專利名稱：動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病的診斷和治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人HSP60(熱激蛋白60)在人的治療或診斷方法中的用途，更特別地，本發(fā)明涉及診斷試驗(yàn)方法、診斷試劑的生產(chǎn)以及用于因動(dòng)脈粥樣硬化而患有血管疾病的患者的診斷試驗(yàn)試劑盒，這些患者傾向于熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活，例如患有心肌疾病如冠心病。
補(bǔ)體系統(tǒng)(見(jiàn)McAleer，M.A.和Sim，R.B.在補(bǔ)體的激活劑和抑制劑，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，R.B.Sim編，1993年，第1至15頁(yè)；Reid，K.B.M.和Law，A.，1988年，補(bǔ)體，IRL出版社，牛津)涉及抵抗感染的宿主防御—在系統(tǒng)激活后，一個(gè)催化系列的反應(yīng)和相互作用發(fā)生，導(dǎo)致激活細(xì)胞、組織或顆粒的靶向而破壞。由于該系統(tǒng)的破壞性質(zhì)，如果不正確地被引發(fā)，它具有引起宿主系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p傷的潛在可能(Davis，A.E.，1988年，Ann.Rev.Immunol.，第6卷第595至628頁(yè)；Frank，M.M.，1993年，在在健康和疾病中的補(bǔ)體，第二版，Whaley，K.等編，Kluwer Acdemic Publishers，Dordrecht，第229頁(yè))并且如果它的活性減小，那么它具有使宿主開(kāi)放于感染性病原體的進(jìn)攻的潛在可能。
已經(jīng)證明補(bǔ)體激活在冠心病和其它動(dòng)脈粥樣硬化的血管并發(fā)癥的發(fā)展中具有重要作用(Prohaszka，Z.等，1999年9月，Int.Immunol，第11卷(9)，第1363-1370頁(yè)；Torzewski等，1997年，動(dòng)脈粥樣硬化，第132卷第131頁(yè))，包括例如外周動(dòng)脈粥樣硬化和中風(fēng)。最近的出版物，如Xu，Q.等(1993年，The Lancet，第341卷第255頁(yè))，Hoppichler，F(xiàn).等(1996年，動(dòng)脈粥樣硬化，第126卷，第333頁(yè))，AT398495和Birnie，D.H.等(1998年，Eur.Heart J.，第19卷第387頁(yè))都已經(jīng)涉及了冠心病和特異性地抗動(dòng)脈粥樣硬化中的分枝桿菌65Kda熱激蛋白(HSP)的抗體之間的聯(lián)系。熱激蛋白(也被稱為唇基(chaperons))，例如HSP60蛋白族，是高度保守的，且對(duì)抗它們的抗體被發(fā)現(xiàn)是高度交叉反應(yīng)性的(Ellas，D.等，1990年，PANS USA，第87卷第1576頁(yè)；Daniele，M.G.等，1992年，第5卷，第443頁(yè)；de Graeff-Meeder，E.R.等，1994年，Pediatr.Res.，第152卷第3656頁(yè)；Metzler，B.等，1997年，Atheroscler.Thromb.Vasc.Biol.，第17卷第536頁(yè)；Latif，N.等，1997年，Transplant.Proc.，第29卷第1039頁(yè)-1040頁(yè)；Schett，G.等，1995年，J.Clin.Invest.，第96卷(6)第2569-2577頁(yè)；Schett，G.等，1997年，Atherosclerosis，第128卷(1)第27-38頁(yè))。已發(fā)現(xiàn)這些對(duì)抗HSP的交叉反應(yīng)性抗體和動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)，并且還發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體激活和動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)，雖然這些關(guān)系的確切的本質(zhì)還未得知，并且在動(dòng)脈粥樣硬化、補(bǔ)體激活和交叉反應(yīng)性HSP抗體之間沒(méi)有已知的因果關(guān)系。HSP的其它用途在例如WO 97/06821中有詳細(xì)描述。
來(lái)自病原體的保守的熱激蛋白引發(fā)心臟病的普遍觀點(diǎn)被例如Bachmaler，K.等，1999年，Science，第283卷第1335-1339頁(yè)證實(shí)。
本發(fā)明成功地確定了心肌疾病的原因(確切為地說(shuō)與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的疾病如冠心病、心肌梗塞和中風(fēng)的原因)，這種原因在已有技術(shù)中尚未提出。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)(見(jiàn)下面的“試驗(yàn)”)i) 人HSP60(hHSP60)和抗hHSP60抗體的免疫復(fù)合物的形成通過(guò)經(jīng)典途徑(CP)以劑量依賴性的方式引起補(bǔ)體系統(tǒng)的激活，但hHSP本身并不引起補(bǔ)體激活；以及ii) 引起補(bǔ)體激活的復(fù)合物中被抗hHSP抗體結(jié)合的hHSP表位對(duì)hHSP是單一的。
在患者是否患有冠心病以及冠心病的嚴(yán)重程度和在患者血清中特異性地對(duì)抗hHSP的抗體水平(即不與其它HSP如分枝桿菌HSP65結(jié)合的抗體)之間存在強(qiáng)烈的正相關(guān)。因此這可以被用作確定來(lái)自相同傾向于熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的患者和樣品的診斷試驗(yàn)的基礎(chǔ)。
因此，根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了在人體的治療或診斷方法中使用的hHSP60或其免疫原性片段。
自然地，可以使用重組hHSP，并且這樣的重組分子可以具有小修飾，例如作為它們的氨基酸序列的改變的結(jié)果，或作為在表達(dá)系統(tǒng)中起作用(或不起作用)的翻譯后修飾的結(jié)果。這樣的分子可以具有至少50％，或60％、70％、80％、90％或95％的與hHSP60的同源性，其通過(guò)使用BLAST2程序(www.ncbi.nlm.nih.gov)所采用的算法測(cè)定。如上述討論的，hHSP60和其它HSP60分子的同源性很高，因此為落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，修飾分子必須顯示與hHSP60相同的功能性質(zhì)，這些性質(zhì)對(duì)于本發(fā)明是基本的，即它們必須顯示hHSP特異性表位。例如，這可以通過(guò)進(jìn)行hHSP60和修飾分子的對(duì)比試驗(yàn)來(lái)測(cè)定。取自具有傾向于能夠和hHSP結(jié)合并產(chǎn)生補(bǔ)體激活的抗體的患者的樣品用修飾hHSP60代替hHSP60應(yīng)該同樣能夠獲得相同的結(jié)果。這樣的修飾分子在本文中被稱為“基本組成hHSP60”，并且hHSP60的參比也是這種基本組成hHSP60分子的參比。
補(bǔ)體系統(tǒng)不適當(dāng)?shù)募せ羁赡軐?dǎo)致很寬范圍的疾病，包括動(dòng)脈粥樣硬化，特別是冠心病的發(fā)展或并發(fā)癥。因此本發(fā)明可以用來(lái)診斷那些具有冠心病和其它動(dòng)脈粥樣硬化血管并發(fā)癥傾向的患者。特別令人驚奇的是，試驗(yàn)(下面的)已表明產(chǎn)生高水平的補(bǔ)體激活抗人HSP60抗體的能力是在幼年時(shí)可診斷的遺傳性狀，它和成年后冠心病發(fā)病的高易感性(即趨勢(shì))有關(guān)。這意味著在本發(fā)明的試驗(yàn)中的高水平結(jié)果對(duì)那些在其它方面很健康的幼年患者患這種疾病的易感性是指示性的。
本發(fā)明同時(shí)提供熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的趨勢(shì)的診斷試驗(yàn)方法，其包括以下步驟i) 從患者取樣品；ii) 將樣品和hHSP60接觸；iii)檢測(cè)任何補(bǔ)體激活；以及iv) 將檢測(cè)步驟(iii)的結(jié)果和熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的趨勢(shì)相關(guān)。
本發(fā)明同時(shí)提供熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的趨勢(shì)的診斷試驗(yàn)方法，其包括以下步驟i) 從患者取樣品；ii) 檢測(cè)步驟(i)的樣品中對(duì)hHSP60特異性的任何抗體；以及iii)將檢測(cè)步驟(ii)的結(jié)果和熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的趨勢(shì)相關(guān)。
上述檢測(cè)步驟(ii)可以包括以下步驟i) 將樣品和HSP60蛋白質(zhì)族的非hHSP60成員(例如HSP65)接觸；ii) 將得自步驟(i)的樣品和hHSP60接觸；以及iii)檢測(cè)所有的抗體-hHSP60結(jié)合反應(yīng)。
或者，檢測(cè)步驟(ii)可以包括以下步驟i) 將樣品和顯示對(duì)hHSP60單一而不顯示任何共享HSP60表位的抗原接觸；以及ii) 檢測(cè)任何抗體-抗原結(jié)合反應(yīng)。
抗體-hHSP60結(jié)合反應(yīng)可以通過(guò)檢測(cè)任何的補(bǔ)體激活而檢測(cè)，特別是通過(guò)C4b(補(bǔ)體因子4b)的結(jié)合。
診斷試驗(yàn)方法可以是人體的診斷方法。
診斷試驗(yàn)如ELISA(酶連免疫吸附測(cè)定)和免疫層析試驗(yàn)如快速試驗(yàn)(Rapid-Test(EP291194))可以在本發(fā)明的診斷試驗(yàn)方法中使用，其它適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)方法和試劑盒對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員容易明確并正確使用。
除確定患者何時(shí)傾向于hHSP60介導(dǎo)的補(bǔ)體激活之外，診斷試驗(yàn)還可以被用于確定傾向于熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的患者的治療進(jìn)行得如何-hHSP60誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活降低的水平或抗hHSP60抗體可以指示治療是有效的。類似地，其它結(jié)果如果適當(dāng)，可以指示治療正在防止癥狀的發(fā)展(惡化)或可以指示該癥狀正在惡化。
本發(fā)明同時(shí)提供了hHSP60在用于傾向于熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的患者的診斷試劑的生產(chǎn)中的用途。本發(fā)明同時(shí)提供了hHSp60和HSP60蛋白質(zhì)族的非hHSP60成員在用于傾向于熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的患者的診斷試劑的生產(chǎn)中的用途。同時(shí)提供的還有顯示對(duì)hHSP60單一的表位，而不顯示任何共享HSP60表位的抗原在用于傾向于熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的患者的診斷試劑的生產(chǎn)中的用途。如下描述的，這樣的抗原可以使用如表位定位和mimotope設(shè)計(jì)的技術(shù)或者使用各種其它可獲得的技術(shù)而容易地產(chǎn)生。類似地，競(jìng)爭(zhēng)性抑制抗hHSP60抗體和hHSP60結(jié)合的結(jié)合試劑可能是有用的。因?yàn)榫哂羞@種作為結(jié)合試劑的能力而被篩選出的分子包括多肽、β轉(zhuǎn)角模擬物(beta-turn mimetics)、多糖、磷脂、激素、前列腺素、類固醇、芳族化合物、雜環(huán)化合物、苯二氮類、寡聚氮取代的甘氨酸和寡氨基甲酸酯。龐大的化合物組合庫(kù)可以通過(guò)編碼合成庫(kù)建立，這種方法在以下文獻(xiàn)中描述Affymax，WO 95/12608，Affymax，WO 93/06121，哥倫比亞大學(xué)，WO 94/08051，Pharmacopeia，WO95/35503和Scripps，WO 95/30642(這些文獻(xiàn)均引入本文做參考)。肽文庫(kù)同樣可以通過(guò)噬菌體展示產(chǎn)生。參見(jiàn)，例如Devlin，WO91/18980?；谂c抗hHSP60抗體競(jìng)爭(zhēng)地與Hhsp60結(jié)合而篩選化合物庫(kù)?？筯HSP60抗體結(jié)合的抑制通過(guò)補(bǔ)體激活抑制與得自對(duì)照的結(jié)果比較而確定。這種化合物的識(shí)別在藥物發(fā)現(xiàn)方法中特別有用，識(shí)別與hHSP60或抗hHSP60抗體特異性地結(jié)合并且因此可以抑制抗hHSP60抗體的補(bǔ)體誘導(dǎo)活性的化合物。
本發(fā)明同時(shí)提供用于傾向于熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的患者的診斷試驗(yàn)試劑盒，其特征在于它包括hHSP60。本發(fā)明同時(shí)提供用于傾向于熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的患者的診斷試驗(yàn)試劑盒，其特征在于它包括hHSP60和HSP60蛋白質(zhì)族的非hHSP60成員。本發(fā)明同時(shí)提供用于傾向于熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的患者的診斷試驗(yàn)試劑盒，其特征在于它包括顯示對(duì)hHSP60單一的表位，而不顯示任何共享HSP60表位的抗原。
除在診斷上有用外，本發(fā)明還提供了治療機(jī)會(huì)。與抗hHSP60抗體結(jié)合以在患者中引起熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活所需的hHSP60表位(或多個(gè)表位)可以容易地用來(lái)自傾向于(或患有)熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的患者的血清確定。通過(guò)使用表位定位(Geysen，H.M.等，1987年，Journalof Immunological Methods，第102卷第259-274頁(yè)；Geysen，H.M.等，1988年，J.Mol.Recognit.，第1卷(1)第32-41頁(yè)；Jung，G.和Beck-Sickinger，A.G.，1992年，Angew.Chem.Int.Ed.Eng.，第31卷；第367-486頁(yè))，可以產(chǎn)生一系列為hHSP60序列的重疊肽。然后每一個(gè)重疊肽可以與患者血清樣品混合。那些引起補(bǔ)體激活的(即C4b的結(jié)合)顯示抗體結(jié)合和補(bǔ)體激活所需的表位。核心表位序列可以從它們被決定并且產(chǎn)生顯示(即攜帶)表位而不引起補(bǔ)體激活的肽或其它分子。如果表位定位失敗，那么其它技術(shù)如mimotope設(shè)計(jì)(Geysen，H.M.等，1987年，1988年，如上；Jung，G.和Beck-Sickger，A.G.，1992年，如上)可以被用于合成顯示表位的分子，使用例如抗體在它們的療效測(cè)定中作為參比物質(zhì)。特別地，這允許具有三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)特征的表位的決定和復(fù)制，這種特征有可能無(wú)法通過(guò)表位定位識(shí)別。因此，本發(fā)明同樣延伸至hHSP60的片段的用途。產(chǎn)生單克隆抗體的克隆(Harlow，E.和Lane，D.，“使用抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，ColdSpring Harbor Laboratory Press，紐約，1998年)可以通過(guò)它們與補(bǔ)體激活所需的hHSP60表位(上述)結(jié)合的能力，或通過(guò)它們?cè)趆HSP60存在下引起補(bǔ)體激活的能力而容易被識(shí)別，并且本發(fā)明延伸至到這樣的單克隆抗體及其抗原結(jié)合片段的用途。類似地，hHSP60可以被分成片段，并且攜帶和顯示hHSP60特異性表位的特異性片段被識(shí)別。其它技術(shù)(如上面討論的)可以獲得用來(lái)識(shí)別抗體靶和結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，并且可以容易地得以應(yīng)用。
因此根據(jù)本發(fā)明同時(shí)提供hHSP60在治療熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活，特別是治療由于動(dòng)脈粥樣硬化而發(fā)生的血管疾病的患者的藥物的生產(chǎn)中的用途。藥物可以用于健康的保持或恢復(fù)，即它可以治愈、緩解、消除或減輕熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的癥狀，或者它可以預(yù)防或減輕熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的可能性。該藥物可以例如是疫苗。用途可以包括表位或肽的用途，所述表位和肽攜帶被hHSP60顯示而不被HSP60分子族的其它成員顯示的表位。同時(shí)提供用于治療熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的患者的藥物的生產(chǎn)方法，其特征在于hHSP60的使用。
因?yàn)閔HSP60已經(jīng)被確定是熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的原因，hHSP60(或如上述討論的其片段)可被用于藥物發(fā)現(xiàn)方法，識(shí)別那些能夠防止其引發(fā)補(bǔ)體激活的試劑。因此本發(fā)明同時(shí)提供識(shí)別抑制hHSP60誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的化合物、物質(zhì)或試劑的方法，其特征在于hHSP60(或其片段)的使用。同時(shí)提供hHSP60(或其片段)在抑制hHSP60誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的化合物、物質(zhì)或試劑的識(shí)別方法中的用途。同時(shí)提供本發(fā)明的試驗(yàn)在藥物發(fā)現(xiàn)方法中的用途，例如篩選組合化學(xué)庫(kù)確實(shí)檢測(cè)那些可以抑制hHSP60誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活或動(dòng)脈粥樣硬化或冠心病發(fā)作的化學(xué)藥品或藥物。
本發(fā)明將參照附圖從隨后的說(shuō)明中變得更加明確，它們僅通過(guò)實(shí)施例的方式顯示傾向于熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的患者的檢測(cè)的形式。
附圖中

圖1顯示hHSP60的劑量依賴性的補(bǔ)體激活。人HSP60和正常人血清(NHS；實(shí)心方塊)或和熱滅活人血清(HIHS；實(shí)心圓)一起保溫。與hHSP60結(jié)合的C4b的量用抗C4b抗體測(cè)定。未涂覆的對(duì)照平板和NHS(空心圓)或和HIHS(空心三角)一起保溫。該圖顯示四個(gè)平行測(cè)定的平均OD值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。來(lái)自于全部三個(gè)重復(fù)試驗(yàn)的一個(gè)代表試驗(yàn)的結(jié)果被列出。發(fā)現(xiàn)指示(**)的情況與未涂覆的對(duì)照平板相比，C4b的結(jié)合有顯著性的增加(斯氏t檢驗(yàn)，p＜0.01)；圖2顯示無(wú)丙種球蛋白血清(AGS)中hHSP60的經(jīng)典途徑激活的缺乏。人HSP60(0.1μg/ml)和NHS或兩種不同的AGS一起保溫。與平板結(jié)合的C4b的量用抗C4b抗體測(cè)定。未涂覆的孔被用作對(duì)照。AGS+IgG代表和抗體(5％熱滅活血清)重組的AGS。來(lái)自于全部?jī)蓚€(gè)重復(fù)試驗(yàn)的一個(gè)代表試驗(yàn)的結(jié)果被列出。發(fā)現(xiàn)指示(***，p＜0.0001；*，p＜0.05)的情況與未涂覆的對(duì)照平板相比，C4b的結(jié)合有顯著性的增加(斯氏t檢驗(yàn))；圖3顯示了(圖A)抗hHSP60抗體水平和與hHSP60結(jié)合的C4b的量之間的相關(guān)。在抗hHSP60抗體水平和與hHSP60結(jié)合的C4b之間觀察到高顯著性(r＝0.459，p＜0.0001)正相關(guān)。圖B顯示在抗牛分枝桿菌HSP65抗體水平和與hHSP60結(jié)合的C4b的量之間相關(guān)性的缺乏(r＝0.1068，p＝0.554)。通過(guò)使用在各平板上測(cè)試的8個(gè)單獨(dú)血清的結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)現(xiàn)了在不同平板獲得的結(jié)果的歸一化。
圖4顯示通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性ELISA獲得的抗hHSP60和抗牛分枝桿菌HSP65抗體之間的差異。用hHSP60(左圖)或用牛分枝桿菌HSP65(右圖)涂覆ELISA平板，并和患者血清的系列稀釋保溫。IgG型的抗體和平板的結(jié)合被進(jìn)入保溫混合物中(緩沖液被加入到對(duì)照樣品中，實(shí)心方塊)的5μg/mlhHSP60(空心圓)或HSP65(虛線)阻斷。來(lái)自于全部三個(gè)重復(fù)試驗(yàn)的一個(gè)代表試驗(yàn)的結(jié)果被列出。數(shù)值代表三個(gè)平行試驗(yàn)的平均值和SEM OD值；圖5顯示對(duì)因?yàn)榧易迨吩蚨ｋU(xiǎn)的兒童冠心病易感性預(yù)測(cè)的研究的結(jié)果。Y軸顯示了補(bǔ)體激活指數(shù)。X軸顯示了兩套中值數(shù)據(jù)，包括對(duì)照兒童的數(shù)據(jù)(中值0.58，四分位間范圍(interquartile range)0.33-1.07)(左邊的數(shù)據(jù))以及危險(xiǎn)兒童的數(shù)據(jù)(中值＝1.27，四分位間范圍0.53-2.33)(右邊的數(shù)據(jù))。用Mann-Whitney檢驗(yàn)的結(jié)果p＝0.0002。
試驗(yàn)試驗(yàn)如下面詳細(xì)描述進(jìn)行且結(jié)果顯示i) hHSP60能夠通過(guò)抗HSP60抗體誘導(dǎo)補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的激活；ii) 在hHSP60誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活和抗HSP60抗體之間存在相關(guān)；以及iii)在抗HSP抗體系列中，不和其它HSP60蛋白交叉反應(yīng)的是hHSP60特異性抗體，其通過(guò)與hHSP60相互作用引起補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的激活。
該結(jié)果表明患者血清中的抗hHSP60抗體(即不和其它HSP60蛋白交叉反應(yīng)的)的水平和因?yàn)閯?dòng)脈粥樣硬化引起的冠心病的正相關(guān)。
另外的獨(dú)立進(jìn)行的研究表明本發(fā)明的試驗(yàn)給出在補(bǔ)體激活抗hHSP60抗體和冠心病事件中的強(qiáng)烈相關(guān)，第二和第三三分位數(shù)(tertile)的讓步比(odds ratio)為5.24和6.37。
同時(shí)用來(lái)自其父母或祖父母在45歲前患有心肌梗塞的健康兒童的樣品進(jìn)行研究。結(jié)果表明產(chǎn)生高水平補(bǔ)體激活抗hHSP60抗體的能力是與成年時(shí)冠心病發(fā)病的高易感性有關(guān)的遺傳性狀，因此是特別有用的幼年診斷。定義術(shù)語(yǔ)“抗體”在本文中被用于指免疫球蛋白分子和免疫蛋球白分子的免疫活性部分，即含有抗體結(jié)合部位或抗原互補(bǔ)位的分子。這樣的分子也被稱為免疫球蛋白分子的“抗原結(jié)合片段”。
抗體分子的實(shí)例是完整免疫球蛋白分子、基本上完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的那些含有抗原互補(bǔ)位的部分，包括本領(lǐng)域已知為Fab、Fab′、F(ab′)2和F(v)的那些部分。
“治療”是被設(shè)計(jì)用來(lái)治愈、緩解、消除或減輕人或動(dòng)物體的癥狀，或者預(yù)防或降低人或動(dòng)物體感染任何疾病或功能障礙的可能性的治療。實(shí)施本發(fā)明的形式此外，固相重組hHSP60能夠激活合并的正常人血清以及冠心病患者血清中的補(bǔ)體系統(tǒng)。由于第一補(bǔ)體成分被Mg2+EGTA阻斷的C4激活和結(jié)合抑制，以及具有純合C2缺乏患者的血清中沒(méi)有出現(xiàn)C3與hHSP60的結(jié)合，因此可以推斷hHSP60通過(guò)CP激活人血清中的補(bǔ)體。
CP可以被不同的物質(zhì)直接激活或用特異性抗體的貢獻(xiàn)，即通過(guò)免疫復(fù)合物的形成被激活。在hHSP60的情況中，由于在無(wú)丙種球蛋白的血清樣品沒(méi)有觀察到補(bǔ)體激活，CP的引發(fā)看起來(lái)是通過(guò)免疫復(fù)合物的形成而發(fā)生的。
本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)表明抗hHSP60的特異性抗體引發(fā)，并且劑量依賴性地促進(jìn)通過(guò)hHSP60進(jìn)行的補(bǔ)體激活。
此外，抗IgG抗體(類風(fēng)濕因子)同樣可能影響這種激活。并且，分枝桿菌HSP65同樣被發(fā)現(xiàn)激活CP，但這種激活的程度與抗HSP60或抗HSP65抗體的水平不相關(guān)。由于抗HSP65和抗幽門螺桿菌抗體彼此相關(guān)(Birnie，D.H.等，1998年，如前所述)，進(jìn)行了試驗(yàn)以確定是否抗H.pylori抗體的量和HSP65誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活程度相關(guān)。發(fā)現(xiàn)與HSP65結(jié)合的C4b的量和在CHD患者血清中抗H.pylori抗體水平間有強(qiáng)烈的正相關(guān)。另一種對(duì)HSP65誘導(dǎo)的CP激活和抗HSP65抗體水平之間缺乏相關(guān)性的可能的解釋有可能是抗HSP65抗體的不同的(補(bǔ)體非激活)亞型。
這些發(fā)現(xiàn)表明當(dāng)暴露于hHSP60與特異性抗體的復(fù)合體時(shí)，補(bǔ)體系統(tǒng)可能被有效激活。不同的病理癥狀和緊張狀況都可能明顯地增加內(nèi)皮細(xì)胞中hHSP60的表達(dá)(Wick，G.等，1995年，Immunol.Today，第16卷第27頁(yè)；Xu，Q.和Wick，G.，1996年，Mol.Med.Today，第2卷(9)第372頁(yè))。例如，非毒性的局部缺血再灌注被發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生能夠激活人血清中補(bǔ)體系統(tǒng)的人體臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Collard，C.D.等，1997年，Circulation，第96卷第326頁(yè))。這一過(guò)程的機(jī)理還沒(méi)有完全被了解。然而，本結(jié)果表明在內(nèi)皮細(xì)胞表面hHSP60的過(guò)度表達(dá)可能是提高培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞補(bǔ)體激活能力的因素之一，特別是在抗HSP65抗體的高滴定度存在時(shí)。由于補(bǔ)體激活在動(dòng)脈粥樣硬化形成的早期和晚期都具有重要的作用，本發(fā)現(xiàn)具有重要的病理學(xué)意義。
假定的抗HSP65抗體在冠心病的發(fā)展中的作用被最近的幾個(gè)發(fā)現(xiàn)所支持。Xu等(1993年，如前所述)發(fā)現(xiàn)高水平的抗分枝桿菌HSP65抗體與頸動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)。更近地，Hopplicher等(1996年，如前所述)測(cè)得114個(gè)患有冠心病的患者具有與76個(gè)年齡和性別相當(dāng)?shù)慕】祵?duì)照相比明顯升高的抗HSP65滴定度。類似地，Birnie等(1998年，如前所述)驗(yàn)證了在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的程度和抗HSP65抗體的滴定度之間的正相關(guān)。
抗hHSP60和抗HSP65抗體在它們的抗原識(shí)別和補(bǔ)體激活能力之間的差異的驗(yàn)證非常重要，并且在以前沒(méi)有被提出。與健康的受檢者相比，60kDa族的熱激蛋白的抗體在患有幾種疾病的患者體內(nèi)升高。如果抗卡普拉黃素族不同成員的抗體被平行測(cè)量，通常(但不總是(Handley，H.H.等，1996年，Clin.Exp.Immunol.，第103卷第429頁(yè)))在它們的量之間發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈的相關(guān)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在HIV患者的血清中抗HSP60和抗HSP65抗體水平之間存在顯著性的相關(guān)。
全部256個(gè)檸檬酸鹽血漿樣品如下面詳細(xì)介紹地進(jìn)行分析。對(duì)每一個(gè)取自某病例的樣品，即患有冠心病的患者，從沒(méi)有心臟問(wèn)題跡象的患者中選擇兩個(gè)樣品。
·56個(gè)樣品與110個(gè)對(duì)照取自事件發(fā)生前的病例。
·33個(gè)樣品與66個(gè)對(duì)照取自事件發(fā)生后的病例。
所有的樣品均取自中年男性，并且病例和兩個(gè)對(duì)照樣品是年齡匹配的。取樣后，樣品立即進(jìn)行離心并在-45℃冷凍，然后在用干冰運(yùn)輸?shù)組RC單元。血漿然后在-80℃存貯并且僅在用于此評(píng)價(jià)時(shí)解凍。本試驗(yàn)的實(shí)際測(cè)試為盲試，直到測(cè)試全部完成才開(kāi)始分析。1.試驗(yàn)原理將純化的人重組HSP60蛋白涂覆在微滴孔表面。然后施加樣品。抗hHSP60抗體和孔中的抗原復(fù)合。未結(jié)合的物質(zhì)被洗去，加入過(guò)氧化物酶綴合的抗C4b。如果抗體已經(jīng)結(jié)合并激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)，C4b綴合物將與共價(jià)結(jié)合在抗原上的C4b片段結(jié)合。未結(jié)合的物質(zhì)再次被洗去。加入底物3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)后，僅在酶存在的那些孔中有顏色出現(xiàn)，表明人C4b的存在。然后通過(guò)加入硫酸終止酶促反應(yīng)并在450nm測(cè)量吸光度。2.材料
HSP60(www.stressneg.com)是從人早幼粒細(xì)胞白血病(HL-60)的cDNA文庫(kù)克隆的重組hHSP60。平板涂覆將50μl在0.05M，pH為9.6的碳酸鹽緩沖液中的1μg/mlhHSP60加入到每個(gè)孔中，并在4℃保溫過(guò)夜。然后在將平板阻斷之前用200μl的1％明膠、5％蔗糖、0.15MnaCl、0.05M的Tris以及0.1％吐溫20洗滌，并在液體除去前在RT(室溫)保溫1小時(shí)，平板在37℃干燥過(guò)夜。陰性對(duì)照0.05Mtris、0.15MnaCl、5％明膠，pH7.5低陽(yáng)性對(duì)照低陽(yáng)性對(duì)照包括在0.05M Tris、0.15M NaCl、5％明膠，pH7.5中的約1/500的稀釋兔抗hHSP60。綴合物在穩(wěn)定酶綴合物稀釋劑中的約1/500稀釋的C4b蛋白的異雙功能HRP綴合物。低陽(yáng)性對(duì)照還含有約1/60000稀釋的山羊抗兔HSP綴合物。洗滌緩沖液0.05M Tris、0.15M NaCl、0.1％吐溫20，pH7.5。終止溶液0.2％硫酸。測(cè)定試劑盒
試劑制備洗滌緩沖液使用1份洗滌緩沖液濃縮物和19份蒸餾水稀釋濃洗滌緩沖液。為每8個(gè)孔條(well strip)，通過(guò)加入4ml濃緩沖液到76ml蒸餾水中制備80ml稀洗滌緩沖液。3.測(cè)定步驟1.在開(kāi)始測(cè)定前使所有的試劑盒成分和測(cè)試樣品達(dá)到室溫(20℃到25℃)。
2.試劑盒對(duì)照應(yīng)與每批樣品一起展開(kāi)以檢驗(yàn)試驗(yàn)性能。試劑盒對(duì)照應(yīng)該平行兩份展開(kāi)。為包括試劑盒對(duì)照在內(nèi)的要測(cè)試的樣品數(shù)目選擇足夠的微孔條。將條放置在框上，并除去保護(hù)塑料密封膜。在提供的EIA數(shù)據(jù)記錄紙上記錄試劑盒對(duì)照和測(cè)試樣品的位置。未使用的條應(yīng)該被存貯在帶有干燥劑的可重新密封的箔袋中，其在置于2℃到8℃存貯前被替換。
3.不稀釋對(duì)照或測(cè)試樣品，將50μl樣品或?qū)φ昭?試劑2、3)分散到適當(dāng)?shù)目字小?duì)照應(yīng)該最后加入以確保結(jié)果的精確解釋。輕輕搖動(dòng)5秒鐘。用提供的平板蓋蓋上平板，然后在RT 20℃到30℃將其放在吸水紙上20分鐘。
4.在保溫周期結(jié)束時(shí)，移去平板，留下吸水紙，然后如下面描述洗滌平板。
5.如在試劑制備部分描述的那樣稀釋洗滌緩沖液(試劑5)。用稀洗滌緩沖液手動(dòng)或用自動(dòng)平板洗滌器洗滌平板三次。對(duì)于機(jī)器洗滌，確保每個(gè)孔分散300μl且將適當(dāng)?shù)南緞┘尤氲綇U液收集瓶中。洗滌完畢，通過(guò)在吸水紙上輕敲倒置的平板除去過(guò)量液體。
對(duì)于手動(dòng)洗滌，通過(guò)仔細(xì)地將內(nèi)容物清空到含有適當(dāng)?shù)南緞┑娜萜髦邢礈炜?，然后將孔置于廢液容器中。再重復(fù)該過(guò)程兩次。洗滌后，通過(guò)在吸水紙上輕敲倒置的平板除去過(guò)量液體。必須記住對(duì)試驗(yàn)用血清的潛在生物危害采取適當(dāng)?shù)念A(yù)防措施。這些預(yù)防措施必須貼在實(shí)驗(yàn)室的公共區(qū)域。洗滌步驟很關(guān)鍵，因?yàn)椴怀浞值南礈鞎?huì)導(dǎo)致差的精確度和錯(cuò)誤升高的吸光度。
6.在每個(gè)孔中分散100μl綴合物(試劑4)。在將蓋放到平板上并放回保溫器之前，輕輕地?fù)u動(dòng)平板5秒鐘，確保平板被放置在吸水紙的頂部。在RT 20℃到30℃保溫60分鐘。
7.在保溫周期結(jié)束時(shí)，重復(fù)步驟4以及步驟5中描述的洗滌步驟。
8.在每個(gè)孔中分散100μl穩(wěn)定化的TMB底物(試劑7)。在將蓋放回到平板并在室溫(20℃到30℃)置于黑暗中15分鐘之前，輕輕地晃動(dòng)平板5秒鐘。
9.通過(guò)加入100μl終止液(試劑8)到每個(gè)孔中終止反應(yīng)。這將導(dǎo)致在含有酶的孔中顏色從藍(lán)到黃的變化，該現(xiàn)象表明補(bǔ)體激活的存在在。在空氣將平板讀數(shù)器清除。在終止反應(yīng)后立即測(cè)定每個(gè)孔在450nm的吸光度。4.結(jié)果的計(jì)算和解釋對(duì)每一個(gè)試驗(yàn)和對(duì)照，測(cè)定孔中獲得的OD。試驗(yàn)有效性對(duì)有效的試驗(yàn)結(jié)果，低陽(yáng)性對(duì)照的平均OD值應(yīng)該大于0.3。
顯示陽(yáng)性結(jié)果的OD水平，即補(bǔ)體激活抗hHSP60抗體的顯著水平，可以預(yù)期在樣品群之間變化，例如在成年和幼年群體之間。例如，在一個(gè)群體中被認(rèn)為是陽(yáng)性的結(jié)果可能在另一群體中并不重要。因此，對(duì)被研究的群體建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線，該曲線將OD與實(shí)際危險(xiǎn)相關(guān)并定義了結(jié)果被認(rèn)為是陽(yáng)性的截?cái)嘀怠?br> 為了在各個(gè)試驗(yàn)間進(jìn)行比較，必須計(jì)算補(bǔ)體激活指數(shù)(CAI)CAI＝樣品的OD/低陽(yáng)性對(duì)照的平均OD低陽(yáng)性對(duì)照的平均OD的使用允許不同系列試驗(yàn)，例如使用不同的設(shè)備之間的結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化。5.結(jié)果在采集原始數(shù)據(jù)后進(jìn)行下列統(tǒng)計(jì)分析。在病例和對(duì)照中的補(bǔ)體激活指數(shù)結(jié)果如表3.1所示。將外露層(outlier)從對(duì)照中除去。條件對(duì)數(shù)回歸分析優(yōu)勢(shì)比(OR)為在log CAI中的1 sd增加(0.94)。
這等價(jià)于CAI的2.6倍增長(zhǎng)。
數(shù)據(jù)如表4所示。事件發(fā)生的時(shí)間56個(gè)病例在他們的事件發(fā)生前取樣。在33個(gè)病例中，在事件發(fā)生后取樣。
與事件發(fā)生的時(shí)間有明顯的相互影響(p＝0.007)。在事件發(fā)生取樣的病例中，CAI顯著性地增加，而這種關(guān)系在事件發(fā)生后取樣的病例中沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)。事件發(fā)生前的樣品事件發(fā)生前所取樣品的數(shù)據(jù)如表5所示。事件發(fā)生后的樣品事件發(fā)生后所取樣品的數(shù)據(jù)如表6所示。
在那些事件發(fā)生前取樣的病例中，沒(méi)有證據(jù)表明該關(guān)系根據(jù)事件的近似性而變化(p＝0.65)。6.等分分析通過(guò)等分進(jìn)行的CAI分析表明該關(guān)系是非線性的，僅在最低等分中危險(xiǎn)降低。CAI等分的截?cái)帱c(diǎn)為0.27和0.6。同樣存在與事件發(fā)生時(shí)間的顯著性相互影響(p＝0.007)。
所有的等分分析中的結(jié)果如表7所示。事件發(fā)生前的樣品的等分結(jié)果如表8所示，而事件發(fā)生后的樣品的等分結(jié)果如表9所示。
在補(bǔ)體激活指數(shù)嵌套的(nested)病例-對(duì)照研究中的單變關(guān)系如表10所示。補(bǔ)體激活指數(shù)對(duì)事件發(fā)生前所取的樣品，補(bǔ)體激活指數(shù)的等分和病例/對(duì)照狀態(tài)之間的關(guān)系在對(duì)吸煙狀況、心收縮壓、膽固醇、甘油三酸酯、纖維蛋白原以及體重指數(shù)的調(diào)整后依然保持(P＝0.003)。
相對(duì)于等分1，等分2和等分3的讓步比分別為5.24(1.50-18.26)和6.37(1.80-22.58)。
全部模型如表11所示。該分析使用155個(gè)觀察-53個(gè)病例和102個(gè)匹配的對(duì)照。讓步比在除吸煙和抗體指數(shù)的變量中提高了1 sd。甘油三酸酯和纖維蛋白原用對(duì)數(shù)變換。
在模型中單獨(dú)使用補(bǔ)體激活指數(shù)的等分，ROC(接受器工作特征)曲線下的面積為0.65。7.結(jié)論數(shù)據(jù)表明由本發(fā)明的試驗(yàn)測(cè)定的補(bǔ)體激活指數(shù)(CAI)與患冠心病的危險(xiǎn)強(qiáng)烈相關(guān)。這如表8所示。
表10表明膽固醇、吸煙、纖維蛋白原和心收縮壓同樣與這些男性的危險(xiǎn)相關(guān)。
表11是對(duì)這些危險(xiǎn)因素的獨(dú)立關(guān)系的強(qiáng)度的多變量分析。從該表中的p值和95％置信區(qū)間可以看到僅該試驗(yàn)與危險(xiǎn)獨(dú)立相關(guān)。與具有分布中低部三分之一水平的男性相比，中部三分之一的男性的危險(xiǎn)為5.2倍，而高部三分之一的男性的危險(xiǎn)為6.4倍。
在本評(píng)價(jià)中，所使用的試驗(yàn)試劑盒因此被認(rèn)為對(duì)冠心病危險(xiǎn)具有高預(yù)測(cè)性。
分析了總共117個(gè)樣品。
危險(xiǎn)兒童-64個(gè)年齡在10到16歲之間的健康兒童，他們的父母或祖父母中至少有一個(gè)在45歲以前患有心肌梗塞。
對(duì)照-53個(gè)年齡匹配的健康兒童，他們?cè)谶x擇性外科手術(shù)前或受到外傷后被隨機(jī)選擇。這些對(duì)照并不完全充分，因?yàn)樗麄冎袃H有一部分被問(wèn)及家族史，因此不能排除這組中同樣含有危險(xiǎn)兒童。因此預(yù)期當(dāng)危險(xiǎn)兒童與正確的對(duì)照，即那些被證明陰性冠心病家族史的兒童相比時(shí)，結(jié)果(下面)中顯示的差異將更高。
血清樣品在測(cè)試前在-70℃保存。1.試驗(yàn)原理—如前所詳述的。2.材料—如前所詳述的。3.試驗(yàn)過(guò)程—如前所詳述的。4.結(jié)果的計(jì)算和解釋—如前所詳述的。5.結(jié)果在采集原始數(shù)據(jù)后，進(jìn)行下列統(tǒng)計(jì)分析。
危險(xiǎn)兒童的讓步比(OR)通過(guò)使用在對(duì)照組中測(cè)定的兩個(gè)單獨(dú)的75％和95％的截?cái)嘞抻?jì)算。這給出分別使用補(bǔ)體激活指數(shù)(CAI)1.07和2.0的截?cái)嘀怠?br> 數(shù)據(jù)在表12和13以及圖5中給出。
該結(jié)果表明危險(xiǎn)組的兒童與對(duì)照組的兒童相比給出顯著性高的結(jié)果。7.結(jié)論數(shù)據(jù)表明在本評(píng)價(jià)中，產(chǎn)生高水平補(bǔ)體激活抗hHSP60抗體的能力是與在成年時(shí)冠心病發(fā)病的易感性升高相關(guān)的遺傳性狀。
這意味著在本發(fā)明的試驗(yàn)中的高水平結(jié)果對(duì)那些在其它方面完全健康的幼年患者患這種疾病的易感性是指示性的。
權(quán)利要求
1.用于人體的治療或診斷方法的hHSP60或其免疫原性片段。
2.熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的趨勢(shì)的診斷試驗(yàn)方法，所述方法包括以下步驟i) 將患者樣品和hHSP60接觸；ii) 檢測(cè)任何補(bǔ)體激活；以及iii)將檢測(cè)步驟(ii)的結(jié)果和熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的趨勢(shì)相關(guān)。
3.熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的趨勢(shì)的診斷試驗(yàn)方法，所述方法包括以下步驟i) 從患者取樣品；ii) 檢測(cè)步驟(i)的樣品中任何對(duì)hHSP60特異性的單一的抗體；以及iii)將檢測(cè)步驟(ii)的結(jié)果和熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的趨勢(shì)相關(guān)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的診斷試驗(yàn)方法，其中檢測(cè)步驟(ii)包括以下步驟i) 將樣品和HSP60蛋白質(zhì)族的非hHSP60成員接觸；ii) 將從步驟(i)得到的樣品和hHSP60接觸；以及iii)檢測(cè)任何抗體-hHSP60結(jié)合反應(yīng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的診斷試驗(yàn)方法，其中檢測(cè)步驟(ii)包括以下步驟i) 將樣品和顯示對(duì)hHSP60單一的表位，而不顯示任何共享HSP60表位的抗原接觸；以及ii) 檢測(cè)任何抗體-抗原結(jié)合反應(yīng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5中的任一權(quán)利要求的診斷試驗(yàn)方法，其中通過(guò)任何補(bǔ)體激活的檢測(cè)檢測(cè)抗體-hHSP60結(jié)合反應(yīng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求2或6中的任一權(quán)利要求的診斷試驗(yàn)方法，其中通過(guò)C4b的結(jié)合檢測(cè)補(bǔ)體激活。
8.hHSP60在用于傾向于熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的患者的診斷試劑的生產(chǎn)中的用途。
9.hHSP60和HSP60蛋白質(zhì)族的非hHSP60成員在用于傾向于熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的患者的診斷試劑的生產(chǎn)中的用途。
10.顯示對(duì)hHSP60單一的表位，而不顯示任何共享HSP60表位的抗原在用于傾向于熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的患者的診斷試劑的生產(chǎn)中的用途。
11.用于傾向于熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的患者的診斷試驗(yàn)試劑盒，其特征在于它包含hHSP60或顯示對(duì)hHSP60單一的表位，而不顯示任何共享HSP60表位的抗原。
12.用于傾向于熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的患者的診斷試驗(yàn)試劑盒，其特征在于它包含hHSP60和HSP60蛋白質(zhì)族的非hHSP60成員。
13.用于傾向于熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的患者的診斷試驗(yàn)試劑盒，其特征在于它包含顯示對(duì)hHSP60單一的表位，而不顯示任何共享HSP60表位的抗原。
14.hHSP60或顯示對(duì)hHSP60單一的表位，而不顯示任何共享HSP60表位的抗原在用于治療熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的藥物的生產(chǎn)中的用途。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的hHSP60或顯示對(duì)hHSP60單一的表位，而不顯示任何共享HSP60表位的抗原的用途，其中藥物是疫苗。
16.用于治療熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的藥物的生產(chǎn)方法，其特征在于hHSP的使用。
17.根據(jù)權(quán)利要求2至7中的任一權(quán)利要求的診斷試驗(yàn)方法，其是人體的診斷方法。
18.根據(jù)權(quán)利要求2至17中的任一權(quán)利要求的診斷試驗(yàn)方法、用途或診斷試驗(yàn)試劑盒，其中熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的趨勢(shì)是與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的疾病的趨勢(shì)。
19.根據(jù)權(quán)利要求2至17中的任一權(quán)利要求的診斷試驗(yàn)方法、用途或診斷試驗(yàn)試劑盒，其中熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的趨勢(shì)是心肌疾病的趨勢(shì)。
20.根據(jù)權(quán)利要求2至17中的任一權(quán)利要求的診斷試驗(yàn)方法、用途或診斷試驗(yàn)試劑盒，其中熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的趨勢(shì)是冠心病的趨勢(shì)。
21.hHSP60在識(shí)別抑制hHSP60誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的化合物或物質(zhì)或試劑的方法中的用途。
22.識(shí)別抑制hHSP60誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活的化合物或物質(zhì)或試劑的方法，其特征在于hHSP的使用。
全文摘要
本發(fā)明涉及人HSP60(熱激蛋白60)在人的治療或診斷方法中的新用途,更特別地,本發(fā)明涉及診斷試驗(yàn)方法、診斷試劑的生產(chǎn)以及用于因動(dòng)脈粥樣硬化而患有血管疾病的患者的診斷試驗(yàn)試劑盒,這些患者傾向于熱激蛋白誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活,例如,患有心肌疾病如冠心病。
文檔編號(hào)A61K39/00GK1351713SQ00807857
公開(kāi)日2002年5月29日 申請(qǐng)日期2000年5月22日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月21日
發(fā)明者馬哈維爾·辛格, 佐爾坦·普羅哈斯卡, 捷爾吉·富斯特, 拉斯洛·羅米奇 申請(qǐng)人:澤梅爾魏斯醫(yī)科大學(xué), 馬哈維爾·辛格