專利名稱：腫瘤疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在腫瘤的復(fù)發(fā)預(yù)防、轉(zhuǎn)移抑制及治療方面有用的腫瘤疫苗。
已開發(fā)出多種腫瘤疫苗(Pardoll，D，M.，Nature Med.，4(5Suppl)，pp.525-531，1998)。大體分類的話，腫瘤特異的腫瘤疫苗有(1)應(yīng)用性狀已經(jīng)明確的腫瘤抗原肽作為腫瘤疫苗；(2)應(yīng)用腫瘤組織的提取液作為腫瘤疫苗，其中包含未鑒定的腫瘤抗原肽；(3)這些抗原與抗原呈遞細(xì)胞，特別是與抗原呈遞能力強的樹突細(xì)胞結(jié)合后作為疫苗使用(Nestle，F(xiàn).O.，et al.，Nature Med.，4，pp.328-332，1998)；(4)讓樹突細(xì)胞攝取腫瘤抗原蛋白，使之負(fù)載后作為疫苗使用；(5)使樹突細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞融合后作為疫苗使用；(6)使腫瘤抗原與脂質(zhì)體結(jié)合，連同脂質(zhì)體攝取作后為疫苗使用(Nakanishi，T.，et al.，Biochem.Biophys.，Res.Comm.，240，pp.793-797，1997)；(7)用放射線或固定劑對腫瘤細(xì)胞進行失活處理，然后作為腫瘤疫苗施用；(8)用基因治療法，將對抗原呈遞細(xì)胞或淋巴細(xì)胞有刺激作用的細(xì)胞因子基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，以此作為疫苗施用，或者將腫瘤抗原基因?qū)脒m當(dāng)?shù)募?xì)胞內(nèi)，以表達該基因的腫瘤細(xì)胞作為疫苗施用；(9)將腫瘤抗原基因整合到病毒或細(xì)菌中，感染患者；(10)施用活的腫瘤細(xì)胞、腫瘤抗原肽或腫瘤細(xì)胞提取液，再通過其它途徑施用大量的細(xì)胞因子(Rosenberg，S.A.，et al.，Nature Med.，4，pp.321-327，1998)，或者將細(xì)胞因子緩釋性制劑化后施用(Golumbek，P.T.，et al.，Cancer Res.，53，pp.5841-5844，1993)等。
但是，上述腫瘤疫苗每一個均有其優(yōu)缺點。例如，方法(1)只能適用于表達與鑒定出的腫瘤抗原肽相適應(yīng)的特定的主要組織相容性復(fù)合物(以下，略作MHC，I類MHG記作MHC-I，II類MHC記作MHC-II)的腫瘤。人類的MHC種類繁多，而該腫瘤抗原肽的適應(yīng)病例極為有限。為了克服這種缺點，開發(fā)出了方法(2)，它使用包含未鑒定的腫瘤抗原肽的腫瘤組織提取液，但從腫瘤組織提取出的腫瘤抗原肽的量是極微量的，當(dāng)作為原材料的腫瘤量少時，多不能進行濃縮。其結(jié)果，不能如鑒定出的、合成的腫瘤抗原肽大量施用，其效果也就很有限。
象方法(3)中，先讓腫瘤抗原肽與抗原呈遞細(xì)胞結(jié)合的話，CTL的活化效果就高。但是分離、制備抗原呈遞細(xì)胞，尤其其中抗原呈遞能力強的樹突細(xì)胞時，為了避免外周血和骨髓產(chǎn)生的危險的移植片對宿主間排斥反應(yīng)(以下，略作GVHD)，必須從腫瘤疫苗療法的適用對象，腫瘤患者本人來制備，而且技術(shù)要求高，也很復(fù)雜。方法(4)和(5)存在與方法(3)同樣的問題，方法(5)的融合操作極為繁雜。方法(6)雖不必考慮GVHD的危險性，但腫瘤抗原向抗原呈遞細(xì)胞的導(dǎo)入效率未必高，另外，為制備腫瘤疫苗，需要較大量的腫瘤抗原。
方法(7)的問題是，通過大量培養(yǎng)來得到腫瘤細(xì)胞不僅繁雜且耗費高，并且腫瘤細(xì)胞中所包含的腫瘤抗原量甚微。另外，已知這一方法在對抗原性高的腫瘤細(xì)胞追加多聚-L-賴氨酸處理時能成功(Naito，M.and Seno，S.，Cell Biol.International Rep.，5，pp.675-681，1981)，抗原性低的腫瘤細(xì)胞則不能成功。方法(8)和(9)的基因治療，從治療操作到獲得治療許可，手續(xù)極為繁雜。現(xiàn)階段，方法(10)有些希望，但是尤其在Rosenberg等的方法中，同時施用的大量的白介素-2的副作用很嚴(yán)重，腫瘤臨床效果也不一定高。即使用Golumbek等的方法，將細(xì)胞因子緩釋制劑化時，制備經(jīng)放射線處理的活腫瘤細(xì)胞也很繁雜。
期望能極為便利地獲得腫瘤疫苗。其中一點是，將活的腫瘤細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞作為疫苗的一部分來施用的方法，由于有必要在活的狀態(tài)下進行操作，所以技術(shù)非常復(fù)雜就成為一個問題。若進行基因治療，操作過程則更為復(fù)雜。在腫瘤抗原肽已確定時，能大量合成并施用腫瘤抗原肽，然而腫瘤抗原肽的種類非常多，又由于受患者個人MHC的限制，多數(shù)情況下都無法判定哪種腫瘤抗原肽適用于作為對象的患者個人，因此適用受限。不用腫瘤抗原肽而應(yīng)用腫瘤抗原蛋白時，由于蛋白在抗原呈遞細(xì)胞內(nèi)被處理并可篩選出與MHG相應(yīng)的腫瘤抗原肽，其蛋白不受所適用患者個人MHC的限制，但問題是腫瘤抗原蛋白本身的純化及大量制備很難。
另一方面，已知CTL的誘導(dǎo)方法有，將病理切片脫蠟處理后，從所得固定腫瘤組織上的外周血單核細(xì)胞級分誘導(dǎo)CTL的方法(Liu，S.Q.et al.，Nature Med.，2，pp.1283-1283，1996)。通常，溶解狀態(tài)的抗原蛋白給予抗原呈遞細(xì)胞時，MHC-II與抗原蛋白來源的抗原肽結(jié)合，并且對與產(chǎn)生抗體相關(guān)聯(lián)的體液免疫的刺激效果高；MHC-I與抗原蛋白來源的抗原肽結(jié)合，但對激活殺傷性細(xì)胞的細(xì)胞免疫應(yīng)答的刺激效果低。而Falo等應(yīng)用抗原性強的異種蛋白-卵白蛋白與鐵粉結(jié)合，不加佐劑，注射給小鼠，誘導(dǎo)出對卵白蛋白來源的抗原肽產(chǎn)生反應(yīng)的CTL(Falo，Jr.，L.D.，et al.，Nat.Med.，1，pp.649-653，1995)。
本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)，將可溶性腫瘤抗原蛋白固定到微小的聚苯乙烯珠上，在體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，以微小固形物的形式被人外周血單核細(xì)胞級分中的抗原呈遞細(xì)胞吞食時，可從同一人的外周血淋巴細(xì)胞中有效誘導(dǎo)出CTL(Kim，C.，et al.，Cancer Immunol.Immunother.，47，pp.90-96，1998)。另外，已知死細(xì)胞來源的抗原，在死細(xì)胞狀態(tài)被未成熟的樹突細(xì)胞吞食時，激發(fā)免疫應(yīng)答的效率與不被吞食時相比可達數(shù)千倍(稻葉1998年12月2日，日本免疫學(xué)會，演講題目SI-3-3)。
本發(fā)明者們?yōu)榱私鉀Q上述課題進行了深入研究，他們應(yīng)用腫瘤組織、腫瘤細(xì)胞或?qū)@些成分進行固定操作而得到的固化材料，將這些材料微?；?，使其大小適于被抗原呈遞細(xì)胞所吞食，或通過溶解操作使之溶解，再與至少一種細(xì)胞因子組合，應(yīng)用這樣的腫瘤疫苗，實現(xiàn)高效預(yù)防腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移抑制及治療。
也就是說，本發(fā)明提供腫瘤疫苗，它包含由腫瘤組織、腫瘤細(xì)胞及選自由這些成分構(gòu)成的組的固化腫瘤材料制備的微粒和至少一種細(xì)胞因子和/或細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑；并且本發(fā)明提供腫瘤疫苗，它包含由腫瘤組織、腫瘤細(xì)胞及選自由這些成分構(gòu)成的組的固化腫瘤材料制備的溶解物和至少一種細(xì)胞因子和/或細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑。
本發(fā)明的優(yōu)選方案是提供進一步包含能引起非特異性免疫應(yīng)答的佐劑的上述腫瘤疫苗；在體內(nèi)同一局部施用的上述腫瘤疫苗；包含作為細(xì)胞因子的緩釋性細(xì)胞因子制劑的上述腫瘤疫苗；含有作為細(xì)胞因子的粒細(xì)胞·巨噬細(xì)胞集落刺激因子和/或白介素-2的上述腫瘤疫苗。從其它觀點來看，就是提供至少與一種細(xì)胞因子組合應(yīng)用的腫瘤疫苗，并且包含由腫瘤組織、腫瘤細(xì)胞及選自由這些成分構(gòu)成的組的固化腫瘤材料制備的微?；驈脑撃[瘤材料制備的溶解物作有效成分的疫苗。
再從其它觀點來看，就是提供腫瘤的治療方法、復(fù)發(fā)預(yù)防方法及轉(zhuǎn)移抑制的方法，并且將有效量的由腫瘤組織、腫瘤細(xì)胞及選自由這些成分構(gòu)成的組的固化腫瘤材料制備的微粒和至少一種細(xì)胞因子和/或細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑施于患者的方法；將有效量的由腫瘤組織、腫瘤細(xì)胞及選自由這些成分構(gòu)成的組的固化腫瘤材料制備的溶解物和至少一種細(xì)胞因子和/或細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑施于患者的方法；在同一局部重復(fù)施用的上述方法；以及由制備上述腫瘤疫苗的上述固化腫瘤材料制備的微?；蛉芙馕锏氖褂?。
本發(fā)明的完成受到美國政府的資助，因此美國政府享有與本發(fā)明相關(guān)的權(quán)利。
圖2表示例4中用溶解固定腫瘤細(xì)胞制備的腫瘤疫苗體內(nèi)致敏的實驗結(jié)果。圖中，○表示PBS對照組，□表示1次腫瘤疫苗施用組，■表示3次腫瘤疫苗施用組。
圖3表示例5中改變培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞與靶腫瘤細(xì)胞的比率(E/T比)時，檢測細(xì)胞殺傷活性的結(jié)果。圖中，●表示PBS對照組，■表示腫瘤疫苗施用組，□表示其它種的對照組(預(yù)先用X射線50Gy照射過的活B16-F10細(xì)胞+GM-CSF微球施用組)。
圖4表示例6中應(yīng)用的各種腫瘤疫苗的細(xì)胞殺傷活性。圖中，●表示PBS對照組，○表示HA-A20細(xì)胞施用組，□表示沒混合GM-CSF微球的腫瘤疫苗施用組，▲表示預(yù)先用X射線50Gy照射過的活GM-CSF-HA-A20細(xì)胞施用組，△表示混合了GM-CSF微球的腫瘤疫苗施用組。
圖5表示本發(fā)明的腫瘤疫苗的細(xì)胞殺傷活性被抗小鼠CD8的單克隆抗體抑制的結(jié)果。
本發(fā)明的最佳實施方案本發(fā)明腫瘤疫苗的特征是，含有由腫瘤組織、腫瘤細(xì)胞及選自由這些成分構(gòu)成的組的固化腫瘤材料制備的微粒或溶解物作為腫瘤抗原，還包含至少一種細(xì)胞因子和/或細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑。
作為腫瘤細(xì)胞或腫瘤組織，例如可應(yīng)用哺乳類動物來源的，優(yōu)選來源于人的，但只要是包含作為治療和預(yù)防對象的腫瘤的腫瘤抗原的細(xì)胞或組織，任一生物種來源的細(xì)胞或組織均可使用。腫瘤組織只要是包含腫瘤細(xì)胞的組織，對其種類無特殊限制。另外，應(yīng)用腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞的成分時，只要是包含能成為腫瘤抗原的物質(zhì)，其種類無限制。固形癌組織、骨髓、白細(xì)胞等從活體分離或提取的含有癌細(xì)胞的活體樣品可作為腫瘤材料應(yīng)用。作為腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞的成分，例如可應(yīng)用抗原肽和抗原蛋白。
用于制備固化腫瘤材料的固定方法無特殊限制，可采用業(yè)內(nèi)人士可以應(yīng)用的任何手段。例如，應(yīng)用組織固定劑時，可以用中性福爾馬林、戊二醛、甲醇、乙醇等醇類。除此之外，只要是可使活體組織或細(xì)胞、或其成分固化的方法，任何方法均可應(yīng)用。也可通過石蠟包埋和冷凍等方法將腫瘤材料固化。骨組織等本來就是固態(tài)的組織作為固化腫瘤組織應(yīng)用時，希望采用適宜的固定方法。
微粒的制備方法無特殊限制，例如，將固化的腫瘤組織破碎成微細(xì)片段而制備微粒的方法，除此之外，溶解腫瘤組織的破碎片段和腫瘤細(xì)胞并固定到固體微粒的方法，或?qū)⒖乖暮涂乖鞍椎瓤扇苄阅[瘤抗原固定到固體微粒的方法等。作為固體微粒，可應(yīng)用直徑0.05μm-1000μm程度的鐵粉、炭粉、聚苯乙烯珠子等。另外，可應(yīng)用將組織的破碎片段、腫瘤細(xì)胞或可溶性腫瘤抗原與脂質(zhì)體等脂質(zhì)顆粒結(jié)合，形成能被抗原呈遞細(xì)胞作為微粒識別吞食的粒子，或可應(yīng)用可溶性腫瘤抗原本身通過結(jié)合劑或交聯(lián)劑相互結(jié)合形成微粒化的粒子。
微粒的大小無特殊限定，希望其大小為體內(nèi)具有吞食能力的細(xì)胞可吞食的程度。對本來微小的單個細(xì)胞狀態(tài)的固定腫瘤細(xì)胞沒必要進行特殊破碎，但在細(xì)胞固定化操作中發(fā)生集結(jié)時，要進行破碎或分散處理。破碎或分散處理可應(yīng)用勻漿處理、超聲波處理、消化酶部分消化法等。另外，可通過空隙大小在1000μm以下的篩網(wǎng)，優(yōu)選通過380μm以下的篩網(wǎng)來制備微粒。這些微粒的制備方法為該領(lǐng)域的人員所熟知，業(yè)內(nèi)人士可單獨應(yīng)用適宜的方法，或組合應(yīng)用數(shù)種方法來制備微粒。
由固化的腫瘤組織制備溶解物的方法，例如可采用應(yīng)用蛋白酶的方法。蛋白酶如蛋白酶K等。另外，也可應(yīng)用蛋白酶以外的酶、酸或堿等適當(dāng)組合的方法。只要能溶解固化腫瘤材料，可采用任意方法，業(yè)內(nèi)人士可選擇適當(dāng)?shù)姆椒?。也可將溶解物固定到上述固體微粒。
本說明書中所使用的“溶解物”這一術(shù)語是指固化的腫瘤材料在水、生理鹽水、緩沖液等水性介質(zhì)中分散成肉眼看不到固形物的程度的狀態(tài)，其分散物只要達到能被抗原呈遞細(xì)胞吞食的程度即可，并沒有其他特殊的限定。另外，固定化腫瘤材料的制備方法、微粒的制備方法及溶解物的制備方法的詳細(xì)內(nèi)容在本說明書的實施例中有具體指示，所以業(yè)內(nèi)人士可參照上述一般說明及實施例的具體說明，必要時對之進行適當(dāng)?shù)男揎椖酥粮淖?，即可制備出所期望的微?；蛉芙馕铩?br> 本發(fā)明的腫瘤疫苗中所包含的細(xì)胞因子的種類無特殊限制，可應(yīng)用一種或兩種以上的細(xì)胞因子。例如，優(yōu)選應(yīng)用粒細(xì)胞·巨噬細(xì)胞集落刺激因子(以下，略作GM-CSF)或白介素-2(以下，略作IL-2)，也優(yōu)選GM-GSF與IL-2組合應(yīng)用。另外，也可應(yīng)用刺激體內(nèi)局部免疫細(xì)胞的，實現(xiàn)結(jié)果與施用GM-CSF和/或IL-2時同樣狀況的其它細(xì)胞因子和細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑。這兩種細(xì)胞因子以外的其它細(xì)胞因子或細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑例如白介素12、白介素18、干擾素類等，但不限定于此。
這些細(xì)胞因子和誘導(dǎo)劑，優(yōu)選制備成緩釋性制劑，這樣可使其在施用局部的濃度盡可能地長期保持在高狀態(tài)。這種緩釋手段如Golumbek等的報告(Golumbek，P.T.，et al.，Cancer Res.，53，pp.5841-5844，1993)，業(yè)界已知的各種緩釋方法，可采用任何一種方法。
本發(fā)明的腫瘤疫苗可含有引起非特異性免疫應(yīng)答的佐劑?？蓱?yīng)用一種佐劑或組合應(yīng)用兩種以上的佐劑。作為佐劑，如弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、卡介苗(BCG)等細(xì)菌制劑、結(jié)核菌素等細(xì)菌成分制劑、匙孔血藍(lán)蛋白和酵母甘露聚糖等天然高分子物質(zhì)、明磯、TiterMax Gold等合成佐劑制劑等，但不限定于這些具體例，只要是有佐劑效果的物質(zhì)均可應(yīng)用。是否應(yīng)用佐劑，要以施用局部炎癥性反應(yīng)的強度、施用結(jié)果引起的抗腫瘤效果的強度為指標(biāo)進行判斷。例如，可在同一局部交替施用含佐劑的腫瘤疫苗和不含佐劑的腫瘤疫苗。
本發(fā)明腫瘤疫苗的制劑形式無特殊限制，但希望是適于局部施用的制劑形式。對制劑化方法也無特殊限制，可通過該領(lǐng)域內(nèi)可利用的方法的單獨應(yīng)用，或適當(dāng)?shù)慕M合應(yīng)用來制備成所期望形式的制劑。制劑化過程中除可應(yīng)用注射用蒸餾水和生理鹽水等水性介質(zhì)外，可應(yīng)用1種或2種以上該領(lǐng)域內(nèi)可利用的制劑用添加物。例如，應(yīng)用緩沖劑、pH調(diào)節(jié)劑、助溶劑、穩(wěn)定劑、鎮(zhèn)靜劑及防腐劑等，它們的具體成分業(yè)內(nèi)人士已眾所周知。另外，可將腫瘤疫苗制成冷凍干燥劑等固體制劑，用時加入注射用蒸餾水等溶解劑制備成注射劑。
應(yīng)用本發(fā)明的腫瘤疫苗進行疫苗療法時，可只一次施用腫瘤疫苗，但是為了使腫瘤抗原與細(xì)胞因子或細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑盡可能長時間共存，優(yōu)選在體內(nèi)的同一局部反復(fù)施用。例如，為了在施用局部激起炎癥性反應(yīng)，達到免疫細(xì)胞集中存在于此的持續(xù)狀態(tài)，兩成分最好共存3小時以上。施用不含佐劑的腫瘤疫苗時，可在同一局部施用佐劑。一般而言，可將腫瘤疫苗施用給腫瘤材料來源的患者，但也可施用給這樣的腫瘤患者，其包含的腫瘤抗原在病理診斷上與腫瘤材料包含的腫瘤抗原同種或近緣。
施用局部無特殊限制，如皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、淋巴結(jié)內(nèi)、脾臟等主要臟器內(nèi)，優(yōu)選細(xì)胞因子不易簡單擴散消失的部位。不過，通過選用腫瘤疫苗的有效成分不易擴散的劑型，可進行任意部位的局部施用，也可通過應(yīng)用藥物輸送系統(tǒng)進行全身施用。本發(fā)明的腫瘤疫苗的施用劑量與施用期限無特殊限制，希望根據(jù)疫苗療法的效果來決定適宜的施用劑量與施用期限。施用例如可通過注射等途徑進行。
將微粒沉淀懸浮到2ml雙蒸水中，添加20mg/ml濃度的用孔徑0.22μm的濾膜過濾除菌的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(以后，略作EDC)溶液，使其終濃度達0.8mg/ml。25℃保存15分鐘，再添加無菌的2ml 0.1M的甘氨酸溶液。25℃保存30分鐘后，生成穩(wěn)定的微球，將該懸浮液在半徑12cm的水平轉(zhuǎn)頭上2000rpm離心10分鐘，沉淀微球并回收。向其中加入適量的雙蒸水懸浮，反復(fù)離心，共洗滌6次。其后，懸浮到含有1μg的GM-CSF(相當(dāng)于106國際單位)的，或含有103國際單位IL-2的20μl生理鹽水中。3.致敏和腫瘤排斥反應(yīng)的測定混合上述1中制備的固定Hepa1-6細(xì)胞、上述2中制備的GM-CSF微球和IL-2微球、市售的佐劑TiterMax Gold(CytRX，Atlanta，Norcross，GA)，作為腫瘤疫苗。它們在每0.05ml腫瘤疫苗中的量依次是1.25×106個，106單位，103國際單位，20μl。改變這些組成制劑的組合，也制作成腫瘤疫苗。其組合分別如表1、表2和表3所示。
將腫瘤疫苗，皮內(nèi)注射到與Hepa1-6細(xì)胞具有同源(syngeneic)關(guān)系的6-8周齡C57BL/6雄性小鼠尾根部，每只注射0.05ml。1組5只。對照組的5只C57BL/6雄性小鼠注射0.05mlPBS。7天后，再在同一部位施用一次，再7天后，直接肝內(nèi)注射懸浮到0.05mlPBS中的培養(yǎng)的Hepa1-6活細(xì)胞107個(最大肝葉的被膜下)。21天后，測量形成的肝癌組織的大小，計算出其體積。(結(jié)果)如表1所示，對照組中所有的小鼠形成肝癌，癌組織的平均體積為270mm3。與此相對，用包含固定Hepa1-6細(xì)胞、佐劑TiterMaxGold、IL-2微球、GM-CSF微球的腫瘤疫苗進行處置的組中，5只中4只完全沒看到腫瘤(表中，用無腫瘤小鼠的比率表示)，觀察到肝癌的1只小鼠，其腫瘤僅為18mm3的小腫瘤。這表明腫瘤的疫苗療法有效。表1致敏 無腫瘤小鼠 腫瘤體積(mm3)的比例 (平均±SD) 范圍對照組(A)PBS0/5 270±146 140-480處置組(B)固定Hepa 1-6細(xì)胞 4/5 3.6±80-18+Titer Max Gold+IL-2/GM-CSF微球接著，為了判定腫瘤疫苗構(gòu)成成分的組合的重要性，改變了處置組中腫瘤疫苗成分。結(jié)果如表2所示。對照組(A)與處置組(E)得到與表1同樣的結(jié)果，并顯示出重現(xiàn)性。表2致敏 無腫瘤小鼠腫瘤體積(mm3)的比例(平均±SD) 范圍對照組(A)PBS0/5 420±326 144-910處置組(B)PBS0/5 152±106 75-294+固定Hepa 1-6細(xì)胞+Titer Max Gold(C)PBS0/567±97 18-240+固定Hepa 1-6細(xì)胞+Titer Max Gold+IL-2微球(D)PBS2/532±430-105+固定Hepa 1-6細(xì)胞+Titer Max Gold+GM-CSF微球(E)固定Hepa 1-6細(xì)胞 4/53.6±8 0-18+Titer Max Gold+IL-2/GM-CSF微球該表中，處置組(B)中，用只包含固定Hepa1-6細(xì)胞和佐劑TiterMax Gold的腫瘤疫苗致敏小鼠，無腫瘤小鼠1只也沒看到。由此說明并用細(xì)胞因子的重要性。處置組(C)中，用除固定Hepa1-6細(xì)胞和佐劑TiterMax Gold之外只包含IL-2微球的腫瘤疫苗，同樣無腫瘤小鼠1只也沒看到。但所生腫瘤的大小均明顯縮小，平均腫瘤體積為67mm3，只為對照組(A)的1/6以下。由此說明IL-2微球的重要性。另外，處置組(D)中，用除固定Hepa1-6細(xì)胞和佐劑TiterMax Gold之外只包含GM-CSF微球的腫瘤疫苗，無腫瘤小鼠只有2只。由此說明GM-CSF微球的重要性。但是，無腫瘤小鼠僅為處置組(E)的無腫瘤小鼠的半數(shù)，未取得處置組(E)那樣的成績。由該結(jié)果可以判斷細(xì)胞因子IL-2和GM-CSF組合應(yīng)用至關(guān)重要。
為了進-步研究作為腫瘤抗原的固定腫瘤細(xì)胞的必要性，也為了測定佐劑的效果，制備不含固定腫瘤細(xì)胞的腫瘤疫苗，或不含佐劑的腫瘤疫苗，比較其結(jié)果。結(jié)果如表3所示。表3致敏 無腫瘤小鼠腫瘤體積(mm3)的比例(平均±SD) 范圍對照組(A)PBS0/5 231±146 120-480處置組(B)PBS0/5 174±149 60-432+Titer Max Gold(C)PBS0/5 300±258 60-648+Titer Max Gold+IL-2/GM-CSF微球(D)PBS0/5 210±170 60-480+IL-2/GM-CSF微球(E)PBS1/5 85±780-210+固定Hepa 1-6細(xì)胞(F)PBS1/5 78±580-150+固定Hepa 1-6細(xì)胞+Titer Max Gold(G)固定Hepa 1-6細(xì)胞 5/5 00+Titer Max Gold+IL-2/GM-CSF微球(H)PBS4/5 7±16 0-36+固定Hepa 1-6細(xì)胞+IL-2/GM-CSF微球與表1相同，對照組(A)與處置組(G)得到與表1同樣的結(jié)果，但是處置組(G)中，5只全部是無腫瘤小鼠。除不合固定Hepa1-6細(xì)胞之外，處置組(C)中應(yīng)用包含與處置組(G)相同的IL-2微球和GM-CSF微球，以及佐劑TiterMax Gold的腫瘤疫苗進行處理，可以看到所有的小鼠均有大的肝癌生成(平均300mm3)。由該結(jié)果可以判定固體微粒狀的腫瘤抗原是極為重要的。實際上，如處置組(E)中看到的那樣，即便PBS中只加了固定Hepa1-6細(xì)胞的腫瘤疫苗，也有1只無腫瘤小鼠。與此相對，在含有固定Nepa1-6細(xì)胞、IL-2微球和GM-CSF微球，不含佐劑TiterMax Gold的處置組(H)中，可看到4/5為無腫瘤小鼠，而有一只生成了小而清晰的36mm3的肝癌。由此可以判定激起非特異性免疫應(yīng)答的佐劑的效果也值得充分考慮。
由這些結(jié)果可以得到這樣的結(jié)論作為由Hepa1-6細(xì)胞造成的抑制小鼠肝癌癌組織形成的腫瘤疫苗，組合應(yīng)用固定Hepa1-6細(xì)胞、IL-2微球、GM-CSF微球、佐劑TiterMax Gold，對于抗腫瘤效果的發(fā)揮是最為有效的。例2由固定腫瘤組織制備微?；[瘤抗原的方法破碎包含固定腫瘤細(xì)胞的固定腫瘤組織，制備微細(xì)的固化腫瘤抗原。(方法)將與例1中給對照組(A)的小鼠使用的等量的Hepa1-6細(xì)胞移植到小鼠的大腿皮下，3周后摘出所生成的肝癌組織，在市售的中性福爾馬林液中，室溫浸泡3天并固定。取出該組織，用眼科剪刀剪成直徑1mm左右的細(xì)塊，加入原初肝癌濕重10倍量的PBS，再在冰冷的勻漿器(Heidorf公司制，DIAX-600，6G電動軸)中勻漿30秒鐘。為了讓勻漿液冰冷，每次間隔3分鐘以上，重復(fù)5次。將該勻漿液1.2ml移到1.5ml Eppendorf離心管中，在Eppendorf微量高速離心機上，15000rpm離心3分鐘，測量壓緊體積(packed volume)。測量是與加入了50μl以上水的1.5ml Eppendorf離心管進行比較。將剩余的勻漿液在半徑12cm的水平轉(zhuǎn)頭上，2000rpm離心10分鐘，得到沉淀。
將該沉淀5ml懸浮到70％乙醇中，并洗凈，2000rpm離心10分鐘，棄上清，然后再度懸浮到原來體積的PBS中。將之通過40目的不銹鋼網(wǎng)(Sigma公司制，S0770，孔徑380μm)。取1.2ml通過的懸浮液到1.5ml Eppendorf離心管中，在微量高速離心機上，15000rpm離心3分鐘，測量壓緊體積(packed volume)。測量是與加入了一定量水的1.5ml Eppendorf離心管進行比較。(結(jié)果)從固定肝癌組織得到的勻漿中的組織斷片非常細(xì)，通過上述篩網(wǎng)后，微細(xì)到很容易通過普通22G規(guī)格以下的細(xì)注射器。回收的細(xì)胞數(shù)雖無法確定，但目測回收的壓緊體積(packed volume)可清楚地顯示回收細(xì)胞數(shù)超過相當(dāng)于Hepa1-6活細(xì)胞107個的水平，用通過上述篩網(wǎng)前后的壓緊體積(packed volume)計算的回收率為78％。該勻漿包含固化的腫瘤細(xì)胞斷片，且可充分滿足作為腫瘤疫苗的需要量，所以可作為微?；哪[瘤抗原使用。例3體外誘導(dǎo)CTL的抗腫瘤效果以固定腫瘤細(xì)胞作為靶細(xì)胞，檢測誘導(dǎo)CTL時的腫瘤細(xì)胞殺傷活性與特異性。(方法)1.固定腫瘤細(xì)胞將源于C57BL/6小鼠的黑素瘤細(xì)胞B16的亞株B16-F10(購自American Type Culture Collection(Bethesda，MA，USA))108-109個浸到10％福爾馬林液中，4℃固定2-4周。將之懸浮在30ml 70％乙醇中，離心洗滌，然后再懸浮到PBS中，離心洗滌3次。將之懸浮到適量的含10％胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)用MEM培養(yǎng)基中，37℃加溫2-3天，或60℃加溫4小時。再離心回收(以下，將進行這種處理的細(xì)胞叫做固定B16-F10細(xì)胞)，懸浮成5×108個/ml。2.通過體外致敏和腫瘤細(xì)胞殺傷活性來測定抗腫瘤效果從沒經(jīng)過任何致敏的C57BL/6小鼠脾臟，用業(yè)內(nèi)人士熟知的方法輕輕碾碎組織，得到脾臟細(xì)胞。其大部分為淋巴細(xì)胞。取該細(xì)胞4×107個，與2×106個固定B16-F10細(xì)胞一起，在添加了人IL-1β(167單位/ml)、人IL-2(67國際單位/ml)、人IL-6(134單位/ml)(均為Immunex公司制)，含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)10日，使之增殖。培養(yǎng)開始后第3天及第5天，全部更換培養(yǎng)液，以后每2天更換一半。如此增殖的淋巴細(xì)胞為CTL。
抗腫瘤效果的測定是在體外測定CTL的腫瘤細(xì)胞殺傷活性。細(xì)胞殺傷活性是以未經(jīng)放射線照射的活B16-F10作靶細(xì)胞，用廣為人知的標(biāo)準(zhǔn)測定方法4小時Cr-51釋放法進行測定。另外，用例1中敘述的Hepa1-6細(xì)胞和購自American Type Culture Collection(Bethesda，MA，USA)的Lewis肺癌細(xì)胞替代B16-F10作為靶細(xì)胞進行比較。(結(jié)果)

圖1表示了通過體外致敏誘導(dǎo)的CTL的活性?？v座標(biāo)的％Lysis表示CTL對靶細(xì)胞的殺傷活性。橫座標(biāo)的E/T比表示用4小時Cr-51釋放法測定殺傷活性時CTL數(shù)與靶細(xì)數(shù)的比值。B16-F10作為靶細(xì)胞時(□)，E/T比為10時，約殺傷20％。其活性比來自相同C57BL/6小鼠的其它2種腫瘤細(xì)胞作靶細(xì)胞時明顯要高。該結(jié)果說明針對固定B16-F10細(xì)胞誘導(dǎo)的CTL，對于雖來自相同的C57BL/6小鼠，但與其它2種腫瘤細(xì)胞相比，它能特異性識別B16-F10活細(xì)胞并具有殺傷力。例4從溶解固定腫瘤細(xì)胞制備微?；[瘤抗原的方法及其體內(nèi)的抗腫瘤效果用病理切片做材料時，用例2所示的方法進行微粒化的話，其產(chǎn)量很糟，并且腫瘤疫苗的制備很困難。此時，可如下用消化酶溶解固定腫瘤細(xì)胞，將之作成微球制劑，并與細(xì)胞因子的微球制劑組合制備腫瘤疫苗。(方法)1.溶解固定腫瘤微球的制備方法及腫瘤疫苗制劑的制備方法將固定B16-F10細(xì)胞懸浮到PBS中，并使其終濃度為5×108個/ml，向其中添加終濃度達1mg/ml的鏈霉蛋白酶K(pronase k)(Sigma公司)，56℃加溫一晚。3000rpm離心10分鐘，除去沉淀，上清作為溶解B16-F10抗原。向該上清中加入例1中應(yīng)用的人血清白蛋白注射液，使其終濃度達2.5％。其以后的操作與例1中GM-CSF微球的制備順序相同，制備出溶解固定腫瘤微球。最終稀釋成懸浮到80μl生理鹽水中的微球中所含腫瘤抗原的量相當(dāng)于107個腫瘤細(xì)胞數(shù)。將之與由例1中相同方法制備的GM-CSF微球20μl混合，作為腫瘤疫苗制劑。2.通過體內(nèi)致敏和腫瘤細(xì)胞攻擊來測定抗腫瘤效果用乙醚麻醉與B16-F10細(xì)胞具有同源(syngeneic)關(guān)系的6-8周齡的C57BL/6雄性小鼠(1組10只)，使用26G注射器，將腫瘤疫苗制劑注射到小鼠的大腿皮內(nèi)，每只注射100μl。對照組注射等量的PBS。反復(fù)施用腫瘤疫苗時，隔周重復(fù)等量施用。初次腫瘤疫苗施用2周后，在腹部皮下注射懸浮的培養(yǎng)B16-F10活細(xì)胞105個?？鼓[瘤效果用殘存無腫瘤小鼠的％計算。(結(jié)果)圖2表示體內(nèi)致敏實驗的結(jié)果。與對照組相比，腫瘤疫苗制劑施用組的殘存無腫瘤小鼠的％明顯要高。尤其是在施用該腫瘤疫苗制劑3次的組中，觀察時間超過90天，仍有半數(shù)的小鼠保持無腫瘤的狀態(tài)。該結(jié)果提示體內(nèi)施用腫瘤疫苗制劑也能誘導(dǎo)針對B16-F10細(xì)胞的CTL，所以它能殺傷其后注射的活B16-F10細(xì)胞，使半數(shù)的小鼠無法生存。另外，該結(jié)果還提示腫瘤摘除手術(shù)后，用其腫瘤細(xì)胞制備腫瘤疫苗制劑的話，防止腫瘤復(fù)發(fā)的腫瘤疫苗療法可成立。例5從溶解固定腫瘤細(xì)胞制備的腫瘤疫苗制劑的CTL誘導(dǎo)效果例4中施用了腫瘤疫苗的動物，體外驗證其實際體內(nèi)誘導(dǎo)的CTL。(方法)用與例4相同的方法，將腫瘤疫苗制劑施用給C57BL/6雄性小鼠，而作為對照組的小鼠及其他種的對照組，使用將107個經(jīng)X-射線50Gy照射過的活B16-F10細(xì)胞與GM-CSF微球20μl混合并作為對照腫瘤疫苗制劑施用給小鼠的組，代替例4中施用1次腫瘤疫苗制劑的組。從這些組中取出脾臟及鼠腹股溝淋巴結(jié)，輕輕碾碎組織，得到淋巴細(xì)胞。將這些淋巴細(xì)胞在添加了人IL-1β(167單位/ml)、人IL-2(67國際單位/ml)、人IL-6(134單位/ml)(均為Immunex公司制)，含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)7日，使之增殖。該實驗體系，從在培養(yǎng)期間完全不用固定B16-F10細(xì)胞進行刺激這一點來講，與例3的體系不同。這樣在培養(yǎng)期間無誘導(dǎo)出CTL的可能性，可使與體內(nèi)誘導(dǎo)的CTL數(shù)成比例數(shù)的CTL在體外增殖。培養(yǎng)淋巴細(xì)胞的細(xì)胞殺傷活性是用未經(jīng)放射線照射的活B16-F10細(xì)胞作靶細(xì)胞，用眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)測定方法4小時Cr-51釋放方法進行測定。(結(jié)果)改變培養(yǎng)淋巴細(xì)胞與目的腫瘤細(xì)胞的比例(E/T比)，檢測細(xì)胞的殺傷活性。結(jié)果如圖3所示。用與例4相同的方法，將腫瘤疫苗制劑體內(nèi)施用給小鼠，用來源于這些小鼠的淋巴細(xì)胞處理的組，其殺傷靶細(xì)胞B16-F10的比率明顯要高。該淋巴細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞殺傷活性，與根據(jù)已知能誘導(dǎo)CTL的既存的方法制備的其他種對照組(施用對照腫瘤疫苗制劑的小鼠)來源的淋巴細(xì)胞的細(xì)胞殺傷活性幾乎相同。該結(jié)果提示在小鼠體內(nèi)能誘導(dǎo)針對B16-F10細(xì)胞的CTL。另外，由此結(jié)果可以斷定，由于CTL的腫瘤細(xì)胞殺傷能力高，所以一旦誘導(dǎo)出CTL，那么在體內(nèi)也能殺傷已經(jīng)存在的腫瘤細(xì)胞，進而可以期待抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移和治愈腫瘤。例6從溶解固定腫瘤細(xì)胞制備的腫瘤疫苗的CTL誘導(dǎo)效果-用HA-20細(xì)胞時確認(rèn)了根據(jù)本發(fā)明誘導(dǎo)出的CTL，并不限定于作為抗原的腫瘤B16-F10細(xì)胞一種。(方法)HA-A20細(xì)胞是來源于Balb/c小鼠的B淋巴瘤細(xì)胞株。通過基因操作使該細(xì)胞改變的GM-CSF-HA-A20細(xì)胞是導(dǎo)入了流感血凝素(influenza-hemagglutinin)和小鼠GM-CSF兩種基因的表達載體的穩(wěn)定細(xì)胞株，已成為經(jīng)典的GM-CSF生成性活細(xì)胞型腫瘤疫苗的研究材料(Levitsky，H.I.，et al.，J.Immunol.，156，pp.3858-3865，1996)。用野生型HA-A20細(xì)胞替代B16-F10細(xì)胞，用與例4相同的方法，制備混合了20μl GM-CSF微球的腫瘤疫苗制劑，用于致敏Balb/c小鼠。此時，將PBS施用組、107個預(yù)先經(jīng)X-射線50Gy照射過的活HA-A20細(xì)胞施用組、未混合GM-CSF微球的腫瘤疫苗制劑施用組及107個預(yù)先經(jīng)X-射線50Gy照射過的活GM-CSF-HA-A20細(xì)胞施用組作為對照組。
與例4相同，施用1次來致敏Balb/c小鼠。隨后，用野生型HA-A20細(xì)胞替代B16-F10細(xì)胞，用與例5相同的方法，測定CTL對HA-A20細(xì)胞的活性。另外，同時并行這樣的實驗，用眾所周知的4小時Cr-51釋放方法這一標(biāo)準(zhǔn)測定方法進行測定時，同時向96孔板的各孔中添加針對已知為典型的CTL細(xì)胞表面抗原的小鼠CD8的單克隆抗體(Sigma公司制，產(chǎn)品號F7525，5μg)。(結(jié)果)如圖4所示，對照組中，PBS施用組、(預(yù)先經(jīng)X-射線50Gy照射過的活的)HA-A20細(xì)胞施用組、未混合GM-CSF微球的腫瘤疫苗制劑施用組中幾乎看不到細(xì)胞殺傷活性。而在混合了20μl GM-CSF微球的腫瘤疫苗制劑施用組中，存在明顯的靶細(xì)胞野生型HA-A20細(xì)胞的細(xì)胞殺傷活性，其強度與已知的經(jīng)典的GM-CSF生成性活細(xì)胞型腫瘤疫苗(預(yù)先經(jīng)X-射線50Gy照射過的活的)的GM-CSF-HA-A20細(xì)胞施用組幾乎相同。但是，如圖5所示，當(dāng)E/T比為64時，添加抗小鼠CD8的單克隆抗體，明顯抑制細(xì)胞殺傷活性。這提示細(xì)胞殺傷活性大部分是由CD8陽性淋巴細(xì)胞，即包含典型CTL的淋巴細(xì)胞組產(chǎn)生的。例7例2中制備的由固定腫瘤組織而來的微?；[瘤抗原在體內(nèi)的抗腫瘤效果(方法)將例2中制備的微?；[瘤抗原10μl壓緊體積(packedvolume)一份，代替例1中應(yīng)用的1.25×106個固定腫瘤細(xì)胞，進行與例1的表1的實驗同樣的實驗，測定體內(nèi)的抗腫瘤效果。但用培養(yǎng)Hepa1-6活細(xì)胞攻擊時，例1中是直接肝內(nèi)注射107個細(xì)胞，而本實施例中是注射2×107個細(xì)胞于左后肢皮下，體外測定腫瘤組織的生長速度。腫瘤大小的表示方法，按照該研究領(lǐng)域的習(xí)慣，不用體積而用皮下腫瘤的面積表示。同時，作為相同實驗中的一組，制備不使用佐劑Titer Max Gold 20μl，而用市售的結(jié)核菌素20μl(日本BCG制造株式會社)代替的組。(結(jié)果)如表4所示，對照組在3周時間內(nèi)，用Hepa1-6活細(xì)胞攻擊的6只小鼠均有腫瘤形成。但是，在處置組中，與例1的表1中(B)組相對應(yīng)的，用微粒化腫瘤抗原替代固定腫瘤細(xì)胞的組中，6只小鼠中只有3只形成腫瘤，3只中觀察到抗腫瘤效果(50％)。另外，該微?；[瘤抗原組的，用結(jié)核菌素作為佐劑的組中，6只小鼠中只有1只形成腫瘤，抗腫瘤效果高達83％。
由這些結(jié)果可以得出這樣的結(jié)論作為抑制癌組織形成的腫瘤疫苗，從固定腫瘤組織制備的微粒化腫瘤抗原、IL-2微球、GM-CSF微球、佐劑Titer Max Gold或結(jié)核菌素的組合，用于發(fā)揮抗腫瘤效果是十分有效的。
表4致敏 無腫瘤小鼠 腫瘤面積(mm2)的比例 (平均±SD) 范圍對照組(A)PBS 0/6 164±76 81-256處置組(B)固定腫瘤組織來源的微?；[瘤抗原 3/6 70±80 0-180+IL-2/GM-CSF微球+Titer Max Gold(C)固定腫瘤組織來源的微?；[瘤抗原 5/6 8.2±20 0-49+IL-2/GM-CSF微球+結(jié)核菌素產(chǎn)業(yè)上的實用性本發(fā)明腫瘤疫苗的特征是，它制備簡便，同時具有不論哪種腫瘤的復(fù)發(fā)預(yù)防、轉(zhuǎn)移抑制及治療均可適用的通用性，且抗腫瘤效果極佳。
權(quán)利要求
1.一種腫瘤疫苗，其特征在于含有由腫瘤組織、腫瘤細(xì)胞及選自由這些成分構(gòu)成的組的固化腫瘤材料制備的微粒，和至少一種細(xì)胞因子和/或細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑。
2.一種腫瘤疫苗，其特征在于含有由腫瘤組織、腫瘤細(xì)胞及選自由這些成分構(gòu)成的組的固化腫瘤材料制備的溶解物，和至少一種細(xì)胞因子和/或細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求第1項或第2項記載的腫瘤疫苗，其中進一步含有佐劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求第1項到第3項中任一項記載的腫瘤疫苗，其中含有緩釋性細(xì)胞因子制劑作為細(xì)胞因子。
5.根據(jù)權(quán)利要求第1項到第4項中任一項記載的腫瘤疫苗，其中含有粒細(xì)胞·巨噬細(xì)胞集落刺激因子和/或白介素-2作為細(xì)胞因子。
6.一種腫瘤疫苗，它是與至少一種細(xì)胞因子組合應(yīng)用的腫瘤疫苗，并且含有由腫瘤組織、腫瘤細(xì)胞及選自由這些成分構(gòu)成的組的固化腫瘤材料制備的微?；蛴稍撃[瘤材料制備的溶解物作為有效成分。
全文摘要
腫瘤疫苗,它包含由腫瘤組織、腫瘤細(xì)胞及選自由這些成分構(gòu)成的組的固化腫瘤材料制備的微?；蛉芙馕?至少一種細(xì)胞因子和/或細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑(例如粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞集落刺激因子和/或白介素－2等),及根據(jù)需要可含有佐劑。其特征是它制備簡便,同時具有不論哪種腫瘤的復(fù)發(fā)預(yù)防、轉(zhuǎn)移抑制及治療均可適用的通用性,且抗腫瘤效果極佳。
文檔編號A61P35/00GK1355709SQ00805910
公開日2002年6月26日 申請日期2000年2月9日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月9日
發(fā)明者大野忠夫, 彭寶崗, K·利昂, 劉書欽 申請人:理化學(xué)研究所, 約翰斯霍普金斯大學(xué), 大野忠夫, 彭寶崗