專利名稱：制備靜脈注射用雙病毒失活的免疫球蛋白的方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)靜脈注射用的免疫球蛋白的完整、多步的工業(yè)化生產(chǎn)方法。其中該免疫球蛋白包含的主要成分為IgG(γ-球蛋白)。
已知有多種從由人類血漿的科恩分級(jí)分離(Cohn fractionation)得來(lái)的起始物質(zhì)中獲得靜脈注射用γ-球蛋白的方法。一些科恩級(jí)分(fraction)比其他的科恩級(jí)分包含有更高效價(jià)的γ-球蛋白。常用的用于制備γ-球蛋白溶液的起始物質(zhì)為科恩級(jí)分II或科恩級(jí)分II+III。
盡管在現(xiàn)有技術(shù)中人們采用了多種分離和殺菌技術(shù)，仍需要不斷探索改進(jìn)方法以提高終產(chǎn)物的純度、安全性和總產(chǎn)量。
很多工業(yè)化生產(chǎn)方法使用溶劑/去污劑或熱處理步驟使病毒失活。到目前為止，還沒(méi)有提出過(guò)以科恩級(jí)分II或科恩級(jí)分II+III糊狀物為起始物質(zhì)的多步方法。該多步方法包括以兩種不同的病毒失活步驟作為高效、高產(chǎn)量的γ-球蛋白生產(chǎn)方法的一部分。
Kaneyama等人的美國(guó)專利第5,151,499號(hào)中提供了一種制備病毒失活的蛋白質(zhì)組合物的方法，其中將該蛋白質(zhì)組合物進(jìn)行蛋白質(zhì)組合物的溶劑/去污劑處理中的包殼病毒的病毒失活以及蛋白質(zhì)組合物的的熱處理中的非包殼病毒的病毒失活。美國(guó)專利第5,151,499號(hào)中指出優(yōu)選使溶劑/去污劑步驟在蛋白酶抑制劑存在的情況下首先發(fā)生，接下來(lái)進(jìn)行熱處理，該熱處理在大部分實(shí)例中為干燥的熱處理。如果熱處理在液態(tài)下進(jìn)行，在任何熱處理之前，通過(guò)將蛋白質(zhì)吸附至一個(gè)離子交換柱而從溶劑/去污劑中回收。液態(tài)熱處理可在糖、糖醇或氨基酸穩(wěn)定劑存在的情況下進(jìn)行。盡管美國(guó)專利第5,151,499號(hào)中列出了很多包含免疫球蛋白的起始蛋白質(zhì)組合物，其生產(chǎn)實(shí)例采用了VIII因子、IX因子、凝血酶、血纖維蛋白原和纖維結(jié)合素。
Uuki等人的美國(guó)專利第5,371,196號(hào)中提供了純化分泌性免疫球蛋白A的方法。其中描述了液態(tài)熱處理或多種液態(tài)熱處理與溶劑處理病毒失活相結(jié)合的方法。其中每一步之后都使用了聚乙烯乙二醇分級(jí)分離，并且總作為最終步驟。該發(fā)明沒(méi)有涉及到高γ-球蛋白效價(jià)的血清免疫球蛋白。
一些現(xiàn)有技術(shù)中生產(chǎn)可靜脈注射的γ-球蛋白溶液的方法描述了在山梨醇熱穩(wěn)定劑存在的情況下、以科恩級(jí)分II+III糊狀物為起始物的多步純化步驟進(jìn)行的液態(tài)熱處理的結(jié)合。Hirao等人的美國(guó)專利第4,845,199號(hào)中，使科恩級(jí)分II+III經(jīng)聚乙烯乙二醇(后文中稱為“PEG”)分級(jí)分離(8％w/v PEG用來(lái)沉淀雜質(zhì)，接著用12％w/v PEG聚集以沉淀γ-球蛋白)，接著進(jìn)行離子交換色譜分離，除去人血型抗體，然后，在作為蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑的山梨醇存在的情況下進(jìn)行液態(tài)熱處理。另一方面，Hirao等人的美國(guó)專利第4,876,088號(hào)中的實(shí)施例1描述了從科恩級(jí)分II+III糊狀物中制備可靜脈注射的γ-球蛋白的方法，其中，糊狀物懸浮于水中，pH值調(diào)至5.5，進(jìn)行離心分離，上清液隨后在33％w/v山梨醇存在的情況下進(jìn)行熱處理使病毒失活，接著進(jìn)行PEG分級(jí)分離(6％/12％)，然后進(jìn)行包括DEAE-Sephadex離子交換色譜法等的其它純化步驟。
本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供一種非常純的可靜脈注射的γ-球蛋白溶液，其不含包括各種熱敏感病毒在內(nèi)的包殼病毒和非包殼病毒。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種工業(yè)上可用的γ-球蛋白方法，包括兩個(gè)連續(xù)的病毒失活步驟，而不需要在第一個(gè)病毒失活步驟之后或第二個(gè)病毒失活之前回收γ-球蛋白。
本發(fā)明提供了本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的上述或其它目的，其中可被部分純化、富含γ-球蛋白的乙醇科恩級(jí)分，首先經(jīng)PEG分級(jí)分離，然后經(jīng)過(guò)兩步病毒失活處理，一步為在溶劑、優(yōu)選為溶劑-去污劑混合液存在的情況下進(jìn)行的病毒失活，以破壞包殼病毒，另一步為熱處理病毒失活，在這兩步之間不需要回收γ-球蛋白。接下來(lái)，將任何熱處理形成的凝聚物從熱處理和溶劑處理過(guò)的溶液中分離出來(lái)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，山梨醇作為熱穩(wěn)定劑，三烷基磷酸鹽作為溶劑。
在本發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施方案中，在溶劑-去污劑處理之前除去所有存在的顆粒。
在本發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施方案中，在病毒失活完成以后，γ-球蛋白溶液經(jīng)PEG分級(jí)分離。
在本發(fā)明另外一個(gè)實(shí)施方案中，在病毒失活完成以后用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂處理γ-球蛋白溶液。
在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，進(jìn)行一步聚乙烯乙二醇分級(jí)分離步驟而不需要沉淀γ-球蛋白。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在熱處理病毒失活之前進(jìn)行溶劑-去污劑病毒失活。
在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種適用于靜脈注射的熱-殺菌和溶劑-去污劑殺菌的γ-球蛋白。發(fā)明詳述本發(fā)明以包含免疫球蛋白的級(jí)分作為起始物質(zhì)，該級(jí)分并不局限于起源于人血漿，并且包含一種免疫球蛋白級(jí)分。所述的含免疫球蛋白級(jí)分的具體例子包括可由科恩乙醇分級(jí)分離獲得的級(jí)分II+III和級(jí)分II及與其同等的含免疫球蛋白級(jí)分的糊狀物。其它的起始物質(zhì)為級(jí)分I+II+III和級(jí)分II+IIIw。起始物質(zhì)中可含雜質(zhì)，如人血型抗體，血纖維蛋白溶酶原、血纖維蛋白溶酶、激肽釋放酶、激肽釋放酶原活化因子、IgM、IgA、IgG聚合物(前后文均為凝聚物)等。
優(yōu)選的起始物質(zhì)為科恩級(jí)分II或者科恩級(jí)分II+III。當(dāng)使用科恩級(jí)分糊狀物II+III時(shí)，建議先經(jīng)過(guò)初步的清洗步驟以形成級(jí)分II+IIIw，該級(jí)分隨后用于本發(fā)明的方法。“級(jí)分II+IIIw”為經(jīng)磷酸氫二鈉溶液清洗過(guò)的科恩級(jí)分II+III沉淀。
級(jí)分II+IIIw可通過(guò)將級(jí)分II+III沉淀沉淀物懸浮于冷水中獲得，作為注射劑，其比率為每約20體積水中含1千克的II+III糊狀物。然后加入磷酸鈉使磷酸鈉的最終濃度為大約0.003M，以溶解脂類、脂蛋白和白蛋白。加入冷乙醇使冷乙醇的最終濃度達(dá)到20％。在乙醇的添加過(guò)程中，溫度逐漸降至-5±1℃，pH值，例如通過(guò)使用醋酸鹽緩沖液或氫氧化鈉稀釋液維持不變或調(diào)至7.2±0.1℃。將溫度維持在-5±1℃時(shí)，使用離心分離和/或過(guò)濾回收所形成的級(jí)分II+IIIw沉淀沉淀物。
根據(jù)本發(fā)明的操作順序，在進(jìn)行PEG分級(jí)分離之前，可進(jìn)行若干初步純化和/或聚集-還原步驟。如當(dāng)使用級(jí)分II+IIIw糊狀物時(shí)，通常含有約20％的乙醇，超過(guò)70％的蛋白質(zhì)為IgG。可將級(jí)分II+IIIw糊狀物懸浮于3到10體積，優(yōu)選3到5體積的約0到5℃的冷水中，pH值使用pH值為4.0的醋酸緩沖液或鹽酸調(diào)至4.5到6.0，優(yōu)選5.0到5.5。然后攪拌混合物2到15小時(shí)，使得所有的γ-球蛋白溶于溶液之中。然后，可通過(guò)離心分離和/或過(guò)濾將不溶的蛋白如白蛋白和α-球蛋白除去。
當(dāng)使用不同的起始科恩級(jí)分時(shí)，可適當(dāng)?shù)剡x擇起始步驟或操作步驟以進(jìn)行理想的初步純化，從而得到高IgG含量的級(jí)分以進(jìn)行進(jìn)一步的處理。例如當(dāng)將科恩級(jí)分II(含有95％純的IgG)從科恩級(jí)分III中分離出來(lái)時(shí)，將科恩級(jí)分II進(jìn)一步處理，初步處理可在酸性pH值為3.2到5.0，優(yōu)選為3.8到4.2(如Uemura等人在美國(guó)專利第4,371,520號(hào)中所述)下進(jìn)行，以使以凝聚物形式存在的免疫球蛋白分解為免疫球蛋白單體和二聚物，因?yàn)橐阎畚锞哂锌够パa(bǔ)性(ACA)。另外一種選擇中，以科恩級(jí)分II+III為起始物質(zhì)，可在以上所述的初步純化之后和PEG分級(jí)分離步驟之前將Uemura等人的專利所述的低pH值處理作為一個(gè)附加步驟來(lái)進(jìn)行。
PEG分級(jí)分離在病毒失活之前進(jìn)行，PEG分級(jí)分離在純化免疫球蛋白的技術(shù)領(lǐng)域是眾所周知的方法，可使理想的IgG單體和二聚物從IgG凝聚物和自然存在于起始血漿蛋白質(zhì)級(jí)分的其它雜質(zhì)中分離出來(lái)。在病毒失活之前除去凝聚物和一些存在的雜質(zhì)可降低在如60℃下進(jìn)行10小時(shí)的熱處理步驟中產(chǎn)生的聚集的程度和濁度。
第二級(jí)PEG分級(jí)分離步驟在熱處理病毒失活之后進(jìn)行，其有益于除去熱處理過(guò)程中產(chǎn)生的變性的雜質(zhì)和/或凝聚物。
可使用任何在現(xiàn)有技術(shù)中記載的PEG分級(jí)分離的方法。在第一級(jí)PEG分級(jí)分離中，可選擇PEG濃度和pH值使得理想的IgG單體和二聚物留在溶液中，而不理想的蛋白質(zhì)如凝聚物沉淀出溶液。離心分離和/或過(guò)濾以后，可調(diào)節(jié)pH以任選地增加PEG濃度，從而使得理想的IgG單體和二聚物沉淀。
例如當(dāng)級(jí)分II+IIIw糊狀物作為起始物質(zhì)時(shí)，PEG分級(jí)分離的第一級(jí)可在pH約為5到7.5，優(yōu)選6.5到7.5下進(jìn)行。當(dāng)級(jí)分II+III糊狀物作為起始物質(zhì)時(shí)，優(yōu)選pH為5.5到6.0，當(dāng)級(jí)分II+IIIw糊狀物作為起始物質(zhì)時(shí)，PEG的濃度范圍為4％到8％，優(yōu)選4％到6％，或者當(dāng)級(jí)分II+III糊狀物作為起始物質(zhì)時(shí)，PEG的濃度為6％到8％。在保持低溫于0℃到2℃之間時(shí)，PEG分級(jí)分離的第一級(jí)可進(jìn)行約1到8小時(shí)，之后按如上所述除去包含凝聚物的不理想蛋白質(zhì)沉淀。如果希望收集純化的免疫球蛋白，過(guò)濾液的pH值調(diào)至約8.0到9.0，優(yōu)選約8.5到8.9，并且加入PEG使得其最終濃度為約10％到15％，優(yōu)選為約12％。純化的免疫球蛋白沉淀，經(jīng)過(guò)濾和/或離心分離除去。
有助于本發(fā)明的實(shí)施的PEG分級(jí)分離的更詳細(xì)的描述可參見(jiàn)上述Hirao等人的美國(guó)專利第4,876,088號(hào)和和Hirao等人的美國(guó)專利第4,845,199號(hào)。
本發(fā)明的下一個(gè)關(guān)鍵步驟為進(jìn)行選自于熱處理和溶劑或溶劑-去污劑混合物處理的第一次病毒失活步驟。于是，進(jìn)行另外的未用于第一次病毒失活的熱處理和溶劑或溶劑-去污劑處理的第二次病毒失活步驟。如下所述，可在熱處理或溶劑/去污劑處理之前或之后的進(jìn)行進(jìn)一步的純化步驟，尤其是那些涉及到使用離子交換樹(shù)脂的純化步驟。
一種特別有利的方法為在作為第一次病毒失活的溶劑-去污劑病毒失活之前進(jìn)行陰離子交換處理。然后在作為第二次病毒失活的熱處理病毒失活之后進(jìn)行陽(yáng)離子交換處理。通過(guò)該方法，可使用陰離子交換劑將一些存在于人類血漿中不需要的蛋白質(zhì)物質(zhì)(如激肽釋放酶原活化因子、IgA、IgM和白蛋白)從IgG中除去，然后，可通過(guò)陽(yáng)離子交換劑除去另外的上述物質(zhì)(激肽釋放酶原活化因子、IgA、IgM和白蛋白)連同PEG、由溶劑-去污劑處理產(chǎn)生的殘留試劑以及由熱處理產(chǎn)生的變性蛋白質(zhì)。因而，在病毒失活完成后可使用陽(yáng)離子交換方法代替第二級(jí)PEG分級(jí)分離，以除去變性的雜質(zhì)和熱處理病毒失活產(chǎn)生的凝聚物。
如果在整個(gè)過(guò)程中沒(méi)有達(dá)到目的，應(yīng)將經(jīng)溶劑/去污劑處理的溶液進(jìn)行處理以除去所有可包括變性蛋白質(zhì)的顆粒物質(zhì)。因此，優(yōu)選在添加溶劑/去污劑之前使用1微米或更細(xì)的過(guò)濾器將溶液過(guò)濾。這還可以減少存在于大的顆粒中的病毒的生存可能性，從而有可能避免暴露于溶劑/去污劑。
至今，優(yōu)選的用于失活包殼病毒的溶劑為三烷基磷酸鹽。本發(fā)明所使用的三烷基磷酸鹽不受特定的限制，但優(yōu)選使用三(正-丁基)磷酸鹽(后文為“TNBP”)，其它可用的三烷基磷酸鹽為三(叔丁基)磷酸鹽、三(正-己基)磷酸鹽、三(2-乙基己基)磷酸鹽等?？墒褂脙煞N或更多種不同的三烷基磷酸鹽的混合物。
三烷基磷酸鹽的使用量為0.01到10(w/v)％，優(yōu)選0.01到3(w/v)％。
三烷基磷酸鹽可在去污劑或表面活性劑存在或不存在的情況下使用。優(yōu)選三烷基磷酸鹽和去污劑聯(lián)用。去污劑可增強(qiáng)免疫球蛋白組合物中病毒與三烷基磷酸鹽的接觸。
去污劑的實(shí)例包括脂肪酸的聚氧乙烯基衍生物，無(wú)水山梨醇的一些酯如聚山梨醇酯80(商品名Tween 80等)和聚山梨醇酯20(商品名Tween 20等)；和非離子油浴漂洗劑如氧乙烯烷基酚(商品名TritonX100等)。實(shí)例包括其它表面活性劑和去污劑如Zwitter離子去污劑等。
當(dāng)使用去污劑時(shí)，不必以嚴(yán)格的量加入；如可以其比率在約0.001％與10％之間使用，優(yōu)選在越0.01％與3％之間。
本發(fā)明中，含免疫球蛋白組合物的三烷基磷酸鹽的處理在大約20℃到35℃，優(yōu)選25℃到30℃之間進(jìn)行超過(guò)1小時(shí)，優(yōu)選約5到8小時(shí)，更優(yōu)選約6到7小時(shí)。
在三烷基磷酸鹽的處理中，免疫球蛋白存在于約3％到8％蛋白質(zhì)的水介質(zhì)溶液中。
三烷基磷酸鹽和任選的去污劑可直接加到來(lái)源于一級(jí)PEG分級(jí)分離的過(guò)濾液，其中，γ-球蛋白不被加入的附加PEG所沉淀，需要稀釋蛋白質(zhì)，否則，將沉淀的γ-球蛋白懸浮于冷水中以便注射，pH值可被調(diào)至約5.0到6.0，然后向其中加入有機(jī)溶劑和任選的去污劑。
對(duì)于熱殺菌步驟，可使用從PEG分級(jí)分離或從溶劑(去污劑)步驟獲得的而未經(jīng)純化的免疫球蛋白蛋白質(zhì)溶液，向其中加入糖、糖醇和/或氨基酸熱穩(wěn)定劑。pH調(diào)至約4.5到6，優(yōu)選約5.0到5.5。熱穩(wěn)定劑優(yōu)選蔗糖、麥芽糖、山梨醇或甘露醇，最優(yōu)選為山梨醇。糖或糖醇可以粉末的形式加入到免疫球蛋白溶液中，或先與小劑量的水混合然后再加入，以使最終濃度為約10到50w/w％，達(dá)飽和。
加入熱穩(wěn)定劑之后，混合物在約50-70℃加熱約10-100小時(shí)，優(yōu)選在約60℃加熱10到20小時(shí)，以使熱敏感病毒病毒性失活。熱處理步驟不僅使病毒失活，而且通過(guò)蛋白質(zhì)變性作用，可優(yōu)先降低一些不必要的且通常與科恩級(jí)分II+III有關(guān)的蛋白質(zhì)如激肽釋放酶原活化因子、血纖維蛋白溶酶、血纖維蛋白溶酶原的數(shù)量。
熱處理后，溶液可被冷卻至約0℃到30℃，優(yōu)選約10℃，pH值被調(diào)至約5.0到6.0之間，優(yōu)選約5.0到5.5之間。
如果陰離子交換處理不在溶劑-去污劑處理之前進(jìn)行，可在熱處理過(guò)的免疫球蛋白上進(jìn)行。優(yōu)選地，病毒失活完成之后對(duì)熱處理過(guò)的產(chǎn)品至少進(jìn)行一次陽(yáng)離子交換處理，并在使用溶劑-去污劑處理之前使用陰離子交換處理作為第一次病毒失活。進(jìn)行離子交換處理時(shí)，免疫球蛋白溶于含水溶劑中，通常pH值為約5.0到5.5，并且有最大吸附IgG的理想離子強(qiáng)度。蛋白質(zhì)濃度的范圍通常為約1-15w/v％，更優(yōu)選為約3到10w/v％。離子交換劑與所使用的同樣的水溶劑平衡，并且可以采用間歇式或連續(xù)式系統(tǒng)。例如，可以這樣進(jìn)行陰離子交換分批處理混合免疫球蛋白溶液與陰離子交換劑，該陰離子交換劑的量為10到100ml每ml預(yù)先處理過(guò)的陰離子交換劑(例如1g的DEAE SephadexA-50樹(shù)脂在0.4％的氯化鈉溶液中膨脹至濕重為20g)，在0℃到5℃攪拌混合物0.5到5小時(shí)，然后過(guò)濾或以6000到8000rpm的速率離心分離30分鐘以回收上清液?？赏ㄟ^(guò)將免疫球蛋白溶液以足以將雜質(zhì)吸附至離子交換劑的流速通過(guò)離子交換柱并回收未吸附的級(jí)分，來(lái)影響連續(xù)處理。
欲使用的陰離子交換劑包括如連接至一種不溶性載體的陰離子交換基團(tuán)。陰離子交換基團(tuán)包括二乙氨乙基(DEAE)，季胺乙基(QAE)等，不溶性載體包括瓊脂糖、纖維素、右旋糖苷、聚丙烯酰胺等。
可使用的陽(yáng)離子交換劑的實(shí)例為羧甲基Sephadex(CM-Sephadex)CM-纖維素、SP-Sephadex、CM-Sepharose和SP-Sepharose。將1ml的預(yù)先處理過(guò)的陽(yáng)離子交換劑(如1g的CM-Sephadex C-50樹(shù)脂在0.4％的氯化納溶液中膨脹至濕重為30-35g)與0.5到5ml的免疫球蛋白溶液混合，并在0到5℃下攪拌1-6小時(shí)。將懸浮液離心分離或過(guò)濾以回收吸附了IgG的樹(shù)脂。同樣，也可采用連續(xù)式操作。
當(dāng)在以上所述的條件下使用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂時(shí)，IgG將會(huì)被吸附，接著洗滌吸附了蛋白質(zhì)的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，IgG可被洗脫掉，例如通過(guò)約1.4N的氯化鈉溶液的洗滌。
經(jīng)過(guò)以上所述步驟之后，IgG已被澄清，雙過(guò)濾(diafiltered)并且被濃縮到所需要的程度。如需要，可加入穩(wěn)定劑如D-山梨醇，并做最終的調(diào)節(jié)以產(chǎn)生一種pH值為5.4，包含約50mg/ml或100mg/ml的IgG和50mg/ml的D-山梨(糖)醇的組合物的溶液。然后將該溶液通過(guò)一種滅菌的細(xì)菌固位過(guò)濾器(sterilized bacterial retentive filters)進(jìn)行滅菌過(guò)濾，裝入小瓶中。
以下例子用于說(shuō)明本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。
如需要，可將其它的免疫球蛋白純化方法與所述的方法聯(lián)合使用。如可使用一種膨潤(rùn)土澄清步驟，其有助于減少激肽釋放酶和前-激肽釋放酶活化因子的水平。對(duì)該方法的說(shuō)明見(jiàn)下面的實(shí)施例1。實(shí)施例1溶劑-去污劑和熱處理的γ-球蛋白將685g的級(jí)分II+IIIw懸浮于約11.9kg的冷水中。向懸浮液中加入三水醋酸鈉使其最終濃度為約0.04M，以選擇性地溶解IgG?；旌霞s15分鐘后，使用pH值為4.0的醋酸緩沖液將懸浮液的pH值調(diào)至5.2。向懸浮液中加入冷乙醇(95％)使其最終濃度為17％，在乙醇的添加過(guò)程中，懸浮液的溫度逐漸降至約-6℃。加入303g的酸洗硅藻土535(可從Celite Corporation購(gòu)得)作為助濾劑至懸浮液中，使其最終濃度約為2.0％?；旌?小時(shí)后，通過(guò)使用壓濾機(jī)使硅藻土和包含不需要的蛋白質(zhì)如血纖維蛋白溶酶、血纖維蛋白溶酶原、IgA和IgM的級(jí)分III糊狀物被除去。濾液通過(guò)0.45μm和0.2μm過(guò)濾器被進(jìn)一步澄清。然后通過(guò)使用1.0M碳酸氫鈉將級(jí)分III的上清液的pH值調(diào)至7.0，溫度降低至-7℃，同時(shí)加入冷乙醇(95％)使其最終濃度為25％。如需要，可將懸浮液pH值調(diào)至7.2，沉淀物、級(jí)分II可在溫度為-7℃時(shí)通過(guò)過(guò)濾除去。
將每kg的級(jí)分II糊狀物懸浮于保持在0℃到2℃下、大約1.5kg的包含0.2％白蛋白(人)和約2.0％的聚乙烯乙二醇的冷水溶液中。使用稀鹽酸將pH值調(diào)節(jié)至3.7±0.2。然后使該懸浮物保持在該pH值，同時(shí)混合15小時(shí)。
保持溫度為0℃到2℃時(shí)，使用稀釋的氫氧化鈉將溶液的pH值調(diào)節(jié)至5.3。向溶液中加入50％的聚乙烯乙二醇(PEG)3350使得PEG的終濃度為4％。所形成的沉淀物在1℃下通過(guò)過(guò)濾和離心分離除去。使用1.0N鹽酸將濾液的pH值調(diào)節(jié)至4.9。加入膨潤(rùn)土使其最終濃度為0.25％。將膨潤(rùn)土懸浮液的pH值重新調(diào)節(jié)至約5.2。然后在1℃下，過(guò)濾或離心分離懸浮液以除去膨潤(rùn)土。使用0.25N氫氧化鈉溶液將濾液的pH值調(diào)節(jié)至8.0。加入50％的PEG3350溶液使得PEG的終濃度為12％，所形成的沉淀(純化的免疫球蛋白)在0℃到2℃下通過(guò)過(guò)濾和離心分離除去。
以上提出了用于進(jìn)行PEG分級(jí)分離的典型的方法，其它的PEG分級(jí)分離方法為本領(lǐng)域的人員所公知。
將100g的PEG純化免疫球蛋白糊狀物懸浮于450ml冷水中做注射之用。通過(guò)添加5％的醋酸溶液將懸浮液的pH值調(diào)節(jié)至5.5。在5℃下混合懸浮液2小時(shí)后，加入33.3g的pH值為5、用0.3％氯化鈉溶液預(yù)平衡的DEAE Sephadex A-50。吸附進(jìn)行兩小時(shí)后，通過(guò)過(guò)濾將DEAE樹(shù)脂除去。
向?yàn)V液中加入三-正-丁基磷酸鹽(TNBP)和聚山梨酸酯80混合物以產(chǎn)生最終濃度為0.3％的TNBP和1％聚山梨酸酯80的溶液。溶液在5℃下保溫過(guò)夜。然后向處理過(guò)的溶液中加入D-山梨醇使其終濃度為33％，混合穩(wěn)定的IgG溶液1小時(shí)，pH值調(diào)至5.5，在60℃下加熱過(guò)夜。
將混合物冷卻至5℃，pH值調(diào)至5.8。使用CM-Sephadex C-50按如下處理混合物以除去溶劑去污劑、PEG和山梨醇用冷水將溶劑/去污劑處理的和熱處理的溶液稀釋4倍。然后將稀釋的溶液分成三等分。加入氯化鈉使得三份溶液中氯化鈉的最終濃度分別為0.2％、0.4％和0.6％，分別作為懸浮液a、b和c。然后使用每克蛋白質(zhì)0.65g干重的CM-Sephadex C-50樹(shù)脂處理每份溶液，該樹(shù)脂已在pH 5.8下預(yù)平衡，并與NaCl濃度相對(duì)應(yīng)。
使用樹(shù)脂吸附蛋白質(zhì)3±2小時(shí)后，將液體過(guò)濾除去。然后分別用0.2％、0.4％和0.6％的氯化鈉溶液清洗吸附了蛋白質(zhì)的樹(shù)脂，以除去殘留的聚山梨酸酯80、TNBP、PEG和山梨醇。然后將清洗過(guò)的吸附了蛋白質(zhì)的CM-Sephadex C-50樹(shù)脂重新懸浮于1.5±0.5N的氯化鈉溶液2±1小時(shí)，以解吸吸附的蛋白質(zhì)，然后通過(guò)過(guò)濾將樹(shù)脂從解吸的蛋白質(zhì)中分離出來(lái)。
正如所討論的，12％的PEG階段和陰離子交換樹(shù)脂處理階段是任選的步驟。另外，可使用第二級(jí)PEG分級(jí)分離步驟來(lái)代替或加上陰離子交換樹(shù)脂處理。而且，熱處理和溶劑(溶劑-去污劑)病毒失活步驟可以任何順序進(jìn)行。
本發(fā)明的變化對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。
權(quán)利要求
1.一種用于制備可靜脈注射的γ球蛋白溶液的方法，包括(a)使不純的γ球蛋白溶液經(jīng)過(guò)聚乙烯乙二醇分級(jí)分離，以獲得純化的γ球蛋白；(b)使用有機(jī)溶劑處理聚乙烯乙二醇純化的γ球蛋白以使包殼病毒失活；(c)在足以使熱敏感病毒失活的時(shí)間和溫度條件下熱處理聚乙烯乙二醇純化的γ球蛋白；然后(d)除去熱處理產(chǎn)生的凝聚物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中不純的γ球蛋白溶液為科恩級(jí)分I+II+III、科恩級(jí)分II+III、科恩級(jí)分II+IIIw或科恩級(jí)分II。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中不純的γ球蛋白溶液在聚乙烯乙二醇分級(jí)分離步驟a前，經(jīng)過(guò)至少一次純化步驟。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中熱處理步驟(c)在大約50℃到70℃下進(jìn)行10到100小時(shí)。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中熱處理步驟(c)在大約60℃下進(jìn)行10小時(shí)。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中通過(guò)熱處理過(guò)的溶液的聚乙烯乙二醇分級(jí)分離進(jìn)行步驟(d)。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(b)中所使用的有機(jī)溶劑為烷基磷酸鹽。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其中步驟(b)中所使用的有機(jī)溶劑為烷基磷酸鹽。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中烷基磷酸鹽為三-正丁基磷酸鹽。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中有機(jī)溶劑包含去污劑。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其中有機(jī)溶劑包含去污劑。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(a)后，用陰離子交換樹(shù)脂和陽(yáng)離子交換樹(shù)脂處理γ球蛋白溶液。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中步驟(b)在步驟(c)之前進(jìn)行，陰離子交換樹(shù)脂處理在步驟(b)之前進(jìn)行，陽(yáng)離子交換樹(shù)脂處理在步驟(c)之后進(jìn)行。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中對(duì)由步驟(b)所得的免疫球蛋白有機(jī)溶劑溶液進(jìn)行熱處理步驟(c)，而不需要任何干涉步驟。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其中對(duì)由步驟(b)所得的免疫球蛋白-有機(jī)溶劑溶液進(jìn)行熱處理步驟(c)，而不需要任何干涉步驟。
16.如權(quán)利要求6所述的方法，其中在第一級(jí)聚乙烯乙二醇分級(jí)分離后使用膨潤(rùn)土澄清步驟。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其中通過(guò)處理用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂熱處理過(guò)的溶液來(lái)進(jìn)行步驟(d)。
18.如權(quán)利要求1所述的方法，其中進(jìn)行聚乙烯乙二醇分級(jí)分離步驟(a)而不產(chǎn)生γ球蛋白沉淀。
19.如權(quán)利要求6所述的方法，其中進(jìn)行聚乙烯乙二醇分級(jí)分離步驟(d)的而不產(chǎn)生γ球蛋白沉淀。
20.如權(quán)利要求1所述的方法，其中聚乙烯乙二醇分級(jí)分離步驟(a)至少分兩個(gè)階段進(jìn)行，其中在第一級(jí)聚乙烯乙二醇分級(jí)分離中雜質(zhì)作為沉淀物被除去，在第二級(jí)聚乙烯乙二醇分級(jí)分離中γ球蛋白作為沉淀劑被回收。
21.如權(quán)利要求6所述的方法，其中聚乙烯乙二醇分級(jí)分離步驟(d)至少分兩個(gè)階段進(jìn)行，其中在第一級(jí)聚乙烯乙二醇分級(jí)分離中雜質(zhì)作為沉淀物被除去，在第二級(jí)聚乙烯乙二醇分級(jí)分離中γ球蛋白作為沉淀劑被回收。
22.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(b)在步驟(c)之前進(jìn)行。
23.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(c)在步驟(b)之前進(jìn)行。
24.一種由如權(quán)利要求14所述的方法生產(chǎn)的可靜脈注射的γ球蛋白溶液。
25.一種由如權(quán)利要求15所述的方法生產(chǎn)的可靜脈注射的γ球蛋白溶液。
全文摘要
一種用于生產(chǎn)可靜脈注射的γ球蛋白溶液的方法,通過(guò)以下步驟使該γ球蛋白溶液基本上不含污染病毒:分級(jí)分離不純的γ球蛋白溶液,然后以任何順序,用溶劑－去污劑處理純化的γ球蛋白使病毒失活,以及熱處理使病毒失活。然后,將由熱處理產(chǎn)生的變性雜質(zhì)、殘留溶劑和凝聚物從γ球蛋白中除去。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1351500SQ00807723
公開(kāi)日2002年5月29日 申請(qǐng)日期2000年5月17日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月20日
發(fā)明者R·R·馬米第, A·巴格達(dá)薩里安, G·卡尼亞韋拉爾, K·塔克奇 申請(qǐng)人:阿爾法治療公司