專利名稱：使用小肽類實現(xiàn)抗纖維變性活性的治療方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用小肽類治療哺乳動物以便實現(xiàn)抗纖維變性活性且由此抑制、預(yù)防哺乳動物體內(nèi)的纖維變性乃至使哺乳動物體內(nèi)的纖維變性逆轉(zhuǎn)的方法。更具體地說，這類治療在動脈或氣道腔內(nèi)表現(xiàn)出纖維損害的哺乳動物的方法可以如通過減少纖維變性而顯示出的使腔重建。
如果炎癥反應(yīng)實際上沒有使侵害因素失效或?qū)⑵涑?，那么它就會無限期地持續(xù)存在下去。如果是這樣，那么炎癥反應(yīng)刺激平滑肌細(xì)胞遷移和增殖，其中平滑肌細(xì)胞與形成中間損害的炎癥區(qū)域混合。如果這些反應(yīng)不能持續(xù)減弱，那么它們可以使動脈壁、支氣管氣道或其它發(fā)炎腔增厚。
一般來說，在動脈粥樣硬化中，腔通過逐步膨脹代償至所述腔保持不變的一點上。就炎癥細(xì)胞而言，粒細(xì)胞在粥樣化形成的任何階段中幾乎不存在。代之以在疾病的每一階段由單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞特殊亞型介導(dǎo)反應(yīng)。
持續(xù)的炎癥導(dǎo)致巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量增加，這兩種細(xì)胞均來源于血液并在損害內(nèi)增加。激活這些細(xì)胞可使水解酶、細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子釋放，它們可以誘發(fā)進一步的損害且最終導(dǎo)致局部壞死。因此，單核細(xì)胞累積、平滑肌細(xì)胞遷移和增殖以及纖維組織形成的循環(huán)導(dǎo)致?lián)p害進一步擴大和重新形成，使得它被蓋在脂類和壞死組織中心上的纖維覆蓋物所覆蓋(一種稱作發(fā)展的復(fù)雜損害)。在一定程度上，動脈可能不再通過擴張代償。然后該損害侵入腔并改變血流。
在粥樣化形成中的細(xì)胞相互作用基本上不同于在諸如肝硬變、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎小球硬化癥、肺纖維化和慢性胰腺炎這樣的慢性炎癥-纖維增殖性疾病中的那些細(xì)胞相互作用。每種特定組織或器官的反應(yīng)取決于其特征細(xì)胞和結(jié)構(gòu)、其血液和淋巴的供應(yīng)和侵害因素的名稱。因此，動脈(動脈粥樣硬化)、肝(肝硬變)、關(guān)節(jié)(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、腎(腎小球硬化癥)、肺(肺纖維化)和胰腺(胰腺炎)中的細(xì)胞反應(yīng)是相似的，這也是每種組織或器官的特征。
哮喘的特征在于氣道嗜酸粒細(xì)胞增多、水腫、粘液分泌過多、支氣管上皮損傷和反應(yīng)過度的復(fù)雜炎癥反應(yīng)。過敏性哮喘中吸入過敏原攻擊激發(fā)即刻的氣道過敏反應(yīng)即早期氣道反應(yīng)(EAR)，通常在幾小時之后發(fā)生延緩的氣道反應(yīng)、即晚期氣道反應(yīng)(LAR)。
對哮喘中的慢性炎癥機理的深入了解來源于對動物模型中LAR的研究。已經(jīng)證實大量動物模型可產(chǎn)生大量物種中LAR的典型特征，這些動物包括小鼠、大鼠、豚鼠和非人類的靈長類。
據(jù)報導(dǎo)Balb/c小鼠可產(chǎn)生模擬人過敏性肺病的過敏性肺病，包括反復(fù)攻擊后對免疫接種卵清蛋白(OVA)反應(yīng)的氣道/間質(zhì)嗜酸粒細(xì)胞增多、粘液分泌過多、水腫和氣道狹窄。已經(jīng)報導(dǎo)了人肺活檢和尸檢物內(nèi)慢性哮喘的肺組織結(jié)構(gòu)和功能的改變。持續(xù)性炎癥、間質(zhì)組織中纖維變性的膠原蛋白沉積和氣道狹窄表現(xiàn)了這些結(jié)構(gòu)變化的特征。肺功能降低是與慢性哮喘相關(guān)的功能改變的標(biāo)志。已經(jīng)證實Balb/c小鼠免疫接種OVA 3個月或3個月以上可產(chǎn)生與具有纖維變性的人慢性哮喘、氣道狹窄和持續(xù)性炎癥浸潤相似的病理特征。
在動脈粥樣硬化和肝硬變、腎小球硬化癥和慢性胰腺炎中幾乎不存在粒細(xì)胞。它們僅在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和肺纖維化中出現(xiàn)。就關(guān)節(jié)炎而言，盡管早期反應(yīng)從粒細(xì)胞開始，但是主要在關(guān)節(jié)腔中發(fā)現(xiàn)它們。巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞主要存在于在滑膜中，從而導(dǎo)致軟骨和骨受到腐蝕，使得它們被纖維變性組織(血管翳)所取代。在肺纖維化中，粒細(xì)胞開始出現(xiàn)在肺泡(alvcolar)空間內(nèi)；然而，最終發(fā)生纖維變性的肺實質(zhì)被巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤。因此，在這些炎癥疾病中存在相似之處。已經(jīng)鑒定了至少三種不同類型的巨噬細(xì)胞，它們各自由不同的T-細(xì)胞細(xì)胞因子(干擾素-7、白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-4和白細(xì)胞介素-10)來調(diào)節(jié)。
慢性炎癥反應(yīng)通常與特殊類型的有害或誘發(fā)肉芽腫的因素有關(guān)。如果有害因素或多種有害因素不被炎癥反應(yīng)除去或消除且炎癥發(fā)展，那么該反應(yīng)就會從保護性的反應(yīng)轉(zhuǎn)變成有害的反應(yīng)。這類時?；蚍磸?fù)的損傷可以通過纖維增殖反應(yīng)刺激各組織修復(fù)或阻止損害，當(dāng)所述的纖維增殖反應(yīng)過度時，它可減少組織或器官的功能容量并變成部分疾病反應(yīng)。
纖維變性是慢性發(fā)炎組織的顯著特征。其特征在于因成纖維細(xì)胞增殖的增加而導(dǎo)致胞外基質(zhì)膠原蛋白漸進和過度累積(主要的間充質(zhì)細(xì)胞對合成間質(zhì)膠原而言是必不可少的)。來自患有纖維變性肺病的患者的肺組織的特征是肥大細(xì)胞數(shù)量增加，它們中的許多處于極接近增殖的成纖維細(xì)胞的部分脫粒狀態(tài)。
代表主要間質(zhì)膠原的I、II、III、V和XI型膠原蛋白由1-3個α-鏈組成，它們各自具有95-100kD的分子量，這些鏈涉及形成單三股螺旋結(jié)構(gòu)。I型膠原蛋白具有由化學(xué)計算比例為2∶1的α1和α2鏈組成的不對稱異三聚化構(gòu)型，從而可產(chǎn)生鏈組合(α1[I]2、α2[I])；而一種3個α1鏈的同三聚體II型膠原蛋白具有的名稱為[α1(I)]3。I型膠原蛋白的α1和α2鏈在還原條件下以輕度不同的比例遷移。以α鏈組成為基礎(chǔ)并通過使用對I型膠原蛋白的特異性抗體的免疫印跡將通過類胰蛋白酶處理刺激的膠原蛋白鑒定為I型。
膠原蛋白形成胞外基質(zhì)的累積部分且沉積在肺中的膠原蛋白的量受到嚴(yán)格調(diào)節(jié)以便確保生物合成與降解之間的嚴(yán)格平衡。對這種平衡不適宜的控制可以導(dǎo)致造成纖維變性的膠原蛋白沉積增加。目前認(rèn)識到如急性呼吸窘迫綜合征、原因不明性纖維化肺泡炎、結(jié)節(jié)病中報導(dǎo)的膠原蛋白的量或?qū)嶋H上是膠原蛋白類型的任何改變可以導(dǎo)致肺中的細(xì)胞異常。
正常人肺由65％的I型和30％的III型膠原蛋白組成。已經(jīng)在原發(fā)性慢性肺纖維化、與動脈粥樣硬化相關(guān)的纖維變性和肝硬變中報導(dǎo)了I型膠原蛋白量的特殊增加并伴隨有II型膠原蛋白的減少。一般來說，順應(yīng)的組織具有低比例的I型與III型膠原蛋白。諸如在肺纖維化中發(fā)現(xiàn)的順應(yīng)性較低的組織具有較高比例的I型與III型膠原蛋白。
動脈血管中層中以及損害中的平滑肌細(xì)胞被不同類型的結(jié)締組織包圍。在動脈血管中層中，基質(zhì)主要由I型和III型腓膠原蛋白組成，而在動脈粥樣硬化損害中它主要由混有松散膠原蛋白原纖維的蛋白聚糖組成。
目前正在持續(xù)探求因各種疾病情況、外傷或外科手術(shù)(surgicalprocedures)導(dǎo)致的炎癥造成的纖維變性的新型治療方法。
發(fā)明概括已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以通過對這類哺乳動物給予在合適的藥理載體含有具備抗纖維變性活性的小肽的藥物組合物來治療哺乳動物體內(nèi)的纖維變性。這類治療可以抑制纖維變性。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，可將纖維變性減少或使之逆轉(zhuǎn)，由此使腔中幾乎沒有通道狹窄和其中流動體流。
因此，本發(fā)明提供了一種使用在適宜的藥物載體中含有抗纖維變性有效量的具有抗纖維變性活性的N-甲酰基-甲硫氨?；?亮氨?；?“f-Met-Leu”)肽的藥物組合物治療哺乳動物體內(nèi)纖維變性的方法。特別有用的這類肽是那些具有通式f-Met-Leu-X的肽類，其中X選自由Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr組成的組。
本發(fā)明(invitation)的方法用于治療哺乳動物的各種纖維變性疾病，包括例如肺纖維化、動脈粥樣硬化、肝硬變、腎小球硬化癥、慢性胰腺炎(pancreatitus)、冠狀動脈疾病(諸如由細(xì)菌肺炎衣原體(bacterium chlamydin pneumoniae)所導(dǎo)致)。因外傷或外科手術(shù)造成的過度纖維變性也可以由本發(fā)明的方法治療，包括例如脊柱手術(shù)后硬膜中或神經(jīng)根中神經(jīng)周(peri-neurally in the dura ornerve roots)的手術(shù)后纖維變性、帶有粘連的受損的或修補的腱的腱松解術(shù)、帶有粘連(adhesions)的受損的或修補的外周神經(jīng)的神經(jīng)松解術(shù)、因婦科和腹部手術(shù)造成的手術(shù)后粘連、逆轉(zhuǎn)男性或女性絕育的輸精管或輸卵管修復(fù)手術(shù)以及諸如尿道、腸或食道這樣的其它管狀結(jié)構(gòu)的外科修復(fù)。
為了治療氣道膜，優(yōu)選的給藥方式是通過吸入方式。為了治療表面損害，優(yōu)選的給藥方式是使用合適的藥物載體局部施用?？梢詫⒄嫫?nèi)注射或片劑用于全身療法。
在本發(fā)明的某些優(yōu)選的實施方案中，患者可以因?qū)⒈景l(fā)明的肽與第二種活性組分一起給藥而受益。例如，用于本發(fā)明的這類聯(lián)合用藥的特別有用的其它活性組分是抗白三烯類(antileukotrienes)、β2-興奮劑、皮質(zhì)類固醇等。
附圖2A和2B是說明將按照本發(fā)明治療(A)后和不進行治療(B)的患慢性哮喘小鼠肺組織的病理特征進行比較的照片。
附圖3A-3C是說明將按照本發(fā)明治療(A)后、不進行治療(C)和對照組(B)表現(xiàn)出膠原蛋白纖維變性性累積的小鼠肺組織進行比較的照片。
附圖4A-4C是說明將按照本發(fā)明治療(B)后、不進行治療(C)和對照組(A)表現(xiàn)出膠原蛋白纖維變性性累積的小鼠肺組織進行比較的照片。
附圖5是說明本發(fā)明治療方法對因慢性哮喘誘發(fā)的小鼠體內(nèi)氣道粘液阻塞和炎癥細(xì)胞累積的作用的示意圖。
附圖6是說明本發(fā)明治療方法對因慢性哮喘誘發(fā)的小鼠氣道內(nèi)肺粘液細(xì)胞數(shù)量的作用的示意圖。
附圖7是說明本發(fā)明治療方法對因慢性哮喘誘發(fā)的小鼠氣道內(nèi)肺嗜酸細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量的影響的示意圖。
附圖8是說明本發(fā)明治療方法對因慢性哮喘誘發(fā)的小鼠肺內(nèi)肉芽腫的影響的示意圖。
附圖9A-9C是說明在按照本發(fā)明治療(A)后、不進行治療(C)和對照組(B)因慢性哮喘誘發(fā)的小鼠經(jīng)本發(fā)明治療方法治療沒有誘發(fā)肝臟毒性的照片。
附

圖10是免疫接種以誘發(fā)慢性哮喘且隨后在另外進行鼻內(nèi)攻擊前按照本發(fā)明方法治療的給藥方案。
附圖11A-11C是說明將按照本發(fā)明治療(A)后、不進行治療(C)和對照組(B)患慢性哮喘且隨后進一步鼻內(nèi)攻擊的小鼠肺組織進行比較的照片。
附圖12A-12C是說明將按照本發(fā)明治療(A)后、不進行治療(C)和對照組(B)患慢性哮喘且隨后進一步鼻內(nèi)攻擊的小鼠肺組織中膠原蛋白進行比較的照片。
附圖13A-13C是說明將按照本發(fā)明治療(A)后、不進行治療(C)和對照組(B)患慢性哮喘且隨后進一步鼻內(nèi)攻擊的小鼠肺組織中粘液細(xì)胞進行比較的照片。
附圖14是本發(fā)明治療方法對因慢性哮喘誘發(fā)并進行反復(fù)變應(yīng)性攻擊的小鼠氣道內(nèi)嗜酸細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量的影響的示意圖。
附圖15是本發(fā)明治療方法對因慢性哮喘誘發(fā)并進行反復(fù)變應(yīng)性攻擊的小鼠體內(nèi)氣道粘液阻塞和炎癥細(xì)胞累積的影響的示意圖。
附圖16是本發(fā)明治療方法對因慢性哮喘誘發(fā)并進行反復(fù)變應(yīng)性攻擊的小鼠氣道粘液阻塞形成的影響的示意圖。
附圖17是本發(fā)明治療方法對因慢性哮喘誘發(fā)并進行反復(fù)變應(yīng)性攻擊的小鼠氣道內(nèi)肺粘液細(xì)胞數(shù)量的影響的示意圖。
附圖18是本發(fā)明治療方法對因慢性哮喘誘發(fā)并進行反復(fù)變應(yīng)性攻擊的小鼠肺內(nèi)肉芽腫的影響的示意圖。
發(fā)明詳述按照本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有通式f-Met-Leu-X的某些小肽類對抑制纖維變性且在優(yōu)選的實施方案中減少纖維性損害并重建腔具有令人意外的活性，其中X選自由Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr組成的組。涉及本發(fā)明的術(shù)語“重建(remodeling)”用以指將例如氣道通道或動脈等這樣的腔重新恢復(fù)到在病理作用前的原始狀態(tài)。在極為優(yōu)選的實施方案中，使所述腔恢復(fù)到在疾病前的原始狀態(tài)。
結(jié)果是這類肽用于治療表現(xiàn)出因例如肺纖維化、動脈粥樣硬化、肝硬變、腎小球硬化癥、慢性胰腺炎和冠狀動脈疾病導(dǎo)致的肺纖維性損害的哺乳動物。因外傷或外科手術(shù)造成的過度纖維變性也可以由本發(fā)明的方法治療，包括例如脊柱手術(shù)后硬膜中神經(jīng)周或神經(jīng)根中的手術(shù)后纖維變性、帶有粘連的受損的或修補的腱的腱松解術(shù)、帶有粘連的受損的或修補的外周神經(jīng)的神經(jīng)松解術(shù)、因婦科和腹部手術(shù)造成的手術(shù)后粘連、使男性或女性恢復(fù)生殖能力的輸精管或輸卵管修復(fù)手術(shù)以及諸如尿道、腸或食道這樣的其它管狀結(jié)構(gòu)的外科修復(fù)。
可以通過常規(guī)小肽化學(xué)技術(shù)來制備本發(fā)明的肽類。當(dāng)用于給藥時，在無菌條件下使用藥物上可接受的載體或稀釋劑來制備所述肽類。
藥物組合物的劑量將取決于受試者和所用的特定給藥途徑。劑量可以在每天0.1-100,000μg/kg、更優(yōu)選1-10,000μg/kg的范圍。最優(yōu)選的劑量范圍在約1-100μg/kg體重、更優(yōu)選約1-10μg/kg且最優(yōu)選1.0-2.0μg/kg。一般按每天一次至每4-6小時一次給予劑量，這取決于疾病的嚴(yán)重程度。就急性病而言，優(yōu)選每4-6小時給予一次所述肽。就維持或治療作用而言，可以優(yōu)選每天僅給藥一次或兩次。優(yōu)選每天給予約0.18-約16mg的肽，這取決于給藥途徑和疾病的嚴(yán)重程度。用于輸送特定組合物的多劑量所需的時間間隔可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員使用一種以上的常規(guī)實驗來確定。
給藥途徑包括口服、非腸道、直腸、陰道內(nèi)、局部、鼻部、眼部、直接注射等途徑。在一個優(yōu)選的實施方案中，可以對患者給予抗炎有效量或抑制肥大細(xì)胞脫粒的劑量的本發(fā)明肽類。一種典型的藥物組合物是通常包含在藥物上可接受載體中的本發(fā)明治療有效量的可提供抗炎作用或抑制肥大細(xì)胞脫粒的肽。
本文所用和下文更完整地描述的術(shù)語“藥物上可接受的載體”包括一種或多種適合于對人或其它動物給藥的相容性固體或液體填充稀釋劑或包囊物質(zhì)。在本發(fā)明中，術(shù)語“載體”由此指的是有機或無機組分、天然或合成組分，它們與本發(fā)明的分子聯(lián)用可有利于應(yīng)用。術(shù)語“治療有效量”指的是本藥物組合物對所治療的特殊疾病產(chǎn)生所需效果或發(fā)揮所需影響的量。可以在制備混有相同組分的組合物過程中使用不同濃度以便依據(jù)所治療的患者年齡、疾病的嚴(yán)重程度、治療期限和給藥方式提供變化形式。
所述載體也必需是相容性的。本文所用的術(shù)語“相容性”指的是藥物組合物中的成分能夠以基本上不影響所需藥物功效的方式與本發(fā)明的小肽類混合且彼此相容。
一般給予本發(fā)明的小肽類本身(純的)。然而，可以給予其藥物上可接受的鹽的形式。這類藥物上可接受的鹽包括但不限于由下列酸制備的那些鹽鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、馬來酸、乙酸、水楊酸、對甲苯磺酸、酒石酸、檸檬酸、甲磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。此外，可以將藥物上可接受的鹽制備成堿金屬或堿土金屬鹽，諸如羧酸部分的鈉、鉀或鈣鹽。因此，本發(fā)明提供了具有醫(yī)療用途的藥物組合物，它們包括本發(fā)明的肽類及其一種或多種藥物上可接受的載體和可以包括任意其它治療組分或可以不包括這些其它治療組分。
所述的組合物包括那些適合于口服、直腸、陰道內(nèi)、局部、鼻部、眼部或非腸道給藥的組合物，這些給藥途徑均可以用作使用本發(fā)明物質(zhì)的給藥途徑。含有本發(fā)明肽類的藥物組合物還可以含有一種或多種藥物上可接受的載體，這些載體可以包括賦形劑諸如穩(wěn)定劑(有利于長期儲存)、乳化劑、粘合劑、增稠劑、鹽、防腐劑、溶劑、分散介質(zhì)、包衣材料、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和延緩吸收劑等。這類介質(zhì)和試劑在藥物活性物質(zhì)中的應(yīng)用在本領(lǐng)域中是眾所周知的。除任意常用介質(zhì)或試劑與本發(fā)明的肽類不相容外，它們在藥物制劑中的應(yīng)用是本文所關(guān)注的。還可以將補充的活性組分混入本發(fā)明的組合物中。
優(yōu)選將適合于口服給藥的組合物用于治療哮喘。一般來說，將這類組合物制成吸入氣溶膠、噴霧劑(nebule)、糖漿劑或片劑。優(yōu)選將適合于局部給藥的組合物用于治療關(guān)節(jié)炎，不過口服組合物也可能是便利的。一般來說，將這類局部用組合物制成霜劑、軟膏劑或溶液。在這類組合物中所述肽活性組分的濃度一般低于50μg/ml、更優(yōu)選低于30μg/ml且最優(yōu)選約為5-10μg/ml。
可以便利地將所述組合物制成單位劑型且可以通過制藥領(lǐng)域眾所周知的任意方法來制備它們。方法一般包括將本發(fā)明活性組分與構(gòu)成一種或多種輔助組分的載體混合的步驟。
例如，可以將適合于吸入給藥的本發(fā)明組合物制成氣溶膠或吸入溶液。典型的氣溶膠組合物的實例由懸浮在三氯一氟甲烷和二氯二氟甲烷與油酸的混合物中的所需量的微晶肽組成。典型溶液的實例由溶解或懸浮在無菌鹽水(為增溶可以含有約5％v/v二甲亞砜(“DMSO”))中的所需量的肽、苯扎氯銨和硫酸(用來調(diào)節(jié)pH)組成。
還可以將適合于口服給藥的組合物制成分散單位諸如膠囊劑、扁囊劑、片劑或錠劑，它們各自含有預(yù)定量的本發(fā)明肽；或可以將本發(fā)明的肽包含在脂質(zhì)體中或制成含水液體或非水液體的混懸劑諸如糖漿劑、酏劑或乳劑。作為非活性組分的片劑基質(zhì)的實例包括玉米淀粉、乳糖和硬脂酸鎂。糖漿劑基質(zhì)的實例包括檸檬酸、著色染料、增香劑、羥丙基甲基纖維素、糖精、苯甲酸鈉、檸檬酸鈉和純水。
適合于非腸道給藥的組合物便利地包括本發(fā)明分子的無菌含水制劑，它優(yōu)選與接受者的血液等滲?？梢园凑帐褂煤线m的分散劑或濕潤劑和懸浮劑的公知方法配制這種含水制劑。無菌注射劑還可以是無菌注射溶液或在無毒性的非腸道可接受的稀釋劑或溶劑中的混懸液、例如制成1，3-丁二醇的溶液。在可以使用的可接受載體或溶劑中有水、林格液和等滲氯化鈉溶液。在水溶液中，可以將高達約10％v/v的DMSO或Trappsol用于維持某些肽類的溶解度。此外，可以便利地將無菌的固定油用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為了這一目的，可以使用包括合成的單甘油二酸酯或二脂酰甘油酯在內(nèi)的許多固定油。此外，可以將脂肪酸類(諸如油酸或中性脂肪酸類)用于制備注射劑。此外，為了以定時釋放為基礎(chǔ)在數(shù)周或數(shù)月期限內(nèi)注射來自固體形式的化合物，在4℃下用脂類配制伯洛沙姆嵌段共聚物。
可以將適合于局部給藥的組合物制成所述肽的Trappsol或DMSO溶液、或霜劑、軟膏劑或洗劑。
一般來說，將約0.1-約2.5％的活性組分混入基質(zhì)或載體。霜劑基質(zhì)的實例包括純水、凡士林、芐醇、十八烷醇、丙二醇、肉豆蔻酰異丙酯、聚氧乙烯(40)硬脂酸酯、卡波姆934、十二烷基硫酸鈉、乙酸二鈉、氫氧化鈉且可以包括DMSO。軟膏劑基質(zhì)的實例包括白凡士林且可以包括礦物油、失水山梨糖醇倍半油酸酯和DMSO。洗劑基質(zhì)的實例包括卡波姆940、丙二醇、聚山梨醇酯-40、丙二醇硬脂酸酯、膽甾醇和相關(guān)的甾醇類、肉豆蔻酰異丙酯、失水山梨糖醇棕櫚酸酯、乙酰基醇、三乙醇胺、抗壞血酸、二甲基硅油和純水。
OVA-誘發(fā)的支氣管哮喘小鼠模型將慢性哮喘的小鼠模型用于測試f-Met-Leu-Phe-Phe(HK-X)對頑固性哮喘的作用。這種鼠系統(tǒng)是一種慢性哮喘模型，其中存在與氣道基層外部邊緣結(jié)合的大量炎癥細(xì)胞浸潤。在免疫接種5個月的期限中，小鼠在第1個月中開始進行免疫接種程序，隨后每周用OVA進行鼻內(nèi)攻擊，這一方案在小鼠體內(nèi)建立了頑固性哮喘疾病。免疫接種的小鼠的血管和氣道周圍含有增加的膠原蛋白累積，從而顯示出纖維變性狀態(tài)。在16天的期限內(nèi)用8次劑量的HK-X治療免疫接種的小鼠(即每隔一天一次)。實施例1材料和方法試劑結(jié)晶OVA獲自Pierce Chem.Co.(Rockford，IL)且硫酸鋁鉀(alum)來自Sigma Chem.Co.(St.Louis，MO)，而不含致熱原的蒸餾水來自Baxter，healthcare Corporation(Deerfield，IL)。將OVA(500μg/ml)與等體積的10％(wt/vol)alum的蒸餾水溶液混合。以750g將在室溫下培養(yǎng)60分鐘后的該混合物(使用10N NaOH將pH調(diào)節(jié)至6.5)離心5分鐘；將沉淀在蒸餾水中重新懸浮至原始體積并在1小時內(nèi)使用。
使雌性BALB/c小鼠(商購的6-8周齡小鼠；D和K，Seattle WA)在常規(guī)研究條件下寄居。
誘發(fā)慢性哮喘的過敏原免疫接種/攻擊方案在第1天給小鼠腹膜內(nèi)(“i.p.”)注射0.2ml(100μg)OVA的alum溶液并在第14天將腹膜內(nèi)注射(100μgOVA的alum溶液)與鼻內(nèi)給予OVA(100μg的鹽水溶液)聯(lián)用。在第25、26和27天時，通過鼻內(nèi)給予OVA(100μg的鹽水溶液)進一步攻擊小鼠。隨后每周通過鼻內(nèi)給予OVA(100μg的鹽水溶液)攻擊小鼠、再持續(xù)5個月。參見附圖1。
慢性哮喘的治療方法正如附圖1中所示，將50μg/ml的HK-X經(jīng)鼻內(nèi)(“IN”)總計給予在16天期限內(nèi)輸送的8次劑量。在最后一次HK-X劑量后1天處死動物。
用于給藥的HK-X的制備50μg HK-X(溶于50μl含有2.5％以下的DMSO的鹽水)。將足量的DMSO用于溶解該化合物，但不要超過2.5％(體積)。將該溶液通過鼻輸注入肺，同時對接受者進行麻醉。
就對照組載體而言，動物通過鼻接受(鼻內(nèi)給藥)相同量的鹽水，同時麻醉。
組織學(xué)在最后一次HK-X治療或最后一次OVA攻擊后通過注射麻醉劑處死所有動物。切下肺并用10％福爾馬林固定。將一片肺葉固定在卡諾氏固定液中以用于免疫細(xì)胞化學(xué)研究。在固定24小時后，將肺脫水并置于石蠟塊中。用實驗室號給所有的石蠟塊編號以用于盲試分析。
將石蠟塊切片并選擇分隔成1mm距離的各肺的2層且由各層制成8個載玻片。用蘇木精和伊紅將栽玻片染色以便用肉眼觀察一般細(xì)胞和組織的結(jié)構(gòu)情況。用愛茜藍鑒定含有細(xì)胞的粘液和釋放入氣道的粘液；對纖維變性中的膠原蛋白沉積進行Mason’s trichrome染色；并用亞甲藍和伊紅鑒定肺組織中的嗜酸細(xì)胞。
形態(tài)測量分析分析過敏性慢性肺病的下列參數(shù)。
1.氣道阻塞得分-借助于一種從+到++++的得分系統(tǒng)，可以按照已有的報導(dǎo)(Henderson等《實驗藥物雜志》(J.Exp.Medicine)第1-84卷1483-94頁，1996年10月)確定分泌入培養(yǎng)基和大尺寸氣道的粘液的嚴(yán)重程度。
2.含有粘液顆粒的上皮細(xì)胞的部分-通過對在培養(yǎng)基到較大氣道(600μm-1,000μm直徑)中含有100個上皮細(xì)胞外的粘液的上皮細(xì)胞的數(shù)量隨機計數(shù)來評價。對不同肺葉中的總計10個區(qū)域計數(shù)并將平均得分制表。
3.浸潤細(xì)胞的細(xì)胞密度-通過使用從+到++++范圍的得分系統(tǒng)估計結(jié)合在氣道并位于血管周隔間中累積的炎癥細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)。得分為+表示炎癥細(xì)胞層為3個細(xì)胞但在5個細(xì)胞以下；++表示炎癥密度在5-10個細(xì)胞；+++表示炎癥密度為10-20個細(xì)胞；且++++表示炎癥密度為20-40個細(xì)胞。
4.各種細(xì)胞類型的數(shù)量-通過對每個高倍視野(40x)中結(jié)合在氣道中的2,200u2區(qū)域內(nèi)的數(shù)量進行計數(shù)來對嗜酸細(xì)胞和中性粒細(xì)胞進行定量。
5.肉芽腫得分-在低倍(5x)下對肉芽腫樣結(jié)構(gòu)進行計數(shù)。將結(jié)合在氣道或血管上的細(xì)胞聚集物計為肉芽腫。
組織形態(tài)測量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析將SigmaStat 2.0版用于進行實驗組與對照組之間的統(tǒng)計比較。通過ANOVA分析差異的顯著性(p＜0.05)。將SigmaPlot 4.0版或GraphPad Prism用于構(gòu)建數(shù)據(jù)的圖解表示。
結(jié)果在用OVA免疫接種小鼠和隨后用HK-X治療過程中沒有觀察到不良反應(yīng)或疾病征兆。在整個實驗期限中小鼠是活躍的。
然而，在處死動物并對肺組織進行組織學(xué)檢查后，僅免疫接種OVA的動物具有與在人體中觀察到的慢性哮喘一致的嚴(yán)重肺病理改變。因此，這種小鼠系統(tǒng)是慢性哮喘的模型，其中存在與氣道基層外部邊緣結(jié)合的大量炎癥細(xì)胞浸潤(參見附圖2B)。
當(dāng)在16天期限內(nèi)用8次劑量的HK-X治療動物時，在氣道和血管周圍的炎癥細(xì)胞數(shù)量明顯減少(參見附圖2A)。
正如附圖3中所說明的，OVA免疫接種的小鼠的血管(Vessels)和氣道周圍含有的膠原蛋白累積增加(藍色)(參見附圖3C)。然而，用HK-X治療的肺表現(xiàn)出膠原蛋白沉積水平下降(參見附圖3A)。在對照組小鼠中(給予HK-X鹽水溶液)，肺組織不含炎癥細(xì)胞和纖維變性膠原蛋白沉積(參見附圖3B)。
當(dāng)在pH2.3下用愛茜藍通過肉眼觀察到含粘液的細(xì)胞時，觀察到了相似形式的結(jié)果。在免疫接種OVA的小鼠體內(nèi)的極高比例的上皮細(xì)胞中含有粘液顆粒(參見附圖4C)。相反，使用HK-X的治療方法顯著減少了氣道中含有粘液的細(xì)胞數(shù)量(參見附圖4B)。實際上，這一頻率并沒有不同于對照組或僅給予含有HK-X的鹽水的非免疫接種動物的頻率(參見附圖4A)。
這些6個月齡的慢性哮喘小鼠氣道的50-60％被粘液阻塞(附圖5)。當(dāng)在16天期限內(nèi)經(jīng)鼻內(nèi)給予8次劑量的HK-X時，氣道中粘液的累積和粘液細(xì)胞明顯減少(附圖6)。此外，每單位面積上包括嗜酸細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在內(nèi)的浸潤炎癥細(xì)胞的數(shù)量也得到了減少(附圖7)。對免疫接種OVA和用HK-X治療的動物的組織病理學(xué)觀察結(jié)果與僅用鹽水或含HK-X的鹽水治療的動物的組織病理學(xué)觀察結(jié)果相似。
在鼠模型中慢性哮喘的重要特征之一是在肺中出現(xiàn)肉芽腫結(jié)構(gòu)。HK-X減少了經(jīng)治療動物肺中的這些結(jié)構(gòu)的數(shù)量和大小(附圖8)。
就對用HK-X治療的慢性哮喘小鼠以及用生理鹽水治療的動物的比較而言，在肝臟的組織病理學(xué)方面沒有顯著性差異(附圖9)。因此，正如本文所確定的，不存在因?qū)π∈箢l繁鼻內(nèi)給予劑量的HK-X而產(chǎn)生的肝臟毒性。
將這些研究用于確定給予HK-X是否能夠減少過敏原誘發(fā)的慢性哮喘的鼠模型中的氣道炎癥和粘液細(xì)胞功能亢進。在這種模型中，小鼠對OVA敏感并通過每周經(jīng)鼻內(nèi)途徑接觸OVA5個月且在16天的期限內(nèi)用HK-X經(jīng)鼻內(nèi)將其治療8次。這種免疫接種過敏原和攻擊方案導(dǎo)致嗜酸細(xì)胞和其它類型的炎癥細(xì)胞的慢性氣道浸潤、氣道中粘液累積和粘液分泌細(xì)胞增生。
通過給予HK-X來減少氣道分泌過多、粘液細(xì)胞增生和嗜酸細(xì)胞和中性粒細(xì)胞補充。這些結(jié)果表明HK-X在減少過敏原誘發(fā)的慢性哮喘模型中發(fā)生的氣道粘液分泌過多和晚期炎癥方面起重要作用。觀察到了通過HK-X可以緩和肺部炎癥和減少粘液分泌和粘液細(xì)胞分化。
進一步值得關(guān)注的是HK-X在16天期限的治療過程中持續(xù)有效，這表明在這種模型中不會發(fā)生快速脫敏。此外，當(dāng)在延長的期限內(nèi)以1mg/Kg體重對小鼠給藥時，鼻內(nèi)給予HK-X不會產(chǎn)生任何可檢測到的肝臟毒性。
本實施例報導(dǎo)了試驗結(jié)果，其中隨后用OVA經(jīng)鼻內(nèi)(“IN”)進一步攻擊患有誘發(fā)的慢性哮喘和按照本發(fā)明治療的小鼠。材料與實施例1中相同。
方法如實施例1中所述在6個月期限內(nèi)給Balb/c小鼠反復(fù)免疫接種OVA。此后，如實施例1中所述在16天的期限內(nèi)用每次劑量50μg的HK-X經(jīng)鼻內(nèi)治療小鼠、總計8次劑量。然后在用OVA進行鼻內(nèi)攻擊前15-30分鐘再給予50μg劑量的HK-X的方案。將該方案總計重復(fù)3天。在最后一次治療后的當(dāng)天處死小鼠。參見附圖10。
按照與實施例1中相同的方式制備HK-X。
HK-X的給藥HK-X/OVA組動物接受的HK-X劑量為0.4mg/Kg體重(50μg/20gm體重/天)，而鹽水組接受相同劑量的不含OVA的HK-X。前期藥代動力學(xué)研究表明HK-K在小鼠體內(nèi)的血漿T1/2(半衰期)低于30分鐘。因此，為了維持過敏原攻擊過程中的血漿濃度，在OVA攻擊前立即使這些小鼠再接受鼻內(nèi)HK-X劑量。
肺組織學(xué)收集氣管和左肺(上葉和下葉)并在20℃下用10％福爾馬林固定15小時。在包埋入石蠟中后，將組織切成5μm的部分。用改進的Discombe’s溶液給肺組織中的嗜酸細(xì)胞染色。通過如上所述的形態(tài)測量分析(Henderson等《實驗藥物雜志》(J.Exp.Medicine)第1-84卷1483-94頁，1996年10月；Su等《美國復(fù)發(fā)性疾病綜述》(American Review Repetitive Diseases)第147卷448-56頁，1993)確定每單位氣道面積(2,000μm2)中的嗜酸細(xì)胞數(shù)量。通過下列染色法來鑒定氣道粘液和粘液細(xì)胞亞甲藍、粘蛋白胭脂紅、甲苯胺藍和愛茜藍。
根據(jù)0-5+范圍的半定量模式估計被粘液封閉的氣道直徑。就每只小鼠而言，通過形態(tài)測量分析評價不了解方案設(shè)計的個體隨機分布在被粘液封閉的整個左肺中的10個氣道部分。以下列標(biāo)準(zhǔn)為基準(zhǔn)給予各氣道部分被粘液封閉的氣道直徑的得分0-無粘液；1+-10％封閉；2+-30％封閉；3+-50％封閉；4+-80％封閉；和5+-90-100％封閉。
結(jié)果來自變應(yīng)性攻擊的小鼠的肺組織的光學(xué)顯微照片在6個約期限內(nèi)免疫接種OVA且然后反復(fù)用OVA攻擊的動物具有與在人體內(nèi)觀察到的慢性哮喘一致的嚴(yán)重肺結(jié)構(gòu)改變。觀察到了與氣道基層外部邊緣結(jié)合的大量炎癥細(xì)胞浸潤(參見附圖11C)。當(dāng)在16天的期限中用8次劑量的HK-X治療動物并在變應(yīng)性攻擊前30分鐘給予HK-X時，氣道和血管周圍炎癥細(xì)胞數(shù)量明顯減少(參見附圖11A)且與用鹽水處理的小鼠中觀察到的形式相似(參見附圖11B)。
免疫接種OVA的小鼠血管和氣道周圍的膠原蛋白累積增加(藍色)(參見附圖12C)。然而，用HK-X治療的肺表現(xiàn)出膠原蛋白沉積水平下降(參見附圖12A)。在給予HK-X鹽水溶液的對照組小鼠中，肺組織不含炎癥細(xì)胞和纖維變性膠原蛋白沉積(參見附圖12B)。
當(dāng)在pH2.3下用愛茜藍通過肉眼觀察到含粘液的細(xì)胞時，觀察到了相似形式的結(jié)果。在免疫接種OVA的小鼠體內(nèi)的極高比例的上皮細(xì)胞中含有粘液顆粒(參見附圖13C)。相反，使用HK-X的治療方法顯著減少了氣道中含有粘液的細(xì)胞數(shù)量(參見附圖13A)。實際上，這一頻率并沒有不同于對照組或給予含有HK-X的鹽水的非免疫接種動物的頻率(參見附圖13B)。
HK-X對進入肺的嗜酸細(xì)胞和中性粒細(xì)胞補充(recruitment)的影響HK-X治療對進入肺的嗜酸細(xì)胞和中性粒細(xì)胞補充的影響如附圖14中所示。用HK-X的預(yù)治療使進入OVA免疫接種和攻擊的小鼠肺組織中的浸潤嗜酸細(xì)胞數(shù)量和浸潤中性粒細(xì)胞數(shù)量分別減少了70％和30％。在鹽水處理的肺中觀察到的嗜酸細(xì)胞的平均數(shù)量為0.3±0.1個細(xì)胞/2,200μm2。在僅用HK-X的鹽水溶液治療后，肺組織中的嗜酸細(xì)胞數(shù)量輕度增加、為0.75±0.18個細(xì)胞/2,200μm2。相反，HK-X治療顯著減少了結(jié)合在氣道和血管上的總炎癥細(xì)胞浸潤的數(shù)量(附圖15)。
通過HK-X治療減少的肺中粘液累積在連續(xù)3天經(jīng)鼻內(nèi)進行過敏原攻擊后，確定氣道粘液阻塞得分和氣道粘液細(xì)胞的數(shù)量。如上述方法中所述按照0-5的等級估計氣道粘液阻塞得分。如實施例1中所述對粘液細(xì)胞數(shù)量進行半定量測定。在鹽水治療組中，平均氣道粘液累積得分為0.1±0.05(參見附圖16)。在OVA攻擊組中，氣道阻塞得分增加23.3倍，達到23.3±0.17的得分(鹽水組與OVA組相比p＜0.001；通過Mann Whitney Rank Sum Test)。在OVA攻擊前15-30分鐘，通過HK-X治療使氣道粘液阻塞得分或氣道封閉(occlusion)減少了78％(p＜0.001；通過Mann Whitney RankSum Test)。類似地，氣道中粘液細(xì)胞的數(shù)量得到了減少(參見附圖17)。特別地，在OVA攻擊而未經(jīng)HK-X治療的肺中，34.66±6.45％的上皮細(xì)胞已經(jīng)分化成粘液分泌，而在HK-X治療的肺中，僅有11.24±4.73％的細(xì)胞中含有粘液(p＜0.001；通過Mann Whitney RankSum Test)。
慢性哮喘肺中肉芽腫樣結(jié)構(gòu)的形成水平通過用OVA和HK-X或單獨的OVA在免疫接種OVA動物體內(nèi)反復(fù)攻擊來確定6個月的肺中肉芽腫的形成情況。正如附圖18中所示，在經(jīng)HK-X治療的肺中形成的肉芽腫減少了3倍(p＜0.001；通過MannWhitney Rank Sum Test)。
設(shè)計這些研究用于確定給予HK-X是否能夠減少過敏原誘發(fā)的慢性哮喘的鼠模型中的氣道炎癥和粘液細(xì)胞功能亢進(hyperactivity)。在這種模型中，小鼠對OVA敏感且隨后通過每周經(jīng)鼻內(nèi)途徑接觸OVA 5個月且進一步連續(xù)3天接觸OVA的鼻內(nèi)攻擊。這種免疫接種過敏原和攻擊方案導(dǎo)致嗜酸細(xì)胞和其它類型的炎癥細(xì)胞的慢性氣道浸潤、氣道中粘液累積和粘液分泌細(xì)胞增生。
此外，在這種模型中，通過給予HK-X來減少氣道分泌過多、粘液細(xì)胞增生和嗜酸細(xì)胞和中性粒細(xì)胞補充。這些結(jié)果表明HK-X在減少這種過敏原誘發(fā)的慢性哮喘模型中發(fā)生的氣道粘液分泌過多和晚期炎癥方面起重要作用。通過HK-X可以緩解肺部炎癥和減少粘液分泌和粘液細(xì)胞分化表明HK-X可用于治療人體內(nèi)的慢性哮喘。
已經(jīng)參照本發(fā)明的優(yōu)選實施方案具體描述了本發(fā)明。然而，可以理解的是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在考慮本說明書和附圖時在如中定義的本發(fā)明實質(zhì)和范圍內(nèi)對其進行修改和改進。
權(quán)利要求
1.一種用于治療哺乳動物纖維變性的方法，該方法包括對所述的哺乳動物給予抗纖維變性有效量的肽的步驟，所述的肽具有通式f-Met-Leu-X，其中X選自由Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr組成的組。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的纖維變性是因為一種疾病狀況導(dǎo)致的病理變化所造成的，所述的疾病狀況選自由肺纖維化、動脈粥樣硬化、肝硬變、腎小球硬化癥、慢性胰腺炎和冠狀動脈疾病組成的組。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的纖維變性是因為肺纖維化導(dǎo)致的病理變化所造成的。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的纖維變性是因為動脈粥樣硬化導(dǎo)致的病理變化所造成的。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的纖維變性是因為肝硬變導(dǎo)致的病理變化所造成的。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的纖維變性是因為腎小球硬化癥導(dǎo)致的病理變化所造成的。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的纖維變性是因為慢性胰腺炎導(dǎo)致的病理變化所造成的。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的纖維變性是因為冠狀動脈疾病導(dǎo)致的病理變化所造成的。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的纖維變性是因為一種選自外傷和外科手術(shù)組成的組的疾病情況導(dǎo)致的病理變化所造成的。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的纖維變性是因為外傷導(dǎo)致的病理變化所造成的。
11.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的纖維變性是因為外科手術(shù)導(dǎo)致的病理變化所造成的。
12.權(quán)利要求10所述的方法，其中所述的纖維變性是因為一種疾病情況導(dǎo)致的病理變化所造成的，所述的疾病情況選自脊柱手術(shù)后硬膜中或神經(jīng)根中神經(jīng)周的手術(shù)后纖維變性、帶有粘連的受損的或修補的腱的腱松解術(shù)、帶有粘連的受損的或修補的外周神經(jīng)的神經(jīng)松解術(shù)、因婦科和腹部手術(shù)造成的手術(shù)后粘連、逆轉(zhuǎn)男性或女性絕育的輸精管或輸卵管修復(fù)手術(shù)以及諸如尿道、腸或食道這樣的其它管狀結(jié)構(gòu)的外科修復(fù)。
全文摘要
本發(fā)明描述了用于治療哺乳動物體內(nèi)纖維變性的方法。對哺乳動物給予抗纖維變性有效量的一種肽,它具有通式f－Met－Leu－X,其中X選自由Tyr、Tyr－Phe、Phe－Phe和Phe－Tyr組成的組。這種纖維變性可能是因為例如由肺纖維化、動脈粥樣硬化、肝硬變、腎小球硬化癥、慢性胰腺炎、冠狀動脈疾病(諸如由細(xì)菌肺炎衣原體、外傷或外科手術(shù)感染所導(dǎo)致)導(dǎo)致的病理變化所造成的。導(dǎo)致纖維變性的外科手術(shù)的實例有脊柱手術(shù)后硬膜中或神經(jīng)根中神經(jīng)周的手術(shù)后纖維變性、帶有粘連的受損的或修復(fù)的腱的腱松解術(shù)、帶有粘連的受損的或修復(fù)的外周神經(jīng)的神經(jīng)松解術(shù)、因婦科和腹部手術(shù)造成的手術(shù)后粘連、使男性或女性絕育逆轉(zhuǎn)的輸精管或輸卵管修復(fù)手術(shù)以及諸如尿道、腸或食道這樣的其它管狀結(jié)構(gòu)的外科修復(fù)。
文檔編號A61P17/02GK1348381SQ00806666
公開日2002年5月8日 申請日期2000年3月20日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月22日
發(fā)明者J·克拉格特 申請人:海斯塔泰克有限責(zé)任公司