專利名稱：作為酪氨酸激酶抑制劑的取代的1,4－二氫茚并[1,2－c]吡唑的制作方法
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本發(fā)明涉及一些為蛋白激酶，尤其是酪氨酸激酶和絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑的具有4，5(3，4)-雙環(huán)稠合的3-芳基吡唑，其中一部分為新化合物，涉及含有這些吡唑類的藥用組合物以及這些吡唑類的制備方法。
酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸殘基上的這些磷酸化反應(yīng)，及其相反作用的磷酸酶反應(yīng)涉及無數(shù)的細(xì)胞過程，此構(gòu)成了對大量細(xì)胞內(nèi)信號(通常由細(xì)胞受體介導(dǎo))產(chǎn)生反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞功能、以及細(xì)胞過程的激活或失活的基礎(chǔ)。級聯(lián)蛋白激酶通常參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并為實(shí)現(xiàn)這些細(xì)胞過程所必須。由于它們普遍存在于這些過程，可以發(fā)現(xiàn)蛋白激酶是質(zhì)膜固有的一部分或者是胞質(zhì)酶或者定位于細(xì)胞核，且通常作為酶復(fù)合體的組分。在許多情況下，這些蛋白激酶是決定細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞過程在何時(shí)及何地發(fā)生的酶和結(jié)構(gòu)性蛋白復(fù)合體的基本單元。酪氨酸蛋白激酶酪氨酸蛋白激酶(PTKs)是催化細(xì)胞內(nèi)蛋白中特定酪氨酸殘基磷酸化反應(yīng)的酶。這些底物蛋白，通常是酶自身的這種轉(zhuǎn)移后修飾，充當(dāng)著細(xì)胞增殖、激活或分化的分子開關(guān)(其綜述參見，Schlessinger和Ulrich，1992，Neuron 9383-391)。已經(jīng)在多種疾病狀態(tài)中發(fā)現(xiàn)PTK活性異常或過量，包括良性和惡性增殖性疾病以及由免疫系統(tǒng)異常激活導(dǎo)致的疾病(例如，自身免疫性疾病)、異體移植排斥反應(yīng)和移植體抗宿主性疾病。此外，內(nèi)皮細(xì)胞特異性受體PTKs如KDR和Tie-2介導(dǎo)血管生成過程，并因此參與支持癌的發(fā)展以及與異常血管化相關(guān)的其它疾病(例如，糖尿病性視網(wǎng)膜病、由年齡相關(guān)的黃斑變性導(dǎo)致的脈絡(luò)膜新血管生成、牛皮癬、關(guān)節(jié)炎、新生兒血管瘤)的基礎(chǔ)。
酪氨酸激酶可以是受體型(具細(xì)胞外、跨膜及細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域)或非受體型(全部在細(xì)胞內(nèi))。受體酪氨酸激酶(RTKs)RTKs包括具有多種生物學(xué)活性的一個(gè)跨膜受體的大家族。目前，至少已經(jīng)確認(rèn)了十九(19)種不同的RTK亞家族。受體酪氨酸激酶(RTK)家族包括對于多種細(xì)胞類型的生長及分化極為重要的受體(Yarden和Ullrich，Ann.Rev.Biochem.57433-478，1988；Ullrich和Schlessinger，Cell 61243-254，1990)。RTKs的固有功能在結(jié)合配基時(shí)被激活，這導(dǎo)致受體和多重細(xì)胞內(nèi)底物磷酸化，并隨后導(dǎo)致多種細(xì)胞反應(yīng)(Ullrich和Schlessinger，1990，CeH 61203-212)。由此，受體酪氨酸激酶介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的是在細(xì)胞外與特定生長因子(配基)相互作用下啟動的，隨后通常形成受體二聚體，激發(fā)酪氨酸蛋白激酶的固有活性以及受體的轉(zhuǎn)移磷酸化。由此確立了細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的結(jié)合位點(diǎn)并且導(dǎo)致與許多細(xì)胞質(zhì)信號分子形成復(fù)合體而促進(jìn)適當(dāng)?shù)募?xì)胞反應(yīng)(例如，細(xì)胞分裂、分化、代謝作用、細(xì)胞外微環(huán)境改變)(參見Schlessinger和Ullrich，1992，Neuron 91-20)。
具有SH2(src同源性-2)或磷酸酪氨酸結(jié)合(PTB)域的蛋白與激活的酪氨酸激酶受體及其對傳入細(xì)胞的信號具有高度親和力的底物結(jié)合。這兩個(gè)域都識別磷酸酪氨酸(Fantl等，1992，Cell 69413-423；Songyang等，1994，Mol.Cell.Biol.142777-2785；Songyang等，1993，Cell 72767-778；Koch等，1991，Sience 252668-678；Shoelson，Curr.Opin.Chem.Biol.(1997)，1(2)，227-234；和Cowburn，Curr.Opin.Struct.Biol.(1997)，7(6)，835-838)。已經(jīng)鑒定出數(shù)種與受體酪氨酸激酶(RTKs)相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)底物蛋白。它們可以被分為兩個(gè)主要組別(1)具有催化域的底物；和(2)缺乏該區(qū)域但充當(dāng)調(diào)節(jié)物并與催化活性分子相關(guān)的底物(Songyang等，1993，Cell 72767-778)。受體或蛋白與其底物的SH2或PTB域之間相互作用的特異性由密切環(huán)繞磷酸化酪氨酸殘基的氨基酸殘基決定。例如，SH2域與特定受體上的磷酸酪氨酸殘基周圍的氨基酸序列的之間的結(jié)合親和性差異與所觀察到的它們的底物磷酸化特征的差異相關(guān)(Songyang等，1993，Cell 72767-778)。觀察表明各種受體酪氨酸激酶的功能不僅取決于它的表達(dá)形式和配基有效性，而且也取決于一系列的后續(xù)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，后者由特殊受體以及這些刺激的時(shí)間及時(shí)程激活。因此，磷酸化提供了一個(gè)重要的調(diào)節(jié)步驟，這決定著特定生長因子受體對所采用的信號途徑的選擇性，以及因子受體的差異性。
已發(fā)現(xiàn)數(shù)種受體酪氨酸激酶，以及與之結(jié)合的生長因子，在血管發(fā)生中起作用，盡管某些可能是間接地促進(jìn)血管生成(Mustonen和Alitalo，J.Cell Biol.129895-898，1995)。這些受體酪氨酸激酶之一，名為“胎肝激酶1”(FLK-1)，屬于RTKsIII型亞類的成員。人FLK-1的另一個(gè)名稱是“含激酶插入域的受體(kinase insert domain-containing receptor)”(KDR)(Terman等，Onccogene 61677-83，1991)。FLK-1/KDR的又一個(gè)名稱是“血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2”(VEGFR-2)因?yàn)樗愿叨鹊挠H和力與VEGF結(jié)合。小鼠FLK-1/VEGFR-2變型(version)還被稱作NYK(Oelrichs等，Oncogene 8(1)11-15，1993)。已經(jīng)分離出編碼小鼠、大鼠及人FLK-1的DNAs，并且其核苷酸及其編碼的氨基酸序列也被報(bào)道(Matthews等，Proc.Natl.Sci.USA，889026-30，1991；Terman等，1991，同上；Terman等，Biochem.Biophys.Res.Comm.1871579-86，1992；Sarzani等，同上；以及Millauer等，Cell 72835-846，1993)。許多研究如Millauer等(同上)所報(bào)道的那些，提示VEGF與FLK-l/KDR/VEGFR-2是分別在血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、以及血管形成和新生，即血管發(fā)生和血管生成中起重要作用的配基-受體對。
另一種稱作“鰭狀(fins-like)酪氨酸激酶-1”(Flt-1)的亞型IIIR TK與FLK-1/KDR相關(guān)(DeVries等，Science 255989-991，1992；Shibuya等，Oncogene 5519-524，1990)。Flt-1的另一個(gè)名稱是“血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體1”(VEGFR-1)。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)FLK-1/KDR/VEGFR-2和Flt-1/VEGFR-1亞家族成員主要在內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)。這些亞型成員由血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)家族的配基成員特異性激發(fā)(Klagsburn和D’Amore，Cytokine & Growth Factor Reviews7259-270，1996)。內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)與Flt-1接合的親和力高于與FLK-1/KDR接合的親和力，并且促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂(Terman等，1992，同上；Mustonen等，同上；DeVries等，同上)。據(jù)信在血管生成過程中Flt-1為內(nèi)皮組織所必需.Flt-1表達(dá)與小鼠胚胎中的早期血管生成、以及傷口愈合期的新血管生成有關(guān)(Mustonen和Alitalo，同上)。成人器官如腎小球中的Flt-1的表達(dá)提示該受體具有與細(xì)胞生長無關(guān)的其他功能(Mustonen和Alitalo，同上)。
如前文所述，新近的證據(jù)提示VEGF同時(shí)在刺激正常與病理的血管發(fā)生中均起作用(Jakeman等，Endocrinology 133848-859，1993；Kolch等，Breast Cancer Research and Treatment 36139-155；1995；Ferrara等，Endocrine Reviews 18(1)；4-25，1997；Ferrara等，血管生成調(diào)節(jié)(Regulation of Angiogenesis)(L.D.Goldberg和E.M.Rosen主編)，209-232，1997)。此外，VEGF還與控制和促進(jìn)血管通透性有關(guān)(Connolly等，J.Biol.Chem.26420017-20024，1989；Brown等，Regulation of Angiogenesis(血管生成調(diào)節(jié))(L.D.Goldberg和E.M.Rosen主編)，233-269，1997)。
來源于不同剪接的mRNA的不同形式的VEGF已經(jīng)被報(bào)道，包括Ferrara等描述的四種(J.Cell.Biochem.47211-218，1991)。Ferrara等(同上)鑒定了分泌及優(yōu)勢細(xì)胞相關(guān)種類(predominantly cell-associated species)的兩類VEGF，并且已知該蛋白以二硫鍵連接的二聚體形式存在。
幾個(gè)相關(guān)的VEGF同系物新近被鑒定。然而，它們在正常生理和疾病過程的作用尚未闡明。此外，VEGF家族成員在許多組織內(nèi)經(jīng)常與VEGF共表達(dá)，并且通常能夠與VEGF形成雜合二聚體。這種特性可能改變受體特異性以及雜合二聚體生物學(xué)作用并進(jìn)一步使闡明其下文描述的特定功能復(fù)雜化(Korpelainen和Alitalo，Curr.Opin.Cell Biol.，159-164，1998以及該文引用的參考文獻(xiàn))。
胎盤生長因子(PlGF)的氨基酸序列顯示出與VEGF序列的顯著同源性(Park等，J.Biol.Chem.26925646-54，1994；Maglione等，Oncogene8925-31，1993)。與VEGF類似，不同類型的PlGF來源于不同剪接的mRNA，并且該蛋白以二聚體形式存在(Park等，同上)。PlGF-1和PlGF-2與Flt-1結(jié)合具有高度親和力，并且PlGF-2還極易結(jié)合神經(jīng)纖維網(wǎng)因子-1(neuropilin-1)(Migdal等，J.Biol.Chem.273(35)22272-22278)，但兩者均不結(jié)合FLK-1/KDR(Park等，同上)。據(jù)報(bào)道PlGF既促進(jìn)血管通透性也促進(jìn)低濃度存在的VEGF對內(nèi)皮細(xì)胞的致分裂作用(推測是由雜合二聚體形成所引致)(Park等，同上)。
以兩種同工型形式(167和185個(gè)殘基)生成的VEGF-B似乎也結(jié)合Flt-1/VEGFR-1。它可能通過調(diào)節(jié)尿激酶類纖溶酶原激活因子及纖溶酶原激活因子抑制物-1的表達(dá)及活性而在調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)降解、細(xì)胞粘附、和遷移中發(fā)揮作用(Pepper等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1998)，95(20)11709-11714)。
主要由淋巴結(jié)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的VEGF-C最初是作為VEGFR-3/Flt-4的配基被克隆。在其完整生成形式下，VEGF-C也可以結(jié)合KDR/VEGFR-2而且在體外刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增生和遷移并在活體模型中刺激血管生成(Lymboussaki等，Am.J.Pathol(1998)，153(2)395-403；Witzenbichler，等，Am.J.Pathol(1998)，153(2)381-394)。VEGF-C轉(zhuǎn)基因過量表達(dá)僅導(dǎo)致淋巴管增生和膨大，而血管則不受影響。與VEGF不同，VEGF-C的表達(dá)不受低氧誘導(dǎo)(Ristimaki等，J.Biol.Chem.(1998)，273(14)，8413-8418)。
最新發(fā)現(xiàn)的VEGF-D在結(jié)構(gòu)上與VEGF-C非常相似。據(jù)報(bào)道VEGF-D至少結(jié)合并激活兩種VEGFRs，VEGFR-3/Flt-4和KDR/VEGFR-2。其最初作為c-fos可誘導(dǎo)的成纖維母細(xì)胞促分裂素被克隆并且主要在肺和皮膚間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)(Achen等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1998)，95(2)，548-553以及該文參考文獻(xiàn))。
據(jù)稱在活體Miles分析中皮膚組織注射VEGF-C和VEGF-D時(shí)引起血管通透性增加(PCT/US97/14696；WO98/07832，Witznbichler等，同上)。這些配基在其表達(dá)的組織中在調(diào)節(jié)血管高通透性以及內(nèi)皮細(xì)胞的反應(yīng)中的生理學(xué)作用及重要性尚待闡明。
基于VEGF和VEGFRs的其它同系物以及配基與受體雜合二聚作用的新發(fā)現(xiàn)，這些VEGF同系物的作用可能涉及形成VEGF配基雜合二聚體和/或受體雜合二聚體化，或結(jié)合尚未發(fā)現(xiàn)的VEGFR(Witzenbichler等，同上)。新近報(bào)道還指出神經(jīng)纖維網(wǎng)因子-1(Migdal等，同上)或VEGFR-3/Flt-4(Witzenbichler等，同上)，或非KDR/VEGFR-2的其它受體可能負(fù)責(zé)誘導(dǎo)血管通透性(Stacker，S.A.，Domagala，T.，Nice，E.，和Wilks，A.F.，“血管生成與腫瘤”學(xué)術(shù)會(“Angiogenesis and Cancer”Conference)，美國癌癥研究學(xué)會(Amer.Assoc.Cancer Res.)，1998年1月，Orlando，F(xiàn)L；Williams，Diabetelogia40S118-120(1997))。迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)KDR在VEGF介導(dǎo)的血管高通透性中的基礎(chǔ)作用的直接證據(jù)。非受體酪氨酸激酶非受體酪氨酸激酶代表缺乏胞外及跨膜序列的細(xì)胞酶的集合。目前，已經(jīng)鑒定至少24種獨(dú)特的非受體酪氨酸激酶，包括十一(11)個(gè)亞家族(Src，F(xiàn)rk，Btk，Csk，Abl，Zap70，F(xiàn)es/Fps，F(xiàn)ak Jak，Ack和LIMK)。目前，非受體酪氨酸激酶的Src亞家族包括的PTKs數(shù)量最多并包括Scr，Yes，F(xiàn)yn，Lyn，Lck，Blk，Hck，F(xiàn)gr和Yrk。已發(fā)現(xiàn)Src亞家族的酶與腫瘤發(fā)生相關(guān)。Bolen，1993，Oncogene 82025-2031提供了對非受體酪氨酸激酶的更詳細(xì)的討論，其通過參考文獻(xiàn)結(jié)合到本文中。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多酪氨酸激酶，不論是RTK或非受體酪氨酸激酶，所涉及的細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑與多種病原性疾病相關(guān)，包括癌癥、牛皮癬、以及其它高增殖性疾病或高免疫性疾病。調(diào)節(jié)PTKs的化合物的進(jìn)展由于總結(jié)認(rèn)識到PTKs在控制、調(diào)節(jié)和調(diào)整細(xì)胞增殖、與非正常的細(xì)胞增殖相關(guān)的疾病和紊亂中的重要性，已經(jīng)采用多種途徑嘗試鑒定出受體或非受體酪氨酸激酶“抑制劑”，包括采用突變型配基(美國專利No.4966849)、可溶性受體及抗體(專利申請?zhí)朩O 94/10202；Kendall & Thomas，1994，Proc.Natl.Acad.Sci 9010705-09；Kim等，1993，Nature 362841-844)、RNA配基(Jellinek，等Biochemistry3310450-56；Takano等1993，Mol.Bio.Cell 4358A；Kinsella，等，1992，Exp.Cell Res.19956-62；Wright，等，1992，J.Cellular Phys.152448-57)以及酪氨酸激酶抑制劑(WO 94/03427；WO 92/21660；WO 91/15495；WO 94/14808；美國專利No.5330992；Mariani等，1994，Proc.Am.Assoc.Cancer Res.352268)。
最近，進(jìn)行了鑒定作為酪氨酸激酶抑制劑的小分子的嘗試。例如，雙單環(huán)、雙環(huán)或雜環(huán)芳基化合物(PCT WO 92/20642)和亞乙烯基-氮雜吲哚衍生物(PCT WO 94/14808)已作為酪氨酸激酶抑制劑被普遍描述。苯乙烯基化合物(美國專利No.5217999)、苯乙烯基取代的吡啶基化合物(美國專利No.5302606)、某些喹唑啉衍生物(歐洲專利申請書No.0566266A1；Expert Opin.Ther.Pat.(1998)，8(4)475-478)、硒代吲哚類和硒化物(PCT WO 94/03427)、三環(huán)多羥基化合物(PCT WO92/21660)以及芐基膦酸化合物(PCT WO 91/15495)已作為用作酪氨酸激酶抑制劑而用于治療癌癥的化合物被公開。苯胺基鄰二氮雜萘類(PCT WO 97/34876)和喹唑啉衍生物化合物(PCT WO 97/22596，PCTWO 97/42187)已作為血管生成和血管滲透性抑制劑被描述。
此外，已經(jīng)進(jìn)行了鑒定作為絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑的小分子的嘗試。特別是，已經(jīng)描述了作為雙(吲哚基馬來酰亞胺)化合物可抑制PKC絲氨酸/蘇氨酸激酶同工型，其功能障礙在VEGF相關(guān)疾病中與血管通透性改變有關(guān)(PCT WO97/40830，PCT WO97/40831)。
因此鑒定出通過調(diào)節(jié)受體或非受體酪氨酸和絲氨酸/蘇氨酸激酶活性而調(diào)節(jié)或修正異常或不適當(dāng)?shù)募?xì)胞增殖、分化、或代謝的特異性抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的小分子化合物是需要的。特別是，對于導(dǎo)致水腫、腹水、隙透、滲出液、及大分子滲出與基質(zhì)沉積以及相關(guān)疾病的血管生成過程或形成血管高通透性所必需的酪氨酸激酶的功能，鑒定其特異性抑制方法及化合物是有益的。
本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員能夠理解，當(dāng)n不是0或1時(shí)R2基團(tuán)可能相同或不同。
術(shù)語任選取代的氨基是指式NRkRl基團(tuán)，其中Rk和Rl獨(dú)立地代表氫、C1-12烷基、C1-12烷氧基、C3-12環(huán)烷基、苯基、苯基C1-6烷基、雜芳基或雜芳基C1-6烷基，其中所述各基團(tuán)任選被一個(gè)或多個(gè)下列基團(tuán)取代C1-6烷基、C1-6烷氧基、羥基、鹵素；或Rk和Rl與它們所連接的氮原子共同代表一個(gè)五、六或七元飽和雜環(huán)，其任選含選自O(shè)、S或N的另外雜原子并任選被C1-6烷基取代。
本文采用的涉及苯基和雜芳基的術(shù)語“任選取代”是指被一個(gè)或多個(gè)下列基團(tuán)取代a)鹵素，b)任選被一個(gè)或多個(gè)下列基團(tuán)取代的C1-6烷基羥基、鹵素、任選取代的氨基或五、六或七元飽和含氮雜環(huán)，其任選另含選自O(shè)、S或N的雜原子并任選被C1-6烷基取代，其中所述飽和環(huán)通過碳原子連接，c)C1-6烷氧基，其任選被一個(gè)或多個(gè)下列基團(tuán)取代羥基；C1-6烷氧基；鹵素；或任選取代的氨基，條件是這些基團(tuán)不與連接烷氧基的氧原子的碳原子連接，或五、六或七元飽和含氮雜環(huán)其任選另含選自O(shè)、S或N的雜原子并任選被C1-6烷基取代，其中所述飽和環(huán)通過碳原子連接，d)任選取代的苯氧基，e)羥基，f)式CORa基團(tuán)，其中Ra代表羥基、C1-6烷氧基或Ra代表式NRbRc基團(tuán)，其中Rb和Rc獨(dú)立地代表氫、C1-12烷基、C3-12環(huán)烷基或苯基，其中烷基、環(huán)烷基和苯基任選被一個(gè)或多個(gè)下列基團(tuán)取代羥基、鹵素、C3-12環(huán)烷基或式NRhRj的氨基，其中Rh和Rj獨(dú)立地代表氫或C1-6烷基或其中Rh和Rj與它們所連接的氮原子共同代表一個(gè)五、六或七元飽和雜環(huán)，其任選另含選自O(shè)、S或N的雜原子并任選被C1-6烷基取代，g)式NRdRe基團(tuán)，其中Rd和Re相互獨(dú)立地選自氫、C1-12烷基、C3-12環(huán)烷基或苯基或式CORf基團(tuán)，其中Rf代表氫、C1-12烷基、C3-12環(huán)烷基、苯基C1-6烷基或苯基，其中在各種情況下，烷基、環(huán)烷基和苯基任選被一個(gè)或多個(gè)下列基團(tuán)取代鹵素、羥基、硝基或式NRhRj的氨基，其中Rh和Rj同前文定義，h)式O(CH2)mRg基團(tuán)，其中m是2、3、4或5且Rg代表羥基或式NRdRe基團(tuán)其中Rd和Re同前文定義；或Rg代表式CORa基團(tuán)其中Ra同前文定義且m是1、2、3、4或5，i)硝基，j)任選取代的苯基C1-6烷基，k)任選取代的苯基C1-6烷氧基，l)氰基，m)C3-6鏈烯氧基，n)吡啶氧基或吡啶硫基，其中吡啶環(huán)任選被一個(gè)或多個(gè)下列基團(tuán)取代三氟甲基或硝基，o)羥基脒基，p)氨基甲基，q)甲酰氨基甲基，r)C1-6烷硫基，s)苯基或t)C24鏈烯基或C24鏈炔基，其中每個(gè)均任選被苯基取代，而該苯基任選被一個(gè)或多個(gè)下列基團(tuán)取代C1-6烷基、C1-6烷氧基或鹵素。
術(shù)語雜芳基是指任選取代的單或雙環(huán)芳族雜環(huán)，其中雜環(huán)含有1、2、3或4個(gè)選自氮、硫或氧的雜原子。該雜芳基可以通過碳或雜原子連接。合適的雜芳基包括咪唑基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、噁唑基、噻唑基、異噁唑基、噻二唑基、噁二唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噠嗪基、喹啉基、異喹啉基、吲唑基、苯并噁唑基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、中氮茚基、咪唑并吡啶基或苯并(b)噻吩基，其中各基團(tuán)如前文所述被任選取代。
當(dāng)任選取代的氨基代表飽和雜環(huán)時(shí)該環(huán)優(yōu)選為嗎啉基、全氫噻嗪-4-基、哌啶子基、吡咯烷-1-基、哌嗪-1-基、4-甲基哌嗪-4-基、硫雜嗎啉基、全氫-1，4-二氮雜-1-基或全氫氮雜基。
術(shù)語取代的亞甲基是指，例如，亞甲基被一個(gè)或多個(gè)下列基團(tuán)取代羥基或C1-4烷基，其中烷基任選進(jìn)一步被式N-RrRs基團(tuán)取代其中Rr和Rs相互獨(dú)立地代表H或C1-6烷基。
應(yīng)當(dāng)理解本文中提及的任何基團(tuán)含有三個(gè)或三個(gè)以上原子的鏈時(shí)表示其基團(tuán)中的鏈可以是直鏈或支鏈的。例如，烷基可以包括丙基，其包括正丙基、異丙基，及丁基，其包括正丁基、仲丁基、異丁基和叔丁基。術(shù)語C3-12環(huán)烷基包括橋聯(lián)基團(tuán)例如金剛烷基。術(shù)語“鹵素”用于本文時(shí)表示氟、氯、溴和碘。
X優(yōu)選為CH2或S。
第一組優(yōu)選的式I化合物中，X為CH2且A是NR25。
第二組優(yōu)選的式I化合物中，X為S且A是NR25。
第三組優(yōu)選的式I化合物中，X為CH2且A是HNSO2。
第四組優(yōu)選的式I化合物中，X為CH2且A是SO2NH。
第五組優(yōu)選的式I化合物中，X為CH2且A是CONH。
第六組優(yōu)選的式I化合物中，X為CH2且A是HNCO。
在最優(yōu)選的式I化合物中，X為CH2、A是NR25、L1是(CH2)q其中q是1至6的整數(shù)且亞烷基鏈任選被一個(gè)或多個(gè)下列基團(tuán)取代任選被一個(gè)或多個(gè)羥基、鹵素或任選取代的氨基取代的C1-6烷基；任選被一個(gè)或多個(gè)羥基、鹵素或任選取代的氨基取代的C1-6烷氧基；羥基；鹵素；或任選取代的氨基；L2是一個(gè)鍵且R1是任選取代的吡啶基。
式I化合物可以作為與藥學(xué)上可接受的酸所成的鹽存在。本發(fā)明包括這些鹽。這些鹽的實(shí)例包括鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、甲磺酸鹽、硝酸鹽、馬來酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、延胡索酸鹽、酒石酸鹽[例如(+)-酒石酸鹽、(-)-酒石酸鹽或其混合物包括外消旋混合物]、琥珀酸鹽、苯甲酸鹽以及與氨基酸例如谷氨酸形成的鹽。這些鹽可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備。
某些含有酸性取代基的式I化合物可以作為與藥學(xué)上可接受的堿所成的鹽存在。本發(fā)明包括這些鹽。這些鹽的實(shí)例包括鈉鹽、鉀鹽、賴氨酸鹽和精氨酸鹽。這些鹽可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備。
某些式I化合物及其鹽可以一種以上的晶體形式存在而本發(fā)明包括各種晶體形式及其混合物。
某些式I化合物及其鹽還可以溶劑化物形式存在，例如水化物，而本發(fā)明包括各種溶劑化物及其混合物。
某些式I化合物可能存在一個(gè)或多個(gè)手性中心，并存在不同的光學(xué)活性形式。當(dāng)式I化合物含有一個(gè)手性中心時(shí)，該化合物以兩種對映異構(gòu)體形式存在而本發(fā)明包括兩種對映體以及對映體的混合物。該對映體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的方法析分，例如通過形成可以被分離的非對映異構(gòu)的鹽，例如，通過結(jié)晶化；通過形成可以被被分離的的非對映異構(gòu)體衍生物或復(fù)合體，例如，通過結(jié)晶、氣-液或液相色譜；一種對映體選擇性地與對映體特異性試劑反應(yīng)，例如，酶促酯化反應(yīng)；或手性環(huán)境下的氣-液或液相色譜，例如與手性配基結(jié)合的硅膠或手性溶劑中的手性載體。應(yīng)當(dāng)理解當(dāng)通過上述分離方法之一將所需對映體轉(zhuǎn)化為另一種化學(xué)實(shí)體時(shí)，還需要釋放所需的對映體另外步驟?；蛘?，可以通過采用光學(xué)活性的試劑、底物、催化劑或溶劑通過不對稱合成，或通過不對稱轉(zhuǎn)化將一種對映體轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N而合成特定的對映體。
當(dāng)式I化合物含有一個(gè)以上的手性中心時(shí)，其可能以非對映異構(gòu)體形式存在。成對的非對映異構(gòu)體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員所知的方法分離，例如色譜法或結(jié)晶法而每對中的單一對映體可以如前所述進(jìn)行分離。本發(fā)明包括式I化合物的各種非對映異構(gòu)體及其混合物。
某些式I化合物可能以不同的互變異構(gòu)體形式或作為不同的幾何異構(gòu)體存在，而本發(fā)明包括式I化合物的每種互變異構(gòu)體和/或幾何異構(gòu)體以及它們的混合物。
某些式I化合物可能以不同的可分離的穩(wěn)定構(gòu)象形式存在。由于一個(gè)不對稱單鍵的限制性旋轉(zhuǎn)所致的扭轉(zhuǎn)不對稱性，例如由于立體阻礙或環(huán)張力，可能使不同構(gòu)象被分離。本發(fā)明包括式I化合物的每種構(gòu)象異構(gòu)體以及它們的混合物。
某些某些式I化合物可能以兩性離子形式存在而本發(fā)明包括式I化合物的各種兩性離子形式以及它們的混合物。
本發(fā)明化合物用作絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸激酶抑制劑。特別是，本發(fā)明化合物用作酪氨酸激酶抑制劑，它對于高增殖性疾病，特別是在血管生成過程中是重要的。由于這些化合物是抗血管生成劑，因此它們是重要的抑制以血管生成為重要成分的疾病發(fā)展的物質(zhì)。
現(xiàn)在給出這些物質(zhì)的優(yōu)選定義。
R1優(yōu)選代表任選取代的苯基、任選取代的噻吩基、任選取代的吡啶基、任選取代的呋喃基或任選取代的吡咯基。
更加優(yōu)選的R1代表2-噻吩基、3-噻吩基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基，其中每一個(gè)均任選被取代，以及任選為一、二和三取代的苯基，其中取代基選自任選取代的烷氧基(特別是甲氧基、3-嗎啉基丙氧基、2-嗎啉基乙氧基、3-羧基丙氧基、羧基甲氧基、2-羧基乙氧基、2-氨甲酰基乙氧基、氨甲?；籽趸?-氨甲?；趸?-哌啶基乙氧基、2-(哌嗪-1-基)乙氧基、2-(吡咯烷-1-基)乙氧基、2-二甲氨基乙氧基、2-(全氫噻嗪-4-基)乙氧基、3-哌啶基丙氧基、3-(哌嗪-1-基)丙氧基、3-(吡咯烷-1-基)丙氧基、3-二甲氨基丙氧基、3-(全氫噻嗪-4-基)丙氧基)、低級烷基(特別是甲基)、鹵素(特別是氟和氯)、芳基(特別是苯基)、羥基、芳氧基(特別是苯氧基)、芳基烷氧基(特別是芐氧基)、二-低級烷基氨基(特別是二甲氨基)、多鹵代低級烷基、多鹵代低級烷氧基(特別是三氟甲氧基)、硝基、氰基、低級烷硫基(特別是甲硫基)、羧基、低級烷氧基羰基(特別是甲氧羰基)、酰氨基(特別是乙酰氨基和苯甲酰氨基)以及任選取代的氨基甲酰基(特別是氨基甲?；-甲基氨基甲?；?、N-苯基氨基甲?；?和吡啶基氧基或吡啶基硫基，其中吡啶環(huán)任選被一個(gè)或多個(gè)下列取代基取代三氟甲基或硝基。
最優(yōu)選的R1代表4-吡啶基、2-甲酰氨胺甲基-4-吡啶基、2-氨基甲基-4-吡啶基、2-(羥基脒基)-4-吡啶基、2-氨基甲?；?4-吡啶基、4-吡啶基-N-氧化物、2-氯-4-吡啶基、2-氰基-4-吡啶基、5-甲基-2-呋喃基、5-(2-硝基-4-三氟甲基苯基)呋喃-2-基、苯基、4-甲氧基苯基、3-甲氧基苯基、2-甲氧基苯基、3，4-二甲氧基苯基、3，4，5-三甲氧基苯基、4-(3-嗎啉基丙氧基)苯基、4-(2-嗎啉基乙氧基)苯基、4-(3-羧基丙氧基)苯基、4-羧基甲氧基苯基、4-(3-氨基甲?；趸?苯基、4-氨甲?；籽趸交?-(3-嗎啉基-丙氧基)苯基、3-(2-嗎啉基乙氧基)苯基、3-(3-羧基-丙氧基)苯基、4-羧基甲氧基苯基、3-(3-氨基甲酰基丙氧基)苯基、3-氨基甲酰基甲氧基苯基、2-羥基苯基、3-羥基苯基、4-羥基苯基、3-羥基-4-甲氧基苯基、4-羥基-3-甲氧基苯基、4-二氟甲氧基苯基、3-硝基苯基、4-硝基苯基、3，5-二-叔丁基-4-羥基苯基、4-甲基苯基、4-氟苯基、2-氯苯基、3-氯苯基、4-氯苯基、2，4-二氯苯基、2-氯-5-硝基苯基、4-氟-2-氯苯基、4-甲硫基苯基、4-聯(lián)苯基、3-苯氧基苯基、4-苯氧基苯基、4-芐氧基苯基、4-二甲基氨基苯基、4-二乙基氨基苯基、4-甲氧羰基苯基、4-氨基甲?；交?-氰基苯基、4-N-甲基氨基甲?；交?-N-苯基氨基甲?；交?、4-乙酰氨基苯基、4-苯甲酰氨基苯基、4-羧基苯基、4-[N-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰基]苯基、4-(丙-1-烯氧基)苯基、3-(2-羥基乙氧基)苯基、3-(N-(2-二乙基氨基乙基)-氨基甲?；籽趸?苯基、3-[3-(N-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰基)丙氧基]苯基、4-(N-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲?；籽趸?苯基、4-[3-(N-(2-二乙基氨基乙基)-氨基甲?；?丙氧基]苯基、2-呋喃基、5-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]-2-呋喃基、3-溴-2-噻吩基、5-甲氧基-2-呋喃基、5-(2-硝基-4-三氟甲基苯基)-2-呋喃基、3-N-(2-嗎啉基乙基)氨基甲酰基甲氧基)苯基、3-[3-(N-(2-嗎啉基乙基)氨基甲酰基)丙氧基苯基]、4-(N-(2-嗎啉基乙基)-氨基甲?；籽趸?苯基、4-(嗎啉基乙酰氨基)苯基和4-[3-(N-(2-嗎啉基乙基)氨基甲酰基)丙氧基]-苯基。
優(yōu)選的R3、R4、R5和R6獨(dú)立地代表氫、鹵素(尤其是氟)、任選取代的低級烷氧基(尤其是甲氧基、3-嗎啉基丙氧基、2-嗎啉基乙氧基、3-羧基丙氧基、羧基甲氧基、2-羧基乙氧基、2-氨基甲酰基乙氧基、3-氨基甲?；趸?、2-哌啶基乙氧基、2-(哌嗪-1-基)乙氧基、2-(吡咯烷-1-基)乙氧基、2-二甲基氨基乙氧基、2-(全氫噻嗪-1-基)乙氧基、3-哌啶基丙氧基、3-(哌嗪-1-基)丙氧基、3-(吡咯烷-1-基)丙氧基、3-二甲基氨基丙氧基、3-(全氫噻嗪-4-基)丙氧基)、氨基甲?；籽趸?、羥基丙氧基、羥基乙氧基、(3-嗎啉基)丙氧基和(2-嗎啉基)丙氧基、酰氨基(尤其是乙酰氨基和苯甲酰氨基)、任選取代的氨基甲?；?尤其是氨基甲?；?、N-甲基-氨基甲酰基和N-苯基氨基甲?；?、羧基、硝基和氨基。
更優(yōu)選R3、R4、R5和R6代表下列基團(tuán)6，7-二甲氧基、6，7，8-三甲氧基、6-氟、6-乙酰氨基、7-甲氧基、6-氨基甲?；?、6-(N-甲基-氨基甲?；?、6-(N-苯基氨基甲酰基)、(3-嗎啉基)丙氧基和(2-嗎啉基)乙氧基。
本文所用術(shù)語“低級”是指具有1至6個(gè)碳原子的基團(tuán)。
本發(fā)明特別優(yōu)選的化合物包括4-(1，4-二氫茚并[1，2-c]吡唑)-N-(4-吡啶基)芐胺N-[4-(1，4-二氫茚并[1，2-c]吡唑-3-基)苯基]苯磺酰胺4-(1，4-二氫茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-(2-甲氧基乙基)苯甲酰胺4-(1，4-二氫茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-(4-硝基苯基)苯甲酰胺4-(1，4-二氫茚并[1，2-c]吡唑-3-基)咪唑-1-基乙酰苯胺4-(1，4-二氫茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-[2-(咪唑-1-基)乙基]苯胺4-(1，4-二氫茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-(2-嗎啉基乙基)苯磺酰胺4-(1，4-二氫茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-(2-甲氧基乙基)苯磺酰胺N-[2-(N，N-二乙基氨基)乙基]-4-(1，4-二氫茚并[1，2-c]吡唑-3-基)芐胺N-[2-(N，N-二乙基氨基)乙基]-4-(1，4-二氫茚并[1，2-c]吡唑-3-基)苯磺酰胺4-(1，4-二氫茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-(2-嗎啉基乙基)芐胺N-(4-乙氧基苯基)-4-(1，4-二氫茚并[1，2-c]吡唑-3-基)芐胺(S)-4-(1，4-二氫茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-(吡咯烷-2-基甲基)苯甲酰胺4-(1H-[1]苯并噻吩并[3，2-c]吡唑-3-基)-N-[3-(咪唑-1-基)丙基]芐胺4-(1H-[1]苯并噻吩并[3，2-c]吡唑-3-基)-N-(2-嗎啉基乙基)芐胺以及它們藥學(xué)上可接受的鹽，包括各對映體以及對映體的混合物。
本發(fā)明提供抑制酪氨酸激酶和絲氨酸/蘇氨酸激酶的酶活性的方法，其包括將有效濃度的抑制所述激酶的酶活性的式I表示的化合物給予所述激酶。
本發(fā)明還包括這些化合物在含有藥學(xué)上有效量的上述化合物和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑的藥用組合物中的用途。這些藥用組合物可以給予個(gè)體以減慢或阻止伴有血管生成促成的疾病中的血管生成進(jìn)程，或治療水腫、滲漏、滲出、或腹水以及其它與血管通透性過高相關(guān)的疾病。本發(fā)明詳述本發(fā)明化合物具有抗血管生成特性。這些抗血管生成特性至少部分地是由于抑制血管生成過程所必需的酪氨酸蛋白激酶。因?yàn)槿绱?，這些化合物可以用作抗如下疾病狀態(tài)的活性藥物如關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化、牛皮癬、血管瘤、心肌血管增生、冠脈或大腦血管側(cè)枝形成(collaterals)、缺血肢端(limb)血管生成、傷口愈合、螺桿菌相關(guān)性消化道潰瘍性疾病、骨折、貓抓熱、潮紅、血管新生性青光眼和視網(wǎng)膜病如那些與糖尿病相關(guān)的視網(wǎng)膜病或年齡相關(guān)性肌肉退化。此外，部分這些化合物可以用作抗實(shí)體瘤、惡性腹水、血癌和高增殖性疾病如甲狀腺增生(尤其是Grave氏病)和囊腫(例如卵巢基質(zhì)特征性血管過多的多囊卵巢綜合征(Stein-Leventhal綜合征))的活性藥物，因?yàn)檫@些疾病需要血管細(xì)胞的增殖而生長和/或轉(zhuǎn)移。
此外，部分這些化合物可以用作活性藥物而抗灼傷、慢性肺病、中風(fēng)、息肉、過敏反應(yīng)、慢性和過敏性炎癥、卵巢過度刺激(hyperstimulation)綜合征、腦腫瘤相關(guān)性大腦水腫、高(high-altitude)、外傷或低氧導(dǎo)致的大腦或肺水腫、眼和黃斑水腫、腹水、以及其它以血管通透性過高、積液、滲漏、血管內(nèi)蛋白滲出、或水腫為顯著特征的疾病。這些化合物還可以用于治療血管內(nèi)蛋白滲出引起纖維蛋白以及細(xì)胞外基質(zhì)沉積、促進(jìn)基質(zhì)增生的疾病(例如，纖維變性、硬化和腕管綜合征)。
VEGF’s是已知唯一促進(jìn)血管通透性過高并形成水腫的血管生成的獨(dú)特的生長因子。事實(shí)上，與表達(dá)或給予許多其它生長因子相關(guān)的血管通透性過高看來是由VEGF生成而介導(dǎo)的。炎癥細(xì)胞因子刺激VEGF的生成。低氧導(dǎo)致多種組織內(nèi)VEGF的顯著上調(diào)，這些情形涉及通常由于VEGF/VPF介導(dǎo)的反應(yīng)導(dǎo)致的梗死、閉塞、局部缺血、貧血或血管損傷。血管通透性過高、相關(guān)性水腫、穿過內(nèi)皮的交換的改變以及血管內(nèi)大分子滲出，其經(jīng)常伴隨著血細(xì)胞滲出，可導(dǎo)致基質(zhì)過度沉積、迷管基質(zhì)增生、纖維變性，等等。因此，VEGF-介導(dǎo)的血管通透性過高在具有這些病因?qū)W特征的疾病中可能是重要誘因。
已發(fā)現(xiàn)與KDR/VEGFR-2和/或Flt-1/VEGF-1酪氨酸激酶相關(guān)的蛋白酪氨酸激酶可以介導(dǎo)上文列舉的疾病達(dá)到顯著程度。通過抑制這些酪氨酸激酶，因?yàn)樽鳛椴∏榻M成部分的血管生成或血管通透性過高被嚴(yán)重削弱而使上列疾病的進(jìn)程被阻止。對于較低選擇性的酪氨酸激酶抑制劑使用時(shí)可能發(fā)生的副作用，本發(fā)明化合物的作用，以其對特定酪氨酸激酶的選擇性而使之最小化。
本發(fā)明化合物對蛋白激酶具有抑制活性。即，這些化合物調(diào)節(jié)通過蛋白激酶的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。本發(fā)明化合物抑制絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸類蛋白激酶。特別是，這些化合物選擇性抑制KDR/FLK-1/VEGFR-2酪氨酸激酶活性。本發(fā)明的某些化合物還抑制其它酪氨酸激酶例如Ftl-1/VEGFR-1、Src-亞家族激酶如Lck、Src、fyn、yes等的活性。此外，本發(fā)明的部分化合物顯著抑制絲氨酸/蘇氨酸激酶如在細(xì)胞周期進(jìn)程中具有重要作用的CDKs。本發(fā)明的一般化合物對特定激酶的作用強(qiáng)度和特異性通常通過取代基(即，R1，R2，R3，R4，R5和R6)的性質(zhì)、數(shù)量和排列以及構(gòu)象限制的變化而改變和優(yōu)化。此外某些化合物的代謝產(chǎn)物也具有顯著的蛋白激酶抑制活性。
本發(fā)明化合物，當(dāng)對需要這些化合物的個(gè)體給藥時(shí)，抑制這些個(gè)體的血管通透性過高以及水腫的形成。可以相信，這些化合物通過抑制與血管通透性過高及水腫形成進(jìn)程有關(guān)的KDR酪氨酸激酶活性而起作用。此KDR酪氨酸激酶也被稱為FLK-1酪氨酸激酶、NYK酪氨酸激酶或VEGFR-2酪氨酸激酶。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)或其它活性配基(例如，VEGF-C、VEGF-D或HIV Tat蛋白)與分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的KDR酪氨酸激酶受體的結(jié)合時(shí)KDR酪氨酸激酶被激活。這些KDR酪氨酸激酶激活后，隨之發(fā)生血管通透性過高并且液體從血流中穿過血管壁進(jìn)入組織間隙，由此形成水腫區(qū)域。該反應(yīng)常常還伴有血細(xì)胞滲出。類似地，過高的血管通透性能夠破壞重要組織和器官(例如，肺和腎)中正常的跨內(nèi)皮的分子交換，由此導(dǎo)致血管內(nèi)大分子滲出和沉積。據(jù)信KDR刺激的急性反應(yīng)能夠促進(jìn)其后的血管生成進(jìn)程，在此之后KDR酪氨酸激酶的長時(shí)刺激導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞增生和趨化性以及形成新的血管。通過抑制KDR酪氨酸激酶活性，或者通過阻斷激活配基的生成，通過阻斷活性配基與KDR酪氨酸激酶受體結(jié)合，通過防止受體二聚化及磷酸根轉(zhuǎn)移，通過抑制KDR酪氨酸激酶的酶活性(抑制酶的磷酸化功能)或通過某些干擾信號傳遞的其它機(jī)制(D.Mukhopedhyay等，Cancer Res.581278-1284(1998)及其參考文獻(xiàn))，可以抑制和最大限度地減少血管通透性過高，以及與之相關(guān)的血管外滲、后續(xù)水腫形成及基質(zhì)沉積，和血管生成反應(yīng)。
一組優(yōu)選的本發(fā)明化合物具有抑制KDR酪氨酸激酶活性而不會顯著抑制Flt-1酪氨酸激酶活性(Flt-1酪氨酸激酶又稱VEGFR-1酪氨酸激酶)的活性。VEGF分別與KDR酪氨酸激酶受體及與Flt-1酪氨酸激酶受體結(jié)合而激活KDR酪氨酸激酶和Flt-1酪氨酸激酶。由于Flt-1酪氨酸激酶活性可能在血管內(nèi)皮完整性及血管功能中介導(dǎo)重要事件，抑制該酶活性可能導(dǎo)致毒性作用或副作用。至少，這種抑制對于阻斷血管生成反應(yīng)、降低血管通透性過高以及水腫形成并非必要，因而對于個(gè)體來說是多余和沒有價(jià)值的。某些優(yōu)選的本發(fā)明化合物是獨(dú)特的，因?yàn)樗鼈円种朴苫罨呐浠せ畹腣EGF-受體酪氨酸激酶(KDR)活性而不抑制其它酪氨酸激酶受體，例如Flt-1，其由某些活性配基激活。因此，優(yōu)選的本發(fā)明化合物是在其酪氨酸激酶抑制活性中具有選擇性的。
本發(fā)明化合物還用于治療潰瘍-細(xì)菌性、真菌性、莫倫氏潰瘍和潰瘍性結(jié)腸炎。
本發(fā)明化合物還用于治療發(fā)生于病毒感染中如單純皰疹、帶狀皰疹、AIDS、卡波濟(jì)氏肉瘤，原生動物感染和弓形體病，繼發(fā)于外傷、輻射、中風(fēng)、子宮內(nèi)膜異位、子宮過度刺激綜合征，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，肉瘤樣結(jié)節(jié)病，滑膜炎，克羅恩氏病，鐮刀狀紅細(xì)胞貧血，萊姆氏病，類天皰瘡，佩吉特氏病，粘滯性過高綜合征，Osler-Weber-Rendu病，慢性炎癥，慢性閉塞性肺病，哮喘，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎的不需要的血管生成、水腫或基質(zhì)沉淀的病癥。
本發(fā)明化合物還用于治療眼科病如眼和黃斑部水腫、眼球新血管病、鞏膜炎、徑向角膜切開術(shù)、葡萄膜炎、玻璃體炎、近視、眼部凹陷(optic pits)、慢性視網(wǎng)膜剝離、激光治療后并發(fā)癥、結(jié)膜炎、stargardt氏病和伊爾斯氏病以及視網(wǎng)膜病和黃斑部變性。
本發(fā)明化合物還用于治療心血管病如動脈粥樣硬化、再狹窄、血管閉塞和頸動脈梗塞性疾病。
本發(fā)明化合物還用于治療癌癥相關(guān)性適應(yīng)癥如實(shí)體瘤、肉瘤(尤其是尤因氏肉瘤和骨肉瘤)、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、惡性血癌，包括白血病和淋巴瘤，腫瘤引起的胸膜或心包膜積液、以及惡性腹水。
本發(fā)明化合物還用于治療糖尿病癥狀如青光眼、糖尿病性視網(wǎng)膜病和微血管病。
可以想象上文列舉的疾病可以由VEGF受體(例如，KDR和Fil-1)相關(guān)的酪氨酸蛋白激酶介導(dǎo)至顯著性程度。通過抑制這些受體酪氨酸激酶的活性，所列舉的疾病的進(jìn)程被抑制，因?yàn)樽鳛榧膊顟B(tài)組成部分的血管生成被嚴(yán)重減弱。本發(fā)明化合物的作用，通過它們對特異性酪氨酸激酶的選擇性，致使在使用低選擇性的酪氨酸激酶抑制劑時(shí)可能發(fā)生的副作用最小化。
另一個(gè)方面本發(fā)明提供前文最初定義(包括前提條件)的用作治療藥物，特別是作為蛋白激酶活性例如酪氨酸激酶活性、絲氨酸激酶活性和蘇氨酸激酶活性抑制劑的式I化合物。在又一個(gè)方面本發(fā)明提供前文最初定義(包括前提條件)的式I化合物在制備用于抑制蛋白激酶活性的藥物中的用途。
在本發(fā)明中，下列定義是適用的“藥學(xué)上可接受的鹽”指保留了游離堿的生物學(xué)效用和特性并且通過與無機(jī)酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸反應(yīng)或與有機(jī)酸如磺酸、羧酸、有機(jī)磷酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸、乳酸、酒石酸等反應(yīng)獲得的那些鹽。
“烷基”指飽和脂肪族烴，包括含1-4個(gè)碳原子的直鏈和支鏈基團(tuán)。
“烷氧基”指“O-烷基”基團(tuán)，其中烷基同上述定義。藥用制劑本發(fā)明化合物可以采用治療或改善血管通透性過高、水腫及相關(guān)癥狀的劑量以其自身或它們與合適的載體或賦形劑混合組成的藥用組合物給予人類患者。這些化合物的混合物也可以簡單混合或適當(dāng)配制成藥用組合物給藥。治療有效劑量進(jìn)一步指一種或數(shù)種化合物足以產(chǎn)生預(yù)防或減輕不良新血管生成、過度增殖性疾病發(fā)展、水腫、VEGF-相關(guān)性血管通透性過高和/或VEGF-相關(guān)性低血壓的量。這些化合物制劑及給藥的直接應(yīng)用技術(shù)可見于最新版“Remington氏藥物學(xué)(Remington’s Pharmaceutical Siences)”Msck出版公司，Easton，PA。給藥途徑合適的給藥途徑可以，例如，包括口服、滴眼、直腸內(nèi)、透粘膜、局部、或腸內(nèi)給藥；胃腸外給藥，包括肌肉內(nèi)、皮下、骨髓注射，以及鞘內(nèi)、直接心室內(nèi)注射、靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、鼻內(nèi)、或眼內(nèi)注射。
此外，這些化合物通常可以以植入劑或緩釋制劑進(jìn)行局部給藥而非全身給藥，例如，將化合物直接注射到水腫部位。
而且，可以用靶向釋藥系統(tǒng)，例如，以內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗體包衣的脂質(zhì)體給藥。組合物/制劑本發(fā)明藥用組合物可以用不言自明的方法，例如，混合、溶解、制粒、制糖衣丸、磨光、乳化、填膠囊、壓片或凍干處理的常規(guī)方法制備。
根據(jù)本發(fā)明使用的藥用組合物可以按照常規(guī)方法采用一種或多種生理學(xué)上可接受的載體包括賦形劑和輔料(它們使活性化合物易于進(jìn)入制劑并且在藥物學(xué)上是可用的)配制。正確的制劑取決于所選擇的給藥途徑。
對于注射給藥，本發(fā)明的藥物可以配制成水溶液，優(yōu)選生理學(xué)上相容的緩沖劑如Hank’s溶液、Ringer’s溶液、或生理鹽水緩沖液。對于粘膜給藥，適合穿過屏障的滲透劑被用于制劑中。這些滲透劑通常是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。
對于口服給藥，通過使活性化合物與本領(lǐng)域內(nèi)熟知的藥學(xué)上可接受的載體混合即可容易配制該化合物。這些載體使得本發(fā)明化合物能夠被配制成適合待治療患者口服的片劑、丸劑、糖衣丸、膠囊、液體、膠體、糖漿劑、漿劑、混懸液等。用于口服的制劑可以通過將活性化合物與固體賦形劑混合，任選研磨所得混合物而獲得，如果需要的話，在加入合適的輔料后，將混合物加工成顆粒，以獲得片劑或糖衣芯。特別地，合適的賦形劑是，填充劑如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇、或山梨糖醇；纖維素制品如玉米淀粉、小麥淀粉、大米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可以加入崩解劑，如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、或海藻酸或它們的鹽如海藻酸鈉。
對糖衣芯給予適當(dāng)包衣。為此，可以使用濃的糖溶液，其可以任選含有阿拉伯膠、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯樹膠(carbopolgel)、聚乙二醇和/或二氧化鈦、臘克漆溶液，以及合適的有機(jī)溶劑或溶劑混合物?？蓪⑷玖匣蛏丶尤肫瑒┗蛱且峦璋虏牧现?，以鑒別或區(qū)分活性化合物劑量的不同組合。
可以用于口服的藥用制劑包括明膠制成的推合膠囊，以及由明膠及增塑劑，如甘油或山梨糖醇制成的封閉軟膠囊。推合膠囊可以含有活性成分與填充劑如乳糖，粘合劑如淀粉，和/或潤滑劑如滑石粉或硬脂酸鎂以及，任選穩(wěn)定劑的混合物。在軟膠囊中，活性化合物可溶解或懸浮于合適的液體中，如脂肪油、液體石蠟、或液態(tài)聚乙二醇。此外，可以加入穩(wěn)定劑。所有口服給藥制劑應(yīng)當(dāng)是適合如此給藥的單位劑型。
對于頰內(nèi)給藥，組合物可以采用以常規(guī)方法配制的片劑或錠劑形式。
對于吸入給藥，按照本發(fā)明使用的化合物通常從壓力容器或噴霧器中以氣霧劑噴霧的形式釋藥，其采用合適的拋射劑，例如，二氯二氟甲烷、三氯一氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合適的氣體。在加壓氣霧劑的情況下，其劑量單位可取決于給定的釋藥計(jì)量的值。膠囊或藥筒，例如由明膠制備的，被用于吸入劑或吹入劑時(shí)應(yīng)當(dāng)被配制成含有化合物與合適的粉末性基質(zhì)如乳糖或淀粉的混合粉末。
這些化合物可以配制成適合于胃腸外給藥的注射劑，例如，大劑量(bolus)注射或連續(xù)滴注。注射用制劑可以以單位劑型存在，例如，裝入安瓿或多劑量容器中，可加入防腐劑。組合物可采用以油或水為溶媒的懸液、溶液或乳濁液的這些形式，并且可以含有制劑用試劑如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。
胃腸外給藥用的藥用制劑包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。此外，活性化合物的混懸液可以制備成合適的油性注射混懸液。合適的親脂性溶劑或溶媒包括脂肪油如麻油，或合成脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯，或脂質(zhì)體。注射用水懸液可以含有增加混懸液粘度的物質(zhì)，如羧甲基纖維素鈉，山梨糖醇，或葡聚糖?；鞈乙哼€任選含有合適的穩(wěn)定劑或增加化合物溶解性的物質(zhì)使之能夠制備高濃度的溶液。
此外，活性成分可以是適合在臨用前以合適溶媒，如無菌無熱源的水配制的粉末形式。
這些化合物還可以配制成直腸給藥的制劑例如，含有常規(guī)栓劑基質(zhì)如可可油或其它甘油酯的栓劑或滯留灌腸劑。
除前文描述的制劑外，這些化合物還可以配制成植入制劑。這些長效制劑可以通過植入法給藥(例如皮下或肌肉內(nèi)或肌內(nèi)注射)。因此，例如，這些化合物可以與合適的聚合物或疏水性物質(zhì)(例如可接受的油中的乳劑)或離子交換樹脂進(jìn)行配制，或配制為微溶性衍生物，例如配制為微溶性的鹽。
用作本發(fā)明疏水性化合物的藥用載體的一個(gè)實(shí)例是含有苯甲醇、非極性表面活性劑、水可溶混的有機(jī)聚合物和水相的共溶系統(tǒng)(co-solvent system)。此共溶系統(tǒng)可以是VPD共溶系統(tǒng)。VPD是含3％w/v苯甲醇、8％w/v非極性表面活性劑吐溫80和65％w/v聚乙二醇300，添加無水乙醇至總體積的溶液。此VPD共溶系統(tǒng)(VPD5W)由5％葡聚糖水溶液按1∶1稀釋VPD而組成。此VPD共溶系統(tǒng)很好地溶解疏水性化合物，并且其自身在系統(tǒng)給藥中產(chǎn)生的毒性很低。事實(shí)上，在不破壞其溶解性和毒性的特征下，該共溶系統(tǒng)的組成比例可以在較大范圍內(nèi)改變。此外，共溶劑組分的成分可以改變，例如，可以采用其它低毒非極性表面活性劑代替吐溫80；聚乙二醇部份的大小可以改變；聚乙二醇可以被其它生物相容性聚合物代替，例如聚乙烯吡咯烷酮；并且葡聚糖可以被其它糖或多糖代替。
或者對于疏水性藥用化合物可以采用其它的釋藥系統(tǒng)。脂質(zhì)體和乳劑是熟知的疏水性藥物的釋藥溶媒或載體的例子。某些有機(jī)溶劑如二甲亞砜也可以被采用，盡管通常以較大的毒性為代價(jià)。此外，這些化合物可以采用緩釋系統(tǒng)釋藥，例如，含有治療藥的固體疏水性聚合物的半滲透性基質(zhì)。已經(jīng)有多種緩釋材料被確立并且為本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員所熟知。緩釋膠囊，根據(jù)其化學(xué)性質(zhì)，可以釋放該化合物數(shù)周至多達(dá)超過100天。根據(jù)治療藥的化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)穩(wěn)定性，可以采用穩(wěn)定蛋白的其它措施。
藥用組合物還可以包括合適的固體或凝膠態(tài)載體或賦形劑。這些載體或賦形劑的實(shí)例包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖類、淀粉類、纖維素衍生物、明膠和聚合物如聚乙二醇。
許多本發(fā)明的有機(jī)分子化合物可以作為與藥學(xué)上相容性抗衡離子所成鹽的的形式提供。藥學(xué)上相容性的鹽可以與許多酸形成，包括但不限于鹽酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸等等。與相應(yīng)的游離堿形式相比，鹽在水或其它質(zhì)子性溶劑中可能具有更好的溶解性。有效劑量用于本發(fā)明的藥用組合物包括含有能夠達(dá)到預(yù)定目的的有效量的活性成分的組合物。更具體地說，治療有效量是指有效預(yù)防被治療患者的癥狀發(fā)展或減輕現(xiàn)有癥狀的量。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員在其能力范圍之內(nèi)能夠確定有效量。
對于用于本發(fā)明的方法中的任何化合物，其治療有效劑量最初可以通過細(xì)胞測定而估算。例如，可以用公式計(jì)算在細(xì)胞和動物模型中獲得某一循環(huán)濃度范圍時(shí)的劑量，其濃度范圍包括由細(xì)胞測定所確定的IC50(即，達(dá)到對給定蛋白激酶活性最大抑制一半時(shí)的待測化合物濃度)。在某些情況下，應(yīng)當(dāng)在3-5％血清白蛋白存在下測定IC50，因?yàn)檫@樣的測定近似血漿蛋白對化合物的結(jié)合作用。這項(xiàng)資料可以用于更準(zhǔn)確地確定人體有效劑量。此外，用于系統(tǒng)給藥的最優(yōu)選的化合物在完整細(xì)胞中可以在安全達(dá)到的血漿水平下有效蛋白激酶的信號。
治療有效量是指達(dá)到改善患者癥狀的化合物的量。這些化合物的毒性和治療作用可以在細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動物中通過標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法測定，例如，測定最大耐受劑量(MTD)和ED50(50％最大反應(yīng)的有效劑量)。毒性與治療作用的劑量比為治療指數(shù)而它可以用MTD與ED50的比率表示。優(yōu)選呈現(xiàn)出較高治療指數(shù)的化合物。由這些細(xì)胞測定和動物實(shí)驗(yàn)中獲得的數(shù)據(jù)可以用于制訂用于人體的劑量范圍。這些化合物的劑量優(yōu)選在包括ED50而僅有較小或沒有毒性的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。其劑量可以在此范圍內(nèi)根據(jù)所采用的劑型及所采用的給藥途徑而變化。其準(zhǔn)確的劑型、給藥途徑和劑量可以由各位醫(yī)師根據(jù)對患者病情的判斷而選擇(例見，F(xiàn)ingl等，1975，“治療學(xué)的藥理學(xué)基礎(chǔ)(The Pharmacological Basis of Therapeutics)”，第1章，第1頁)。在治療危重病例時(shí)，可能要求以接近MTD的快速大劑量注射或滴注以獲得快速反應(yīng)。
可以分別地調(diào)整劑量和給藥間隔以獲得足以維持激酶調(diào)節(jié)作用的活性基團(tuán)的血漿水平，或最小有效濃度(MEC)。各化合物的MEC會有變化但可以通過體外數(shù)據(jù)推算；例如，采用本說明書描述的檢測法測定的達(dá)到蛋白激酶50-90％抑制的必需濃度。達(dá)到MEC的必需劑量將取決于各自的特性及給藥途徑。然而，HPLC分析或生物學(xué)檢測可以用于測定血漿濃度。
給藥間隔也可以采用MEC值確定?；衔锼捎玫慕o藥方案應(yīng)當(dāng)保持血漿濃度在10-90％，優(yōu)選在30-90％并最優(yōu)選在50-90％之間的時(shí)間里高于MEC直至達(dá)到所需的癥狀減輕。在局部給藥或選擇吸收的情況下，藥物的有效局部濃度可以與血漿濃度無關(guān)。
當(dāng)然，組合物的給予量取決于受治療的對象、治療對象的體重、病情嚴(yán)重程度、給藥方式以及責(zé)任醫(yī)師的判斷。包裝如果需要的話，這些組合物可以以一種包裝或自動配藥裝置提供，其可以含有一個(gè)或多個(gè)含活性成分的單位劑型。例如該包裝可以含有金屬或塑料箔衣，例如，泡罩包裝。這些包裝或自動配藥裝置應(yīng)當(dāng)附有用藥說明書。也可以制備以相容性藥用載體配制的含有本發(fā)明化合物的組合物，置于合適的容器內(nèi)，并標(biāo)明所治療的適應(yīng)癥。
在某些制劑中，使用精細(xì)顆粒形式，例如通過流能磨粉碎所獲得的本發(fā)明化合物可能是有益的。
如果需要，在本發(fā)明組合物中活性化合物可以與適配的其它藥理學(xué)活性成分聯(lián)用。例如，本發(fā)明的化合物可以與一種或多種抑制或預(yù)防VEGF生成、削弱對VEGF的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)、阻斷細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)、抑制血管通透性過高、減少炎癥，或抑制或預(yù)防腫瘤形成或新血管產(chǎn)生的其它藥物聯(lián)合給藥。無論那種給藥途徑合適，本發(fā)明化合物都可以先于、隨后或同時(shí)與其它藥物給藥。其它藥物包括但不限于抗水腫甾族化合物、NSAIDS、ras抑制劑、抗-TNF藥、抗-IL-1藥、抗組胺藥、PAF-拮抗劑、COX-1抑制劑、COX-2抑制劑、NO合成酶抑制劑、PKC抑制劑和PI3激酶抑制劑。本發(fā)明化合物與這些其它藥物的作用或者是相加的或者是協(xié)同的。因此，抑制血管通透性過高和/或抑制水腫形成的這些物質(zhì)的聯(lián)合給藥與單獨(dú)給予各物質(zhì)相比，可以更好地減輕高增殖性疾病、血管生成、血管通透性過高或水腫的有害作用。在治療惡性疾病中可以與抗增殖或細(xì)胞毒化療藥或放療聯(lián)合。
本發(fā)明還包括式I化合物作為治療藥的用途。
Src和Syk兩個(gè)家族的激酶在免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。目前已知Src家族包括Fyn、Lck、Fgr、Fes、Lyn、Src、Yes、Hck和Blk。目前已知Syk家族僅包括Zap和Syk。Janus家族的激酶涉及生長因子和促炎細(xì)胞因子信號通過一系列受體的傳導(dǎo)。盡管Tec家族激酶的成員，BTK和ITK，在免疫學(xué)中作用還不夠清楚，但抑制劑對它們的調(diào)節(jié)可能被證明是有治療效果的。激酶RIP、IRAK-1、IRAK-2、NIK、IKK-1和IKK-2與重要的促炎細(xì)胞因子TNF和IL-1前體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。由于它們能夠抑制一種或多種的此類激酶，式I化合物可以作為免疫調(diào)節(jié)劑而有益于維持同種異體移植和治療自身免疫性疾病。盡管它們能夠調(diào)節(jié)T細(xì)胞的激活或增強(qiáng)炎癥過程，這些化合物可以用于治療這些自身免疫性疾病。由于排斥現(xiàn)象，無論是宿主針對移植體的實(shí)體器官或移植物針對宿主的骨髓，移植都受到當(dāng)前所能獲得的免疫抑制劑的毒性的限制，但將從改善治療指數(shù)的有效藥物中獲得益處?；虬邢?qū)嶒?yàn)已經(jīng)證明Src在破骨細(xì)胞生物學(xué)中的基礎(chǔ)性作用，這些細(xì)胞負(fù)責(zé)骨質(zhì)的再吸收。由于式I化合物能夠調(diào)節(jié)Src，它可以用于治療骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)硬化癥、佩吉特氏病、腫瘤誘發(fā)的高血鈣以及用于治療骨轉(zhuǎn)移。
許多蛋白激酶已經(jīng)被證明是原癌基因。染色體斷裂(位于5號染色體上的ltk激酶斷裂點(diǎn))、易位如在含BCR(費(fèi)城(philadelphia)染色體)的Abl基因的情形中、截短如在c-Kit或EGFR的實(shí)例中、或突變(例如，Met)導(dǎo)致產(chǎn)生異常調(diào)節(jié)蛋白而將它們由原癌基因轉(zhuǎn)變?yōu)橹掳┗?。在其它腫瘤中，自分泌或旁分泌性配基/生長因子受體相互作用促進(jìn)腫瘤形成。Src-家族激酶成員典型地與下游信號傳遞有關(guān)，因此增強(qiáng)腫瘤形成而且它們自身通過過度表達(dá)或突變而成為致癌性的。通過抑制這些蛋白質(zhì)的蛋白激酶活性可以終止其疾病進(jìn)程。血管再狹窄可能涉及FGF和/或PDGF的作用-促進(jìn)平滑肌及內(nèi)皮細(xì)胞增生。抑制FGFr或PDGFr激酶活性可能是抑制這種現(xiàn)象的有效措施。式I化合物抑制正?；虍惓５腸-kit、c-met、c-fms、src-家族成員、EGFr、erbB2、erbB4、BCR-Abl、PDGFr、FGFr以及其他受體或細(xì)胞質(zhì)酪氨酸激酶的激酶活性可能治療良性和腫瘤性的增殖性疾病有價(jià)值。
在許多病理?xiàng)l件下(例如，原發(fā)性實(shí)體瘤及轉(zhuǎn)移、卡波氏肉瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、異常的眼新血管生成所致的失明、牛皮癬和動脈粥樣硬化)，疾病的發(fā)展伴隨有持續(xù)的血管生成。疾病組織或相關(guān)的炎癥細(xì)胞通常產(chǎn)生多肽生長因子，而且其相應(yīng)的內(nèi)皮細(xì)胞特異性受體酪氨酸激酶(例如，KDR/VEGFR-2、Flt-1/VEGFR-1、Tie-2/Tek和Tie)對于刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長、遷移、排列、分化以及建立起所需的新的功能性血管結(jié)構(gòu)是必需的。
由于VEGF的“血管通透性因子”活性是介導(dǎo)血管高通透性原因，也相信VEGF刺激的VEGFR激酶在形成腫瘤性腹水，大腦及肺水腫，胸膜和心包膜積液，遲發(fā)性過敏反應(yīng)，繼發(fā)于外傷、燒傷、局部缺血、糖尿病并發(fā)癥、子宮內(nèi)膜異位癥、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、心肺旁路術(shù)后相關(guān)的低血壓及通透性過高的組織水腫及器官功能障礙，以及眼水腫所致的青光眼或異常新血管生成所致的失明中也起著重要作用。除VEGF外，新近鑒定出的VEGF-C和VEGF-D、及HIV-Tat蛋白也能夠通過刺激VEGFR激酶而導(dǎo)致血管通透性過高的反應(yīng)。
Tie-2還在一選定的造血干細(xì)胞群體中表達(dá)，其可能在它們的聚集、粘附、調(diào)節(jié)和分化中起作用(Blood 89，4317-4326(1997))；這些表達(dá)Tie-2的群體可能作為循環(huán)的血管生成內(nèi)皮細(xì)胞的祖細(xì)胞起作用。根據(jù)式I的某些藥物能夠阻斷內(nèi)皮細(xì)胞特異性激酶的活性，因而能夠抑制涉及這些情況的疾病進(jìn)程。
式I化合物或其鹽或含有效治療量的式I化合物的藥用組合物可以用于治療良性或腫瘤性的增殖性疾病和免疫系統(tǒng)疾病。這些疾病包括自身免疫性疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、甲狀腺炎、I型糖尿病、多發(fā)性硬化、肉瘤樣結(jié)節(jié)病、炎性腸道病、重癥肌無力和系統(tǒng)性紅斑狼瘡；牛皮癬，器官移植排斥反應(yīng)(例如，腎排斥、移植體抗宿主性疾病)，良性和腫瘤性增殖性疾病，人類癌癥如肺、乳房、胃、膀胱、結(jié)腸、胰腺、卵巢、前列腺和直腸癌以及造血細(xì)胞(例如白血病和淋巴癌)，和與異常血管化有關(guān)的疾病如糖尿病性視網(wǎng)膜病、由于年齡相關(guān)的黃斑區(qū)退化所致的脈絡(luò)膜新血管生成、和人類中的小兒血管瘤。此外，這些抑制劑可以用于治療與VEGF介導(dǎo)的水腫、腹水、積液和滲出液相關(guān)的疾病，例如包括黃斑區(qū)水腫、大腦水腫、和成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)。
本發(fā)明化合物還可用于預(yù)防上述疾病。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供式I化合物或其鹽在制備用于治療哺乳動物，尤其是人類的血管通透性過高、血管生成依賴性疾病、增殖性疾病和/或免疫系統(tǒng)疾病的藥物中的用途。
本發(fā)明還提供治療血管通透性過高、異常新血管化、增殖性疾病和/或免疫系統(tǒng)疾病的方法，其包括以有效治療量的式I化合物給予有需要的哺乳動物，尤其是人類。
化合物在體外抑制這些蛋白激酶的效力可以通過下文詳述的方法測定。
化合物的效力可以通過檢測待測化合物與對照物對外源性底物(例如，合成多肽(Z.Songyang等，Natrue 373536-539))磷酸化抑制的量而測定。采用桿狀病毒系統(tǒng)制備KDR酪氨酸激酶采用從HUVEC細(xì)胞中分離的cDNAs通過PCR獲得人類KDR細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(aa789-1354)的編碼序列。還在此蛋白質(zhì)的N-端引入六聚組氨酸(poly-His6)序列。將該片段克隆到轉(zhuǎn)染載體pVL1393的Xba 1和Not1位上。重組桿狀病毒(BV)采用BaculoGold Trahsfection試劑(PharMingen)通過共轉(zhuǎn)染獲得。重組BV以空斑法純化并通過Western分析法確證。至于蛋白質(zhì)生成，使SF-9細(xì)胞以2×106/ml的密度生長于SF-900-II培養(yǎng)基中，并且以每個(gè)細(xì)胞0.5個(gè)空斑形成單位(MOI)進(jìn)行感染。細(xì)胞在感染后48小時(shí)收獲。KDR純化將50ml Triton X-100溶胞緩沖液(20mM Tris，pH8.0，137mMNaCl，10％甘油，1％Triton X-100，1mM PMSF，10μg/ml抑肽酶、1μg/ml亮抑酶肽)加入到1L細(xì)胞培養(yǎng)液的細(xì)胞團(tuán)中使表達(dá)(His)6KDR(aa789-1354)的SF-9細(xì)胞溶解。該溶胞產(chǎn)物在Sorval SS-34轉(zhuǎn)子中在4C下以19000rpm離心30分鐘。將該細(xì)胞溶解產(chǎn)物加于5ml NiCl2螯合的瓊脂糖柱上，以50mM HEPES，pH7.5，0.3M NaCl平衡。以含有0.25M咪唑的相同緩沖液洗脫KDR。柱純化部分采用SDS-PAGE和測定激酶活性的ELISA檢測法(見下文)分析。純化的KDR轉(zhuǎn)移到25mMHEPES，pH7.5，25mM NaCl，5mM DTT緩沖液中并于-80℃保存。人類Tie-2激酶的產(chǎn)生與純化采用從人血小板中分離的cDNAs為模板，通過PCR獲得人類Tie-2細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(aa775-1124)的編碼序列。將聚合-His6序列引入N-端并將該結(jié)構(gòu)克隆到轉(zhuǎn)染載體pVL1939的Xba 1和Notl位點(diǎn)上。重組BV采用BaculoGold轉(zhuǎn)染試劑(PharMingen)通過共轉(zhuǎn)染獲得?？瞻叻兓亟MBV并以Western分析法確證。至于蛋白產(chǎn)生，使SF-9細(xì)胞以2×106/ml的密度生長于SF-900-II培養(yǎng)基中，并且以0.5 MOI進(jìn)行感染。His-靶向激酶的純化采用類似于KDR中的描述篩選。人類Flt-1酪氨酸激酶的制備和純化采用表達(dá)載體pVL1393(Phar Mingen，Los Angeles，CA)的桿狀病毒。編碼六聚-His6的核苷酸序列置于編碼人類Flt-1(氨基酸786-1338)的完整細(xì)胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域的核苷酸結(jié)構(gòu)域的5’端。編碼激酶域的核苷酸序列采用從HUVEC細(xì)胞中分離的cDNA基因文庫通過PCR制備。組氨酸殘基使之能夠以類似于KDR和ZAP70的方式進(jìn)行蛋白質(zhì)親和性純化。以0.5的感染復(fù)數(shù)感染SF-9昆蟲細(xì)胞并在感染48小時(shí)后收獲。EGFR酪氨酸激酶來源EGFR購自Sigma(Cat#E-3641；500單位/50μl)而EGF配基得自O(shè)ncogene Research Products/Calbiochem(Cat#PF011-100)。ZAP70表達(dá)所采用的桿狀病毒的表達(dá)載體是pVL1393(Pharmingen，LosAngeles，Ca.)。編碼氨基酸M(H)6 LVPR9S的核苷酸序列置于編碼全部ZAP70(氨基酸1-619)的5’。編碼ZAP70的密碼區(qū)的核苷酸序列采用從Jurkat的無限增殖化T細(xì)胞中分離的cDNA基因文庫，通過PCR生成。組氨酸殘基使蛋白能夠被親和性純化(見下文)。LVPR9S鍵橋構(gòu)成了凝血酶對蛋白水解裂解的識別序列，使之能夠從酶上除去親和性標(biāo)記物。以0.5的感染復(fù)數(shù)感染SF-9昆蟲細(xì)胞并在感染48小時(shí)后收獲。ZAP70的提取和純化使SF-9細(xì)胞在含有20mM Tris、PH8.0、137mM NaCl、10％甘油、1％Triton X-100、1mM PMSF、1μg/ml亮抑酶肽、10μg/ml抑肽酶和1mM原釩酸鈉的緩沖液中溶解。將可溶性溶解產(chǎn)物應(yīng)用于以50mM HEPES，PH7.5，0.3M NaCl平衡的瓊脂糖HiTrap螯合柱(Pharmacia)上。以250mM咪唑洗脫融合蛋白。該酶貯存于含50mMHEPES，pH7.5，50mM NaCl和5mM DTT的緩沖液中。Lck來源Lck或截?cái)嘈问降腖ck從商業(yè)上獲得(例如來自UpstateBiotechnology Inc.(Saranac Lake，N.Y)和Santa Cruz BiotechnologyInc.(Santa Cruz，Ca.))或者采用常規(guī)方法從已知天然或重組來源的原料中純化。Cdc2來源人類重組酶和檢測緩沖液可以從商業(yè)上獲得(New EnglandBiolabs，Beverly，MA.USA)或者采用常規(guī)方法從已知天然或重組來源的材料中純化。Cdc2測定所采用的方案是對所采購試劑的條件稍加改進(jìn)來提供。簡單地說，該反應(yīng)在緩沖液中進(jìn)行該緩沖液含有50mM Tris，pH 7.5，100mMNacl，1mM EGTA，2mM DTT，0.01％Brij，5％DMSO和10mMMgCl2(商品緩沖劑)，并補(bǔ)充有新配制的終濃度為300μM的ATP(31μCi/ml)和30μg/ml的IIIss型組蛋白。反應(yīng)體積80μL，含有單位酶，反應(yīng)在抑制劑存在或不存在下在25℃進(jìn)行20分鐘。通過加入120μL 10％乙酸終止該反應(yīng)。通過將混合物點(diǎn)樣(spotting)于磷酸纖維素紙而從未結(jié)合的標(biāo)記物中分離底物，隨后用75mM磷酸洗滌3次，每次5分鐘。在液閃劑存在下以β計(jì)數(shù)計(jì)測定數(shù)值。
本發(fā)明的某些化合物在低于50μM濃度下顯著抑制cdc2。PKC激酶來源PKC催化亞單位可以從商業(yè)上獲得(Calbiochem)。PKC激酶檢測放射活性的激酶采用下列文獻(xiàn)方法檢測(Yasuda，I.，Kirshimoto，A.，Tanaka，S.，Tominaga，M.，Sakurai，A.，Nishizuka，Y.，Biochemicaland Biophysical Research Communication 3166，1220-1227(1990))。簡要地說，全部反應(yīng)在由50mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2，2mMDTT，1mM EGTA，100μM ATP，8μM肽，5％DMSO和33PATP(8Ci/mM)組成的激酶緩沖液中進(jìn)行?；衔锖兔冈诜磻?yīng)瓶中混合并通過加入ATP和底物混合物啟動反應(yīng)。然后通過加入10μL終止緩沖液(75mM磷酸溶液中含5mM ATP)終止反應(yīng)，部分混合物點(diǎn)樣于磷酸纖維素濾紙上。點(diǎn)染的樣品在室溫下在75mM磷酸以5至15分鐘洗滌三次。放射標(biāo)記物的結(jié)合以液體閃爍計(jì)數(shù)器定量。Erk2酶來源重組的小鼠酶和測定緩沖液可以從商業(yè)上獲得(New EnglandBiolabs，Beverly MA.USA)或采用常規(guī)方法從已知的天然或重組來源的材料中純化。Erk2酶檢測簡要地說，該反應(yīng)在含有50mM Tris，pH 7.5，1mM EGTA，2mMDTT，0.01％Brij，5％DMSO和10mM MgCl2(商品緩沖液)并按照供貨商的建議補(bǔ)充新配制的100μM ATP(31μCi/ml)和30μM髓鞘質(zhì)堿性蛋白的緩沖液中進(jìn)行。反應(yīng)體積和結(jié)合的放射活性的測定方法見PKC分析中的描述(見上文)。PTKs酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)采用酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)檢測和測量所存在的酪氨酸激酶活性。ELISA按照已知方案進(jìn)行，其描述于，例如，Voller，等，1980，“酶聯(lián)免疫吸附分析”，及臨床免疫學(xué)手冊(Manual of ClinicalImmunology)，第2版，Rose和Friedman主編，359-371頁，美國微生物學(xué)會(Am.Soc.Of Microbiology)，Washington，D.C.。
此公開的方案適用于測定特異性PTK的活性。例如，進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)的優(yōu)選方案提供如下。對于測定PTK家族受體的其它成員，以及非受體酪氨酸激酶的化合物活性的這些方案進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員的能力之內(nèi)的事。為達(dá)到測定抑制劑選擇性的目的，采用通用的PTK底物(例如，20,000-50,000MW的聚(Glu4Tyr)的隨機(jī)共聚物)和同時(shí)在測定中采用濃度約為表觀Km的兩倍的ATP(通常5μM)。
下例步驟用于測定本發(fā)明化合物對KDR，F(xiàn)lt-1，Tie-2，EGFR和ZAP70酪氨激酶活性的抑制作用緩沖液和溶液PGT聚(Glu，Tyr)4∶1粉末貯存于-20℃下。使粉末在磷酸緩沖鹽水(PBS)中溶解成50mg/ml的溶液。以每份1ml等分貯存于-20℃。制板時(shí)以Gibco PBS稀釋成250μg/ml。
反應(yīng)用緩沖液100mM Hepes，20mM MgCl2，4mM MnCl2，5mMDTT，0.02％BSA，200μM NaVO4，pH7.10ATP以每份100mM等分貯存于-20℃。以水稀釋成20μM。
洗滌用緩沖液含0.1％吐溫20的PBS抗體稀釋緩沖液含0.1％小牛血清白蛋白(BSA)的PBSTMB底物使用前將TMB底物與過氧化(Peroxide)溶液按9∶1混合或采用購自Neogen的K-Blue底物終止液1M磷酸步驟1.培養(yǎng)板制備以PBS將PGT貯存液(50mg/ml，冷凍)稀釋至250μg/ml。Corning改進(jìn)的高親和性ELISA平底培養(yǎng)板(Corning#25805-96)的每個(gè)培養(yǎng)孔中加入125μl。空白孔中加入125μl PBS。封口膠覆蓋并于37℃下孵育過夜。以250μl洗滌緩沖液洗滌一次并在37℃干燥培養(yǎng)箱中干燥約2小時(shí)。將培養(yǎng)板以刻度袋(scaled bag)包裹貯存于4℃下直至使用。2酪氨酸激酶反應(yīng)按4×濃度以20％DMSO水溶液制備抑制劑溶液。
制備反應(yīng)緩沖液。
制備酶溶液使50μl中含有所需單位，例如，對于KDR配制成為1ng/μl，使每個(gè)反應(yīng)孔中的總量為50ng。冰浴保存。
由100mM的貯存液以水制備20μM的4×濃度的ATP溶液。冰浴保存。
每孔加入50μl酶溶液(根據(jù)激酶的特異性活性通常為5-50ng酶/孔)。
加入25μl 4×的抑制劑。
加入25μl 4×的ATP用于抑制劑測定。
室溫下孵育10分鐘。
每孔加入50μl 0.05N HCl終止反應(yīng)。
洗滌培養(yǎng)板。
**反應(yīng)終濃度5μM ATP，5％DMSO3.抗體結(jié)合以含0.1％BSA的PBS通過兩步稀釋(100×，然后200×)將每份1mg/ml的PY20-HRP(Pierce)抗體(一種磷酸酪氨酸抗體)稀釋至50ng/ml。
每孔加入100μlAb。室溫下孵育1小時(shí)。4℃下孵育1小時(shí)。
培養(yǎng)板洗滌4次。4.顯色反應(yīng)制備TMB底物并每孔加入100μl。
650nm下監(jiān)測OD值直至達(dá)到0.6。
以1M磷酸終止反應(yīng)。搖動平板讀數(shù)器。
迅速讀出450nm下的OD值。
根據(jù)每批酶的制備，其最適培養(yǎng)時(shí)間以及酶反應(yīng)條件稍有改變并可以由經(jīng)驗(yàn)決定。
對于Lck，在類似的測定條件下采用100mM MOPSO，pH6.5，4mMMnCl2，20mM，MgCl2，5mM DTT，0.2％BSA，200mM NaVO4的反應(yīng)緩沖液。
式I化合物在治療與已鑒定的，包括本文未提及的那些疾病，以及未鑒定的能夠被式I化合物抑制的酪氨酸蛋白激酶有關(guān)的疾病中具有治療上的應(yīng)用價(jià)值。本文中的所有示例化合物在50微摩爾或更低濃度下都顯著抑制KDR激酶。本發(fā)明的某些化合物在50微摩爾更低濃度下還顯著抑制其它的PTKs例如lck。T細(xì)胞激活的體外模型在促分裂原或抗原激活下，T細(xì)胞被誘導(dǎo)分泌IL-2，一種支持后續(xù)增殖期的生長因子。因此原始T細(xì)胞或合適的T細(xì)胞系產(chǎn)生的IL-2或細(xì)胞增殖的測定都可以都代替T細(xì)胞激活檢測。這兩種檢測法都見于文獻(xiàn)描述而且它們的參數(shù)也有充分的文獻(xiàn)資料(見CurrentProtocols in Immunology，Vol2，7.10.1-7.11.2)。
簡要地說，T細(xì)胞可以通過與過敏刺激細(xì)胞共培養(yǎng)一種稱作單向混合的淋巴吞噬細(xì)胞反應(yīng)的方法而激活。按照各制造商說明書的Ficoll-Hypaque梯度(Pharmacia)純化外周血液中單核細(xì)胞的反應(yīng)者和刺激者。以絲裂霉素C(Sigma)或γ射線處理使刺激細(xì)胞有絲分裂活性喪失。在有或無檢測化合物的存在下反應(yīng)細(xì)胞和刺激細(xì)胞以2∶1的比率共培養(yǎng)。通常105個(gè)反應(yīng)細(xì)胞與5×104個(gè)刺激細(xì)胞混合并植入(200μl體積)U形底微量滴定板(Costar Scientific)。使這些細(xì)胞培養(yǎng)于補(bǔ)充有熱滅活的小牛血清(Hyclone Laboratories)，或來源于男性供體的混合人AB血清，5×10-5M 2巰基乙醇和0.5％DMSO的RPMI 1640中。培養(yǎng)物在收獲前一天(通常在第三天)以0.5μCi的3H胸腺嘧啶核苷(Amersham)激發(fā)(pulsed)。收獲(Betaplate收獲器，Wallac)培養(yǎng)物并且通過液體閃爍計(jì)數(shù)器(Betaplate，Wallac)測定同位素的吸收量。
可以采用相同的培養(yǎng)系統(tǒng)通過測定IL-2的生成量測定T細(xì)胞激活。培養(yǎng)開始18至24小時(shí)后，去上清液并根據(jù)制造商的說明書以ELISA(R&D系統(tǒng))測定IL-2濃度。T-細(xì)胞激活的體內(nèi)模型已知在直接測定T細(xì)胞激活或證明T細(xì)胞是效應(yīng)子的動物模型中可檢測化合物的體內(nèi)功效。通過以單克隆抗CD-3抗體(Ab)阻斷恒定部分的T-細(xì)胞受體而激活體內(nèi)的T-細(xì)胞。在此模型中，BALB/c小鼠在放血前2小時(shí)腹腔給予10μg的抗CD-3 Ab。接受實(shí)驗(yàn)藥物的動物在給予抗CD-3 Ab前1小時(shí)用單劑量的化合物預(yù)處理。T-細(xì)胞激活的標(biāo)志物，促炎細(xì)胞因子干擾素-γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的血清水平通過ELISA測定。一種類似模型采用以特異性抗原如鑰孔蟲戚血藍(lán)素(KLH)激發(fā)體內(nèi)T-細(xì)胞，既而以相同抗原第二次在體內(nèi)攻擊流出的淋巴結(jié)細(xì)胞。與前述相同，細(xì)胞因子生成量的測定用于評價(jià)培養(yǎng)細(xì)胞的激活狀態(tài)。簡單地說，在第0天通過皮下注射在完全福氏佐劑(CFA)中乳化的100μg KLH使C57BL/6小鼠免疫。動物在免疫前一天及免疫后的第一、二和三天以化合物預(yù)處理。在第4天收獲流出的淋巴結(jié)細(xì)胞并將它們的細(xì)胞按6×106/ml在組織培養(yǎng)基中(RPMI 1640，補(bǔ)充有熱滅活小牛血清(Hyclone Laboratories)，5×10-5M 2-巰基乙醇和0.5％DMSO)培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)。然后以ELISA測定培養(yǎng)物上清液中的自分泌的T-細(xì)胞生長因子白介素-2(IL-2)和/或IFN-γ的水平。
在人類疾病的動物模型中也檢測先導(dǎo)化合物。這些是通過實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)和膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)證實(shí)的。模擬人類多發(fā)性硬化的大鼠及小鼠EAE模型都已經(jīng)有報(bào)道(綜述FASEB J.52560-2566，1991；小鼠模型Lab.Invest.4(3)278，1981；嚙齒類動物模型J.Immunol 146(4)1163-8，1991)。簡單地說，小鼠和大鼠以髓磷脂堿性蛋白(MBP)的乳化液，或它們的衍生物神經(jīng)原肽及CFA免疫?？梢约尤爰?xì)菌毒素如百日咳博德特氏菌(bordetellapertussis)誘導(dǎo)急性疾病。復(fù)發(fā)/緩和疾病通過接受由源自MBP/肽免疫動物的T-細(xì)胞過繼性轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)。
DBA/1小鼠的CIA可以通過II型膠原蛋白免疫而誘導(dǎo)(J.Immunol142(7)2237-2243)。小鼠可以早在抗原攻擊后十天發(fā)生關(guān)節(jié)炎體征并可在免疫后保持長達(dá)九十天。在EAE和CLA兩種模型中，化合物既可以預(yù)防給藥也可以在發(fā)病后的時(shí)程中給藥。有效的藥物應(yīng)減輕疾病的嚴(yán)重性和/或發(fā)病率。
抑制一種或多種促血管生成受體PTK、和/或介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的蛋白激酶如lck的部分本發(fā)明化合物在這些模型中可以減輕關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重性和發(fā)病率。
還可以在小鼠同種異體移殖，皮膚移殖(Ann.Rev.Immunol.，10333-58，1992；Transplantation57(12)1701-1706，1994的綜述)或心臟移殖(Am.J.Anat.113273，1963)模型中檢驗(yàn)化合物。簡單地說，將完全厚度的皮膚移殖物由C57BL/6小鼠移殖到BALB/c小鼠。從第六天開始，每日檢查移殖物的排斥反應(yīng)跡象。在新生小鼠的心臟移殖模型中，幼體心臟由C57BL/6小鼠異位移殖到成年CBA/J小鼠的耳廓。心臟移殖后開始跳動到四至七天并且采用解剖顯微鏡查找搏動停止而視覺評價(jià)排斥反應(yīng)。細(xì)胞受體PTK測定下列細(xì)胞測定用于測定本發(fā)明的不同化合物對KDR/VEGFR2的活性和作用水平。采用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的技術(shù)按照相同的路線采用特異性配基刺激物可以設(shè)計(jì)適合其它酪氨酸激酶的類似受體PTK的檢測法。
VEGF-誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的KDR磷酸化通過蛋白質(zhì)印跡法檢測。
1.HUVEC細(xì)胞(來源于混合的供體)購自Clonetics(San Diego，CA)并按照制造商的說明書培養(yǎng)。僅早期的傳代(3-8代)被用于這種檢測法。細(xì)胞采用完全EBM培養(yǎng)基(Clonetics)在100mm的培養(yǎng)皿(Falcon，組織培養(yǎng)用；Becton Dickinson；Plymouth，England)中培養(yǎng).
2.對于化合物抑制活性的評價(jià)，細(xì)胞以胰酶消化并以0.5-1.0×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6-孔組合(cluster)培養(yǎng)板(Costar，Cambridge，MA)的每個(gè)培養(yǎng)孔中。
3.接種3至4天后，培養(yǎng)板90-100％融合。從每個(gè)培養(yǎng)孔中去除培養(yǎng)基，以5-10ml的PBS漂洗細(xì)胞并以5ml無補(bǔ)充劑(即，無血清)的EBM基本培養(yǎng)基孵育18-24小時(shí)。
4.將在1ml EBM培養(yǎng)基中的系列稀釋的抑制劑(終濃度為25μM，5μM，或1μM)加入到細(xì)胞中并在37℃下孵育1小時(shí)。然后按50ng/ml的終濃度將2ml含有人重組VEGF165(R & D(system))的EBM培養(yǎng)基加入到所有培養(yǎng)孔中并在37℃下孵育10分鐘。對照組細(xì)胞不以或僅以VEGF處理用于評價(jià)本底磷酸化反應(yīng)和VEGF誘導(dǎo)的磷酸化反應(yīng)。
然后所有培養(yǎng)孔都以5-10ml含1mM原釩酸鈉(Sigma)的冷PBS漂洗并且使細(xì)胞溶解并收獲于200μl的RIPA緩沖液(50mM Tris-HCl，pH7，150mM NaCl，1％NP-40，0.25％去氧膽酸鈉，1mM EDTA)中，其含有蛋白酶抑制劑(PMSF 1mM，抑肽酶1μg/ml，胃酶抑素1μg/ml，亮抑酶肽1μg/ml，釩酸鈉1mM，氟化鈉1mM)和1μg/mlDnase(所有化學(xué)試劑均來自Sigma Chemical Company，St Louis，MO)。溶胞產(chǎn)物以14000rpm離心30分鐘，以去除細(xì)胞核。
然后通過加入冷(-20℃)乙醇(2體積)保持最少1小時(shí)或最長過夜使等量蛋白沉淀。沉淀以含有5％β-巰基乙醇(BioRad；Hercules，CA)的Laemli樣品緩沖液重新組成并煮沸5分鐘。蛋白質(zhì)以聚丙烯酰胺凝膠電泳(6％，1.5mm Novex，San Deigo，CA)分離并采用Novex系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。用小牛血清白蛋白(3％)阻斷后，蛋白質(zhì)在4℃下以抗-KDR多克隆抗體(C20，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)或以抗磷酸酪氨酸單克隆抗體(4G 10，Upstate Biotechnology，LakePlacid，NY)過夜探針識別(probed)。洗滌并與羊抗兔或羊抗鼠IgG的HRP-結(jié)合的F(ab)2孵育1小時(shí)后采用化學(xué)發(fā)光(ECL)系統(tǒng)(AmershamLife Sciences，Arlington Height，IL)觀察電泳帶(bands)。
本發(fā)明的某些實(shí)施例化合物在低于50μM的濃度下，顯著抑制細(xì)胞VEGF-介導(dǎo)的KDR酪氨酸激酶磷酸化。內(nèi)體子宮水腫模型該檢測法測定化合物對雌激素刺激后最初幾小時(shí)內(nèi)發(fā)生的小鼠子宮重量急性增加的抑制效力。已知這種早期發(fā)生的子宮重量增加的原因是子宮脈管系統(tǒng)通透性增加所引起的水腫。Cullinan-Bove和Koss(Endocrinology(1993)，133829-837)證明了雌激素刺激的子宮水腫與子宮中VEGF mRNA表達(dá)增加之間的瞬時(shí)密切關(guān)系。這些結(jié)果通過采用對VEGF的中和單克隆抗體所證實(shí)，VEGF顯著減少雌激素刺激后的子宮重量快速增加(WO97/42187)。因而，該系統(tǒng)可以用作抑制VEGF信號以及相關(guān)的通透性過高和水腫的體內(nèi)模型。材料全部激素均為購自Sigma(St.Louis，MO)或Cal Biochem(La Jolla，CA)的凍干粉末并按照供應(yīng)商說明書制備。
溶媒化合物(DMSO，Cremaphor EL)購自Sigma(St.Louis，MO)。
小鼠(Balb/c，8-12周齡)購自Taconic(Germantown，NY)并按照動物保護(hù)與使用委員會指南(Animal Care and Use Committee Guidelines)飼養(yǎng)于無病原動物房。方法第1天Balb/c小鼠腹腔注射(i.p.)給予12.5單位的孕馬血清促性腺激素(PMSG)。
第3天小鼠腹腔注射接受15單位的人絨毛膜促性腺激素(hCG)。
第4天將小鼠隨機(jī)分成5-10組。根據(jù)溶解性和溶媒以i.p.，i.v.或p.o.途徑按1-100mg/kg的劑量給予實(shí)驗(yàn)化合物。
30分鐘后，試驗(yàn)組、溶媒組和1個(gè)未治療組腹腔注射給予17β-雌二醇(500μg/kg)。2-3小時(shí)后，通過二氧化碳窒息處死動物。沿中線切開后，分離并沿子宮頸下端以及輸卵管與子宮連接處切開而取出各子宮。小心除去脂肪和結(jié)締組織，以免在稱重前破壞子宮的完整性。比較治療組與未治療組或溶媒處理組的平均重量。顯著性以Student’s t-檢驗(yàn)判斷。未刺激對照組用于監(jiān)測雌二醇反應(yīng)。
結(jié)果表明以多種途徑系統(tǒng)給藥時(shí)，本發(fā)明的部分化合物能夠抑制水腫形成。
作為血管生成受體酪氨酸激酶抑制劑的部分本發(fā)明化合物在新血管形成的Matrigel移植模型中也表現(xiàn)出活性。Matrigel新血管形成模型涉及在移植的皮下的透明的“大理石”樣細(xì)胞外基質(zhì)中的新血管形成，其由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的前血管生成因子所誘導(dǎo)(例見Passaniti，A.，等，Lab.Investig.(1992)，67(4)，519-528；Anat.Rec.(1997)，249(1)，63-73；Int.J.Cancer(1995)，63(5)，694-701；Vasc Biol.(1995)，15(11)，1857-6)。該模型優(yōu)選進(jìn)行3-4天并且其結(jié)果包括在取出移植物后比較對照組與抑制劑未處理的動物的新血管形成的顯微觀察/圖像紀(jì)錄、微血管密度的顯微檢測、以及血紅蛋白定量(Drabkin法)。該模型可以選擇采用bFGF或HGF作為刺激劑。
抑制一種或多種腫瘤形成、原癌基因或增殖依賴性蛋白激酶，或血管生成受體PTK的部分本發(fā)明化合物還抑制原代小鼠異種移植的小鼠、大鼠或人腫瘤生長，或在小鼠模型中的轉(zhuǎn)移。
L1A代表Ch2NH的式I化合物可以通過使A代表CONH的式I化合物與還原劑，如氫化鋁鋰在0-250℃范圍內(nèi)的溫度下，在任選溶劑存在下反應(yīng)來制備。
或者，L1A代表CH2NH的式I化合物可以使通過式TL1CHO化合物與式H2N-L2-R1的胺，在還原劑如三乙酰氧基硼氫化鈉存在下，在0-250℃的溫度范圍內(nèi)任選在溶劑存在下反應(yīng)來制備。
或者L1-A-L2-R1基團(tuán)可以以苯環(huán)存在及可按下文描述構(gòu)成環(huán)系其中 美國專利3843665和美國專利3843666中提出了兩種合成式I化合物環(huán)系的常規(guī)方法。
在美國專利3843665中，通過在惰性溶劑和催化量的酸中加熱式II化合物和式III芳香族磺酰肼而使吡唑環(huán)環(huán)化。該反應(yīng)優(yōu)選在75℃-100℃的溫度下進(jìn)行5-30小時(shí)并獲得R1是氫的式I化合物。 其中p是0、1、2；W是低級烷基；且R、R3、R4、R5、R6及X同前文定義。式II化合物是在酸或堿催化劑存在下以式V的醛處理合適的官能化的式IV化合物來制備的(Braun，R.A.；Mosher，W.A.J.Amer.Chem.Soc.1958，80，2749)。 制備式I化合物環(huán)系的第二種方法由美國專利3843666提出，其中通式VI化合物與催化量的有機(jī)羧酸或有機(jī)磺酸在惰性溶劑如芳香族烴中，在75℃-175℃中加熱6-24小時(shí)， 其中R、R3、R4、R5、R6及X同前文定義。
式VI化合物通過在惰性溶劑中以肼處理通式VII化合物來制備。該反應(yīng)在15℃-20℃下進(jìn)行最多長達(dá)24小時(shí)。 或者，式I化合物可以在不分離式VI化合物下直接由式VII化合物與肼反應(yīng)制備，例如在惰性溶劑，如甲醇中，在催化劑，如乙酸存在下，在60℃至所采用的惰性溶劑的沸點(diǎn)間的溫度下加熱式VII化合物和肼。
式I化合物還可以通過使式XVI化合物 其中R、R3、R4、R5、R6及X同前文定義，與肼在惰性溶劑，如甲醇中，在15℃至所采用的惰性溶劑的沸點(diǎn)間的溫度下反應(yīng)而制備。
具結(jié)構(gòu)式VII的化合物可以在堿性條件下以式V的醛處理式VIII化合物而制備。該反應(yīng)在惰性溶劑中在5℃至10℃溫度下進(jìn)行3-6小時(shí)的時(shí)間， 其中Y是任何常規(guī)離去基團(tuán)，例如氯、溴、碘、甲苯磺酸根或甲磺酸根而R3、R4、R5、R6及X同前文定義。
式VII的化合物還可以通過式II化合物與環(huán)氧化試劑，如過氧化氫，在惰性試劑，如甲醇、二氯甲烷、水或它們的混合物中，在0℃-100℃下，任選在堿存在下反應(yīng)而制備。
VI的環(huán)化也可以通過用無機(jī)酸如鹽酸、硫酸或磷酸處理而進(jìn)行。該反應(yīng)在低級烷醇中在15℃-20℃溫度下進(jìn)行12-48小時(shí)。然后該反應(yīng)產(chǎn)物，IX，可以通過與有機(jī)羧酸或有機(jī)磺酸在直鏈醚或環(huán)醚中，在50℃-150℃溫度下加熱8-30小時(shí)而被芳香化。 式IX可以通過用式(RxCO)2O(結(jié)構(gòu)X)的酸酐，其中Rx是C1-4烷基，在惰性溶劑如芳族烴，在35℃-200℃溫度下處理5-8小時(shí)而二乙?；玫绞絏I化合物。 然后式XI化合物通過與無機(jī)酸或有機(jī)酸在惰性溶劑中，在35℃-200℃溫度下加熱4-8小時(shí)而芳香化為式XII化合物。最后，式XII化合物可以通過在惰性溶劑如水或低級醇中在堿金屬或堿土金屬氫氧化物存在下，在50℃-150℃溫度下加熱8-30小時(shí)而轉(zhuǎn)變成式I化合物。 通式II化合物可以通過在惰性溶劑，如甲醇中，在35℃-150℃的溫度范圍內(nèi)與肼反應(yīng)而環(huán)化成為式XIII化合物。 式I化合物可以通過使式XIII化合物與脫氫試劑，如硫、氧、鈀、二氧化錳或二氧化鉛，任選在一種惰性溶劑，如烴存在下，在15℃-250℃的溫度范圍內(nèi)反應(yīng)來制備。
上述轉(zhuǎn)化反應(yīng)的特定實(shí)例可見于美國專利3843665和3843666。
通過相應(yīng)的腙的Wolf-Kishner還原反應(yīng)可以使橋聯(lián)羰基轉(zhuǎn)化為亞甲基(Mosher，W.A.，Tawfik，E.-Z.，Lipp，D.W.J.Org.Chem.1971，36，3890)。
橋聯(lián)羰基官能化的其它方法以及特定實(shí)例可見于日本專利申請JP 60130521 A2，和B.Loev，美國專利3004983(1960)。
式I化合物可以通過使式XIV化合物 與強(qiáng)堿，如正丁基鋰在-78℃至25℃的溫度范圍內(nèi)反應(yīng)，隨后與式R2COG(結(jié)構(gòu)XV)化合物反應(yīng)來制備，其中R2同前文定義且G代表C1-6烷氧基。
式IV、VIII、XIV、XV和XVI化合物或者從商業(yè)上獲得或者通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的方法制備。
X代表SO、或SO2的式I化合物可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)員已知的方法，例如采用適當(dāng)摩爾當(dāng)量數(shù)的3-氯過苯甲酸氧化X代表S的式I化合物而制備。
X代表式-C＝NOR7基團(tuán)的式I化合物可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的方法使X代表羰基的式I化合物，與式H2NOR7化合物反應(yīng)而制備。
R1＝4-吡啶基的式I化合物可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的方法在吡啶環(huán)的2-位進(jìn)一步官能化，例如，通過吡啶-N-氧化物介導(dǎo)的重排反應(yīng)。
式I化合物的某些取代基可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的方法相互轉(zhuǎn)化。例如烷氧基取代基可以與適當(dāng)?shù)拿呀怆x試劑如氫溴酸、三溴化硼或鹽酸吡啶反應(yīng)獲得具有羥基取代基的式I化合物?；蛘?，可以使具有羥基取代基的式I化合物烷基化而制備具有烷氧基取代基的式I化合物。羧酸酯取代基可以轉(zhuǎn)變成羧基或酰胺取代基并且羧酸取代基可以轉(zhuǎn)變成羧酸酯或酰胺取代基。硝基取代基可以被還原成胺并且胺可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的方法?；?。
本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員能夠理解，某些取代基可與上述步驟中所述的某些試劑反應(yīng)。在此情況下應(yīng)當(dāng)采用其它方法或在反應(yīng)前保護(hù)反應(yīng)性取代基并在反應(yīng)后去保護(hù)。
下列實(shí)施例用于解釋本發(fā)明，其僅為舉例而已。各實(shí)施例的終產(chǎn)物通過下列一種或多種方法鑒別高效液相色譜，元素分析，核磁共振譜，紅外光譜和高分辨率質(zhì)譜。下列縮略語被采用IMS＝工業(yè)用甲基化酒精LCMS＝液相色譜/質(zhì)譜實(shí)施例1a)將茚滿-1-酮(3.3g)、4-甲酰苯甲酸甲酯(5.0g)，哌啶(0.6ml)和冰醋酸(0.5ml)的混合物蒸汽浴加熱3小時(shí)。所得固體物質(zhì)在工業(yè)用甲基化酒精(200ml)中煮沸然后乘熱過濾。所得固體殘留物以工業(yè)用甲基化酒精洗滌并干燥得到4-(1-氧代亞茚滿-2-基甲基)苯甲酸甲酯，m.p.194-198℃。
b)將得自a)的產(chǎn)物(1.5g)混懸于甲醇(10ml)和二氯甲烷(15ml)中并攪拌在0-5℃下，同時(shí)先后加入2M氫氧化鈉溶液(2.7ml)和30％過氧化氫(100vol.1.1ml)。在0-5℃下攪拌該混合物5分鐘，然后在室溫下攪拌24小時(shí)。將二氯甲烷(100ml)加入到混合物中，然后以鹽水(2×50ml)洗滌、干燥、過濾并蒸發(fā)得到4-(1-氧代螺[茚滿-2，2’-環(huán)氧乙烷]-3’-基)苯甲酸甲酯，m.p.160-163℃。水相以5M鹽酸酸化并以二氯甲烷萃取獲得4-(1-氧代螺[茚滿-2，2’-環(huán)氧乙烷]-3’-基)苯甲酸，m.p.220℃分解。
c)將得自b)的4-(1-氧代螺[茚滿-2，2’-環(huán)氧乙烷]-3’-基)苯甲酸(780mg)、甲醇(50ml)、水合肼(0.18ml)和冰醋酸(6滴)沸騰回流24小時(shí)。冰浴冷卻該混合物并過濾得到4-(1，4-二氫茚并[1，2-c]吡唑-3-基)苯甲酸，m.p.＞320℃。
d)將得自c)的產(chǎn)物(5.3g)和二氯甲烷(250ml)的混合物在室溫下攪拌，然后加入草酰氯(5ml)和無水N，N-二甲基甲酰胺(6滴)，將混合物在室溫下攪拌10分鐘然后沸騰回流90分鐘。減壓去溶劑得到粗制酰氯，其直接用于下一步實(shí)驗(yàn)。
e)室溫下將來自d)的酰氯(3.73g)在二氯甲烷(150ml)中攪拌，然后加入三乙胺(3ml)，再加入4-氨基吡啶(0.9g)。將該混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)。加入水(150ml)和5M氫氧化鈉溶液(50ml)并將混合物在室溫?cái)嚢?0分鐘。過濾該混合物并以二氯甲烷和水洗滌殘留物。合并濾液和洗液，分離并干燥二氯甲烷層并蒸發(fā)得到固體與起先過濾所得固體混合并通過快速硅膠柱層析，采用二氯甲烷/乙醇(10∶1)洗脫分離得到N-(4-吡啶基)-4-(1，4-二氫茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-苯甲酰胺。
f)在室溫下，向攪拌的無水四氫呋喃(50ml)中的得自e)的產(chǎn)物(1.9g)的混合物中分批加入氫化鋰鋁(830mg)。將該混合物沸騰回流1小時(shí)。將混合物冷卻到0-5℃并加入到乙酸乙酯(70ml)中，然后加入水(70ml)。將混合物攪拌10分鐘并過濾得到固體A。分離水相并進(jìn)一步以乙酸乙酯(100ml)萃取。固體A以乙醇攪拌并過濾。合并乙酸乙酯萃取物和乙醇濾液并蒸干。所得殘留物通過快速柱層析純化采用二氯甲烷/乙醇(10∶1)洗脫得到4-(1，4-二氯茚并[1，2-c]吡唑)-N-(4-吡啶基)苯甲胺，m.p.270-274℃。
b)在20℃下用二氯甲烷(100ml)和甲醇(100ml)攪拌得自a)的產(chǎn)物(28.0g)，然后先后加入2M氫氧化鈉溶液(50ml)和過氧化氫(20ml，100vol.)。將混合物在20℃下攪拌24小時(shí)。加入另外的過氧化氫(10.0ml，100vol.)并將混合物再攪拌24小時(shí)。再加入另外的過氧化氫(10ml，100vol.)并將混合物再攪拌64小時(shí)。用冰醋酸中和反應(yīng)混合物并過濾收集形成的固體并干燥得到3’-(4-硝基苯基)-1-氧代螺[茚滿-2，2’-環(huán)氧乙烷]。
c)使得自b)的產(chǎn)物(10.0g)溶解于甲醇(180ml)中并將水合肼(1.78g)加入到所得溶液中，隨后加入冰醋酸(30滴)。將該混合物沸騰回流5小時(shí)，然后冷卻至20℃并在此溫度下靜置18小時(shí)。過濾收集固體并在丙酮中重結(jié)晶得到3-(4-硝基苯基)-1，4-二氫茚并[1，2-c]吡唑，m.p.267-270℃。
d)使得自c)的產(chǎn)物(3.0g)混懸于工業(yè)用甲基化酒精(200ml)中并加入5％披鈀碳(250mg)，隨后加入甲酸銨(2.05g)。攪拌該混合物并在70℃下加熱3小時(shí)，然后冷卻至室溫并再過濾。減壓濃縮濾液并以二氯甲烷研磨得到4-(1，4-二氫茚并[1，2-c]吡唑-3-基)苯胺，m.p.253-254℃。
e)使得自d)的產(chǎn)物(1.0g)溶解于二氯甲烷(30ml)中并加入三乙胺(0.62ml)。將該混合物冷卻至0℃并在攪拌中加入苯磺酰氯(0.79g)。將該混合物升溫至20℃并在此溫度下攪拌2小時(shí)。再加入三乙胺(0.62ml)和苯磺酰氯(0.79g)并將混合物在室溫下攪拌4小時(shí)，再令其在室溫下靜置16小時(shí)。先后加入乙醚(80ml)，水(40ml)。過濾收集沉淀的固體，以碳酸氫鈉溶液和醚洗滌，然后在60℃下真空干燥。該物質(zhì)在丙酮中重結(jié)晶得到固體，通過快速硅膠柱層析純化，采用二氯甲烷洗脫得到固體，其被鑒定為4’-(1-苯基-磺酰基(1，4-二氫茚并[1，2-c]吡唑-3-基)N-苯磺?；桨?。
f)使得自e)的產(chǎn)物(0.56g)混懸于甲醇(40ml)中并加入2M氫氧化鈉溶液(5.3ml)。在20℃下攪拌所得清澈溶液20分鐘。將該混合物倒入2M鹽酸(75ml)中并通過過濾收集所得固體，以飽和碳酸鈉(25ml)和乙酸乙酯(25ml)將所得固體攪拌30分鐘，然后過濾得到N-[4-(1，4-二氫茚并[1，2-c]吡唑-3-基)苯基]苯磺酰胺，m.p.286-288℃。
b)將得自a)的產(chǎn)物(1.4g)、咪唑(0.95g)和四氫呋喃(40ml)在氮?dú)庵杏?0℃下沸騰回流6小時(shí)。過濾該混合物并將濾液減壓蒸發(fā)得到的殘留物在乙酸乙酯和2M鹽酸之間分配。過濾收集所得固體并干燥得到4-(1，4-二氫茚并[1，2-c]吡唑-3-基)咪唑-1-基乙酰苯胺二鹽酸鹽。m.p.264-266℃。
b)將得自a)的產(chǎn)物(0.65g)和無水甲苯(30ml)在0-5℃下攪拌并在0-5℃下加入氫化二異丁基鋁(4.4ml 1.0M的環(huán)己烷溶液)。加入后溶液在30分鐘內(nèi)升溫至室溫，然后沸騰回流30分鐘以上并煮沸3小時(shí)。冷卻該混合物并在10-15℃下加入到5M鹽酸(10ml)中。然后將混合物加熱至90℃ 10分鐘，再冷卻并分離出甲苯層。水層以乙酸乙酯洗滌然后，以5M氫氧化鈉溶液中和到pH 7-8。該混合物以乙酸乙酯萃取、干燥、過濾并蒸發(fā)得到的膠狀物在40℃下真空干燥得到固體，其被鑒定為4-甲?；?N-(2-嗎啉乙基)苯磺酰胺，m.p.114-116℃。
c)將得自b)的產(chǎn)物(200mg)、2-溴二氫茚酮(142mg)和無水甲醇(3ml)在0℃下攪拌，并向該混合物中加入甲醇鈉(44mg)的甲醇(0.5ml)溶液。將該混合物在0℃下攪拌2小時(shí)得到一固體，過濾收集之，以甲醇洗滌并真空干燥得到環(huán)氧化物。
d)將得自c)的產(chǎn)物(3.7g)、水合肼(1ml)、冰醋酸(10滴)和乙醇(100ml)沸騰回流26小時(shí)并使乙醇通過Soxhlet提取器的分子篩干燥。減壓去溶劑并以快速柱層析純化殘留物得到4-(1，4-二氫茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-(2-嗎啉乙基)苯磺酰胺，m.p.218-220℃。
b)將得自a)的產(chǎn)物(1.5g)混懸于甲醇(10ml)和二氯甲烷(15ml)中并在0-5℃下攪拌期間先后加入2M氫氧化鈉溶液(2.7ml)和30％過氧化氫(100vol.1.1ml)。在0-5℃下攪拌該混合物5分鐘，然后在室溫下攪拌24小時(shí)。將二氯甲烷(100ml)加入到混合物中，然后以鹽水(2×50ml)洗滌，干燥、過濾并蒸發(fā)得到4-(1-氧代螺[茚滿-2，2’-環(huán)氧乙烷]-3’-基)苯甲酸甲酯，m.p.160-163℃。水相以5M鹽酸酸化并以二氯甲烷萃取得到4-(1-氧代螺[茚滿-2，2’-環(huán)氧乙烷]-3’-基)苯甲酸，m.p.220℃下降解。
c)將4-(1-氧代螺[茚滿-2，2’-環(huán)氧乙烷]-3’-基)苯甲酸甲酯(750mg)、甲醇(30ml)和水合肼(0.16ml)的混合物在室溫下攪拌，同時(shí)加入冰醋酸(6滴)。將該混合物沸騰回流24小時(shí)然后令其在室溫下靜置24小時(shí)，然后冷卻至0℃并過濾得到4-(1，4-.二氫茚并[1，2-c]吡唑-3-基)苯甲酸甲酯，m.p.224-226℃。
d)使得自c)的酯(2.20g)和N，N-二乙基乙二胺(7ml)沸騰回流4.5小時(shí)。使該混合物冷卻至室溫，然后加入沸點(diǎn)為40-60℃的石油醚(50ml)。過濾混合物得到酰胺。
e)使此酰胺(2.75g)混懸于四氫呋喃(80ml)中并在室溫下氮?dú)庵袛嚢柘录尤霘浠囦X(1.14g)。將混合物攪拌3.5小時(shí)，然后再加入氫化鋰鋁(1.14g)和四氫呋喃(40ml)。22.5小時(shí)后加入第三份氫化鋰鋁然后將該混合物攪拌24小時(shí)。使該混合物沸騰回流2.5小時(shí)，然后在室溫下靜置過夜。該混合物在氮?dú)庵斜∠吕鋮s期間先后加入乙酸乙酯(100ml)，和水(100ml)，分離有機(jī)層，洗滌、干燥并蒸發(fā)得到油，使其在快速硅膠柱上以乙酸乙酯/乙醇/三乙胺(7∶2∶1)純化。合并合適的流分并蒸發(fā)得到膠狀物(0.85g)，使其加溫溶解于乙醇(5ml)中并向該溶液中加入濃鹽酸(0.6ml)。減壓蒸發(fā)該混合物并將殘留的膠狀固體以乙醇(10ml)煮沸，然后以冰浴冷卻并過濾得到N-[2-(N，N-二乙胺基)乙基]-4-(1，4-二氫茚并[1，2-c]吡唑-3-基)芐胺三鹽酸鹽，m.p.225℃。
b)將得自a)的產(chǎn)物(18.0g)在乙醇(150ml)中在含4分子篩的Soxhlet提取器套管填充的燒瓶中攪拌并沸騰回流。先后加入1滴冰醋酸和水合肼(3.9ml)并使該混合物沸騰并在回流條件下攪拌64小時(shí)。冷卻該混合物和收集沉淀并直接用于下一步實(shí)驗(yàn)。
c)將得自b)的產(chǎn)物(4.0g)溶解于四氫呋喃(200ml)并在0℃下氮?dú)庵兄鸬螖嚢杓尤氲綒浠?1.53g)的四氫呋喃(100ml)的攪拌混懸液中。加入后，將混合物攪拌15分鐘然后冷卻到-78℃。逐滴加入叔丁基鋰(17.0ml的1.5M戊烷溶液)并在此溫度下攪拌45分鐘后加入二甲基甲酰胺(4.7ml)。在-78℃的溫度下保持一小時(shí)，然后令反應(yīng)混合物緩慢升溫至室溫。小心加入1M鹽酸(200ml)淬滅該混合物。分離有機(jī)層，以水、飽和碳酸氫鹽、鹽水洗滌，然后干燥、過濾和蒸發(fā)得到紅色蠟狀固體，將其以快速硅膠柱層析純化，用含20％乙酸乙酯的石油醚為移動相沸點(diǎn)為260-280℃，得到3-(4-甲酰苯基)-1H-[1]苯并噻吩并[3，2-c]吡唑，m.p.261-263℃。
d)將得自c)的產(chǎn)物(100mg)、3-(1-咪唑基)丙胺(58mg)的含冰醋酸(0.03ml)的1，2-二氯乙烷溶液在室溫下攪拌1小時(shí)。加入三乙氧基硼氫化鈉(84mg)并將該混合物在室溫下攪拌16小時(shí)。加入另外的三乙氧基硼氫化鈉(90mg)并將混合物在室溫下攪拌24小時(shí)。將該混合物倒入攪拌的飽和碳酸氫鈉水溶液(約20ml)中。分離有機(jī)層并以二氯甲烷萃取水層。合并的有機(jī)層和萃取液以水洗滌、干燥并減壓蒸發(fā)得到固體使其溶解于乙醇(15ml)并加入2滴濃鹽酸。減壓濃縮該溶液得到的固體以二乙醚研磨、過濾并干燥得到4-(1H-[1]苯并噻吩并[3，2-c]吡唑-3-基)-N-[3-(咪唑-1-基)丙基]苯甲酰胺三鹽酸鹽，m.p.206-208℃(分解)。
a)膠囊在膠囊制備中，將10份重量的活性化合物和240份重量的乳糖分散并混合。將該混合物填充到硬明膠膠囊中，每粒膠囊含有1個(gè)單位劑量或部分單位劑量的活性化合物。
b)片劑以下列成份制備片劑。
重量份活性化合物 10乳糖 190玉米淀粉 22聚乙烯吡咯烷酮 10硬脂酸鎂3將活性化合物、乳糖和部分淀粉分散、混合并將所得混合物以聚乙烯吡咯烷酮的乙醇溶液制粒。將干燥顆粒與硬脂酸鎂及剩余淀粉混合。然后在壓片機(jī)中將該混合物壓片得到每片含有一個(gè)單位劑量或單位劑量一部分的活性化合物的片劑。
c)腸溶包衣片以上述(b)中描述的方法制備片劑。采用20％鄰苯二甲酸醋酸纖維素和3％鄰苯二甲酸二乙脂的乙醇二氯甲烷(1∶1)溶液以常規(guī)方法對片劑進(jìn)行腸溶包衣。
d)栓劑在栓劑制備中，將100份重量的活性化合物與1300份重量的甘油三酯栓劑基質(zhì)合并并混合形成每粒含治療有效量的活性成份的栓劑。等效性盡管本發(fā)明已經(jīng)以其優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行特別說明和描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)懂得在不背離附屬權(quán)利要求書定義的本發(fā)明的精神和范圍下可以進(jìn)行多種形式上的改變和細(xì)化。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員能夠僅以常規(guī)經(jīng)驗(yàn)識別或可以界定，與本說明書特別描述的本發(fā)明特定實(shí)施方案等價(jià)的諸多方案。這些等價(jià)方案包括在權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.式I化合物 及其藥學(xué)上可接受的鹽，其中L1代表式(E)s(CH2)q基團(tuán)，其中E代表NR24、O或S，s是0或1且q是0至6的整數(shù)，條件是當(dāng)s是1時(shí)q至少是1，其中亞烷基鏈任選被一個(gè)或多個(gè)下列取代基取代任選被一個(gè)或多個(gè)羥基、鹵素或任選取代的氨基取代的C1-6烷基；任選被一個(gè)或多個(gè)羥基、鹵素或任選取代的氨基取代的C1-6烷氧基；羥基；鹵素；或任選取代的氨基；A代表CONH、NHCO、SO2NH、NHSO2、或NR25；L2代表式(CH2)r基團(tuán)，其中r是0至6的整數(shù)，其中亞烷基鏈任選被一個(gè)或多個(gè)下列取代基取代任選被一個(gè)或多個(gè)羥基、鹵素或任選取代的氨基取代的C1-6烷基；任選被一個(gè)或多個(gè)羥基、鹵素或任選取代的氨基取代的C1-6烷氧基；羥基；鹵素；或任選取代的氨基；R2代表任選被一個(gè)或多個(gè)下列取代基取代的C1-6烷基鹵素、羥基、C1-6烷氧基或任選取代的氨基；任選被一個(gè)或多個(gè)下列取代基取代的C1-6烷氧基鹵素、羥基、C1-6烷氧基或任選取代的氨基；或R2是鹵素、羥基、氰基、硝基、氨基甲?；1-6鏈烷?；?C1-6烷氧基)羰基或任選取代的氨基；n代表0、1、2或3；X代表a)取代的亞甲基，b)羰基，c)氧，d)式C＝NOR7基團(tuán)，其中R7代表H或C1-4烷基，e)式NR8基團(tuán)，其中R8代表H、任選取代的C1-4烷基或任選取代的苯基，f)式(CH2)n基團(tuán)，其中n是1、2或3，或g)式S(O)p基團(tuán)，其中p是0、1或2；R3、R4、R5和R6獨(dú)立地代表a)H，b)鹵素，c)任選被一個(gè)或多個(gè)下列取代基取代的C1-6烷基羥基、C1-6烷氧基、鹵素或任選取代的氨基，d)任選被一個(gè)或多個(gè)下列取代基取代的C1-6烷氧基羥基；C1-6烷氧基；鹵素；或任選取代的氨基，條件是這些基團(tuán)不是結(jié)合在烷氧基的氧原子結(jié)合的碳原子上；e)任選取代的苯氧基，f)羥基，g)式CORa基團(tuán)，其中Ra代表羥基、C1-6烷氧基或Ra代表任選取代的氨基，h)任選取代的氨基，i)C1-6鏈烷?；?，j)硝基，k)任選取代的苯基C1-6烷基，l)任選取代的苯基C1-6烷氧基，m)氰基，或o)C2-4鏈烯基或C2-4鏈炔基，其中的每一個(gè)任選被苯基取代，而后者任選被一個(gè)或多個(gè)下列基團(tuán)取代C1-6烷基，C1-6烷氧基或鹵素；并且1)當(dāng)A是SO2NH或NHSO2時(shí)R1代表a)任選取代的苯基，b)任選取代的雜芳基，c)含氮原子的五、六或七元飽和雜環(huán)，其任選含有選自O(shè)、S或N的另外的雜原子并任選被C1-6烷基取代，其中所述飽和環(huán)可以通過碳或雜原子連接，d)任選取代的氨基或e)C1-6烷氧基；2)當(dāng)A代表CONH或NHCO時(shí)R1代表a)被硝基或一個(gè)或多個(gè)C1-6烷氧基取代的苯基，所述烷氧基任選被一個(gè)或多個(gè)下列基團(tuán)取代鹵素、羥基、C1-6烷氧基或任選取代的氨基，b)任選取代的雜芳基或c)含氮原子的五、六或七元飽和雜環(huán)，其任選另含選自O(shè)、S或N的雜原子并且任選被C1-6烷基取代，其中所述飽和環(huán)可以通過碳原子連接或d)C1-6烷氧基；3)當(dāng)A代表NR25基團(tuán)且q至少是1時(shí)，則R1代表a)任選取代的苯基，b)任選取代的雜芳基或c)任選取代的氨基；以及4)當(dāng)A代表NR25基團(tuán)并且q是0和s是0時(shí)，則R1代表任選取代的雜芳基；R24和R25獨(dú)立地代表H；C1-6烷基，其任選被一個(gè)或多個(gè)下列基團(tuán)取代羥基、C1-6烷氧基、鹵素或任選取代的氨基；C1-6鏈烷?；駽1-6烷基磺?；粭l件是兩雜原子不連接于同一個(gè)sp3雜化碳原子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中X是CH2或S。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中X是CH2且A是NR25。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中X是S且A是NR25。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中X是CH2且A是HNSO2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中X是CH2且A是SO2NH。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中X是CH2且A是CONH。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中X是CH2且A是HNCO。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中X是CH2，A是NR25、L1是(CH2)q，其中q是1-6的整數(shù)并且烷基鏈任選被一個(gè)或多個(gè)下列取代基取代任選被一個(gè)或多個(gè)羥基、鹵素或任選取代的氨基取代的C1-6烷基；任選被一個(gè)或多個(gè)羥基、鹵素或任選取代的氨基取代的C1-6烷氧基；羥基；鹵素；或任選取代的氨基；L2是鍵且R1是任選取代的吡啶基。
10.一種化合物，它選自4-(1，4-二氫茚并[1，2-c]吡唑)-N-(4-吡啶基)芐胺N-[4-(1，4-二氫茚并[1，2-c]吡唑-3-基)苯基]苯磺酰胺4-(1，4-二氫茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-(2-甲氧基乙基)苯甲酰胺4-(1，4-二氫茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-(4-硝基苯基)苯甲酰胺4-(1，4-二氫茚并[1，2-c]吡唑-3-基)咪唑-1-基乙酰苯胺4-(1，4-二氫茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-[2-(咪唑-1-基)乙基]苯胺4-(1，4-二氫茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-(2-嗎啉乙基)苯磺酰胺4-(1，4-二氫茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-(2-甲氧基乙基)苯磺酰胺N-[2-(N，N-二乙基氨基)乙基]-4-(1，4-二氫茚并[1，2-c]吡唑-3-基)芐胺N-[2-(N，N-二乙基氨基)乙基]-4-(1，4-二氫茚并[1，2-c]吡唑-3-基)苯磺酰胺4-(1，4-二氫茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-(2-嗎啉乙基)芐胺N-(4-乙氧基苯基)-4-(1，4-二氫茚并[1，2-c]吡唑-3-基)芐胺(S)-4-(1，4-二氫茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-(吡咯烷-2-基甲基)苯甲酰胺4-(1H-[1]苯并噻吩并[3，2-c]吡唑-3-基)-N-[3-(咪唑-1-基)丙基]芐胺4-(1H-[1]苯并噻吩并[3，2-c]吡唑-3-基)-N-(2-嗎啉基乙基)芐胺及其藥學(xué)上可接受的鹽，包括單一的對映體以及對映體的混合物。
11.一種藥用組合物，其包括權(quán)利要求1定義的式I化合物與藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體。
12.權(quán)利要求1定義的式I化合物作為藥物的用途。
13.權(quán)利要求1定義的式I化合物作為抑制蛋白激酶活性藥物的用途。
14.權(quán)利要求1定義的式I化合物在用于抑制蛋白激酶活性的藥物制備中的用途。
15.一種抑制蛋白激酶活性的方法，該方法包括對所述激酶給予足夠抑制所述激酶的酶活性的濃度的式I化合物。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述蛋白激酶是酪氨酸激酶。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述酪氨酸激酶是受體酪氨酸激酶或非受體酪氨酸激酶。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述酪氨酸激酶選自包括KDR、flt-1、TIE-2、Lck、Src、fyn和yes。
19.權(quán)利要求15的方法，其中所述酪氨酸激酶活性影響血管生成。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述酪氨酸激酶的抑制是抗血管生成。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述酪氨酸激酶的所述抑制作用抑制選自下列一組疾病的病情發(fā)展癌癥、關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化、牛皮癬、血管瘤、心肌血管生成、冠脈及腦血管側(cè)枝形成、缺血性肢端血管生成、角膜病、潮紅、新血管性青光眼、黃斑變性、傷口愈合、消化性潰瘍、螺桿菌相關(guān)性疾病、骨折、糖尿病性視網(wǎng)膜病和貓抓熱。
22.權(quán)利要求16的方法，其中所述酪氨酸激酶活性引起血管通透性過高或水腫形成。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述酪氨酸激酶的抑制是抗水腫的。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述酪氨酸激酶的抑制作用抑制選自下列一組疾病病情的發(fā)展燒傷、慢性肺病、中風(fēng)、息肉、牛皮癬、過敏性炎癥、黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病、卵巢過度刺激綜合征和腦腫瘤相關(guān)性腦水腫。
25.權(quán)利要求16的方法，其中所述酪氨酸激酶的抑制具有抗腫瘤作用。
26.權(quán)利要求16的方法，其中所述酪氨酸活性的抑制作用與抗生育或墮胎作用相關(guān)。
27.權(quán)利要求15的方法，其中所述蛋白激酶是絲氨酸激酶。
28.權(quán)利要求15的方法，其中所述蛋白激酶是蘇氨酸激酶。
29.權(quán)利要求16的方法，其中所述酪氨酸激酶是KDR。
30.與說明書描述相同的制備方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及抑制蛋白激酶活性的式(I)化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽,涉及含有這些吡唑類的藥用組合物并涉及這些吡唑類的制備方法。
文檔編號A61K31/416GK1368970SQ00808326
公開日2002年9月11日 申請日期2000年3月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月6日
發(fā)明者K·J·多伊勒, P·拉菲蒂, R·W·斯特勒, A·圖爾納, D·J·維爾金斯, L·D·阿諾 申請人:克諾爾股份有限公司