yīng)。變應(yīng)性微生物或其部分(如螨的部分)、植物部分(例如花粉)或動物部分(毛發(fā)和皮屑)，以及人造的和無機(jī)物質(zhì)屬于該類。另一方面，幾乎人體的每一部分，如果受到機(jī)體免疫系統(tǒng)的不正確加工或接觸，會產(chǎn)生自身免疫應(yīng)答反應(yīng)，并對該物質(zhì)產(chǎn)生變應(yīng)性反應(yīng)。在采用較窄的解釋時，變應(yīng)原是在體內(nèi)引起速發(fā)型過敏反應(yīng)的物質(zhì)、一類或一系列物質(zhì)，這些反應(yīng)可通過免疫治療來減少或消除，無論是否非侵入性通過皮膚。
本發(fā)明中術(shù)語“(治療性)疫苗接種”描述了任何類型的治療性疫苗接種，無論是在患病后為改善臨床狀況而進(jìn)行，還是出于預(yù)防疾病的目的而進(jìn)行。該疫苗接種可涉及單次或反復(fù)給予本發(fā)明疫苗。治療性接種預(yù)防病理學(xué)狀況和/或改善臨床狀況。當(dāng)用作預(yù)防制劑時，它通常會產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。
免疫接種指任何類型的激發(fā)免疫應(yīng)答反應(yīng)的方法，而不論所述應(yīng)答是否是治療性的。
“抗體”或“免疫球蛋白”指IgA，IgD，IgE，IgG或IgM，包括其所有亞型，如IgA1和IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。它們的“衍生物”包括可用化學(xué)、生物化學(xué)和其它方式獲得的衍生物，如基因工程改造的抗體衍生物。片段例如包括單鏈片段、Fc-、Fab-、F(ab)′2-和Ig的其它部分，而不論它們是內(nèi)源、異源、(半)合成還是重組的。本發(fā)明還包括兩種或多種上述抗體、衍生物或片段的復(fù)合物。
“抗原”是天然形式的或片段化或衍生處理后病原體或變應(yīng)原的一部分。更通常的，術(shù)語“抗原”指大分子或其片段，任何半抗原部分(例如簡單的碳水化合物、復(fù)雜的碳水化合物、多糖、脫氧核糖核酸)，簡言之，是當(dāng)給予機(jī)體時可被機(jī)體抗體所有組分識別且可能會誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的任何分子。
本發(fā)明中術(shù)語“抗原混合物和/或變應(yīng)原混合物”指至少兩種抗原或變應(yīng)原的組合。預(yù)計包含至少一個抗原和至少一個變應(yīng)原的抗原與變應(yīng)原的混合物也可用于本發(fā)明。
本發(fā)明所用的術(shù)語“細(xì)胞因子”指細(xì)胞因子，如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18和它們的所有的亞型如IL-1α和IL-1β，腫瘤壞死因子(TNF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β和-α)、I型和II型干擾素(IFN-α1，IFN-α2，(IFN-ω)、IFN-β、IFN-γ)、遷移抑制因子MIF、c-kit配體、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、單核細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、趨化因子等以及這些分子的所有功能性衍生物。
能非常好地介導(dǎo)天然免疫力的細(xì)胞因子包括I型干擾素(IFN-α和IFN-β)、腫瘤壞死因子(TNF)、白介素-1(IL-1α和IL-1β)、白介素-6(IL-6)和吸引和激活白細(xì)胞的趨化因子。該過程依賴于其中的抗增殖(例如IFN-s)、促炎(例如TNF，IL-1)或協(xié)同刺激(例如IL-6)作用。介導(dǎo)淋巴細(xì)胞激活、生長和分化的最佳的細(xì)胞因子包括白介素2(IL-2)、白介素-4(IL-4)和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)。因此，這些細(xì)胞因子不僅能影響靶標(biāo)的生長，而且還影響到最終可能會在治療中起作用的細(xì)胞的激活和其它細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
非常依賴細(xì)胞介導(dǎo)應(yīng)答的介導(dǎo)免疫性炎癥的細(xì)胞因子是γ干擾素(IFN-γ)、淋巴毒素(TNF-β)、白介素-10(IL-10)、白介素-5(IL-5)、白介素-12(IL-12)，可能還有遷移抑制因子。白細(xì)胞生長和分化最受白介素-3(IL-3)、c-kit配體、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細(xì)胞或粒細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF或G-CSF)以及白介素-7(IL-7)的影響。
本文的術(shù)語“免疫佐劑”用于描述能支持、增強(qiáng)、刺激、激活、強(qiáng)化或調(diào)節(jié)所需的細(xì)胞或體液免疫應(yīng)答(尤其是在預(yù)防中增強(qiáng)任何種類的抗原特異性免疫應(yīng)答，以及在治療中經(jīng)常支持細(xì)胞介導(dǎo)免疫力)的物質(zhì)。這可通過以下方式來實(shí)現(xiàn)，加入合適的細(xì)胞因子、其混合物或拮抗劑，或較間接地用化學(xué)物質(zhì)刺激皮膚(該化學(xué)物質(zhì)直接或間接使皮膚或其它涉及的外周組織釋放細(xì)胞因子)，或催化或加速組織中細(xì)胞因子的生物合成然后產(chǎn)生該作用，只要最終結(jié)果是提高了疫苗接種成功率，即所用抗原有預(yù)防和/或治療作用。對有用的細(xì)胞因子庫有間接貢獻(xiàn)的免疫佐劑種類，包括具有變應(yīng)原潛力的小的化學(xué)物質(zhì)，如某些變應(yīng)原性(金屬)離子，包括但不局限于LiCl、HgCl2、鉬(molibdenum)、酸、堿和其它刺激性化合物，如二環(huán)己基甲烷-4，4′-二異氰酸酯、ditrocarb(二乙基二硫代氨基甲酸酯)、2，4-二硝基氯苯、異丙肌苷、異佛爾酮-二異氰酸酯、左旋咪唑、(苯基)噁唑酮等，Swansonine、西左伏蘭(sizofran)、苯二甲酸酐、胸腺生成素(thymopentin)、(脂肪)醇、(脂肪)胺、(脂肪)醚、蓖麻蛋白或其它合適的兩親物，眾多表面活性劑和化學(xué)皮膚滲透增強(qiáng)劑，以及它們的衍生物或組合物；另外還有(低分子量的)微生物的片段和衍生物，包括脂多糖(如LPS)、索狀因子(海藻糖-二霉菌酸酯)和其它膜結(jié)合多糖(當(dāng)用量充足時)，乙?；邗?丙氨酰-異谷氨酰胺和較大的微生物片段，包括細(xì)菌外毒素和內(nèi)毒素或腸毒素，如霍亂毒素和大腸桿菌的不耐熱毒素(HLT)，及其大分子片段，如A-鏈衍生物(其大部分(如果不是全部的話)看上去具有ADP-核糖基化活性)，高效免疫佐劑LT全毒素等，細(xì)胞壁骨架、減毒細(xì)菌如BCG等。較不熟知的例子包括梭菌毒素、純化的結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)衍生物、LT-R192G、釀膿鏈球菌的纖連蛋白結(jié)合蛋白I、B型腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白(GBOMP)、其它各種肽聚糖等。換句話說，免疫佐劑包括能改變抗原攝入或呈遞、激活或增強(qiáng)抗原特異性淋巴細(xì)胞的增殖、或干擾免疫應(yīng)答中占優(yōu)勢控制機(jī)制的分子(不僅在皮膚中，而且在其它免疫活性組織中)。(ADP-核糖基化細(xì)菌腸毒素的粘膜佐劑活性是一個已經(jīng)確定的已知例子)。另一方面，能改變細(xì)胞因子的(相對)濃度的分子或其它免疫佐劑，如抗免疫佐劑抗體或免疫佐劑的激動劑或拮抗劑也是本發(fā)明意義中的免疫佐劑。對于影響淋巴細(xì)胞歸巢的分子(如各種選擇蛋白(LECAMS如各種CD62-s)、GlyCAM-1、MaDCAM-1、VCAM-1、ICAM-1、透明質(zhì)酸等)以及其它趨化因子(如RANTES或MCP-1)也是如此。內(nèi)源型免疫佐劑還包含組胺、轉(zhuǎn)移因子、吞噬作用激素等。由于許多上述免疫佐劑在以太低、有時太高的濃度或其本身非侵入性免疫接種后沒有足夠的能力確保所需效果，本文所用佐劑的功能定義包括，對細(xì)胞因子濃度和其體內(nèi)的分布方式更充分地調(diào)節(jié)導(dǎo)致產(chǎn)生所需的治療性或預(yù)防性免疫應(yīng)答。如果需要弄清楚，例如可在測定特定細(xì)胞因子水平的實(shí)驗中確定所述調(diào)節(jié)及其程度。
“免疫輔助操作”指對皮膚的非化學(xué)處理，例如對皮膚摩擦、擠壓、加熱，接觸電或力，例如超聲、場等，或?qū)⒎敲庖咴灾苿┳⑸淙肫つw中，只要該處理使皮膚或其它外周有免疫活性的組織釋放免疫輔助性化合物，或減少針對所需接種的拮抗劑的作用濃度/作用時間。然而，根據(jù)本發(fā)明，“免疫輔助操作”也指用免疫調(diào)節(jié)劑和/或細(xì)胞因子和/或細(xì)胞因子釋放因子(尤其是組胺)預(yù)處理皮膚。
術(shù)語“免疫原”指能誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的與免疫學(xué)載體偶聯(lián)的半抗原或不含載體或與載體結(jié)合的抗原。
“免疫耐受性”指沒有針對抗原的不希望的免疫應(yīng)答(更通常的是減少)。
Th1(T輔助細(xì)胞I型)涉及的抗體包括IgG2a，IgG2b和IgG3。
Th2(T輔助細(xì)胞II型)涉及的抗體包括IgG1類、IgG4類和IgE類。
本發(fā)明中的術(shù)語“物質(zhì)的兩種形式”指同一物質(zhì)的兩種離子化狀態(tài)或鹽形式，該物質(zhì)的兩種不同的復(fù)合物等。
“非侵入性給藥”或“非侵入性輸送”指在生物學(xué)施藥時施加或輸送通過完整的屏障，在本文中是通過完整的皮膚。
“穿透”描述了相當(dāng)大的物質(zhì)通過屏障的非擴(kuò)散性運(yùn)動。該過程通常依賴于穿透劑改變屏障中禁閉的孔，而且還可能涉及引起屏障阻力下降的穿透，例如孔變寬或通道打開；然而，該過程并不主要取決于通過屏障的穿透劑濃度梯度。
“滲透”指通過半滲透屏障的擴(kuò)散性運(yùn)動。其主要例子是分子或分子團(tuán)聚體在滲透性物質(zhì)濃度梯度影響下輸送通過屏障。
因此，穿透劑是包含一種或一系列分子的物質(zhì)，這些分子大得不能滲透通過屏障，但是卻能靠穿透劑改變屏障的禁閉通道(孔)的形狀和/或直徑的能力(即適應(yīng)性)而通過屏障。該改變能力可從例如以下事實(shí)看出比孔徑大兩倍的穿透劑可通過雙層但不變成孔徑大小的片段。另一方面，穿透劑是能滲透通過半透屏障(如皮膚)的物質(zhì)。外場中的穿透劑所受推動力與穿透劑的標(biāo)稱大小以及施加的場(該場可天然存在)成比例。在完整的未堵塞皮膚上的這種力被認(rèn)為源于橫跨角質(zhì)層的水濃度梯度，如果該力強(qiáng)度足以使穿透劑變形或/和使屏障中通道變寬從而避免體積排斥，則該力可使穿透劑運(yùn)動通過屏障(包括皮膚)。
至于進(jìn)一步的定義，尤其是關(guān)于穿透劑的復(fù)雜的體變形性、相應(yīng)的作用機(jī)理、感興趣的穿透劑組分或所選試劑的清單，參見以下授權(quán)的或待批的專利(DE 41 07 152，PCT/EP91/01596，PCT/EP96/04526，DE4447287)。關(guān)于生產(chǎn)過程以及穿透劑與抗原性(大)分子和/或免疫佐劑(它們太大而不能滲透通過屏障)一起加載的詳細(xì)信息，可在國際專利申請PCT/EP98/06750中找到。
在形成載體的聚集性物質(zhì)中溶解度較低的通常是脂質(zhì)或脂質(zhì)類物質(zhì)，尤其是極性脂質(zhì)，而在懸浮液中有較高溶解度且增加液滴適應(yīng)性的物質(zhì)是表面活性劑或具有表面活性劑類似性質(zhì)。前一組分通常是來自生物來源的脂質(zhì)或脂質(zhì)類物質(zhì)，或是相應(yīng)的合成的脂質(zhì)或經(jīng)修飾的脂質(zhì)，這些脂質(zhì)通常屬于具有以下化學(xué)式的純的磷脂類 其中R1和R2是脂族鏈，通常是C10-20-酰基或烷基，或部分不飽和的脂肪酸殘基，具體是油?；⒆貦坝王；?、反油?；営拖┗?、亞麻基(linolenyl)、亞麻?；⒒ㄉ南；⑴６换?、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕櫚?；陀仓；?，其中R3是氫、2-三甲基氨基-1-乙基、2-氨基-1-乙基、C1-4烷基、羧基取代的C1-5烷基、羥基取代C2-5烷基、羧基和羥基取代的C2-5烷基、或羧基和氨基取代的C2-5烷基，以及氨基、環(huán)己六醇、鞘氨基醇或所述物質(zhì)的鹽，所述脂質(zhì)還包含甘油酯、類異戊二烯脂質(zhì)、類固醇、硬脂酸精或甾醇、含硫或糖脂質(zhì)、或任何其它形成雙層的脂質(zhì)，尤其是半質(zhì)子化液態(tài)脂肪酸、較佳的選自磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸、磷脂酰絲氨酸、鞘磷脂或其它鞘磷脂、鞘糖脂(包括腦苷脂、神經(jīng)酰胺己多糖、硫苷脂、鞘縮醛磷脂)、神經(jīng)節(jié)苷脂或其它糖脂或合成脂質(zhì)，尤其是相應(yīng)的鞘氨醇衍生物，或其它糖脂，其中兩條相同或不同的鏈可以與骨架酯化(在二?；投溝；衔镏?，或以醚堿與骨架相連(如在二烷基脂質(zhì)中)。
所用表面活性劑通常是非離子型、兩性離子型、陰離子型或陽離子型，尤其是脂肪酸或脂肪醇，烷基-三/二/甲基-銨鹽，烷基硫酸鹽，膽酸、脫氧膽酸、甘氨膽酸、甘氨脫氧膽酸、?；敲撗跄懰帷⑴；悄懰岬鹊膯蝺r鹽，?；蛲轷；?二甲基-氨基氧化物(aminoxide)(尤其是十二烷基-二甲基-氨基氧化物)，烷基或烷?；?N-甲基葡糖酰胺，N-烷基-N，N-二甲基甘氨酸，3-(?；谆?-鏈烷磺酸鹽，N-?；?磺基甜菜堿，聚乙二醇-辛基苯基醚(尤其是九乙二醇-辛基苯基醚)，聚乙烯-?；?尤其是九乙烯-十二烷基醚)、聚乙二醇-異?；?尤其是八乙二醇-異十三烷基醚)、聚乙烯-?；?尤其是八乙烯十二烷基醚)、聚乙二醇-縮水山梨糖醇-?；?如聚乙二醇-20-單月桂酸酯(Tween 20)，或聚乙二醇-20-縮水山梨糖醇-單油酸酯(Tween 80))、聚羥乙烯-?；?尤其是聚羥乙烯-月桂?；?、-肉豆蔻酰基、-十六烷基硬脂?；?油?；?，如聚羥基乙烯-4或6或8或10或12等月桂酰基醚(Brij系列)，或相應(yīng)的酯，如聚羥乙烯-8-硬脂酸酯(Myri45)、肉豆蔻酸酯、月桂酸酯、亞油酸酯、亞麻酸酯、棕櫚油酸酯或油酸酯型，或多乙氧基化的蓖麻油40，縮水山梨糖醇-單烷基化物(例如Arlacel或Span)(尤其是縮水山梨糖醇-單月桂酸酯、肉豆蔻酸酯、亞油酸酯、亞麻酸酯、棕櫚油酸酯或油酸酯)，?；蛲轷；?N-甲基葡糖酰胺(尤其是癸?；蛟鹿瘐；?N-甲基葡糖酰胺)，烷基硫酸鹽(如月桂?；?、肉豆寇酰基、棕櫚?；?、油?；?、棕櫚油?；?、亞油?；?、亞麻?；⑴６换蚍从王；蛩猁})，脫氧膽酸鈉，甘氨脫氧膽酸鈉，油酸鈉，酒石酸鈉，優(yōu)先具有上述脂族鏈的脂肪酸，溶血磷脂(如正十八烯(＝油?；?-甘油磷脂酸、-磷酸甘油或-磷酸絲氨酸)，正-?；?(例如月桂酰基、肉豆寇?；⒆貦磅；⒂王；?、棕櫚油酰基、反油酰基、牛痘酰基、亞油酰基、亞麻酰基)-甘油磷脂酸、-磷酸甘油或-磷酸絲氨酸，或相應(yīng)的短雙鏈磷脂，如十二烷基磷脂酰膽堿或有表面活性的多肽。然而，重要的是應(yīng)認(rèn)識到，極性脂質(zhì)與其它兩親性物質(zhì)的復(fù)合物通常會在載體包衣中起表面活性劑作用，且不同的離子化或鹽狀態(tài)的極性脂質(zhì)的性質(zhì)相差很大。因此，很顯然，在膜中一起混合的同一(極性)脂質(zhì)的兩種不同物理化學(xué)狀態(tài)將產(chǎn)生使本項工作條件滿意的高度可變形的載體。
關(guān)于磷脂懸浮液的更通常信息可在《脂質(zhì)體》手冊(Gregoriadis，G.，Hrsg.，CRCPress，Boca Raton，F(xiàn)I.，1-3卷，1987)、《作為藥物載體的脂質(zhì)體》(Gregoriadis，G.，Hrsg.，John Wiley & Sons，New York，1988)或?qū)嶒炇沂謨浴吨|(zhì)體實(shí)踐方法》(New，R.，Oxford-Press，1989)中找到。常規(guī)用于制備生物相容的免疫穿透劑的磷脂性質(zhì)綜述見《磷脂手冊》(Cevc，G.，編，Dekker，New York，1995)。
在配制制劑后或應(yīng)用之前可方便地調(diào)節(jié)制劑的pH值。該調(diào)節(jié)應(yīng)能防止單個系統(tǒng)成分和/或藥物載體在初始pH條件下的劣化而不損害生理相容性。為了中和穿透劑懸浮液，可以采用生物相容的酸或堿來配制pH值在3-12之間(通常在5-9之間，更經(jīng)常的在6-8之間)的緩沖液。生理上可接受的酸例如是無機(jī)酸(如鹽酸、硫酸或磷酸)或有機(jī)酸(如羧基鏈烷酸如乙酸)的稀釋水溶液。生理上可接受的堿例如是稀氫氧化鈉、適當(dāng)離子化的磷酸等。
如果需要，免疫原懸浮液可以在應(yīng)用前進(jìn)行稀釋或濃縮(例如通過超離心或超濾)；此時或在此之前懸浮液中還可加入添加劑。添加劑通常選自使配方對環(huán)境應(yīng)力敏感性減少的物質(zhì)，包括殺微生物劑、抗氧化劑、不希望的酶作用的拮抗劑，冷凍防護(hù)劑、增稠劑等。然而，在任何系統(tǒng)操作后，都應(yīng)當(dāng)檢查載體特征，如果需要，可重新調(diào)節(jié)。
本發(fā)明驚奇地發(fā)現(xiàn)，與本文所述的超變形性脂質(zhì)團(tuán)聚體結(jié)合的大分子抗原(免疫穿透劑)能通過人工的多孔屏障以及皮膚，盡管所述穿透劑的平均直徑超過屏障的平均孔/通道直徑，而且該免疫穿透劑能引發(fā)治療性或預(yù)防性免疫應(yīng)答，只要所述免疫穿透劑與表現(xiàn)出細(xì)胞因子活性或能誘導(dǎo)皮膚和/或其它免疫活性器官產(chǎn)生和/或釋放細(xì)胞因子的化合物結(jié)合?；蛘?，所述化合物能拮抗細(xì)胞因子活性。后一實(shí)施方案通過阻斷其它途徑有利地將免疫應(yīng)答導(dǎo)向Th1或Th2依賴型免疫應(yīng)答。本文所述的抗原載體在該過程之前和期間維持了足夠的穩(wěn)定性。另外，驚奇地發(fā)現(xiàn)所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答與施加劑量不成正比，這暗示可以改變抗原的量。應(yīng)對所述量進(jìn)行仔細(xì)選擇以獲得最優(yōu)效果?？乖钸m量或最適范圍的選擇是本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀了本說明書后力所能及的。
本發(fā)明疫苗中用作載體的至少兩組分免疫團(tuán)聚體有高度可變形的優(yōu)點(diǎn)，更通常的是具有非常柔軟的膜的泡囊形式。盡管這些載體在以前已在免疫程序中采用過，但是出人意料的是以前所假定的載體免疫輔助性沒能消除加入細(xì)胞因子活性化合物或合適拮抗劑(較佳的是IL-4、IL-10、TGF-β、IL-5、IL-6、IL-9和IL-13)的需要；或在T細(xì)胞受體預(yù)先刺激后，還加入IL-1以便獲得所需的保護(hù)性免疫應(yīng)答。同樣，宜加入IL-12、IFN-γ和淋巴毒素(LT或TNF-β)來促進(jìn)Th1應(yīng)答，從而有利于細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，并提供治療病毒和其它寄生蟲疾病或促進(jìn)免疫耐受性的方法。例如，加入IFNγ、IL-12和抗IL-4的組合物或單單加入IL-12預(yù)計會將Th2型應(yīng)答變成Th1型。更廣地說，在穿透劑介導(dǎo)的免疫接種的情況下，提議在免疫應(yīng)答開始時增加IL-12和IL-4的相對量(有利于前者)可用來促進(jìn)Th1應(yīng)答，反之，IL-2將支持NK和B細(xì)胞生長，以刺激抗體合成，并在總體上影響T細(xì)胞依賴性免疫應(yīng)答的強(qiáng)度。因此，盡管現(xiàn)有技術(shù)描述了用合適的載體與抗原以及任選的免疫佐劑組合可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體滴度，但是所得的免疫應(yīng)答未表現(xiàn)出保護(hù)性。
本發(fā)明的一個特別的好處是因為驚奇地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所述穿透劑的轉(zhuǎn)移不會導(dǎo)致皮膚中細(xì)胞因子組成的實(shí)質(zhì)性失調(diào)。換句話說，這些載體輸送通過皮膚本身不會誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子釋放。因此，現(xiàn)在可以進(jìn)行研究，將能特異性誘導(dǎo)皮膚(或有能力釋放細(xì)胞因子的其它器官)細(xì)胞釋放細(xì)胞因子的化合物加入本發(fā)明的疫苗中，未引發(fā)所需的免疫應(yīng)答。這樣就可對所需的免疫應(yīng)答進(jìn)行微調(diào)?；蛘撸稍诒景l(fā)明疫苗中加入具有或能發(fā)揮細(xì)胞因子活性的化合物。另外，可采用特異性防止這類細(xì)胞因子作用的細(xì)胞因子活性拮抗劑。在該實(shí)施方案中，宜將免疫應(yīng)答導(dǎo)向Th1或Th2途徑。重要的是要注意，這些化合物特異性地誘導(dǎo)或釋放細(xì)胞因子依賴于抗原性質(zhì)。因此，它們與本發(fā)明中非特異性且廣泛支持免疫應(yīng)答的佐劑不同。
總之，應(yīng)用本發(fā)明的疫苗可以微調(diào)所需的對給定抗原的免疫應(yīng)答(當(dāng)然，抗原特性也起一定作用)。該免疫應(yīng)答可用例如佐劑觸發(fā)的非特異性免疫應(yīng)答來增強(qiáng)。與僅用注射疫苗的現(xiàn)有技術(shù)相比，微調(diào)免疫應(yīng)答的選擇自由特別有好處，因為注射過程本身嚴(yán)重地非特異性地干擾了皮膚中細(xì)胞因子的相對濃度。
對上述標(biāo)準(zhǔn)加以考慮不僅為向皮膚細(xì)胞以及外周免疫系統(tǒng)的合適類型的免疫呈遞提供了基礎(chǔ)(通過載體)，而且也確保這種免疫加工在將體內(nèi)主要產(chǎn)生抗原中和性抗據(jù)，再用該曲線來進(jìn)一步優(yōu)化制劑或下一步應(yīng)用。其核心是測定免疫穿透劑通過明確屏障中孔的流動量與橫跨屏障的合適的推動力或壓力的函數(shù)關(guān)系，并根據(jù)不同數(shù)據(jù)組的比較結(jié)果以特征曲線形式對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，該特征曲線可用于進(jìn)一步優(yōu)化配方或下一步應(yīng)用。這包括與已知能穿透皮膚的無免疫原穿透劑懸浮液的結(jié)果(例如由Cevc等人(1998，同上)報道)比較。在一個補(bǔ)充的較佳方案中，測試免疫調(diào)節(jié)劑或免疫調(diào)節(jié)程序的各種組合(主要是Th1或Th2有關(guān)的細(xì)胞因子產(chǎn)生)，然后用這些結(jié)果來適當(dāng)選擇最終的治療或預(yù)防應(yīng)用。
疫苗接種通常在室溫下進(jìn)行，但是較低或較高的溫度也是適合的。這對于含有在室溫和皮膚或其它屏障溫度之間呈剛性的合成物質(zhì)的制劑特別有意義。
生產(chǎn)溫度通常在0-95℃范圍內(nèi)選擇。較佳的，在10-70℃的溫度范圍內(nèi)，更經(jīng)常的在15℃-45℃之間，在所有情況下，該溫度均低于重要的配方組分發(fā)生不可逆的組成或物理狀態(tài)變化的溫度。其它溫度范圍也有可能，然而，最明顯的是含有可冷凍或非揮發(fā)性組分的系統(tǒng)、低溫或加熱穩(wěn)定的配方等。
如果需要維持系統(tǒng)個別組分的完整性和所需性質(zhì)，載體配方可與或不與所連接的抗原一起冷藏(例如在4℃下)。在惰性氣體(如氮?dú)?下生產(chǎn)和保藏是可以的，有時是敏感的。利用只有少量雙鍵的物質(zhì)(即利用低的不飽和度)，通過加入抗氧化劑、螯合劑和其它穩(wěn)定化劑，或通過制備特別的免疫穿透劑或從冷凍干燥或干燥的混合物原位制得，也可延長免疫原制劑的使用期。
在本發(fā)明疫苗的較佳實(shí)施方案中，采用了特異性釋放或特異性誘導(dǎo)產(chǎn)生具有細(xì)胞因子或抗細(xì)胞因子活性的化合物以及將抗原與穿透劑結(jié)合。
在本發(fā)明疫苗的另一較佳實(shí)施方案中，溶解度較低的自聚集性分子是極性脂質(zhì)，溶解度較高的組分是表面活性劑或類似于表面活性劑的分子，或是出于本發(fā)明目的有足夠溶解度的極性脂質(zhì)形式。
在本發(fā)明疫苗的另一較佳實(shí)施方案中，穿透劑的平均直徑在30-500納米之間，較佳的在40-250納米之間，更佳的在50-200納米之間，特別佳的在60-150納米之間。
在另一個較佳的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種疫苗，其中人或動物皮膚用的制劑中的液滴總重量為總重量的0.01-40重量％，特別是在0.1-30重量％之間，更佳的在5-20重量％之間。
在本發(fā)明疫苗的另一個較佳實(shí)施方案中，抗原總濃度為穿透劑總重量的0.001-40重量％，特別在0.01-30重量％之間，更佳的在0.1-20重量％之間，最佳的在0.5-10重量％之間。
在本發(fā)明疫苗的另一個較佳實(shí)施方案中，該制劑還包含(da)低分子量化學(xué)刺激劑體，將引發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，或?qū)?dǎo)致逐漸產(chǎn)生針對該抗原的耐受性或特異性促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力。
本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，非侵入性透皮疫苗接種受免疫穿透劑(抗原載體)組合物的影響很大。采用不同純度的抗原出人意料地導(dǎo)致大大不同的免疫應(yīng)答。這反映在總滴度相似的生物體誘導(dǎo)了不同水平的保護(hù)力的觀察結(jié)果中，這可能是因為最終的抗原同種型方式不同而致。
另外，加入常規(guī)的低分子量免疫佐劑單磷酸脂質(zhì)A不僅使表皮免疫結(jié)果更可靠(以前的出版物中記載所測抗體滴度的標(biāo)準(zhǔn)偏差更小)。而且與以前在小鼠中獲得的經(jīng)驗相反，在免疫載體中采用該免疫佐劑還出人意料地增加了IgG2b的分泌(比IgG2a低)，但不增強(qiáng)IgA的產(chǎn)生。由于IgG1(它是Th1樣免疫球蛋白)的存在據(jù)推斷對抵抗破傷風(fēng)毒素的保護(hù)作用(至少在小鼠中)是必需的，因此首次揭示了脂質(zhì)A或細(xì)菌抗原的作用。對于本發(fā)明公開內(nèi)容的未來醫(yī)學(xué)和商業(yè)上的用途，重要的是要認(rèn)識到高(特異性)抗體滴度不一定意味著良好的保護(hù)結(jié)果；為了獲得所需和充分的保護(hù)作用，需要有恰當(dāng)種類和相當(dāng)量的某些抗體同種型，從而提供占優(yōu)勢的Th1或Th2型免疫應(yīng)答(見以前的討論)(視情況而定)。
適合獲得所需目的的基礎(chǔ)配方是本領(lǐng)域已知的；更詳細(xì)的或補(bǔ)充的信息例如參見DE 41 07 152，PCT/EP91/01596，PCT/EP96/04526，DE 44 47 287。本發(fā)明的疫苗不僅僅用于預(yù)防性或治療性疫苗接種，而且還適用于治療過敏和獲得抵抗微生物(包括在人和獸醫(yī)中的胞外和胞內(nèi)細(xì)菌、病毒和寄生蟲)的免疫力。
通過與上述穿透劑結(jié)合，可將抗原(如免疫活性物質(zhì))以和滲透劑的物理或化學(xué)復(fù)合物的形式轉(zhuǎn)運(yùn)通過屏障。
為了從皮膚中的細(xì)胞因子庫得到好處，提議特別有用的疫苗接種方法是先用上述免疫輔助操作預(yù)處理器官，然后將免疫原施加到皮膚上。
特別好地是利用對貼劑評價的上述局部免疫應(yīng)答的讀數(shù)，優(yōu)化進(jìn)一步給予變應(yīng)原的細(xì)節(jié)和過程，從而積極地影響治療性或預(yù)防性疫苗接種的結(jié)果。認(rèn)為這樣的方法可用來很好地達(dá)到或改善受測試對象對所施加變應(yīng)原的免疫耐受性。
如果首次免疫采用侵入性方法(通常用皮下注射或其它一些合適的刺穿/破壞皮膚屏障的方法)，則預(yù)計可獲得高水平的IgM，但是隨后的加強(qiáng)免疫可用本發(fā)明所述的非侵入性方法來進(jìn)行。
最后，提出幾種優(yōu)化方法，這些方法可根據(jù)高度可變形性穿透劑來改善免疫原和疫苗接種。較佳的一種方法是測定結(jié)合了免疫原的穿透劑通過明確屏障中各個孔的流通量與橫跨該屏障的合適的推動力或壓力的函數(shù)關(guān)系，然后用特征性曲線來描述數(shù)和/或(db)來自病原體的低分子量化合物或其片段或衍生物。
在本發(fā)明疫苗的還有一個較佳實(shí)施方案中，發(fā)揮細(xì)胞因子活性的化合物是IL-4，IL-3，IL-2，TGF，IL-6，IL-7，TNF，IL-1α和/或IL-1β，I型干擾素，較佳的是IFN-α或IFN-β、IL-12、IFN-γ、TNF-β、IL-5或IL-10。
在本發(fā)明疫苗的更佳的實(shí)施方案中，具有抗細(xì)胞因子活性的化合物是抗細(xì)胞因子抗體或其對應(yīng)的活性片段、衍生物或類似物。
本文中的術(shù)語“活性片段或衍生物”指所用物質(zhì)基本上維持或模擬了上述活性。
在本發(fā)明疫苗的另一較佳實(shí)施方案中，抗原衍生自病原體。
在本發(fā)明疫苗的另一特別佳的實(shí)施方案中，所述病原體選自胞外細(xì)菌，包括形成膿的球菌，如葡萄球菌和鏈球菌、革蘭陰性菌如腦膜炎球菌和淋球菌屬、奈瑟氏菌屬、革蘭陰性菌，包括腸微生物如大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、假單胞菌、白喉桿菌、百日咳博德特氏菌和革蘭陽性菌(如鼠疫耶爾森氏菌，BCG)，尤其是厭氧菌，如梭菌屬(破傷風(fēng)梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、諾氏梭菌、腐爛梭菌)；在宿主細(xì)胞內(nèi)存活并復(fù)制的細(xì)菌和病毒，包括分支桿菌(如結(jié)核桿菌)和單核細(xì)胞增生李斯特菌，逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒，包括但不局限于肝炎病毒、(人)免疫缺陷病毒、皰疹病毒、天花(禽痘)、流感、麻疹、腮腺炎和脊髓灰質(zhì)炎病毒、巨細(xì)胞病毒、鼻病毒等，在宿主細(xì)胞內(nèi)繁殖的真菌，寄生蟲，包括動物寄生蟲，如原生動物和蠕蟲，以及外寄生物，如蜱和螨，或布魯氏菌屬(如馬爾他布魯氏菌、流產(chǎn)布魯氏菌、豬布魯氏菌、狗布魯氏菌、木鼠布魯氏菌、羊布魯氏菌)、霍亂病原體(如霍亂弧菌)、嗜血菌屬如伴放線菌素嗜血菌、大葉性肺炎嗜血菌和引發(fā)副傷寒、鼠疫、狂犬病、破傷風(fēng)和風(fēng)疹疾病的病原體，引起動物或人體腫瘤形成、自身免疫疾病和其它病理學(xué)狀況(不一定由微生物感染引起)的病原體。
在本發(fā)明疫苗的較佳實(shí)施方案中，變應(yīng)原是內(nèi)源或異源的、微生物、動物或植物來源的物質(zhì)，該物質(zhì)導(dǎo)致接觸該變應(yīng)原的機(jī)體產(chǎn)生急性過敏反應(yīng)，許多這樣的變應(yīng)原來自螨、花粉、動物毛發(fā)或皮屑，或是人造的和/或刺激性無機(jī)物質(zhì)，或是未經(jīng)機(jī)體免疫系統(tǒng)正確加工或與其接觸的人體部分或組分。
在本發(fā)明疫苗的另一較佳實(shí)施方案中，選擇每一個具有細(xì)胞因子活性的化合物的所用濃度，使其比用所選抗原和免疫佐劑一起通過皮下注射所測試的或體外測試所確定的最適濃度高1000倍，較佳的高100倍，更通常的高50倍，還要佳的是高20倍。
在本發(fā)明疫苗的不同的較佳實(shí)施方案中，病原體提取物或化合物是脂多糖、索狀因子(海藻糖-二霉菌酸酯)、胞壁酰二肽、或其它與病原體膜免疫學(xué)活性部分相同或相似的(多)糖或(多)肽；病原體提取物，包括細(xì)菌外毒素和內(nèi)毒素，較佳的是霍亂毒素或大腸桿菌的不耐熱毒素(HLT)，A-鏈衍生物(具有ADP-核糖基化活性的組分)，肽聚糖、梭菌毒素、純化的結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)衍生物、LT-R192G、釀膿鏈球菌的纖連蛋白結(jié)合蛋白I、B型腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白(GBOMP)或細(xì)菌或病毒核酸，如含有非甲基化CpG二核苷酸的寡核苷酸。
在本發(fā)明特別佳的實(shí)施方案中，所述脂多糖是脂質(zhì)A或其衍生物和修飾物，如單磷酸脂質(zhì)A或其類似物，如蔗糖的脂肪衍生物。
在本發(fā)明疫苗的另一特別佳的實(shí)施方案中，衍生自病原體的病原體化合物的濃度比采用類似抗原的相應(yīng)的注射劑所用濃度低10倍到高1000倍之間，更通常的，表皮給予的免疫佐劑濃度與注射的免疫佐劑濃度相差0.5-100倍，更佳的相差1-50倍，最佳的相差2-25倍。
在本發(fā)明疫苗的還有一個較佳實(shí)施方案中，低分子量刺激劑選自變應(yīng)原性金屬離子、酸、堿、刺激性液體、(脂肪)醇、(脂肪)胺、(脂肪)醚、(脂肪)磺酸鹽、磷酸鹽等，或其它合適的溶劑或兩親物，或選自通常能增強(qiáng)皮膚滲透的表面活性劑類似分子，及其衍生物或組合物。
在本發(fā)明疫苗的較佳實(shí)施方案中，選擇低分子量刺激劑的濃度，使其比在相同或相當(dāng)對象上進(jìn)行獨(dú)立測試時因局部刺激(經(jīng)常用于測試刺激劑的方法和標(biāo)準(zhǔn)品測得)而被認(rèn)為不能接受的濃度低至少2倍，更通常的低5倍，還要佳的低10倍或更多。
在本發(fā)明疫苗的另一個特別佳的實(shí)施方案中，變應(yīng)原屬于吸入變應(yīng)原類，包括各種花粉、孢子、少量動物毛發(fā)、皮膚、羽毛、天然或合成的織物、小麥、(房間)灰塵，包括螨；食物和藥物變應(yīng)原；接觸變應(yīng)原；注射、侵入性和貯存變應(yīng)原，如各種(常駐于腸胃的)蠕蟲、棘球蚴、旋毛蟲等、部分植入物質(zhì)等。
在本發(fā)明疫苗的較佳實(shí)施方案中，抗原應(yīng)用劑量與免疫過程中的注射劑量相差0.1-100倍，常在0.5-50倍范圍內(nèi)，更佳在1-20倍之間，理想的是比注射所用劑量高不到10倍。
在本發(fā)明疫苗的另一較佳實(shí)施方案中，穿透劑應(yīng)用量在0.1-15毫克/平方厘米之間，更通常的在0.5-10毫克/平方厘米之間，較佳的在1-5毫克/平方厘米之間。對于容易達(dá)到的或遮蔽的機(jī)體區(qū)域(如胸部或背部、手臂、頸側(cè)面如耳后或頭皮區(qū)域)，用不同的給藥面積來控制免疫原應(yīng)用量也是有利的。
在本發(fā)明疫苗的不同的較佳實(shí)施方案中，所述抗原是純的或純化的抗原。在本發(fā)明疫苗中采用高度純化的抗原已經(jīng)證實(shí)對于產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答是特別有利的。
本發(fā)明還涉及一種試劑盒，它包括裝在瓶子或其它包裝形式中的至少一個劑量的疫苗。
根據(jù)本發(fā)明的一個較佳實(shí)施方案，該試劑盒包括上述抗原的至少一個注射劑量。
本發(fā)明還涉及一種使哺乳動物產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，該方法包括用上述疫苗對所述哺乳動物進(jìn)行接種。
在本發(fā)明方法的另一較佳實(shí)施方案中，選擇不同的處理面積，以控制免疫原的施加劑量以及治療性疫苗接種的結(jié)果。
在本發(fā)明方法的一個更佳的實(shí)施方案中，在給藥的前一天，較佳的給予皮膚所述制劑前360分鐘(更佳為60分鐘、還要佳為30分鐘)，將抗原加入無抗原的穿透劑懸浮液中與穿透劑結(jié)合。
在本發(fā)明方法的另一較佳實(shí)施方案中，在用免疫輔助性操作對器官進(jìn)行預(yù)處理后，將本發(fā)明疫苗施加到皮膚上，所述操作例如包括對皮膚進(jìn)行摩擦、擠壓、加熱，使皮膚接觸電或力的作用，如超聲場等，或?qū)⒎敲庖咴灾苿┳⑸淙肫つw中，只要該處理能使皮膚或其它有免疫活性的外周組織釋放免疫輔助性化合物，或減少針對所需疫苗的拮抗劑的作用濃度/作用時間。
在本發(fā)明方法的較佳實(shí)施方案中，免疫原以非堵塞性貼劑形式施加。該實(shí)施方案也可用于評價皮膚對表皮給予的穿透劑懸浮液中的免疫原的反應(yīng)，皮膚至少在開始時對該免疫原有過敏，從而產(chǎn)生了急性局部過敏反應(yīng)(例如可從產(chǎn)生的皮膚發(fā)紅、刺激等看出)。
在本發(fā)明方法的另一較佳實(shí)施方案中，給予至少一劑疫苗。
本發(fā)明方法的這個實(shí)施方案包括反復(fù)給予本發(fā)明疫苗。反復(fù)給予包括在皮膚上反復(fù)給予，或在皮膚上給予一次或多次并與例如腸胃外給藥相聯(lián)合。在這種情況下，本發(fā)明所用試劑盒宜包括含有本發(fā)明疫苗的一個或多個容器。
在本發(fā)明方法的特別佳的實(shí)施方案中，所述疫苗以加強(qiáng)接種形式給予。
在本發(fā)明方法的最佳實(shí)施方案中，初次免疫采用侵入性方法，通常用皮下注射或其它一些合適的刺穿/破壞皮膚屏障的方法，而隨后的至少一次加強(qiáng)免疫采用非侵入性方式。
在本發(fā)明方法的較佳實(shí)施方案中，當(dāng)采用非變應(yīng)原性抗原時，疫苗應(yīng)用次數(shù)在2-10次之間，較佳的在2-7次之間，更佳的多至5次，最佳的3次，或在變應(yīng)原情況下接種如此次數(shù)，這是實(shí)現(xiàn)所需免疫耐受性(根據(jù)合適的評價方法來測定)或認(rèn)為嘗試失敗所必需的。
在本發(fā)明方法的特別佳的實(shí)施方案中，選擇隨后的接種間隔的時間為2周-5年之間，通常為1個月至3年，更通常的為2個月至1年半。在更佳的實(shí)施方案中，提倡反復(fù)給予免疫原以使治療性疫苗接種最終效果達(dá)到最大。當(dāng)采用非變應(yīng)原性抗原時，建議疫苗接種次數(shù)在2-10次之間，通常在2-7次之間，更常多至5次，最佳的3次，或在變應(yīng)原情況下接種如此次數(shù)，這是實(shí)現(xiàn)所需免疫耐受性(用上述或其它合適的評價方法來測定)或認(rèn)為嘗試失敗所必需的。在對象首次接受免疫后，隨后的接種時間間隔宜為2周-5年，通常為1個月至3年，更通常為2個月至1年半。嚙齒類動物(如小鼠)和家兔宜在2周間隔內(nèi)免疫，靈長類動物(如猴子和人)需要在3-6周間隔時間內(nèi)加強(qiáng)接種。
在本發(fā)明方法的較佳實(shí)施方案中，測定攜帶免疫原通過明確的屏障的各個孔的穿透劑流通量與橫跨作用于該屏障的合適推動力或壓力的函數(shù)關(guān)系，然后用特征曲線方便地描述該數(shù)據(jù)，進(jìn)而用該特征曲線優(yōu)化制劑或下一步的應(yīng)用。
最后，本發(fā)明涉及上述透皮載體，能特異性釋放或特異性誘導(dǎo)細(xì)胞因子或抗細(xì)胞因子活性或發(fā)揮該活性的化合物，抗原或變應(yīng)原，以及任選的微生物的提取物或化合物或其片段或衍生物和/或低分子量化學(xué)刺激劑，用于制備誘導(dǎo)保護(hù)性或致耐受性免疫應(yīng)答的疫苗的用途。


圖1給出了用加有TT的Transfersomes或混合的分子團(tuán)表皮免疫的動物存活數(shù)據(jù)，以描述團(tuán)聚體大小(穩(wěn)定性)的效果，因為過度失穩(wěn)定的Transfersomes通常會崩解成混合的脂質(zhì)分子團(tuán)。
在圖2中，比較了對施加在皮膚上的攜帶TT的常規(guī)脂囊泡(脂質(zhì)體)和超變形性脂囊泡(Transfersomes)的免疫應(yīng)答，上圖中給出了血清中對應(yīng)的特異性抗體的濃度(用吸收值表示)。
圖3描述了增加抗原劑量對于利用Transfersomes進(jìn)行表皮免疫結(jié)果的影響，結(jié)果用吸收值變化、抗體滴度或動物存活以及對應(yīng)的特異性抗體同種型數(shù)據(jù)表示。
圖4揭示了抗原純度對于Transfersomes中破傷風(fēng)類毒素表皮免疫結(jié)果的影響，包括動物存活的時間依賴性的信息。
圖5比較了反復(fù)侵入性(皮下)免疫與用含TT的Transfersomes進(jìn)行非侵入性(表皮)免疫的結(jié)果，結(jié)果包括動物存活、血清濃度(用吸收值表示)、特異性抗體滴度和抗體分布方式的數(shù)值。
圖6描述了皮膚預(yù)處理(非特異性攻擊)對Transfersomes介導(dǎo)的TT輸送通過皮膚后免疫應(yīng)答反應(yīng)的影響。
圖7側(cè)重于較低分子量免疫調(diào)節(jié)劑單磷酸脂質(zhì)A(LA)和Transfersomes中的TT一起通過完整皮膚的佐劑效果。
圖8證明了細(xì)胞因子白介素-12(IL-12)和TT一起靠Transfersomes輸送通過皮膚的免疫輔助性能。
圖9涉及小鼠對各種細(xì)胞因子非侵入性輸送通過皮膚的Transfersomes中破傷風(fēng)類毒素(TT)抗原的應(yīng)答反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)。
圖10表示當(dāng)載體中還包括支持特異性抗體產(chǎn)生的霍亂毒素(CT)時，皮膚經(jīng)Transfersomes中TT處理刺激小鼠免疫應(yīng)答的實(shí)驗證據(jù)，以及動物針對破傷風(fēng)毒素致死性攻擊的保護(hù)作用。
圖11描述了用大腸桿菌不耐熱毒素作為免疫佐劑。
圖12描述了用組胺作局部皮膚預(yù)處理與用Transfersomes透皮施加抗原相結(jié)合的免疫調(diào)節(jié)效果。
圖13描述了皮下引導(dǎo)對抗破傷風(fēng)抗體滴度以及對表皮接種后宿主存活的影響。
圖14顯示了用破傷風(fēng)類毒素和霍亂毒素作為抗原進(jìn)行二價疫苗接種的效果。
下面的實(shí)施例對本發(fā)明作了說明，但對本發(fā)明沒有限制作用。
實(shí)驗總體安排和樣品制備從National Institute of Nutrition(Hyderabad，India)獲得Swiss白化小鼠(18-20克)。在首次免疫時，小鼠為8-12周齡，它們通常按4-6只一組放在吊籠內(nèi)。動物可以自由接近標(biāo)準(zhǔn)食品和水。免疫前一天，仔細(xì)刮去小鼠背上施加疫苗區(qū)域的毛。用高精度滴定管將抗原施加到皮膚表面上，使其部分變干。為了防止免疫原被磨去，將動物轉(zhuǎn)移到單個的動物籠中，使它們在那里每次表皮給藥后呆18小時。
在包括免疫接種的操作期間，用通用的麻醉方法使測試動物無應(yīng)力和安靜。為此，注射Ketavet和Rompun的混合物，在每只小鼠腹膜腔內(nèi)注射0.3毫升含0.0071％Rompun(Bayer，LeverKusen，Germany)和14.3毫克/毫升Ketavet(Parke-Davis，Rochester，N.Y)的等滲NaCl溶液。這通常使動物沉睡大約2小時。
免疫原本工作中研究的超變形性免疫-載體或免疫-穿透劑(免疫-Transfersomes)通常具有(數(shù)層)雙層泡囊的形式。它們含有生物相容的(磷)脂質(zhì)，如磷脂酰膽堿和(生物)表面活性劑，如膽酸鈉或多山梨醇酯(Tween 80)，維持該高度團(tuán)聚體可變形性的不同組成是可能的。其它組分是具有多用途免疫輔助活性的單磷酸脂質(zhì)A，以及所需的指定的抗原。
常規(guī)的泡囊脂質(zhì)體包含大豆磷脂酰膽堿(SPC；Nattermann Phospholipids，Rhone-Poulenc Rorer，Cologne，Germany)，它如下所述制得。首先，真空干燥(10Pa，過夜)有或沒有佐劑單磷酸脂質(zhì)A(MLA，相對于SPC為0.04％摩爾)的有機(jī)脂質(zhì)溶液。所得脂質(zhì)膜用含破傷風(fēng)類毒素(2.0毫克/毫升；Accurate Antibodies，NY，USA)的磷酸緩沖液(pH＝6.5)水化，得到10％(重量)的脂質(zhì)懸浮液。將脂囊泡懸浮液粗品擠壓通過一系列800納米、400納米和200納米孔徑的聚碳酸酯膜，以使最終的泡囊大小分布范圍變窄。
如前所述(Paul等人，1995，同上)，制備可高度可變形的泡囊Transfersomes。簡言之，使SPC乙醇溶液與膽酸鈉(Merck，Darmstadt，Germany)(3.75/1摩爾/摩爾)以及佐劑(如果需要)混合。將混合物分散在10mM磷酸緩沖液(pH＝6.5)中。在溶液中加入破傷風(fēng)類毒素，使1毫升懸浮液按需有0.25-2.0毫克蛋白質(zhì)。然后，對泡囊懸浮液凍融三次。隨后，使制劑在壓力下通過微孔濾膜(200納米；Poretics，CA)。為了檢查泡囊生產(chǎn)的重復(fù)性，測定每一制備物400納米的光密度，確認(rèn)大致是恒定的。
通過改變表面活性劑與脂質(zhì)之比，可控制泡囊團(tuán)聚體的可變形性，其濃度最高為膜因表面活性劑濃度高而變得不穩(wěn)定變成分子團(tuán)形式的濃度。不加入表面活性劑的脂囊泡通常稱為脂質(zhì)體，其膜的可屈曲性比Transfersome低至少10倍，將它用作負(fù)對照。
脂質(zhì)總濃度通常為10％重量，除非另有所述。抗原濃度通常(但不是必需)約為1毫克/毫升。含有殺微生物藥的緩沖液提供了此大批量相。對于其它合適的組合物，專家可直接參見我們實(shí)驗室的其它出版物和專利。
免疫接種可用不同的配方來進(jìn)行，包括沒有抗原的超變形泡囊；然后，這些泡囊含有破傷風(fēng)類毒素(有或沒有脂質(zhì)A)且不含免疫原。每一制劑在6只小鼠上進(jìn)行試驗，除非另有所述。
在皮下免疫的情況下，給每只小鼠注射40微克免疫原。對于非侵入性給藥，在每只小鼠上背部完整皮膚上給予1微克-80微克與不同載體結(jié)合的破傷風(fēng)類毒素。所有非注射的制劑用高精度移液管施加，使其干燥；在此期間，小鼠被放在隔離的籠子內(nèi)，以最大程度地減小施加物的磨損(例如由于鼠背相互摩擦而引起)。每兩周(即在第14天和28天)對動物加強(qiáng)免疫；因此，整個免疫方案由三劑組成，包括初次免疫和兩次加強(qiáng)免疫。
在第7、21和35天從動物的后眼眶取血。首先使收集的血液凝塊。在微量離心機(jī)中簡單離心后，分離血清，在56℃下去除補(bǔ)體30分鐘，然后-20℃保藏至測定抗體總濃度和特異性抗體同種型。
吸光度測定采用標(biāo)準(zhǔn)的UV-vis分光光度計。
用ELISA測定血清中破傷風(fēng)類毒素(TT)特異性抗體。用ELISA以習(xí)慣方式測定抗破傷風(fēng)抗體的水平，通常一式兩份。簡言之，用包被緩沖液(碳酸鈉/碳酸氫鈉，pH＝9.6)配的等份抗原(100微升，每毫升含有10微克TT)包被ELISA板(maxisorpNUNC，Germany)37℃ 3小時?？紫扔?00微升/孔的洗滌緩沖液洗滌兩次，然后，于37℃用含2％牛奶的洗滌液(1000毫升中有8克氯化鈉、1.45克二水磷酸氫二鈉、0.2克磷酸二氫鉀、0.2克氯化鉀和0.05％Tween-20)封閉3小時。在用每孔200毫升的洗滌緩沖液洗滌一次后，使平板與各種稀釋度(1/50-1/6400)的測試血清培育。4℃培育過夜后，用每孔200微升的洗滌緩沖液洗滌平板3次，與100微升第二抗體培育。在測定IgG、IgA或IgM的量時，采用辣根過氧化物酶(hrp)偶聯(lián)的合適的抗Ig。37℃培育3小時后，用每孔200微升的洗滌緩沖液洗滌平板三次，用鄰苯二胺作為hrp底物顯色。為用于此目的，以磷酸檸檬酸緩沖液(pH4.5)配制0.4毫克/毫升的鄰苯二胺，且每毫升中有0.4微升過氧化氫。2分鐘后，加入50微升2N硫酸終止反應(yīng)。測定492納米下的吸光度。
用于檢測各種同種型的方法也以ELISA為基礎(chǔ)。它依靠的是過氧化物酶標(biāo)記的、親和純化的對IgG1(1∶1000)、IgG2a(1∶1000)、IgG2b(1∶1000)以及IgG3(1∶200)有特異性的第二抗體(均從ICN ImmunoBiologicals獲得)。其它第二抗體包括與辣根過氧化物酶連接的IgA(1∶1000)和IgM(1∶1000)(Sigma，Neu-Ulm，Germany)。相應(yīng)標(biāo)記的抗小鼠IgE購自PharMingen(san Diego，CA)。同樣，使抗原吸附到測試板上，在洗去過量抗原后與測試血清一起培育。隨后，在6個不同的板之一中加入100微升合適的特異性第二抗體溶液，以分別測定抗IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA，IgM。37℃培育平板3小時，如上段中所述那樣進(jìn)行。
用抗原(破傷風(fēng)毒素)進(jìn)行體內(nèi)攻擊。在第35天，皮下注入(s.c.)50倍LD50的破傷風(fēng)毒素，對試驗動物進(jìn)行攻擊。(LD50的實(shí)際值在分開的試驗中固定，在此期間，一組16只重量匹配的動物用增加量的毒素進(jìn)行皮下攻擊，測定存活數(shù))。為了測定接種動物中的急性TT毒性，在第一次攻擊后4天，記錄這些試驗小鼠的臨床狀況。
未受保護(hù)的小鼠在24小時后顯示出癱瘓癥狀，在至少36小時后導(dǎo)致死亡。在攻擊后4天內(nèi)未產(chǎn)生癱瘓或其它異常癥狀的動物認(rèn)為有抵抗破傷風(fēng)的免疫力。
用對應(yīng)于50倍LD50的毒素劑量每月攻擊所有免疫的小鼠，攻擊至少半年，以測試長期免疫力。
實(shí)施例1-2團(tuán)聚體大小(穩(wěn)定性)效果高度可變形性泡囊(TransfersomesTMIDEA)87.4毫克大豆磷脂酰膽堿(SPC)
12.6毫克膽酸鈉(NaChol)相對于SPC為0.04％摩爾的單磷酸脂質(zhì)A(MLA，LA)0.9毫升磷酸緩沖液，10mM，pH6.50.1毫升乙醇(混合的脂質(zhì))分子團(tuán)65毫克大豆磷脂酰膽堿(SPC)35毫克膽酸鈉(NaChol)相對于SPC為0.04％摩爾的單磷酸脂質(zhì)A(MLA)0.9毫升磷酸緩沖液，10mM，pH6.50.1毫升乙醇破傷風(fēng)類毒素(2毫克/毫升；Accurate Antibodies)，每只小鼠每次免疫用40微克(20微升)或80微克(40微升)TT的劑量施加區(qū)域每只小鼠上背部的1平方厘米或2平方厘米為40微克或80微克TT。
為了測試制劑穩(wěn)定性對各種表皮給予制劑的免疫學(xué)性質(zhì)的效果，制備兩種團(tuán)聚體較大的泡囊(直徑在100納米-200納米之間)和較小的分子團(tuán)(直徑小于50納米)。預(yù)計選擇后者，在次優(yōu)條件下可能從前者產(chǎn)生后者(由于脂質(zhì)降解或團(tuán)聚體組成不合適)。
492納米的血清吸光度反映的抗體滴度顯示在圖1中。它們表明混合的脂質(zhì)分子團(tuán)的抗原載體效果比加有相同量TT的超變形混合脂囊泡(Tfs)差。含有強(qiáng)度較低的洗滌劑的混合分子團(tuán)(皮膚滲透增強(qiáng)能力較低)的免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑效果更低。
動物保護(hù)力數(shù)據(jù)揭示了如圖1下圖所示的類似的趨勢。
實(shí)施例3-4團(tuán)聚體可變形性效果常規(guī)的脂囊泡(脂質(zhì)體)100毫克大豆磷脂酰膽堿(SPC)相對于SPC為0.04％摩爾的單磷酸脂質(zhì)A(MLA)0.5毫升磷酸緩沖液，10mM，pH6.52毫克/毫升破傷風(fēng)類毒素(Accurate Antibodies)高度可變形的泡囊(TransfersomesTM)87.4毫克大豆磷脂酰膽堿(SPC)12.6毫克膽酸鈉(NaChol)
相對于SPC為0.04％摩爾的單磷酸脂質(zhì)A(MLA)0.9毫升磷酸緩沖液，10mM，pH6.50.1毫升乙醇每只小鼠每次免疫采用的破傷風(fēng)類毒素劑量為40微克或80微克TT施加區(qū)域每次免疫在每只小鼠上背部的1平方厘米或2平方厘米為40微克或80微克TT。
用常規(guī)泡囊獲得的結(jié)果與用高度可變形性泡囊測得的數(shù)據(jù)不同簡單的脂質(zhì)體不能通過屏障中的窄孔，也不能引發(fā)高的抗體滴度。相反，具有高屈曲性和可變形性、因而更適合的膜的泡囊顯示出更容易移動通過屏障中的窄孔，根據(jù)血清吸光度測定的結(jié)果(比較圖2)，它施加在完整皮膚上后產(chǎn)生了顯著量的抗體。
實(shí)施例5-10抗原劑量效果高度可變形的泡囊86.3毫克大豆磷脂酰膽堿(SPC)13.7毫克膽酸鈉(NaChol)相對于SPC為0.04％摩爾的單磷酸脂質(zhì)A(MLA)0.9毫升磷酸緩沖液，10mM，pH6.50.1毫升乙醇破傷風(fēng)類毒素(TT；Accurate Antibodies，New York，USA)濃度空的、0.25毫克/毫升、0.5毫克/毫升、1毫克/毫升、2毫克/毫升，每只小鼠每次免疫0微克、10微克、20微克、40微克或80微克TT施加區(qū)域每次免疫在每只小鼠上背部的1平方厘米給予0微克、10微克、20微克、40微克，和2平方厘米給予80微克TT。
該系列實(shí)驗的結(jié)果在圖3中有所描述。該圖清楚地表明，對于表皮給予的超變形性載體中的破傷風(fēng)類毒素的免疫應(yīng)答隨破傷風(fēng)類毒素劑量的增加而增加。這反映在血清吸光度(每次免疫最高達(dá)20微克劑量)，特異性抗體滴度(每次免疫最高達(dá)40微克的劑量)和存活數(shù)據(jù)(對于每次免疫高達(dá)80微克的劑量沒有飽和)上。
除IgG1(強(qiáng)烈表明應(yīng)答飽和)和IgG2b(飽和度可能在每次免疫40微克-80微克之間)外，同種型分布方式不清楚。IgM顯示了類似于IgG1的劑量依賴性。IgG2a得到的圖令人困惑。
實(shí)施例11-13抗原純度的影響高度可變形的泡囊如實(shí)施例5-10所述(只是用不純的TT處理的組不接受免疫佐劑脂質(zhì)A)破傷風(fēng)類毒素2毫克/毫升，對應(yīng)于每只小鼠每次免疫80微克TT。
施加面積上背部2平方厘米。
當(dāng)類毒素已經(jīng)非侵入性地施加到皮膚上時，抗原純度對小鼠產(chǎn)生抵抗破傷風(fēng)類毒素的保護(hù)力有很大影響。(用注射抗原獲得的類似結(jié)果沒有顯示)。
為了證實(shí)上述內(nèi)容，首先用體外培養(yǎng)的破傷風(fēng)梭菌培養(yǎng)基濾液作為不純的抗原。為了獲得部分純化的抗原，使該濾液通過10kDa的截留膜，用pH6.5的磷酸緩沖液充分洗滌；在該過程中，培養(yǎng)濾液被濃縮15倍。純化的類毒素購自Accurate Antibodies，NY，USA。
用標(biāo)稱劑量相同的不純抗原、添加單磷酸脂質(zhì)A的部分純化的抗原或加入單磷酸脂質(zhì)A的純化抗原免疫Swiss白化小鼠(n＝6)?？乖冀K與類似的Transfersomes結(jié)合。后者的組成及其制備方法如前面的實(shí)施例所述。免疫方案詳情、取血時間、攻擊和分析詳情也與上述實(shí)施例相似。
結(jié)果顯示在圖4中。圖4說明了抗原純度在決定抗TT免疫應(yīng)答的性質(zhì)和強(qiáng)度中所起的作用。圖4中顯示的數(shù)據(jù)還表明，特異性抗體滴度的吸光度并不是治療(即，表皮疫苗接種的預(yù)防效果)的可靠預(yù)測器。這是因為特異性抗體同種型中有很大的差別，如果采用足夠純的抗原，它只含有與Th2樣IgG1組分相比很大部分的Th1樣IgG2b(另見第12頁)。
實(shí)施例14-15表皮和皮下給藥的比較高度可變形的泡囊TransfersomesTM(IDEA)如實(shí)施例5-10所述破傷風(fēng)類毒素劑量每次表皮免疫用80微克TI(用2毫克TT/毫升，施加面積為2平方厘米)每次皮下免疫用40微克TI(用2毫克TT/毫升)用與實(shí)施例1-4所述大致相同的實(shí)驗步驟，測定抗體-特異性血清滴度、抵抗破傷風(fēng)毒素的動物保護(hù)作用水平以及不同特異性抗體同種型的相對出現(xiàn)率。
結(jié)果顯示在圖5中。盡管在侵入性和非侵入性給予抗原后，血清吸光度的免疫接種依靠性增加是相當(dāng)?shù)?，但是在后一情況中，初次免疫后的滴度低6倍，第二次加強(qiáng)免疫后低8倍。同樣，盡管Th2的TT特異性水平表明IgG1在本實(shí)驗的兩個分枝中是相似的，但是其它抗體亞型的特異性讀數(shù)，尤其是IgG2a以及在較早時間IgG2b分別比抗原注射后高25倍和3倍。然而，試驗小鼠在隨后注射的通常致死劑量的破傷風(fēng)毒素攻擊下存活的可能性與抗原給藥途徑無關(guān)(至少在本系列試驗方案中)。
實(shí)施例16-17用佐劑處理皮膚(預(yù)先注射)的效果高度可變形的泡囊TransfersomesTM(IDEA)89.3毫克大豆磷脂酰膽堿(SPC)10.7毫克膽酸鈉(NaCho1)相對于SPC為0.04％摩爾的單磷酸脂質(zhì)A(MLA)0.9毫升磷酸緩沖液，10mM，pH6.50.1毫升乙醇每只小鼠用破傷風(fēng)類毒素，2毫克/毫升，對應(yīng)于80微克TT/用不純的抗原對每組6只Swiss白化小鼠進(jìn)行免疫施加面積上背部上的2平方厘米將與Transfersomes結(jié)合的大分子透皮輸送通過皮膚看來是非常柔和的；因此，如果抗原用量較少或不純，它不能觸發(fā)免疫系統(tǒng)發(fā)生Th2-樣免疫應(yīng)答。為了改變這種情況，可以(預(yù)先)刺激皮膚，使器官在經(jīng)超變形泡囊進(jìn)行實(shí)際的非侵入性給予抗原之前釋放出相應(yīng)的信息分子。為此，我們預(yù)先向施加部位注射了0.1毫升鹽水、或非抗原性泡囊的輕微配方，后者在使用前一天從類似于抗原攜帶泡囊的生物可降解物質(zhì)制得。對于其它對照，還可在免疫載體施加到皮膚上之前24小時將不完全的Freund佐劑注射入不同動物中。
圖6給出了結(jié)果的說明性例子。圖6揭示，經(jīng)注射預(yù)處理的小鼠中的特異性抗體滴度比作為對照的施加在皮膚上的載體配方更高，保護(hù)作用得到改進(jìn)。不完全Freund′s佐劑的效果令人驚奇地低。
值得注意的是，血清吸收度或特異性抗體滴度與表明保護(hù)性疫苗接種效果的動物存活沒有相關(guān)性。
實(shí)施例18-21
低分子量佐劑(脂質(zhì)A)的影響高度可變形的免疫調(diào)節(jié)的TT-TransfersomesTM(IDEA)86.3毫克大豆磷脂酰膽堿(SPC)13.7毫克膽酸鈉(NaChol)相對于SPC為0.04％摩爾的單磷酸脂質(zhì)A(MLA)0.9毫升磷酸緩沖液，10mM，pH6.50.1毫升乙醇高度可變形的標(biāo)準(zhǔn)的免疫泡囊，TT-TransfersomesTM(IDEA)如上所述，但是不加入LA破傷風(fēng)類毒素2毫克/毫升每次免疫接種用20微升或40微升，相當(dāng)于40微克或80微克TT施加面積1平方厘米或2平方厘米，分別在上背部。
我們認(rèn)為，當(dāng)已經(jīng)通過屏障的TT載體將抗原呈遞給機(jī)體時，為了獲得所需的針對抗原的免疫學(xué)作用，免疫活性(通常是免疫增強(qiáng)性)分子必須存在于皮膚內(nèi)。為了證實(shí)該結(jié)論，我們比較了有或沒有熟知的免疫刺激劑(例如，單磷酸脂質(zhì)A(LA)，已知它引發(fā)體內(nèi)產(chǎn)生TNF)時通過Transfersomes來非侵入性地免疫呈遞TT的結(jié)果。采用兩種不同的抗原劑量。在任一情況下，均能獲得充分的滴度和可測定的預(yù)防性免疫應(yīng)答(部分免疫力)。
血清吸光度如預(yù)計的那樣增加(比較圖7)。相反，用較低劑量看到的LA效果比較高劑量好。這可能是試驗差異，或反映了劑量對局部免疫數(shù)據(jù)作用曲線的非線性關(guān)系。例如，佐劑可能僅在低劑量范圍內(nèi)有效，而在高劑量方案中，系統(tǒng)是準(zhǔn)飽和的，使得佐劑在試驗設(shè)定范圍內(nèi)進(jìn)一步增強(qiáng)免疫應(yīng)答幾乎不可能。在本系列試驗中，較高的TT劑量與單單LA聯(lián)合應(yīng)用，獲得了抵抗50LD50的正常致死性攻擊的完全的動物保護(hù)作用。
還觀察到，與沒有LA的組相比，有LA的組的Th1-細(xì)胞因子IgG2b較高。這一差別在低劑量時更為顯著(相差4倍)，而在高劑量下只觀察到增強(qiáng)2倍。主要存在的是Th2-細(xì)胞因子IgG1，除了IgG2b提供相當(dāng)保護(hù)作用的低劑量LA組之外。
實(shí)施例22-23高分子量佐劑IL-12細(xì)胞因子的影響高度可變形的泡囊TransfersomesTM(IDEA)如實(shí)施例5-10所述，每毫升免疫原懸浮液有0.01毫克IL-12。
破傷風(fēng)類毒素，2毫克/毫升，對應(yīng)于每只小鼠每次免疫用80微克TT(如實(shí)施例9-11所述經(jīng)部分純化)施加面積Swiss白化小鼠上背部的2平方厘米。
為了研究細(xì)胞因子對于用破傷風(fēng)類毒素進(jìn)行非侵入性表皮疫苗接種結(jié)果的影響，每只小鼠采用單磷酸脂質(zhì)A與0.4微克IL-12的組合。每只小鼠給予80微克IL-12以及加有破傷風(fēng)類毒素和單磷酸脂質(zhì)A的Transfersomes。免疫方案詳情、取血時間、破傷風(fēng)毒素最終攻擊與上述相同。
一系列試驗的結(jié)果描述在圖8中。證實(shí)結(jié)論是，在表皮給予TT后免疫呈遞期間皮膚中促Th2細(xì)胞因子的存在積極地影響疫苗接種的結(jié)果。這可從血清吸收度、特異性抗體滴度以及試驗動物存活可能性看出。
通過將IL-12以外的細(xì)胞因子摻入免疫原配方中，驗證了實(shí)施例22-23討論的效果。結(jié)果顯示在圖9中。
實(shí)施例24-25高分子量佐劑(IFN-γ和GM-CSF+IL-4)的影響高度可變形的泡囊TransfersomesTM(IDEA)如實(shí)施例5-8所述，加上每毫升免疫原懸浮液有0.05毫克IFN-γ和0.004毫克GM-CSF和0.004毫克IL-4破傷風(fēng)類毒素，2毫克/毫升，對應(yīng)于每次免疫每只小鼠80微克TT(不純的)施加面積Swiss白化小鼠上背部的2平方厘米用不同細(xì)胞因子的混合物也證實(shí)了實(shí)施例22-23所討論的效果。結(jié)果顯示在圖10中。
實(shí)施例28-29加強(qiáng)免疫的影響(免疫應(yīng)答的成熟)在前述大多數(shù)實(shí)施例中，無論在免疫期間何時測定吸光度，都觀察到了一致的模式。與初次免疫后獲得的應(yīng)答相比，每一次加強(qiáng)都使免疫應(yīng)答增加(見圖3、4、5、6、7、8)。初次應(yīng)答的特征是主要為IgM，第一次加強(qiáng)后逐漸出現(xiàn)IgG，第二次加強(qiáng)后出現(xiàn)了更多量的IgG，同時IgM消失。這種典型的同種型模式意味著免疫應(yīng)答的親和力成熟。在該過程，特異性抗體混合物的平均親和力隨反復(fù)免疫而增加。
各種表皮疫苗接種實(shí)驗的結(jié)果提示，將侵入性初次疫苗接種與非侵入性二次(加強(qiáng))免疫組合起來是有利的。
實(shí)施例30-72Transfersomes使皮膚體外釋放細(xì)胞因子高度可變形的泡囊(C型Transfersomes)87.4毫克大豆磷脂酰膽堿(SPC)12.6毫克膽酸鈉(NaChol)0.9毫升磷酸緩沖液，50mM，pH7.32.5微升高度可變形的泡囊(T型Transfersomes)50毫克大豆磷脂酰膽堿(SPC)50毫克聚乙二醇-20-縮水山梨糖醇-單油酸酯(Tween 80)0.9毫升磷酸緩沖液，50mM，pH6.52.5微升正對照A2.5微升5％十二烷基硫酸鈉(SDS)正對照B100微升脂多糖(LPS；105U/ml)負(fù)對照2.5微升磷酸緩沖鹽溶液(PBS)所有產(chǎn)物均不稀釋進(jìn)行測試。
細(xì)胞類型采用形成具有致密角質(zhì)層的多層上皮的正常人角質(zhì)化細(xì)胞；組織學(xué)揭示與體內(nèi)人表皮非常相似。
方法將角質(zhì)細(xì)胞接種到化學(xué)組成確定的、有添加物的培養(yǎng)基中0.63平方厘米的聚碳酸酯濾膜插入物上，在氣液界面處培育17天。
測試測定用微量移液管加入給定量的各測試產(chǎn)品，用小的無菌裝置均勻分散在8個重建表皮的角質(zhì)層表面上。于37℃、5％CO2下培育培養(yǎng)物24小時。用0.5毫升PBS洗滌一式四份的培養(yǎng)物(只是LPS處理的細(xì)胞一式兩份培育)，37℃、5％CO2下在300微升0.5毫克/毫升MTT上培育3小時。
采用待測定的每種免疫調(diào)節(jié)劑特異性的ELISA試劑盒(R&D systems UK；Quantikine)定量測定組織下基質(zhì)中的炎性介質(zhì)(IL1α、IL2、IL4、IL8、IL1O、IFN-γ和TNF-α)的釋放。

Transfersomes O觀察到有較大標(biāo)準(zhǔn)偏差可以解釋為該產(chǎn)品難以在重建表皮的角質(zhì)層上均勻地分散。
當(dāng)細(xì)胞與含有LPS(它是確定的免疫佐劑)的正對照接觸后，TNF-α水平升高到113.43pg/ml的水平。
在細(xì)胞與Transfersomes培育后，IL 8的濃度超過檢測下限2倍，在一個例子中在95％置信水平下沒有意義(在另一個例子中幾乎沒有意義)，但是這二種狀況與含有免疫佐劑LPS的正對照所觀察到的增加(提供了高167倍的數(shù)值)相比都可以忽略。
非特異性刺激劑SDS使皮膚細(xì)胞釋放出大量IL-1α進(jìn)入體外培養(yǎng)基。有這樣的可能，即，與Transfersomes O培育的細(xì)胞釋放出一定的量，包含高濃度的有潛在刺激性的油酸，但是后一試驗系統(tǒng)所得結(jié)果中大的標(biāo)準(zhǔn)偏差使得結(jié)論不牢靠。
其它測試的A型和B型Transfersomes的IL-1α濃度變?yōu)楸镜姿降拇蠹s2倍。與負(fù)對照相比，該差別在統(tǒng)計學(xué)上有意義，但是在實(shí)踐中是可以忽略的，因為含有LPS的正對照所觀察到的增加超過60倍。
IFN-γ、IL-2、IL-4或IL10沒有升高至可測定的水平，提示在任何其它測試條件下沒有釋放出這些細(xì)胞因子。
總之，上述發(fā)現(xiàn)提示Transfersomes不釋放細(xì)胞因子，也不誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞產(chǎn)生這些分子。這解釋了當(dāng)用這些載體將抗原或變應(yīng)原輸送通過皮膚并引發(fā)治療性或預(yù)防性免疫應(yīng)答時需要使用免疫佐劑/調(diào)節(jié)劑的原因。
實(shí)施例73-82
細(xì)菌細(xì)胞壁組分霍亂毒素作為特異性免疫佐劑高度可變形的泡囊TransfersomesTM86.3毫克大豆磷脂酰膽堿(SPC)13.7毫克膽酸鈉(NaChol)0.9毫升磷酸緩沖液，10mM，pH6.5霍亂毒素(CT；Sigma，Neu-UIm)，每次免疫10微克，如果需要，加上破傷風(fēng)類毒素(TT，純的；Accurate Antibodies)2毫克/毫升在4-6只Swiss白化小鼠上背部的2平方厘米區(qū)域內(nèi)，表皮給予的劑量分別為每次免疫每只小鼠0微克TT(負(fù)對照)、1微克TT、5微克TT、10微克TT、20微克TT、40微克TT(用CT的情況下)和80微克TT(沒有CT)；在正對照組每只小鼠相應(yīng)部位每次免疫皮下注射20微克TT。將未免疫的小鼠用作另一負(fù)對照。
當(dāng)測試配方中加入霍亂毒素與破傷風(fēng)類毒素結(jié)合時，表皮給予抗原的保護(hù)效果十分優(yōu)異。沒有該免疫佐劑的配方產(chǎn)生了較差的保護(hù)作用，這可通過1/4(25％)的動物在用破傷風(fēng)毒素攻擊后癱瘓的事實(shí)來證明。
圖10的結(jié)果揭示，每次免疫給予超過20微克的抗原確保了完全的保護(hù)作用，而其它測試佐劑或佐劑處理卻不是這樣(見前面的實(shí)施例)。較少的抗原給藥量提供了類似的定性影響，但是不足以保證所有測試小鼠都存活(除每次免疫接受5微克TT的測試組外)。(這暗示每次免疫1微克-15微克之間的TT劑量屬于過渡區(qū)。)然而，霍亂毒素的其它劑量可能是同樣或甚至是更有利的。
實(shí)施例83-85大腸桿菌不耐熱毒素(HLT)作為免疫佐劑高度可變形的泡囊TransfersomesTM86.3毫克大豆磷脂酰膽堿(SPC)13.7毫克膽酸鈉(NaChol)0.9毫升磷酸緩沖液，10mM，pH6.5不耐熱毒素(HLT，SIGMA，Neu-UIm)，1微克/毫升，如果需要，加上破傷風(fēng)類毒素(TT，純的；Accurate Antibodies)2毫克/毫升采用不同的佐劑/抗原相對濃度來測試最常用的一種ADP核糖基化酶透皮疫苗接種的效果。如前面的實(shí)施例所述，制備Transfersomes。其它的試驗細(xì)節(jié)(動物居所；抗原給藥；滴度測定)如上所述。
對Swiss白化小鼠進(jìn)行免疫，給藥劑量為每只小鼠每次表皮給予20微克TT和1-2微克HLT，正對照為皮下注射0.5微克TT。結(jié)果示于圖11。
與沒有佐劑皮下注射抗原或與沒有佐劑在皮膚上用Transfersomes給予TT的情況相比，發(fā)現(xiàn)當(dāng)用HLT作為佐劑時，抗TT滴度有所提高。發(fā)現(xiàn)抵抗破傷風(fēng)毒素正常致死攻擊的體液應(yīng)答和保護(hù)作用與劑量有關(guān)，較高的HLT劑量有較高的抗TT滴度和改進(jìn)的存活率。測得的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)提示，有用的HLT劑量范圍從100毫微克/劑開始，而在該系列測試所用實(shí)驗條件下實(shí)際上有用的最好劑量約高100倍。這表明，與表皮給予的Transfersomes結(jié)合使用的佐劑劑量的上限與常規(guī)侵入性(皮下)免疫所用劑量的數(shù)量級相當(dāng)，至多高10倍；我們認(rèn)為實(shí)際下限比常規(guī)皮下劑量小1-2個數(shù)量級。故提出其它有關(guān)免疫佐劑也應(yīng)有類似的關(guān)系。
實(shí)施例86-87用組胺進(jìn)行局部預(yù)處理高度可變形的泡囊TransfersomesTM86.3毫克大豆磷脂酰膽堿(SPC)13.7毫克膽酸鈉(NaChol)0.9毫升磷酸緩沖液，10mM，pH6.5破傷風(fēng)類毒素(TT，純的；Accurate Antibodies)2毫克/毫升1毫克/毫升組胺溶液，以10mM，pH6.5的磷酸緩沖液配制為了測試其它方式對于免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的效果，在用Transfersomes皮膚上剛要給予抗原之前或前15分鐘在表皮免疫部位將10微克組胺溶液注入小鼠該部位。預(yù)計這將誘使皮膚釋放細(xì)胞因子，和/或?qū)Ψ乔秩胄酝钙っ庖呓臃N的結(jié)果有其它一些積極的作用。為了驗證該假設(shè)，如前面實(shí)施例所述制備了Transfersomes，并如上文所述用Swiss白化小鼠進(jìn)行此實(shí)驗(只是用組胺進(jìn)行預(yù)處理)。
圖12證實(shí)了上述假設(shè)。結(jié)果顯示有良好的體液應(yīng)答，且組胺注射與表皮免疫之間需要有一段時間，以獲得抵抗破傷風(fēng)毒素攻擊的合理的保護(hù)作用。與皮膚上用Transfersomes中的TT在沒有佐劑下所測得的結(jié)果相比，表明注射組胺有助于加強(qiáng)動物免疫應(yīng)答。
實(shí)施例88-89初次免疫和加強(qiáng)免疫的不同的給藥途徑高度可變形的泡囊TransfersomesTM86.3毫克大豆磷脂酰膽堿(SPC)
13.7毫克膽酸鈉(NaChol)0.9毫升磷酸緩沖液，10mM，pH6.5霍亂毒素(CT；SIGMA，Neu-UIm)，每次免疫0-1微克，破傷風(fēng)類毒素(TT，純的；Accurate Antibodies)2毫克/毫升關(guān)于泡囊制備和動物實(shí)驗的詳細(xì)描述可在前述實(shí)施例中找到。
初次免疫的給藥劑量為皮下單獨(dú)注射20微克TT，或0.5微克TT加上1微克CT。但加強(qiáng)免疫采用表皮給藥。如前面所提示的，該組合大大提高了疫苗接種的效果。
抗TT滴度高得足以產(chǎn)生100％的抵抗破傷風(fēng)毒素攻擊的保護(hù)作用(圖13)。與前面用不含佐劑的TT-Tfs在皮膚上進(jìn)行的實(shí)施例的數(shù)據(jù)相比，清楚地證實(shí)皮下/表皮疫苗聯(lián)合接種方案是有用的。
因此，結(jié)果提示，應(yīng)用于皮膚上的加有抗原的TransfersomesTM為侵入性給予抗原提供了吸引人的補(bǔ)充方法，這對于加強(qiáng)免疫來說應(yīng)當(dāng)是特別重要的。
實(shí)施例90用破傷風(fēng)類毒素和霍亂毒素作為抗原進(jìn)行二價疫苗接種高度可變形的泡囊TransfersomesTM86.3毫克大豆磷脂酰膽堿(SPC)13.7毫克膽酸鈉(NaChol)0.9毫升磷酸緩沖液，10mM，pH6.5霍亂毒素(CT；Sigma，Neu-UIm)，每次免疫10微克，破傷風(fēng)類毒素(TT，純的；Accurate Antibodies)2毫克/毫升霍亂毒素不僅作為佐劑而提高了抗TT應(yīng)答(見前述實(shí)施例)，而且它本身也是抗原。因此，當(dāng)該佐劑以某一濃度使用時，它可起第二抗原的作用。然而，佐劑性能與免疫原性并不線性相關(guān)，這為優(yōu)化疫苗接種結(jié)果(以及在副作用和誘導(dǎo)產(chǎn)生變態(tài)反映方面)提供了令人感興趣的可能性。用Transfersomes中的CT在小鼠中進(jìn)行測試研究，我們發(fā)現(xiàn)每次應(yīng)用CT劑量在不到50毫微克到至少10毫微克之間對于本申請所述目的是有用的。
皮膚經(jīng)過不同體積測試制劑處理(對應(yīng)于10微克TT和10微克CT)的小鼠產(chǎn)生了抗霍亂毒素抗體，表明CT有抗原性。這證實(shí)超變形泡囊有潛力制備含一種以上抗原的TransfersomesTM至少兩價疫苗。
圖14顯示了預(yù)先用相同載體中的TT和CT進(jìn)行免疫的小鼠所測得的TT和CT滴度。
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權(quán)利要求
1.一種透皮疫苗，它包含(a)一種透皮載體，該載體是以微小液滴形式懸浮或分散于水性溶劑中的穿透劑，這些液滴被一層或數(shù)層具有聚集趨勢的至少兩種不同物質(zhì)或物質(zhì)的兩種不同形式的膜狀包衣包圍，所述物質(zhì)或物質(zhì)形式在較佳的水性液體介質(zhì)中的溶解度相差至少10倍，從而使溶解度較大的物質(zhì)或物質(zhì)形式的均相團(tuán)聚體的平均直徑、或由所述兩種物質(zhì)或所述物質(zhì)兩種形式組成的非均相團(tuán)聚體的平均直徑小于溶解度較小的物質(zhì)或物質(zhì)形式的均相團(tuán)聚體的平均直徑，和/或其中溶解度較大的組分有使穿透性液滴增溶的趨勢，且其中這些組分的含量高達(dá)使液滴增溶所需濃度的99％(摩爾)或?qū)?yīng)于非增溶液滴的飽和濃度的99％(摩爾)，無論哪一個更高，和/或其中在膜狀包衣周圍的液滴的彈性變形能量比血紅細(xì)胞或具有液體脂族鏈的磷脂雙層低至少5倍，更佳的低至少10倍，理想的是低10倍以上；(b)特異性釋放或特異性誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子或抗細(xì)胞因子活性或其本身發(fā)揮這種活性的化合物；和(c)抗原、變應(yīng)原、抗原混合物和/或變應(yīng)原混合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其中表現(xiàn)出或誘導(dǎo)出細(xì)胞因子或抗細(xì)胞因子活性的化合物以及抗原與穿透劑相結(jié)合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2任一項所述的疫苗，其中溶解度較低的自聚集性分子是極性脂質(zhì)，溶解度較高的組分是表面活性劑或類似于表面活性劑的分子，或是出于本發(fā)明目的有足夠溶解度的極性脂質(zhì)形式。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的疫苗，其中穿透劑的平均直徑在30-500納米之間，較佳的在40-250納米之間，更佳的在50-200納米之間，特別佳的在60-150納米之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項所述的疫苗，其中人或動物皮膚用的制劑中的液滴總重量為總重量的0.01-40重量％，特別是在0.1-30重量％之間，最佳的在5-20重量％之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項所述的疫苗，其中抗原總濃度為穿透劑總重量的0.001-40重量％，特別在0.01-30重量％之間，更佳的在0.1-20重量％之間，最佳的在0.5-10重量％之間。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項所述的疫苗，該疫苗還包含(da)低分子量化學(xué)刺激劑；和/或(db)病原體的提取物或化合物或其片段或衍生物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項所述的疫苗，其中發(fā)揮細(xì)胞因子活性的化合物是IL-4，IL-3，IL-2，TGF，IL-6，IL-7，TNF，IL-1α和/或IL-1β，IL-12、IFN-γ、TNF-β、IL-5或IL-10，I型干擾素，較佳的是IFN-α或IFN-β。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項所述的疫苗，其中表現(xiàn)出抗細(xì)胞因子活性的化合物是抗細(xì)胞因子抗體或其對應(yīng)的活性片段、衍生物或類似物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9任一項所述的疫苗，其中抗原衍生自病原體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的疫苗，其中所述病原體選自胞外細(xì)菌，包括形成膿的球菌如葡萄球菌和鏈球菌，革蘭陰性菌如腦膜炎球菌和淋球菌屬、奈瑟氏菌屬、革蘭陰性菌，包括腸微生物如大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、假單胞菌、白喉桿菌、百日咳博德特氏菌，和革蘭陽性菌(如鼠疫耶爾森氏菌，BCG)，尤其是厭氧菌，如梭菌屬(破傷風(fēng)梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、諾氏梭菌、腐爛梭菌)；在宿主細(xì)胞內(nèi)存活并復(fù)制的細(xì)菌和病毒，包括分支桿菌(如結(jié)核桿菌)和單核細(xì)胞增生李斯特菌，逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒，包括但不局限于肝炎病毒、(人)免疫缺陷病毒、皰疹病毒、天花(禽痘)、流感、麻疹、腮腺炎和脊髓灰質(zhì)炎病毒、巨細(xì)胞病毒、鼻病毒等，在宿主細(xì)胞內(nèi)繁殖的真菌，寄生蟲，包括動物寄生蟲，如原生動物和蠕蟲，以及外寄生物，如蜱和螨，或布魯氏菌屬(如馬爾他布魯氏菌、流產(chǎn)布魯氏菌、豬布魯氏菌、狗布魯氏菌、木鼠布魯氏菌、羊布魯氏菌)、霍亂病原體(如霍亂弧菌)、嗜血菌屬如伴放線菌素嗜血菌、大葉性肺炎嗜血菌和引發(fā)副傷寒、鼠疫、狂犬病、破傷風(fēng)和風(fēng)疹疾病的病原體，引起動物或人體各種腫瘤形成、自身免疫疾病或與其它不一定由病原體感染引起的病理狀況有關(guān)的病原體。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11任一項所述的疫苗，其中變應(yīng)原是異源或內(nèi)源的、衍生自微生物、動物或植物，或?qū)儆谌嗽旌?或刺激性無機(jī)物質(zhì)，或是經(jīng)機(jī)體免疫系統(tǒng)錯誤加工或與機(jī)體免疫系統(tǒng)接觸的人體部分或組分。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12任一項所述的疫苗，其中選擇每一個表現(xiàn)出細(xì)胞因子活性的化合物的使用濃度，使其比用所選抗原劑量和免疫佐劑一起通過注射制劑進(jìn)行測試或進(jìn)行體外測試的對應(yīng)試驗中所確定的最適濃度高1000倍，較佳的高100倍，更通常的高50倍，還要佳的是高20倍。
14.根據(jù)權(quán)利要求7至13任一項所述的疫苗，其中病原體提取物或化合物是脂多糖、索狀因子(海藻糖-二霉菌酸酯)、胞壁酰二肽、或其它與病原體膜的免疫學(xué)活性部分相同或相似的(多)糖或(多)肽；病原體提取物，包括細(xì)菌外毒素和內(nèi)毒素，較佳的是霍亂毒素或大腸桿菌的不耐熱毒素，A-鏈衍生物，具有ADP-核糖基化活性的組分，肽聚糖、梭菌毒素、純化的結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)衍生物、LT-R192G、釀膿鏈球菌的纖連蛋白結(jié)合蛋白I、B型腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白(GBOMP)；或細(xì)菌或病毒核酸，如含有非甲基化CpG二核苷酸的寡核苷酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的疫苗，其中所述脂多糖是脂質(zhì)A或其衍生物和修飾物，如單磷酸脂質(zhì)A或其類似物，如蔗糖的脂肪衍生物。
16.根據(jù)權(quán)利要求7至13任一項所述的疫苗，其中衍生自病原體的病原體化合物濃度在比采用類似抗原的對應(yīng)的注射制劑所用濃度低10倍到高1000倍之間，更通常的，表皮給予的免疫佐劑濃度與注射的免疫佐劑濃度相差0.5-100倍，更佳的相差1-50倍，最佳的相差2-25倍。
17.根據(jù)權(quán)利要求7至16任一項所述的疫苗，其中所述低分子量刺激劑選自變應(yīng)原性金屬離子、酸、堿、刺激性液體、(脂肪)醇、(脂肪)胺、(脂肪)醚、(脂肪)磺酸鹽、磷酸鹽等，或其它合適的溶劑或兩親物，或選自通常能增強(qiáng)皮膚滲透的表面活性劑類似分子，及其衍生物或組合物。
18.根據(jù)權(quán)利要求7至17任一項所述的疫苗，其中選擇低分子量刺激劑的濃度，使其比在相同或相當(dāng)對象上進(jìn)行獨(dú)立測試時因局部刺激而被認(rèn)為不能接受的濃度低至少2倍，更通常的低5倍，還要佳的低10倍或更多。
19.根據(jù)權(quán)利要求7至16任一項所述的疫苗，其中變應(yīng)原屬于吸入變應(yīng)原類型，包括各種花粉、孢子、少量動物毛發(fā)、皮膚、羽毛、天然或合成的織物、小麥、房屋灰塵，包括螨；另外，食物和藥物變應(yīng)原；接觸變應(yīng)原；注射、侵入性和貯存變應(yīng)原，如各種常駐于腸胃的蠕蟲、棘球蚴、旋毛蟲等、部分植入物質(zhì)等。
20.根據(jù)權(quán)利要求1至19任一項所述的疫苗，其中免疫過程中的抗原應(yīng)用劑量與注射劑量相差0.1-100倍，更通常的在0.5-50倍范圍內(nèi)，還要佳的在1-20倍之間，理想的比注射所用劑量高不到10倍。
21.根據(jù)權(quán)利要求1至20任一項所述的疫苗，其中穿透劑應(yīng)用量在0.1-15毫克/平方厘米之間，更通常的在0.5-10毫克/平方厘米之間，較佳的在1-5毫克/平方厘米之間。
22.根據(jù)權(quán)利要求1至21任一項所述的疫苗，其中所述抗原是純的或純化抗原。
23.一種試劑盒，它包含裝在瓶子或其它包裝形式中的至少一個劑量的 1至22任一項所述的疫苗。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的試劑盒，它還包含至少一種權(quán)利要求11所述的抗原或權(quán)利要求12所述的抗原的一個可注射劑量。
25.一種使哺乳動物產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，該方法包括用權(quán)利要求1至22任一項所述的疫苗對所述哺乳動物進(jìn)行接種。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中選擇不同的處理面積，以控制免疫原的施加劑量以及治療性疫苗接種的結(jié)果。
27.根據(jù)權(quán)利要求25或26所述的方法，其中在給藥前一天，較佳的是在皮膚上給予所得制劑前360分鐘、更佳為60分鐘、還要佳為30分鐘，將抗原加入無抗原的穿透劑懸浮液中與穿透劑結(jié)合。
28.根據(jù)權(quán)利要求25至27任一項所述的方法，其中在用免疫輔助性操作對器官進(jìn)行預(yù)處理后，將權(quán)利要求1至22任一項所述的疫苗施加到皮膚上，所述操作例如包括對皮膚進(jìn)行摩擦、擠壓、加熱，使皮膚接觸電或力的作用，如超聲場等，或?qū)⒅T如組胺的非免疫原性制劑注射入皮膚中，只要該處理能使皮膚或其它免疫活性外周組織釋放免疫輔助性化合物，或減少針對所需疫苗的拮抗劑的作用濃度/作用時間。
29.根據(jù)權(quán)利要求25至28任一項所述的方法，其中免疫原以非堵塞性貼劑形式施加。
30.根據(jù)權(quán)利要求25至29任一項所述的方法，其特征在于，給予至少一個劑量的疫苗。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中給予所述疫苗作為加強(qiáng)免疫接種。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中初次免疫采用侵入性方法，通常用皮下注射或其它一些合適的刺穿/破壞皮膚屏障的方法，而隨后的至少一次加強(qiáng)免疫采用非侵入性方式進(jìn)行。
33.根據(jù)權(quán)利要求25至32任一項所述的方法，其中當(dāng)采用非變應(yīng)原性抗原時，疫苗應(yīng)用次數(shù)在2-10次之間，較佳的在2-7次之間，更佳的至多5次，最佳的至多3次，或在變應(yīng)原情況下需要如此多次數(shù)，應(yīng)以合適的評價方法確定是否達(dá)到了所需的免疫耐受性，否則認(rèn)為嘗試失敗。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所選擇的后續(xù)的接種時間間隔為2周-5年之間，通常為1個月至3年，更通常的為2個月至1年半。
35.根據(jù)權(quán)利要求25至34任一項所述的方法，其中對攜帶免疫原通過明確屏障各個孔的穿透劑流通量與橫跨作用于該屏障的合適推動力或壓力的函數(shù)關(guān)系進(jìn)行測定，然后用特征曲線方便地描述該數(shù)據(jù)，進(jìn)而用該特征曲線優(yōu)化制劑或進(jìn)一步的應(yīng)用。
36.前述任一項權(quán)利要求中定義的透皮載體、特異性釋放或特異性誘導(dǎo)細(xì)胞因子或抗細(xì)胞因子活性或發(fā)揮該活性的化合物、抗原或變應(yīng)原、以及任選的微生物的提取物或化合物或其片段或衍生物、和/或低分子量化學(xué)刺激劑用于制備誘導(dǎo)保護(hù)性或致耐受性免疫應(yīng)答反應(yīng)的疫苗的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于預(yù)防性或治療性疫苗的非侵入性透皮給予與超變形性載體結(jié)合的抗原的新型疫苗。疫苗包含(a)透皮載體,該載體是穿透劑,(b)能特異性釋放或特異性誘導(dǎo)細(xì)胞因子或抗細(xì)胞因子活性或本身發(fā)揮該活性的化合物,和(c)抗原、變應(yīng)原、抗原混合物和/或變應(yīng)原混合物。本發(fā)明還涉及給哺乳動物進(jìn)行疫苗接種以獲得保護(hù)性或治療性免疫應(yīng)答的方法。
文檔編號A61K39/09GK1342066SQ00804453
公開日2002年3月27日 申請日期2000年1月26日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月27日
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