專(zhuān)利名稱(chēng)：T細(xì)胞受體的Vβ－Dβ－Jβ序列及其檢測(cè)方法
背景技術(shù)：
按照來(lái)自國(guó)立衛(wèi)生研究院的撥款號(hào)NS36140，美國(guó)政府可以擁有本發(fā)明中的權(quán)利。
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總的來(lái)講涉及治療自身免疫病的領(lǐng)域，所述自身免疫病例如多發(fā)性硬化(MS)。更詳細(xì)地講，本發(fā)明涉及一種在某些MS患者中發(fā)現(xiàn)的T細(xì)胞受體序列以及檢測(cè)它的方法。
2.相關(guān)技術(shù)的描述在人和其它哺乳動(dòng)物中，在T細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)了T細(xì)胞受體。T細(xì)胞受體包括α鏈和β鏈；β鏈從N-末端至C-末端包含下面區(qū)域Vβ-Dβ-Jβ-Cβ。在Vβ-Dβ-Jβ區(qū)域中，T細(xì)胞受體由天然的變化。
當(dāng)由呈遞抗原細(xì)胞(APC)呈遞一抗原給T細(xì)胞時(shí)，具有偶然發(fā)生的、識(shí)別該抗原的可變區(qū)域(包括Vβ-Dβ-Jβ)的T細(xì)胞受體結(jié)合所述APC上的該抗原。然后，具有該T細(xì)胞受體的T細(xì)胞受到活化(克隆擴(kuò)充)。
人們認(rèn)為許多自身免疫病的發(fā)病機(jī)理在于自身免疫T細(xì)胞對(duì)由所述有機(jī)體正常呈遞的抗原的反應(yīng)。這樣的疾病的一個(gè)實(shí)例是多發(fā)性硬化(MS)；認(rèn)為MS是由于T細(xì)胞對(duì)髓磷脂抗原且尤其是對(duì)髓磷脂堿性蛋白(MBP)的反應(yīng)而引起的。人們發(fā)現(xiàn)MBP反應(yīng)性T細(xì)胞在體內(nèi)受到活化，且與對(duì)照個(gè)體不同，MBP反應(yīng)性T細(xì)胞在MS病人血液和腦脊髓液中以較高的前體頻率出現(xiàn)。這些MBP反應(yīng)性T細(xì)胞產(chǎn)生Th1細(xì)胞因子，例如IL-2、TNF、以及γ-干擾素。這些Th1細(xì)胞因子促進(jìn)炎性細(xì)胞移動(dòng)到中樞神經(jīng)系統(tǒng)中去，并使MS中的髓磷脂破壞性的炎性反應(yīng)加劇。
在MS的治療方面，可以利用許多調(diào)節(jié)機(jī)制。一種這樣的機(jī)制是用數(shù)目有限的具有胞外域的T細(xì)胞膜結(jié)合肽中一種或更多種接種。Vandenbark的美國(guó)專(zhuān)利5,614,192公開(kāi)了利用至少包含T細(xì)胞受體第二互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR2)的一部分的15至30個(gè)氨基酸的免疫源性T細(xì)胞受體肽來(lái)治療自身免疫病。Zhang的同時(shí)待審的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)(60/099,102)公開(kāi)了利用免疫源性T細(xì)胞受體肽和免疫源性T細(xì)胞活化標(biāo)記肽來(lái)聯(lián)合治療自身免疫病。
可以改善用T細(xì)胞受體肽接種的一個(gè)領(lǐng)域是靠確定哪一些共同基序(如果有的話)存在于例如MS的自身免疫病患者的T細(xì)胞受體中。如果發(fā)現(xiàn)這樣的基序，那么，為了便于治療，可以用和所述基序等同的肽接種該患者。
因此，最好是有在自身免疫病患者的T細(xì)胞受體中發(fā)現(xiàn)的共同基序的氨基酸序列。同樣，最好是能夠用一種方便的方法例如PCR在患者的樣品中很快檢測(cè)出這樣的基序。另外，最理想的是用與所檢測(cè)出的基序等同的肽來(lái)治療患有該自身免疫病的患者。
本發(fā)明公開(kāi)了在Vβ13.1 T細(xì)胞亞群的T細(xì)胞受體中發(fā)現(xiàn)的這樣的共同基序以及一種用PCR快速檢測(cè)它的方法；所述共同基序即“LGRAGLTY”基序，該基序具有Leu Gly Arg Ala Gly Leu Thr Tyr(SEQID NO3)的氨基酸序列。在識(shí)別MBP的83-99號(hào)氨基酸(在下文為“MBP83-99”)的某些T細(xì)胞的一些T細(xì)胞受體中發(fā)現(xiàn)了這種基序。在下文中，可將在這種Vβ13.1 T細(xì)胞亞群環(huán)境(context)中的所述基序稱(chēng)為“Vβ13.1-LGRAGLTY”。為了治療或預(yù)防與Vβ13.1-LGRAGLTY有關(guān)的自身免疫病，可以用和該基序等同的肽來(lái)給患者接種。一種這樣的自身免疫病是多發(fā)性硬化(MS)。
在一系列另外的實(shí)施方案中，可以將該寡核苷酸用于擴(kuò)增或檢測(cè)在Vβ13.1-LGRAGLTY T細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的核酸序列。在這樣的實(shí)施方案的一個(gè)亞系列中，將所述寡核苷酸用于一種引物對(duì)中，該引物對(duì)包括或衍生自(a)第一引物，它是長(zhǎng)度約15至30個(gè)核苷酸的寡核苷酸，且包括SEQ ID NO1的至少10個(gè)鄰接核苷酸或與其互補(bǔ)的一種序列，以及(b)第二引物，它為長(zhǎng)度約15至30個(gè)核苷酸且不包括序列(a)的寡核苷酸，并且所述第二引物序列可以發(fā)現(xiàn)于T細(xì)胞受體T細(xì)胞中Vβ13.1基因的Vβ至Jβ的區(qū)域(SEQ ID NO2)中，其中，序列(a)和序列(b)不存在于所述T細(xì)胞受體基因的同一條鏈上。
所述第一引物優(yōu)選為一種長(zhǎng)度約15至30個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該種寡核苷酸包括SEQ ID NO1的11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23個(gè)鄰接核苷酸、或者與其互補(bǔ)的序列。最優(yōu)選一種長(zhǎng)度約15至30個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該種寡核苷酸包括SEQID NO1的核苷酸序列或與其互補(bǔ)的序列。
在這樣的實(shí)施方案的另一個(gè)亞系列中，將所述寡核苷酸用作寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針包括(a)長(zhǎng)度約為15至30個(gè)核苷酸的寡核苷酸，且該寡核苷酸包括SEQID NO1的至少10個(gè)鄰接核苷酸或與其互補(bǔ)的一種序列，以及(b)一個(gè)標(biāo)記部分。
所述寡核苷酸最好是長(zhǎng)度約15至30個(gè)核苷酸的寡核苷酸，且該種寡核苷酸包括SEQ ID NO1的11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23個(gè)鄰接核苷酸、或者與其互補(bǔ)的一種序列。最優(yōu)選的是一種長(zhǎng)度約15至30個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該種寡核苷酸包括SEQ ID NO1的核苷酸序列或與其互補(bǔ)的序列。最好所述標(biāo)記部分選自32P或地高辛配基。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及檢測(cè)表達(dá)LGRAGLTY基序的MBP83-99Vβ13.1 T細(xì)胞的方法，所述方法包括(i)從MBP83-99Vβ13.1 T細(xì)胞中獲得核酸樣品；(ii)使所述核酸樣品與一種引物對(duì)接觸，所述引物對(duì)選自或衍生自(a)包含長(zhǎng)度約15至30個(gè)核苷酸的寡核苷酸的第一引物，且所述第一引物包括SEQ ID NO1的至少10個(gè)鄰接核苷酸或與其互補(bǔ)的一種序列或由其衍生的一種序列，以及(b)包含長(zhǎng)度約15至30個(gè)核苷酸的寡核苷酸的第二引物，所述寡核苷酸不包含序列(a)，且發(fā)現(xiàn)于Vβ13.1 T細(xì)胞的Vβ13.1基因的Vβ至Jβ的區(qū)域(SEQ ID NO2)中，其中，序列(a)和序列(b)不存在于Vβ13.1基因的同一條鏈上；以及，(iii)檢測(cè)編碼LGRAGLTY基序的核酸的存在。
所述第一引物最好是長(zhǎng)度約15至30個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該種寡核苷酸包括SEQ ID NO的11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23個(gè)鄰接核苷酸、或者與其互補(bǔ)的一種序列。最優(yōu)選的是一種長(zhǎng)度約15至30個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該種寡核苷酸包括SEQ ID NO1的核苷酸序列或與其互補(bǔ)的序列。
而在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療自身免疫病的一種方法，所述方法包括(a)從一個(gè)人獲得MBP83-99Vβ13.1 T細(xì)胞；(b)用上述方法檢測(cè)編碼LGRAGLTY基序的核酸的存在；且如果檢測(cè)出該核酸，則(c)將一種Leu Gly Arg Ala Gly Leu Thr Tyr(SEQ ID NO3)肽給予所述的人。
在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及監(jiān)測(cè)自身免疫病的一種方法，所述方法包括(a)從一個(gè)人獲得MBP83-99Vβ13.1 T細(xì)胞；(b)用上述方法檢測(cè)編碼LGRAGLTY基序的核酸的存在；且如果檢測(cè)出該核酸，則(c)定量測(cè)定定該核酸。


圖1顯示了用于PBMC衍生出的PCR產(chǎn)物的克隆及測(cè)序的實(shí)驗(yàn)步驟。用5’Vβ13.1引物和3’Jβ引物從表達(dá)LGRAGLTY基序的四個(gè)陽(yáng)性PBMC樣品擴(kuò)增衍生自PBMC樣品的cDNA，并將其連接到TA克隆載體pCR2.1中，且將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。運(yùn)用一種M13引物及LGRAGLTY特異性引物，通過(guò)PCR，篩選質(zhì)粒DNA。測(cè)定通過(guò)PCR顯示出明顯擴(kuò)增的陽(yáng)性質(zhì)粒的序列，以證實(shí)存在帶有一個(gè)Vβ13.1引物的Vβ-Dβ-Jβ序列。
圖2表明了兩種MBP83-99 T細(xì)胞克隆對(duì)具有單個(gè)丙氨酸取代的類(lèi)似肽的反應(yīng)方式。在[3H]-胸苷摻入分析中，檢查了顯示出完全相同的Vβ13.1重排(對(duì)于MS7-E2.6和MS27-C3.1)和一種類(lèi)似的Vα-Jα連接序列(對(duì)于MS7-E2.6和MS7-E3.1)的兩對(duì)MBP83-99 T細(xì)胞克隆對(duì)于對(duì)一組丙氨酸取代的肽的反應(yīng)性。將表達(dá)DRB1*1501的一種小鼠成纖維細(xì)胞細(xì)胞系用作呈遞抗原細(xì)胞之源。在72小時(shí)后，測(cè)定所述克隆對(duì)每種類(lèi)似肽的增殖反應(yīng)，并以摻入的CPM的形式描述結(jié)果。影線框意味著由于對(duì)類(lèi)似肽的反應(yīng)而T細(xì)胞克隆的增殖減少＞50％。
圖3顯示了CDR3寡核苷酸對(duì)原始T細(xì)胞克隆和不相關(guān)的T細(xì)胞克隆的特異性的交叉檢查。檢查了對(duì)TCR VDJ區(qū)域特異性的一組寡核苷酸在檢測(cè)在原始MBP83-99 T細(xì)胞克隆中以及在得自同一個(gè)體和不同個(gè)體的不相關(guān)MBP83-99 T細(xì)胞克隆中存在的已知靶DNA序列方面的特異性。用CDR3-特異性寡核苷酸作為正向引物且用3’-Cβ引物作為反向引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。實(shí)心框表示存在于原始T細(xì)胞克隆中或者存在于分享相同CDR3序列之T細(xì)胞克隆中的DNA序列的陽(yáng)性檢測(cè)。也檢查了所有引物與具有不相關(guān)CDR3序列的、隨機(jī)選擇的T細(xì)胞克隆之DNA產(chǎn)物的結(jié)合(影線框)。
圖4顯示了在隨機(jī)選擇的得自MS患者的PBMC樣品中、互補(bǔ)于基序Vβ13.1-LGRAGLTY的靶DNA序列的檢測(cè)。首先在RT-PCR中用一種5’-Vβ13.1特異性引物及一種3’-Cβ引物來(lái)擴(kuò)增由PBMC樣品制備的cDNA，所述PBMC樣品來(lái)自隨機(jī)挑選的MS患者(n＝48)，而且隨后，使所述擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物與一種地高辛配基標(biāo)記的、LGRAGLTY基序特異性寡核苷酸探針雜交。將原始MBP83-99克隆(MS7-E2.6)和一種不相關(guān)的T細(xì)胞克隆(MS32-B9.8)相應(yīng)地分別用作陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照。MS-7和MS-27是從中得到克隆MS7-E2.6(表1中的MS-7)和克隆MS27-C3.1(表1中的MS-27)的原始PBMC樣品。星號(hào)表示DRB1*1501的陽(yáng)性表達(dá)。
圖5顯示了得自正常受實(shí)驗(yàn)者的、隨機(jī)選擇的PBMC樣品中Vβ13.1-LGRAGLTY基序的檢測(cè)。在與圖4的說(shuō)明中描述的條件相同的條件下，分析了得自20個(gè)正常受實(shí)驗(yàn)者(NS)的PBMC樣品。將原始克隆(MS7-E2.6)和一種不相關(guān)的T細(xì)胞克隆(MS32-B9.8)相應(yīng)地分別用作陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。星號(hào)表示DRB1*1501的陽(yáng)性表達(dá)。
圖6顯示了得自MS患者與正常受實(shí)驗(yàn)者的PBMC樣品中LGRAGLTY基序表達(dá)的半定量比較。通過(guò)半定量PCR，分析在得自MS個(gè)體和正常個(gè)體的PBMC的每種cDNA中相對(duì)于所述Cβ表達(dá)的基序Vβ13.1-LGRAGLTY的表達(dá)。以(LGRAGLTY基序的表達(dá)/Cβ的表達(dá))x100％的形式來(lái)計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。
圖7顯示了在得自MS患者的短時(shí)(short-term)MBP83-99 T細(xì)胞系中檢測(cè)到Vβ13.1-LGRAGLTY基序。使用一種MBP的合成83-99肽，從5位MS患者產(chǎn)生一組獨(dú)立的短時(shí)MBP83-99 T細(xì)胞系。進(jìn)一步證實(shí)所有這些T細(xì)胞系對(duì)MBP83-99肽的特異性反應(yīng)(對(duì)MBP83-99應(yīng)答的CPM/對(duì)照的CPM＞5)。在PCR中，用一種5’-Vβ13.1特異性引物和一種3’-Cβ引物來(lái)擴(kuò)增cDNA產(chǎn)物。隨后在DNA印跡分析中，將所述擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物與地高辛配基標(biāo)記的、對(duì)應(yīng)于Vβ13.1-LGRAGLTY基序的寡核苷酸探針雜交。將得自所述原始MBP83-99克隆(MS7-E2.6)的cDNA產(chǎn)物以及得自一種不相的T細(xì)胞克隆(MS32-B9.8)的cDNA產(chǎn)物分別用作陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。
“PCR”意指聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。例如，如在美國(guó)專(zhuān)利第4,683,202號(hào)(1987年7月28日授予Mullins)中一般地描述的，該專(zhuān)利通過(guò)引用結(jié)合到本文中。PCR是一種擴(kuò)增技術(shù)，其中，在存在一種聚合劑(例如聚合酶)和四種核苷三磷酸的情況下，使選定寡核苷酸或引物雜交到核酸模板上，并從所述引物形成延伸的產(chǎn)物。然后，將這些產(chǎn)物變性，并在一個(gè)擴(kuò)增所存在的核酸數(shù)目和數(shù)量的循環(huán)反應(yīng)中(將變性產(chǎn)物)用作模板，從而便于這些產(chǎn)物的隨后的檢測(cè)。各種各樣的PCR技術(shù)都是可用的，并且可將其與按照本發(fā)明的方法一起使用。
“引物”意指能夠用作DNA合成起始點(diǎn)的、在互補(bǔ)于模板分子上一段特定DNA序列的寡核苷酸；所述寡核苷酸或者是天然的，或者是合成的。
在術(shù)語(yǔ)“衍生自…的引物或探針”的范圍里，“衍生自”意指該引物或探針不限于所列舉的核苷酸序列，而是也包括所列舉的核苷酸序列的變異，所述變異包括核苷酸的添加、缺失、或取代，所述變異達(dá)到這樣的程度，以至對(duì)所列舉序列的變異保留在編碼該Vβ13.1-LGRAGLTY序列即Leu Gly Arg Ala Gly Leu Thr Tyr(SEQ ID NO3)的T細(xì)胞受體DNA的檢測(cè)中作為引物的能力。
當(dāng)將“免疫原性的”用來(lái)描述一種肽時(shí)，“免疫原性的”意指該肽能夠誘發(fā)一種免疫應(yīng)答；該免疫應(yīng)答或者是T細(xì)胞介導(dǎo)的，或是抗體的，或者是上述兩者介導(dǎo)的。“抗原性的”意指該肽能以游離形式被抗體識(shí)別；且在抗原特異性T細(xì)胞的情況下，則意指在MHC分子的環(huán)境中。
“免疫相關(guān)疾病”意指在該病的發(fā)病機(jī)理方面與免疫系統(tǒng)有關(guān)的疾病。免疫相關(guān)疾病的一個(gè)亞類(lèi)是自身免疫病。本發(fā)明考慮的自身免疫病包括但不限于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、重癥肌無(wú)力、多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、自身免疫性甲狀腺炎(Hashimoto’s甲狀腺炎)、格雷夫斯氏(Graves’)病、炎性腸病、自身免疫性眼色素層視網(wǎng)膜炎、多肌炎、以及某些類(lèi)型的糖尿病。根據(jù)本說(shuō)明書(shū)，本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員可很快地察覺(jué)能用本發(fā)明組合物和方法治療的其它自身免疫病?！癟細(xì)胞介導(dǎo)的疾病”意指在有機(jī)體中由于T細(xì)胞識(shí)別在該有機(jī)體中正常存在的肽而導(dǎo)致的疾病。
當(dāng)涉及保護(hù)動(dòng)物免受一種疾病時(shí)，“治療”或“醫(yī)治”意指預(yù)防、壓制、或抑制該疾病。預(yù)防該疾病涉及在該疾病誘發(fā)之前將本發(fā)明的一種組合物給予動(dòng)物。壓制該疾病涉及在該疾病誘發(fā)之后但在其臨床顯露之前將本發(fā)明的一種組合物給予動(dòng)物。抑制該疾病涉及在該疾病臨床顯露之后將本發(fā)明的一種組合物給予動(dòng)物。人們將意識(shí)到在人類(lèi)醫(yī)學(xué)方面，人們不能總是知道將在疾病誘導(dǎo)過(guò)程中的什么時(shí)候給予本發(fā)明的一種組合物。
在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包括下述引物的序列或衍生自下述引物的引物對(duì)(a)第一引物，它是長(zhǎng)度約為15至30個(gè)核苷酸的寡核苷酸，且包括SEQ ID NO1的至少10個(gè)鄰接核苷酸或與其互補(bǔ)的核酸序列；以及(b)第二引物，它是長(zhǎng)度約15至30個(gè)核苷酸且不包括序列(a)的寡核苷酸，并且發(fā)現(xiàn)于Vβ13.1 T細(xì)胞T細(xì)胞受體基因的Vβ至Jβ的區(qū)域中，其中，序列(a)和序列(b)不存在于T細(xì)胞受體基因的同一條鏈上。
所述第一引物優(yōu)選為一種長(zhǎng)度約15至30個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該種寡核苷酸包括SEQ ID NO1的11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23個(gè)鄰接核苷酸、或者與其互補(bǔ)的一種序列。最優(yōu)選的是一種長(zhǎng)度約15至30個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該種寡核苷酸包括SEQ ID NO1的核苷酸序列或與其互補(bǔ)的序列。
設(shè)計(jì)根據(jù)本發(fā)明的引物，來(lái)擴(kuò)增編碼人Vβ13.1 T細(xì)胞的T細(xì)胞受體的基因片段；該片段包含一種氨基酸基序Leu Gly Arg Ala Gly LeuThr Tyr(SEQ ID NO3)。已將來(lái)自Vβ13.1 T細(xì)胞、編碼所述包含LGRAGLTY基序的T細(xì)胞受體的基因提交給GenBank，登記號(hào)為AF117132。在本文中，將來(lái)自Vβ13.1 T細(xì)胞、編碼所述包含LGRAGLTY基序的T細(xì)胞受體的基因序列作為SEQ ID NO2而提出。在按照本發(fā)明的方法中，用兩種引物擴(kuò)增來(lái)自Vβ13.1 T細(xì)胞的、大約400bp的T細(xì)胞受基因的片段；其中，所述第一引物在CDR3區(qū)中，而所述第二引物在Cβ區(qū)中。所述T細(xì)胞受體基因的Vβ-Dβ-Jβ區(qū)域?qū)⒃谠揅DR3區(qū)和Cβ區(qū)之間，并且包括CDR3區(qū)和Cβ區(qū)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述引物為上面描述的引物對(duì)。
按照本發(fā)明的引物也包括衍生自引物(a)-(b)的寡核苷酸。如果一種序列具有或包含與所述引物的一種序列基本上相同的序列、且保留了選擇性地退火到與上述大致相同的來(lái)自Vβ13.1 T細(xì)胞的T細(xì)胞受體基因之Vβ-Dβ-Jβ區(qū)域的CDR3區(qū)或Cβ區(qū)的能力，則這一種序列衍生自引物(a)或(b)。更詳細(xì)地講，只要該引物保留對(duì)來(lái)自Vβ13.1 T細(xì)胞的T細(xì)胞受體基因之Vβ-Dβ-Jβ區(qū)域的識(shí)別區(qū)域的選擇性，則在長(zhǎng)度上該引物可以不同于引物(a)或(b)，或者在沿著該序列的一個(gè)或更多個(gè)的位置上，由于核酸的種類(lèi)而不同于引物(a)或(b)。例如，該引物可以是一種至少具有15個(gè)核苷酸的寡核苷酸，其中，所述15個(gè)核苷酸與選自或衍生自引物(a)-(b)的一種序列的一系列15個(gè)鄰接的核酸等同。所述引物也可以是約30個(gè)核苷酸或更少核苷酸的、包含一個(gè)具有選自或衍生自引物(a)-(b)的任一種序列之區(qū)段的任一寡核苷酸。該引物的核苷酸數(shù)應(yīng)該大到足以保持選擇性，而又要小到足以保留在引物合成和該P(yáng)CR步驟中的功效和可操作性。所述引物可以具有各種變異，所述變異包括核苷酸的缺失、添加或取代，所述變異達(dá)到這樣程度，以至這些相對(duì)于引物(a)-(b)之序列的變異保留在Vβ13.1-LGRAGLTY檢測(cè)中作為引物的能力。
在檢測(cè)樣品中任何Vβ13.1-LGRAGLTY存在的一個(gè)步驟中，按照本發(fā)明的Vβ13.1-LGRAGLTY檢測(cè)方法使用一對(duì)上述的引物。待測(cè)定Vβ13.1-LGRAGLTY存在的樣品是一種核酸，最好是DNA。該DNA可以是基因組DNA、cDNA、預(yù)先通過(guò)PCR擴(kuò)增的DNA、或任何其它形式的DNA?？梢灾苯踊蜷g接地從表達(dá)T細(xì)胞受體β鏈基因的任何動(dòng)物或人機(jī)體組織中分離該樣品。一種優(yōu)選的機(jī)體組織為外周血單核細(xì)胞(PBMC)。如果該樣品為基因組DNA，則可以直接從機(jī)體組織中分離它。如果該樣品是cDNA，則可以通過(guò)直接從該機(jī)體組織中分離的mRNA的逆轉(zhuǎn)錄，來(lái)間接地分離它。如果該樣品是預(yù)先通過(guò)PCR擴(kuò)增的DNA，則通過(guò)基因組DNA、cDNA、或任何其它形式DNA的擴(kuò)增，來(lái)間接地分離它。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將來(lái)自Vβ13.1 T細(xì)胞的T細(xì)胞受體基因的一部分即包括編碼LGRAGLTY基序的一段序列的部分?jǐn)U增，從而增強(qiáng)檢測(cè)Vβ13.1-LGRAGLTY(5’-CTAGGGCGGGCGGGACTCACCTAC-3’(SEQ ID NO1)存在的能力。運(yùn)用提供樣品中所述部分的靈敏、選擇性及快速擴(kuò)增的任一特定的PCR技術(shù)或設(shè)備，可以通過(guò)一個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)而進(jìn)行所述的擴(kuò)增。
例如，所述PCR擴(kuò)增可以采用一種方法，其中，制備一種包括下面成分的反應(yīng)混合物5μl 10×PCR緩沖液II(100mM Tris-HCl，pH 8.3，500mM KCl)、3μl 25mM MgCl2、1μl 10mM dNTP混合物、0.3μlTaq聚合酶(5U/μl)(AmpliTaq Gold，Perkin Elmer，Norwalk，CT)、30pmol的引物A、以及30pmol的引物B。根據(jù)本說(shuō)明書(shū)，為了用PCR來(lái)擴(kuò)增來(lái)自Vβ13.1 T細(xì)胞的T細(xì)胞受體基因的所述部分，技術(shù)人員將能夠選擇合適的引物A和引物B。上述混合物對(duì)于擴(kuò)增1μl的DNA樣品是合適的。在下文中，可以把待擴(kuò)增的DNA稱(chēng)為“模板”。
一旦將樣品DNA加入到上述反應(yīng)混合物中，就可以以一種擴(kuò)增分布型(profile)來(lái)進(jìn)行所述PCR反應(yīng)，所述擴(kuò)增分布型即每個(gè)循環(huán)為在95℃ 1分鐘(變性)、在56℃ 20秒(退火)、以及在72℃ 40秒(延伸)，循環(huán)的總數(shù)為35次。
在所述PCR反應(yīng)中，可加熱變性該模板，并退火到兩種寡核苷酸引物上。所述寡核苷酸給打算擴(kuò)增的核酸序列區(qū)域裝上“托架”。在該反應(yīng)混合物中，包括一種熱穩(wěn)定性DNA聚合酶。通過(guò)加入合適的互補(bǔ)核苷酸，該聚合酶使退火到互補(bǔ)DNA的所述引物延長(zhǎng)。優(yōu)選的聚合酶具有在至少95℃的溫度下穩(wěn)定的特性、具有50-60的持續(xù)合成能力以及具有大于每分鐘50個(gè)核苷酸的延伸速率。
在一個(gè)典型的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，大約運(yùn)用40次PCR循環(huán)。然而，某些PCR反應(yīng)可以同少以15到20次的循環(huán)或多達(dá)50次的循環(huán)運(yùn)行。每個(gè)循環(huán)包括一個(gè)解鏈步驟，在該步驟中將所述模板加熱到超過(guò)大約95℃的溫度。
然后，使該P(yáng)CR反應(yīng)的溫度降低，以讓所述引物退火至該模板。在這個(gè)退火步驟中，將該反應(yīng)的溫度調(diào)節(jié)到大約55℃至72℃之間達(dá)大約20秒；可以根據(jù)具體的反應(yīng)而進(jìn)行較長(zhǎng)的時(shí)間或較短的時(shí)間。
然后，使該P(yáng)CR反應(yīng)的溫度升高，以允許由該聚合酶引起的所述引物的最大延伸。在這個(gè)延伸步驟中，將該反應(yīng)的溫度調(diào)節(jié)到大約70℃至75℃之間達(dá)大約40秒?？梢愿鶕?jù)具體的反應(yīng)而使用較高或較低的溫度和/或較長(zhǎng)或較短的時(shí)間。
另外，在開(kāi)始第一次循環(huán)之前，可以使該反應(yīng)混合物在大約5分鐘至15分鐘的期間里經(jīng)受初次變性。類(lèi)似地，在完成最后的循環(huán)之后，可以使該反應(yīng)混合物在大約5分鐘至10分鐘的期間里經(jīng)受最后的延伸。
可以用兩步PCR來(lái)完成擴(kuò)增。在這種技術(shù)方面，為了擴(kuò)增比一個(gè)目的區(qū)域大的、且包括目的區(qū)域的第一區(qū)域，進(jìn)行第一個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)。然后，用該第一區(qū)域作為模板，進(jìn)行第二個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以擴(kuò)增目的區(qū)域。如果來(lái)自所述第一個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的任一引物可被用于第二個(gè)PCR反應(yīng)，則所述第二個(gè)PCR反應(yīng)是“半嵌套式的”。如果來(lái)自所述第一個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的引物沒(méi)有一個(gè)可被用于第二個(gè)PCR反應(yīng)，則所述第二個(gè)PCR反應(yīng)是“嵌套式的”。
在使用本發(fā)明方法的一種優(yōu)選方式中，通過(guò)兩步PCR來(lái)擴(kuò)增Vβ13.1-LGRAGLTY基序。在第一個(gè)PCR反應(yīng)中，使用該反應(yīng)混合物和上面公開(kāi)的分布型，用退火到所述T細(xì)胞受體基因的Vβ區(qū)的第一引物和退火到所述T細(xì)胞受體基因的Cβ區(qū)的第二引物擴(kuò)增該樣品。所述第一個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增大約為600bp的第一區(qū)域，且從Vβ經(jīng)過(guò)Vβ-Dβ-Jβ連接，延伸至Cβ。所述第二個(gè)PCR反應(yīng)是嵌套式的或半嵌套式的；用引物對(duì)(a)-(b)部分地?cái)U(kuò)增該第一區(qū)域的一部分。所述第二個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的區(qū)域。
在擴(kuò)增了所述樣品中任何編碼Vβ13.1-LGRAGLTY的DNA之后，檢測(cè)這種擴(kuò)增的產(chǎn)物。可以用許多方法完成這種檢測(cè)。例如，可以將擴(kuò)增產(chǎn)物的一份等分試樣加樣到電泳凝膠上，對(duì)該凝膠施加一個(gè)電場(chǎng)，從而按大小分離DNA分子。在另一個(gè)方法中，把擴(kuò)增產(chǎn)物的一份等分試樣加樣到用SYBR綠、溴化乙錠、或?qū)⒔Y(jié)合到DNA上并發(fā)出一種可檢測(cè)信號(hào)之另一種分子染色的電泳凝膠上。例如，溴化乙錠結(jié)合到DNA上，且當(dāng)用紫外光照射時(shí)，發(fā)出可見(jiàn)光。一塊干的凝膠可兩者擇一地包含互補(bǔ)于所擴(kuò)增的模板序列一部分的放射性標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記的寡核苷酸(在下文可將其稱(chēng)為“寡核苷酸探針”)；通過(guò)把所述凝膠對(duì)膠片曝光，由該凝膠記錄下放射自顯影。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及寡核苷酸探針，其包括(a)一種長(zhǎng)度約15至30個(gè)核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含SEQ ID NO1的至少10個(gè)鄰接核苷酸或與其互補(bǔ)的核酸序列；以及
(b)一個(gè)標(biāo)記的部分。
“(a)”最好是一種長(zhǎng)度約15至30個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該寡核苷酸包括SEQ ID NO1的11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23個(gè)鄰接核苷酸、或與其互補(bǔ)的序列。最優(yōu)選的是一種長(zhǎng)度約15至30個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該寡核苷酸包括SEQID NO1的核苷酸序列或與其互補(bǔ)的序列。最好所述標(biāo)記部分選自32P或地高辛配基。
可用于檢測(cè)用本發(fā)明引物產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物的典型的放射性標(biāo)記的寡核苷酸取自所述Vβ-Dβ-Jβ區(qū)域。如果用上面公開(kāi)的、其中運(yùn)用一種對(duì)應(yīng)于編碼LGRAGLTY基序的序列的引物的、半嵌套兩步PCR來(lái)擴(kuò)增Vβ13.1-LGRAGLTY區(qū)域，則可以使用互補(bǔ)于擴(kuò)增的Vβ13.1-LGRAGLTY區(qū)域之任一條鏈的一部分的大約10個(gè)或更多個(gè)核苷酸、優(yōu)選約18個(gè)或更多個(gè)核苷酸的任何寡核苷酸。更優(yōu)選地是，把寡核苷酸5’-CTAGGGCGGGCGGGACTCACCTAC-3’(SEQ ID NO1)或與其互補(bǔ)的核酸序列用作探針。
本發(fā)明也包括一種測(cè)試試劑盒，所述試劑盒包括長(zhǎng)度約15至30個(gè)核苷酸的、包含SEQ ID NO1的至少10個(gè)鄰接核苷酸的第一引物(a)、或與其互補(bǔ)的核酸序列。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述測(cè)試試劑盒還包括第二引物(b)，其中，所述第二引物是一種長(zhǎng)度約15至30個(gè)核苷酸、不包含(a)的序列且發(fā)現(xiàn)于T細(xì)胞中的Vβ13.1 T細(xì)胞受體基因之Vβ至Jβ區(qū)域的核酸序列；其中，(a)的序列和(b)的序列不存在于所述T細(xì)胞受體基因的同一條鏈上。
更優(yōu)選所述的第一引物為一種長(zhǎng)度約15至30個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該寡核苷酸包括SEQ ID NO1的11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、或23個(gè)鄰接核苷酸、或與其互補(bǔ)的序列。最優(yōu)選的是一種長(zhǎng)度約15至30個(gè)核苷酸的寡核苷酸，該寡核苷酸包括SEQ ID NO1的核苷酸序列或與其互補(bǔ)的序列。
在這個(gè)實(shí)施方案中，所述測(cè)試試劑盒還包括至少一種可用于如上描述的用PCR技術(shù)擴(kuò)增Vβ13.1-LGRAGLTY DNA的試劑。該試劑盒中可包括的示范性試劑包括但不限于緩沖液、脫氧核苷三磷酸、例如Taq聚合酶的熱穩(wěn)定性DNA聚合酶、作為陽(yáng)性對(duì)照的Vβ13.1-LGRAGLTY DNA、以及作為陰性對(duì)照的非Vβ13.1-LGRAGLTYDNA。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員而言，該測(cè)試試劑盒中可包括的其它試劑是已知的。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述測(cè)試試劑盒還包括一種標(biāo)記部分。該標(biāo)記部分最好是32P或地高辛配基。
本發(fā)明也包括一種治療自身免疫疾病的方法。所述自身免疫疾病是在至少某些患者的Vβ13.1 T細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)包含LGRAGLTY的T細(xì)胞受體的疾病。該患者可以存在其它類(lèi)型的T細(xì)胞、和/或沒(méi)有包含所述LGRAGLTY基序的T細(xì)胞受體之Vβ13.1 T細(xì)胞。
治療所述自身免疫疾病的該方法包括(a)從一個(gè)人獲得MBP83-99Vβ13.1 T細(xì)胞；(b)用上面公開(kāi)的方法，檢測(cè)所述T細(xì)胞中編碼LGRAGLTY基序的核酸的存在；且如果檢測(cè)出該核酸，則(c)給予該人一種Leu Gly Arg Ala Gly Leu Thr Tyr(SEQ ID NO3)肽。
所述自身免疫疾病可以是任一種在Vβ13.1 T細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)包含LGRAGLTY基序的T細(xì)胞受體的自身免疫疾病。本發(fā)明考慮的自身免疫疾病包括但不限于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、重癥肌無(wú)力、多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、自身免疫性甲狀腺炎(Hashimoto’s甲狀腺炎)、格雷夫斯氏(Graves’)病、炎性腸病、自身免疫性眼色素層視網(wǎng)膜炎、多肌炎、以及某些類(lèi)型的糖尿病。一種優(yōu)選的自身免疫疾病是多發(fā)性硬化(MS)。
如果用上面公開(kāi)的方法檢測(cè)出編碼LGRAGLTY基序的核酸，則可以通過(guò)給予一種包含Leu Gly Arg Ala Gly Leu Thr Tyr(SEQ ID NO3)的肽來(lái)治療該自身免疫疾病?？蓡为?dú)地給予該肽，或者可將該肽與一種T細(xì)胞活化標(biāo)記聯(lián)合給予。最好是按照Z(yǔ)hang的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)60/099,102的說(shuō)明書(shū)，將該肽與一種T細(xì)胞活化標(biāo)記肽聯(lián)合給予；該專(zhuān)利申請(qǐng)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。給予該肽可導(dǎo)致一種免疫應(yīng)答，其中，該患者將產(chǎn)生識(shí)別并結(jié)合在Vβ13.1 T細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的T細(xì)胞受體之LGRAGLTY基序的抗體和T細(xì)胞受體。
因?yàn)閂β13.1-LGRAGLTY既可以存在于MS患者體中，又可以存在于沒(méi)有患這種疾病的正常個(gè)體中，所以預(yù)計(jì)既可以將Leu Gly ArgAla Gly Leu Thr Tyr(SEQ ID NO3)肽給予MS患者，又可以將其給予正常的個(gè)體。
在一個(gè)可供選擇的實(shí)施方案中，如果用上面公開(kāi)的方法檢測(cè)到編碼一種LGRAGLTY基序的核酸，則通過(guò)定量測(cè)定該核酸，可監(jiān)測(cè)該自身免疫疾病。存在于一個(gè)樣品(例如PBMC)中的所述核酸量越大，則Vβ13.1 T細(xì)胞數(shù)越大，且該自身免疫疾病癥狀的嚴(yán)重性可能越大。而且，根據(jù)呈現(xiàn)升高的Vβ13.1 T細(xì)胞水平與出現(xiàn)癥狀之間的時(shí)間，臨床醫(yī)師可得到一個(gè)機(jī)會(huì)，以應(yīng)用所計(jì)劃的治療，而將該癥狀的嚴(yán)重性減小到最低和/或在該癥狀出現(xiàn)之前治療該病。
為了證實(shí)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，包括了下面的實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員應(yīng)該意識(shí)到在接下來(lái)的實(shí)施例中公開(kāi)的技術(shù)代表由本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的、在實(shí)施本發(fā)明方面十分有效的技術(shù)；且因此可認(rèn)為這些技術(shù)構(gòu)成了用于本發(fā)明實(shí)施的優(yōu)選模式。然而，根據(jù)本說(shuō)明書(shū)，本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員應(yīng)該意識(shí)到在公開(kāi)的具體實(shí)施方案中，可以在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下進(jìn)行許多變化而仍然獲得同樣的或類(lèi)似的結(jié)果。
實(shí)施例實(shí)施例1T細(xì)胞受體Vβ-Dβ-JβDNA序列以及由來(lái)源于不同MS患者的MBP83-99特異性T細(xì)胞克隆分享的序列基序由七個(gè)MS患者產(chǎn)生出20個(gè)一組的獨(dú)立CD4+T細(xì)胞克隆。通過(guò)把用DRB1*1501轉(zhuǎn)染的鼠成纖維細(xì)胞(L細(xì)胞)用作呈遞抗原細(xì)胞測(cè)定，所有的T細(xì)胞克隆均識(shí)別在HLA-DR2環(huán)境中的髓磷脂堿性蛋白的83-99肽(MBP83-99)。用Vα-特異性寡核苷酸引物和Vβ-特異性寡核苷酸引物，在反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)中特定鑒定所述T細(xì)胞克隆的TCR V基因重排，并且隨后對(duì)Vα-Jα和Vβ-Dβ-Jβ連接區(qū)測(cè)序。在表1和表2中顯示了該連接區(qū)的序列。
表1概括了用一組共20個(gè)獨(dú)立MBP83-99特異性T細(xì)胞克隆的分析結(jié)果，所述T細(xì)胞克隆已運(yùn)用一組對(duì)Vα基因家族特異性的寡核苷酸引物(所用獨(dú)特引物的序列通過(guò)在對(duì)應(yīng)于每個(gè)克隆的所述DNA序列下劃線來(lái)表明)通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR、按照T細(xì)胞克隆的Vα基因用法進(jìn)行了表征。在表1中如下表明每個(gè)克隆的“Vα”、“n”、“Jα”、及“Cα”部分的氨基酸序列在所述“n”部分下劃線；所述“Vα”序列和“Jα”序列在所述“n”序列的相應(yīng)一側(cè)用粗體表示所述“Vα”序列和“Jα”序列；以及用正常無(wú)下劃線的字體表示所述“Cα”序列。使擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物與地高辛配基標(biāo)記的CαcDNA探針雜交，且隨后對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的DNA序列進(jìn)行序列分析。
表2概括了一組共20個(gè)獨(dú)立的MBP83-99特異性T細(xì)胞克隆的分析結(jié)果。用一組對(duì)26個(gè)Vβ基因家族特異性的寡核苷酸引物(每個(gè)克隆的特定引物的序列通過(guò)在相應(yīng)的所述DNA序列下劃線來(lái)表明)，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR，對(duì)所述克隆作Vβ基因用法的分析。在表2中如下表明每個(gè)克隆的“Vβ”、“D”、“Jβ”、以及“Cβ”部分在所述“D”部分下劃線；所述“Vβ”序列和“Jβ”序列在所述“D”序列的相應(yīng)一側(cè)用粗體表示；且用正常字體顯示剩下的序列“Cβ”(無(wú)下劃線或粗體標(biāo)記)。使所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物與地高辛配基標(biāo)記的Cβ cDNA探針雜交，且隨后對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的DNA序列進(jìn)行序列分析。
表1對(duì)MBP83-99肽特異性的TCRVα基因序列
表2對(duì)MBP83-99肽特異性的TCRVβ基因序列
雖然所述的Vα和Vβ重排在各個(gè)MBP83-99 T細(xì)胞克隆之間不同，但起源于一種特定個(gè)體的許多這些獨(dú)立的T細(xì)胞克隆分享相同的、具有相同Vα-Jα和Vβ-Dβ-Jβ連接區(qū)序列的Vα鏈和Vβ鏈。這個(gè)發(fā)現(xiàn)和先前報(bào)道的在特定MS患者體內(nèi)的MBP83-99特異性T細(xì)胞之克隆擴(kuò)充(Vandevyver 1995，Wucherpfenning 1994)是一致的。
有趣地是，正如在表1和表2中表明的，起源于一個(gè)患者(MS-1)的一個(gè)獨(dú)立的T細(xì)胞克隆(克隆E2.6)與得自另一個(gè)患者(MS-2)的4個(gè)T細(xì)胞克隆中的3個(gè)(克隆C3.1、D7.16和F3.4)分享相同的Vβ13.1和Vα17。這些T細(xì)胞克隆的Vβ13.1分享一種在Vβ-Dβ-Jβ連接區(qū)內(nèi)的完全相同的DNA序列。
實(shí)施例2Vβ-Dβ-Jβ-特異性寡核苷酸引物在檢測(cè)存在于原始MBP83-99 T細(xì)胞克隆中以及存在于包含原始MBP83-99 T細(xì)胞的PBMC中的、相應(yīng)的DNA序列方面是高度特異性的和高度靈敏的根據(jù)在獨(dú)立的MBP83-99 T細(xì)胞克隆的Vβ-Dβ-Jβ連接區(qū)內(nèi)的DNA序列，合成了一組共14種寡核苷酸引物；且隨后在RT-PCR中，檢查其特異性。在表3中顯示了這些寡核苷酸引物的DNA序列。
表3 Vβ-Dβ-Jβ-特異性寡核苷酸引物的DNA序列T細(xì)胞克隆 DNA序列 SEQ ID NOMS1-E3.1 AGCAGCCAAGATCGTTTTTGG SEQ ID NO68MS1-E2.6 CTAGGGCGGGCGGGACTCACCTACSEQ ID NO69MS2-C3.1 CTAGGGCGGGCGGGACTCACCTACSEQ ID NO70MS2-D4.4MS3-F5.12 TACTCGATTAGGGGACAGGGTAACSEQ ID NO71MS3-B9.8MS4-D9.3 CAAGATCGGGTTGCGCCA SEQ ID NO72MS4-B9.1 ACCCGGCAAGGACCTCAAGAGACCSEQ ID NO73MS5-D2.7 AGCTTAGGACAGGGGGCT SEQ ID NO74MS5-D1.3MS6-D8.1 GCCAGCCGGGACAGGTCC SEQ ID NO75MS6-D1.2 GAGTAGATTGGTACGGGA SEQ ID NO76MS7-C.26MS8-C7.2 TACATCTGAAGTGCTATAGAC SEQ ID NO77
這些Vβ-Dβ-Jβ-特異性引物僅結(jié)合到存在于原始MBP83-99 T細(xì)胞克隆中的DNA序列上，而不結(jié)合到得自不相關(guān)MBP83-99 T細(xì)胞克隆的所述序列上(圖2)；這暗示了它們對(duì)于原始Vβ-Dβ-Jβ序列的高度特異性。注意到有關(guān)克隆MS1-E2.6和克隆MS2-C3.1的唯一例外，其中，結(jié)合到一種Vβ-Dβ-Jβ連接DNA序列上的同樣引物由兩種T細(xì)胞克隆分享。
已知所述Vβ-Dβ-Jβ寡核苷酸引物的特異性及PCR檢測(cè)系統(tǒng)的高度靈敏性，則我們問(wèn)這種運(yùn)用5’Vβ引物和Vβ-Dβ-Jβ-特異性的寡核苷酸引物的兩步PCR檢測(cè)系統(tǒng)是否可被用來(lái)檢測(cè)存在于所述MBP83-99 T細(xì)胞克隆所起源的外周血單核細(xì)胞(PBMC)樣品中的相應(yīng)DNA序列。兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示在原始PBMC樣品中的Vβ-Dβ-Jβ序列的陽(yáng)性檢測(cè)。因此，所述研究的結(jié)果證明其中Vβ-Dβ-Jβ序列用作指紋的該P(yáng)CR檢測(cè)系統(tǒng)在通過(guò)探查完全相同的DNA序列而追蹤存在于外周血單核細(xì)胞中的MBP83-99 T細(xì)胞方面是特異性的和靈敏的。
實(shí)施例3在得自不同MS患者和健康個(gè)體的PBMC樣品中檢測(cè)一種共同Vβ-Dβ-JβDNA序列接著，我們檢查在隨機(jī)選自一組MS患者和健康個(gè)體的PBMC樣品中是否可以檢測(cè)到對(duì)應(yīng)于所述MBP83-99 T細(xì)胞克隆的Vβ-Dβ-Jβ連接區(qū)的DNA序列。使用采用對(duì)相應(yīng)Vβ家族之特異性引物(在所述第一個(gè)PCR中)和Vβ-Dβ-Jβ序列之特異性引物(在所述第二個(gè)半嵌套式PCR中)的相同PCR擴(kuò)增系統(tǒng)。使所述的PCR擴(kuò)增系統(tǒng)與用相應(yīng)的Vβ-Dβ-Jβ探針進(jìn)行雜交的DNA印跡分析相結(jié)合。已知所述兩步PCR檢測(cè)系統(tǒng)的具體需要和Vβ-Dβ-Jβ引物及探針的特異性，因此所鑒定的DNA序列將起源于特定的TCR Vβ鏈，且代表與目的Vβ-Dβ-Jβ序列或者等同或者相似。
結(jié)果表明只有一種Vβ-Dβ-Jβ寡核苷酸引物(MS1-E2.6，Vβ13.1-LGRAGLTY)在得自不同MS患者的48個(gè)PBMC樣品里的15個(gè)樣品(31％)中檢測(cè)出互補(bǔ)的TCR Vβ13.1 DNA序列。因此，這個(gè)研究結(jié)果表明在這些MS患者體內(nèi)存在表達(dá)Vβ13.1-LGRAGLTY的MBP83-99 T細(xì)胞。在類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)條件下，所述的同一引物在得自健康個(gè)體的20個(gè)PBMC樣品里的5個(gè)樣品(25％)中也檢測(cè)出相應(yīng)的DNA序列。剩下的13種Vβ-Dβ-Jβ引物在同一組PBMC樣品中沒(méi)能鑒定出任何序列信號(hào)。這些結(jié)果在三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中是可以再現(xiàn)的。E2.6引物擴(kuò)增的所鑒定的DNA產(chǎn)物起源于表達(dá)Vβ13.1的T細(xì)胞，因?yàn)闉榱藬U(kuò)增而在第一個(gè)PCR中使用了一種Vβ13.1特異性引物。
此外，也在產(chǎn)生自5個(gè)其PBMC樣品被證明包含所鑒定的Vβ13.1-LGRAGLTY序列的MS(MS-35、MS36和MS39)患者的24個(gè)短時(shí)MBP83-99 T細(xì)胞系里的13個(gè)細(xì)胞系中，擴(kuò)增了所述Vβ13.1-LGRAGLTY序列。因此，這些結(jié)果證實(shí)了在所述PBMC樣品中檢測(cè)出的該Vβ13.1-LGRAGLTY DNA序列起源于識(shí)別MBP83-99的T細(xì)胞。這個(gè)發(fā)現(xiàn)也暗示表達(dá)該Vβ13.1-LGRAGLTY序列的MBP83-99 T細(xì)胞代表了在某些MS患者中發(fā)現(xiàn)的全部或大多數(shù)的MBP83-99 T細(xì)胞系。
一種將Vβ-Dβ-Jβ序列用作指紋的聯(lián)合PCR-DNA雜交檢測(cè)系統(tǒng)，在通過(guò)檢測(cè)等同的Vβ-Dβ-Jβ連接序列而追蹤抗原特異性T細(xì)胞方面提供了一種強(qiáng)有力的手段。所述檢測(cè)系統(tǒng)的高特異性和高靈敏性允許在外周血T細(xì)胞中鑒定特異性的Vβ-Dβ-Jβ序列。本研究首次證明在大約30％MS患者中，存在一個(gè)識(shí)別MBP的免疫顯性83-99肽且一致表達(dá)一種相同Vβ-Dβ-Jβ序列的Vβ13.1 T細(xì)胞的共同亞群。基于在本文中描述的分段實(shí)驗(yàn)獲得了所述的結(jié)論。第一，在得自不同患者的、獨(dú)立的MBP83-99 T細(xì)胞克隆之中，找到所述相同的DNA序列(Vβ13.1-LGRAGLTY)。第二，在由得自不同MS患者的PBMC樣品的TCR Vβ13.1所擴(kuò)增的cDNA產(chǎn)物中，鑒別出該序列。第三，在產(chǎn)生自被證明包含該Vβ13.1-LGRAGLTY序列的PBMC樣品的獨(dú)立的短時(shí)MBP83-99 T細(xì)胞系中，檢測(cè)到該DNA序列。表達(dá)該Vβ13.1-LGRAGLTY序列的MBP83-99T細(xì)胞似乎代表了全部或大多數(shù)的產(chǎn)生自某些MS患者的MBP83-99 T細(xì)胞系。最后，通過(guò)重組DNA克隆和直接的DNA序列分析，證實(shí)PBMC樣品中Vβ13.1-LGRAGLTY序列的存在。
而且，表達(dá)所述共同Vβ13.1-LGRAGLTY序列的MBP83-99 T細(xì)胞也存在于某些健康的個(gè)體中不是意想不到的。迄今所報(bào)道的研究表明MBP反應(yīng)性T細(xì)胞，包括識(shí)別所述免疫顯性83-99肽的T細(xì)胞，也存在于某些健康的個(gè)體中(Zhang 1994，Ota 1990)。然而，與健康個(gè)體不同的是在MS患者中有一種功能上差異，即這些T細(xì)胞經(jīng)歷體內(nèi)的活化和克隆擴(kuò)充(Zhang 1994)。
分享所述共同的Vβ-Dβ-Jβ序列的這些Vβ13.1 MBP83-99 T細(xì)胞可能代表在某些MS患者中所發(fā)現(xiàn)的MBP83-99 T細(xì)胞的相當(dāng)大的一部分。這種可能性得到以下觀察的支持該Vβ13.1-LGRAGLTY序列存在于40％的、在兩次刺激循環(huán)后產(chǎn)生自MS患者的短時(shí)MBP83-99 T細(xì)胞系中性。
在一個(gè)定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)中，為了監(jiān)測(cè)體內(nèi)的克隆擴(kuò)充和與該疾病潛在相關(guān)的體內(nèi)活性，可以將所鑒定的共同Vβ-Dβ-Jβ序列用作一種特異性標(biāo)記，以檢測(cè)在一大組MS患者的血液及腦脊髓液中的MBP83-99 T細(xì)胞的共同亞群。這種方法將優(yōu)于基于細(xì)胞培養(yǎng)物的常規(guī)分析，因?yàn)镸BP反應(yīng)性T細(xì)胞的體外選擇和擴(kuò)展常常被細(xì)胞培養(yǎng)物中固有的各種各樣的抑制因子所阻礙。這與最近的研究是一致的，在所述的研究中，當(dāng)用直接的離體分析來(lái)測(cè)定MBP反應(yīng)性T細(xì)胞的數(shù)量時(shí)，發(fā)現(xiàn)MBP反應(yīng)性T細(xì)胞的頻率在MS患者中是驚人地高的(Hafler為最后的作者JEM1997)。
此外，已表明對(duì)應(yīng)于所述T細(xì)胞受體的合成肽在MS患者體內(nèi)誘導(dǎo)對(duì)MBP反應(yīng)性T細(xì)胞的抗獨(dú)特型T細(xì)胞應(yīng)答(Chou等，J.I.)。因此，在一組其MBP83-99 T細(xì)胞具有共同的CDR3序列基序的患者體內(nèi)激發(fā)抗獨(dú)特型T細(xì)胞以抑制MBP反應(yīng)性T細(xì)胞特定亞群方面，包含一種共同CDR3序列的T細(xì)胞受體肽可具有巨大的潛力。在MS患者方面，作為一種潛在的治療方法，用這樣的共同CDR3肽的免疫法會(huì)優(yōu)于用CDR2肽或個(gè)體相關(guān)CDR3肽的免疫法(Vandenbark 1996)。
根據(jù)本說(shuō)明書(shū)，可以獲得及實(shí)施在本文中公開(kāi)且要求保護(hù)的所有組合物和/或方法，而不需過(guò)分地試驗(yàn)。雖然已借助優(yōu)選的實(shí)施方案描述了本發(fā)明的組合物及方法，但對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員，顯而易見(jiàn)的將是在本文描述方法的步驟中、或步驟順序方面，可以在不偏離本發(fā)明的概念、精神和范圍的情況下對(duì)所述組合物和/或方法進(jìn)行多種改變。更具體地講，顯而易見(jiàn)的將是可以用某些不但在化學(xué)上、而且在生理學(xué)上相關(guān)的試劑代替本文描述的試劑，能夠得到同樣結(jié)果或相似結(jié)果。認(rèn)為對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員顯而易見(jiàn)的所有這樣的取代以及修改在由所附的權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的精神、范圍和概念內(nèi)。
序列表<110>Jingwu，Zhang Z.<120>T細(xì)胞受體VB-DB-JB序列及其檢測(cè)方法<130>BCOL003<140><141><160>77<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>24<212>DNA<213>合成的<400>1ctagggcggg cgggactcac ctac 24<210>2<211>400<212>DNA<213>人類(lèi)(Homo sapiens)<400>2catgtctccg ataacccaga ggatttcccg ctcaggctgc tgtcggctgc tccctcccag 60acatctgtgt acttctgtgc cagcagccta gggcgggcgg gactcaccta cgagcagtac 120ttcgggccgg gcaccaggct cacggtcaca gaggacctga aaaacgtgtt cccacccgag 180gtcgctgtgt ttgagccatc agaagcagag atctcccaca cccaaaaggc cacactggta 240tgcctggcca caggcttcta ccccgaccac gtggagctga gctggtgggt gaatgggaag 300gaggtgcaca gtggggtcag cacagacccg cagcccctca aggagcagcc cgccctcaat 360gactccagat actgcctgag cagccgcctg agggtctcgg 400<210>3<211>8<212>PRT<213>人類(lèi)<400>3Leu Gly Arg Ala Gly Leu Thr Tyr1 5<210>4<211>30<212>PRT<213>人類(lèi)<400>4Tyr Phe Cys Ala Leu Ser Arg Gly Gly Ser Asn Tyr Lys Leu Thr Phe1 5 10 15Gly Lys Gly Thr Leu Leu Thr Val Asn Pro Asn Ile Gln Asn20 25 30<210>5<211>90<212>DNA<213>人類(lèi)<400>5tacttctgtg ctctgagtag gggaggtagc aactataaac tgacatttgg aaaaggaact 60ctcttaaccg tgaatccaaa tatccagaac 90<210>6<211>30<212>PRT<213>人類(lèi)<400>6Tyr Tyr Cys Ala Leu Lys Arg Asn Phe Gly Asn Glu Lys Leu Thr Phe1 5 10 15Gly Thr Gly Thr Arg Leu Thr Ile Ile Pro Asn Ile Gln Asn20 25 30<210>7<211>90<212>DNA<213>人類(lèi)<400>7tattactgtg ctctaaaaag aaactttgga aatgagaaat taacctttgg gactggaaca 60agactcacca tcatacccaa tatccagaac 90<210>8<211>30<212>PRT<213>人類(lèi)<400>8Tyr Phe Cys Ala Ala Ser Pro Gly Gly Ser Asn Tyr Lys Leu Thr Phe1 5 10 15Gly Lys Gly Thr Leu Leu Thr Val Asn Pro Asn Ile Gln Asn20 25 30<210>9<211>90<212>DNA<213>人類(lèi)<400>9tacttctgtg cagcaagccc cggaggtagc aactataaac tgacatttgg aaaaggaact 60ctcttaaccg tgaatccaaa tatccagaac 90<210>10<211>30<212>PRT<213>人類(lèi)<400>10Tyr Phe Cys Ala Ala Met Gly Asp Phe Gly Asn Glu Lys Leu Thr Phe1 5 10 15Gly Thr Gly Thr Arg Leu Thr Ile Ile Pro Asn Ile Gln Asn20 25 30<210>11<211>90<212>DNA<213>人類(lèi)<400>11tacttctgtg cagcaatggg ggactttgga aatgagaaat taacctttgg gactggaaca 60agactcacca tcatacccaa tatccagaac 90<210>12<211>30<212>PRT<213>人類(lèi)<400>12Tyr Phe Cys Ala Ala Met Gly Asp Phe Gly Asn Glu Lys Leu Thr Phe1 5 10 15Gly Thr Gly Thr Arg Leu Thr Ile Ile Pro Asn Ile Gln Asn20 25 30<210>13<211>90<212>DNA<213>人類(lèi)<400>13tacttctgtg cagcaatggg ggactttgga aatgagaaat taacctttgg gactggaaca 60agactcacca tcatacccaa tatccagaac 90<210>14<211>30<212>PRT<213>人類(lèi)<400>14Tyr Phe Cys Ala Ala Met Gly Asp Phe Gly Asn Glu Lys Leu Thr Phe1 5 10 15Gly Thr Gly Thr Arg Leu Thr Ile Ile Pro Asn Ile Gln Asn20 25 30<210>15<211>90<212>DNA<213>人類(lèi)<400>15tacttctgtg cagcaatggg ggactttgga aatgagaaat taacctttgg gactggaaca 60agactcacca tcatacccaa tatccagaac 90<210>16<211>32<212>PRT<213>人類(lèi)<400>16Tyr Phe Cys Ala Leu Ser Val Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Gly Lys Leu1 5 10 15Thr Phe Gly Gln Gly Thr Ile Leu Thr Val His Pro Asn Ile Gln Asn20 25 30<210>17<211>96<212>DNA<213>人類(lèi)<400>17tacttctgtg ctctgagcgt tgctggtggt actagctatg gaaagctgac atttggacaa 60gggaccatct tgactgtcca tccaaatatc cagaac 96<210>18<211>33<212>PRT<213>人類(lèi)<400>18Tyr Tyr Cys Leu Val Gly Asp Ala Val Arg Pro Gly Gly Gly Asn Lys1 5 10 15Leu Thr Phe Gly Thr Gly Thr Gln Leu Lys Val Glu Leu Asn Ile Gln
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25<210>31<211>84<212>DNA<213>人類(lèi)<400>31tatttctgtg ccagcagcgc tatgggagag acccagtact tcgggccagg cacgcggctc 60ctggtgctcg aggacctgaa aaac84<210>32<211>32<212>PRT<213>人類(lèi)<400>32Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Leu Gly Arg Ala Gly Leu Thr Tyr Glu Gln1 5 10 15Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn20 25 30<210>33<211>96<212>DNA<213>人類(lèi)<400>33tacttctgtg ccagcagcct agggcgggcg ggactcacct acgagcagta cttcgggccg 60ggcaccaggc tcacggtcac agaggacctg aaaaac 96<210>34<211>32<212>PRT<213>人類(lèi)<400>34Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Leu Gly Arg Ala Gly Leu Thr Tyr Glu Gln1 5 10 15Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn20 25 30<210>35<211>96<212>DNA<213>人類(lèi)<400>35tacttctgtg ccagcagcct agggcgggcg ggactcacct acgagcagta cttcgggccg 60ggcaccaggc tcacggtcac agaggacctg aaaaac 96<210>36<211>31<212>PRT<213>人類(lèi)<400>36Phe Cys Ala Ser Ser Leu Gly Arg Ala Gly Leu Thr Tyr Glu Gln Tyr1 5 10 15Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn20 25 30<210>37<211>96<212>DNA<213>人類(lèi)<400>37tacttctgtg ccagcagcct agggcgggcg ggactcacct acgagcagta cttcgggccg 60ggcaccaggc tcacggtcac agaggacctg aaaaac 96<210>38<211>32<212>PRT<213>人類(lèi)<400>38Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Leu Gly Arg Ala Gly Leu Thr Tyr Glu Gln1 5 10 15Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn20 25 30<210>39<211>96<212>DNA<213>人類(lèi)<400>39tacttctgtg ccagcagcct agggcgggcg ggactcacct acgagcagta cttcgggccg 60ggcaccaggc tcacggtcac agaggacctg aaaaac 96<210>40<211>29<212>PRT<213>人類(lèi)<400>40Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Pro Thr Val Asn Tyr Gly Tyr Thr Phe Gly1 5 10 15Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val Val Glu Asp Leu Asn Lys20 25<210>41<211>87<212>DNA<213>人類(lèi)<400>41tatttctgtg ccagcagccc gacagttaac tatggctaca ccttcggttc ggggaccagg 60ttaaccgttg tagaggacct gaacaag 87<210>42<211>32<212>PRT<213>人類(lèi)<400>42Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Tyr Ser Ile Arg Gly Gln Gly Asn Glu Gln1 5 10 15Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn20 25 30<210>43<211>96<212>DNA<2l3>人類(lèi)<400>43tacttctgtg ccagcagtta ctcgattagg ggacagggta acgagcagta cttcgggccg 60ggcaccaggc tcacggtcac agaggacctg aaaaac 96<210>44<211>32<212>PRT<213>人類(lèi)<400>44Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Tyr Ser Ile Arg Gly Gln Gly Asn Glu Gln1 5 10 15Tyr Phe Arg Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn20 25 30<210>45<211>96<212>DNA<213>人類(lèi)<400>45tacttctgtg ccagcagtta ctcgattagg ggacagggta acgagcagta cttccggccg 60ggcaccaggc tcacggtcac agaggacctg aaaaac 96<210>46<211>29<212>PRT<213>人類(lèi)<400>46Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Gln Asp Arg Val Ala Pro Gln Tyr Phe Gly1 5 10 15Pro Gly Thr Arg Leu Leu Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn20 25<210>47<211>87<212>DNA<213>人類(lèi)<400>47tatctctgtg ccagcagcca agatcgggtt gcgccacagt acttcgggcc aggcacgcgg 60ctcctggtgc tcgaggacct gaaaaac 87<210>48<211>31<212>PRT<213>人類(lèi)<400>48Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Thr Arg Gln Gly Pro Gln Glu Thr Gln Tyr1 5 10 15Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Leu Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn20 25 30<210>49<211>93<212>DNA<213>人類(lèi)<400>49tatctctgtg ccagtagtac ccggcaagga cctcaagaga cccagtactt cgggccaggc 60acgcggctcc tggtgctcga ggacctgaaa aac 93<210>50<211>30<212>PRT<213>人類(lèi)<400>50Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu Gly Gln Gly Ala Tyr Glu Gln Tyr Phe1 5 10 15Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn20 25 30<210>51<211>90<212>DNA<213>人類(lèi)<400>51tatctctgtg ccagcagctt aggacagggg gcttacgagc agtacttcgg gccgggcacc 60aggctcacgg tcacagagga cctgaaaaac 90<210>52<211>30<212>PRT<213>人類(lèi)<400>52Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu Gly Gln Gly Ala Tyr Glu Gln Tyr Phe1 5 10 15Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn20 25 30<210>53<211>90<212>DNA<213>人類(lèi)<400>53tatctctgtg ccagcagctt aggacagggg gcttacgagc agtacttcgg gccgggcacc 60aggctcacgg tcacagagga cctgaaaaac 90<210>54<211>30<212>PRT<213>人類(lèi)<400>54Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu Gly Gln Gly Ala Tyr Glu Gln Tyr Phe1 5 10 15Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn20 25 30<210>55<211>90<212>DNA<213>人類(lèi)<400>55tatctctgtg ccagcagctt aggacagggg gcttacgagc agtacttcgg gccgggcacc 60aggctcacgg tcacagagga cctgaaaaac 90<210>56<211>29<212>PRT<213>人類(lèi)<400>56Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Leu Gln Val Tyr Ser Pro Leu His Phe Gly1 5 10 15Asn Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Asn Lys20 25<210>57<211>87<212>DNA<213>人類(lèi)<400>57tacttctgtg ccagcagttt acaagtgtat tcacccctcc actttgggaa cgggaccagg 60ctcactgtga cagaggacct gaacaag 87<210>58<211>31<212>PRT<213>人類(lèi)<400>58Tyr Phe Cys Ala Ile Ser Glu Ser Ile Gly Thr Gly Thr Glu Ala Phe1 5 10 15Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Thr Val Val Glu Asp Leu Asn Lys20 25 30<210>59<211>93<212>DNA<213>人類(lèi)<400>59tacttctgtg ccatcagtga gtcgattggt acgggaactg aagctttctt tggacaaggc 60accagactca cagttgtaga ggacctgaac aag 93<210>60<211>31<212>PRT<213>人類(lèi)<400>60Tyr Phe Cys Ala Ile Ser Glu Ser Ile Gly Thr Gly Thr Glu Ala Phe1 5 10 15Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Thr Val Val Glu Asp Leu Asn Lys20 25 30<210>61<211>93<212>DNA<213>人類(lèi)<400>61tacttctgtg ccatcagtga gtcgattggt acgggaactg aagctttctt tggacaaggc 60accagactca cagttgtaga ggacctgaac aag 93<210>62<211>28<212>PRT<213>人類(lèi)<400>62Tyr Leu Cys Ala Ser Arg Asp Arg Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro1 5 10 15Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn20 25<210>63<211>84<212>DNA<213>人類(lèi)<400>63tacctctgtg ccagccggga caggtcctac gagcagtact tcgggccggg caccaggctc 60acggtcacag aggacctgaa aaac84<210>64<211>31<212>PRT<213>人類(lèi)<400>64Tyr Phe Cys Ala Ile Ser Glu Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ile Tyr1 5 10 15Phe Gly Glu Gly Ser Trp Leu Thr Val Val Glu Asp Leu Asn Lys
20 2530<210>65<211>93<212>DNA<213>人類(lèi)<400>65tacttctgtg ccatcagtga ggggtccagc tctggaaaca ccatatattt tggagaggga 60agttggctca ctgttgtaga ggacctgaac aag 93<210>66<211>26<212>PRT<213>人類(lèi)<400>66Phe Tyr Ile Cys Ser Ala Ile Asp Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr1 5 10 15Arg Leu Thr Val Val Glu Asp Leu Asn Lys20 25<210>67<211>78<212>DNA<213>人類(lèi)<400>67ttctacatct gcagtgctat agacggctac accttcggtt cggggaccag gttaaccgtt 60gtagaggacc tgaacaag 78<210>68<211>21<212>DNA<213>人類(lèi)<400>68agcagccaag atcgtttttg g 21<210>69<211>24<212>DNA<213>人類(lèi)<400>69ctagggcggg cgggactcac ctac24<210>70<211>24<212>DNA<213>人類(lèi)<400>70ctagggcggg cgggactcac ctac 24<210>71<211>24<212>DNA<213>人類(lèi)<400>71tactcgatta ggggacaggg taac 24<210>72<211>18<212>DNA<213>人類(lèi)<400>72caagatcggg ttgcgcca18<210>73<211>24<212>DNA<213>人類(lèi)<400>73acccggcaag gacctcaaga gacc 24<210>74<211>18<212>DNA<213>人類(lèi)<400>74agcttaggac agggggct 18<210>75<211>18<212>DNA<213>人類(lèi)<400>75gccagccggg acaggtcc 18<210>76<211>18<212>DNA<213>人類(lèi)<400>76gagtagattg gtacggga 18<210>77<211>21<212>DNA<213>人類(lèi)<400>77tacatctgaa gtgctataga c 2權(quán)利要求
1.一種長(zhǎng)度約為15至30個(gè)核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括SEQ ID NO1的至少10個(gè)鄰接核苷酸或與其互補(bǔ)的核酸。
2.權(quán)利要求1的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括SEQ ID NO1的至少15個(gè)鄰接核苷酸或與其互補(bǔ)的核酸。
3.權(quán)利要求1的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括SEQ ID NO1的序列或與其互補(bǔ)的核酸。
4.一種引物對(duì)，所述引物對(duì)包括(a)長(zhǎng)度約15至30個(gè)核苷酸的第一引物，所述第一引物包括SEQ IDNO1的至少10個(gè)鄰接核苷酸或與其互補(bǔ)的核酸；以及(b)第二引物，所述第二引物包含一種長(zhǎng)度約15至30個(gè)核苷酸的核酸，不包括該序列(a)，且發(fā)現(xiàn)于T細(xì)胞受體T細(xì)胞中Vβ13.1基因的Vβ至Jβ的區(qū)域中，其中，所述第一引物和第二引物的序列不存在于所述T細(xì)胞受體基因的同一條鏈上。
5.權(quán)利要求4的引物對(duì)，其中，所述Vβ13.1基因序列是SEQ ID NO2。
6.一種寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括(a)一種長(zhǎng)度約10至30個(gè)核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括SEQ ID NO1的至少10個(gè)鄰接核苷酸或與其互補(bǔ)的核酸；以及(b)一個(gè)標(biāo)記部分。
7.權(quán)利要求6的寡核苷酸探針，其中，所述標(biāo)記部分選自32P或地高辛配基。
8.一種檢測(cè)表達(dá)T細(xì)胞受體LGRAGLTY基序的MBP83-99Vβ13.1T細(xì)胞的方法，所述方法包括(a)從MBP83-99Vβ13.1 T細(xì)胞中獲得核酸樣品；(b)使所述核酸樣品與一種引物對(duì)接觸，所述引物對(duì)選自或衍生自(i)長(zhǎng)度約15至30個(gè)核苷酸的第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括SEQ ID NO1的至少10個(gè)鄰接核苷酸或與其互補(bǔ)的核酸，以及(ii)長(zhǎng)度約15至30個(gè)核苷酸的第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸不包含所述第一寡核苷酸的序列，且發(fā)現(xiàn)于T細(xì)胞受體T細(xì)胞中Vβ13.1基因的Vβ至Jβ的區(qū)域中，其中，所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的序列不存在于所述T細(xì)胞受體基因的同一條鏈上；以及(c)檢測(cè)編碼LGRAGLTY基序的核酸的存在。
9.權(quán)利要求8的方法，其中，所述Vβ13.1基因序列是SEQ ID NO2。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增所述核酸樣品的片段。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中，所述檢測(cè)步驟包括用一種寡核苷酸探針探查，該寡核苷酸探針包括(a)一種寡核苷酸，所述寡核苷酸包括SEQ ID NO1的序列或與其互補(bǔ)的核酸；以及(b)一個(gè)標(biāo)記部分。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中，所述檢測(cè)步驟包括放射自顯影。
13.包括長(zhǎng)度約15至30個(gè)核苷酸的第一寡核苷酸的一種測(cè)試試劑盒，所述第一寡核苷酸包括SEQ ID NO1的至少10個(gè)鄰接核苷酸或與其互補(bǔ)的核酸。
14.權(quán)利要求13的測(cè)試試劑盒，所述試劑盒還包括長(zhǎng)度約15至30個(gè)核苷酸的第二寡核苷酸；所述第二寡核苷酸不包含所述第一寡核苷酸的序列，且發(fā)現(xiàn)于T細(xì)胞受體T細(xì)胞中Vβ13.1基因的Vβ至Jβ的區(qū)域中；其中所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的序列不存在于所述T細(xì)胞受體基因的同一鏈上。
15.權(quán)利要求14的測(cè)試試劑盒，其中，所述Vβ13.1基因序列是SEQID NO2。
16.權(quán)利要求13的測(cè)試試劑盒，所述試劑盒還包括一種標(biāo)記部分，其中，所述標(biāo)記部分選自32P或地高辛配基。
17.一種治療人類(lèi)自身免疫病的方法，所述方法包括(a)從一個(gè)人獲得MBP83-99Vβ13.1 T細(xì)胞；(b)從MBP83-99Vβ13.1 T細(xì)胞中獲得核酸樣品；(c)使所述核酸樣品與一種引物對(duì)接觸，所述引物對(duì)選自或衍生自(i)長(zhǎng)度約15至30個(gè)核苷酸的第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括SEQ ID NO1的至少10個(gè)鄰接核苷酸或與其互補(bǔ)的核酸，以及(iii)長(zhǎng)度約15至30個(gè)核苷酸的第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸不包含所述第一寡核苷酸的序列，且發(fā)現(xiàn)于T細(xì)胞受體T細(xì)胞中Vβ13.1基因的Vβ至Jβ的區(qū)域中，其中，所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的序列不存在于所述T細(xì)胞受體基因的同一條鏈上；以及(d)檢測(cè)編碼LGRAGLTY基序的核酸的存在；且如果檢測(cè)到該核酸，則(e)將一種Leu Gly Arg Ala Gly Leu Thr Tyr(SEQ ID NO3)肽給予所述的人。
18.權(quán)利要求17的方法，其中，所述Vβ13.1基因序列是SEQ ID NO2。
19.權(quán)利要求17的方法，其中，所述的給予步驟還包括給予一種T細(xì)胞活化標(biāo)記肽。
20.一種監(jiān)測(cè)自身免疫病的方法，所述方法包括(A)從一個(gè)人獲得MBP83-99Vβ13.1 T細(xì)胞；(B)通過(guò)下面的步驟，檢測(cè)編碼LGRAGLTY基序的核酸的存在(i)從MBP83-99Vβ13.1 T細(xì)胞中獲得核酸樣品；(ii)使所述核酸樣品與一種引物對(duì)接觸，所述引物對(duì)選自或衍生自(a)長(zhǎng)度約15至30個(gè)核苷酸的第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括SEQ ID NO1的至少10個(gè)鄰接核苷酸或與其互補(bǔ)的核酸，以及(b)長(zhǎng)度約15至30個(gè)核苷酸的第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸不包含所述第一寡核苷酸的序列，且發(fā)現(xiàn)于T細(xì)胞受體T細(xì)胞中Vβ13.1基因的Vβ至Jβ的區(qū)域中，其中，所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的序列不存在于所述T細(xì)胞受體基因的同一條鏈上；以及(iii)檢測(cè)編碼LGRAGLTY基序的核酸的存在；且如果檢測(cè)到該核酸，則(C)測(cè)定該核酸的量。
21.權(quán)利要求20的方法，其中，所述Vβ13.1基因序列是SEQ ID NO2。
全文摘要
在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及第一寡核苷酸,所述第一寡核苷酸包括序列5’－CTAGGGCGGGCGGGACTCACCTAC－3’或衍生自它的序列或與其互補(bǔ)的核酸序列?？梢詫⑺龅谝还押塑账崤c長(zhǎng)度在15至30個(gè)核苷酸之間、不包含該第一寡核苷酸序列、且在Vβ13.1T細(xì)胞的Vβ13.1基因的Vβ至Jβ區(qū)域中發(fā)現(xiàn)的核酸一起使用,來(lái)擴(kuò)增該Vβ13.1基因的一部分,其中,該寡核苷酸序列和所述核酸序列不存在于Vβ13.1基因?qū)Φ耐粭l鏈上。用另一種方法,可以將所述第一寡核苷酸與一種標(biāo)記部分一起用于檢測(cè)發(fā)現(xiàn)于Vβ13.1T細(xì)胞的T細(xì)胞受體中的LGRAGLTY基序的方法中。這種基序與自身免疫病有關(guān),所述自身免疫病例如多發(fā)性硬化(MS)。一旦檢測(cè)出該基序,就可以治療該自身免疫病或監(jiān)測(cè)其發(fā)展。通過(guò)給予包含LGRAGLTY基序的肽,可以治療所述的自身免疫病。
文檔編號(hào)A61P21/00GK1355852SQ00806558
公開(kāi)日2002年6月26日 申請(qǐng)日期2000年2月22日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月23日
發(fā)明者J·Z·張 申請(qǐng)人:貝勒醫(yī)學(xué)院