專利名稱：用葉下珠定向刺激免疫系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用葉下珠定向刺激免疫系統(tǒng)，最好是刺激腫瘤壞死因子、樹狀細胞和吞噬細胞。
葉下珠屬包括多種植物，多分布于中印和南印、臺灣以及中南美洲。在本發(fā)明中，“葉下珠”包括所有代表性品種，例如霸貝菜，amarue葉下珠等。在印度民間醫(yī)學中，已知可用葉下珠屬植物治療多種疾病。因此，例如“DoctorK.M.Nadarni′s Indian Materia Medica(第3版；A.K.Nadkarni增編)”在第一卷中指出，此類植物具有輕瀉、利尿、收斂、清涼的作用。同理，葉下珠屬植物配制的組合物據(jù)說可用于治療黃膽、水腫、淋病、經(jīng)血過多等與泌尿生殖道相關(guān)的疾患。還知道，可將取自樹干的汁液與油混合，作為眼藥或其它制劑用于潰瘍、創(chuàng)傷和腫脹等，并可用其葉子治療瘙癢等皮膚病。
而且，已知可從葉下珠屬植物中提取多種活性物質(zhì)，例如葉下珠脂素、次葉下珠脂素，三十烷醇，三十烷醛，repandusinic酸A(參見JP 03206044 A；AIDS-Res-Hum-逆轉(zhuǎn)錄病毒(11/1992)，第8卷(11)，HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶……)，phyllanthostatin-1，葉下珠苷，phyllanthocin，phyllanthocin酸(參見，例如EP1734480；美國專利4,388,457)，葉霉素(phyllamycin)A、B和C，反爵床脂素(retroiusticidin)B，爵床脂素(justididin)A和B(參見，例如，AIDS-周刊，25.9.95，AIDS治療……)，亞油酸，亞麻酸和蓖麻油酸(參見美國油料化學家協(xié)會雜志81.06.00，霸貝菜中的蓖麻油酸……)，phyllamyricin D、E和F、phyllamycoside A、B和C(參見J.Nat.Prod.(11/1996)，Vol.59(11)，6(04/1995)，Vol43(4)，Inhibitoryeffects of Egyptian……)，putranjivain A(參見化學制藥通報(東京)，(04/1995)，vol.43(4)，埃及的…抑制作用)，ursulic酸和niruriside(參見J.Nat.Prod.02/96，vol。59(2)，Nimriside，a new HIV……；Recl.Trav.Chim(06/1996)，Synthesisof……)。
迄今已知的治療作用包括抗衰老(參見JP08176004)，預防和治療AIDS等免疫缺陷癥，流感，傷風，結(jié)核病，肝炎，硬化癥(參見US5,529,778；AIDS-Weekly-Plus 05.08.96，抗病毒(藥物開發(fā))；Inhibition of HIV……)，抗癌作用(參見US4,388,457)，治療HIV、HBV和/或HCV感染，尤其是局部治療Kaposi′s肉瘤(參見EP1734480；US5,466,455)，蛋白酶抑制作用，彈性酶抑制作用和增白作用(參見JP09087136)，鎮(zhèn)痛和消炎作用，酪氨酸激酶抑制作用(參見JP08012566)，以及與其它植物提取物聯(lián)用作為抗感染劑。而且還可用于化妝品。根據(jù)以上所述的廣泛用途，和可分離得到的多種活性成分可以看出，葉下珠是一類可用于多種病患治療的藥用植物。
免疫系統(tǒng)在維持人體健康及抵抗疾病方面起著重要作用。免疫系統(tǒng)中知悉最多的是介導體液免疫的B細胞(抗體)和介導細胞免疫的T細胞。免疫系統(tǒng)迅速而有效地破壞通過多種渠道(昆蟲叮咬、鼻/咽粘膜感染、個體間的非腸胃道傳染、母嬰間的水平傳遞)進入機體的細菌、病毒及其它進入體內(nèi)的異源物質(zhì)，它們由合適的呈遞細胞呈遞給免疫系統(tǒng)從而被消滅。
免疫系統(tǒng)中特化的抗原呈遞細胞包括例如樹狀細胞，它們在誘導初次免疫應答中起著重要作用。例如，在樹狀細胞表面上的病毒表位呈遞可引發(fā)病毒特異性細胞毒T細胞應答，由此消滅機體內(nèi)的病毒。
許多現(xiàn)有免疫系統(tǒng)刺激劑的主要缺點在于是來自化學合成而非天然來源。尤其是當前環(huán)保意識逐漸增強而且健康越來越受重視時，許多人排斥純化學合成藥而要求醫(yī)生使用天然藥物。
然而，目前還沒有可令人滿意的藥物既可定向刺激免疫系統(tǒng)，同時又具有良好的患者耐受性。
因此，本發(fā)明目的就在于提供一種既可定向刺激免疫系統(tǒng)又具有良好耐受性的物質(zhì)。
本發(fā)明涉及用葉下珠定向刺激免疫系統(tǒng)，特別是刺激腫瘤壞死因子(TNF)尤其是TNFα的合成。還包括對樹狀細胞的刺激。
例如，已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)作為免疫成分的單核細胞(MNC)或樹狀細胞可通過改變細胞因子合成對環(huán)境改變作出應答。
“細胞因子”是一種細胞分泌的肽，在與特異性受體結(jié)合后可影響其它細胞的功能。細胞因子的作用之一是調(diào)節(jié)免疫細胞間復雜的相互作用。其例子包括干擾素、膽堿刺激因子等。特別重要的是腫瘤壞死因子(TNF)，尤其是TNFα，這是一類內(nèi)源性蛋白質(zhì)，接觸內(nèi)毒素后在巨噬細胞內(nèi)形成單核毒素形式，但由活化肥大細胞體內(nèi)分泌時仍是三聚體。TNFα既可從組織中分離，也可通過基因工程獲得，并具有免疫調(diào)節(jié)和保護作用。一方面，它可激活免疫系統(tǒng)中的巨噬細胞和白細胞，誘導炎性急相蛋白的合成(觸珠蛋白，補體成分C3)，具有抗病毒作用，與γ干擾素具有協(xié)同作用，可保護實驗動物抵抗瘧疾，并能破壞某些腫瘤而不傷及健康組織。另一方面，它也具有某些副作用，例如改變血管內(nèi)皮細胞的特性，嚴重減輕體重，發(fā)燒和毒性休克等。而且，TNFα與病毒衣殼蛋白非常相似，但氨基酸序列不同。
TNFα由巨噬細胞(特殊的防御細胞)分泌，可抗病毒感染。TNFα參與防御機制中的炎性反應。已知，慢性乙肝和丙肝常與細胞防御衰退有關(guān)，因為這些病毒能夠繞過宿主的免疫應答(Rosenberg W.(1999)“病毒性肝炎中的免疫逃避機制”，Gut44，759-764)。包括TNFα在內(nèi)的某些細胞因子能夠體外激活“幼稚”T細胞和“記憶”T細胞。因此，慢性病毒性肝炎患者體內(nèi)富含細胞因子的炎性環(huán)境促進T細胞的激活，這對病毒的消除十分重要。因此，這對于即使在無抗原刺激情況下(例如病毒清除后)增強肝內(nèi)效應T細胞的功能以及維持外周T記憶細胞十分重要。TNFα“路徑”是細胞特異性的，但仍是基于丙肝病毒特異性人細胞毒T淋巴細胞(CTL)的“旁觀者殺傷機制”。TNFα由CTL分泌，介導所謂“旁觀細胞”的破壞，但不發(fā)生緊密的細胞與細胞接觸。
現(xiàn)在，出人意料地發(fā)現(xiàn)，葉下珠提取物能刺激樹狀細胞并促進TNFα的合成。因此，脂多糖(LPS)刺激的MNC中的TNFα合成顯著增強。即使對提取物進行純化去除其中的內(nèi)毒素后，在刺激的MNC中仍可看到以上結(jié)果。
脂多糖指各種脂類與多肽構(gòu)成的共軛物。革蘭氏陰性菌細胞壁外膜內(nèi)的LPS主要有三種成分類脂A，核心寡多糖和O特異性鏈。類脂A使LPS錨著于細菌膜，并具有免疫激活細菌細胞膜組分的作用。
由于已知葉下珠還具有對其它細胞因子的調(diào)節(jié)作用，而且，根據(jù)不同的研究系統(tǒng)，有時具有消炎作用，有時則具有消滅病毒、抵御病原性物質(zhì)的促炎作用，因此，葉下珠非常適合用于調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，特別是因為，TNFα在細胞因子網(wǎng)絡中占據(jù)著重要位置。適合接受免疫系統(tǒng)刺激的有免疫缺陷狀態(tài)、腫瘤形成和感染，但也包括處于一般健康和增強免疫目的的疾病預防。
葉下珠刺激免疫系統(tǒng)的確切機制尚不知道，但一般認為可能是通過粒細胞—巨噬細胞集落—刺激因子(GM-CSF)調(diào)節(jié)作用導致TNFα的釋放(參見，Carreno等(1998)，增刊1，113-115)。GM-CSF是一種糖蛋白性血細胞生長因子，由活化的T淋巴細胞、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞產(chǎn)生，能夠增強嗜中性粒細胞、單核細胞和嗜酸性粒細胞的產(chǎn)生，被用于丙肝治療和化學治療(Carreno等(1998)，同上)。
在這方面，葉下珠良好的免疫系統(tǒng)刺激效力可能一方面來自其抗氧化作用，另一方面來自其免疫刺激作用，或者兩者兼而有之。因此，可以推測，即使目前所有的抗病毒藥物也不能消除病毒，而只能抑制病毒。即使病毒在外周血中已消失(低于可測水平)，但仍常會在肝組織中檢測到。因此，葉下珠可通過抗氧化作用和免疫刺激作用對消除病毒和抑制慢性炎癥作出貢獻。
本發(fā)明還包括在以上所述路徑之一中使用取自葉下珠的分離物?！胺蛛x物”在此表示通過層析、蒸餾、沉淀、萃取、過濾等方法從葉下珠中分離得到的葉下珠物質(zhì)，特別是通過層析、蒸餾、沉淀或萃取得到的萃得物和組分。
本發(fā)明的另一種使用方式是，根據(jù)以上所述的任一實例使用一種或多種化學物質(zhì)，尤其是分離自葉下珠的活性物質(zhì)。這也包括由葉下珠萃得物或其它萃得物即所謂天然分離物分離的單一物質(zhì)，這些也是現(xiàn)有技術(shù)已知的。使用這些分離得到的活性物質(zhì)的優(yōu)點在于與使用全萃得物或片劑相比，這些物質(zhì)的用量較少，并可獲得特異性作用。
本發(fā)明用途之一中，所述的葉下珠選自amarus葉下珠，霸貝菜，油柑，刺果葉下珠，myrtofolis Moon葉下珠，maderas patensis葉下珠和/或ussuriensis葉下珠。
在本發(fā)明用途中，可以使用葉下珠的葉子、樹皮、花、種籽、果實、莖、枝、干、根和/或木質(zhì)，優(yōu)選其藥用部分(herb)，即植株的全部地上部分。此外，葉下珠材料既可使用其粉碎后形式，也可使用其未加工形式，即完整葉、顆粒、粉末、沉淀物、萃得物、干燥萃得物和/或浸出物，其中優(yōu)選的是萃得物或干燥萃得物。
用于本發(fā)明的葉下珠制劑的制備方法包含由上述植株部分獲得葉下珠材料的粉末或顆粒，先用其它溶劑處理植物萃取物、粉碎后的植物部分、粉末和殘留物，然后用己烷、水、甲醇和/或等其它醇進行萃取。其中還包括通過過濾和真空蒸發(fā)獲得干燥萃得物。另一種方法包括用水溶液和/或醇溶劑和/或極性溶劑進行的多相萃取。另外，常用的還有過濾(例如纖維素濾膜過濾)、沉淀(優(yōu)選乙醇沉淀)，或超離心分離，以及浸漬。而且，還常提高或降低溫度后進行操作。
本發(fā)明中特別優(yōu)選的是使用葉下珠水溶液、非極性溶劑或醇溶劑的萃得物，醇性萃得物最好用短鏈(C1至C4)伯醇(尤其是甲醇或乙醇)或其混合物制取，非極性萃得物用C5-C10分支或不分支烴鏈或其混合物(尤其是正己烷)制取。
另外適合用作萃取劑的是乙酸乙酯或其它合適的有機溶劑/水混合物，優(yōu)選甲醇/水混合物或乙醇/水混合物。合適的萃取過程參見，例如美國專利4,673,575或美國專利4,937,074。
本發(fā)明用途中，葉下珠的使用形式最好是一種或多種藥物產(chǎn)品(參見Rompp，Lexikon Chemie，1.4版)，例如輸注液、注射液、片劑、顆粒劑、藥膏、藥貼、灌腸劑或一種或多種食品/食品補充的形式。這包括通常的藥物和治療應用形式，還特別包括食品補充劑，這使得葉下珠可作為天然無害的食品添加劑用于預防和用作功能性抗氧化劑，并顯示前述治療和預防性功能。
根據(jù)本發(fā)明，葉下珠制劑可口服、局部和/或腸胃外使用。
在一優(yōu)選實施例中，除葉下珠物質(zhì)外還使用了一種或多種活性物質(zhì)和/或合適添加劑和/或助劑。就本發(fā)明而言，“活性物質(zhì)”指具有治療活性的物質(zhì)，例如維生素C或生育酚(特別是α生育酚)，這些是已知的抗氧化劑或可抵抗氧化性應激反應的活性物質(zhì)，另外例如消炎物質(zhì)。因此，這也包括與葉下珠制劑組成的混合制劑產(chǎn)品。在這方面需要指出的是，本發(fā)明的某一種用途決不僅限于葉下珠或取自所述植物的一種形式、組分或分離得到的活性物質(zhì)，而是可以就一種用途聯(lián)合使用多種不同的形式和/或組分和/或分離到的葉下珠活性物質(zhì)。
助劑和添加劑指已知用于治療或食物補充以實現(xiàn)或強化效應用途的物質(zhì)，例如佐劑、崩解劑和潤滑劑、膨大劑、緩沖劑、防腐劑、穩(wěn)定劑等。
以下實施例和附圖是用來具體描述本發(fā)明而不是限定本發(fā)明。


圖1是1，1-二苯基-2-苦基偕腙肼(DPPH)和本發(fā)明葉下珠萃得物的自由基清除實驗結(jié)果；圖2是DPPH和維生素C的自由基清除實驗結(jié)果，用作比較；圖3是DPPH和α-生育酚的自由基清除實驗結(jié)果，用作比較；圖4是溴化3-[4，5-二甲基噻唑-2-噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑鎓(MTT)和本發(fā)明葉下珠萃得物的自由基清除實驗結(jié)果；圖5是MTT與維生素C的自由基清除實驗結(jié)果，用作比較；圖6是細胞色素和本發(fā)明葉下珠萃得物的自由基清除實驗結(jié)果，用作比較；圖7是細胞色素與維生素C的自由基清除實驗結(jié)果，用作比較；圖8是3′[1-[(苯基氨基)-羰基]-3，4-四唑鎓]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸鈉水合物/吩嗪硫酸二甲酯(XTT/PMS)和本發(fā)明葉下珠萃得物的自由基清除實驗結(jié)果；圖9是XTT/PMS與維生素C的自由基清除實驗結(jié)果，用作比較；圖10是葉下珠萃得物對LPS誘導的MNC的作用(萃得物1-4)；圖11是葉下珠萃得物對LPS誘導的MNC的作用(萃得物5-6)；圖12是作為對照的內(nèi)毒素檢測；圖13是葉下珠萃得物對非誘導MNC的作用(萃得物1-4)；圖14是葉下珠萃得物對非誘導的MNC作用(萃得物5-6)；圖15是葉下珠萃得物對樹狀細胞的作用(LAT NO.00120514)；圖16是葉下珠萃得物對樹狀細胞的作用(LAT NO.00130514)；圖17是葉下珠萃得物對樹狀細胞的作用(LAT NO.00140514)；
圖18是葉下珠萃得物對樹狀細胞的作用(LAT NO.00150514)。
實施例1本發(fā)明干燥萃得物的制備(組分1；批號9810H)由2kg印度Madras Phyllanthus amarus藥用部分制取450g粉末。該450g粉末在Soxhlet儀中用3L蒸餾正己烷蒸餾萃取12小時。過濾并真空蒸發(fā)后制得25g干燥的正己烷萃得物，其中的主要組分是親脂性的木酚素、甾醇和色素。該萃得物呈灰棕色糊狀，不溶于水和甲醇，可溶于乙酸乙酯。實施例2干燥甲醇萃得物的制備(組分2；批號9810M)在Soxhlet儀中，用3L蒸餾甲醇繼續(xù)萃取實施例1中不溶于正己烷的殘留植物殘渣12小時。過濾并真空蒸發(fā)后得50g干燥的甲醇萃得物。其中的主要組分是類黃酮、寡聚棓單寧和酚羧酸。該深棕色粉末不溶于水，幾乎全溶于甲醇。實施例3水性上清液的制備(組分3；批號9810W)將甲醇萃取(實施例2)后的不溶性植物殘渣(約375g)浸泡在2.5L熱蒸餾水中，低溫(4℃)浸泡12小時。然后滴加2.5L乙醇(100％(＝1∶1))以沉淀出高分子量的二糖和糖蛋白，然后7500rpm超離心分離。上清液經(jīng)冷凍干燥得15g干物質(zhì)。其主要組分是寡聚棓單寧和其它水溶性聚合物。所得是一種紅棕色粉末，可溶于水，不溶于有機溶劑。實施例4水沉淀物的制備(組分4批號9810pp)將實施例3中的乙醇沉淀和離心分離所得聚合物溶于熱水，冷凍干燥。于是，由450g粗制粉末起始物制得了5g萃得物。其主要組分是高分子量的多糖和糖蛋白。所得產(chǎn)物呈棕色粉末，不溶于水。實施例5無葉綠素甲醇粗提物的制備(組分5批號9901Mcf；P1159)在Soxhlet儀中，用500ml蒸餾甲醇12小時萃取100g由藥用部分制得的葉下珠粉末。過濾并真空蒸發(fā)得15g干燥萃得物，將其溶于300ml熱的蒸餾水/甲醇1∶1混合物。在80℃水浴，間或攪拌，將該溶液濃縮至一半體積。通過纖維素紙熱(80℃)過濾去除油狀沉淀。在濾液中加入熱(80℃)蒸餾水至300ml，再過濾。濾液經(jīng)冷凍干燥得約10g干燥甲醇萃得物，其外觀呈棕色糊狀，可溶于甲醇。實施例6無葉綠素水萃得物的制備(組分6批號9901Wcf)在80-100℃的水浴中，用500ml蒸餾水1小時萃取由藥用部分制得的50g葉下珠粉末，間或攪拌。用纖維素紙過濾熱溶液。在(約400ml)濾液中加入100ml蒸餾甲醇。在80℃水浴，間或攪拌，將混合物蒸發(fā)至一半體積。用纖維素紙趁熱(80℃)過濾去除油狀沉淀。濾液經(jīng)冷凍干燥得3g干燥水萃得物。該萃得物為紅棕色粉末，可溶于甲醇。實施例7DPPH自由基清除實驗將實施例5制得的本發(fā)明萃得物P11599配制成7種不同的濃度，用自由基清除實驗研究其捕獲自由基的能力。即測定515nm處穩(wěn)定自由基DPPH(1，1-二苯基-2-苦基偕腙肼)與相應非自由基性1，1-二苯基-2-苦基偕腙肼之間的顏色改變。為此必須將被測物質(zhì)的DMSO系列稀釋液與DPPH的甲醇溶液在37℃保溫30分鐘，然后測定顏色改變，該實驗進行一式兩份。根據(jù)結(jié)果計算SC50，即DPPH的自由基50％被捕獲時的樣品濃度。用DMSO作為陰性對照，維生素C作為陽性對照，還對α生育酚進行了測定。經(jīng)測定，P11599的SC50為6.2μg/ml，維生素C的為10μM，α生育酚的為18μM(參見圖1-3)。由此可見，作為自由基清除劑，P11599優(yōu)于α生育酚，與維生素C相當。實施例8MTT自由基清除實驗10.6mM濃度的MTT(溴化3-[4，5-二甲基噻唑-2-噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑鎓)與不同濃度的本發(fā)明實施例5萃得物P11599或與作為參照的維生素C在37℃保溫1小時，然后用光度法測定因樣品作用引起的吸光度改變。結(jié)果顯示，P11599具有極高的抗氧化能力，接近于較強的還原劑維生素C(參見圖4和5)。實施例9細胞色素C自由基清除實驗150μM細胞色素C與不同濃度的本發(fā)明實施例5萃得物P11599或與作為參照的維生素C在37℃保溫0.5小時，然后用光度法測定因樣品作用引起的吸光度改變。結(jié)果顯示，P11599具有極高的抗氧化能力，接近于較強的還原劑維生素C(參見圖6和7)。實施例10XTT/PMS自由基清除實驗500μM/0.21μM的3′[1-[(苯基氨基)-羰基]-3，4-四唑鎓]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸鈉水合物/吩嗪硫酸二甲酯(XTT/PMS)與不同濃度的本發(fā)明實施例5萃得物P11599或與作為參照的維生素C在37℃保溫1小時，然后用光度法測定因樣品作用引起的吸光度改變。結(jié)果顯示，P11599具有極高的抗氧化能力，接近于較強的還原劑維生素C(參見圖8和9)。實施例11單核細胞(MNC)的制備用50ml Perfusor針筒的蝴蝶針抽取空腹健康人的血樣，刺人在此前14天中沒有用過藥，每10ml血樣中加入100μl肝素。室溫下在Lekosept Bluecaps中加入15ml Ficoll-Hypaque，1000g離心2分鐘。Ficoll集于分離盤下。用針筒加入15ml上述肝素化血樣，然后加入15ml無菌0.9％NaCl溶液。最后，20℃、2200rpm離心15分鐘。于是，從上到下分層如下血漿/MNC環(huán)/Ficoll/分離盤/Ficoll/紅細胞等。用移液管吸取MNC環(huán)，加入Bluecaps，加NaCl溶液至50ml。然后將此洗滌三次，每次都用等滲鹽水重懸細胞沉淀，然后離心。每次傾出上清液。留下的細胞沉淀即MNC，加入MNC培養(yǎng)基。實施例12葉下珠對特異性表面分子表達的刺激將新鮮分離的MNC培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中的營養(yǎng)培養(yǎng)基中。然后用白介素4(500U/ml)和GM-CSF(1000U/ml)刺激，MNC于是進一步發(fā)育為樹狀細胞。培養(yǎng)6天后，細胞表現(xiàn)出典型的樹狀細胞形態(tài)，并表達HLA-DR、CD54(ICAM-1)、CD80(B7.1)和CD86等表面分子(標志)。這些標志是樹狀細胞的特征。加入TNF等細胞因子可進一步增強樹狀細胞標志的表達。經(jīng)如此處理，樹狀細胞可表達成熟的標志CD83，未受刺激的細胞是不表達該標志的。經(jīng)一系列實驗發(fā)現(xiàn)，不同的葉下珠萃得物均能刺激樹狀細胞標志的表達。以上實驗結(jié)果可參見圖15-18。實施例13對TNFα合成刺激作用的測定將實施例11所得MNC與不同濃度的本發(fā)明實施例1-6的樣品共培養(yǎng)，用ELISA測定TNFα濃度。48孔培養(yǎng)板的每孔中加200μl MNC懸液，濃度為5×106個細胞/ml MNC培養(yǎng)基(RPMI培養(yǎng)基+1％L-谷氨酰胺+1％AB血清+1％青霉素/鏈霉素+1％人白蛋白+1％HEPES)，向其中加入100μl LPS溶液(40ng/ml NMC培養(yǎng)基)和100μl葉下珠稀釋液。葉下珠稀釋液為實施例1-6萃得物的稀釋液，稀釋度為500、100、10、1和0.1μ/ml，由儲備液制得。作為對照，用MNC培養(yǎng)液取代100μl葉下珠稀釋液。
48孔培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)20小時，然后于-80℃冷凍，經(jīng)3輪凍融循環(huán)后進行TNFα試驗。
用ELISA測定所得TNFα濃度，以抗人TNFα作為第一抗體，抗TNF-Bi作為第二抗體，利用450/690nm處的顏色反應。
結(jié)果，本發(fā)明的某些萃得物顯著刺激LPS引起的TNFα合成(圖10，11)。
然而，部分萃得物中含有內(nèi)毒素(Endosafe Inc.USA的LAL測試測得；圖12)。所以，作為該試驗的繼續(xù)，在脫毒柱上對萃得物繼續(xù)純化。該柱先用5ml 1％脫氧膽酸鹽溶液、5ml水和5ml生理鹽水洗滌。然后上樣，暗培養(yǎng)2小時，然后用生理鹽水洗脫。內(nèi)毒素留在柱上。各活性萃得物4、5和6即使在去除內(nèi)毒素后仍表現(xiàn)出明顯的TNFα合成作用。
若取消LPS刺激仍可獲得類似的結(jié)果。此時，與以上實驗一樣，用未純化的葉下珠稀釋液，但用100μl MNC培養(yǎng)基代替100μl LPS溶液(參見圖13，14)。
以上結(jié)果顯示本發(fā)明的萃得物可顯著刺激TNFα的合成。
權(quán)利要求
1.葉下珠用于定向刺激免疫系統(tǒng)的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，被刺激的是腫瘤壞死因子TNF，尤其是TNFα的合成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，被刺激的是抗原呈遞細胞，尤其是樹狀細胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，被刺激的是吞噬細胞，尤其是人吞噬細胞，更好的是粒細胞和單核細胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的用途，所用的是自中葉下珠分離的組分。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的用途，所用的分離自葉下珠的一種或多種化學物質(zhì)，尤其是活性物質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的用途，所述的葉下珠選自amarus葉下珠，霸貝菜，油柑，刺果葉下珠，myrtofolis Moon葉下珠，maderas patensis葉下珠和/或ussuriensis葉下珠。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述的用途，所用的是葉子、樹皮、花、種籽、果實、莖、枝、干、根和/或木質(zhì)，優(yōu)選其藥用部分。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的用途，所用的是葉下珠的粉碎后或未加工形式，即完整葉、顆粒、粉末、沉淀物、萃得物、干燥萃得物和/或浸出物，優(yōu)選萃得物或干燥萃得物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其中使用水性、非極性、C5-10分支或不分支烴鏈或其混合物，以正己烷為佳，和/或使用醇，以C1-4短鏈伯醇或其混合物為佳，尤其是甲醇或乙醇。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項所述的用途，給藥形式是輸注液、注射液、片劑、顆粒劑、藥膏、灌腸劑、藥貼和/或食品補充劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項所述的用途，通過口服、局部和/或腸胃外給藥。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項所述的用途，除葉下珠之外還使用了其它活性物質(zhì)和/或合適的添加劑和/或助劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的用途，其中使用了維生素C和/或生育酚。
全文摘要
本發(fā)明涉及用葉下珠定向刺激免疫系統(tǒng),最好是刺激腫瘤壞死因子、樹狀細胞和吞噬細胞。
文檔編號A61P13/12GK1352563SQ00806852
公開日2002年6月5日 申請日期2000年4月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月29日
發(fā)明者H·瓦格納, S·恩德斯, D·亞當 申請人:西邁醫(yī)藥創(chuàng)新中心股份公司