專利名稱：假單胞霉素的天然產(chǎn)品的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及到假單胞霉素天然產(chǎn)品，本發(fā)明包括假單胞霉素A’和B’、用于制造這樣的假單胞霉素的方法和使用這些假單胞霉素的抗真菌活性的方法。
背景技術：
真菌感染是疾病、生活質量降低以及人類死亡的一個重要原因，尤其是對于免疫受損的患者。在過去20年中，人體的真菌感染發(fā)生率猛增。這部分由免疫系統(tǒng)受到削弱或由于器官移植、癌癥化療、AIDS、衰老和其它類似的失調或癥狀而被毀壞的患者數(shù)量的增加所導致。這樣的患者易于被真菌病原攻擊，這些真菌在整個人類群體中十分普遍，但它們可以被有功能的免疫系統(tǒng)所檢查出來。由于現(xiàn)存的抗真菌試劑不是毒性高就是只能抑制真菌活性，因此這些病原難于控制。例如，多烯可以殺死真菌但毒性高；而吡咯類毒性較低但只能抑制真菌。更重要的是，近來有關于抗吡咯類和多烯的的菌株假絲酵母報道，該菌株嚴重地限制了針對這些菌株的醫(yī)療選擇。
丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)產(chǎn)生幾個類別的抗真菌和抗生素試劑，例如假單胞霉素(pseudomycin)、丁香霉素、syringotoxin，syringostatins，這些試劑為脂縮酚九肽(lipodepsinonapeptide)。由天然菌株和轉座子產(chǎn)生的丁香假單胞菌突變體產(chǎn)生這些脂縮酚九肽。幾種假單胞霉素、丁香霉素和其它脂縮酚九肽抗真菌試劑已經(jīng)被分離、，化學鑒定并表現(xiàn)出具有光譜抗真菌活性，這些活性包括抵抗人類和植物體內的重要真菌抗原的活性。例如，假單胞霉素A、B、C和C’均已被分離并純化，并且已通過包括氨基酸測序、NMR和質譜分析在內的方法對其結構進行了特征研究。例見，Ballio et al.，“Novel bioactive lipodesipeptides fromPseudomonas syringaethe pseudomycins.”FEBS Lett.355，96-100(1994)以及美國專利No.5,576,298。假單胞霉素、丁香霉素、syringotoxin、syringostatin為結構不同的抗真菌化合物家族。
假單胞霉素、丁香霉素、syringotoxin、syringostatin均未被引入抗真菌治療市場。不良副作用的發(fā)現(xiàn)、制劑制造、產(chǎn)量的提高和其它開發(fā)問題進一步阻礙了假單胞霉素、丁香霉素、syringotoxin、syringostatin在對抗各種影響人類、動物和植物的真菌感染中的應用。對一種抗真菌試劑以及該試劑對于抵抗人類、動物和植物的真菌感染的應用的需要依然存在，該試劑應可被用于抵抗現(xiàn)存的抗真菌試劑所不能治療的感染。
發(fā)明概要本發(fā)明提供了一種假單胞霉素天然產(chǎn)品，該產(chǎn)品由丁香假單胞菌所產(chǎn)生。該假單胞霉素天然產(chǎn)品包括一種縮九肽環(huán)，其序列為Ser-Dab-Asp-Lys-Dab-aThr-Dhb-HOAsp-ClThr，在更特定的情況下，該序列為L-Ser-D-Dab-L-Asp-L-Lys-L-Dab-L-aThr-Z-Dhb-L-Asp(3-OH)-L-Thr(4-Cl)，其ClThr的羧基基團和絲氨酸的羥基基團以一個內酯鍵閉合了該環(huán)。假單胞霉素A’(IA)包括3，4-二羥基十五烷酸基團，其羧基基團同N-末端絲氨酸的氨基基團形成一個酰胺鍵。 假單胞霉素B’(IB)包括3-羥基十二烷酸基團，其羧基基團同N-末端絲氨酸的氨基基團形成一個酰胺鍵。 本發(fā)明還涉及到使用假單胞霉素天然產(chǎn)品，諸如假單胞霉素A’、假單胞霉素B’或其混合物，以抑制真菌活性或減輕有需要的患者體內的真菌感染癥狀的方法。這些方法可以殺死真菌，減輕真菌感染的負擔，退燒和/或患者的一般生活質量。本發(fā)明的方法可有效地抵抗諸如假絲酵母菌parasilosis、假絲酵母菌adbicans、Crytococcusneoformans和/或Histoplasma capsulatum這樣的真菌。
發(fā)明詳述假單胞霉素本文所用的假單胞霉素或假單胞霉素天然產(chǎn)物指的是抗真菌試劑家族的一個或多個成員，該成員分離自丁香假單胞菌。假單胞霉素為一種脂縮酚九肽，其為一種環(huán)形肽，該肽含有一種或多種非常見氨基酸并且具有一個或多個額外的疏水或脂肪酸側鏈。在特定情況下，該假單胞霉素為一種脂縮酚九肽，其具有一個環(huán)形肽部分，該環(huán)通過內酯鍵閉合并且含有非常見的氨基酸4-氯-蘇氨酸、3-羥基天冬氨酸、脫羥基-2-氨基丁酸以及2，4-二氨基丁酸。據(jù)信這些非常見的氨基酸涉及到了假單胞霉素生物學特性，例如在血清中的穩(wěn)定性和它們的殺傷活動。
各假單胞霉素均具有同樣的環(huán)肽核心，但是它們的與核心連接的羥基側鏈不同。各假單胞霉素均具有一個九肽核心，其序列為Ser-Dab-Asp-Lys-Dab-aThr-Dhb-HOAsp-ClThr(即，絲氨酸；2，4-二氨基丁酸；天冬氨酸；賴氨酸；2，4-二氨基丁酸；allo蘇氨酸；脫羥基-2-氨基丁酸；3-羥基天冬氨酸；4-氯-蘇氨酸)，其ClThr的羧基基團和絲氨酸的羥基基團以一個內酯鍵閉合了該環(huán)。親脂性基團連接于N-末端的氨基基團。該絲氨酸的氨基基團同在假單胞霉素A’中的3，4-二羥基十四烷酸基團的羧基形成肽鍵，在假單胞霉素B’中的3-單羥基十四烷酸基團的羧基形成肽鍵，在假單胞霉素C中的3，4-二羥基十六烷酸基團的羧基形成肽鍵，在假單胞霉素C’中的3-單羥基十六烷酸基團的羧基形成肽鍵。該絲氨酸的羧基基團同該環(huán)中的Dab形成酰胺鍵。假單胞霉素A’和B’本文所用的術語假單胞霉素A’和假單胞霉素B’指的是分離自丁香假單胞菌的抗真菌試劑。假單胞霉素A’和B’為具有特征的縮九肽環(huán)的假單胞霉素，該環(huán)的序列為Ser-Dab-Asp-Lys-Dab-aThr-Dhb-HOAsp-ClThr，其ClThr的羧基基團和絲氨酸的羥基基團以一個內酯鍵閉合了該環(huán)。假單胞霉素A’(IA)包括3，4-二羥基十五烷酸基團，其羧基基團同N-末端絲氨酸的氨基基團形成一個酰胺鍵。假單胞霉素B’(IB)包括3-羥基十二烷酸基團，其羧基基團同N-末端絲氨酸的氨基基團形成一個酰胺鍵。假單胞霉素的生物活性假單胞霉素具有多種生物活性，其中包括殺傷多種真菌，例如植物體和動物體的真菌病原體。特別地，假單胞霉素為一種活性的抗霉菌試劑，該試劑可抵抗導致免疫受損個體中的機會性感染的真菌。這些真菌包括不同種類的假絲酵母，其中包括C.parapsilosis，C.albicans，C.glabrata，C.tropicalis，以及C.krusei。這些真菌還包括其它屬的真菌，例如Crytococcus neoformans，Aspergillusfumigatus以及Histoplasma capsulatum。諸如假單胞霉素A’和/或B’這樣的抗真菌物質的一種理想的以及優(yōu)選的生物活性是其殺傷而不是抑制真菌的生長，尤其是真菌病原體的生長。
假單胞霉素對范圍很廣的植物病原體真菌表現(xiàn)出毒性，這些真菌包括Rynchosporium secalis，Ceratocystis ulmi，Rizoctonicsolani，Sclerotinia sclerotiorum，Verticillium albo-atrum，Verticillium dahilae，Thielaviopis basicola，F(xiàn)usariumoxysporum以及Fusarium culmorum。(見Harrison，L.，et al.，“Pseudomycins，a family of novel peptides from Pseudomonassyringae possessing broad-spectrum antifungal activity”，J.of General Microbiology，7.2857-2865(1991))另外，在被Ceratocystis ulmi感染的榆樹中，P.Syringae MSU 16H表現(xiàn)出可產(chǎn)生比野生型菌株更強的保護，Ceratocystis ulmi為荷蘭榆樹疾病的引發(fā)物(例見，Lam et al.，Proc.Natl Sci.USA.84，6447-6451(1987))。丁香假單胞菌丁香假單胞菌包括范圍很廣的細菌，這些細菌一般同植物有關。一些丁香假單胞菌是植物病原體，而另一些僅為較弱的病原或腐生物。丁香假單胞菌的許多分離菌株產(chǎn)生一種或多種細胞毒性試劑，這些試劑可幫助該細菌在必須同真菌和其它細菌競爭的野生環(huán)境中生存。由丁香假單胞菌產(chǎn)生的細胞毒性試劑包括抗真菌試劑，例如假單胞霉素、丁香霉素、syringotoxin以及syringostatin。
產(chǎn)生一種或多種假單胞霉素的丁香假單胞菌菌株已在本領域中有所描述。例如，野生型菌株MSU 174(分離自蒙大拿州的麥田)以及使用TN905(MSU 16H)通過轉座子突變而產(chǎn)生的該菌株的一種突變體的描述見美國專利No.5,576,298，該專利屬于Strobel等人，發(fā)布于1996年11月19日；Harrison et al.，J.“Pseudomycins，a a family of novel peptides from Pseudomonas syringaepossessing broad-spectrum antifungal activity”，Gen.Microbiology，137，2857-2865(1991)；以及Lamb et al.，“Transposon mutagenesis and tagging of fluorescentpseudomonasAntimycotic production is necessary for controlof Dutch elm disease，”Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84，6447-6451(1987)。用于生長多種丁香假單胞菌菌株的方法以及其在諸如假單胞霉素這樣的抗真菌試劑的生產(chǎn)中的應用披露于Matthew D.Hilton等人的美國專利申請序列號No.＿＿＿＿＿＿＿，其標題為“Pseudomycin Production By Pseudomonas Syringae”，與本文同日遞交并在下文有描述。MSU 174和MSU 16H的培養(yǎng)物保存于蒙大拿州立大學(Bozeman，Montana，USA)，并且可獲自American TypeCulture Collection(Parklawn Drive，Rockville，MD，USA)。在本段中引用的參考的披露在此引入作為參考。
本發(fā)明包括一個菌株，一種分離菌以及一種生物學上純化的丁香假單胞菌培養(yǎng)物，該培養(yǎng)物產(chǎn)生假單胞霉素A’和/或B’，其量至少為10μg/ml。在優(yōu)選的情況下，微生物體的生物學純化的培養(yǎng)物為丁香假單胞菌菌株MSU 16H、25-B1、67H1或7H9-1，或這些產(chǎn)生假單胞霉素A’和/或B’的菌株的一種突變體、變體、分離菌或重組體。培養(yǎng)物MSU 174和MSU 16H如上文所描述獲得。
適于假單胞霉素A’和/或B’的生產(chǎn)的丁香假單胞菌菌株可分離自環(huán)境來源，該來源包括植物，例如大麥作物、柑橘類的植物以及丁香類植物，該菌株還可分離自諸如土壤、水、空氣和灰塵這樣的來源。優(yōu)選的菌株分離自植物。分離自環(huán)境來源的丁香假單胞菌菌株可被稱為野生型。本文所使用的“野生型”指的是一種顯性基因型，該基因型天然存在于丁香假單胞菌的普通群體中(即，可見于自然界中并且非由實驗室操作產(chǎn)生的丁香假單胞菌菌株或分離菌)。對于其它的生物體，應用于本發(fā)明的產(chǎn)生假單胞霉素A’和/或B’的培養(yǎng)物，丁香假單胞菌菌株如MSU 174、MSU 16H、MSU 206、25-B1、67H1或7H9-1的特征有一定的變化。由此，這些菌株的后代，例如，重組體、突變體和變體，可以通過本領域的技術人員所熟知的方法來獲得。
丁香假單胞菌的突變體也適于假單胞霉素A’和/或B’的生產(chǎn)。本文所用的突變體指的是在一個菌株的表型上具有一個突然的可遺傳的變化，該變化可以是自發(fā)產(chǎn)生的或通過已知的突變試劑誘導產(chǎn)生，該試劑包括照射和各種化學物質。本發(fā)明的突變體丁香假單胞菌可以使用各種突變試劑產(chǎn)生，這些突變試劑包括照射，如紫外線、x射線；化學突變原，位點特異性突變和轉座子介導的突變。化學突變原的例子為甲基碳酸乙酯(ethyl methanesulfonate)(EMS)、diepoxyoctane、N-甲基-N-硝基-N’-nitrosoguanine亞硝基胍(NTG)以及亞硝酸。
本發(fā)明的產(chǎn)生假單胞霉素A’和/或B’的丁香假單胞菌突變體可以通過以一定量的突變試劑處理細菌而產(chǎn)生，該量足以產(chǎn)生突變體，該突變體過量產(chǎn)生假單胞霉素A’和/或B’，產(chǎn)生超過其它丁香假單胞菌的假單胞霉素A’和/或B’，或者在更有利的生長條件下產(chǎn)生假單胞霉素A’和/或B’。盡管被使用的突變試劑的類型和量可以有變動，一種優(yōu)選的方法為對NTG進行一系列的稀釋，其水平從l到100μg/ml。本發(fā)明的優(yōu)選突變體為在最低限度培養(yǎng)基中生長過量產(chǎn)生假單胞霉素A’和/或B’的丁香假單胞菌突變體。該突變體過量產(chǎn)生的假單胞霉素優(yōu)選為至少約10μg/ml。
丁香假單胞菌的環(huán)境分離菌、突變體菌株以及其它理想菌株可進行針對生長習性、生長培養(yǎng)基、營養(yǎng)來源、碳源、生長條件以及氨基酸需求的理想特征的選擇。在優(yōu)選的情況下，對產(chǎn)生假單胞霉素A’和/或B’的丁香假單胞菌進行諸如N21培養(yǎng)基這樣的最低限度培養(yǎng)基的生長進行選擇，和/或進行假單胞霉素A’和/或B’的產(chǎn)量高于10μg/ml的選擇。優(yōu)選的菌株表現(xiàn)的特征為其在某種培養(yǎng)基上生長時可產(chǎn)生假單胞霉素A’和/或B’，該培養(yǎng)基含有甘氨酸，并且根據(jù)情況含有一種脂、一種馬鈴薯產(chǎn)品或它們的組合。
重組菌株的開發(fā)可通過轉化丁香假單胞菌來進行，該轉化使用本領域的技術人員所熟知的已確立的實驗室程序。通過使用重組技術，丁香假單胞菌可被轉化以表達抗生素之外的多種基因。例如，可以以一種重組載體對該菌株進行轉化，該載體可導致對某種抗生素的抗性，該菌株正常情況下對該抗生素敏感。由此獲得的轉化子將不止產(chǎn)生諸如假單胞霉素A’和/或B’這樣的假單胞霉素，而且還產(chǎn)生導致抗性的酶，該酶使轉化子得以從野生型中選出。進一步，使用類似的工藝，現(xiàn)存的菌株可以經(jīng)修飾而引入多拷貝的內源假單胞霉素合成基因以獲得更高的假單胞霉素產(chǎn)量，例如假單胞霉素A’和/或B’。丁香假單胞菌菌株25-B1、67H1和7H9-1的后代，即，天然的和誘導的變體、突變體和重組體，它們?yōu)楸景l(fā)明的一部分，這些菌株均保持了過量生產(chǎn)假單胞霉素A’和/或B’的特征。丁香假單胞菌的生長本文所描述的“水性營養(yǎng)培養(yǎng)基”指的是一種水基的組合物，該組合物含有本發(fā)明使用的細菌的生長所必需的無機物質和有機化合物以及它們的鹽。優(yōu)選的營養(yǎng)培養(yǎng)基含有有效量的3種或更少的氨基酸，在優(yōu)選的情況下其為谷氨酸、甘氨酸、組氨酸或它們的組合。在一個實施方案中，該培養(yǎng)基含有有效量的甘氨酸并且根據(jù)情況含有一種或多種馬鈴薯產(chǎn)品以及一種脂。甘氨酸可作為一種氨基酸單獨提供，也可作為一種氨基酸混合物，例如水解蛋白的一部分來提供。適當?shù)闹ù蠖褂突蛞环N脂肪酸。適當?shù)鸟R鈴薯產(chǎn)品包括馬鈴薯葡萄糖肉湯、馬鈴薯糊精、馬鈴薯蛋白以及商品化的馬鈴薯泥(mashedpotato)混合物食物產(chǎn)品。營養(yǎng)培養(yǎng)基中的優(yōu)選的無機物質包括在細胞培養(yǎng)和發(fā)酵中典型使用的鹽混合物，例如Czapek無機物鹽溶液(例如，KCl，MgSO4以及FeSO4)。營養(yǎng)培養(yǎng)基中的有機化合物在優(yōu)選的情況下包括葡萄糖并且可根據(jù)情況包括可溶性淀粉；還可含有其它類似的有機化合物。該培養(yǎng)基的pH在優(yōu)選的情況下在約4到6.5之間，在更優(yōu)選的情況下在約4.5到5.7之間，在最優(yōu)選的情況下為約5.2。
盡管營養(yǎng)肉湯中的各組分的量在典型的情況下對于假單胞霉素A’和/或B’的產(chǎn)生并不關鍵，但特定水平的營養(yǎng)是有利的。甘氨酸的一個優(yōu)選的量為約0.1g/L到10g/L，更優(yōu)選的量為約0.3g/L到3g/L，最優(yōu)選的量為約1g/L。脂的一個優(yōu)選的量為約1g/L到10g/L的一種油產(chǎn)品，例如大豆油，更優(yōu)選的量為約0.5g/L到2g/L的大豆油。脂肪酸或脂肪酸酯的優(yōu)選的量為約0.5g/L到5g/L。優(yōu)選的量的馬鈴薯產(chǎn)品含有約12g/L到36g/L的馬鈴薯葡萄糖肉湯，在優(yōu)選的情況下為約24g/L；含有約5g/L到50g/L的商品化的馬鈴薯泥混合物，在優(yōu)選的情況下為約30g/L；含有約1g/L到30g/L的馬鈴薯糊精，在優(yōu)選的情況下為約20g/L；含有約1g/L到10g/L的馬鈴薯蛋白，在優(yōu)選的情況下為約4g/L。一種優(yōu)選的營養(yǎng)培養(yǎng)基含有的無機物質中，KCL在優(yōu)選的情況下為0.02到2g/L，更優(yōu)選的情況下約0.2g/L；MgSO4，優(yōu)選地為MgSO4·7H2O，在優(yōu)選的情況下為0.02g/L到2g/L，更優(yōu)選的情況下約0.2g/L；FeSO4，優(yōu)選地為FeSO4·7H2O，在優(yōu)選的情況下為0.4mg/L到4mg/L，更優(yōu)選的情況下約4mg/L。在其存在時，可溶性淀粉在優(yōu)選情況下為約0.5到50g/L，更優(yōu)選的情況下約5g/L。葡萄糖在優(yōu)選的情況下約含有2到80g/L，更優(yōu)選的情況下約20g/L。
丁香假單胞菌典型地在所描述的培養(yǎng)基上在控制或調節(jié)pH和溫度的條件下生長。丁香假單胞菌在15℃到35℃的溫度下生長并產(chǎn)生假單胞霉素A’和/或B’，在優(yōu)選的情況下溫度為約20℃到30℃，更優(yōu)選的情況下溫度為約22℃到27℃，最優(yōu)選的情況下溫度為約25℃。。丁香假單胞菌在約4到9的pH下生長并產(chǎn)生假單胞霉素A’和/或B’，在優(yōu)選的情況下pH為約4到6，在更優(yōu)選的情況下pH為約4.5到5.5。在典型的情況下，丁香假單胞菌不在高于37℃或低于10℃的溫度下或高于9或低于4的pH下生長。產(chǎn)生假單胞霉素A’和/或B’的方法為從一種野生型或突變體的丁香假單胞菌中生產(chǎn)假單胞霉素A’和/或B’，在一種水性營養(yǎng)培養(yǎng)基中對該微生物進行振蕩培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含有有效量的三種或更少的氨基酸。這三種或更少種的氨基酸在優(yōu)選的情況下為谷氨酸、甘氨酸、組氨酸或它們的混合物。在一個優(yōu)選的實施方案中，這些氨基酸包括甘氨酸并且根據(jù)情況含有一種或多種馬鈴薯產(chǎn)品以及一種脂。培養(yǎng)在足以使丁香假單胞菌生長并產(chǎn)生假單胞霉素A’和/或B’的有效條件下進行。有效的條件包括約22℃到27℃的溫度以及約36到96小時的持續(xù)時間。在培養(yǎng)基，例如本文所述的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)時，丁香假單胞菌可生長至細胞密度高達干重約10-15g/L并且產(chǎn)生的假單胞霉素A’和/或B’總量為至少約10μg/ml。
在培養(yǎng)丁香假單胞菌期間對培養(yǎng)基中的氧的濃度進行控制對于假單胞霉素A’和/或B’的產(chǎn)生是有利的。在優(yōu)選的情況下，氧的水平維持在約5％到50％飽和度，在優(yōu)選的情況下，約30％飽和度。噴射空氣、純氧或含氧的混合氣體可調控培養(yǎng)基中的氧含量。進一步，攪拌速度的調節(jié)可被用于調節(jié)氧傳輸速度。
在培養(yǎng)丁香假單胞菌期間對培養(yǎng)基中的pH進行控制對于假單胞霉素A’和/或B’的產(chǎn)生是有利的。假單胞霉素，例如假單胞霉素A’和/或B’在堿性pH下不穩(wěn)定，并且如果培養(yǎng)基的pH持續(xù)12小時以上高于約6可能發(fā)生顯著的降解。在優(yōu)選的情況下，該培養(yǎng)基的pH維持在至少約6上，較為優(yōu)選的情況下至少為約5.5，更優(yōu)選的情況下高于4.0。該pH在優(yōu)選的情況下維持在約5到約5.4，更優(yōu)選的情況下維持在約5.0到約5.2。盡管本發(fā)明未作限定，據(jù)信假單胞霉素在堿性pH下的降解是由于內酯環(huán)的打開以及ClThr變?yōu)門hr。
丁香假單胞菌在大量培養(yǎng)時可產(chǎn)生假單胞霉素A’和/或B’。然而，以葡萄糖以及根據(jù)情況以一種酸或堿，例如氫氧化銨進行fed-batch或半連續(xù)進料培養(yǎng)以控制pH可提高假單胞霉素的產(chǎn)量。丁香假單胞菌進行的假單胞霉素生產(chǎn)可通過使用連續(xù)培養(yǎng)方法進一步加強，在該方法中，以葡萄糖以及根據(jù)情況以一種酸或堿，例如氫氧化銨進行自動進料來控制pH。
假單胞霉素A’和/或B’可通過多種本領域的技術人員已知的方法進行檢測、測定、分離和/或純化。例如，在肉湯或在分離或純化的組合物中的假單胞霉素活性水平可通過其對諸如假絲酵母菌這樣的真菌的抗真菌活動來檢測。多種用于制備和分析假單胞霉素的方法是已知的。例如，可通過色譜來分離和純化一種或多種假單胞霉素，例如通過HPLC。
藥學應用假單胞霉素A’和/或B’的制劑和抗真菌作用假單胞霉素A’和/或B’均表現(xiàn)出體內和體外活性并且因此可用于抵抗系統(tǒng)真菌感染或真菌皮膚感染。因此，本發(fā)明提供了一種抑制真菌活性的方法，該方法包括使假單胞霉素A’和/或B’或它們的一種藥學上可接受的鹽同一種真菌相接觸。一種優(yōu)選的方法包括對多種真菌的生長或活動進行抑制，這些真菌包括C.parasilosis、C.albicans、Cryptococcus neoformans以及Histoplasmacapsulatum。本文所用的使本發(fā)明的一種化合物同一種寄生蟲或真菌相接觸指的是本發(fā)明的一種化合物同一種寄生蟲或真菌的一種連接或聯(lián)合，或者表面接觸或相互接觸。但是，術語接觸并不意味著任何的抑制機制。
本發(fā)明進一步提供了一種治療一種真菌感染的方法，該方法包括以一種有效量的假單胞霉素A’和/或B’或它們的一種藥學上可接受的鹽、水合物或酯對需要該處理的宿主進行給藥。一種優(yōu)選的方法包括對多種真菌造成的感染進行治療，這些真菌包括C.parasilosis、C.albicans、Cryptococcus neoformans以及Histoplasmacapsulatum。當以有效并且適當?shù)牧窟M行給藥時，假單胞霉素A’和/或B’的一種制劑降低了真菌感染的負擔，減輕了與真菌感染相關的癥狀，并且可導致該真菌感染的消除。
需要抗真菌治療的一些患者具有嚴重的感染癥狀，例如高燒，并且可能處于加強或病危護理中。多種真菌可導致這樣的嚴重感染。例如，假絲酵母菌spp.可能導致粘膜和嚴重的系統(tǒng)感染。吡咯或多烯抗性的假絲酵母菌的報道頻率正在增加。Aspergillus導致威脅生命的系統(tǒng)感染。Cryptococcus與腦膜炎有關。這樣的嚴重真菌感染可能發(fā)生在免疫受損的患者體內，例如那些接受了器官或骨髓移植、正在進行癌癥化療、正從大型手術中恢復或遭受HIV感染的患者。對于這樣的患者，抗真菌治療典型地包括以一種制劑進行幾天或更長時間的靜脈內給藥以阻止感染，該制劑含有假單胞霉素A’和/或B’。
涉及到抗真菌活性，術語“有效量”指的是本發(fā)明的化合物的一種量，該量的化合物能夠抑制真菌的生長或活動，或者可以減輕真菌感染的癥狀。對于多數(shù)的真菌感染，感染癥狀的減輕包括退燒、恢復知覺或者提高該患者的生活質量。在優(yōu)選的情況下，這些癥狀可以通過殺滅真菌以消除感染，或將感染降低至患者可忍受的程度或患者的免疫系統(tǒng)可控制的程度。本文所用的抑制指的是對真菌活動的抑制，該抑制包括對真菌生長或任何伴隨的特征以及真菌的存在所導致的結果的終止、延緩或預防性的阻礙或防止。
用于給藥的劑量可根據(jù)諸如感染性質和嚴重程度、宿主的年齡和整體健康狀況以及該宿主對抗真菌試劑的耐受能力而變動。在典型的情況下，以足以抑制真菌感染的有效量的組合物對有需要的患者(人類或其它動物，包括哺乳動物，例如貓、馬和牛，但不限于這些，還包括鳥類)進行給藥。特定的藥劑方案同樣可根據(jù)這樣的因素而變動并且可以以日單劑量或日多劑量給藥。該方案可持續(xù)約2-3天到約2-3周或更長時間。一個典型的日單劑量(一次給藥或以分割劑量給藥)所含有的藥劑水平為從約0.01mg/kg體重到約100mg/kg體重的本發(fā)明的活性化合物。優(yōu)選的日劑量一般從約0.1mg/kg到約60mg/kg，在理想的情況下從約2.5mg/kg到約40mg/kg。對于嚴重感染，該化合物可以通過靜脈灌輸來進行，例如使用0.01到10mg/kg/小時的活性成分。
本發(fā)明還提供了可用于以本發(fā)明的抗真菌化合物進行給藥的藥學制劑。因此，本發(fā)明還提供了一種藥學制劑，該制劑包括一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑、攜帶物、賦形劑或其它添加劑，還包括假單胞霉素A’和/或B’。在這樣的制劑中的活性成分包括該制劑重量的約0.1％到約99.9％，更普遍的情況下為約10％到約30％?！八帉W上可接受的”指的是該載體、稀釋劑或賦形劑與制劑中的其它成分兼容并且對其受體無毒。
該制劑可以含有諸如各種油類的添加劑，這些油類包括石油、動物油、植物油或合成來源的油類，例如花生油、大豆油、礦物油和芝麻油。合適的藥物賦形劑包括淀粉、纖維素、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、氯化鈉、干燥脫脂牛奶、甘油、丙二醇、水和乙醇?？蓪υ摻M合物使用傳統(tǒng)的藥物賦形劑，例如滅菌，并且可以含有傳統(tǒng)的藥物添加劑，例如防腐劑、穩(wěn)定劑、濕劑或乳化劑，調節(jié)滲透壓的鹽，以及緩沖液。適當?shù)乃帉W載體和它們的制劑的描述見Martin，“Remington’s PharmaceuticalSciences”，15thEd.，Mack Publishing Co.，Easton(1975)，例見pp.1405-1412以及1461-1487。
本文所使用的術語“藥學可接受的鹽”指的是上述的化合物的鹽，這些鹽對于活的有機體基本無毒。典型的藥學可接受的鹽包括通過本發(fā)明的化合物與一種無機或有機酸或一種無機堿。這樣的鹽被稱為酸加成鹽和堿加成鹽。
通常用于形成酸加成鹽的酸為無機酸，例如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸和磷酸，也可以是有機酸，例如對甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、對溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、檸檬酸、安息香酸和乙酸。這樣的藥學可接受的鹽為硫酸鹽、焦硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、磷酸一氫鹽、磷酸二氫鹽、偏磷酸鹽、焦磷酸鹽、鹽酸鹽、溴化鹽、碘化鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、acrylate、甲酸鹽、異丁酸鹽、己酸鹽、庚酸鹽、丙酸鹽(propionate)、草酸鹽、丙二酸鹽、琥珀酸鹽、辛二酸鹽、癸二酸鹽、延胡索酸鹽、順丁烯二酸鹽、丁炔-1-4-二酸(butyne-1，4-dioate)、己炔-1，6-二酸(hexyne-1，6-dioate)、安息香酸鹽、氯代苯甲酸(chlorobenzoate)、甲基苯甲酸(methylbenzoate)、二硝基苯甲酸(dinitrobenzoate)、hydrobenzoate、甲氧基苯甲酸(methoxybenzoate)、鄰苯二甲酸鹽、磺酸鹽、二甲苯磺酸鹽、苯乙酸鹽、苯丙酸鹽、苯丁酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、γ-羥基丁酸鹽、乙醇酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、丙磺酸鹽、萘-1-磺酸、萘-2-磺酸以及苯基乙醇酸鹽。優(yōu)選的藥學可接受的酸加成鹽為諸如同鹽酸和氫溴酸這樣的無機酸以及同諸如順丁烯二酸和甲磺酸這樣的有機酸形成的鹽。
堿加成鹽包括來自無機堿的鹽，例如銨、或堿金屬或堿土金屬的氫氧化物、碳酸鹽和碳酸氫鹽。由此，可用于本發(fā)明的鹽的制備的堿包括氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、碳酸鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、氫氧化鈣以及碳酸鈣。鉀鹽和鈉鹽形式特別地優(yōu)選。
應當認識到，只要一種鹽其整體為藥學可接受的并且其平衡離子并不對該鹽的整體造成不良性質，形成本發(fā)明的任何鹽的一部分的特定平衡離子并不是關鍵性的。
假單胞霉素A’和/或B’可以進行不經(jīng)腸胃的給藥，例如使用肌肉間、皮下或腹膜內注射、鼻腔或口腔途徑。除這些給藥方法之外，假單胞霉素A’和/或B’可被局部應用于皮膚表面感染或用于消除或抑制粘液中的真菌感染。
對于非腸胃給藥，該制劑包括假單胞霉素A’和/或B’以及一種藥學可接受的稀釋劑，如去離子水、生理鹽水、5％的葡萄糖和其它常用稀釋劑。該制劑可含有一種環(huán)糊精和/或一種增溶試劑，如聚乙二醇或聚丙二醇或其它已知的增溶劑。這樣的制劑可包裝入消毒的藥瓶中，該瓶中含有干粉狀或凍干的該抗真菌制劑和賦形劑。在使用之前，加入一種藥學可接受的稀釋劑并以注射器將溶液從瓶中取出以用于對患者進行給藥。
本藥學制劑通過一致的程序使用已知的并且可容易獲得的組分進行制備。在本發(fā)明的組合物的制備中，該活性組分一般同一種載體進行混合，或以載體進行稀釋或以載體進行封裝，該載體可以為膠囊、小袋、紙或其它容器形式。當載體作為一種稀釋劑起作用時，該載體可以為固體、半固體或液體材料，該材料可作為活性成分的一種載體、賦形劑或介質。這樣，該組合物可以為藥片、藥丸、粉末、藥糖塊、藥囊、膠囊、酏劑、懸浮物、乳劑、溶液、糖漿、氣溶膠(固體或液體介質)、藥膏的形式，該藥膏中含有，例如，最高至重量百分比10％的該活性化合物，該組合物還可以為軟或硬明膠膠囊、栓劑、消毒的注射溶液和消毒的包裝粉末形式。
對于口腔給藥，該抗真菌化合物被裝填入明膠膠囊或被制成藥片。這樣的藥片還可以含有一種粘合劑，一種分散劑或其它的適當賦形劑，這些賦形劑適于將假單胞霉素A’和/或B’藥劑制成合適大小的藥片。對于兒科或老人的應用，該抗真菌化合物可被制成一種可口的液體懸浮物、溶液或乳劑。優(yōu)選的口腔制劑為亞油酸、cremophorRH-60和水，在優(yōu)選的情況下為體積比為8％的亞油酸、5％cremophorRH-60、87％無菌水和含量為約2.5到40mg/ml假單胞霉素A’和/或B’。
對于局部使用，該抗真菌化合物可被制成干粉以用于皮膚表面，或者可被制備成液體制劑，該制劑含有溶解性的含水液體或不含水的液體，例如乙醇或甘油。假單胞霉素A’或B’制劑的使用本發(fā)明還包括一種試劑盒，該試劑盒含有本藥學組合物并可被用于本發(fā)明的方法。該試劑盒可含有一種藥瓶，該藥瓶含有本發(fā)明的一種制劑和適當?shù)妮d體，干燥形式或液體形式均可。該試劑盒進一步含有用于該化合物給藥的指導說明，該說明為藥瓶上的標簽形式和/或該藥瓶的包裝盒中的插入說明。該說明可被印刷在藥瓶的包裝盒上。該說明包含有諸如充分劑量以及給藥信息這樣的信息以使本領域的工作人員進行給藥。預計本領域的工作人員包括任何醫(yī)生、護士或可以給藥的技術人員。
本發(fā)明還涉及到一種藥學組合物，該組合物含有假單胞霉素A’和/或B’的一種制劑，并且該組合物適于通過注射進行給藥。根據(jù)本發(fā)明，假單胞霉素A’和/或B’的一種制劑可被用于制造一種組合物或藥劑，該組合物或藥劑適于通過注射給藥。本發(fā)明還涉及到用于制造組合物的方法，該組合物含有假單胞霉素A’和/或B’的一種制劑，該制劑為適于通過注射進行給藥的形式。例如，可通過幾種方法使用傳統(tǒng)工藝制造一種液體或固體制劑?？赏ㄟ^將假單胞霉素A’和/或B’在適當?shù)膒H溶于一種適當?shù)娜軇缛苡谒畞碇苽湟后w制劑，該溶劑包括緩沖液或其它賦形劑。
農(nóng)業(yè)應用產(chǎn)自丁香假單胞菌NRRL B-12050的抗生素已經(jīng)證明可有效地治療荷蘭榆樹疾病。(例見，美國專利Nos.4,342,746和4,277,462)特別地，丁香假單胞菌MSU 16H已經(jīng)表明可在被Ceratocystis ulmi感染的榆樹體內導致比野生型菌株更強的防護，Ceratocystis ulmi是荷蘭榆樹疾病的引發(fā)物。(例見，Lam et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，6447-6451(1987))。在土載榆樹上進行的更廣泛測試證實了在預防水平上的生物控制現(xiàn)象。因此，本發(fā)明的假單胞霉素可被用作對荷蘭榆樹疾病的預防處理。
已經(jīng)表明該假單胞霉素對廣泛范圍的植物病原真菌具有毒性，這些真菌包括Rynchosporium secalis，Ceratocystis ulmi，Rizoctonic solani，Sclerotinia sclerotiorum，Verticilliumalbo-atrum，Verticillium dahilae，Thielaviopis basicola，F(xiàn)usarium oxysporum以及Fusarium culmorum。(見Harrison，L.，et al.，“Pseudomycins，a family of novel peptides fromPseudomonas syringae possessing broad-spectrum antifungalactivity”，J.of General Microbiology，7.2857-2865(1991))。因此，被分離的假單胞霉素A’和/或B’(包括水化物、溶劑化物及其酯)可以用于對植物體內的真菌的治療(特別是V.albo-atrum、R.solani以及F.oxysporum)，作為直接的處理或預防性處理均可。通常情況下，被感染的植物通過向其注射或噴灑假單胞霉素化合物的一種水化懸浮物來進行治療。注射的方法為本領域的技術人員所熟知(例如，gouge pistol)。可以使用任何可使有效量的活性物質分布于植物表面的噴灑懸浮物的方法。該懸浮物可含有其它的添加劑，這些添加劑通常為本領域的技術人員所使用，例如增溶劑、穩(wěn)定劑、加濕試劑及它們的組合。
對該植物的治療還可使用一種干組合物來完成，該組合物含有被分離的假單胞霉素A’和/或B’化合物。該干制劑可通過本領域的技術人員所知的任何方法而被應用于植物表面，例如從容器中噴出或搖出。
本發(fā)明可通過參考以下實施例而被更好地理解。這些實施例意圖顯示本發(fā)明的具體實施方案而非作為本發(fā)明的范圍的限定。
實施例保藏的生物材料丁香假單胞菌MSU 16H可公開地獲自American Type CultureCollection，Parklawn Drive，Rockville，MD，USA，其保藏號為No.ATCC 67028。丁香假單胞菌菌株25-B1、7H9-1和67H1于2000年3月23日保存于American Type Culture Collection，被指定為以下的Nos.
25-B1保藏編號No.PTA-16227H9-1保藏編號No.PTA-162367H1 保藏編號No.PTA-1621實施例1假單胞霉素A’和/或B’發(fā)酵方法經(jīng)開發(fā)以用于在一種丁香假單胞菌菌株的發(fā)酵肉湯中生產(chǎn)假單胞霉素A’和/或B’。材料和方法接種物的制備在液氮中的氣相中貯藏的一份細胞被融化并用于接種兩瓶900ml的CSM肉湯。CSM肉湯由以下成分組成(g/L)葡萄糖(5)、麥芽糖(4)、Difco胰酶大豆肉湯(30)、Difco酵母抽提物(3)以及MgSO47H2O(2)。約0.5mL的細胞被用于接種在2L的燒瓶中的900mL培養(yǎng)基。燒瓶被接種并在25℃下振蕩24小時。兩個燒瓶中的內含物一起被接種入一個150L的發(fā)酵罐，該罐中含有115L的滅菌過的發(fā)酵肉湯。
發(fā)酵階段發(fā)酵肉湯由以下成分組成(g/L)葡萄糖(20)、可溶淀粉(5)、Basic American Foods Country Style Potato Pearls土豆泥(30)、甘氨酸(1)、MgSO47H2O(0.2)、KCl(0.2)以及FeSO47H2O(0.004)，溶于自來水中。其pH在滅菌之前被調節(jié)至5.2。發(fā)酵在25℃下進行68小時。溶解的氧被維持在30％空氣飽和之上，這可以通過空氣氣流和攪拌器的攪拌速度的調節(jié)來進行。其pH通過添加H2SO4或NaOH而維持在4.0到5.4之間。
批量方法的變化簡單的批量加工的幾種變化也被發(fā)現(xiàn)可用于產(chǎn)生假單胞霉素A’和/或B’。在開始接種24后可以開始以60mL每小時的速度投放葡萄糖?？稍谡麄€發(fā)酵期間連續(xù)投放。或者，可以使用一種加工過程，在該過程中在開始接種24后開始維持溶解氧在5％的空氣飽和度，并且持續(xù)直至發(fā)酵結束。將溶解氧維持在5％通過向為發(fā)酵罐提供的空氣中添加惰性的氮氣(N2)來完成。在所有的情況下，空氣通過一根液面下的噴射管來提供，該管的開口位于發(fā)酵罐中的底部攪拌器螺旋之下。
結果和結論幾種發(fā)酵方法從丁香假單胞菌中產(chǎn)生假單胞霉素A’和/或B’。
實施例2假單胞霉素A’和B’的分離和純化開發(fā)了用于從丁香假單胞菌菌株的發(fā)酵肉湯中分離和純化假單胞霉素A’和/或B’的方法。材料和方法完整的發(fā)酵肉湯(4×100L)在收集之后以Membralox陶瓷濾器(0.45μm)進行過濾以產(chǎn)生一個過濾組分(級分A)和一個固體漿狀物(級分B)。以等體積的含0.1％的TFA的丙酮抽提級分B(135L)120分鐘并使其沉降。通過過濾分離出澄清的丙酮抽提物并隨后在真空中蒸發(fā)成含水溶液以產(chǎn)生級分C(88L)。首先，級分A被上樣于一個HP20ss樹脂柱(10L)，該柱以水填充并以含0.1％的TFA的15％的乙腈(20L)洗滌。隨后以級分C對同樣的柱子上樣并同上以20L含0.1％的TFA的15％的乙腈(20L)洗滌。
該柱隨后以含0.1％的TFA的15-20％乙腈線性梯度洗脫30分鐘，并以含0.1％的TFA的20-35％乙腈線性梯度洗脫60分鐘，流速為1L/分鐘。收集每一升的級分?；旌霞壏?-9(4L)以產(chǎn)生級分D(24g)。以級分D的一部分在一個反相柱(Dynamax C1841.4×250mm)上進行層析，使用三乙銨磷酸緩沖液(pH3)-乙腈-甲醇作為流動相(進行40分鐘的65∶17∶18到30∶35∶35的梯度洗脫，流速40ml/分鐘)?；旌线m當?shù)募壏?，體積減為75ml并在一個C18柱上同上使用80∶10∶10到46∶27∶27的梯度進行再次層析以產(chǎn)生級分E(113mg)和級分F(116mg)。級分E和F在C18柱上的進一步層析分別產(chǎn)生了45mg的假單胞霉素A’和62mg的假單胞霉素B’。結果和結論類似用于純化其它的假單胞霉素的HPLC方法導致了假單胞霉素A’和B’從發(fā)酵肉湯中的純化。
實施例3假單胞霉素A’和B’的結構測定假單胞霉素A’的結構測定材料和結果通過高分辨率FABMS測定了假單胞霉素A’的分子式為C52H89ClN12O20[C52H89ClN12O20(M+H)+的m/z為1237.6112，Δ-2.4ppm]。同假單胞霉素A相比較，假單胞霉素A’的分子式顯示了一個額外的CH2基團。該結果表明在假單胞霉素A’中N-末端的絲氨酸可能被3，4-二羥基十五烷酸酰化而非如在假單胞霉素A中被3，4-二羥基十四烷酸酰化。這一論點被以下事實支持，在先前特征被研究的所有假單胞霉素中，其核心具有一個獨特并相同的縮九肽并且唯一的區(qū)別是由疏水側鏈的性質所產(chǎn)生。
因此，其NMR譜數(shù)據(jù)于所有已知的假單胞霉素相同，如假單胞霉素A、B、C和C’。包括TOCSY和HMQC在內的以1H、13C和2D NMR譜進行的對假單胞霉素A’全面分析顯示了在其疏水側鏈上的3，4二醇功能性并且完成了在該分子上的所有質子和帶碳質子的排列(表1)。對假單胞霉素A’的結構的測定根據(jù)這些質譜數(shù)據(jù)進行，NMR數(shù)據(jù)在下文顯示。 質譜和NMR譜數(shù)據(jù)所產(chǎn)生的假單胞霉素A’結構表1 假單胞霉素A’在H2O+CD3CN中的1H和13C NMR數(shù)據(jù)
*Dab-1和Dab-2的排列可互換假單胞霉素B’的結構測定假單胞霉素B’的結構也是通過對質譜和NMR譜數(shù)據(jù)的解釋來完成的。通過高分辨率FAB-MS數(shù)據(jù)確定了分子式為C49H83ClN12O19[C49H83ClN12O19(M+H)+的m/z為1179.5685，Δ-1.8ppm]。該分子式顯示其比假單胞霉素B少兩個CH2。包括TOCSY和HMQC在內的以1H、13C和2D NMR譜進行的詳細分析以及該譜數(shù)據(jù)同其它已知的假單胞霉素的數(shù)據(jù)的比較再一次顯示了相同的氨基酸位置。另外，NMR數(shù)據(jù)顯示了3-羥基十二烷酸基團的存在(表2)。這樣，假單胞霉素B’的結構如下文顯示。
質譜和NMR譜數(shù)據(jù)所產(chǎn)生的假單胞霉素B’結構表2假單胞霉素B’在H2O+CD3CN中的1H和13C NMR數(shù)據(jù)
*Dab-1和Dab-2的排列可互換結論假單胞霉素A’和B’為脂縮酚九肽的一個獨特的家族的新成員。盡管這些分子非常接近地類似于已知的假單胞霉素而僅僅在疏水側鏈性質上有所區(qū)別，但它們應在闡明該類化合物作為抗真菌物的結構-活性的關系上起重要作用。
實施例4丁香假單胞菌的分離、特征研究和突變丁香假單胞菌的環(huán)境分離菌和突變體被產(chǎn)生并應用于抗真菌試劑的生產(chǎn)。材料和方法菌株MSU 174和MSU16-H被分離并且進行了特征研究，過程同美國專利No.5,576,298，該專利屬于Strobel等人，發(fā)布于1996年11月19日；Harrison et al.，J.“Pseudomycins，a a family ofnovel peptides from Pseudomonas syringae possessing broad-spectrum antifungal activity”，J.Gen.Microbiology，137，2857-2865(1991)；以及Lamb et al.，“Transposon mutagenesis andtagging of fluorescent pseudomonasAntimycotic production isnecessary for control of Sutch elm disease，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，6447-645l(1987)中描述。在本段落中的參考的披露在此引為參考。
額外的菌株通過化學突變而產(chǎn)自這樣的野生型和轉座子產(chǎn)生的突變體。用于突變的菌株包括MSU 174、MSU 16H和25-B1。在CSM培養(yǎng)基上生長待突變的菌株，隨后將之分入含有0、1、2、4、16或32μg/ml化學突變原1-甲基-3-氮-1-亞硝基胍(NTG或MNNG)的培養(yǎng)基。隨后凍存這些細胞以備檢測和選擇。
對突變細胞進行針對理想生長條件和/或一種或多種假單胞霉素的產(chǎn)生的選擇，例如假單胞霉素A’和/或假單胞霉素B’。丁香假單胞菌的化學突變體，例如，經(jīng)突變的菌株25-B1被融化并在N21SM培養(yǎng)基(表5)中稀釋至6細胞/ml。該培養(yǎng)基有時含有一種或多種用于選擇的組分，例如濃度不同的磷酸。50μL體積的突變細胞被分散入一個96孔圓底微滴度板中以使其平均0.3個細胞每孔。在典型情況下，向每孔中加入硅樹脂油以使蒸發(fā)最小化。該板在25℃下振蕩溫育6至12天。
表5-N21SM的組成
溫育之后，從各孔中取一份，在典型情況下取5TL進行一系列稀釋(例如，1∶56、1∶196、1∶320、1∶686和/或1∶1715)并且在液體微滴度板生物分析中檢測其抗假絲酵母菌albicans的活性。該板在37℃下溫育過夜，并且評測各孔中C.albicans生長的抑制。選出適當?shù)木辏臃N入CSM培養(yǎng)基(表6)，并且在25℃下生長1到3天。
表6.完全鏈霉素培養(yǎng)基(CSM)
被選擇的菌株被保存并接種入含13mL的N21SM培養(yǎng)基的發(fā)酵瓶中并在25℃下生長66小時。從該發(fā)酵物中取出一份，以等體積的乙腈抽提1小時，離心并倒出用于對一種或多種假單胞霉素的HPLC分析，例如假單胞霉素A’或B’，過程同實施例1-3。產(chǎn)生一種或多種假單胞霉素，例如產(chǎn)生假單胞霉素A’或B’的菌株被再次分離，重新發(fā)酵并準備用于大規(guī)模生長。結果通過上述方法產(chǎn)生了表現(xiàn)出諸如假單胞霉素A’或B’這樣的一種或多種假單胞霉素的產(chǎn)生的菌株。結論在此披露的選擇方法和標準可有效地用于產(chǎn)生可在最低限度培養(yǎng)基中生長并產(chǎn)生一種或多種假單胞霉素，例如產(chǎn)生假單胞霉素A’或B’的丁香假單胞菌菌株。
實施例5丁香假單胞菌的生長和假單胞霉素的生產(chǎn)丁香假單胞菌在培養(yǎng)基N21中的發(fā)酵產(chǎn)生假單胞霉素的水平適于分離，該培養(yǎng)基不含任何在已公開的媒體中使用過的用于丁香假單胞菌生長的馬鈴薯產(chǎn)品。假單胞霉素在振蕩燒瓶和N21培養(yǎng)基中的生產(chǎn)材料和方法在一個250mL燒瓶內的50mL N21培養(yǎng)基(表7)中生長丁香假單胞菌。以一小份丁香假單胞菌MSU 16H接種物起始該培養(yǎng)，并在一個孵育器中在25℃和70％濕度下維持250rpm振蕩7天。孵育結束時，從燒瓶中取出4mL肉湯并同6mL含有0.1％的磷酸的甲醇混合。據(jù)信低pH可使假單胞霉素穩(wěn)定。通過過濾或離心除去顆粒狀物質并且同上文通過HPLC測定假單胞霉素。
表7-N21培養(yǎng)基的組成
使用含有和不含添加的豆蔻酸甲酯的N21培養(yǎng)基對丁香假單胞菌的幾個菌株的假單胞霉素生產(chǎn)進行評測。經(jīng)評測的丁香假單胞菌的菌株包括MSU 16H、25-B1、67H1和7H9-1。結果當在有和不含添加的豆蔻酸甲酯的N21培養(yǎng)基中生長時，丁香假單胞菌的多種菌株產(chǎn)生水平明顯的一種或多種假單胞霉素，例如，高于10Tg/mL的假單胞霉素A、假單胞霉素B和/或假單胞霉素C的一種或多種。豆蔻酸甲酯刺激特定菌株的假單胞霉素生產(chǎn)。結論丁香假單胞菌的多種菌株在缺乏馬鈴薯產(chǎn)品的培養(yǎng)基中產(chǎn)生具商業(yè)價值的假單胞霉素，并且該生產(chǎn)可被豆蔻酸甲酯刺激。使用N21培養(yǎng)基在5,000L規(guī)模上生產(chǎn)假單胞霉素用于使用一種不含添加的馬鈴薯產(chǎn)品的培養(yǎng)基來生產(chǎn)假單胞霉素的方法被擴展到5,000升水平。材料和方法以凍存的假單胞霉素培養(yǎng)物對含有完全鏈霉素培養(yǎng)基的vegetative-stage燒瓶進行接種并且在25℃下以250rpm振蕩24小時，在典型情況下該培養(yǎng)物為菌株67H1。對這些vegetative-stage燒瓶溫育24小時后，這些燒瓶被用于接種bump-stage燒瓶。這些bump-stage燒瓶含有CSM培養(yǎng)基，維持在25℃下以250rpm搖轉。以來自三到四個vegetative-stage燒瓶的約0.45mL的收集的培養(yǎng)物對這些bump-stage燒瓶進行接種。該bump-stage燒瓶在典型情況下含有900mL的CSM，該CSM處于一個無塞的2.5L TunairTM燒瓶中。每個發(fā)酵罐設置兩個在TunairTM燒瓶中的bump-stage培養(yǎng)物，bump-stage燒瓶溫孵16小時。
隨后，通過在一個接種bazooka中混合來匯合兩個bump-stage培養(yǎng)物。這些混合的培養(yǎng)物被用來接種一個大罐，該罐含有在表15中描述的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基被補充以額外的3g/L的甘氨酸(總共4g/L)、1g/L大豆油以及1g/L的酵母抽提物。在25℃下生長這些大規(guī)模培養(yǎng)物3到4天。在這一生長期間，以攪拌和空氣流將溶解氧控制在30％的空氣飽和度。通過根據(jù)需要添加硫酸或氫氧化鈉來將pH控制在5.2±0.2。啟動大規(guī)模培養(yǎng)18個小時后開始以200mL/小時的速度加入葡萄糖。啟動大規(guī)模培養(yǎng)20個小時后開始以20mL/小時的速度加入氫氧化銨。在該培養(yǎng)期間，保持壓力為5psig。攪拌的起始設置為150rpm，空氣流為0.5scfm。如果需要，還可加入一種防泡沫試劑?？梢詼y試對這些條件的改動。三到四天的大規(guī)模培養(yǎng)后，收集該丁香假單胞菌。如實施例6測量抗真菌活性。結果與結論在5,000升規(guī)模下，使用不含添加的馬鈴薯產(chǎn)品生產(chǎn)了具有商業(yè)意義的量的假單胞霉素。
實施例6假單胞霉素的純化和測定通過抗真菌活性進行的假單胞霉素的檢測和定量一種假單胞霉素或幾種假單胞霉素的混合物的存在或量可通過測量一個制備物的抗真菌活性來測定。通過使用標準的瓊脂稀釋測試或碟分散測試(disc-diffusion test)而獲得該制備物的最低抑制濃度(MIC)來在體外測定抗真菌活性。一種或多種假單胞霉素的制備物可以是細胞培養(yǎng)物的一個抽提物或一種更加純化的混合物。用于測試抗真菌活性一種典型的真菌為C.albicans。當測試制備物在假絲酵母菌albicanx 657接種的瓊脂平板上導致10-12mm直徑抑菌圈時抗真菌活性被認為是明顯的。
根據(jù)臨床實驗室標準國家委員會(National Committee forClinical Laboratory Standard)的規(guī)定，抗真菌的研究使用在96孔板中的微滴度肉湯稀釋分析來進行。調節(jié)Sabourauds和葡萄糖肉湯至含有2.5×104分生孢子/ml。將測試化合物溶于水中并在起始于最高濃度為20μg/ml的二倍稀釋液中進行測試。平板在35℃下溫育48小時。表3和4的結果顯示了與未處理的生長參照相比該化合物的完全抑制生長的最低抑制濃度(MIC)。
表3.假單胞霉素A’的抗真菌活性
表4.假單胞霉素B’的抗真菌活性
通過HPLC對假單胞霉素的檢測和定量通過過濾或離心澄清一個據(jù)信含有一種或多種假單胞霉素的樣品。該澄清混合物在一個Zorbax RxC8柱(3.5T顆粒25×0.46cm)中以1ml/分鐘的流速進行層析。以含0.2％的TFA的20-55％的線性梯度的乙腈進行15分鐘的洗脫并在含0.2％的TFA的55％的乙腈中維持5分鐘。在典型的情況下，假單胞霉素A’在約13.7分鐘被洗脫(822秒)，假單胞霉素B’在約12.4分鐘被洗脫(822秒)。通過在215nm下的吸收檢測假單胞霉素并通過紫外峰的積分進行定量。各種假單胞霉素的標準被用于鑒定和定量。
實施例7含有假單胞霉素A’和/或B’的制劑以下的制劑實施例僅僅是闡釋性的，并不在任何方面對本發(fā)明進行限制。術語“活性組分”指的是假單胞霉素A’和/或B’或它們的藥學可接受的鹽。制劑1使用以下組分制備硬明膠膠囊
制劑2使用以下組分制備一種藥片。這些成分經(jīng)混合和壓縮以形成每片重665mg的藥片。
制劑3制備一種含有以下成分的氣溶膠溶液。將活性化合物同乙醇混合，并且將混合物加入氣霧發(fā)生劑22的一部分，冷凍至-30℃并且轉移至一個填充設備中。隨即將所需要的量加入不銹鋼容器中并以該氣霧發(fā)生劑剩下的部分進行稀釋。隨后為該容器裝上閥門裝置。
制劑4含有60mg活性組分的藥片如下配制
以該活性組分、淀粉和纖維素通過一個No.45網(wǎng)眼的US篩并完全混合。將含有聚乙烯吡咯烷酮的水溶液同所產(chǎn)生的這些粉末混合，隨后將該混合物通過一個No.14網(wǎng)眼的US篩。在50℃下干燥所產(chǎn)生的顆粒并且通過一個No.18網(wǎng)眼的US篩。先將羧甲基淀粉鈉、硬脂酸鎂和Talc通過一個No.60網(wǎng)眼的US篩，隨后將其加入該顆粒中，將這些物質混合后在一臺藥片機器上壓縮以產(chǎn)生重150mg的藥片。制劑5含有80mg活性組分的膠囊如下配制
將該活性組分、淀粉和纖維素混合后通過一個No.45網(wǎng)眼的US篩并且將其每200mg裝填入硬明膠膠囊。制劑6含有225mg活性組分的栓劑如下配制
以該活性組分通過一個No.60網(wǎng)眼的US篩并懸浮于飽和的脂肪酸甘油酯中，該酯事先使用所需的最低熱量進行融化。隨后將該混合物倒入一個普通的2克栓劑模具中并將其冷卻。制劑750mg活性組分每5ml劑量的懸浮物如下配制
將該活性組分通過一個No.45網(wǎng)眼的US篩并且將其同羧甲基纖維素鈉和糖漿混合以形成均勻的糊狀物。以一部分水稀釋安息香酸溶液、調味劑和色素并攪拌加入。隨后加入足量的水以產(chǎn)生所需體積。制劑8如下制備一種靜脈內制劑。這些組分的溶液通常以1ml每分鐘的速度對醫(yī)療對象進行靜脈內給藥。
本發(fā)明已經(jīng)參考多種具體和優(yōu)選的實施例以及工藝進行了描述。然而，應當考慮到在保持本發(fā)明的精髓和范圍的情況下可以做出許多的改動和修飾。
權利要求
1.一種被分離的假單胞霉素天然產(chǎn)品，該產(chǎn)品包括假單胞霉素、假單胞霉素B’、它們的一種混合物或它們的一種藥學可接受的鹽、水合物或酯。
2.權利要求1的假單胞霉素，該假單胞霉素包括假單胞霉素A’或其一種藥學可接受的鹽、水合物或酯。
3.權利要求2的假單胞霉素，該假單胞霉素具有以下結構式 或其一種藥學可接受的鹽、水合物或酯。
4.權利要求1的假單胞霉素，該假單胞霉素包括假單胞霉素B’或其一種藥學可接受的鹽、水合物或酯。
5.權利要求4的假單胞霉素，該假單胞霉素具有以下結構式 或其一種藥學可接受的鹽、水合物或酯。
6.一種被分離的化合物，該化合物具有以下結構式 或其一種藥學可接受的鹽、水合物或酯。
7.一種被分離的化合物，該化合物具有以下結構式 或其一種藥學可接受的鹽、水合物或酯。
8.一種抑制真菌活性的方法，該方法包括使一種真菌同一種被分離的假單胞霉素天然產(chǎn)品相接觸，該產(chǎn)品包括假單胞霉素A’、假單胞霉素B’、它們的一種混合物或它們的一種藥學可接受的鹽、水合物或酯。
9.權利要求8的方法，其中該假單胞霉素天然產(chǎn)品包括假單胞霉素A’或其一種藥學可接受的鹽、水合物或酯。
10.權利要求9的方法，其中該假單胞霉素天然產(chǎn)品具有以下結構式 或其一種藥學可接受的鹽、水合物或酯。
11.權利要求8的方法，其中該假單胞霉素天然產(chǎn)品包括假單胞霉素B’或其一種藥學可接受的鹽、水合物或酯。
12.權利要求11的方法，其中該假單胞霉素天然產(chǎn)品具有以下結構式 或其一種藥學可接受的鹽、水合物或酯。
13.權利要求8的方法，其中該真菌包括假絲酵母菌parasilosis、假絲酵母菌albicans、Crytococcus neoformans或Histoplasma capsulatum。
14.一種抑制真菌活性的方法，該方法包括使一種真菌同一種被分離的化合物相接觸，化合物具有以下結構式 或其一種藥學可接受的鹽、水合物或酯。
15.一種抑制真菌活性的方法，該方法包括使一種真菌同一種被分離的化合物相接觸，化合物具有以下結構式 或其一種藥學可接受的鹽、水合物或酯。
16.一種減輕有需要的患者的真菌感染癥狀的方法，該方法包括以有效量的組合物對該患者進行給藥，該組和物含有一種被分離的假單胞霉素天然產(chǎn)品，該產(chǎn)品包括假單胞霉素A’、假單胞霉素B’、它們的一種混合物或它們的一種藥學可接受的鹽、水合物或酯。
17.權利要求16的方法，其中該假單胞霉素天然產(chǎn)品包括假單胞霉素A’或其一種藥學可接受的鹽、水合物或酯。
18.權利要求17的方法，其中該假單胞霉素天然產(chǎn)品具有以下結構式 或其一種藥學可接受的鹽、水合物或酯。
19.權利要求16的方法，其中該假單胞霉素天然產(chǎn)品包括假單胞霉素B’或其一種藥學可接受的鹽、水合物或酯。
20.權利要求19的方法，其中該假單胞霉素天然產(chǎn)品具有以下結構式 或其一種藥學可接受的鹽、水合物或酯。
21.權利要求16的方法，其中該真菌包括假絲酵母菌parasilosis、假絲酵母菌albicans、Crytococcus neoformans或Histoplasma capsulatum。
22.權利要求1、2、3、4、5、6或7的化合物在一種藥物組合物的制造中的應用，該藥物組合物用于抑制真菌活性。
23.權利要求1、2、3、4、5、6或7的化合物在一種藥學組合物的制造中的應用，該藥物組合物用于抑制真菌活性或減輕患者體內的真菌感染的癥狀。
全文摘要
本發(fā)明涉及到假單胞霉素天然產(chǎn)品,本發(fā)明包括假單胞霉素A’和B’、用于制造這樣的假單胞霉素的方法和使用這些假單胞霉素的抗真菌活性的方法,NMR和質譜顯示的結構式(I)為假單胞霉素A’,NMR和質譜顯示的結構式(II)為假單胞霉素B’。
文檔編號A61P31/10GK1355812SQ00806258
公開日2002年6月26日 申請日期2000年4月14日 優(yōu)先權日1999年4月15日
發(fā)明者帕蘭尼亞潘·庫蘭泰維爾, 馬修·戴維·貝爾沃, 詹姆斯·威廉·馬丁, 小托馬斯·約翰·帕朗, 道格拉斯·約瑟夫·澤克納 申請人:伊萊利利公司