專利名稱：用作TNF－α信號傳導(dǎo)途徑抑制物的TRAF2變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
腫瘤壞死因子α(TNFα)是多種細胞產(chǎn)生的免疫應(yīng)答中的細胞間遞質(zhì)，包括活化的巨噬細胞和單核細胞。由TNFα激發(fā)的應(yīng)答通過它與兩個獨特的TNFα細胞表面受體TNFαR1和TNFαR2之間的相互作用啟動。TNFα與這些細胞表面受體結(jié)合并激發(fā)轉(zhuǎn)錄因子的活化，例如，核因子κB(NFκB)，它們調(diào)節(jié)多種免疫和炎性應(yīng)答基因的表達。
憑借TNFα的結(jié)合，TNFα受體通過它們的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域與多種細胞內(nèi)信號翻譯蛋白質(zhì)相互作用。已知與TNFα受體相關(guān)的一組細胞內(nèi)信號翻譯蛋白質(zhì)是腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子，即已知為受體蛋白的“TRAF”家族。TRAF家族由許多具有共同結(jié)構(gòu)特征的同源蛋白質(zhì)組成，它們與TNFα受體蛋白相聯(lián)系并從中傳導(dǎo)信號。TRAF蛋白缺少酶促活性基元，而似乎顯示接頭蛋白質(zhì)的功能，它可將載體偶聯(lián)至下游信號傳導(dǎo)級聯(lián)中。該家族的一個成員，TRAF2，與許多TNFα受體家族蛋白質(zhì)相聯(lián)系，包括TNFαR1、TNFαR2、CD40和CD30。對于TRAF2，已鑒定至少有8個細胞內(nèi)分子與其直接結(jié)合。TRAF2已顯示出對于TNFα介導(dǎo)的各種轉(zhuǎn)錄因子的活化是關(guān)鍵的，尤其是對NFκB和C-jun N-末端激酶(JNK/SAPK)，這些轉(zhuǎn)錄因子依次負責免疫/炎性應(yīng)答的表達。
有多種疾病與受TNFα結(jié)合控制的所調(diào)節(jié)途徑有關(guān)系。在某些情況下，TNFα結(jié)合激發(fā)了最終導(dǎo)致疾病的炎性應(yīng)答。因此，需要開發(fā)預(yù)防與TNFα受體結(jié)合相關(guān)的疾病的方法。尤其期望找到預(yù)防炎性應(yīng)答激活的方法，所述應(yīng)答原本會被TNFα的激活所引發(fā)。為了治療和預(yù)防與TNFα結(jié)合相關(guān)的疾病，本發(fā)明提供了以TRAF2為基礎(chǔ)并能抑制TNFα信號傳導(dǎo)途徑的多肽。
已報道的進展TRAF蛋白的一般結(jié)構(gòu)已被描述并在

圖1(a)中進行了大致說明，該圖顯示了圖表形式的全長TRAF2(TRAF-FL)。這些蛋白質(zhì)具有帶鋅環(huán)指基元的N-末端區(qū)，隨后是一列類鋅指結(jié)構(gòu)。鋅指區(qū)之后是由兩個亞結(jié)構(gòu)域組成的保守(TRAF)結(jié)構(gòu)域N-末端結(jié)構(gòu)域和C-末端結(jié)構(gòu)域。C-末端結(jié)構(gòu)域涉及受體的結(jié)合和TRAF的同源及異源寡聚化作用，它是各種其它信號傳導(dǎo)蛋白質(zhì)的停泊位點。
TRAF2遵循上述TRAF蛋白質(zhì)的一般結(jié)構(gòu)。已有許多研究試圖將TRAF2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的亞結(jié)構(gòu)域與該蛋白的功能相聯(lián)系起來。
Takeuchi等對TRAF2進行了廣泛的突變分析(Takeuchi等，生物化學雜志J.Biol.Chem.，271(33)19935-42(1996))。這些研究顯示TRAF2由介導(dǎo)獨特活性的模塊化結(jié)構(gòu)域組成。作者確定TRAF2的N-末端環(huán)指及兩個相鄰的鋅指是NFκB激活所需要的，而TRAF結(jié)構(gòu)域中的獨特的TRAF-N和TRAF-C亞結(jié)構(gòu)域看來是獨立介導(dǎo)自身結(jié)合及其與TRAF1的相互作用。
Song等(美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，94，9792-9796(1997))隨后的研究顯示TNFα誘導(dǎo)的NFκB及c-jun N-末端激酶(JNK/SAPK)活化需要TRAF2。作者顯示，TRAF2是兩激酶級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致NFκB和JNK激活的分支點。此報告支持了TRAF2及TRAF家族其它成員作為接頭蛋白質(zhì)的功能性模型，其中具有起始平行下游應(yīng)答之附加信號蛋白質(zhì)的停泊位點。
Min等(免疫學雜志(J.Immunology)，159，3508-3518(1997))用轉(zhuǎn)染/過表達的策略來分析TRAF蛋白質(zhì)的作用。先前已顯示含TRAF結(jié)構(gòu)域但缺少氨基末端殘基1-80的TRAF2可抑制TNFα誘導(dǎo)NFκB的活化。作者證實此TRAF2變體還阻斷TNFα對JNK的激活作用。
Brink等(生物化學雜志(J.Biol.Chem.)，273，7，4129-4134(1998))描述了一種TRAF2的剪接變體，他們稱之為“TRAF2A”。TRAF2A的cDNA除了具有附加的21bp序列外，其余部分與TRAF2相同，此21bp序列編碼的7個氨基酸插入TRAF2A環(huán)指結(jié)構(gòu)域中。作者發(fā)現(xiàn)TRAF2AmRNA的表達以組織特異的方式被調(diào)節(jié)，且TRAF2A蛋白能與TNFαR2的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合。他們還發(fā)現(xiàn)，與TRAF2相反，當TRAF2A在293細胞中過表達時，它不能刺激NFκB活性，而是充當TNFαR2依賴型NFκB活化的主要抑制物。
許多研究已將炎性過程和TNFα與主要的心血管疾病聯(lián)系起來(Bryant等，循環(huán)(Circulation)，97(14)1375-81(1998)；Kubota等，循環(huán)研究(Circ.Res.)，81(4)627-35(1997)；Muller Werdan等，歐洲細胞因子網(wǎng)(Eur.Cytokine Netw.)，9(4)689-91(1998)；Aukrust等，美國心血管雜志(Am.J.Cardiol.)，83(3)376-82(1999))。在過去的五年中，積累的證據(jù)已表明，局部TNFα水平的提高與以下疾病相關(guān)(a)心肌梗死、冠狀動脈旁路手術(shù)、心臟移植后的心臟局部缺血-再灌注損傷或中風后CNS中的局部缺血-再灌注損傷；(b)嚴重冠狀動脈粥樣硬化斑的加重和斷裂；(c)充血性心力衰竭的發(fā)展和加重；以及(d)球囊血管成形術(shù)之后的內(nèi)皮細胞損傷。此外，最近的發(fā)現(xiàn)顯示細胞程序死亡可能是心力衰竭或梗塞期間心肌細胞死亡的病理生理學中的一個重要因素。
除上述心血管疾病外，還有許多其它疾病的發(fā)病機理與TNFα相關(guān)。這些疾病包括克隆病(Crohn’s disease)、牛皮癬、類風濕性關(guān)節(jié)炎、移植中的排斥反應(yīng)(graft versus host disease)、炎性腸疾病、非胰島素依賴型的糖尿病和神經(jīng)變性疾病(如帕金森癥)。
由于TNFα與多種諸如上文所述疾病之間的相互關(guān)系，所以希望為抑制和治療這些疾病提供組合物和方法。
發(fā)明概述按照本發(fā)明，已發(fā)現(xiàn)TRAF2變體，尤其是含天然剪接變異的變體(TRAF2TR)和含天然剪接變異且在TRAF2 N-末端區(qū)缺失的變體(TRAF2TD)，可抑制TNFα的信號傳導(dǎo)及相關(guān)的免疫炎性應(yīng)答。
按照本發(fā)明的實施方案，提供了編碼TRAF2TR的DNA序列，包括如圖2a所示的序列。
按照本發(fā)明的另一實施方案，提供了編碼TRAF2TD的DNA序列，包括如圖3a所示的序列。
在優(yōu)選的實施方案中，TRAF2TR和TRAF2TD DNA是cDNA。
在其它的實施方案中，本發(fā)明提供了含如圖2b所示氨基酸序列并能抑制腫瘤壞死因子α(TNFα)所調(diào)節(jié)途徑的TRAF2TR多肽，以及含如圖3b所示氨基酸序列并能抑制腫瘤壞死因子α(TNFα)所調(diào)節(jié)途徑的TRAF2TD多肽。
本發(fā)明的另一方面提供了抑制患者中TNFα調(diào)節(jié)的途徑的方法，包括將能抑制TNFα所調(diào)節(jié)途徑的組合物引入患者體內(nèi)，該組合物包含能表達TRAF2TR多肽的表達載體、能表達TRAF2TD多肽的表達載體、TRAF2TR多肽及藥學可接受載體或TRAF2TD多肽及藥學可接受載體。
本發(fā)明的另一方面是提供了抑制TNFα過度產(chǎn)生所涉及疾病的方法，包括將能抑制TNFα所調(diào)節(jié)途徑的組合物施用于患者，該組合物包括能表達TRAF2TR多肽的表達載體、能表達TRAF2TD多肽的表達載體、TRAF2TR多肽及藥學可接受載體或TRAF2TD多肽及藥學可接受載體。
本發(fā)明還有另一方面提供了抑制TNFα病理的方法，所說病理涉及核因子κB(NFκB)依賴型基因超活化，該方法包括將能抑制TNFα所調(diào)節(jié)途徑的組合物施用于患者，該組合物包括能表達TRAF2TR多肽的表達載體、能表達TRAF2TD多肽的表達載體、TRAF2TR多肽及藥學可接受載體或TRAF2TD多肽及藥學可接受載體。
本發(fā)明還提供了抑制涉及腫瘤壞死因子α的發(fā)炎過程的方法，包括將能抑制TNFα所調(diào)節(jié)途徑的組合物施用于患者，該組合物包括能表達TRAF2TR多肽的表達載體、能表達TRAF2TD多肽的表達載體、TRAF2TR多肽及藥學可接受載體或TRAF2TD多肽及藥學可接受載體。
在某些實施方案中，所述發(fā)炎過程選自以下疾病克隆病、牛皮癬、類風濕性關(guān)節(jié)炎、移植中的排斥反應(yīng)、炎性腸疾病、非胰島素依賴型的糖尿病和神經(jīng)變性疾病。
在另一些實施方案中，發(fā)炎過程是選自以下的心血管疾病(a)心肌梗死、冠狀動脈旁路手術(shù)、心臟移植或中風后CNS中的局部缺血-再灌注損傷引起的心臟局部缺血-再灌注損傷；(b)嚴重冠狀動脈粥樣硬化斑的加重和斷裂；(c)充血性心力衰竭的發(fā)展和加重；(d)球囊血管成形術(shù)之后的內(nèi)皮細胞損傷；以及(e)心肌細胞的程序性細胞死亡。
本發(fā)明的另一方面，提供了編碼TRAF2TR/2TD變體的DNA序列。
本發(fā)明的另一方面，提供了能抑制TNFα所調(diào)節(jié)途徑的TRAF2TR/2TD變體多肽。
本發(fā)明所提供產(chǎn)物具有能治療多種疾病的優(yōu)勢，它利用天然存在的蛋白質(zhì)的變體干擾這些疾病共同的早期過程，即TNFα信號傳導(dǎo)。
附圖概述圖1是全長TRAF2(TRAF2-FL)及其剪接變體TRAF2TR的示意結(jié)構(gòu)。圖2a和2b是TRAF2TR cDNA的核酸序列(2a)和TRAF2TR的氨基酸序列(2b)。圖3a和3b是TRAF2TD cDNA的核酸序列(3a)和TRAF2TD的氨基酸序列(3b)。圖4a和4b是剪接過的TRAF2(TRAF2TR)和全長TRAF2的核酸(4a)及氨基酸(4b)排列。圖5說明了TRAF2TR變體mRNA的組織分布。泳道1-對照TRAF2FL cDNA；2-對照TRAF2剪接變體(TRAF2TR)cDNA；3-Jurkat；4-HeLa細胞系；5-胸腺；6-胎盤；7-胸腺；8-脾；9-卵巢；10-對照TRAF2FL。圖6描述了在被轉(zhuǎn)染HeLa細胞中Nyc-融合的TRAF2FL和TRAF2TR的免疫檢測。泳道1-pcDNA3載體；2-myc-TRAF2FL；3-myc-TRAF2TR。圖7圖示了用NFKB UAS探針進行的電泳遷移率變動測定(EMSA)。來自FL TRAF2過表達細胞的核提取物(泳道3和4)顯示TNF-α誘導(dǎo)的遷移變動明顯強于對照(泳道1和2)。TRAF2-TR過表達阻斷了NF-κB的形成，并因此在TNF-α刺激的細胞中未檢測到遷移變動條帶(泳道5和6)。
發(fā)明詳述以下是本文所用術(shù)語的定義及本發(fā)明優(yōu)選實施方案的描述。定義
“克隆載體”是一復(fù)制子，例如，質(zhì)粒、噬菌體或粘粒，另一DNA片段可連于其上從而使所連接片段得以復(fù)制?！皬?fù)制子”是用作體內(nèi)DNA自主復(fù)制單位的任何遺傳元件(如質(zhì)粒、染色體、病毒)，即能在其自身控制下復(fù)制?？寺≥d體可以在一種細胞類型中復(fù)制而于另一種細胞中表達(“穿梭載體”)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，克隆載體能于宿主細胞中表達，且“表達載體”能表達足以干擾細胞中TNF-α所調(diào)節(jié)途徑的量的TRAF2TR和TRAF2TD。
“盒”指能在一個或多個特異限制位點插入載體的DNA片段。DNA片段編碼目的多肽，而盒及限制位點的設(shè)計要保證盒在轉(zhuǎn)錄和翻譯的正確閱讀框架處插入。
當外源或異源DNA已被引入細胞中時，細胞就被所說的DNA“轉(zhuǎn)染”了。當所轉(zhuǎn)染DNA引起表型改變時，此細胞就已被外源或異源DNA“轉(zhuǎn)化”了。轉(zhuǎn)化的DNA可整合入(共價連接)組成細胞基因組的染色體DNA中。
“核酸分子”指核糖核苷(腺苷、鳥苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脫氧核糖核苷(脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷或脫氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合形式或它們的任何磷酸酯類似物，如硫代磷酸酯和硫酯，可以是單鏈形式或雙鏈螺旋。雙鏈DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是可能的。術(shù)語“核酸分子”，特別是DNA或RNA分子，只指該分子的一級和二級結(jié)構(gòu)，并未將其限制于任何三級結(jié)構(gòu)的形式。因此，此術(shù)語包括許多分子中，尤其是線性或環(huán)狀DNA分子(如限制片段)、質(zhì)粒及染色體中的雙鏈DNA。在對特殊的雙鏈DNA分子結(jié)構(gòu)的討論中，序列在此可按正常慣例進行描述，即給出的只是沿DNA非轉(zhuǎn)譯鏈的5’至3’方向的序列(即，所具序列與mRNA同源的鏈)。“重組DNA分子”是經(jīng)過分子生物學操作的DNA分子。
當核酸分子的單鏈形式能在適當?shù)臏囟群碗x子強度條件下與其它核酸分子如cDNA、基因組DNA或RNA退火時，則對于該另一核酸分子來說，此核酸分子就是“可雜交的”(見Sambrook等，見下文)。溫度和離子強度條件決定了雜交的“嚴格謹性”。雜交要求兩核酸間含互補序列，盡管依賴于雜交的嚴謹性，堿基之間的錯配還是有可能的。對于核酸雜交來說，恰當?shù)膰乐斝匀Q于核酸長度和互補的程度，這些變量是本領(lǐng)域眾所周知的。
用于此處時，術(shù)語“寡核苷酸”指可與編碼TRAF2的基因組DNA分子、cDNA分子或mRNA分子雜交且通常至少18個核苷酸長的核酸。寡核苷酸可被標記，例如，用32P-核苷酸或標記物(諸如生物素之類)已共價連接其上的核苷酸進行標記。在一實施方案中，標記后的寡核苷酸可用作探針檢測編碼TRAF2之核酸的存在。在另一實施方案中，寡核苷酸(其中之一或兩個均可被標記)能用作PCR引物，用于克隆全長或部分長度的TRAF2，或用于檢測編碼TRAF2的核酸的存在。在進一步的實施方案中，寡核苷酸可與TRAF2 DNA分子形成三鏈螺旋。一般說來，寡核苷酸可合成制備，優(yōu)選用核酸合成儀。因此，可用非天然存在的磷酯類似鍵制備寡核苷酸，諸如硫酯鍵等。
DNA“編碼序列”是指當置于適當調(diào)節(jié)序列控制下時，在體外或體內(nèi)細胞中被轉(zhuǎn)譯和翻譯成多肽的雙鏈DNA序列。DNA編碼序列及合適的調(diào)節(jié)序列優(yōu)選提供于表達載體中。編碼序列的邊界決定于5’(氨基)末端的起始密碼子和3’(羧基)末端的翻譯終止密碼子。編碼序列可以包括，但不局限于，原核序列、來自真核mRNA的cDNA、來自真核(如哺乳動物)DNA的基因組DNA序列，甚至是合成的DNA序列。若編碼序列預(yù)期用于真核細胞中表達，則多腺苷酸化信號和轉(zhuǎn)錄終止序列通常將位于編碼序列的3’端。
轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列是DNA調(diào)節(jié)序列，如提供編碼序列在宿主細胞中的表達的啟動子、增強子和終止子。在真核細胞中，多腺苷酸化信號是控制序列。
“啟動子序列”是能結(jié)合細胞中的RNA聚合酶并起始下游(3’方向)編碼序列轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)節(jié)區(qū)。為了對本發(fā)明進行說明，啟動子序列在3’末端被轉(zhuǎn)錄起始位點限定并向上游(5’方向)延伸，包括起始背景以上可檢測水平的轉(zhuǎn)錄所必需的最小數(shù)目堿基或元件。在啟動子序列中可找到轉(zhuǎn)錄起始位點(可方便地確定，例如，用核酸酶S1作圖)，以及負責RNA聚合酶結(jié)合的蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(共有序列)。
當RNA聚合酶將編碼序列轉(zhuǎn)譯成mRNA，然后被剪接(如編碼序列含內(nèi)含子)并翻譯成編碼序列編碼的蛋白質(zhì)時，則編碼序列處于細胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列的“控制下”。
用于此處時，術(shù)語“同源”指蛋白質(zhì)間具有“共同進化起源”的相互關(guān)系。這樣的蛋白質(zhì)(及它們的編碼序列)具有序列同源性，反映在它們的序列具有高度的相似性。術(shù)語“序列相似性”指具有或不具有共同進化起源的蛋白質(zhì)核酸或氨基酸序列間的相同或一致程度。不過，在通常使用及本文中，當用諸如“高度”之類副詞修飾時，術(shù)語“同源的”可能指序列相似性而非共同的進化來源。
術(shù)語“TNFα所調(diào)節(jié)途徑”及相關(guān)術(shù)語指涉及TNFα與腫瘤壞死因子受體家族(TNFR)成員結(jié)合的信號所調(diào)節(jié)途徑。
術(shù)語“相當于”用于此處是指相似或同源序列在確定位置是否與相似性或同源性已測定的分子相同或不同。核酸或氨基酸序列排列可包括間隔。因此，術(shù)語“相當于”指序列相似性而非氨基酸殘基或核苷酸堿基的編號。
術(shù)語“剪接變體”指由這樣的mRNA編碼的多肽，此mRNA由一個或多個基因編碼的全長mRNA經(jīng)過另外的加工后產(chǎn)生，導(dǎo)致mRNA相對于原基因的全長mRNA來說含一個或多個缺失。
本發(fā)明的實施方案本發(fā)明涉及抑制TNFα信號傳導(dǎo)途徑的TRAF2的兩個變體。一實施方案是在下文被稱為“截短的TRAF2”或“TRAF2TR”的TRAF2 RNA加工剪接變體。另一實施方案是基于缺失相當于TRAF2TR第1-87位氨基酸殘基的TRAF2TR，它被稱為“截短并缺失的TRAF2”或“TRAF2TD”。TRAF2TR和TRAF2TD都具有抑制TNFα信號傳導(dǎo)途徑的能力。由于TRAF2TD顯著降低對TNFα結(jié)合之應(yīng)答的能力，所以它是尤其優(yōu)選的實施方案。
下文是這兩個實施方案結(jié)構(gòu)的描述，隨后是關(guān)于如何制備這些實施方案的討論。
TRAF2TR實施方案的結(jié)構(gòu)和制備此剪接變體的cDNA序列見圖2a，氨基酸序列見圖2b。至于概略性的顯示TRAF2TR的圖1，可見缺失去除了TRAF2FL的第123-201位氨基酸殘基，包括鋅指結(jié)構(gòu)域1的C-末端部分和所有的鋅指2和3，以及鋅指4的N-末端殘基。
可用任何合適的方法制備本領(lǐng)域的TRAF2TR，包括本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員已知的各種方法?？赏ㄟ^各種渠道找到分離、克隆和DNA測序的教材。本領(lǐng)域技術(shù)中普通分子生物學、微生物學和重組DNA技術(shù)在文獻中有充分的解釋。參閱，如，Sambrook，F(xiàn)ritsch & Maniatis，分子克隆實驗室手冊(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第二版(1989)冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約(此處為“Sambrook等，1989”)；DNA克隆實用方法(DNA CloningA Practical Approach)，第I和第II卷(D.N.Glover編輯，1985)；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait編輯，1984)；核酸雜交(Nucleic Acid Hybridization)[B.D.Hams & S.J.Higgins編輯(1985)]；轉(zhuǎn)錄和翻譯(Transcription And Translation)[B.D.Hames& S.J.Higgins，編輯(1984)]；動物細胞培養(yǎng)(Animal Cell Culture)[R.I.Freshney編輯(1986)]；固定化細胞和酶(Immobilized CellsAnd Enzymes)[IRL出版社，(1986)]；B.Perbal，分子克隆實用指導(dǎo)(A Practical Guide To Molecular Cloning)(1984)；F.M.Ausubel等(編輯)，分子生物學通用手冊(Current Protocols in MolecularBiology)，John Wiley & Sons，有限公司(1994)。
基于本文所述關(guān)于TRAF2TR DNA序列的信息和本領(lǐng)域所知獲得cDNA的方法，編碼TRAF2TR和TRAF2TD的核苷酸序列可方便地克隆或制備自野生型TRAF2并插入恰當?shù)妮d體，在體外或體內(nèi)表達這些蛋白質(zhì)。關(guān)于涉及克隆cDNA和表達載體的方法描述參見文獻，Sambrook等，同上文。
編碼TRAF2的基因，無論是基因組DNA或cDNA，均可分離自人基因組文庫或cDNA文庫。獲得具本文所給出DNA序列信息之基因的方法是本領(lǐng)域眾所周知的?？捎帽绢I(lǐng)域已知的標準步驟從克隆DNA(即DNA“文庫”)中獲得TRAF2 DNA。優(yōu)選由從高水平表達此蛋白質(zhì)之組織中制備的cDNA文庫(如，淋巴來源的細胞，尤其是，B細胞或骨肉瘤細胞系，例如，呈現(xiàn)TRAF2或TRAF2TR高水平表達的人骨肉瘤SAOS-2(ATCCNo.HTB-85))獲得。DNA還可通過純化自預(yù)期細胞的基因組DNA或其片段克隆獲得(參閱，例如，Sambrook等，1989，同上；Glover，D.M.(編輯)1985，DNA克隆實用方法，MRL出版社，Ltd.，牛津，英國，第I、II卷)或用化學合成的方法獲得。來源于基因組DNA的克隆除編碼區(qū)外還可包含調(diào)節(jié)和內(nèi)含子DNA區(qū)；來自cDNA的克隆將不含內(nèi)含子序列。由于本發(fā)明部分以全長TRAF2剪接變體(TRAF2TR)的分離為基礎(chǔ)，所以希望獲得編碼TRAF2TR序列的cDNA。
獲得cDNA的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。簡略地說，這些方法包括從真核細胞中分離信使RNA(mRNAs)的混合物，并應(yīng)用一系列酶促反應(yīng)合成與分離mRNA互補的雙鏈DNA拷貝(cDNAs)。
如下文實施例1中所提出的，已發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)克隆是分離含TRAF2TR剪接變體之cDNA的有效方法。RT-PCR包括用逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄細胞mRNA，隨后用PCR擴增產(chǎn)生的DNA產(chǎn)物。
不管是以何方式獲得目的cDNA，用許多已知技術(shù)中的任一種都可將雙鏈cDNA混合物插入克隆載體，這至少部分取決于所用的特殊載體。在以下文獻中對多種插入方法進行了相當詳細的討論酶學方法(Methods in Enzymology)，68，16-18(1980)，以及Sambrook等，1989，同上。
一旦DNA片段插入克隆載體，克隆載體就被用于轉(zhuǎn)化合適的宿主。這些克隆載體通常賦予宿主抗生物素抗性的性狀。這樣的宿主通常是原核細胞且只有一些宿主細胞含目的cDNA。被轉(zhuǎn)染的宿主細胞組成了基因“文庫”，成為分離出mRNA的細胞中所存在的mRNA的代表性樣品。
根據(jù)本文所提供的TRAF2的序列信息，可制備合適的寡核苷酸序列，優(yōu)選如上所述合成，并用于鑒別含TRAF2序列的克隆。為了鑒定含TRAF2序列的克隆，將單個轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細胞在硝酸纖維素濾膜上長成菌落。溶解菌落并通過加熱將DNA緊密固定在濾紙上。然后將濾紙和與TRAF2互補的被標記寡核苷酸探針一起保溫。與TRAF2基本同源的DNA片段將雜交于探針上。同源程度越大，可使用的雜交條件越嚴謹。
探針與它互補的cDNA雜交。用放射自顯影或可鑒定探針存在的化學反應(yīng)可進行鑒定。為了鑒定含目的蛋白質(zhì)所有結(jié)構(gòu)信息的一個或多個克隆，對克隆進行定性。分離編碼目的蛋白的核酸序列并重插入表達載體中。表達載體將克隆基因置于特異原核或真核控制元件調(diào)控下，使得ds-DNA有效表達(轉(zhuǎn)錄和翻譯)。
進一步的篩選可以基因特性為基礎(chǔ)進行。例如，基因是否編碼具有與TRAF2等電的、電泳上相同之氨基酸組成的蛋白質(zhì)或具有如上所述之TRAF2蛋白質(zhì)部分氨基酸序列的蛋白質(zhì)。因此，通過以其表達產(chǎn)物物理、化學或免疫特性為基礎(chǔ)進行的分析可檢測基因的存在。例如，通過其所產(chǎn)生蛋白質(zhì)在電泳遷移、等電聚焦、非均衡pH凝膠電泳、蛋白水解或抗原性上是否具有與TRAF2TR類似或相同的特性來挑選cDNA克隆或DNA克隆。
TRAF2TD的結(jié)構(gòu)和制備相對于TRAF2TR，TRAF2TD缺失第1-87位氨基酸和編碼這些氨基酸的相應(yīng)核苷酸。TRAF2TD的DNA序列見圖3a，而氨基酸序列見圖3b。
任何合適的方法都可用于制備TRAF2TD，例如，包括基于上述信息的各種方法。有許多方法可用于產(chǎn)生缺失第1-87位氨基酸的截短形式的TRAF2TR。在優(yōu)選的制備方法中，TRAF2TR cDNA用作PCR模板，所用的5’引物含TRAf2全長編碼序列的第262-280位核苷酸(ATGAGTTCGGCCTTCCCAGAT)，其中包括ATG以建立翻譯的起始位點；3’引物是TTA TAG CCC TGT CAG GTC CAC。產(chǎn)生的構(gòu)建體開始于全長TRAF2的第88位氨基酸，缺失TRAF2TR的第123-201位氨基酸。
用上述制備TRAF2TD的方法之類的方式可制備TRAF2TR的其它變體。
TRAF2TR/2TD變體本發(fā)明范圍內(nèi)包括TRAF2TR或TRAF2TD的等位基因變體、取代、添加和缺失突變體、類似物和衍生物(下文稱之為“TRAF2TR/2TD變體”)，以及來自其它物種、具有與TRAF2TR相同或相似功能活性的同系物。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明實踐上應(yīng)用了具缺失或取代的基因，所述突變提高了原基因產(chǎn)物抑制TNFα信號傳導(dǎo)途徑的能力。TRAF2TR/2TD變體的制備或分離也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明的范圍包括具功能活性的TRAF2TR/TRAF2TD變體，即呈現(xiàn)與TRAF2TR相關(guān)的一個或多個功能活性。
通過取代、添加或缺失改變編碼核酸序列以提供功能相當?shù)姆肿?，可以制備TRAF2TR/2TD變體。優(yōu)選制備相對于TRAF2TR或TRAF2TD來說具有增強或提高的功能活性的TRAF2TR/2TD蛋白。
由于核苷酸編碼序列的簡并性，編碼與TRAF2TR基本上相同的氨基酸序列(包括含單個氨基酸變異的氨基酸序列)的其它DNA序列也可應(yīng)用于本發(fā)明的實踐中。這些包括，但不局限于，等位基因、來自其它物種的同源基因以及含全部或部分TRAF2TR的核苷酸序列，所說的核苷酸序列通過用編碼原序列中相同氨基酸殘基的不同密碼子取代而改變，因此產(chǎn)生沉默的變異。同樣的，本發(fā)明的TRAF2TR/2TD變體包括，但不局限于，從一級氨基酸序列上說，含TRAF2TR全部或部分氨基酸序列的變體，包括用序列中導(dǎo)致保守氨基酸取代的殘基來替代功能相當?shù)陌被釟埢桓淖兊男蛄?。例如，可用極性相似的另一氨基酸取代序列中的一個或多個氨基酸殘基，它可用作功能同等物，產(chǎn)生沉默的改變。序列中氨基酸的取代可選自該氨基酸所屬類型的其它成員。例如，非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。帶芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電的(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負電的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。預(yù)期這樣的改變不會影響聚丙烯酰胺凝膠電泳測定的表觀分子量或等電點。
尤其優(yōu)選的取代是-用賴氨酸取代精氨酸，反之亦然，從而保持正電荷；-用谷氨酸取代天冬氨酸，反之亦然，從而保持負電荷；-用絲氨酸取代蘇氨酸，從而保持游離羥基；及-用谷氨酰胺取代天冬酰胺，從而保持游離CONH2。
還可導(dǎo)入氨基酸取代，以便用具特別優(yōu)選特性之氨基酸取代。例如，半胱氨酸可引入一個可能與其它半胱氨酸形成二硫鍵的位點。組氨酸可引入作為特別有催化活性的位點(即，組氨酸可作為酸或堿，是生化催化中最常用的氨基酸)。脯氨酸的引入是由于其特殊的平面結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中可誘導(dǎo)β-轉(zhuǎn)角。
編碼本發(fā)明TRAF2TR/2TD變體的基因可用本領(lǐng)域已知的多種方法產(chǎn)生。導(dǎo)致它們產(chǎn)生的操作可發(fā)生在基因或蛋白質(zhì)水平。例如，可用本領(lǐng)域已知的許多策略中的任一種修飾被克隆的TRAF2基因序列(Sambrook等，1989，同上)?？捎孟拗菩詢?nèi)切酶在適當?shù)奈稽c切割此序列，若需要還可進行進一步的酶促修飾、分離和體外連接。生產(chǎn)編碼TRAF2TR/2TD的基因時，應(yīng)小心保證修飾后的基因保留在與TRAF2TR相同的翻譯閱讀框架內(nèi)而在編碼預(yù)期活性的基因區(qū)內(nèi)不被翻譯終止信號打斷。
此外，編碼TRAF2TR/2TD的核酸序列可體外或體內(nèi)突變以建立和/或破壞翻譯、起始和/或終止序列，或建立編碼區(qū)中的變異和/或形成新的限制性內(nèi)切酶位點或破壞原先存在的位點，從而方便進一步的體外修飾。優(yōu)選的，這樣的突變增強了突變TRAF2TR基因產(chǎn)物的功能活性。任何本領(lǐng)域已知的誘變技術(shù)都可使用，包括，但不局限于，體外定點誘變(Hutchinson，C.，等，1978，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)2536551；Zoller和Smith，1984，DNA3479-488；Oliphant等，1986，基因44177；Hutchinson等，1986，美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)83710)、“TAB”接頭(Pharmacia)的使用，等等。PCR技術(shù)優(yōu)選用于定位誘變中(見Higuchi，1989，“用PCR加工DNA”，在《PCR技術(shù)DNA擴增的原理和應(yīng)用》中，H.Erlich，編輯，Stockton Press，第六掌，第61-70頁)。
以下有關(guān)編碼預(yù)期多肽之DNA的操作和表達的討論對于TRAF2TR和TRAF2TD以及TRAF2TR/2TD變體都是通用的。將TRAF2TR、TRAF2TD以及TRAF2TR/2TD變體克隆入克隆/表達載體可將鑒定和分離后的DNA序列插入合適的克隆/表達載體(此后稱“載體”)，從而方便序列修飾或蛋白質(zhì)的表達。這些載體一般包括多克隆位點、啟動子、方便在宿主細胞中復(fù)制的序列和選擇標記。
任何合適的載體都可使用。本領(lǐng)域已知的就有許多。可使用的載體包括，但不局限于，例如，質(zhì)?；蛐揎椇蟮牟《尽］d體通常與供其引入的宿主細胞以方便載體的復(fù)制和編碼蛋白質(zhì)的表達相容。例如，可通過將DNA片段插入有互補粘端的克隆載體從而完成DNA序列插入所給定載體的工作。不過，若使DNA片段化所用的互補限制性位點不存在于克隆載體中，則DNA分子的末端可酶促修飾?；蛘?，通過將核苷酸序列(接頭)連接至DNA末端可產(chǎn)生任何預(yù)期的位點；這些連接的接頭可以包含編碼限制性內(nèi)切酶識別序列的特殊化學合成寡核苷酸。有用的載體可由染色體、非染色體和合成的DNA序列區(qū)段組成?？捎糜诒景l(fā)明實踐中的特殊載體例子包括，但不局限于，大腸桿菌噬菌體，例如，λ衍生物，或質(zhì)粒，例如，pBR322衍生物或pUC質(zhì)粒衍生物，如pmal-c、pFLAG，SV40衍生物和已知的細菌質(zhì)粒，如大腸桿菌質(zhì)粒colE1、pCR1、pMa1-C2、pET、pGEX(Smith等，1988，基因6731-40)，pMB9和它們的衍生物，諸如RP4之類的質(zhì)粒；噬菌體DNA，如噬菌體1的許多衍生物，如NM989，以及其它的噬菌體DNA，如M13和絲狀單鏈噬菌體DNA；諸如2μm質(zhì)粒之類的酵母載體或其衍生物；可用于真核細胞的載體，例如，可用于昆蟲細胞的載體，例如桿狀病毒載體，可用于哺乳動物細胞的載體；質(zhì)粒和噬菌體DNA聯(lián)合形成的載體，已經(jīng)修飾以便應(yīng)用噬菌體DNA或其它表達控制序列的質(zhì)粒；等等。
可按本發(fā)明使用的酵母載體包括，但不局限于，非融合型pYES2載體(XbaI、SphI、ShoI、NotI、BstXI、EcoRI、BamHI、SacI、KpnI和HindIII克隆位點；Invitrogen)或融合型pYESHisA、B、C(XbaI、SphI、ShoI、NotI、BstXI、EcoRI、BamHI、SacI、KpnI和HindIII克隆位點，用ProBond樹脂純化并用腸激酶切割的N-末端肽；Invitrogen)。
本發(fā)明實踐中可用的桿狀病毒載體包括各種載體，非融合型轉(zhuǎn)移載體和融合型轉(zhuǎn)移載體都可使用，其中非融合型轉(zhuǎn)移載體有例如，pVL941(BamHI克隆位點；Summers)、pVL1393(BamHI、SmaI、XbaI、EcoRI、NotI、XmaIII、BglII和PstI克隆位點；Invitrogen)、pVL1392(BglII、PstI、NotI、XmaIII、EcoRI、XbaI、SmaI和BamHI克隆位點；Summers和Invitrogen)以及pBlueBacIII(BamHI、BglII、PstI、NcoI和HindIII克隆位點，可用藍/白重組子篩選；Invitrogen)；融合型轉(zhuǎn)移載體有例如，pAc700(BamHI和KpnI克隆位點，其中BamHI識別位點開始于起始密碼子；Summers)、pAc701和pAc702(與pAc700相同，具有不同的閱讀框架)、pAc360(多角體蛋白起始密碼子下游36堿基對處有BamHI克隆位點；Invitrogen(195))和pBlueBacHisA、B、C(三種不同的閱讀框架，具有BamHI、BglII、PstI、NcoI和HindIII克隆位點，用于ProBond純化的N-末端肽和藍/白斑重組子篩選；Invitrogen)。
本發(fā)明考慮使用的哺乳動物載體包括，例如，具可誘導(dǎo)啟動子例如二氫葉酸還原酶(DHFR)啟動子的載體，如具DHFR表達載體的任何表達載體，或DHFR/氨甲喋呤共擴增載體，例如，pED(PstI、SalI、SbaI、SmaI和EcoRI克隆位點，該載體既表達克隆基因又表達DHFR；參閱Kaufman，分子生物學通用手冊，16.12(1991))?；蛘哂霉劝滨０泛铣擅?甲硫氨酸磺基肟共擴增載體，例如，pEE14(HindIII、XbaI、SmaI、SbaI、EcoRI和BclI克隆位點，其中的載體表達谷氨酰胺合成酶和被克隆的基因；Celltech)。在另一實施方案中，可使用在EpsteinBarr病毒(EBV)控制下指導(dǎo)游離體基因表達的載體，例如，pREP4(BamHI、SfiI、XhoI、NotI、NheI、HindIII、NheI、PvuII和KpnI克隆位點，組成型勞氏肉瘤病毒長末端重復(fù)片段(RSV-LTR)啟動子、潮霉素選擇標記；Invitrogen)、pCEP4(BamHI、SfiI、XhoI、NotI、NheI、HindIII、NheI、PvuII和KpnI克隆位點，組成型人巨細胞病毒(hCMV)立即早期基因、潮霉素選擇標記；Invitrogen)、pMEP4(KpnI、PvuI、NheI、HindIII、NotI、XhoI、SfiI、BamHI克隆位點，可誘導(dǎo)的金屬硫蛋白IIa基因啟動子、潮霉素選擇標記；Invitrogen)、pREP8(BamHI、XhoI、NotI、HindIII、NheI和KpnI克隆位點，RSV-LTR啟動子、組氨醇選擇標記；Invitrogen)、pREP9(KpnI、NheI、HindIII、NotI、XhoI、SfiI和BamHI克隆位點，RSV-LTR啟動子、G418選擇標記；Invitrogen)和pEBVHis(RSV-LTR啟動子、潮霉素選擇標記、可通過ProBond樹脂純化并用腸激酶切割的N-末端肽；Invitrogen)。用于本發(fā)明的可選擇哺乳動物表達載體包括pRc/CMV(HindIII、BstXI、NotI、SbaI和ApaI克隆位點，G418選擇；Invitrogen)、pRc/RSV(HindIII、SpeI、BstXI、NotI、XbaI克隆位點，G418選擇；Invitrogen)、pcDNA3(HindIII、KpnI、BamHI、BstXI、EcoRI、EcoRV、BstXI[重復(fù)]、NotI、XhoI、XbaI、ApaI克隆位點，G418、氨芐青霉素篩選，Invitrogen)及其它。本發(fā)明使用的牛痘病毒哺乳動物表達載體(見，Kaufman，1991，同上)包括，但不局限于pSC11(SmaI克隆位點，TK-和β-gal篩選)、pMJ601(SalI、SmaI、AflI、NarI、BspMII、BamHI、ApaI、NheI、SacII、KpnI和HindIII克隆位點；TK-和β-gal篩選)和pTKgptF1S(EcoRI、PstI、SalI、AccI、HindIII、SbaI、BamHI和Hpa克隆位點，TK或XPRT篩選)。
可使用各種方法證實編碼TRAF2TR、TRAF2TD或TRAF2TR/2TD變體的目的DNA序列已克隆入載體中。通?？墒褂靡韵乱环N或多種方法(a)目的質(zhì)粒DNA或特異mRNA的PCR擴增，(b)核酸雜交，(c)選擇標記基因功能的存在或缺失，(d)用合適的限制性內(nèi)切酶進行分析，及(e)插入序列的表達。在第一種方法中，可用PCR擴增核酸以檢測擴增產(chǎn)物。在第二種方法中，可用探針通過核酸雜交檢測插入表達載體的外源基因的存在，所用探針含與插入標記基因同源的序列。在第三種方法中，可以外源基因插入載體而引起的某些“選擇標記”基因功能(如，β-半乳糖苷酶活性、胸苷激酶活性、對抗生素的抗性、轉(zhuǎn)化表型、桿狀病毒中包涵體的形成，等等)的存在或丟失為基礎(chǔ)鑒定和篩選重組載體/宿主系統(tǒng)。在另一實施例中，若編碼TRAF2TR的核酸插入載體的“選擇標記”基因序列中，通過選擇標記基因功能的缺失可鑒定含TRAF2TR插入片段的重組子。在第四種方法中，通過用合適的限制性酶消化鑒定重組表達載體。在第五種方法中，假如表達蛋白質(zhì)呈現(xiàn)功能活性構(gòu)象，可通過檢驗重組子所表達基因產(chǎn)物的活性、生化或免疫學特性來鑒定重組表達載體。啟動子編碼TRAF2TR或TRAF2TD或其TRAF2TR/2TD變體的核苷酸序列可插入含被插入蛋白質(zhì)編碼序列轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需元件的表達載體中。這樣的元件在此被稱為“啟動子”。因此，編碼本發(fā)明多肽的核酸在本發(fā)明的表達載體中與啟動子可操作性的連接。cDNA和基因組序列都可在這樣的調(diào)節(jié)序列控制下克隆和表達。表達載體還優(yōu)選包括復(fù)制起點。必需的轉(zhuǎn)錄和翻譯信號可提供于重組表達載體上，或由編碼TRAF2的天然基因和/或其側(cè)翼區(qū)提供。前述將DNA片段插入克隆載體的任何方法均可用于構(gòu)建含具合適轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號及蛋白質(zhì)編碼序列之基因的表達載體。這些方法可包括體外重組DNA和合成技術(shù)，以及體內(nèi)重組(遺傳重組)。
表達可用本領(lǐng)域已知的任何啟動子/增強子元件控制，但這些調(diào)節(jié)元件必須在選定用于表達的宿主中是有功能的?？捎糜诳刂芓RAF2TR基因表達的啟動子包括，但不局限于，SV40早期啟動子區(qū)(Benoist和Chambon，1981，自然(Nature)290304-310)、勞氏肉瘤病毒3’長末端重復(fù)片段中所含的啟動子(Yamamoto等，1980，細胞22787-797)、皰疹病毒胸苷激酶啟動子(Wagner等，1981，美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)781441-1445)、金屬硫蛋白基因的調(diào)節(jié)序列(Brinster等，1982，自然29639-42)；原核表達載體，例如，β-內(nèi)酰胺酶啟動子(Villa-Kamaroff等，1978，美國國家科學院院報，753727-3731)或tac啟動子(DeBoer等，1983，美國國家科學院院報，8021-25)；也可參閱科技美國人(ScientificAmerican)中“來自重組細菌的有用蛋白質(zhì)”一文，1980，24274-94；來自酵母或其它真菌的啟動子元件，例如，Gal4啟動子、ADC(醇脫氫酶)啟動子、PGK(磷酸甘油激酶)啟動子、堿性磷酸酶啟動子；和呈現(xiàn)組織特異性并已用于轉(zhuǎn)基因動物中的動物轉(zhuǎn)錄控制區(qū)在胰腺泡細胞中有活性的彈性蛋白酶I基因控制區(qū)(Swift等，1984，細胞38639-646；Ornitz等，1986，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，50399-409；MacDonald，1987，肝臟病學(Hepatology)7425-515)；在胰腺β-細胞內(nèi)有活性的胰島素基因控制區(qū)(Hanahan，1985，自然315115-122)、在淋巴細胞內(nèi)有活性的免疫球蛋白基因控制區(qū)(Grosschedl等，1984，細胞38647-658)；Adames等，1985，自然318533-538；Alexander等，1987，細胞分子生物學Mol。Cell。Biol。，71436-1444)、在睪丸、乳房、淋巴和肥大細胞中有活性的小鼠乳腺腫瘤病毒控制區(qū)(Leder等，1986，細胞45485-495)、在肝中有活性的清蛋白基因控制區(qū)(Pinkert等，1987，基因和發(fā)育(Geneand Devel.)1268-276)、在肝細胞中有活性的甲胎蛋白基因控制區(qū)(Krumlauf等，1985，細胞分子生物學51639-1648；Hammer等，1987，科學(Science)23553-58)、在肝細胞中有活性的α1抗胰蛋白酶基因控制區(qū)(Kelsey等，1987，基因和發(fā)育，1161-171)、在骨髓細胞中有活性的β珠蛋白基因控制區(qū)(Mogram等，1985，自然315338-340；Kollias等，1986，細胞4689-94)、在腦的少突膠質(zhì)細胞中有活性的髓鞘堿性蛋白基因控制區(qū)(Readhead等，1987，細胞48703-712)、在骨骼肌中有活性的肌球蛋白輕鏈2基因控制區(qū)(Sani，1985，自然314283-286)和在下丘腦中有活性的促性腺釋放激素基因控制區(qū)(Mason等，1986，科學2341372-1378)。將載體引入宿主細胞載體可用任何合適的方法引入宿主細胞，包括，如轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉淀、脂染(溶酶體融合)、基因槍或DNA載體轉(zhuǎn)運器(參閱，如Wu等，1992，生化雜志(J.Biol.Chem.)267963-967；Wu和Wu，1988，生化雜志26314621-14624；Hartmut等，加拿大專利申請2,012,311，1990年3月15日提交)，由此產(chǎn)生許多基因拷貝。優(yōu)選克隆基因在穿梭載體質(zhì)粒上，以供在克隆細胞如大腸桿菌中擴展，并且方便純化用于隨后插入合適表達細胞系。例如，穿梭載體是能在一種以上類型的生物體中復(fù)制的載體，可通過將來自大腸桿菌質(zhì)粒的序列與來自酵母2μm質(zhì)粒的序列連接制備既能在大腸桿菌中復(fù)制，又能在釀酒酵母中復(fù)制的穿梭載體。宿主細胞系統(tǒng)可能的宿主細胞系統(tǒng)包括，但不局限于感染了病毒(如牛痘病毒、腺病毒等)的哺乳動物宿主細胞系統(tǒng)；感染了病毒(如桿狀病毒)的昆蟲宿主細胞系統(tǒng)；微生物，諸如包含酵母載體的酵母；或以噬菌體、DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA轉(zhuǎn)化的細菌。載體表達元件在強度和特異性上都有所變化。取決于所用的宿主細胞系統(tǒng)，可使用多種合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件中的任一種。
此外，可選擇適當?shù)乃拗骷毎?，它能調(diào)節(jié)插入序列的表達，或以預(yù)期的特異方式修飾和加工基因產(chǎn)物。不同的宿主細胞具有其特性及獨特的蛋白質(zhì)翻譯和翻譯后加工及修飾機制。可選擇合適的細胞系或宿主系統(tǒng)以保證所表達外源蛋白質(zhì)的預(yù)期修飾和加工。于酵母中表達可產(chǎn)生生物活性產(chǎn)物。于真核細胞中表達可提高“自然”折疊的可能性。此外，于哺乳動物細胞中表達可為重組或構(gòu)成TRAF2TR抑制活性提供工具。而且，不同的載體/宿主表達系統(tǒng)可不同程度影響加工反應(yīng)，諸如蛋白水解切割。如上文所指出的，本發(fā)明的表達載體都可用于轉(zhuǎn)染細胞以供TRAF2TR活性調(diào)節(jié)子的篩選或生物檢測。
在經(jīng)重組整合編碼序列后，本發(fā)明的重組TRAF2TR、TRAF2TD或TRAF2TR/2TD變體可于染色體上表達。在這一點上，有一些擴增系統(tǒng)可用于獲得穩(wěn)定基因的高水平表達(見Sambtook等，1989，同上)。
已引入含TRAF2TR編碼核酸之重組載體的細胞在供細胞表達TRAF2TR的條件下培養(yǎng)于適當?shù)募毎囵B(yǎng)基中。
一旦建立了合適的宿主系統(tǒng)和生長條件，就可繁殖和制備一定量的重組表達載體。如上所述，通過收集培養(yǎng)液或溶解包涵體可獲得可溶形式的蛋白質(zhì)，如，用去污劑處理，若需要還可以用超聲波法或其他機械加工。用多種技術(shù)可分離溶解的或可溶解的蛋白質(zhì)，包括聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、等電聚焦、雙向凝膠電泳、層析法(如離子交換、親和、免疫親和及分子排阻柱層析)、離心、差異溶解度、免疫沉淀或用于蛋白質(zhì)純化的任何其他標準技術(shù)。
如上所述，“載體”是用于將本發(fā)明核酸轉(zhuǎn)移至宿主細胞的任何工具。優(yōu)選的載體是病毒載體，例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、腺病毒和腺伴隨病毒。由此，用病毒載體或通過DNA的直接導(dǎo)入將編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)或多肽結(jié)構(gòu)域片段的基因體內(nèi)、離體或體外引入。通過將轉(zhuǎn)基因載體定向于特異細胞可達到于靶組織中表達的目的，如用病毒載體或受體配基，或用組織特異的啟動子，或二者結(jié)合使用。離體和體內(nèi)處理方法中病毒載體系統(tǒng)的使用通常用于體內(nèi)或離體定向和治療步驟的病毒載體是以DNA為基礎(chǔ)的載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。構(gòu)建和使用病毒載體的方法是本領(lǐng)域所已知的[見，如Miller和Rosman，BioTechniques7980-990(1992)]。優(yōu)選的病毒載體是復(fù)制缺陷型的，即，它們在靶細胞中不能自主復(fù)制。一般說來，本發(fā)明范圍內(nèi)使用的復(fù)制缺陷型病毒載體基因組缺少至少一個病毒在感染細胞中復(fù)制所必需的區(qū)域。這些區(qū)域可用本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員已知的任何技術(shù)或被刪除(全部或部分)或使其無功能。這些技術(shù)包括完全去除、取代(用其他序列，尤其是被插入的核酸)、部分刪除或?qū)⒁粋€或多個堿基添加至必需(對于復(fù)制來說)區(qū)。用遺傳操作方法或用誘變劑處理可在體外(在分離的DNA上)或原位完成這樣的技術(shù)。優(yōu)選復(fù)制缺陷型病毒保留包裝病毒顆粒所必需的基因組序列。
DNA病毒載體包括減毒的或缺陷型DNA病毒，諸如以下病毒，但不局限于此單純皰疹病毒(HSV)、人乳頭瘤病毒、Epstein Barr病毒(EBV)、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、牛痘病毒，等等。優(yōu)選完全或幾乎完全缺失病毒基因的缺陷型病毒。缺陷型病毒在引入細胞后無復(fù)制能力，因而不會導(dǎo)致可能產(chǎn)生的病毒感染。使用缺陷型病毒載體可在特異的局部區(qū)域進入細胞，而不用擔心該載體會感染其他細胞。因此可特異定向于特殊組織。具體載體的例子包括，但不局限于，缺陷型皰疹病毒1(HSV1)載體[Kaplitt等，分子細胞神經(jīng)科學(Molec.Cell.Neurosci.)2320-330(1991)]、缺失糖蛋白L基因的缺陷型皰疹病毒載體[專利公開RD371005A]或其他缺陷型皰疹病毒載體[國際專利申請公開WO94/21807，發(fā)表于1994年9月29日；國際專利申請公開WO92/05263，發(fā)表于1994年4月2日]；減毒的腺病毒載體，諸如Stratford-Perricaudet等所述的載體[臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)90626-630(1992)；也可見La Salle等，科學(Science)259988-990(1993)]；以及缺陷型腺伴隨病毒載體[Samulski等，病毒學雜志(J.Virol.)613096-3101(1987)；Samulski等，病毒學雜志(J.Virol.)633822-3828(1989)；Lebkowski等，分子細胞生物學(Mol.Cell.Biol.)83988-3996(1988)]。
體內(nèi)施用時，優(yōu)選將適當?shù)拿庖咭种浦委熍c病毒載體(如腺病毒載體)結(jié)合使用以避免病毒載體和感染細胞的免疫失活。例如，可用諸如白介素-12(IL-12)、干擾素-g(IFN-g)或抗CD4抗體之類的免疫抑制細胞因子來阻斷對病毒載體的體液或細胞免疫應(yīng)答[參見，如Wilson，自然醫(yī)學(Nature Medicine)(1995)]。此外，應(yīng)用改造成表達最小數(shù)量抗原的病毒載體是有利的。
自然的，本發(fā)明涉及載體的送遞，其將表達治療有效量的TRAF2TR用于基因治療。用于此處的短語“治療有效量”指足以減少或最優(yōu)選預(yù)防導(dǎo)致TNFα結(jié)合相關(guān)疾病之明顯臨床表現(xiàn)的免疫應(yīng)答的量?；蛘?，治療有效量是足以改善宿主明顯的臨床癥狀的量。離體及體內(nèi)治療方法中使用的優(yōu)選病毒載體系統(tǒng)某些病毒載體系統(tǒng)已在本領(lǐng)域中很好的建立起來并適用于本發(fā)明的治療方法。a. 腺病毒載體系統(tǒng)在優(yōu)選的實施方案中，載體是腺病毒載體。腺病毒是真核DNA病毒，它可被修飾后以有效傳送本發(fā)明核酸至多種類型細胞中。存在多種血清型的腺病毒。在本發(fā)明范圍內(nèi)，優(yōu)選這些血清型中的2型或5型人腺病毒(Ad2或Ad5)或動物來源的腺病毒(見WO94/26914)?？捎糜诒景l(fā)明范圍內(nèi)的那些動物來源的腺病毒包括犬、牛、鼠(例如May1，Beard等，病毒學75(1990)81)、羊、豬、禽和猿(例如SAV)來源的腺病毒。優(yōu)選的動物來源腺病毒是犬腺病毒，更優(yōu)選CAV2腺病毒(如Manhattan或A26/61株(ATCC VR-800))。
優(yōu)選的本發(fā)明復(fù)制缺陷型腺病毒載體包含ITR、衣殼化序列及目的核酸。更優(yōu)選的是至少腺病毒的E1區(qū)是非功能性的。E1區(qū)中的缺失優(yōu)選為Ad5腺病毒序列的第455-3329位核苷酸(PvuII-BglII片段)或第382-3446位核苷酸(HinfII-Sau3A片段)。其它區(qū)域也可被修飾，尤其是E3區(qū)(WO95/02697)、E2區(qū)(WO94/28938)、E4區(qū)(WO94/28152、WO94/12649和WO95/02697)或晚期基因L1-L5中的任一個。
在優(yōu)選的實施方案中，腺病毒載體在E1區(qū)有缺失(Ad1.0)。E1-缺失的腺病毒例子公布于EP185,573，其內(nèi)容在此收編作為參考。在另一優(yōu)選實施方案中，腺病毒載體在E1和E4區(qū)有缺失(Ad3.0)。E1/E4-缺失的腺病毒例子公布于WO95/02697和WO96/22378，其內(nèi)容在此收編作為參考。在另一優(yōu)選的實施方案中，腺病毒載體在E1區(qū)有缺失，并在其中插入了E4區(qū)和核酸序列(見FR94 13355，其內(nèi)容在此收編作為參考)。
用本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員已知的任何技術(shù)都可制備本發(fā)明復(fù)制缺陷型重組腺病毒(Levero等，基因101(1991)195，EP185 573；Graham，EMBO J.3(1984)2917)。尤其是，它們可通過腺病毒和其中攜帶目的DNA序列的質(zhì)粒之間的同源重組來制備。在腺病毒和質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入合適細胞系后可完成同源重組。采用的細胞系應(yīng)優(yōu)選(i)是所述元件可轉(zhuǎn)化的，且(ii)含能與復(fù)制缺陷型腺病毒基因組部分互補的序列，它優(yōu)選以整合形式存在于細胞系中，從而避免了產(chǎn)生重組的風險。如專利申請WO94/26914和WO95/02697所述，可用的細胞系例子是人胚胎腎細胞系293(Graham等，J.Gen.Virol.36(1997)59)，它含有整合入其基因組中的Ad5腺病毒左手部分基因組(12％)，以及能彌補E1和E4功能的細胞系。用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)人員眾所周知的標準分子生物學技術(shù)回收和純化重組腺病毒。
b.腺伴隨病毒載體系統(tǒng)腺伴隨病毒(AAV)是相對小的DNA病毒，它們能以穩(wěn)定的定位方式整合入感染細胞的基因組中。它們能感染廣譜的細胞并不影響細胞生長、形態(tài)或分化，且它們看上去不涉及人的病理學問題。AAV基因組已克隆、測序和定性。它包括約4700個堿基，且兩末端含有約145個堿基的反向末端重復(fù)(ITR)區(qū)，它可作為病毒的復(fù)制起點?；蚪M的剩余部分被分成兩個具衣殼化功能的基本區(qū)基因組的左手部分，含涉及病毒復(fù)制和病毒基因表達的rep基因；基因組的右手部分，含編碼病毒衣殼蛋白的cap基因。
有關(guān)利用來自AAV的載體在體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)移基因的例子文獻中已有報道(參見WO91/18088；WO93/09239；US4,797,368，US5,139,941，EP488 528)。這些發(fā)表的文獻描述了許多AAV-來源的構(gòu)建體，其中rep和/或cap基因缺失并被目的基因替代，利用這些構(gòu)建體在體外(進入培養(yǎng)細胞)或體內(nèi)(直接進入生物體)轉(zhuǎn)移所述目的基因。通過將含目的核酸序列且該序列側(cè)翼有兩AAV反向末端重復(fù)(ITR)區(qū)的質(zhì)粒與攜帶AAV衣殼化基因(rep和cap基因)的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入被人輔助病毒(例如腺病毒)感染的細胞系，可制備本發(fā)明復(fù)制缺陷型重組AAV。隨后用標準技術(shù)純化產(chǎn)生的AAV重組子。
因此，本發(fā)明還涉及AAV-來源的重組病毒，其基因組包含編碼TRAF2TR或TRAF2TD且側(cè)翼為AAV ITR的核酸序列。本發(fā)明還涉及含編碼TRAF2TR或TRAF2TD且側(cè)翼為兩AAV ITR之核酸序列的質(zhì)粒。這樣的質(zhì)?？捎糜谵D(zhuǎn)移核酸序列，在適當?shù)那闆r下，核酸序列與質(zhì)粒一起摻入脂質(zhì)體載體(假病毒)。
C.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)在另一實施方案中，基因可引入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，例如參閱以下文獻Anderson等，美國專利5399346；Mann等，1983，細胞33153；Temin等，美國專利4650764；Temin等，美國專利4980289；Markowitz等，1988，病毒學雜志621120；Temin等，美國專利5124263；EP453242，EP178220；Bernstein等，遺傳工程學(Genet.Eng.)7(1985)235；McCormick，生物技術(shù)(BioTechnlogy)3(1985)689；國際專利公開WO95/07358，發(fā)表于1995年3月16日，申請人Dougherty等；以及Kuo等，1993，血液學(Blood)82845。逆轉(zhuǎn)錄病毒是感染分裂細胞的整合病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包括兩個LTR、一個衣殼化序列和三個編碼區(qū)(gag、pol和env)。在重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，gag、pol和env基因通常全部或部分缺失，并以異源的目的核酸序列替代。這些載體可自不同類型的逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建，如HIV、MoMuLV(“鼠莫羅尼白血病病毒”)、MSV(“鼠莫羅尼肉瘤病毒”)、HaSV(“Harvey肉瘤病毒”)；SNV(“脾臟壞死病毒”)；RSV(“勞氏肉瘤病毒”)和弗蘭德病毒。缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體公布于文獻WO95/02697中。
一般說來，為了構(gòu)建含核酸序列的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，先構(gòu)建了含LTR、衣殼化序列和編碼序列的質(zhì)粒。此構(gòu)建體用于轉(zhuǎn)染包裝細胞系，該細胞系能反式提供質(zhì)粒中缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒功能。通常，這樣的包裝細胞系能表達gag、pol和env基因。這樣的包裝細胞系在現(xiàn)有技術(shù)中已有描述，尤其是細胞系PA317(US4861719)；PsiCRIP細胞系(WO90/02806)和GP+envAm-12細胞系(WO89/07150)。此外，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可在LTR中有修飾以抑制轉(zhuǎn)錄活性，還可含其中可包括部分gag基因的衣殼化序列(Bender等，病毒學雜志61(1987)1639)。用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)人員已知的標準方法可純化重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
可構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體用作感染顆?；蜻M行單輪轉(zhuǎn)染。在過去的個案中，病毒被修飾以保留其中除負責致癌轉(zhuǎn)化特性之基因之外的所有其他基因，并表達異源基因。制備非感染性病毒載體以破壞病毒包裝信號，但保留包裝共轉(zhuǎn)染病毒所需的結(jié)構(gòu)基因，所述病毒經(jīng)改造后含異源基因和包裝信號。因此，產(chǎn)生的病毒顆粒不能生產(chǎn)另外的病毒。定向基因送遞參見國際專利公開WO95/28494，公布于1995年10月。離體和體外治療方法中所用的非病毒系統(tǒng)某些非病毒系統(tǒng)已用于本領(lǐng)域中且能促進編碼本發(fā)明多肽的DNA進入預(yù)期靶細胞中。
A.脂轉(zhuǎn)染送遞系統(tǒng)通過脂轉(zhuǎn)染可在體內(nèi)引入載體。在過去十年中，越來越多將脂質(zhì)體用于核酸的體外包裝和轉(zhuǎn)染。為解決脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染中所遇困難和危險而設(shè)計的合成陽離子脂類，可用于制備脂質(zhì)體，以供在體內(nèi)轉(zhuǎn)染編碼標記的基因[Felgner等，美國國家科學院院報847413-7417(1987)；參見Mackey等，美國國家科學院院報858027-8031(1988)；Ulmet等，科學2591745-1748(1993)]。使用陽離子脂類可促進帶負電荷核酸的包裝，還促進它與帶負電荷的細胞膜之間的融合[Felgner和Ringold，科學337387-388(1989)]。用于轉(zhuǎn)移核酸的尤其有效的脂類化合物和組合物參見國際專利文件WO95/18863和WO96/17823，以及美國專利5459127。在體內(nèi)應(yīng)用脂轉(zhuǎn)染將外源基因引入特異器官具有某些實際的好處。脂質(zhì)體的分子定向于特異細胞是優(yōu)勢之一。已清楚在具細胞異質(zhì)性的組織中定向轉(zhuǎn)染至特殊細胞類型是尤其有利的，例如，在胰、肝、腎和腦中。為了定向的目的，脂類可化學偶聯(lián)至其他分子上[見Mackey等，同上]。有定向性的肽(如激素或神經(jīng)遞質(zhì))和蛋白質(zhì)(如抗體)或非肽分子均可化學偶聯(lián)至脂質(zhì)體上。
其他的分子也可用于促進核酸的體內(nèi)轉(zhuǎn)染，例如陽離子寡聚肽(如，國際專利文件WO95/21931)、來自DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的肽(如國際專利文件WO96/25508)或陽離子聚合物(如國際專利文件WO95/21931)。b.裸DNA送遞系統(tǒng)還可以以裸DNA質(zhì)粒的形式將載體導(dǎo)入體內(nèi)(見美國專利5693622、5589466和5580859)。供基因治療的裸DNA載體可通過本領(lǐng)域已知方法引入預(yù)期宿主細胞中，如轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉淀、基因槍或DNA載體轉(zhuǎn)移器[見，Wu等，生物化學雜志267963-967(1992)；Wu和Wu，生物化學雜志26314621-14624(1988)；Hartmut等，加拿大專利申請2012311，1990年3月15日提出申請；Williams等，美國國家科學院院報882726-2730(1991)]。也可使用受體介導(dǎo)的DNA送遞方法[Curiel等，人類基因治療(Hum.Gene Ther.)3147-154(1992)；Wu和Wu，生物化學雜志2624429-4432(1987)]。鑒定治療上有用的TRAF2TR變體的方法有許多方法可用于確定TNFα所調(diào)節(jié)途徑是否涉及某疾病，并確定本發(fā)明多肽對這些途徑的效果。例如，為了研究在NFκB調(diào)節(jié)中TRAF2TR的作用，以NFκB UAS為探針進行電泳遷移率變動檢驗(EMSA)分析(圖7)。來自過表達FL TRAF之細胞的核提取物(泳道3和4)顯示TNFα誘導(dǎo)的變動明顯強于對照(泳道1和2)。TRAF2TR過表達阻斷了NFκB的形成，并因此在TNFα所刺激細胞中檢測不到變動(泳道5和6)。由于在TNFα所刺激細胞中未顯示遷移率變動條帶，所以這些結(jié)果表明了對NFκB形成的強抑制作用。在用TNFα刺激后過表達全長TRAF2的細胞中NFκB活性有所提高(泳道4)。
上述類型實驗可用于測定某疾病狀態(tài)中牽涉的途徑是否可用本發(fā)明組合物治療。大體上，用分離或制備的TRAF2變體取代TRAF2TR或TRAF2TD，確定該變體是否具有抑制TNFα所調(diào)節(jié)途徑的能力，由此可進行上述實驗。涉及TNFα所調(diào)節(jié)途徑的疾病如上所述，本發(fā)明涉及用TRAF2TR和TRAF2TD及其變體抑制TNFα所調(diào)節(jié)途徑的用途。尤其是，本發(fā)明涉及用上述方法有效阻斷TNFα誘導(dǎo)的數(shù)個轉(zhuǎn)錄因子的活化，包括NFκB和AP-1。TRAF2TR和TRAF2TD及其變體可用于抑制涉及TNFα的過量產(chǎn)生和NFκB依賴型基因的超活化的病理學中的TNFα信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。多種疾病似乎涉及TNFα所調(diào)節(jié)途徑，而這些疾病的病理學基礎(chǔ)可能包括TNFα的過生產(chǎn)或NFκB依賴型基因的超活化。用TRAF2TR和TRAF2TD蛋白質(zhì)及它們的變體可治療這些疾病。
有證據(jù)顯示發(fā)炎過程與所有主要的心血管疾病都有重要關(guān)系，且TNFα水平的提高與這些發(fā)炎過程相關(guān)，因此認為用本發(fā)明的組合物和方法能治療各種主要的心血管疾病。這些疾病包括，但不局限于心血管疾病，如心肌梗死后的心臟局部缺血-再灌注損傷、冠狀動脈旁路手術(shù)、心臟移植或中風造成的CNS中的局部缺血-再灌注損傷；嚴重冠狀動脈粥樣硬化斑的加重和破裂；充血性心力衰竭的發(fā)展和加重；球囊血管成形術(shù)之后的內(nèi)皮細胞損傷。此外，本發(fā)明可用于預(yù)防心力衰竭或梗塞中心肌細胞的程序性細胞死亡，以及避免肌細胞的凋亡。
通過阻斷TNFα受體的信號傳導(dǎo)，應(yīng)用TRAF2TR或TRAF2TD或其變體進行基因治療的途徑可治療這些疾病。優(yōu)選使用TRAF2TD，因為它高效抑制TNFα所調(diào)節(jié)途徑。
同樣的，通過阻斷TNFα受體的信號傳導(dǎo)，應(yīng)用TRAF2TR或TRAF2TD或其變體進行基因治療的途徑可治療病理學上涉及TNFα的其他疾病。這些疾病包括，但不局限于克隆病、牛皮癬、類風濕性關(guān)節(jié)炎、移植中的排斥反應(yīng)、炎性腸疾病、非胰島素依賴型的糖尿病和神經(jīng)變性疾病(如帕金森癥)。
此外，TRAF2TD可用于多種實驗中研究TRAF2-依賴型信號傳導(dǎo)途徑的機制。治療組合物和劑量在使用中，本發(fā)明的任何載體，不管是病毒或非病毒型的，都優(yōu)選在藥學可接受載體或工具中導(dǎo)入體內(nèi)。短語“藥學可接受的”指分子實體和組合物在施用于人體時是生理狀態(tài)下可忍受的，且一般不引起明顯的過敏或類似的不適反應(yīng)，諸如胃部不適、頭暈等等。用于此處時，術(shù)語“藥學可接受的”優(yōu)選表示聯(lián)邦或州政府主管機構(gòu)所批準的，或列于美國藥典或其他通常認可使用于動物，尤其是人身上的藥典中的。術(shù)語“載體”指稀釋劑、佐劑、賦形劑或與化合物一起施用的工具。這樣的藥用載體可以是無菌液體，例如，水或油，包括石油、動物、植物或合成來源的油，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等等。優(yōu)選水或鹽水溶液以及葡萄糖水溶液和甘油溶液作為載體，尤其是對于可注射的溶液。合適的藥用載體可見于“Remington的藥物科學”“Remington’s Pharmacertical Sciences”一書，作者E.W.Martin。
本發(fā)明提供了包括施用有效量的本發(fā)明組合物至人或其他動物在內(nèi)的治療方法。
有效量可以變化，取決于被治療者的年紀、疾病類型和病情嚴重程度、體重、預(yù)期療程、用藥方式及其他參數(shù)。主治醫(yī)生或其他有資格的醫(yī)學專業(yè)人士都可確定有效量。
目前認為本發(fā)明多肽最廣泛使用的劑量是約0.01mg/kg體重/天-100mg/kg體重/天。優(yōu)選的劑量是約0.1mg/kg體重/天-50mg/kg體重/天，更優(yōu)選的劑量是約1mg/kg體重/天-10mg/kg體重/天。
本發(fā)明的重組病毒通常以約104-1014pfu之間的劑量形式配制和施用。以AAV和腺病毒為例，優(yōu)選使用的劑量是約106-1011pfu。術(shù)語“pfu”(“噬斑形成單位”)相應(yīng)于病毒顆粒懸浮液的感染能力，通過感染合適的細胞培養(yǎng)物并檢測形成的噬斑數(shù)目來測定pfu。測定病毒溶液pfu滴度的技術(shù)在現(xiàn)有技術(shù)中有很好的記錄。
以下實施例對本發(fā)明進行了例證性的說明。
實施例實施例1-編碼TRAF2TR的cDNA的分離在全長TRAF2的RT PCR克隆(分子生物學通用手冊，1996)中，用來自人骨肉瘤細胞系(OSA1)的mRNA分離TRAF2的剪接變體TRAF2TR。當利用引物產(chǎn)生全長TRAF2的cDNA時，觀察到了較小的PCR產(chǎn)物。獨立切出此片段并克隆。用于RT PCR的5’引物是ATG GCT GCA GCT AGC GTGACC，而3’引物是TTA TAG CCC TGT CAG GTC CAC。
通過對此較小克隆(TRAF2TR)進行測序，鑒定出框架內(nèi)編碼第123-201位氨基酸殘基的密碼子缺失。圖4a和4b比較了全長TRAF2和TRAF2TR的核酸序列和氨基酸序列。
身體中多種組織已被鑒定為TRAF2TR mRNA的來源，并可通過上述流程分離其中的TRAF2TR mRNA。為了測定TRAF2TR的組織分布，用剪接區(qū)之外的一對引物進行RT-PCR。缺失區(qū)5’側(cè)的引物是GGT GGA GAG CCTGCC GGC CG，而缺失區(qū)3’側(cè)的引物是GGC AGC CGA TGG CGT GGA ATCTG，并用寡聚dT引物產(chǎn)生不同組織總RNA的cDNA。用瓊脂糖電泳分離cDNA并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用來自鄰近剪接區(qū)5’端之TRAF2序列的特異探針(5’-GAT GCA CCT GGA AGG GGA CCC TGA AAT-3’)進行雜交。此探針識別TRAF2的非剪接和剪接變體。對于非剪接變體(TRAF2FL)來說，預(yù)期大小是373bp；對于剪接變體(TRAF2TR)來說，預(yù)期大小是136bp。現(xiàn)在參照圖5，泳道1-對照TRAF2-FL cDNA；2-對照TRAF2剪接變體cDNA；3-Jurkat；4-HeLa細胞系；5-胸腺；6-胎盤；7-胸腺；8-脾臟；9-卵巢。
對多種細胞來源裂解物的蛋白質(zhì)印跡分析未能明確的檢測到在表達蛋白質(zhì)水平有被截短的TRAF2變體存在。似乎該蛋白質(zhì)的高水平表達和生產(chǎn)以細胞類型依賴的方式在發(fā)育上或時間上受到限制，或受一種尚未明確的機制所控制(如，在生發(fā)中心的B細胞成熟階段)。
剪接變體TRAF2TR中的缺失保留了開放的閱讀框架，并且5’剪接邊界符合規(guī)范的剪接供體序列。缺失去除了野生型TRAF2的第123-201位氨基酸殘基，其中包括鋅指結(jié)構(gòu)域1的C-末端部分和所有的鋅指2和3，以及鋅指4的N-末端殘基(圖1)。此缺失更可能破壞鋅指區(qū)的功能，類似于Takeuchi等人在生物化學雜志271(33)，19935-19942中所建立的缺失，據(jù)報道它們對TNFα誘導(dǎo)的NFκB活化呈現(xiàn)顯性失活效果。實施例2-TRAF2TD的制備已知TRAF2 N-氨基末端87個氨基酸(代表環(huán)指結(jié)構(gòu)域，見圖1)的缺失產(chǎn)生了可用作TNFα依賴型NFκB活化之顯性抑制劑(顯性失活)的蛋白質(zhì)(Takeuchi等，生物化學雜志271(33)，19935-19942(1996))。為了確定N-末端的缺失是否會影響TRAF2TR的活性，制備了代表TRAF2TR具蛋白質(zhì)N-末端87個氨基酸缺失(殘基1-87)的構(gòu)建體。為了制備此TRAF2TR變體，以TRAF2TR cDNA為PCR模板，5’引物含TRAF2全長編碼序列的第262-280位核苷酸(ATGAGTTCGGCCTTCCCAGAT)，其中含ATG密碼子作為翻譯起始位點；3’引物是TTA TAG CCC TGT CAG GTC CAC。產(chǎn)生的構(gòu)建體開始于全長TRAF2的第88位氨基酸，包含TRAF2TR的第123-201位氨基酸缺失，是“雙缺失”的構(gòu)建體。此構(gòu)建體經(jīng)DNA測序確認并克隆入哺乳動物表達載體(pcDNA3，Invitrogen)中。實施例3-用TRAF2TR轉(zhuǎn)染HeLa細胞為了確定TRAF2TR對NFκB活化的作用，在哺乳動物表達載體(pcDNA3，INVITROGEN)中構(gòu)建了帶N-Myc親和標簽的截短及全長(FL)TRAF2。為了制備N-Myc融合構(gòu)建體，合成5’PCR引物，該引物含Myc標簽序列及起始甲硫氨酸(MetGluGlnLysLeuIleSerGluGluAspLeuAsn)，之后是TRAF2 cDNA最初的20個核苷酸5’-ATG GAG CAG AAA TTGATT TCC GAG GAA GAT CTG AAC ATG GCT GCA GCT AGC GTG AC-3’。3’PCR引物序列是5’-TTAGAGCCCTGTCAGGTCCACAA-3’。用標準技術(shù)純化PCR產(chǎn)物并克隆入pcDNA3載體中。
用LipoFectamine(BRL，Gibco)試劑按試劑供應(yīng)商的說明書將pcDNA3-myc TRAF2構(gòu)建體轉(zhuǎn)染HeLa細胞。簡略地說，就是將4m1LipoFectamine與在1ml無血清DMEM(BRL)培養(yǎng)基中的1mg DNA混合，將此混合物與3×105個細胞置于60mm的有蓋培養(yǎng)皿中在5％的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)37℃過夜。轉(zhuǎn)染24小時后，用磷酸鹽緩沖液清洗細胞并溶于200ml SDS電泳加樣緩沖液(SIGMA)中。電泳分離10ml裂解物并通過蛋白質(zhì)印跡法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。按抗體供應(yīng)商推薦的方法進行免疫染色和ECL(AMERSHAM)檢測。
抗Myc抗體(BABCO，Berkeley)檢測以pcDNA-TRAF2FL和pcDNA-TRAF2TR轉(zhuǎn)染的HeLa細胞中預(yù)期大小的蛋白質(zhì)(圖6)。
圖6中的結(jié)果顯示了在被感染HeLa細胞中Myc-融合的TRAF2FL和TRAF2TR的免疫測定結(jié)果。用lipofectamine(Gibco BFL)將HeLa細胞轉(zhuǎn)染上TRAF-FL和TRAF-TR的表達構(gòu)建體，24小時后將細胞溶于SDS上樣緩沖液中。用抗myc抗體和ECL檢測系統(tǒng)檢測Myc-融合蛋白質(zhì)。泳道1-pcDNA3載體；2-myc-TRAF2FL；3-myc-TRAF2TR。實施例4-NFκB報告系統(tǒng)為了測定TRAF2TR、TRAF2TD或這些多肽的變體對NFκB所調(diào)節(jié)基因表達的作用，可使用NFκB報告系統(tǒng)，如文獻Takeuchi等，生物化學雜志271(33)，19935-42(1996)中所利用并描述的系統(tǒng)。NFκB報告激活系統(tǒng)可與適當?shù)募毎Y(jié)合使用，如293細胞、COS7細胞或HeLa細胞。用實施例3中所述的lipofectamine方法使細胞被不同的TRAF2構(gòu)建體所轉(zhuǎn)染，即全長TRAF2、TRAF2TR和TRAF2TD。然后比較不同TRAF2片段對共轉(zhuǎn)染的NFκB報告分子激活的影響，從而鑒定出最有效的抑制劑種類。舉例說來，可將含全長TRAF2、TRAF2TR和TRAF2TD以及TRAF2TR和TRAF2TD變體的TRAF2構(gòu)建體轉(zhuǎn)染入293細胞，并監(jiān)測TNFα存在或缺乏的條件下NFκB報告分子活性的水平。預(yù)計全長TRAF2會激活共轉(zhuǎn)染的NFκB報告分子，而其它TRAF2構(gòu)建體會不同程度的阻斷TNFα介導(dǎo)的NFκB報告分子激活作用。實施例5-離體治療方法離體基因治療方法是本領(lǐng)域所已知的，它通常包括4個階段。在第一階段，從待治療的患者中收集所需類型的細胞。第二階段，將目的基因轉(zhuǎn)染到分離的細胞中。第三階段，收集并培養(yǎng)已獲取目的基因的細胞。第四階段，將細胞或灌注或移植回患者體內(nèi)，從而表達預(yù)期基因并治療疾病。
在使用本發(fā)明的離體治療方法的第一階段，從患者中獲取細胞。細胞的選擇基于許多因素，主要是被治療的特殊疾病。對這些靶細胞激活作用的阻斷會抑制心血管疾病狀態(tài)相關(guān)炎性過程中所涉及之前炎性細胞因子及其它蛋白質(zhì)的表達。
第二階段，將TRAF2TR或TRAF2TD或變體cDNA克隆入適當?shù)牟溉閯游锉磉_載體中。表達載體，例如pcDNA3，可用于包括脂轉(zhuǎn)染在內(nèi)的轉(zhuǎn)染方法中。在優(yōu)選的實施方案中，TRAF2TD由于其對TNFα結(jié)合作用的抑制能力有所增強，被克隆入pcDNA3或其它合適的哺乳動物表達載體中?；诒晦D(zhuǎn)染的細胞類型和用于調(diào)節(jié)表達水平的預(yù)期方法來選擇表達載體中所用的啟動子。適當?shù)膯幼涌蛇x自上文所述的啟動子中。對于心臟疾病的基因治療來說，啟動子，例如，2MHC(見Palermo等，循環(huán)學研究(Circ.Res.)，78(3)，504-9(1996))、MLC2(見Sani，自然314283-286(1985))、CARP(見Jeyaseelan等，生物化學雜志，272(36)，22800-8(1997))被插入TRAF2TD cDNA的上游。然后按提供的方法使用lipofectamine(BRL，Gibco)試劑將含TRAF2TDcDNA的表達載體用于脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染中。對于使用病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法來說，離體治療方法的第二階段采用了重組腺病毒載體系統(tǒng)。在此方法中，TRAF2TD cDNA被克隆入腺病毒表達載體中，例如，腺需求pQBI-AdBN/NB(QUANTUM生物技術(shù)公司)。然后將含有TRAF2TD cDNA的腺病毒轉(zhuǎn)移載體與腺病毒的病毒DNA共轉(zhuǎn)染入293細胞中。在噬斑純化及陽性克隆挑選后，擴增含TRAF2TD cDNA的重組腺病毒并用傳統(tǒng)的氯化銫梯度純化方法進行純化，隨后用適當?shù)木彌_液進行透析，例如，磷酸鹽緩沖液。之后重組腺病毒被用于離體轉(zhuǎn)染靶細胞。
以約104-1014pfu之間的劑量形式配制并施用本發(fā)明的重組病毒。以AAV和腺病毒為例，優(yōu)選使用劑量為約106-1011pfu。術(shù)語“pfu”“噬斑形成單位”)相應(yīng)于病毒粒子懸浮液的感染能力，通過感染合適的培養(yǎng)細胞并檢測所形成噬斑的數(shù)量來測定。測定病毒溶液pfu滴度的技術(shù)在現(xiàn)有技術(shù)中有詳盡的描述。
在第三階段中，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)用脂轉(zhuǎn)染或重組腺病毒感染方式獲得的轉(zhuǎn)染細胞，選擇已被轉(zhuǎn)染的細胞?？捎枚喾N方式進行選擇，包括使用只有獲取了表達載體的那些細胞才能存活或生長的藥物標記。
在第四階段，將轉(zhuǎn)染后的細胞灌注或直接移植入患者體內(nèi)，輸入位點可以在待治療的組織附近或在允許TRAF2TD cDNA產(chǎn)物釋放入循環(huán)的部位，以便與受TNFα結(jié)合激活的細胞相互作用。送遞方法包括，但不局限于，直接注射或通過導(dǎo)管、灌注泵或支架(stent)。實施例6-體內(nèi)治療方法體內(nèi)治療方法可用多種不同的病毒載體中，包括腺病毒載體、腺伴隨病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。在本發(fā)明優(yōu)選的體內(nèi)治療方法中，用腺病毒系統(tǒng)將TRAF2TR或TRAF2TD cDNA引入宿主細胞中。由于TRAF2TD cDNA相對較高的抑制TNFα結(jié)合激活作用的能力，優(yōu)選在腺病毒表達載體中使用TRAF2TD cDNA。在此方法中，TRAF2TD cDNA被克隆入腺病毒轉(zhuǎn)移載體中，例如，腺需求pQBI-AdBN/NB(QUANTUM生物技術(shù)公司)或上述的其它腺病毒載體?；诒晦D(zhuǎn)染的細胞類型和用于調(diào)節(jié)表達水平的預(yù)期方法選擇表達載體中所用的啟動子。適當?shù)膯幼涌蛇x自上文所述的啟動子中。
然后可將含有預(yù)期啟動子和TRAF2TD cDNA的腺病毒轉(zhuǎn)移載體與腺病毒的病毒DNA共轉(zhuǎn)染入293細胞中。在噬斑純化及陽性克隆挑選后，擴增含TRAF2TD cDNA的重組腺病毒并用傳統(tǒng)的氯化銫梯度純化方法進行純化，隨后用適當?shù)木彌_液進行透析，例如，磷酸鹽緩沖液。
在體內(nèi)轉(zhuǎn)染細胞之前，測定病毒顆粒滴度，并進行體外實驗確定蛋白質(zhì)表達水平以及組織培養(yǎng)物的感染劑量(TCID50)。以約104-1014pfu之間的劑量形式配制并施用本發(fā)明的重組病毒。以AAV和腺病毒為例，優(yōu)選使用劑量為約106-1011pfu。術(shù)語“pfu”(“噬斑形成單位”)相應(yīng)于病毒粒子懸浮液的感染能力，通過感染合適的培養(yǎng)細胞并檢測所形成噬斑的數(shù)量來測定。測定病毒溶液pfu滴度的技術(shù)在現(xiàn)有技術(shù)中有詳盡的描述。
然后將重組腺病毒以約106-1011pfu的劑量感染患者。重組腺病毒可通過以下方式引入吸入、灌注、外科植入、直接注射或通過導(dǎo)管、灌注泵或支架送遞。
序列表<110>Searfoss III，George H.
Pagnoni，Marco F.
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Guo，KunClark，Kenneth L.<120>用作TNF-α信號傳導(dǎo)途徑抑制物的TRAF2變體<130>22816 PCT<140>尚未轉(zhuǎn)讓<141>2000-04-06<150>60/131940<151>1999-04-30<160>5<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1269<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1atggctgcag ctagcgtgac cccccctggc tccctggagt tgctacagcc cggcttctcc 60aagaccctcc tggggaccaa gctggaagcc aagtacctgt gctccgcctg cagaaacgtc 120ctccgcaggc ccttccaggc gcagtgtggc caccggtact gctccttctg cctggccagc 180atcctcagct ctgggcctca gaactgtgct gcctgtgttc acgagggcat atatgaagaa 240ggcatttcta ttttagaaag cagttcggcc ttcccagata atgctgcccg cagggaggtg 300gagagcctgc cggccgtctg tcccagtgat ggatgcacct ggaaggggac cctgaaagaa 360tacgagtttc aggaccacgt caagacttgt ggcaagtgtc gagtcccttg cagattccac 420gccatcggct gcctcgagac ggtagagggt gagaaacagc aggagcacga ggtgcagtgg 480ctgcgggagc acctggccat gctactgagc tcggtgctgg aggcaaagcc cctcttggga 540gaccagagcc acgcggggtc agagctcctg cagaggtgcg agagcctgga gaagaagacg 600gccacttttg agaacattgt ctgcgtcctg aaccgggagg tggagagggt ggccatgact 660gccgaggcct gcagccggca gcaccggctg 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Phe Ala Arg Lys Leu Gln Glu275 280 285Ala Val Ala Gly Arg Ile Pro Ala Ile Phe Ser Pro Ala Phe Tyr Thr290 295 300Ser Arg Tyr Gly Tyr Lys Met Cys Leu Arg Ile Tyr Leu Asn Gly Asp305 310 315 320Gly Thr Gly Arg Gly Thr His Leu Ser Leu Phe Phe Val Val Met Lys325 330 335Gly Pro Asn Asp Ala Leu Leu Arg Trp Pro Phe Asn Gln Lys Val Thr340 345 350Leu Met Leu Leu Asp Gln Asn Asn Arg Glu His Val Ile Asp Ala Phe355 360 365Arg Pro Asp Val Thr Ser Ser Ser Phe Gln Arg Pro Val Asn Asp Met370 375 380Asn Ile Ala Ser Gly Cys Pro Leu Phe Cys Pro Val Ser Lys Met Glu385 390 395 400Ala Lys Asn Ser Tyr Val Arg Asp Asp Ala Ile Phe Ile Lys Ala Ile405 410 415Val Asp Leu Thr Gly Leu420<210>3<211>1011<212>DNA<213>人<400>3atgagttcgg ccttcccaga taatgctgcc cgcagggagg tggagagcct gccggccgtc 60tgtcccagtg atggatgcac ctggaagggg accctgaaag aatacgagtt tcaggaccac 120gtcaagactt gtggcaagcg tcgagtccct tgcagattcc acgccatcgg ctgcctcgag 180acggtagagg gtgagaaaca gcaggagcac gaggtgcagt ggctgcggga gcacctggcc 240atgctactga gctcggtgct 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115 120 125Glu Arg Val Ala Met Thr Ala Glu Ala Cys Ser Arg Gln His Arg Leu130 135 140Asp Gln Asp Lys Ile Glu Ala Leu Ser Ser Lys Val Gln Gln Leu Glu145 150 155 160Arg Ser Ile Gly Leu Lys Asp Leu Ala Met Ala Asp Leu Glu Gln Lys165 170 175Val Leu Glu Met Glu Ala Ser Thr Tyr Asp Gly Val Phe Ile Trp Lys180 185 190Ile Ser Asp Phe Ala Arg Lys Leu Gln Glu Ala Val Ala Gly Arg Ile195 200 205Pro Ala Ile Phe Ser Pro Ala Phe Tyr Thr Ser Arg Tyr Gly Tyr Lys210 215 220Met Cys Leu Arg Ile Tyr Leu Asn Gly Asp Gly Thr Gly Arg Gly Thr225 230 235 240His Leu Ser Leu Phe Phe Val Val Met Lys Gly Pro Asn Asp Ala Leu245 250 255Leu Arg Trp Pro Phe Asn Gln Lys Val Thr Leu Met Leu Leu Asp Gln260 265 270Asn Asn Arg Glu His Val Ile Asp Ala Phe Arg Pro Asp Val Thr Ser275 280 285Ser Ser Phe Gln Arg Pro Val Asn Asp Met Asn Ile Ala Ser Gly Cys290 295 300Pro Leu Phe Cys Pro Val Ser Lys Met Glu Ala Lys Asn Ser Tyr Val305 310 315 320Arg Asp Asp Ala Ile Phe Ile Lys Ala Ile Val Asp Leu Thr Gly Leu325 330 335<210>5<211>2262<212>DNA<213>人<220><221>misc_feature<222>()..)<223>TRAF2截短序列含有第421-657位堿基對的缺失<400>5gaattccggc gcgctgcgac cgttggggct ttgttcgcgg gggtcacagc tctcatggct 60gcagctagcg tgaccccccc tggctccctg gagttgctac agcccggctt ctccaagacc 120ctcctgggga ccaagctgga agccaagtac ctgtgctccg cctgcagaaa cgtcctccgc 180aggcccttcc aggcgcagtg tggccaccgg tactgctcct tctgcctggc cagcatcctc 240agctctgggc ctcagaactg tgctgcctgt gttcacgagg gcatatatga agaaggcatt 300tctattttag aaagcagttc ggccttccca gataatgctg cccgcaggga ggtggagagc 360ctgccggccg tctgtcccag tgatggatgc acctggaagg ggaccctgaa agaatacgag 420agctgccacg aaggccgctg cccgctcatg ctgaccgaat gtcccgcgtg taaaggcctg 480gtccgccttg gtgaaaagga gcgccacctg gagcacgagt gcccggagag aagcctgagc 540tgccggcatt gccgggcacc ctgctgcgga gcagacgtga aggcgcacca cgaggtctgc 600cccaagttcc ccttaacttg tgacggctgc ggcaagaaga agatcccccg ggagaagttt 660caggaccacg tcaagacttg tggcaagtgt cgagtccctt gcagattcca cgccatcggc 720tgcctcgaga cggtagaggg tgagaaacag caggagcacg aggtgcagtg gctgcgggag 780cacctggcca tgctactgag ctcggtgctg gaggcaaagc ccctcttggg agaccagagc 840cacgcggggt cagagctcct gcagaggtgc gagagcctgg agaagaagac ggccactttt 900gagaacattg tctgcgtcct gaaccgggag gtggagaggg tggccatgac tgccgaggcc 960tgcagccggc agcaccggct ggaccaagac aagattgaag ccctgagtag caaggtgcag 1020cagctggaga ggagcattgg cctcaaggac ctggcgatgg ctgacttgga gcagaaggtc 1080aggcccttcc aggcgcagtg tggccaccgg tactgctcct tctgcctggc cagcatcctc 1140aggaagctcc aggaagctgt ggctggccgc atacccgcca tcttctcccc agccttctac 1200accagcaggt acggctacaa gatgtgtctg cgtatctacc tgaacggcga cggcaccggg 1260cgaggaacac acctgtccct cttctttgtg gtgatgaagg gcccgaatga cgccctgctg 1320cggtggccct tcaaccagaa ggtgacctta atgctgctcg accagaataa ccgggagcac 1380gtgattgacg ccttcaggcc cgacgtgact tcatcctctt ttcagaggcc agtcaacgac 1440atgaacatcg caagcggctg ccccctcttc tgccccgtct ccaagatgga ggcaaagaat 1500tcctacgtgc gggacgatgc catcttcatc aaggccattg tggacctgac agggctctaa 1560ctgcccccta ctggtgtctg ggggttgggg gcagccaggc acagccggct cacggagggg 1620ccaccacgct gggccagggt ctcactgtac aagtgggcag gggccccgct tgggcgcttg 1680ggagggtgtc ggcctgcagc caagttcact gtcacggggg aaggagccac cagccagtcc 1740tcagatttca gagactgcgg aggggcttgg cagacggtct tagccaaggg ctgtggtggc 1800attggccgag ggtcttcggg tgcttcccag cacaagctgc ccttgctgtc ctgtgcagtg 1860aagggagagg ccctgggtgg gggacactca gagtgggagc acatcccagc agtgcccatg 1920tagcaggagc acagtggatg gccttgtgtc cctcgggcat gacaggcaga aacgagggct 1980gctccaggag aagggcctcc tgctggccag agcaaggaag gctgagcagc ttggttctcc 2040cctctggccc ctggagagaa gggagcattc ctagacccct gggtgcttgt ctgcacagag 2100ctctggtctg tgccaccttg gccaggctgg ctgtgggagg gtctggtccc acgccgcctc 2160tgctcagaca ctgtgtggga gggcacagca cagctgcggg taaagtgtga gagcttgcca 2220tccagctcac gaagacagag ttattaaacc attacaaatc tc226權(quán)利要求
1.編碼TRAF2TR、含圖2a所示序列的DNA序列。
2.編碼TRAF2TD、含圖3a所示序列的DNA序列。
3.權(quán)利要求1的DNA，其中所說的DNA是cDNA。
4.權(quán)利要求2的DNA，其中所說的DNA是cDNA。
5.分離并純化的TRAF2TR多肽，它能抑制TNFα所調(diào)節(jié)途徑并包含如圖2b所示的氨基酸序列。
6.TRAF2TD多肽，它能抑制TNFα所調(diào)節(jié)途徑并包含如圖3b所示的氨基酸序列。
7.抑制患者體內(nèi)TNFα所調(diào)節(jié)途徑的方法，包括將能抑制TNFα所調(diào)節(jié)途徑的組合物引入所說患者的體內(nèi)。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所說的組合物是能表達TRAF2TR多肽的表達載體。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所說的組合物是能表達TRAF2TD多肽的表達載體。
10.權(quán)利要求7的方法，其中所說的組合物含TRAF2TR多肽和藥學可接受載體。
11.權(quán)利要求7的方法，其中所說的組合物含TRAF2TD多肽和藥學可接受載體。
12.抑制TNFα過度產(chǎn)生所涉及疾病的方法，包括將能抑制TNFα所調(diào)節(jié)途徑的組合物引入患者的體內(nèi)。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所說的組合物含能表達TRAF2TR的表達載體。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所說的組合物含能表達TRAF2TD的表達載體。
15.權(quán)利要求12的方法，其中所說的組合物含TRAF2TR多肽和藥學可接受載體。
16.權(quán)利要求12的方法，其中所說的組合物含TRAF2TD多肽和藥學可接受載體。
17.抑制涉及核因子κβ(NFκB)依賴型基因超活化的TNFα疾病的方法，包括將能抑制TNFα所調(diào)節(jié)途徑的組合物引入患者的體內(nèi)。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所說的組合物是能表達TRAF2TR的表達載體。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所說的組合物是能表達TRAF2TD的表達載體。
20.權(quán)利要求17的方法，其中所說的組合物含TRAF2TR多肽和藥學可接受載體。
21.權(quán)利要求17的方法，其中所說的組合物含TRAF2TD多肽和藥學可接受載體。
22.抑制涉及TNFα之發(fā)炎過程的方法，包括將能抑制TNFα所調(diào)節(jié)途徑的組合物引入患者體內(nèi)。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所說的組合物是能表達TRAF2TR的表達載體。
24.權(quán)利要求22的方法，其中所說的組合物是能表達TRAF2TD的表達載體。
25.權(quán)利要求22的方法，其中所說的組合物含TRAF2TR多肽和藥學可接受載體。
26.權(quán)利要求22的方法，其中所說的組合物含TRAF2TD多肽和藥學可接受載體。
27.權(quán)利要求22的方法，其中所說的涉及TNFα的發(fā)炎過程選自克隆病、牛皮癬、類風濕性關(guān)節(jié)炎、移植中的排斥反應(yīng)、炎性腸疾病、非胰島素依賴型的糖尿病和神經(jīng)變性疾病。
28.權(quán)利要求22的方法，其中所說的涉及TNFα的發(fā)炎過程是心血管疾病。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所說的心血管疾病選自(a)心肌梗死后的心臟缺血-再灌注損傷、冠狀動脈旁路手術(shù)、心臟移植或中風后CNS中的局部缺血-再灌注損傷；(b)高度冠狀動脈粥樣硬化斑的加重和斷裂；(c)充血性心力衰竭的發(fā)展和加重；(d)球囊血管成形術(shù)之后的內(nèi)皮細胞損傷；以及(e)心肌細胞的程序性細胞死亡。
30.編碼TRAF2TR/2TD變體的DNA序列。
31.權(quán)利要求30的DNA序列，其中所說的DNA序列包括保守的氨基酸取代。
32.能抑制TNFα所調(diào)節(jié)途徑的TRAF2TR/2TD變體多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及TRFA2的變體,它被證實具有抑制TNF－α信號傳導(dǎo)途徑的能力。具體地說,申請者已分離出TRAF2的剪接變體,在下文中被稱為“截短了的TRAF2”或“TRAF2TR”,以及具有增強的顯性失活特征的TRAF2表達構(gòu)建體,下文中被稱為“截短－缺失的TRAF2”或“TRAF2TD”。TRAF2TR和TRAF2TD均具有抑制TNF－α信號傳導(dǎo)途徑的能力,在TRAF2TD中,此能力得到了很大的提高,大大降低了它對TNF－α結(jié)合的應(yīng)答。
文檔編號A61P19/02GK1353754SQ00808279
公開日2002年6月12日 申請日期2000年4月6日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月30日
發(fā)明者G·H·希爾福斯三世, M·F·帕格諾尼, Y·D·伊瓦申科, K·郭, K·L·克拉克 申請人:阿溫蒂斯藥物制品公司