專利名稱：衍生自lgECε2區(qū)的表位或模擬表位、其拮抗劑以及它們的治療用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及提供用于治療、預(yù)防或緩解變應(yīng)性疾病的新藥物。具體地說(shuō)，所述新藥物是加入IgE Cε2區(qū)表面暴露區(qū)域的表位或模擬表位(mimotope)的分離的肽。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些新的區(qū)域可能是被動(dòng)和主動(dòng)免疫預(yù)防或免疫治療的靶。本發(fā)明還涉及所述藥物、含所述藥物的藥用組合物的生產(chǎn)方法以及所述藥物和藥用組合物在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。能夠結(jié)合本發(fā)明的表面暴露IgE區(qū)域的配體、尤其是單克隆抗體以及它們?cè)卺t(yī)學(xué)中作為被動(dòng)免疫治療或免疫預(yù)防的應(yīng)用也構(gòu)成了本發(fā)明的一個(gè)方面。非肽模擬表位也是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案。
在變態(tài)反應(yīng)中，通常與變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的癥狀是由于變態(tài)反應(yīng)介質(zhì)例如組胺從免疫細(xì)胞中釋放到周圍組織和脈管結(jié)構(gòu)中而引起的。組胺通常貯藏在肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞中，直至由于與變應(yīng)原特異性IgE相互作用而觸發(fā)這種釋放。IgE在變態(tài)反應(yīng)(例如哮喘、食物過(guò)敏、特應(yīng)性皮炎、I型過(guò)敏反應(yīng)和過(guò)敏性鼻炎)介導(dǎo)方面的作用是眾所周知的。在遇到抗原例如花粉或塵螨變應(yīng)原時(shí)，B細(xì)胞開始合成變應(yīng)原特異性IgE。所述變應(yīng)原特異性IgE隨后與嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞上的FcεRI受體(高親和性IgE受體)結(jié)合。隨后的任何一次與變應(yīng)原的相遇均導(dǎo)致通過(guò)相鄰IgE/FcεRI復(fù)合體的交聯(lián)而觸發(fā)肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺(Sutton和Gould，Nature，1993，366421-428；EP 0477 231 B1)。
IgE同所有免疫球蛋白一樣，包含兩條重鏈和兩條輕鏈。ε重鏈由5個(gè)區(qū)組成一個(gè)可變區(qū)(VH)和四個(gè)恒定區(qū)(Cε1至Cε4)。IgE的分子量約為190,000Da，重鏈的長(zhǎng)度約為550個(gè)氨基酸。在Padlan和Davis(Mol.Immunol.，23，1063-75，1986)以及Helm等(于2/10/90以PDB存儲(chǔ)的2IgE模型結(jié)構(gòu)(2IgE model structure deposited 2/10/90 with PDB)(Protein Data Bank，Research Collabarotory for Structural Bioinformatics；http\pdb-browsers.ebi.ac.uk))中討論了IgE的結(jié)構(gòu)。第二個(gè)區(qū)Cε2大約包含IgE的氨基酸226-328(Flanagan J.G.和Rabbitts，T.H.，1982，EMBO J.，1，655-660；Kenten等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，79，6661-6665)，但可以包含額外的氨基酸。通過(guò)與IgG1的已知結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，推定Cε3區(qū)的起始點(diǎn)是Ser337。
過(guò)去已經(jīng)研究了許多設(shè)計(jì)用來(lái)干擾IgE介導(dǎo)的組胺釋放機(jī)制的被動(dòng)或主動(dòng)免疫治療途徑，并且獲得了不同程度的成功。這些途徑包括或者用被動(dòng)給予的抗體、或者通過(guò)被動(dòng)給予競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合FcεRI或FcεRII(低親和性IgE受體)受體的IgE衍生肽，干擾IgE或變應(yīng)原/IgE復(fù)合體與所述受體的結(jié)合。另外，某些作者已經(jīng)描述了在主動(dòng)免疫中應(yīng)用衍生自IgE的特定肽，以刺激抑制組胺釋放的免疫應(yīng)答。
已經(jīng)報(bào)道參與IgE與其受體結(jié)合的IgE區(qū)是Cε3和Cε4(Sutton，B.J.和Gould，H.J.；Nature，1993，366421-428；WO 97/31948)，因此先前的治療策略一直集中于這兩個(gè)區(qū)的部分上。
該領(lǐng)域中先前的研究人員在其研究過(guò)程中，遇到了在設(shè)計(jì)新的抗變態(tài)反應(yīng)療法中必須考慮的許多事項(xiàng)和問(wèn)題。最危險(xiǎn)的問(wèn)題之一圍繞著在組胺釋放信號(hào)中涉及IgE交聯(lián)。最常見的情況是在主動(dòng)免疫接種期間產(chǎn)生的抗IgE抗體自身通過(guò)在缺乏變應(yīng)原的情況下相鄰IgE-受體復(fù)合體的交聯(lián)，能夠觸發(fā)組胺釋放。這種現(xiàn)象稱為過(guò)敏原性。實(shí)際上，通常用于IgE檢測(cè)分析的許多市售抗IgE單克隆抗體是過(guò)敏原性的，如果將其給予患者，則因此是無(wú)用且具有潛在的危險(xiǎn)。
一種抗體是否具有過(guò)敏原性，取決于所述IgE分子上的靶表位的位置。然而，根據(jù)該領(lǐng)域的知識(shí)現(xiàn)狀，雖然有巨大的科學(xué)意義并且作了許多努力，但對(duì)任一抗體或表位可能具有何種特性以及它是否可能對(duì)患者具有正或負(fù)的臨床效應(yīng)的可預(yù)測(cè)性卻很低或者沒有可預(yù)測(cè)性。
因此，為了安全和有效，被動(dòng)給予的抗體或疫苗所誘導(dǎo)的抗體必須結(jié)合在IgE能夠干擾組胺觸發(fā)途徑的區(qū)域中，并且所述抗體自身不具有過(guò)敏原性。本發(fā)明達(dá)到了所有這些目標(biāo)，提供作為能夠產(chǎn)生抑制組胺釋放的非過(guò)敏原性抗體的藥物。這些藥物可以構(gòu)成主動(dòng)疫苗的基礎(chǔ)，或用來(lái)產(chǎn)生用于被動(dòng)免疫治療的合適抗體，或?qū)τ谀骋恢委熜?yīng)本身可以被動(dòng)給予。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已經(jīng)進(jìn)行了許多研究，以鑒定確實(shí)具有抗IgE介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)的有益效應(yīng)的特異性抗IgE抗體(WO 90/15878，WO89/04834，WO 93/05810)。已經(jīng)嘗試鑒定出由這些有用抗體識(shí)別的表位，以構(gòu)建這類表位的肽模擬表位，并且用所述肽模擬表位作為產(chǎn)生抗IgE抗體的免疫原。
WO 97/31948描述了這類研究的實(shí)施例，并且還描述了與載體分子綴合的來(lái)自Cε3和Cε4區(qū)的IgE肽，以用于主動(dòng)疫苗接種目的。這些免疫原可以用于疫苗接種研究，并且據(jù)認(rèn)為能夠產(chǎn)生隨后在體內(nèi)抑制組胺釋放的抗體。在這項(xiàng)研究中，描述了據(jù)認(rèn)為可用于主動(dòng)疫苗接種目的、能夠與包含在Cε3區(qū)中的IgE肽結(jié)合的單克隆抗體(BSW17)。
EP 0 477 231 B1描述了用于主動(dòng)免疫接種性免疫預(yù)防、與匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)綴合的衍生自IgE Cε4區(qū)(殘基497-506，也稱為Stanworth十肽)的免疫原。WO 96/14333是EP 0 477 231 B1中所述研究的繼續(xù)。
其它途徑基于鑒定自身與IgE競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合嗜堿性粒細(xì)胞或肥大細(xì)胞上高親和性或低親和性受體的肽(WO 93/04173，WO 98/24808，EP 0303 625 B1，EP 0 341 290)。
本發(fā)明鑒定出IgE Cε2區(qū)的新的表面暴露表位，它們可以用作變應(yīng)性疾病狀態(tài)的主動(dòng)或被動(dòng)免疫預(yù)防或治療的靶。本發(fā)明提供加入所述分離的表位本身的肽，還提供這些新鑒定的表位的模擬表位，所述模擬表位本身可以用于治療變態(tài)反應(yīng)，或可以用于主動(dòng)免疫接種性免疫預(yù)防或治療的免疫原中。本發(fā)明的分離的表位或模擬表位最好用于主動(dòng)免疫接種方案的免疫原中，以誘導(dǎo)自身抗IgE抗體，它們本身限制、緩解或消除接種疫苗的受治療者的變態(tài)反應(yīng)或癥狀。另一方面，本發(fā)明的模擬表位或免疫原可以被動(dòng)給予患者，以限制、緩解或消除接種疫苗的受治療者的變態(tài)反應(yīng)或癥狀。
加入本發(fā)明的分離表位的肽當(dāng)被穩(wěn)定地呈遞(例如在一種載體上)時(shí)具有免疫原性，而且在體內(nèi)能夠誘導(dǎo)非過(guò)敏原性的自身抗IgE抗體，并且有效緩解過(guò)敏反應(yīng)。本發(fā)明的表位或模擬表位最好僅衍生自Cε2區(qū)，因?yàn)樗鼈儾谎苌匀魏纹渌鼌^(qū)，亦即在Cε1、Cε3或Cε4區(qū)中未發(fā)現(xiàn)它們。特別是，作為一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，它們衍生自由人IgE的Ser222-Ala329編碼的區(qū)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)特別適用于本發(fā)明的模擬表位或免疫原的Cε2區(qū)的特定表位，是本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的表面暴露的那些表位?？梢愿鶕?jù)其建模結(jié)構(gòu)確定IgE區(qū)域的表面暴露。(Padlan和Davies，Mol.Immunol.，23，1063-75，1986；Helm等，于2/10/90以PDB存儲(chǔ)的2IgE模型結(jié)構(gòu)(Protein Data Bank，Research Collabarotory for StructuralBioinformatics))。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)也發(fā)現(xiàn)可用于本發(fā)明的表位是高度表面暴露的。根據(jù)這一觀察，本發(fā)明人已經(jīng)設(shè)計(jì)出一種提供其它合適表位的方法，所述表位是在5殘基滑動(dòng)窗口范圍計(jì)算的具有可及區(qū)的表位。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Cε2區(qū)中的優(yōu)選區(qū)具有一個(gè)在5殘基滑動(dòng)窗口范圍用分子模擬軟件(MSI)計(jì)算的大于502、優(yōu)選大于802的可及表面。
這類表面暴露的Cε2 IgE表位的實(shí)例是
加入這類表位的肽構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面。具有與這些表位相同特性的模擬表位以及包含這類模擬表位、產(chǎn)生與IgE分子環(huán)境內(nèi)的IgE Cε2表位交叉反應(yīng)的免疫應(yīng)答的免疫原，也構(gòu)成了本發(fā)明的部分。
因此，本發(fā)明包括包含天然的IgE表位本身及其任何模擬表位的分離的肽。模擬表位的含義定義為與天然IgE表位足夠相似以能夠被識(shí)別所述天然IgE表位的抗體識(shí)別的實(shí)體；(Gheysen，H.M.，等，1986，作為抗原的合成肽(Synthetic peptides as antigens).Wiley，Chichester，Ciba foundation symposium 119，第130-149頁(yè)；Gheysen，H.M.，1986，Molecular Immunology，23，7，709-715)；或與天然IgE表位足夠相似以便當(dāng)與合適的載體偶聯(lián)時(shí)能夠產(chǎn)生與所述天然IgE表位交叉反應(yīng)的抗體的實(shí)體。
本發(fā)明的模擬表位可以是肽，或是非肽類。以上鑒定的表面暴露的IgE表位的肽模擬表位可以具有一段不同于所述天然表位的序列，但也可以具有與所述天然表位完全相同的序列。這樣一種分子稱為所述表位的模擬表位，因?yàn)殡m然這兩種分子共享相同的序列，但模擬表位將不在完整的Cε2區(qū)結(jié)構(gòu)環(huán)境內(nèi)呈遞，并且因此所述模擬表位可能采取與所述天然IgE表位略為不同的構(gòu)象。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，以上鑒定的線性序列(P1至P7)當(dāng)在IgE三級(jí)結(jié)構(gòu)中時(shí)，與IgE一級(jí)結(jié)構(gòu)中可能相隔的其它區(qū)相鄰。因此，例如一種P1的模擬表位可以是連續(xù)或是不連續(xù)的，因?yàn)樗蚰M多個(gè)P1區(qū)段和由這些相隔氨基酸殘基構(gòu)成的區(qū)段。
可以用于本發(fā)明的優(yōu)選的表面暴露區(qū)含有與環(huán)結(jié)構(gòu)有關(guān)的區(qū)。因此，本發(fā)明的肽或模擬表位可以包含一個(gè)具有N端或C端延伸的環(huán)，所述延伸可以是來(lái)自相鄰β-折疊的天然氨基酸殘基。作為實(shí)例，P1含有IgE Cε2區(qū)的C-D環(huán)，P2含有所述區(qū)的D-E環(huán)，P3含有所述區(qū)的E-F環(huán)，P4含有所述區(qū)的F-G環(huán)，P5含有所述區(qū)的A-B環(huán)，而P6含有所述區(qū)的B-C環(huán)。因此，這些環(huán)的模擬表位構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)方面。
特別優(yōu)選的藥物基于表位P1及其模擬表位。加入這種表位及其模擬表位的肽當(dāng)與載體偶聯(lián)時(shí)，有效誘導(dǎo)能夠抑制人嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺的抗IgE免疫應(yīng)答。而且，這些免疫應(yīng)答是非過(guò)敏原性的。P1的模擬表位最初被描述為當(dāng)配制為免疫原時(shí)能夠誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的實(shí)體，并且所述應(yīng)答能夠在IgE Cε2區(qū)的環(huán)境中識(shí)別P1。
P1對(duì)應(yīng)于Cε2區(qū)的C-D環(huán)。免疫球蛋白折疊的C-D環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)于Cβ鏈末端和Dβ鏈起始之間的連接鏈(Introduction to proteinStructure，第304頁(yè)，第2版，Branden和Tooze，Garland Publishing，New York，ISBN 0 8153 2305-0)，大約對(duì)應(yīng)于IgE分子的氨基酸殘基號(hào)Trp268-Ser280。因此，IgE Cε2 C-D環(huán)的模擬表位以及能夠與IgE Cε2C-D環(huán)結(jié)合的配體構(gòu)成了本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面。
可以通過(guò)添加、缺失或取代選定的氨基酸，設(shè)計(jì)用于特定目的的以上所鑒定IgE表位的肽模擬表位。因此，為了易于與蛋白載體綴合，可以對(duì)本發(fā)明的肽加以修飾。例如，對(duì)于某些化學(xué)綴合方法，可能希望在所述IgE表位中包括一個(gè)末端半胱氨酸。另外，可能希望與蛋白載體綴合的肽包括一個(gè)遠(yuǎn)離所述肽綴合末端的疏水末端，使得所述肽的游離的未綴合末端保持與載體蛋白表面結(jié)合。這降低了所述肽的構(gòu)象的自由度，并因此增加了所述肽以最類似于完整IgE分子環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的IgE肽的構(gòu)象呈遞的可能性。例如，可以改變所述肽，以使其具有一個(gè)N末端半胱氨酸和一個(gè)C末端疏水酰胺化尾。另一方面，可以添加或取代D-立體異構(gòu)體形式的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，以產(chǎn)生有益的衍生物，例如以增強(qiáng)所述肽的穩(wěn)定性。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，這類修飾的肽或模擬表位可以是完全非肽或部分非肽的模擬表位，其中組成殘基不必限于20種天然存在的氨基酸。另外，這些肽或模擬表位可以用本領(lǐng)域已知的技術(shù)進(jìn)行環(huán)化，以將所述肽限于一種非常類似所述肽序列在完整IgE分子環(huán)境中的形狀的構(gòu)象。
含有一對(duì)半胱氨酸殘基以允許形成二硫橋的優(yōu)選環(huán)化肽的實(shí)例是PT1079(SEQ ID NO.14)、PT1079GS(SEQ ID NO.15)、PT1078(SEQID NO.16)和P15q(SEQ ID NO.11)。
此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的模擬表位或免疫原可以比所述分離的肽長(zhǎng)，并且可以包含本文公開的序列。因此，本發(fā)明的模擬表位可以包括在一端或兩端加入許多其它天然殘基的N端和/或C端延伸。所述肽模擬表位也可以是天然IgE序列的retro序列，因?yàn)樗鲂蛄蟹较蚴欠聪虻?；或者所述序列可以全部或至少部分由D-立體異構(gòu)體氨基酸組成(inverso序列)。此外，所述肽序列可以是相稱的retro-inverso，因?yàn)樾蛄蟹较蚴欠聪虻牟⑶宜霭被崾荄-立體異構(gòu)體形式。這類retro或retro-inverso肽的優(yōu)點(diǎn)是非自身的，因此可以解決免疫系統(tǒng)中自身耐受的問(wèn)題(例如P15r-參見下文)。
或者，可以采用例如噬菌體展示技術(shù)(EP 0 552 267 B1)的技術(shù)，用本身能夠與本發(fā)明IgE表位結(jié)合的抗體鑒定肽模擬表位。該技術(shù)產(chǎn)生大量的模擬天然肽結(jié)構(gòu)、并因此能夠與抗天然肽抗體結(jié)合的肽序列，但可能其自身不必與所述天然IgE肽共享顯著的序列同源性。這種途徑可能由于允許鑒定出免疫原性特性增強(qiáng)(例如與所述IgE受體或抗IgE抗體的較高親和性結(jié)合特性，或能夠誘導(dǎo)以較高親和性與IgE結(jié)合的多克隆免疫應(yīng)答)的肽而具有明顯的優(yōu)勢(shì)，或者可以解決可能與天然肽序列應(yīng)用有關(guān)的任何潛在的自身抗原耐受的問(wèn)題。另外，該技術(shù)使得能夠根據(jù)所識(shí)別的模擬表位序列中其共享的化學(xué)特性，鑒定出每種天然肽的識(shí)別模式。
修飾的肽模擬表位的優(yōu)選實(shí)例和噬菌體衍生的模擬表位的實(shí)例包括
在其它模擬表位中，P1、P2、P3、P4、P4、P5、P6或P7的氨基酸殘基每個(gè)可以被最類似該氨基酸的氨基酸獨(dú)立地取代。例如，A可以被V、L或I取代，如下表所述。
能夠與表面暴露的Cε2 IgE表位結(jié)合的配體以及包含所述配體的藥用組合物構(gòu)成了本發(fā)明的部分。這類配體能夠用于被動(dòng)預(yù)防或治療，通過(guò)將這類配體給予患者，緩解變應(yīng)性疾病。這類有用配體的實(shí)例包括單克隆抗體或多克隆抗體。例如，可以對(duì)在1只動(dòng)物中誘導(dǎo)的抗體加以純化，并且被動(dòng)給予另一只動(dòng)物，以預(yù)防或治療變態(tài)反應(yīng)。采用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，也可以應(yīng)用本發(fā)明的肽來(lái)產(chǎn)生單克隆抗體雜交瘤(采用已知的技術(shù)，例如Khler和Milstein，Nature，1975，256，第495頁(yè))、人源化單克隆抗體或CDR移植單克隆抗體。因此，本發(fā)明的一個(gè)相關(guān)方面是能夠與IgE Cε2區(qū)的表面暴露表位結(jié)合的配體。這類配體的實(shí)例是抗體(或Fab片段)。這類抗體可以用于被動(dòng)免疫預(yù)防或免疫治療，或其本身可以用于鑒定IgE肽模擬表位。
本文的術(shù)語(yǔ)“抗體”用來(lái)指具有有用抗原結(jié)合特異性的分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解該術(shù)語(yǔ)也可以包括作為抗體片段或衍生物、但可以顯示出相同或非常類似的功能性的多肽。本文使用的術(shù)語(yǔ)抗體將包括這類抗體片段或衍生物。
優(yōu)選的配體是單克隆抗體。特別優(yōu)選的配體是P1的配體，最好是單克隆抗體。例如，PTmAb0011是根據(jù)用于專利的微生物保存布達(dá)佩斯條約于1999年3月8日保藏于ECACC(歐洲動(dòng)物細(xì)胞保藏中心，Vaccine Research and Production Laboratory，Public HealthLaboratory Service，Centre for Applied Microbiology Research，PortonDown，Salisbury，Wiltshire，SP4 OJG，英國(guó))的小鼠IgG1型單克隆抗體的參考名稱，其保藏號(hào)為99030805。
例如，PTmAb0011識(shí)別Cε2的C-D環(huán)，其本身與人嗜堿性粒細(xì)胞上高親和受體結(jié)合時(shí)能夠識(shí)別IgE，而不引起脫顆粒，此外它能夠通過(guò)阻止IgE與FcεR1α結(jié)合并且抑制變應(yīng)性嗜堿性粒細(xì)胞中LolP1觸發(fā)的組胺釋放，阻斷非變應(yīng)性嗜堿性粒細(xì)胞的被動(dòng)敏化。識(shí)別Cε2的C-D環(huán)的另一單克隆抗體是is PTmAb0005(可得自SigmaChemicals Catalogue number I6510，克隆號(hào)GE-1)。本發(fā)明提供藥用組合物中的這種單克隆抗體。
P1的配體已經(jīng)用于噬菌體淘選技術(shù)，以鑒定新的P1模擬表位。例如，能夠識(shí)別P1的一種單克隆抗體結(jié)合表達(dá)以下序列的噬菌體 通過(guò)用PTmAb0011和PTmAb0005進(jìn)行噬菌體淘選，已經(jīng)鑒定出Cε2 IgE的C-D環(huán)的其它肽模擬表位。這類模擬表位的實(shí)例包括
因此，能夠與PTmAb0005或PTmAb0011結(jié)合的IgE Cε2的模擬表位以及包含這些模擬表位的免疫原構(gòu)成了本發(fā)明的一個(gè)重要方面。包含能夠與PTmAb0005或PTmAb0011結(jié)合的模擬表位的疫苗可用于治療變態(tài)反應(yīng)。
雖然不限制P1模擬表位的更廣義的定義，但根據(jù)這些和其它噬菌體序列，已經(jīng)鑒定出一個(gè)亞組P1樣肽的核心模式。該模式是一個(gè)亞組的P1模擬表位，并且在該特定抗P1單克隆抗體的識(shí)別所需的每個(gè)位置中氨基酸的化學(xué)特性方面描述了其模擬表位yhxdhhananxy其中y......y可以被環(huán)化。
h 疏水性(cys；pro；gly；ala；val；ile；leu；trp；met；phe)。
d 給予離子鍵的(arg；lys；his；gln；asn；trp；tyr；thr；ser)。
a 酸性(asp；glu)。
n 離子中性/非極性(除asp、glu、lys、arg外的所有氨基酸)。
x 任何氨基酸(n＝0-3)。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，P1的模擬表位可以用上述通用核心特征 y h x d h h a n a n x y 來(lái)加以描述。P1肽或其模擬表位可以任選地在任一端鄰接其它氨基酸，以有助于綴合或用于任何其它目的。
P1的一種特別優(yōu)選的模擬表位是P15s(SEQ ID NO.17)，已經(jīng)表明其Q、M和第一個(gè)D殘基對(duì)于PTmAb0011和PTmAb0005結(jié)合活性是關(guān)鍵性的(參見實(shí)施例)。因此，一種其中非必需殘基被相似氨基酸(如上概述)取代的P15s模擬表位的結(jié)構(gòu)式將是Q，X1，M，D，X1，X2，X3其中X1選自V、I、L、M、F或A；X2選自D或E；而X3選自L、I、V、M、A或F。
應(yīng)用PTmAb0005和PTmAb0011鑒定IgE的新模擬表位以隨后用于變態(tài)反應(yīng)治療，也構(gòu)成了本發(fā)明的一個(gè)重要方面。由于PTmAb0005是市售的，因此這種配體不構(gòu)成本發(fā)明的組合物，然而，包含PTmAb0005的藥用組合物及其在鑒定P1模擬表位中的應(yīng)用則構(gòu)成了本發(fā)明的兩個(gè)重要方面。
P2、P3、P4和P5的模擬表位也構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)重要方面。例如，P16和P17分別是P2和P3的模擬表位。這些肽當(dāng)在載體上適當(dāng)?shù)爻蔬f時(shí)，均能夠誘導(dǎo)非過(guò)敏原性的強(qiáng)抗IgE抗體應(yīng)答。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，加入以上鑒定的本發(fā)明的表位或者肽或非肽模擬表位的肽的大小將很小，使得它們模擬選自完整Cε2區(qū)的一個(gè)區(qū)域。設(shè)想了肽模擬表位因此應(yīng)該在長(zhǎng)度上小于100個(gè)氨基酸，優(yōu)選不足75個(gè)氨基酸，更優(yōu)選不足50個(gè)氨基酸，最優(yōu)選長(zhǎng)度在4-25個(gè)氨基酸的范圍內(nèi)。優(yōu)選的肽模擬表位的具體實(shí)例是PT1079和P15q，它們分別長(zhǎng)21個(gè)氨基酸和13個(gè)氨基酸。根據(jù)分子體積，設(shè)計(jì)了大小很小的其肽對(duì)應(yīng)物的非肽模擬表位。
對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是可以采用多種技術(shù)證實(shí)特定構(gòu)建體作為模擬表位的資格(status)。這類技術(shù)包括以下技術(shù)可以分析推定的模擬表位，以確定所述構(gòu)建體的免疫原性，因?yàn)橛伤鐾贫ǖ哪M表位產(chǎn)生的抗血清與所述天然IgE分子交叉反應(yīng)，并且也有效地阻斷變應(yīng)性效應(yīng)細(xì)胞釋放變應(yīng)性介質(zhì)。這些應(yīng)答的特異性可以通過(guò)用所述模擬表位本身或所述天然IgE和/或已知結(jié)合IgE Cε2的表面暴露表位的特異性單克隆抗體阻斷抗血清活性的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)來(lái)加以證實(shí)。用于所述競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定的這類單克隆抗體的具體實(shí)例包括例如PTmAb0005和PTmAb0011，這將證實(shí)所述推定的模擬表位作為IgECε2區(qū)C-D環(huán)模擬表位的資格。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將至少一種加入一個(gè)IgE表位或模擬表位的上述肽與載體分子連接，以形成用于疫苗接種方案的免疫原。最好是，所述載體分子與所述天然IgE分子無(wú)關(guān)。所述肽或模擬表位通過(guò)化學(xué)共價(jià)綴合或通過(guò)遺傳工程融合配偶體的表達(dá)、任選地通過(guò)一個(gè)接頭序列而連接。
可以以本領(lǐng)域眾所周知的方式進(jìn)行所述肽與免疫原性載體的共價(jià)偶聯(lián)。因此，例如利用碳二亞胺、戊二醛或(N-[γ-馬來(lái)酰亞胺基丁酰氧基])琥珀酰亞胺酯，利用普通市售的異雙功能接頭例如CDAP和SPDP(采用生產(chǎn)商的說(shuō)明)進(jìn)行直接共價(jià)偶聯(lián)是可能的。在偶聯(lián)反應(yīng)之后，可以借助透析法、凝膠過(guò)濾法、分級(jí)分離法等容易地分離并純化所述免疫原。
本領(lǐng)域技術(shù)人員容易了解用于本發(fā)明免疫原中的載體的類型。載體的功能是提供細(xì)胞因子輔助，以有助于誘導(dǎo)針對(duì)所述IgE肽的免疫應(yīng)答?？梢杂糜诒景l(fā)明的非詳盡載體表包括匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、血清白蛋白例如牛血清白蛋白(BSA)、滅活細(xì)菌毒素例如破傷風(fēng)毒素或diptheria毒素(TT和DT)、或其重組片段(例如TT片段C的結(jié)構(gòu)域1、或DT的易位結(jié)構(gòu)域(translocation domain)、或結(jié)核菌素的純化蛋白衍生物(PPD)。另一方面，可以將所述模擬表位或表位直接與脂質(zhì)體載體綴合，這還可以包括能夠提供T細(xì)胞輔助的免疫原。肽與載體之比最好約為1∶1至20∶1，最好每個(gè)載體應(yīng)該攜帶3-15個(gè)肽。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，一種優(yōu)選的載體是流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)的D蛋白(EP 0 594 610 B1)。D蛋白是一種流感嗜血菌的IgD結(jié)合蛋白，并且已由Forsgren取得專利權(quán)(WO91/18926，已授權(quán)的EP 0 594 610 B1)。在某些情況下，例如在重組免疫原表達(dá)系統(tǒng)中，可能希望使用D蛋白的片段，例如D蛋白的1/3(包含D蛋白N末端100-110個(gè)氨基酸(GB 9717953.5))。
呈遞本發(fā)明IgE肽的另一種優(yōu)選方法是在重組融合分子的環(huán)境中。例如，EP 0 421 635 B描述了應(yīng)用嵌合嗜肝DNA病毒核心抗原粒子，以在病毒樣粒子中呈遞外源肽序列。因此，本發(fā)明的免疫原可以包含在由乙型肝炎核心抗原組成的嵌合粒子中呈遞的IgE肽。另外，所述重組融合蛋白可以包含本發(fā)明的模擬表位和一種載體蛋白，例如流感病毒的NS1。對(duì)于構(gòu)成本發(fā)明部分的任何重組表達(dá)的蛋白而言，編碼所述免疫原的核酸也構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)方面。
用于本發(fā)明的肽可以容易通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的固相法合成。通過(guò)采用“T-boc”或“F-moc”法可以進(jìn)行合適的合成。運(yùn)用眾所周知的“F-moc”法和在全自動(dòng)裝置中用聚酰胺樹脂，可以通過(guò)固相法合成環(huán)肽。另一方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)了解必需的實(shí)驗(yàn)室步驟以人工進(jìn)行所述方法。固相合成的技術(shù)和步驟描述于′Solid Phase Peptide SynthesisA Practical Approach′，E.Atherton和R.C.Sheppard，由IRL at OxfordUniversity Press出版(1989)?；蛘?，可以采用重組法產(chǎn)生所述肽，所述重組法包括在細(xì)菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中表達(dá)編碼所述模擬表位的核酸分子，然后純化所表達(dá)的模擬表位。用于重組表達(dá)肽和蛋白的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且描述于Maniatis，T.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Sambrook等，Molecular cloning，a laboratory manual，第2版；Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)。
本發(fā)明的免疫原可以包含先前描述的肽，包括模擬表位；或可以是免疫交叉反應(yīng)衍生物或其片段。編碼本發(fā)明免疫原或肽、模擬表位或其衍生物的核酸的部分也構(gòu)成了本發(fā)明的部分。另外，本發(fā)明的免疫原可以在同一免疫原中包含一種以上類型的表位，即P1和P2，或所述模擬表位本身可以包含一種以上類型的表位。
因此，本發(fā)明提供了新肽(包括本發(fā)明的表位或模擬表位)(如上所限定的)在預(yù)防或治療變態(tài)反應(yīng)的藥用組合物生產(chǎn)方面的應(yīng)用。包含本發(fā)明模擬表位或肽以及載體分子的免疫原也可供用于用來(lái)免疫預(yù)防或治療變態(tài)反應(yīng)的疫苗。因此，本發(fā)明的模擬表位、肽或免疫原可供用于醫(yī)學(xué)以及變應(yīng)性疾病的醫(yī)藥治療或預(yù)防。因此，提供了治療變態(tài)反應(yīng)的方法，包括將本發(fā)明的疫苗或藥物給予患有或易患變態(tài)反應(yīng)的患者。
本發(fā)明的疫苗最好也包括一種佐劑。用于本發(fā)明疫苗的合適佐劑包括能夠增強(qiáng)針對(duì)所述IgE肽免疫原的抗體應(yīng)答的那些佐劑。佐劑是本領(lǐng)域眾所周知的(Vaccine Design-The Subunit and AdjuvantApproach，1995，Pharmaceutical Biotechnology，第6卷，Powell，M.F.和Newman，M.J.編著，Plenum Press，New York和London，ISBN 0-306-44867-X)。與本發(fā)明免疫原一起使用的優(yōu)選佐劑包括鋁鹽或鈣鹽(例如氫氧化物或磷酸鹽)。其它佐劑包括皂苷佐劑，例如QS21(US 5,057,540)和3D-MPL(GB 2220 211)。
一般將給予初次劑量和加強(qiáng)劑量的本發(fā)明疫苗。預(yù)期加強(qiáng)劑量將予以適當(dāng)?shù)亻g隔，或最好每年給予一次，或以循環(huán)抗體下降至所需水平之下時(shí)給予。加強(qiáng)劑量可以包括在缺乏原始載體分子情況下的所述肽。這種加強(qiáng)構(gòu)建體可以包含一種替代載體，或可以沒有任何載體。
在本發(fā)明的再一方面，提供本文描述的用于醫(yī)藥的疫苗。
通過(guò)系統(tǒng)途徑或粘膜途徑給予本發(fā)明的疫苗制劑，可以用所述疫苗制劑來(lái)保護(hù)或治療易患或患有變態(tài)反應(yīng)的哺乳動(dòng)物。這些給藥可以包括經(jīng)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)或皮下途徑注射；或經(jīng)粘膜給予口/消化道、呼吸道、泌尿生殖道。一種優(yōu)選的給藥途徑是經(jīng)皮途徑，例如通過(guò)皮膚貼劑。
每個(gè)疫苗劑量中的蛋白量選定為典型疫苗中誘導(dǎo)免疫保護(hù)反應(yīng)且無(wú)明顯副作用的量。這種量將根據(jù)使用何種具體免疫原以及如何呈遞免疫原而變化。一般而言，預(yù)期每個(gè)劑量將包含1-1000μg蛋白，優(yōu)選1-500μg，，優(yōu)選1-100μg，其中最優(yōu)選的范圍是1-50μg。特定疫苗的最適量可以通過(guò)包括觀察受治療者的合適免疫應(yīng)答的標(biāo)準(zhǔn)研究來(lái)確定。在初次接種后，受治療者可以接受適當(dāng)間隔的一次或數(shù)次加強(qiáng)接種。
包含上述配體的藥用組合物也構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)方面。也提供所述配體在醫(yī)學(xué)以及變態(tài)反應(yīng)治療藥物生產(chǎn)方面的應(yīng)用。
本發(fā)明的多個(gè)方面也可以用于診斷分析。例如，可以用多組識(shí)別不同本發(fā)明肽的配體，來(lái)分析取自患者的血清中存在的抗IgE的效價(jià)。此外，所述肽本身可以用來(lái)將循環(huán)抗IgE分型。在某些情況下，分析例如特應(yīng)性患者中循環(huán)抗IgE水平是合適的，因此本發(fā)明的肽和多克隆/單克隆抗體可以用于診斷特應(yīng)性。另外，所述肽可以用來(lái)從患者血液中親和除去循環(huán)抗IgE，然后將所述血液回輸給所述患者。
也構(gòu)成本發(fā)明部分的是采用IgE結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)模型，鑒定用于免疫預(yù)防或治療變態(tài)反應(yīng)的免疫原以及鑒定IgE的表面暴露的那些肽的方法。然后可以將這些區(qū)域配制到免疫原中并用于醫(yī)學(xué)。因此，應(yīng)用PTmAb0005和PTmAb0011鑒定用于變態(tài)反應(yīng)免疫預(yù)防或治療的肽也構(gòu)成本發(fā)明的部分。
在New Trends and Developments in Vaccines，Voller等編著，University Park Press，Baltimore，Maryland，U.S.A.1978中全面描述了疫苗制劑。Likhite的美國(guó)專利4,372,945和Armor等的美國(guó)專利4,474,757公開了蛋白與大分子的綴合。
IgE氨基酸殘基的編號(hào)系統(tǒng)通常是Dorrington KJ和Bennich H(1978)Immunol Rev 41 3-25以及Bennich H和Bahr-Lindastrom，H von(1978)Prog Immunol 11 49-58描述的編號(hào)系統(tǒng)。然而，隨后的人IgE基因和cDNA序列的測(cè)定(Max，E.E.等1982，Cell 29 691-699；FlanaganJ.G.和Rabbitts，T.H.，1982，參見上文；Kenten，J.H.等，1982，參見上文)，揭示了Cε2中位置273(Kabat編號(hào))的一個(gè)額外的亮氨酸，該亮氨酸是先前的論文中未曾報(bào)道的。因此，本發(fā)明人所采用的編號(hào)方案可能不同于Dorrington KJ和Bennich采用的編號(hào)方案。
附圖描述

圖1，采用Padlan和Davies 1986模型的IgE氨基酸表面暴露。
圖2，化學(xué)方案1，固相肽合成。
圖3，化學(xué)方案2和方案3，修飾的載體制備。
圖4，化學(xué)方案4，肽/載體綴合。
圖5，C67-8抗IgE數(shù)據(jù)。(A)用25μg BSA-IgE C67-8(用PTL化學(xué)綴合的)或3μg HepB核心-IgE C67-8構(gòu)建體免疫的Balb C小鼠血清抗平板結(jié)合IgE的反應(yīng)性。(B)用25μg BSA-IgE C67-8(用PTL化學(xué)綴合的)或3μg HepB核心-IgE C67-8構(gòu)建體免疫的Balb C小鼠血清抗受體結(jié)合IgE的反應(yīng)性。
圖6，用可溶性IgE和IgE C67-8肽進(jìn)行的競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定。將來(lái)自BSA-IgE C67-8或HBC-IgEC67-8免疫的小鼠的血清與可溶性IgE(10μg/ml)或IgE C67-8肽(25μM)或不相關(guān)肽PT326(25μM)預(yù)溫育，然后加入到IgE包被的ELISA板中。數(shù)據(jù)為平均值±S.E.M(n＝10)。
圖7，PT1079抗IgE數(shù)據(jù)。(A)用25μg BSA-PT1079(用PTL化學(xué)綴合的)或3μg HepB核心-1079構(gòu)建體免疫的Balb C小鼠血清抗平板結(jié)合IgE的反應(yīng)性。(B)用25μg BSA-1079(用PTL化學(xué)綴合的)或3μg HepB核心-1079構(gòu)建體免疫的Balb C小鼠血清抗受體結(jié)合IgE的反應(yīng)性。
圖8，用可溶性IgE和PT1079肽進(jìn)行的競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定。將來(lái)自BSA-1079或HBC-1079免疫小鼠的血清與可溶性IgE(10μg/ml)或PT1079肽(25μM)或不相關(guān)肽PT326(25μM)預(yù)溫育，然后加入到IgE包被的ELISA板中。數(shù)據(jù)為平均值±S.E.M(n＝10)。
圖9，PT1078抗IgE數(shù)據(jù)。(A)用25μg BSA-PT1078(用PTL化學(xué)綴合的)免疫的Balb C小鼠血清抗平板結(jié)合IgE的反應(yīng)性。(B)用25μgBSA-1078(用PTL化學(xué)綴合的)免疫的Balb C小鼠血清抗受體結(jié)合IgE的反應(yīng)性。
圖10，用可溶性IgE和PT1078肽進(jìn)行的競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定。將BSA-1078免疫小鼠的血清與可溶性IgE(10μg/ml)或PT1078肽(25μM)或不相關(guān)肽PT326(25μM)預(yù)溫育，然后加入到IgE包被的ELISA板中。數(shù)據(jù)為平均值±S.E.M(n＝10)。
圖11，PT1079gs抗IgE數(shù)據(jù)。(A)用3μg HBC-1079gs免疫的BalbC小鼠血清抗平板結(jié)合IgE的反應(yīng)性，(B)用3μg HBC-1079gs免疫的Balb C小鼠血清抗受體結(jié)合IgE的反應(yīng)性。
圖12，用可溶性IgE和PT1079肽進(jìn)行的競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定。將HBC-1079gs免疫小鼠的血清與可溶性IgE(10μg/ml)或PT1079肽(25μM)或不相關(guān)肽PT326(25μM)預(yù)溫育，然后加入到IgE包被的ELISA板中。數(shù)據(jù)為平均值±S.E.M(n＝10)。
圖13，BSA-C67-8誘導(dǎo)的小鼠抗血清的抑制活性。來(lái)自LolP1敏感性供體的細(xì)胞用小鼠血清(以1/50稀釋)處理，然后用LolP1觸發(fā)以釋放組胺。數(shù)據(jù)為平均值±S.E.M.(n＝10)。
圖14，用BSA-1078和BSA 1079誘導(dǎo)的小鼠抗血清的抑制活性。來(lái)自LolP1敏感性供體的細(xì)胞用小鼠血清(BSA和BSA-1078抗血清以1/50稀釋；BSA-1079抗血清以1/1250稀釋)處理，然后用LolP1觸發(fā)以釋放組胺。數(shù)據(jù)為平均值±S.E.M.(n＝10)。
圖15，用HBC-C67-8、HBC-1078、HBC-1079和HBC-1079gs誘導(dǎo)的小鼠抗血清的抑制活性。來(lái)自LolP1敏感性供體的細(xì)胞用小鼠血清(HBC野生型(wt)和HBC-IgEC67-8抗血清以1/50稀釋；HBC-1079和HBC-1079gs抗血清以1/1250稀釋)處理，然后用LolP1觸發(fā)以釋放組胺。數(shù)據(jù)為平均值±S.E.M.(n＝10)。
圖16顯示依賴于濃度的抗體PTmAb0005和PTmAb0011與IgE的結(jié)合。
圖17，顯示與對(duì)照相比的抗體PTmAb0005和PTmAb0011對(duì)IgE與FcεR1α/IgG構(gòu)建體結(jié)合的濃度依賴性抑制。
圖18，顯示與對(duì)照比較的、抗體PTmAb0005對(duì)IgE與直接結(jié)合于塑料板的FcεRIα的修剪胞外域結(jié)合的濃度依賴性抑制。
圖19，顯示采用抗體PTmAb0005(GE-1)和PTmAb0011的IgE與FcεRII(CD23)的結(jié)合。
圖20，顯示與對(duì)照比較的、抗體PTmAb0005和PTmAb0011對(duì)變應(yīng)性人血嗜堿性粒細(xì)胞組胺釋放的濃度依賴性阻斷。
圖21，PTmAb0005和PTmAb0011兩者對(duì)LolP1觸發(fā)的變應(yīng)性人嗜堿性粒細(xì)胞組胺釋放的抑制。
圖22，PTmAb0011與不同IgE的結(jié)合；(A)PTmAb0011與嵌合IgE的結(jié)合；(B)PTmAb0011與骨髓瘤IgE的結(jié)合；(C)PTmAb0011與抗原定向IgE的結(jié)合；(D)PTmAb0011與熱變性IgE的結(jié)合圖23，PTmAb0011對(duì)IgE與FcεR1α結(jié)合的抑制。
圖24，PTmAb0011與受體結(jié)合IgE的結(jié)合。
圖25，(A)PTmAb0011對(duì)IgE與RPMI 8866細(xì)胞上FcεRII結(jié)合的影響。將RPMI 8866細(xì)胞(1×106/ml)在冰上與嵌合IgE(1μg/ml)和抗IgE mAb(10-0μg/ml)孵育1小時(shí)。使IgE和抗IgE于室溫溫育1小時(shí)，然后加入細(xì)胞中。用FITC-山羊抗人IgE檢測(cè)結(jié)合的IgE。結(jié)果顯示通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析10,000個(gè)活的門控(gated)事件測(cè)定的復(fù)份樣品的平均通道(channel)熒光(MCF)。(B)非P1特異性抗體PTmAb0017。
圖26，PTmAb0011對(duì)IgE與原代人B細(xì)胞上FcεRII結(jié)合的影響。將外周血單核細(xì)胞(1×106/ml)在冰上與嵌合IgE(1μg/ml)和抗IgEmAb(10-0μg/ml；空心)或相同濃度的同種型匹配的對(duì)照mAb(實(shí)心)孵育1小時(shí)。將所述IgE和抗IgE于室溫預(yù)溫育1小時(shí)，然后加入細(xì)胞中。用FITC-山羊抗人IgE檢測(cè)結(jié)合的IgE，用PE綴合的抗CD19顯示原代B細(xì)胞。顯示通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析5,000個(gè)活的門控事件測(cè)定的復(fù)份樣品的平均通道熒光(MCF)。
圖27，PTmAb0011對(duì)原代人B細(xì)胞分泌IgE的影響。
外周血單核細(xì)胞(2×105/孔)在補(bǔ)充IL-4(10ng/ml)和抗CD40抗體(1μg/ml)的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。加入PTmAb0011或一種同種型匹配的對(duì)照mAb(1μg/ml)達(dá)14天，然后收獲細(xì)胞上清液，并通過(guò)ELISA分析總IgE含量。結(jié)果以在缺乏任何抗體的情況下分泌的IgE量的百分比表示。
圖28，抗人IgE單克隆抗體在變應(yīng)性(A)和非變應(yīng)性(B)人嗜堿性粒細(xì)胞中的過(guò)敏原性。來(lái)自變應(yīng)性供體或用1μg/ml嵌合IgE被動(dòng)敏化的非變應(yīng)性供體的PBMC用mAb于37℃處理30分鐘。通過(guò)特異性EIA測(cè)定組胺的釋放。數(shù)據(jù)為每個(gè)不同供體3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。
圖29，抗人IgE單克隆抗體在敏化(A)和非敏化(B)人肺肥大細(xì)胞中的過(guò)敏原性。敏化或非敏化的粗制人肺肥大細(xì)胞懸浮液用抗體于37℃處理45分鐘。通過(guò)比色分析，測(cè)定上清液中類胰蛋白酶的釋放。數(shù)據(jù)為來(lái)自一個(gè)代表實(shí)驗(yàn)的復(fù)份測(cè)定的平均值。
圖30，抗人IgE抗體在RBL J41細(xì)胞中通過(guò)人FcεR1(A)和小鼠FcεR1(B)的過(guò)敏原性。RBL J41細(xì)胞用嵌合人IgE或小鼠IgE敏化，然后用抗體于37℃處理30分鐘。通過(guò)比色分析，測(cè)定上清液中的β-氨基己糖苷酶釋放。數(shù)據(jù)為來(lái)自一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)的三份平行測(cè)定的平均值。
圖31，PTmAb0011對(duì)人嗜堿性粒細(xì)胞中變應(yīng)原觸發(fā)的組胺釋放的抑制。將PBMC與PTmAb0011或者直接(變應(yīng)性測(cè)定(A))于37℃溫育30分鐘，或者將它們與IgE(阻斷測(cè)定(B))一起于37℃溫育30分鐘。隨后細(xì)胞用抗原于37℃觸發(fā)30分鐘，然后通過(guò)特異性EIA測(cè)定組胺的釋放。數(shù)據(jù)為不同供體的3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±s.e.m.。
圖32，PTmAb0011和PTmAb0005對(duì)猴皮膚中被動(dòng)皮膚過(guò)敏反應(yīng)的抑制。單克隆抗體Dec7B(stanworth十肽)用作對(duì)照。
通過(guò)以下實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于以下實(shí)施例。部分1 本發(fā)明的模擬表位和免疫原實(shí)施例1.1.1表面暴露表位的鑒定、化學(xué)綴合和血清學(xué)方法用Padlan和Davies描述的人IgE的建模結(jié)構(gòu)(Mol.Immunol.，23，1063-75，1986)，鑒定IgE Cε2區(qū)的表面暴露表位。鑒定出連續(xù)的溶劑暴露的肽。這通過(guò)以下步驟完成采用分子模擬軟件(MSI)計(jì)算每種IgE氨基酸的可及性，在5殘基滑動(dòng)窗口范圍平均所述可及表面，由此鑒定出IgE肽中5-mer內(nèi)平均值大于802的區(qū)域。試驗(yàn)結(jié)果示于圖1。結(jié)果從圖1以及采用1990 Helm等模型(于2/10/90以PDB存儲(chǔ)的2IgE模型結(jié)構(gòu)(Protein Data Bank，Research Collabarotory for StructuralBioinformatics))的同一方法的多次重復(fù)來(lái)看，有許多天然肽可以用作用以產(chǎn)生抗IgE抗體的免疫原。表1，天然表面暴露的連續(xù)IgE肽。
合成這些肽或其模擬表位，并且或者將其與載體蛋白綴合，或者將其置于肝炎核心抗原構(gòu)建體中，以形成表達(dá)重組肽的病毒樣粒子。1.2采用琥珀酰亞胺-馬來(lái)酰亞胺交聯(lián)劑合成IgE肽/D蛋白綴合物采用馬來(lái)酰亞胺-琥珀酰亞胺交聯(lián)劑，可以將D蛋白直接與IgE肽綴合，形成本發(fā)明的抗原。這種化學(xué)通過(guò)固定琥珀酰亞胺基團(tuán)提供載體殘基的受控NH2活化。所述馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)是一個(gè)半胱氨酸結(jié)合位點(diǎn)。因此，對(duì)于以下實(shí)施例的目的，待綴合的IgE肽需要加入一個(gè)N末端半胱氨酸。
所述偶聯(lián)劑是一種選擇性異雙功能交聯(lián)劑，該化合物的一端通過(guò)琥珀酰亞胺基酯活化蛋白載體的氨基，而另一端通過(guò)馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)偶聯(lián)所述肽的巰基。反應(yīng)方案如下a.通過(guò)賴氨酸和琥珀酰亞胺基酯之間的反應(yīng)活化蛋白 b.通過(guò)與馬來(lái)酰亞胺基反應(yīng)在活化蛋白和所述肽的半胱氨酸之間偶聯(lián) 1.3IgE肽-D蛋白綴合物的制備將D蛋白以2.5mg/ml的濃度溶于pH7.2的磷酸緩沖鹽溶液中。將偶聯(lián)劑(N-[γ-馬來(lái)酰亞胺基丁酰氧基]琥珀酰亞胺酯-GMBS)以102.5mg/ml溶于DMSO中，并加入所述蛋白溶液中。1mg D蛋白使用1.025mg GMBS。將反應(yīng)溶液于室溫溫育1小時(shí)。通過(guò)在sephacryl200HR滲透凝膠上脫鹽步驟除去副產(chǎn)物。所用的洗脫液是磷酸緩沖鹽溶液Tween 80 0.1％pH6.8。收獲并合并所述活化蛋白。將所述肽(在表1中鑒定的，或其衍生物或模擬表位)以4mg/ml溶于0.1M乙酸中，以避免形成二硫鍵。偶聯(lián)使用每1分子活化D蛋白2-20個(gè)肽的摩爾比。將所述肽溶液緩慢加入到所述蛋白中，并且將混合物于25℃溫育1小時(shí)。在偶聯(lián)期間，將pH保持在6.6。通過(guò)于25℃、pH6.5下加入半胱氨酸(以4mg/ml溶于0.1M乙酸中每mg活化PD 0.1mg半胱氨酸)達(dá)30分鐘，進(jìn)行一個(gè)猝滅步驟。對(duì)NaCl 150mM Tween 80 0.1％透析2次，以除去過(guò)量的半胱氨酸或肽。
最后一個(gè)步驟是在0.22μm膜上進(jìn)行過(guò)濾除菌。終產(chǎn)物是澄清的可過(guò)濾溶液，將其保存于4℃?？梢酝ㄟ^(guò)氨基酸分析測(cè)定最終的肽/PD比。
以類似的方式，可以將本發(fā)明的肽與其它載體包括BSA綴合。
一種P1的模擬表位是合成的CLEDGQVMDVDLL(P15，SEQ IDNO.8)，采用上述技術(shù)將其與D蛋白和BSA兩者綴合。1.4ELISA法抗肽或抗肽載體ELISA用以下概述的ELISA技術(shù)，研究抗肽和抗載體免疫應(yīng)答。微量滴定板(Nunc)用PBS中的特定抗原包被(4°過(guò)夜)，然后進(jìn)行以下兩者之一2μg/ml鏈霉抗生物素蛋白(然后與生物素酰化肽(1μM)于37℃溫育1小時(shí))、洗滌3X PBS-Tween 20 0.1％。用PBS-BSA 1％-Tween 200.1％(飽和緩沖液)將板于37°飽和1小時(shí)。加入第一(1°)抗體＝以兩步稀釋的血清(于飽和緩沖液中)，于37°溫育1小時(shí)30分鐘。洗滌3次。加入與HRP偶聯(lián)的第二(2°)抗小鼠Ig(或抗小鼠同種型特異性單克隆抗體)，于37°溫育1小時(shí)。洗滌5次。用TMB于室溫避光顯色10分鐘。用0.4N H2SO4阻斷反應(yīng)。檢測(cè)小鼠血清中抗人IgE反應(yīng)性的方法(IgE板結(jié)合ELISA)ELISA板用pH9.6碳酸鹽/碳酸氫鹽包被緩沖液中的1μg/ml人嵌合IgE于37℃包被1小時(shí)，或于4℃包被過(guò)夜。用含5％w/v Marvel奶粉的PBS/0.05％Tween-20于37℃ 1小時(shí)封閉非特異性位點(diǎn)。隨后加入小鼠血清在PBS/0.05％Tween-20/1％w/v BSA/4％新生小牛血清中的連續(xù)稀釋液于37℃達(dá)1小時(shí)用山羊抗小鼠IgG-生物素(1/2000)，然后用鏈霉抗生物素蛋白-HRP(1/1000)，檢測(cè)多克隆血清結(jié)合。。用TMB底物于450nm檢測(cè)綴合的抗體。在每個(gè)板上包括一條PTmAb0011標(biāo)準(zhǔn)曲線，以便可以以μg/ml計(jì)算血清樣品中的抗IgE反應(yīng)性。檢測(cè)小鼠血清中抗人受體結(jié)合IgE反應(yīng)性的方法ELISA板用pH9.6碳酸鹽/碳酸氫鹽包被緩沖液中的0.5μg/ml重組人FcεR1α于37℃包被1小時(shí)，或于4℃包被過(guò)夜。用含5％w/vMarvel低脂奶粉的PBS/0.05％Tween-20于37℃ 1小時(shí)封閉非特異性位點(diǎn)。然后加入1μg/ml人IgE于37℃達(dá)1小時(shí)。隨后加入小鼠血清在PBS/0.05％ Tween-20/1％ w/v BSA/4％新生小牛血清中的連續(xù)稀釋液于37℃達(dá)1小時(shí)。用山羊抗小鼠IgG-生物素(1/2000)，然后用鏈霉抗生物素蛋白-HRP(1/1000)，檢測(cè)多克隆血清結(jié)合。用TMB底物于450nm檢測(cè)綴合的抗體。在每個(gè)板上包括一條PTmAb0011標(biāo)準(zhǔn)曲線，以便可以以μg/ml計(jì)算血清樣品中的抗IgE反應(yīng)性。用模擬表位肽-可溶性IgE或PTmAb0011競(jìng)爭(zhēng)IgE結(jié)合在預(yù)封閉的聚丙烯96孔板中，將多克隆小鼠血清的單一稀釋液與單一濃度的或者模擬表位肽或人IgE混合。將混合物于37℃溫育1小時(shí)，然后加入到IgE包被的ELISA板中于37℃達(dá)1小時(shí)。用山羊抗小鼠IgG-生物素(1/2000)，然后用鏈霉抗生物素蛋白-HRP(1/1000)，檢測(cè)多克隆血清結(jié)合。用TMB底物于450nm檢測(cè)綴合的抗體。對(duì)于血清和PTmAb0011競(jìng)爭(zhēng)IgE的結(jié)合，將血清和PTmAb0011-生物素的混合物加入到IgE包被的ELISA板中。用鏈霉抗生物素蛋白-HRP(1/1000)檢測(cè)PTmAb0011的結(jié)合。1.5人嗜堿性粒細(xì)胞測(cè)定用人嗜堿性粒細(xì)胞(HBA)進(jìn)行兩種類型的測(cè)定，一種測(cè)定是測(cè)定所述單克隆抗體的過(guò)敏原性，包括將所述抗體加入到分離的PBMC中；第二種測(cè)定是測(cè)量通過(guò)所述HBA與所述單克隆抗體的預(yù)溫育對(duì)LolPI(一種強(qiáng)變應(yīng)原)觸發(fā)的組胺釋放的抑制。
通過(guò)靜脈穿刺術(shù)從變應(yīng)性供者將血液收集到含有0.1體積2.7％EDTA，pH7.0的試管中。然后將其用等體積的含0.1％人血清白蛋白的HBH培養(yǎng)液(HBH/HSA)以1/2稀釋。將所產(chǎn)生的細(xì)胞懸浮液鋪在50％體積的Ficoll-Paque上，然后以400g于室溫離心30分鐘。收集位于界面的外周血單核細(xì)胞(PBMC)層，并棄去沉淀。細(xì)胞在HBH/HAS中洗滌1次，對(duì)其計(jì)數(shù)，將其重懸于HBH/HAS中，細(xì)胞密度為2.0×106/mL。將100μl細(xì)胞懸浮液加入到含100μl稀釋的試驗(yàn)樣品或單克隆抗體的V形底96孔板各孔中。以一定范圍的稀釋液測(cè)試每種試樣樣品，每種稀釋液6個(gè)孔。用平板搖動(dòng)器將孔內(nèi)容物短暫混合，然后于37℃溫育30分鐘，同時(shí)以120rpm振搖。
對(duì)于每種血清稀釋液，通過(guò)加入10μl LolpI提取物(最終稀釋度為1/10000)觸發(fā)3個(gè)孔，而3個(gè)孔含有加入的10μl HBH/HSA，以評(píng)價(jià)過(guò)敏原性。用平板搖動(dòng)器再次將孔內(nèi)容物短暫混合，然后于37℃再溫育30分鐘，同時(shí)以120rpm振搖。通過(guò)以500g離心5分鐘終止溫育。取出上清液，以采用市售組胺EIA測(cè)量試劑盒(Immunotech)進(jìn)行組胺測(cè)定。常規(guī)包括含有細(xì)胞但無(wú)試驗(yàn)樣品的對(duì)照孔，以測(cè)定自發(fā)釋放和觸發(fā)釋放。也包括含細(xì)胞+0.05％Igepal去污劑的孔，以測(cè)定總細(xì)胞組胺。
結(jié)果如下表示過(guò)敏原性測(cè)定由試驗(yàn)樣品引起的組胺釋放＝來(lái)自試樣樣品處理的細(xì)胞的組胺釋放的百分比-自發(fā)組胺釋放的百分比。阻斷測(cè)定采用下式可以計(jì)算組胺釋放的抑制程度抑制百分比＝1-(來(lái)自試樣樣品處理的細(xì)胞的組胺釋放*)×100(來(lái)自抗原刺激的細(xì)胞的組胺釋放*)根據(jù)自發(fā)釋放校正數(shù)值。實(shí)施例2，用P15綴合物(P15-BSA或P15-PD)免疫小鼠，誘導(dǎo)抗人IgE抗體的產(chǎn)生。
將在1.4中描述的包含模擬表位P15(25μg蛋白/劑量)的綴合物給予各組的10只BalbC小鼠，用WO 95/17210中描述的含有QS21和3D-MPL的水包油乳液作為佐劑。在第21天和第42天進(jìn)行加強(qiáng)，并且可以在第42天和第56天收集血清。用實(shí)施例1所述方法，測(cè)定免疫應(yīng)答抗肽和抗平板結(jié)合IgE。結(jié)果在第3次接種后第14天測(cè)量的抗肽和抗IgE應(yīng)答的結(jié)果示于表2中。表2，P15免疫原性結(jié)果
實(shí)施例3，用綴合物免疫后在小鼠中誘導(dǎo)的抗IgE是非過(guò)敏原性的可以在存在從變應(yīng)性患者新收集的外周血的嗜堿性粒細(xì)胞的情況下，測(cè)試全血清或從綴合物免疫小鼠純化的IgG的幾種稀釋液。
如下所述，通過(guò)測(cè)量由待測(cè)試抗體誘導(dǎo)的組胺釋放，可以評(píng)價(jià)過(guò)敏原性■在葡萄糖葡聚糖梯度上從外周血中取出紅細(xì)胞■洗滌細(xì)胞，并且加入待測(cè)試樣品(例如變應(yīng)原、抗體、變應(yīng)原+抗體、...)■溫育后，收集上清液，按照生產(chǎn)商的說(shuō)明(Immunotech，組胺酶免疫測(cè)定試劑盒)測(cè)量組胺釋放用或者P15-BSA或者P15-PD產(chǎn)生的抗血清都未表現(xiàn)出過(guò)敏原性。實(shí)施例4，用綴合物免疫后在小鼠中誘導(dǎo)的抗IgE能夠阻斷變應(yīng)原觸發(fā)變應(yīng)性患者的嗜堿性粒細(xì)胞誘導(dǎo)的IgE介導(dǎo)的組胺釋放。
可以測(cè)量在存在或缺乏全血清或從綴合物免疫小鼠純化的IgG的幾種稀釋液的情況下用不同濃度變應(yīng)原觸發(fā)的嗜堿性粒細(xì)胞樣品中的組胺釋放。通過(guò)測(cè)量由所述變應(yīng)原誘導(dǎo)的組胺釋放的抑制，評(píng)估抗血清中抗P15抗體的阻斷活性。如實(shí)施例3所述，測(cè)量組胺釋放和抑制。由于P15是一種P1的模擬表位，因此將PTmAb0011用作對(duì)照，因?yàn)橐阎c同一表位(P1)結(jié)合。結(jié)果示于表3中。表3，對(duì)變應(yīng)性人嗜堿性粒細(xì)胞組胺釋放的抑制
實(shí)施例5，P2和P3的模擬表位的免疫原性用實(shí)施例1.2所述技術(shù)，將以下模擬表位與BSA綴合，并且采用實(shí)施例2所述的相同制劑和方案，用所述綴合物免疫小鼠。
在最后一次免疫后給小鼠放血，并在IgE平板結(jié)合ELISA中測(cè)試抗IgE反應(yīng)性。以下總結(jié)了單個(gè)結(jié)果、平均結(jié)果(Av)、幾何平均結(jié)果(GM)(SD＝標(biāo)準(zhǔn)偏差)。表4，P16和P17免疫原性結(jié)果
實(shí)施例6，P1模擬表位的產(chǎn)生和其免疫原性/功能活性6.1免疫原的產(chǎn)生通過(guò)噬菌體展示技術(shù)或通過(guò)對(duì)IgE Cε2區(qū)的C-D環(huán)分子建模進(jìn)行合理設(shè)計(jì)，衍生P1的模擬表位。合成以下肽，并將其構(gòu)建為BSA-肽綴合物，也將其構(gòu)建到HepB核心抗原重組構(gòu)建體中。
如下產(chǎn)生所述肽/蛋白載體構(gòu)建體。如方案1(圖2)所示，在固相上制備?；码难苌?。用眾所周知的‘Fmoc’法，在全自動(dòng)儀器中，采用或者聚酰胺或者聚乙二醇-聚苯乙烯(PEG-PS)支持體，通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)[用于固相合成的技術(shù)和方法由E.Atherton和R.C.Sheppard描述于‘Solid Phase Peptide SynthesisA Practical Approach’，由IRL at Oxford University Press出版(1989)]，可以容易地制備這些肽衍生物。酸介導(dǎo)的切割提供了線性、去保護(hù)、經(jīng)修飾的肽。用D.Andreau等在‘Methods in Molecular Biology，第35卷PeptideSynthesis Protocols(M.W.Pennington和B.M.Dunn編著)，第7章，第91-171頁(yè)中概述的方法，可以容易地將這種肽氧化和純化，得到二硫橋修飾的表位。
采用以下技術(shù)，可以將由此合成的肽與蛋白載體(在這種情況下為牛血清白蛋白，BSA)綴合6.2修飾載體的合成采用如方案2所述(圖3，有關(guān)進(jìn)一步的細(xì)節(jié)參見WO 98/17628)制備的琥珀酰亞胺基活性酯(BAL-OSu)，引入芳基醛官能團(tuán)。將BAS(牛血清白蛋白)的氨基官能取代至約50％，得到常規(guī)可溶性的修飾蛋白。對(duì)所述BSA進(jìn)行更多的取代，產(chǎn)生不溶性構(gòu)建體。在DMSO/緩沖液(參見方案3，圖3)中將等摩爾濃度的BSA和BAL-OSu混合2小時(shí)。這種實(shí)驗(yàn)性衍生的方案導(dǎo)致通過(guò)熒光胺試驗(yàn)判斷，BSA中約50％游離氨基被取代。6.3肽-BSA構(gòu)建體修飾的肽和衍生化BSA的簡(jiǎn)單組合提供容易通過(guò)透析分離的肽-BSA構(gòu)建體(方案4，圖4)。用SDS-PAGE來(lái)證實(shí)分子量的增加。6.4肝炎核心抗原構(gòu)建體用EP 0 421 635 B中描述的分子生物學(xué)技術(shù)，也制備了肝炎核心抗原重組構(gòu)建體(HBC)。在這些HBC實(shí)驗(yàn)中，對(duì)PT1079加以修飾，以除去末端賴氨酸。
通過(guò)用PTmAb0005和PTmAb0011進(jìn)行BIAcore實(shí)驗(yàn)，證實(shí)P1模擬表位肽的表達(dá)。用僅為3μg/劑HBC的劑量產(chǎn)生免疫原性結(jié)果。6.5免疫原性研究純化所述模擬表位/HBC和模擬表位/BSA構(gòu)建體，將其配制為疫苗，并且用WO 95/17210中描述的含有QS21和3D-MPL的水包油乳液作為佐劑(25μg BSA綴合物劑量)。將這些疫苗給予各組的10只BalbC小鼠，并且在第14天和第28天進(jìn)行加強(qiáng)，然后在第42天收集血清。然后用實(shí)施例1.4中描述的技術(shù)，研究對(duì)抗平板結(jié)合IgE和受體定向IgE的免疫應(yīng)答。此外，用1.5中描述的技術(shù)，測(cè)量抗血清在抑制變應(yīng)性嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺方面的活性。6.6結(jié)果當(dāng)所述IgE直接結(jié)合于ELISA板時(shí)，以及定向到高親和性受體時(shí)，所有BSA和HBC構(gòu)建體均誘導(dǎo)高效價(jià)的抗IgE抗體。而且，證實(shí)所有這些應(yīng)答均是特異性的，因?yàn)樗鼈兪艿接坞xIgE和所述模擬表位本身的競(jìng)爭(zhēng)，并且不受非特異性肽的競(jìng)爭(zhēng)。由這些免疫原誘導(dǎo)的抗IgE能夠抑制來(lái)源于變應(yīng)性供體(黑麥草，LOLP1)的人嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺。
C67-8的結(jié)果參見圖5、6、13和15。PT1078的結(jié)果參見圖9、10、14和15。PT1079的結(jié)果參見圖7、8、14和15。PT1079GS的結(jié)果參見圖11、12和15。
此外，由這些肽模擬表位產(chǎn)生的免疫應(yīng)答不是過(guò)敏原性的。表5，P1模擬表位抗血清的過(guò)敏原性
表的腳注，來(lái)自LolP1過(guò)敏性供體的細(xì)胞用稀釋的小鼠血清處理30分鐘。通過(guò)市售的組胺特異性EIA測(cè)定釋放的組胺。數(shù)據(jù)為平均值±S.E.M.(n＝10)。部分2 與本發(fā)明的表位和模擬表位結(jié)合的配體肽免疫原為部分1中描述的肽免疫原，它們?cè)谝砸呙缧问浇o予哺乳動(dòng)物后，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，所述免疫應(yīng)答(a)識(shí)別IgE，和(b)能夠體外抑制組胺釋放。部分2描述了能夠與本發(fā)明的表位或模擬表位結(jié)合的配體，并且描述了其功能。已經(jīng)鑒定出兩種識(shí)別IgE Cε2的c-d環(huán)的單克隆抗體-PTmAb0005和PTmAb0011。在部分1中已經(jīng)表明這種肽的模擬表位是免疫原性的，并且在活性疫苗中有功能。這一節(jié)描述這些單克隆抗體的表征，并且提供它們?cè)诒粍?dòng)疫苗接種方面用途的證據(jù)。
采用噬菌體淘選技術(shù)，即多個(gè)噬菌體靶的序列對(duì)比，鑒定所述抗體的靶表位，隨后精選，并通過(guò)結(jié)構(gòu)域作圖和定點(diǎn)誘變加以證實(shí)。所述抗體的功能活性不僅在體外通過(guò)分析抗IgE的識(shí)別和變應(yīng)性介質(zhì)釋放的抑制得以證實(shí)，而且在體內(nèi)通過(guò)猴被動(dòng)皮膚過(guò)敏性(PCA)研究而得以證實(shí)。實(shí)施例7，7.1單克隆抗體靶的噬菌體作圖用噬菌體展示文庫(kù)，采用3種不同的噬菌體文庫(kù)，在噬菌體gVIIIp的N末端展示或者XCX15、XCX10或者XAX10肽序列(其中X為任何氨基酸)，將所述單克隆抗體的結(jié)合位點(diǎn)作圖。表6和表7顯示分別用抗人IgE單克隆抗體PTmAb0005和選擇肽配體的結(jié)果。所述肽和人IgE之間的氨基酸模式的相似性表明與IgE Cε2區(qū)中的c-d環(huán)的強(qiáng)同源性匹配。由噬菌體回復(fù)產(chǎn)生的同源性模式是Qhhahah(其中h＝疏水性氨基酸，而a＝酸性氨基酸)，并且這與人IgE Cε2區(qū)C-D環(huán)中的序列QVMDVDL(SEQ ID NO.17)是匹配的。
在IgEC67中，也對(duì)得自噬菌體淘選實(shí)驗(yàn)并且對(duì)PTmAb0005具有最高親和性的肽進(jìn)行表位作圖。通過(guò)經(jīng)PCR誘變引入隨機(jī)突變，并且亞克隆到Fuse 5載體中用于次要絲狀噬菌體蛋白gIIIp展示，進(jìn)行這種作圖。將IgEC67突變體按與PTmAb0005結(jié)合的順序分等級(jí)，如表8中所示。這些結(jié)果和其它結(jié)果表明了IgEC67中與所述Cε2表位匹配的氨基酸的重要性。例如，L8P、D10G、L11M、E12G和L13R突變體均降低與抗IgE PTmAb0005的結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。其它位點(diǎn)的突變對(duì)與PTmAb0005的親和性幾乎沒有影響。
由最高親和性PTmAb0005和PTmAb0011噬菌體展示衍生肽制備隨機(jī)亞文庫(kù)，以采用先前描述的方法(Yu，J.和Smith，G.P.(1996)“噬菌體展示的肽配體的親和性突變”Methods in Enzymology，267，3-27)增強(qiáng)所述肽對(duì)所述抗體的親和性，這涉及借助一個(gè)隨機(jī)PCR步驟，將DNA亞克隆從所述主要外殼蛋白(gVIIIp)絲狀噬菌體展示載體轉(zhuǎn)移至較低拷貝數(shù)的次要噬菌體外殼蛋白(gIIIp)展示載體。由包括最高親和性PTmAb0005配體IgEC67和IgE C67-8在內(nèi)的幾個(gè)噬菌體序列制備亞文庫(kù)。C67和C67-8的親和性成熟(matured)序列分別示于表8和表9。在所述表中包括等級(jí)次序，也包括BIAcore親和性(如果可得到的話)。當(dāng)用表達(dá)IgEC67-8的噬菌體作為免疫原時(shí)，IgEC67-8能夠在小鼠中誘導(dǎo)抗人IgE應(yīng)答。7.2通過(guò)結(jié)構(gòu)域作圖證實(shí)靶產(chǎn)生大量構(gòu)建體，以將PTmAb0005和PTmAb0011對(duì)IgE恒定區(qū)的結(jié)合特異性作圖。產(chǎn)生以下構(gòu)建體Cε2-4、Cε2-3、Cε3-4、Cε3-4L(Cε3-4加Cε2區(qū)和Cε3區(qū)之間的接頭序列)和單獨(dú)的Cε2。
用衍生自雜交瘤系JW8/5/13的cDNA，克隆包含不同人IgE Fc區(qū)的片段，所述雜交瘤系表達(dá)嵌合人IgE(Neuberger，MS等(1985)Nature 314 268-270；Bruggemann，M等(1987)J Exp Med 166 1351-61)。用合適的引物對(duì)并用JW8/5/3 cDNA作為模板，擴(kuò)增所述IgE Fc片段。cε2-4片段編碼氨基酸(aa)S225-K547。cε3-4片段編碼aaG335-547。cε3-4L片段(結(jié)構(gòu)域3-4加連接cε2至cε3的接頭序列)編碼aa E322-K547。cε2-3片段編碼aa S225-G436。cε2片段編碼aa S225-S324。所有的構(gòu)建體均含有一個(gè)COOH末端六組氨酸尾，以用于檢測(cè)和純化。將這些片段克隆到真核生物表達(dá)載體中，且與得自CD33的前導(dǎo)編碼序列符合讀框，以指導(dǎo)所表達(dá)片段的分泌。這使得能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中表達(dá)。該載體衍生自pcDNA3.1+(Invitrogen)。為了表達(dá)所克隆的片段，將合適的克隆轉(zhuǎn)染到COS-7細(xì)胞中，并且在轉(zhuǎn)染后48-60小時(shí)收獲所產(chǎn)生的條件培養(yǎng)液。
通過(guò)ELISA測(cè)定，通過(guò)使所述構(gòu)建體與EILSA板結(jié)合，然后與PTmAb0005和PTmAb0011溫育，并且用抗小鼠抗體顯示，研究PTmAb0005和PTmAb0011與所表達(dá)的IgE區(qū)的結(jié)合。此外，通過(guò)眾所周知的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)，研究與變性構(gòu)建體的結(jié)合。
PTmAb0005的結(jié)果顯示，與天然形式的Cε2-4、Cε2-3和Cε2強(qiáng)結(jié)合，在蛋白質(zhì)印跡中也與變性后的Cε2-4和Cε2結(jié)合。在兩種測(cè)定中都未觀察到與Cε3-4或Cε3-4L的結(jié)合。
PTmAb0011也與天然形式的Cε2-4、Cε2-3和Cε2結(jié)合；也與變性形式的Cε2-4和Cε2結(jié)合。
因此，顯然這兩種抗體均識(shí)別IgE Cε2區(qū)中存在的一個(gè)靶表位。7.3通過(guò)定點(diǎn)誘變證實(shí)靶結(jié)構(gòu)域作圖研究證明，兩種mAb均能夠與單獨(dú)的Cε2區(qū)結(jié)合。對(duì)衍生自噬菌體展示肽文庫(kù)的生物淘選序列的分析表明，PTmAb0005衍生序列顯示出與P1的顯著相似性。在IgE模型結(jié)構(gòu)中該區(qū)在Cε2的C-D β鏈之間形成一個(gè)環(huán)。進(jìn)行定點(diǎn)誘變研究以證實(shí)該序列對(duì)于PTmAb0005和PTmAb0011為表位。
經(jīng)淘選的噬菌體序列的分析和所述IgE模型結(jié)構(gòu)(Helm等1990，參見上文)與已知的人IgG1 Fc結(jié)構(gòu)(Deisenhoffer，J.，1981，Biochemistry，20，2361-2370)的比較，導(dǎo)致鑒定出3個(gè)可能參與抗體識(shí)別的殘基。這些殘基是谷氨酰胺(Q)273、甲硫氨酸(M)275、天冬氨酸(D)276。將這3個(gè)殘基中的每個(gè)殘基變?yōu)楸彼?A)，而至少另一個(gè)氨基酸殘基如下。
Q273A和E(谷氨酸)M275A；Q和K(賴氨酸)D276A和N(天冬酰胺)所述丙氨酸突變既改變所述靶殘基的結(jié)構(gòu)，又改變所述靶殘基的化學(xué)，而另一突變保持結(jié)構(gòu)(盡可能地接近)，但改變電荷，例如Q273E。這里，谷氨酸具有與谷氨酰胺基本相同的結(jié)構(gòu)，但帶負(fù)電，而不是中性的。
在Cε2-4構(gòu)建體中獨(dú)立地產(chǎn)生每種突變。每種突變多肽的表達(dá)水平與野生型(WT)Cε2-4相似，并且在基于ELISA的測(cè)定中，每種突變多肽均能夠同WT cε2-4產(chǎn)物同樣有效地與重組FcεR1α胞外域結(jié)合?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，所述突變對(duì)在所述表達(dá)系統(tǒng)中所述多肽的產(chǎn)生/分泌沒有影響，并且大體上不影響cε2-4片段的結(jié)構(gòu)。
除D276N外，所有的突變均基本上消除了與PTmAb0005和PTmAb0011的結(jié)合，D276N將與PTmAb0005的結(jié)合僅降低約50％(表10)。進(jìn)行Cε2內(nèi)的可變谷氨酰胺殘基Q317的突變，以作為這些實(shí)驗(yàn)的對(duì)照。產(chǎn)生Q317E和Q317K突變體，并且發(fā)現(xiàn)它們對(duì)PTmAb0005和PTmAb0011識(shí)別Cε2-4的能力沒有影響。同樣，不影響FcεR1α的識(shí)別。
因此，PTmAb0005和PTmAb0011的結(jié)合活性特異性地受Cε2的C-D環(huán)內(nèi)突變的影響。
總之，序列P1包含對(duì)PTmAb0005和PTmAb0011兩者的主要結(jié)合決定簇。表10，PTmAb0005和PTmAb0011對(duì)IgE結(jié)構(gòu)域構(gòu)建體的識(shí)別
7.4 IgE Cε2的C-D環(huán)的精細(xì)建模由于尚未確定人IgE的實(shí)際結(jié)構(gòu)(盡管可得到一種模型)，因此在詳細(xì)水平上檢查后該模型結(jié)構(gòu)仍有可能出錯(cuò)。因此，本發(fā)明人通過(guò)將IgE的Cε2環(huán)區(qū)作圖至人IgG1 Cγ2的等同區(qū)(Deisenhoffer J 1981參見上文)，改進(jìn)了IgE的Cε2環(huán)區(qū)的這種模型。
根據(jù)關(guān)于所述結(jié)構(gòu)特征范圍的這一新信息，設(shè)計(jì)了一種環(huán)化肽，所述環(huán)化肽當(dāng)合成時(shí)，應(yīng)該采取非常類似全I(xiàn)gE分子環(huán)境中Cε2的C-D環(huán)構(gòu)象的構(gòu)象。這種肽-Ac-CLEDGVQMDVDLCPREAAEGDK(Ac)-NH2被命名為PT1079(SEQID NO.14)。
用BIAcore技術(shù)，測(cè)量PT1079與PTmAb0005和PTmAb0011兩者的親和性，發(fā)現(xiàn)PT1079表現(xiàn)出對(duì)這兩種單克隆抗體非常強(qiáng)的識(shí)別(被PTmab0005和PTmAb0011兩者識(shí)別，其表觀親和性分別為～20nM和～250nM)。對(duì)照為其中環(huán)化位點(diǎn)僅移動(dòng)一個(gè)氨基酸殘基的PT1079的衍生肽，并因此將所述環(huán)化位點(diǎn)之間的肽長(zhǎng)度減少一個(gè)氨基酸殘基(PT1078)，所述對(duì)照降低了所述肽與或者PTmab0005或者PTmAb0011的結(jié)合。此外，將PT1078修飾，以便加入一個(gè)額外殘基，使得環(huán)區(qū)的殘基數(shù)與PT1079相同，然而這一修飾不能恢復(fù)與PTmAb0005或PTmAb0011的結(jié)合。因此，表明正確呈遞本發(fā)明的肽以使其采取非常類似全I(xiàn)gE分子環(huán)境中所述天然靶的形狀的重要性。 總結(jié)本文描述的研究表明，單克隆抗體PTmAb0005和PTmAb0011特異性地識(shí)別P1。這些抗體已經(jīng)用于噬菌體展示研究，以鑒定被所述單克隆抗體以高親和性識(shí)別的IgE Cε2區(qū)中c-d環(huán)的模擬表位。7.5 PTmAb0005和PTmAb0011特征的功能特征以下實(shí)驗(yàn)描述了PTmAb0005和PTmAb0011的功能特征。因此，應(yīng)用這些抗體的靶將誘導(dǎo)PTmAb0005和PTmAb0011樣免疫應(yīng)答。因此，采用基于這些肽的免疫原的疫苗接種將具有相同的功能特征。實(shí)施例8，8.1材料和方法8.1.1 FcεRIα結(jié)合測(cè)定(A蛋白平板)在該測(cè)定中，用重組形式的IgE高親和性受體α鏈的胞外域(α胞外域)，結(jié)合嵌合IgE。將所述α胞外域的羧基末端與人IgG1 Fc序列融合。這使得所述重組分子能夠通過(guò)所述Fc區(qū)，結(jié)合A蛋白包被的微量滴定板。因而，大多數(shù)所述α胞外域分子應(yīng)該可得到結(jié)合配體，并且提供一種用于分析IgE-受體相互作用的系統(tǒng)。下述測(cè)定形式的目的是檢測(cè)阻斷抗IgE抗體活性的(高親和性)受體。8.1.2用于檢測(cè)IgE與高親和性受體α鏈胞外域結(jié)合的ELISA方案用在封閉緩沖液(PBS/5％ BSA/0.05％ Tween-20)中稀釋至0.25μg/ml的100μl/孔α胞外域(α-ecto)-Ig融合蛋白包被A蛋白板。于37℃溫育1小時(shí)。在10％豬血清中將嵌合IgE稀釋至0.03125μg/ml。在該IgE溶液中將抗IgE抗體稀釋至合適的試驗(yàn)濃度。于室溫溫育1小時(shí)。運(yùn)用洗板機(jī)，用PBS/0.05％Tween-20洗板3次。加入100μl/孔的IgE抗IgE溶液(每個(gè)抗IgE濃度分析4個(gè)平行測(cè)定)。于37℃溫育1小時(shí)。運(yùn)用洗板機(jī)，用PBS/0.05％Tween-20洗板3次。加入100μl/孔的山羊抗小鼠λ鏈HRPO綴合的抗體在封閉緩沖液中稀釋的1∶6000稀釋液。于37℃溫育1小時(shí)。運(yùn)用洗板機(jī)，用PBS/0.05％ Tween-20洗板3次。加入200μl/孔的OPD底物，并于室溫避光溫育2-10分鐘。加入25μl 25％H2SO4終止反應(yīng)。在平板搖動(dòng)器上慢速混合已終止的反應(yīng)物。于490nm讀出OD。
可以計(jì)算出關(guān)于對(duì)IgE與其受體結(jié)合的抑制百分比的圖。根據(jù)僅在10％豬血清中含有IgE(即無(wú)抗IgE)的一組孔的平均值，確定IgE的最大結(jié)合值。
因此，抑制百分比值計(jì)算為(最大IgE值-抗IgE平行測(cè)定的平均值)/最大IgE值×1008.1.3 FcεRIα結(jié)合測(cè)定(經(jīng)修剪的胞外域)該測(cè)定基本上與前一測(cè)定相同，只是FcεRIα胞外域/IgG構(gòu)建體用蛋白水解酶-因子X處理，以切割所述兩個(gè)部分。用A蛋白微珠(bead)除去IgG Fc部分，而用鏈霉抗生物素蛋白微珠除去因子X，因此留下基本純的α鏈胞外域產(chǎn)物。在該測(cè)定形式中，所述α胞外域直接與塑料微量滴定板結(jié)合，所有其它測(cè)定細(xì)節(jié)如上所述。8.1.4 CD23結(jié)合測(cè)定(FcεRII，低親和性受體)該測(cè)定或者在RPMI 8866細(xì)胞上或者在原代人B細(xì)胞上進(jìn)行；可以使用兩種形式，一種形式用于檢測(cè)與結(jié)合了FcεRII的IgE結(jié)合的mAb，而第二種形式分析所述mAb是否干擾結(jié)合了FcεRII的IgE。對(duì)于第一種測(cè)定，在PBS，1％FBS，0.1％NaN3中，在冰上向細(xì)胞加入嵌合IgE(1μg/ml)達(dá)1小時(shí)。除去過(guò)量的IgE并加入抗IgE mAb。結(jié)合的mAb均用FITC綴合的大鼠抗小鼠IgG1抗體顯現(xiàn)。對(duì)于第二種測(cè)定，將嵌合IgE(1μg/ml)與抗IgE mAb于室溫預(yù)溫育1小時(shí)，同時(shí)溫和混合，然后將其加入到細(xì)胞中。將該混合物與所述細(xì)胞在冰上孵育1小時(shí)，然后洗滌以除去未結(jié)合的IgE。用FITC-山羊抗人IgE檢測(cè)結(jié)合的IgE，或者用FITC-綴合的大鼠抗小鼠IgG1抗體檢測(cè)結(jié)合的抗IgE mAb。當(dāng)在PBMC上進(jìn)行研究時(shí)，用PE綴合的抗CD19抗體鑒定組分B細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析樣品。8.2結(jié)果PTmAb0005和PTmAb0011的結(jié)果示于圖16-21。
圖16顯示單克隆抗體與平板結(jié)合的IgE的濃度依賴性結(jié)合。圖17顯示PTmAb0005和PTmAb0011對(duì)IgE與FcεR1α/IgG構(gòu)建體結(jié)合的濃度依賴性抑制。圖18顯示抗體PTmAb0005和PTmAb0011對(duì)IgE與直接結(jié)合于塑料板的FcεRIα經(jīng)修剪的胞外域結(jié)合的抑制。圖19顯示抗體PTmAb0005(克隆GE-1)和PTmAb0011對(duì)IgE與FcεRII(CD23)的結(jié)合沒有抑制作用。圖20和21顯示抗體PTmAb0005和PTmAb0011對(duì)變應(yīng)性人血液嗜堿性粒細(xì)胞組胺釋放的濃度依賴性阻斷作用。
PTmAb0011是一種對(duì)人IgE有特異性的小鼠單克隆抗體，表明與其它人Ig同種型或大鼠/小鼠IgE沒有交叉反應(yīng)性。當(dāng)以隨機(jī)方向與ELISA板結(jié)合時(shí)，PTmAb0011與天然IgE和經(jīng)熱處理的IgE均結(jié)合，表明IgE上的其識(shí)別位點(diǎn)不是熱不穩(wěn)定的。當(dāng)通過(guò)抗原與ELISA板結(jié)合時(shí)，PTmAb0011也識(shí)別IgE。重要的是，這種mAb可以完全阻斷人IgE與高親和性IgE受體(FcεRI)的α鏈結(jié)合組分之間的相互作用。然而，這種mAb當(dāng)預(yù)結(jié)合于FcεRI時(shí)仍識(shí)別人IgE，表明該mAb結(jié)合位點(diǎn)在受體結(jié)合時(shí)未喪失。實(shí)施例9，9.1通過(guò)普通EILSA和抗原定向ELISA分析PTmAb0011的IgE結(jié)合特性如實(shí)施例1中所述，通過(guò)用人嵌合IgE、骨髓瘤IgE、人Ig同種型或嚙齒動(dòng)物IgE(1μg/ml，在pH9.6碳酸鹽/碳酸氫鹽包被緩沖液中)包被平板，進(jìn)行普通的IgE結(jié)合ELISA法。對(duì)于抗原定向ELISA，以飽和濃度包被NP-BSA，然后加入嵌合IgE(1μg/ml)。另一方面，包被可溶性人FcεRIα鏈(0.25μg/ml)，然后包被嵌合IgE。如實(shí)施例1所述(用于檢測(cè)小鼠抗人IgE mAb的ELISA方案)進(jìn)行其余的ELISA。9.2結(jié)果圖22說(shuō)明，PTmAb0011當(dāng)以隨機(jī)定向方式結(jié)合于ELISA板時(shí)，與人/小鼠嵌合IgE和人骨髓瘤IgE均結(jié)合。同樣，與抗原定向IgE的結(jié)合(即與平板結(jié)合NP-BSA結(jié)合的IgE)是劑量依賴性的。也分析了PTmAb0011識(shí)別在56℃熱處理一定時(shí)間后的嵌合IgE的能力。圖22也表明，PTmAb0011對(duì)IgE的結(jié)合容量不受熱處理影響。
進(jìn)一步擴(kuò)展所述mAb的表征，以確定PTmAb0011是否能夠抑制IgE與高親和性IgE受體的α鏈組分的相互作用(圖23)。將IgE與PTmAb0011預(yù)溫育，然后加入到平板結(jié)合的FcεRIα鏈中，導(dǎo)致對(duì)IgE與FcεRIα鏈相互作用的劑量依賴性抑制。PTmAb0011也(圖24)以劑量依賴性方式識(shí)別FcεRIα鏈連接的IgE。實(shí)施例1010.1原代人B細(xì)胞分泌IgE的分析在96孔U形孔板中，在補(bǔ)充IL-4和抗CD40的培養(yǎng)液中以2×105細(xì)胞/孔接種PBMC。加入PTmAb0011或同種型匹配的對(duì)照mAb，并且在收獲上清液進(jìn)行IgE分析之前將細(xì)胞培養(yǎng)14天。通過(guò)用0.5M碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液中(pH9.6)的兔抗人IgE抗體(10μg/ml)包被ELISA板，測(cè)量總IgE水平。用PBS，0.05％Tween 20，5％BSA封閉經(jīng)洗滌的板。將細(xì)胞上清液和IgE標(biāo)準(zhǔn)與飽和量的PTmAb0011(10μg/ml)于室溫溫育1小時(shí)，然后加入至ELISA板中，以讓其形成IgE/抗IgE復(fù)合體。在溫育和洗滌步驟后，用HRP-綿羊抗人IgE，然后用OPD底物，檢測(cè)結(jié)合的IgE。然后估計(jì)相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)曲線的細(xì)胞上清液中的IgE水平。10.2結(jié)果將IgE與劑量范圍為10μg/ml至0.5μg/ml的PTmAb0011預(yù)溫育，并檢查其對(duì)隨后的IgE與人B細(xì)胞系RPMI8866上FcεRII結(jié)合的影響。圖25說(shuō)明，IgE與PTmAb0011的預(yù)溫育增強(qiáng)了IgE與FcεRII的結(jié)合。非P1特異性單克隆抗體(PTmAb0017)不增加IgE與FcεRII受體的結(jié)合。PTmAb0011也增加IgE與原代B細(xì)胞上FcεRII的結(jié)合(圖26)。10.3 PTmAb0011對(duì)原代人B細(xì)胞分泌IgE的影響在加入IL-4和抗CD40抗體的情況下，用PTmAb0011培養(yǎng)外周血單核細(xì)胞，以促進(jìn)B細(xì)胞同種型轉(zhuǎn)換為IgE分泌。開發(fā)了一種ELISA測(cè)定，該測(cè)定提供對(duì)總IgE(即游離IgE和PTmAb0011復(fù)合的IgE)水平的測(cè)量。為了達(dá)到這種定量，將分泌的IgE與飽和水平的PTmAb0011一起預(yù)溫育，以讓所有IgE復(fù)合。相對(duì)于也已經(jīng)與飽和水平的PTmAb0011復(fù)合的IgE的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)組織培養(yǎng)上清液中的總IgE定量。圖27說(shuō)明，在三種不同供體中，原代B細(xì)胞與PTmAb0011(1μg/ml)的溫育導(dǎo)致分泌IgE總水平的顯著降低。用所述同種型匹配的對(duì)照抗體沒有觀察到這種抑制作用。10.4人嗜堿性粒細(xì)胞組胺釋放的測(cè)定采用兩種測(cè)定形式。用1μg/ml嵌合IgE于37℃被動(dòng)敏化得自非變應(yīng)性供體的PBMC，洗滌，然后用單克隆抗體于37℃處理30分鐘?；蛘?，用單克隆抗體于37℃將得自LolP1敏化的供體的PBMC直接處理30分鐘。通過(guò)離心終止反應(yīng)。通過(guò)特異性免疫測(cè)定(Immunotech2562)，測(cè)定細(xì)胞上清液的組胺釋放。在用0.5％Igepal去污劑裂解的細(xì)胞中測(cè)定總細(xì)胞組胺含量。10.5嗜堿性粒細(xì)胞阻斷測(cè)定通過(guò)將得自非變應(yīng)性供體的PBMC與嵌合IgE在存在單克隆抗體和IL-3的情況下于37℃溫育30分鐘，測(cè)定抗IgE抗體阻斷嵌合IgE與人嗜堿性粒細(xì)胞上FcεR1結(jié)合的能力。洗滌細(xì)胞，并用NP-BSA于37℃再觸發(fā)組胺釋放達(dá)30分鐘。通過(guò)離心終止反應(yīng)，并如上所述測(cè)定組胺釋放。10.6變應(yīng)性嗜堿性粒細(xì)胞抑制測(cè)定通過(guò)將得自LolP1敏化供體的PBMC與單克隆抗體于37℃預(yù)溫育30分鐘，然后用LolP1觸發(fā)，來(lái)研究抗IgE抗體抑制變應(yīng)原觸發(fā)的脫顆粒的能力。10.7人肺肥大細(xì)胞類胰蛋白酶釋放的測(cè)定通過(guò)用包含飽和透明質(zhì)酸酶、鏈霉蛋白酶和DNA酶的混合劑進(jìn)行酶消化，由人肺組織制備粗制肥大細(xì)胞懸浮液。或者直接使用細(xì)胞，或者用嵌合IgE預(yù)敏化細(xì)胞，然后用抗IgE抗體處理。通過(guò)對(duì)顆粒酶類胰蛋白酶的比色測(cè)定，測(cè)定肥大細(xì)胞的脫顆粒。10.8用人FcεR1α轉(zhuǎn)染的RBL細(xì)胞的β-氨基己糖苷酶釋放的測(cè)定從University of Sheffield的B.Helm博士獲得轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系RBLJ41。用或者小鼠單克隆IgE抗DNP或者人嵌合IgE抗NP被動(dòng)敏化細(xì)胞，然后用抗人IgE抗體觸發(fā)。通過(guò)對(duì)β-氨基己糖苷酶釋放的比色測(cè)定，測(cè)定脫顆粒。10.9結(jié)果10.9.1抗IgE單克隆抗體在人嗜堿性粒細(xì)胞中的過(guò)敏原性對(duì)多種不同的抗IgE單克隆抗體分析其既觸發(fā)變應(yīng)性嗜堿性粒細(xì)胞的組胺釋放、又觸發(fā)非變應(yīng)性嗜堿性粒細(xì)胞的組胺釋放的能力(圖28)。與其它抗體相對(duì)比，PTmAb0011一致地不能產(chǎn)生顯著的組胺釋放。10.9.2抗IgE單克隆抗體在人肺肥大細(xì)胞中的過(guò)敏原性在敏化和非敏化人肺肥大細(xì)胞中，PTmAb0011也都不能釋放顯著量的類胰蛋白酶(圖29)。多克隆抗人IgE在這些細(xì)胞中產(chǎn)生60-70％的釋放。10.9.3抗IgE單克隆抗體在用人FcεR1α轉(zhuǎn)染的RBL細(xì)胞中的過(guò)敏原性用嵌合人IgE抗NP被動(dòng)敏化的RBL J41細(xì)胞可以用抗原NP-BSA以及用多克隆抗人IgE觸發(fā)，而不能用PTmAb0011觸發(fā)(圖30)。相反，當(dāng)細(xì)胞用小鼠IgE抗DNP敏化時(shí)，兩種抗人IgE抗體均沒有作用。所述細(xì)胞仍可以被抗原DNP-BSA觸發(fā)。10.9.4嗜堿性粒細(xì)胞阻斷測(cè)定PTmAb0011在非變應(yīng)性嗜堿性粒細(xì)胞中能夠阻斷IgE與FcεR1的結(jié)合，因此抑制隨后的用NP-BSA抗原的觸發(fā)。該活性的IC50值約為60ng/ml(圖31)。PTmAb0011也能夠有效地抑制LolP1觸發(fā)的變應(yīng)性嗜堿性粒細(xì)胞的組胺釋放，其IC50值為40ng/ml(圖31)。實(shí)施例11，猴被動(dòng)皮膚過(guò)敏反應(yīng)研究也測(cè)試了PTmAb0005和PTmAb0011的體內(nèi)活性。簡(jiǎn)而言之，刮下非洲綠猴的局部皮膚肥大細(xì)胞，通過(guò)在兩臂皮內(nèi)給予100ng抗NP IgE(人IgE抗硝基苯乙酰(NP)，購(gòu)自Serotech)進(jìn)行敏化。24小時(shí)后，在一臂上給予人IgE的相同注射位點(diǎn)上，注射一定劑量范圍的待測(cè)試的單克隆抗體。所述動(dòng)物另一臂上的對(duì)照位點(diǎn)或者接受磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，或者接受非特異性人IgE(對(duì)人巨細(xì)胞病毒(CMV)或人免疫缺陷病毒(HIV)特異性的)。5小時(shí)后，通過(guò)靜脈注射給予10mgBSA-NP綴合物(購(gòu)自Biosearch Laboratories)。15-30分鐘后，對(duì)照動(dòng)物產(chǎn)生容易觀察到的由過(guò)敏反應(yīng)所致的大致環(huán)形的水腫，這可以以毫米來(lái)測(cè)量。結(jié)果或者以各組3只猴子的平均水腫直徑來(lái)表示，或者以與PBS對(duì)照相比的抑制百分比來(lái)表示。描述于EP 0 477 231 B中的Dec7B識(shí)別人IgE Cε4區(qū)中的肽496-506，將其用作陽(yáng)性對(duì)照。
過(guò)敏反應(yīng)的抑制百分比示于圖32中。表2引物組合和DNA片段大小
優(yōu)選在GeneAmp PCR System 9700(PE Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)中使用Ready-To-Go PCR Beads(Amersham，Piscataway，NJ)進(jìn)行簡(jiǎn)并引物的PCR。在各反應(yīng)中使用20-40ng的基因組DNA或5-10ng的cDNA，其中各引物的終濃度為0.8μM。優(yōu)選的循環(huán)參數(shù)如下94℃1分鐘；3個(gè)循環(huán)的[94℃30秒；37℃30秒；72℃2分鐘]；35個(gè)循環(huán)的[94℃30秒；60℃30秒；72℃2分鐘]；72℃7分鐘；4℃保持。在2％瓊脂糖凝膠上分析反應(yīng)產(chǎn)物并切下適當(dāng)大小的DNA片段。例如使用Geneclean III試劑盒(BIO 101，Inc.，Carlsbad，CA)從瓊脂糖帶上分離DNA片段，例如使用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)對(duì)其進(jìn)行克隆。例如，使用CONCERT快速質(zhì)粒小量制備系統(tǒng)(Life Technologies，Inc.，Rockyille，MD)分離質(zhì)粒并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方案測(cè)序。
NIM-樣DNA片段獲自所嘗試的所有植物物種且在許多情況中分離了多種單一NIM-樣序列。表3和附圖2具體描述了所分離的NIM-樣片段。
表7-根據(jù)親和性從初次噬菌體展示生物淘選鑒定的PTmAb0011肽配體人IgE Cε2 EDGQVMDVD(SEQ ID NO.1)
表8-對(duì)PTmAb0005和PTmAb0011親和性改進(jìn)的IgEC67突變體得自所述原始序列的突變體以藍(lán)色顯示人IgE Cε2 EDGQVMDVD(SEQ ID NO.1)
表9-對(duì)PtmAb0005親和性改進(jìn)的IgEC67-8突變體人IgE Cε2 EDGQVMDVD(SEQ ID NO.1)
權(quán)利要求
1.一種包含一個(gè)分離的IgE Cε2區(qū)的表面暴露表位或其模擬表位的肽。
2.一種權(quán)利要求1中要求保護(hù)的肽，其中所述Cε2的表面暴露表位是P1(SEQ ID No.1)或其模擬表位。
3.一種權(quán)利要求1中要求保護(hù)的肽，其中所述Cε2的表面暴露表位是P2(SEQ ID No.2)或其模擬表位。
4.一種權(quán)利要求1中要求保護(hù)的肽，其中所述Cε2的表面暴露表位是P3(SEQ ID No.3)或其模擬表位。
5.一種權(quán)利要求1中要求保護(hù)的肽，其中所述Cε2的表面暴露表位是P4(SEQ ID No.4)或其模擬表位。
6.一種權(quán)利要求1中要求保護(hù)的肽，其中所述Cε2的表面暴露表位是P5(SEQ ID No.5)或其模擬表位。
7.一種權(quán)利要求1中要求保護(hù)的肽，其中所述Cε2的表面暴露表位是P6(SEQ ID No.6)或其模擬表位。
8.一種權(quán)利要求1中要求保護(hù)的肽，其中所述Cε2的表面暴露表位是P7(SEQ ID No.7)或其模擬表位。
9.一種權(quán)利要求1-8的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的模擬表位，其中所述模擬表位是一種肽。
10.一種權(quán)利要求1中要求保護(hù)的肽，其中所述分離的表位衍生自IgE Cε2區(qū)的一種環(huán)結(jié)構(gòu)。
11.一種權(quán)利要求10中要求保護(hù)的肽，其中所述IgE Cε2區(qū)的環(huán)結(jié)構(gòu)是A-B環(huán)或C-D環(huán)。
12.一種權(quán)利要求2中要求保護(hù)的肽，其中所述P1的模擬表位是通式為hxdhhananxy的肽；其中h為疏水性氨基酸殘基；d為提供離子鍵的氨基酸殘基；a為酸性氨基酸殘基；n為離子中性/非極性氨基酸殘基；而x為一種氨基酸。
13.一種權(quán)利要求2中要求保護(hù)的肽，其中所述P1的模擬表位為具有以下通式的肽Q，X1，M，D，X1，X2，X3其中X1選自V、I、L、M、F或A；X2選自D或E；而X3選自L、I、V、M、A或F。
14.一種權(quán)利要求2中要求保護(hù)的肽，其中所述P1的模擬表位選自P15q(SEQ ID No.11)、PT1079(SEQ ID No.13)、PT1079GS(SEQID No.15)、PT1078(SEQ ID No.16)、PT15(SEQ ID No.8)。
15.一種權(quán)利要求3中要求保護(hù)的肽，其中所述P2的模擬表位是P16(SEQ ID No.24)。
16.一種權(quán)利要求4中要求保護(hù)的肽，其中所述P3的模擬表位是P17(SEQ ID No.26)。
17.一種用于治療變態(tài)反應(yīng)的免疫原，其包含權(quán)利要求1-16的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的肽或模擬表位，還包含一種載體分子。
18.一種權(quán)利要求17中要求保護(hù)的免疫原，其中所述載體分子選自D蛋白或乙型肝炎核心抗原。
19.一種權(quán)利要求17或18中要求保護(hù)的免疫原，其中所述免疫原是權(quán)利要求1-16中要求保護(hù)的肽或模擬表位的化學(xué)綴合物，或其中所述免疫原作為融合蛋白表達(dá)。
20.一種權(quán)利要求17-19的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的免疫原，其中所述肽或肽模擬表位存在于所述載體的一級(jí)序列中。
21.一種用于治療變態(tài)反應(yīng)的疫苗，其包含權(quán)利要求17-20的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的免疫原，還包含一種佐劑。
22.一種能夠識(shí)別IgE Cε2區(qū)的表面暴露表位的配體，其特征為所述配體不是PTmAb0005。
23.一種權(quán)利要求22中要求保護(hù)的配體，其中所述配體是1999年3月8日根據(jù)用于專利的微生物保存布達(dá)佩斯條約保藏于ECACC、保藏號(hào)為99030805的PTmAb0011。
24.一種藥用組合物，其包含一種能夠識(shí)別IgE Cε2區(qū)的表面暴露表位的配體。
25.一種權(quán)利要求24中要求保護(hù)的藥用組合物，其中所述配體能夠識(shí)別IgE Cε2區(qū)的C-D環(huán)。
26.一種權(quán)利要求25中要求保護(hù)的藥用組合物，其中所述配體是選自PTmAb0005或PTmAb0011的單克隆抗體。
27.一種用于醫(yī)藥的權(quán)利要求1-16的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的肽。
28.一種用于醫(yī)藥的權(quán)利要求21中要求保護(hù)的疫苗。
29.一種用于醫(yī)藥的權(quán)利要求17-20的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的免疫原。
30.權(quán)利要求1-16的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的肽在用于治療或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)的藥物生產(chǎn)方面的用途。
31.一種能夠識(shí)別IgE Cε2區(qū)的表面暴露表位、用于醫(yī)藥的配體。
32.一種能夠識(shí)別IgE Cε2區(qū)的表面暴露表位的配體在變態(tài)反應(yīng)治療藥物生產(chǎn)方面的用途。
33.權(quán)利要求31或32中要求保護(hù)的配體的用途，其中所述配體是PTmAb0005或PTmAb0011。
34.PTmAb0005或PTmAb0011在P1模擬表位鑒定方面的用途。
35.一種能夠?yàn)镻TmAb0005或PTmAb0011所識(shí)別的肽。
36.一種包含權(quán)利要求35中要求保護(hù)的肽的免疫原。
37.一種權(quán)利要求1-16中要求保護(hù)的肽在診斷血液循環(huán)抗IgE抗體或從血液中親和純化循環(huán)抗IgE抗體方面的用途。
38.一種生產(chǎn)疫苗的方法，包括生產(chǎn)權(quán)利要求17-20的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的免疫原，并且將所述免疫原與一種佐劑一起配制。
39.一種治療患有或易患變態(tài)反應(yīng)的患者的方法，包括給予所述患者一種權(quán)利要求1-16的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的肽。
40.一種治療患有或易患變態(tài)反應(yīng)的患者的方法，包括給予所述患者一種權(quán)利要求21中要求保護(hù)的疫苗。
41.一種治療患有或易患變態(tài)反應(yīng)的患者的方法，包括給予所述患者一種權(quán)利要求24-26的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的藥用組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及提供用于治療、預(yù)防或緩解變應(yīng)性疾病的新藥物。具體地說(shuō),所述新藥物是加入IgE Cε2區(qū)表面暴露區(qū)域的表位或模擬表位的分離的肽。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn):這些新的區(qū)域可能是被動(dòng)和主動(dòng)免疫預(yù)防或免疫治療的靶。本發(fā)明還涉及所述藥物、含所述藥物的藥用組合物的生產(chǎn)方法以及所述藥物和藥用組合物在醫(yī)藥中的應(yīng)用。能夠結(jié)合本發(fā)明的表面暴露IgE區(qū)域的配體、尤其是單克隆抗體以及它們?cè)卺t(yī)藥中作為被動(dòng)免疫治療或免疫預(yù)防的應(yīng)用也構(gòu)成了本發(fā)明的一個(gè)方面。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1348466SQ00806614
公開日2002年5月8日 申請(qǐng)日期2000年2月22日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月25日
發(fā)明者M·戴森, M·弗里德, J·格林伍德, E·赫維特, A·拉蒙特, S·馬森, R·蘭達(dá)爾, W·G·圖內(nèi)爾, M·P·范梅切倫, C·維納爾斯·Y·德巴索爾斯 申請(qǐng)人:史密絲克萊恩比徹姆生物有限公司, 阿坎姆比斯研究有限公司