專利名稱：應(yīng)用病毒治療腫瘤的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可以復(fù)制并可在干擾素(IFN)介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答中殺死腫瘤細(xì)胞的病毒。在這一點(diǎn)上，RNA和DNA病毒均可應(yīng)用。本發(fā)明還涉及這些病毒在治療腫瘤性疾病中的應(yīng)用，所述腫瘤性疾病包括癌癥和巨大腫瘤。
背景技術(shù)：
包括癌癥在內(nèi)的腫瘤性疾病是導(dǎo)致人類死亡的首要因素之一。在美國(guó)，每年有超過130萬(wàn)的新確診癌癥病例和55萬(wàn)的死亡病例。在癌癥轉(zhuǎn)移到身體第二個(gè)部位之前的早期探察，可以大大增加宿主的存活機(jī)會(huì)。但是，癌癥的早期探察并非總是可行，甚至在早期探察成功的時(shí)候，治療也往往不盡如人意，特別是高度惡性的癌癥病例。癌癥的治療包括化療和放療，對(duì)晚期病例療效差強(qiáng)人意，特別是當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)相當(dāng)巨大和/或腫瘤負(fù)荷較大時(shí)。(見Hillard Stanley，癌癥治療報(bào)告，第61卷，第1期，1977年1/2月，29-36頁(yè)，Tannock，癌癥研究，第42卷，4921-4926頁(yè)，1982年12月)。
與暴露于多種病毒有關(guān)的腫瘤消退業(yè)已有所報(bào)道。所述的絕大多數(shù)病毒對(duì)人類具有致病性，包括流行性腮腺炎病毒和麻疹病毒。其他特定病毒對(duì)特定類型癌癥細(xì)胞的作用也已有報(bào)道。Smith等，(1956)癌癥，9，1211(腺病毒對(duì)宮頸癌的作用)；Holzaepfel等，(1957)癌癥，10，557(腺病毒對(duì)上皮性腫瘤的作用)；Taylor等，(1970)國(guó)立癌癥研究所雜志，44，515(牛腸病毒-l對(duì)肉瘤-l的作用)；Shingu等，(1991)普通病毒學(xué)雜志，72，2031(牛腸病毒MZ-468對(duì)白血病細(xì)胞F-647的作用)；Suskind等，(1957)PSEBM，94，309(柯薩奇B3病毒對(duì)HeLa腫瘤細(xì)胞的作用)；Rukavishnikova等，(1976)病毒學(xué)學(xué)報(bào)，20，387(甲型流感病毒株對(duì)腹水腫瘤的作用)。
最早的文獻(xiàn)描述了應(yīng)用減毒病毒活疫苗而使腫瘤部分消退的現(xiàn)象，上述治療是為了使患者獲得針對(duì)天花或狂犬病的免疫能力。見DePace，N.G.(1912)Ginecologia，9，82-88；Salmon，P.& Baix(1922)Compt.Rend.Soc.Biol.，86，819-820。在自然感染麻疹的病例中，也已觀察到腫瘤的部分消退和白血病的消退。見Pasquinucci，G.(1971)柳葉刀，1，136；Gross，S.(1971)柳葉刀，1，397-398；Bluming，A.Z.和Ziegler，J.L.(1971)柳葉刀，2，105-106。在一項(xiàng)有90名癌癥患者參加的研究中，患者自愿感染流行性腮腺炎活病毒，結(jié)果在79名患者中出現(xiàn)了腫瘤的部分消退。見Asada(1994)癌癥，34，1907-1928。盡管這些病毒的副作用是暫時(shí)的，但感染這些人類病原體的嚴(yán)重后遺癥是人們關(guān)注的一個(gè)焦點(diǎn)。
× × × ×病毒分類如下[見Murphy A和Kingsbury DW主編，病毒學(xué)，第2版，1990，(Ed.Field，B.N.)，Raven出版社，紐約，9-35頁(yè)]分類特征 病毒科名稱RNA病毒ssaRNA，正義鏈， 細(xì)小核糖核酸病毒科，嵌杯狀病毒科未分段，無(wú)包膜，ss RNA，正義鏈， 披膜病毒科，黃病毒科未分段， 冠狀病毒科有包膜ss RNA，反義鏈， 棒狀病毒科，線狀病毒科未分段， 副粘病毒科有包膜ss RNA，反義鏈， 正粘病毒科有片段，有包膜ss RNA，雙義鏈， 布尼病毒科，沙粒病毒科有片段，有包膜dsbRNA，正義鏈， 呼腸病毒科，雙RNA病毒科有片段，無(wú)包膜ss RNA，DNA復(fù)制過程中， 逆轉(zhuǎn)錄病毒科正義鏈，未分段，有包膜DNA病毒ss/dsDNA，無(wú)包膜 嗜肝DNA病毒科ss DNA，無(wú)包膜細(xì)小病毒科dsDNA，無(wú)包膜 乳多空病毒科，腺病毒科dsDNA，有包膜 皰疹病毒科，痘病毒科，虹彩病毒科ass＝單鏈bds＝雙鏈皰疹病毒科(皰疹病毒)中包括α-皰疹病毒(包括生殖器水痘病毒和生殖器單純皰疹病毒)，β-皰疹病毒和γ-皰疹病毒三個(gè)亞科。
新城疫病毒(NDV)是副粘病毒科(或副粘病毒)中的一員。NDV的自然宿主是雞及其他禽類。典型的NDV可與動(dòng)物宿主細(xì)胞表面的特定分子結(jié)合，然后與細(xì)胞表面融合，并將其遺傳物質(zhì)射入宿主細(xì)胞內(nèi)。NDV是一種細(xì)胞致死性病毒。一旦進(jìn)入細(xì)胞，病毒基因就會(huì)指導(dǎo)宿主細(xì)胞生成病毒拷貝，并導(dǎo)致宿主細(xì)胞的死亡，釋放NDV拷貝，感染其他細(xì)胞。與一些病毒不同，尚未發(fā)現(xiàn)NDV可致人類任何嚴(yán)重疾病。與其他種類病毒(如HTLV-1，乙型肝炎病毒)不同，尚未發(fā)現(xiàn)副粘病毒可致癌。
在一小部分暴露于NDV的患者中，曾有報(bào)道腫瘤的一過性消退，見Csatary，L.K.(1971)柳葉刀，2，825。Csatary觀察到，一名養(yǎng)雞農(nóng)民的胃腸癌在其養(yǎng)殖的雞群流行新城疫時(shí)消退。在一個(gè)類似的軼聞報(bào)道中，Cassel，W.A.和Garrett，R.E.觀察到在一例已經(jīng)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者中，向?qū)m頸腫瘤注射NDV后，原位宮頸癌消退。見(1965)癌癥，18，863-868。由于腫瘤殺傷活性的機(jī)制一直被認(rèn)為與免疫有關(guān)，因此旨在闡述病毒對(duì)腫瘤具有直接細(xì)胞毒作用的工作一直沒有開展。相反，研究人員一直致力于揭示NDV的免疫介導(dǎo)效應(yīng)。見，如Murray，D.R.，Cassel，W.A.，Torbin，A.H.，Olkowski，Z.L.，& Moore，M.E.(1977)癌癥，40，680；Cassel，W.A.，Murray，D.R.，& Phillips，H.S.(1983)癌癥，52，856；Bohle，W.，Schlag，PJ.，Leibrich，W.，Hohenberger，P.，Manasterski，M.，Miller，P.，和Schirrmacher，V.(1990)癌癥，66，1517-1523。
在上述參考文獻(xiàn)中，導(dǎo)致腫瘤消退的特定病毒的篩選基于運(yùn)氣或試驗(yàn)以及失誤。僅僅在最近，才開發(fā)出基于機(jī)制研究并有理論支持的應(yīng)用DNA病毒治療癌癥的方法。這類方法的一個(gè)實(shí)例是在研發(fā)重組腺病毒載體時(shí)發(fā)現(xiàn)的，該載體僅能在發(fā)生于特定組織的腫瘤中復(fù)制(Rodriguez，R.等，1997癌癥研究，572559-2563)，或在那些缺乏某種關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白的腫瘤中復(fù)制(Bischoff，JR等，1996科學(xué)，274373-376)。最近的另一種方法是應(yīng)用不具有復(fù)制能力的重組腺病毒載體來(lái)恢復(fù)某些腫瘤細(xì)胞已經(jīng)喪失的一種重要蛋白功能(Zhang，WW等，1994癌癥基因治療，15-13)。最后，單純皰疹病毒業(yè)已經(jīng)工程修飾，優(yōu)先在快速分裂的細(xì)胞中復(fù)制，而快速分裂正是腫瘤的特征所在(Mineta，T.等，1994癌癥研究，543963-6966)。
申請(qǐng)?zhí)?8/260,536的美國(guó)專利公布了應(yīng)用NDV或其他副粘病毒治療癌癥，在此全文引入作為參考。
病毒干擾素轉(zhuǎn)基因表達(dá)應(yīng)用病毒療法治療癌癥的一種常用方法是利用病毒載體，將特定基因給予腫瘤瘤體。
重組腺病毒、腺伴隨病毒、痘苗病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒均已經(jīng)修飾，單獨(dú)表達(dá)干擾素基因或與其他細(xì)胞因子基因聯(lián)合表達(dá)。
在Zhang等發(fā)表的文章中((1996)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA934513-4518)，表達(dá)人干擾素同質(zhì)(即合成)基因的重組腺病毒用于在裸鼠上治療人乳腺癌(和其他)異種移植物。作者總結(jié)道“……將病毒的溶瘤細(xì)胞作用和致病性低的病毒結(jié)合，該病毒本身對(duì)干擾素或干擾素基因治療有抗性，可能成為一種治療多種不同腫瘤的富有成效的方法，特別是對(duì)乳腺癌”。與本發(fā)明涉及干擾素敏感性病毒不同，Zhang等(1996)應(yīng)用了干擾素耐藥性腺病毒治療腫瘤。
在Zhang等發(fā)表的文章中((1996)癌癥基因治療，331-38)，表達(dá)同質(zhì)干擾素基因的腺伴隨病毒(AAV)用來(lái)在體外轉(zhuǎn)導(dǎo)人腫瘤細(xì)胞，然后給裸鼠注射。轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞或者根本未形成腫瘤，或者較未轉(zhuǎn)導(dǎo)的對(duì)照組生長(zhǎng)緩慢。而且，將一種轉(zhuǎn)導(dǎo)的人腫瘤細(xì)胞注射入另一種腫瘤瘤體，結(jié)果可導(dǎo)致未轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤的體積縮小。在Peplinski等的文章中((1996)腫瘤外科學(xué)紀(jì)事，315-23)，γ干擾素(和其他細(xì)胞因子，單獨(dú)表達(dá)或聯(lián)合表達(dá))在小鼠乳腺癌模型中得到了檢測(cè)。用經(jīng)重組痘苗病毒修飾過的腫瘤細(xì)胞免疫小鼠。當(dāng)再次暴露于腫瘤細(xì)胞時(shí)，經(jīng)病毒修飾細(xì)胞免疫的小鼠無(wú)瘤存活時(shí)間延長(zhǎng)，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
Gastl等((1992)癌癥研究，526229-6236)應(yīng)用表達(dá)γ干擾素的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體體外轉(zhuǎn)導(dǎo)腎腫瘤細(xì)胞。結(jié)果顯示，對(duì)免疫系統(tǒng)功能至關(guān)重要的許多蛋白質(zhì)在這些細(xì)胞中的產(chǎn)量大幅提高。
Restifo等((1992)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，1751423-1431)應(yīng)用表達(dá)γ干擾素的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)鼠肉瘤細(xì)胞系，使腫瘤細(xì)胞系可以向CD8+T細(xì)胞更有效地提呈病毒抗原。
Howard等((1994)紐約科學(xué)院紀(jì)事，716167-187)應(yīng)用表達(dá)γ干擾素的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)鼠和人黑色素瘤細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)免疫功能至關(guān)重要的蛋白質(zhì)在這些細(xì)胞的表達(dá)增加。這些細(xì)胞較之未轉(zhuǎn)導(dǎo)的親本細(xì)胞系對(duì)小鼠的致瘤性弱，并可在體內(nèi)激活腫瘤特異性CTL反應(yīng)。
應(yīng)用治療劑量的干擾素作為腫瘤病毒治療的佐劑眾所周知，由于干擾素具有免疫增強(qiáng)作用，幾項(xiàng)研究檢測(cè)了干擾素與其他癌癥病毒疫苗治療的聯(lián)合應(yīng)用。
在Kirchner等的文章中((1995)世界泌尿?qū)W雜志，13171-173)，208名患者應(yīng)用經(jīng)NDV修飾、放射致死的自體腎細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞免疫，并聯(lián)合小劑量IL-2或α干擾素治療。作者表示，這種治療方案使局部晚期的腎細(xì)胞癌患者的自然病程得到改善。治療劑量約為3.3×105PKU/kg。這是局部治療，與系統(tǒng)治療不同，目的是誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)。
Tanaka等((1994)強(qiáng)調(diào)腫瘤免疫學(xué)的免疫治療雜志，16283-293)給小鼠聯(lián)合應(yīng)用α干擾素和重組痘苗病毒，作為癌癥疫苗療法模型。該研究顯示，接受干擾素的小鼠較之未接受的小鼠存活能力具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的改善。作者將干擾素的效果歸功于在動(dòng)物中誘導(dǎo)了CD8陽(yáng)性T細(xì)胞。
Arroyo等((1990)癌癥免疫學(xué)與免疫治療，31305-311)應(yīng)用結(jié)腸癌小鼠模型，檢測(cè)了α干擾素和/或IL-2聯(lián)合治療對(duì)痘苗病毒結(jié)腸瘤細(xì)胞溶解劑(VCO)治療癌癥效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VCO+IL-2+IFN的三聯(lián)療法在該鼠模型中是最有效的。這一方法有賴于免疫是抗治療活性的機(jī)制。
在上述研究中，干擾素用于增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別能力。
發(fā)明目的本發(fā)明的一個(gè)目的是為包括癌癥的疾病治療提供病毒。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是為包括癌癥的腫瘤性疾病的治療提供病毒。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種方法，該方法可以選擇和/或篩查用于腫瘤性疾病治療的備選病毒。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供病毒遺傳工程學(xué)指導(dǎo)，用以在治療腫瘤性疾病時(shí)增加其治療效用。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種方法，用該方法可以篩選病毒治療的潛在靶細(xì)胞，目的是評(píng)價(jià)備選靶細(xì)胞對(duì)病毒殺傷力的敏感性。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供病毒治療管理的指導(dǎo)。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種治療巨大腫瘤的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供純化的病毒以及獲得純化病毒的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及應(yīng)用病毒感染哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，包括將具有復(fù)制能力的干擾素敏感性克隆病毒給予哺乳動(dòng)物。所述病毒選自腺病毒、細(xì)小病毒、乳多空病毒、虹彩病毒和皰疹病毒科的RNA病毒和DNA病毒。
本發(fā)明還涉及應(yīng)用病毒感染哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，包括將具有復(fù)制能力的干擾素敏感性克隆病毒系統(tǒng)性給予哺乳動(dòng)物。
本發(fā)明還涉及一種治療哺乳動(dòng)物包括癌癥在內(nèi)的腫瘤性疾病的方法，該方法包括將治療有效劑量的具有復(fù)制能力的干擾素敏感性克隆病毒給予哺乳動(dòng)物。所述病毒選自腺病毒、細(xì)小病毒、乳多空病毒、虹彩病毒和皰疹病毒科的RNA病毒和DNA病毒。
本發(fā)明還涉及應(yīng)用病毒感染哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，包括將具有復(fù)制能力的干擾素敏感性克隆痘苗病毒給予哺乳動(dòng)物。所述痘苗病毒在一個(gè)或多個(gè)病毒基因上具有一個(gè)或多個(gè)突變，所述病毒基因與干擾素抗病毒活性的阻斷有關(guān)，選自K3L，E3L和B18R基因。
本發(fā)明還涉及一種治療哺乳動(dòng)物包括癌癥在內(nèi)的腫瘤性疾病的方法，該方法是將治療有效劑量的具有復(fù)制能力的干擾素敏感性痘苗病毒給予哺乳動(dòng)物。所述痘苗病毒在一個(gè)或多個(gè)病毒基因上具有一個(gè)或多個(gè)突變，所述病毒基因與干擾素抗病毒活性的阻斷有關(guān)，選自K3L，E3L和B18R基因。
本發(fā)明還涉及應(yīng)用病毒感染哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，該腫瘤至少1cm。所述方法包括將選自(1)RNA病毒；(2)嗜肝DNA病毒；(3)細(xì)小病毒；(4)乳多空病毒；(5)皰疹病毒；(6)痘病毒；和(7)虹彩病毒的克隆病毒給予哺乳動(dòng)物。
本發(fā)明還涉及一種治療哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，包括將治療有效劑量的克隆病毒給予哺乳動(dòng)物，所述病毒選自(1)RNA病毒；(2)嗜肝DNA病毒；(3)細(xì)小病毒；(4)乳多空病毒；(5)皰疹病毒；(6)痘病毒；和(7)虹彩病毒。這里，腫瘤的大小至少1厘米。
本發(fā)明還涉及一種治療哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，包括將治療有效劑量的腫瘤細(xì)胞致死性RNA病毒給予哺乳動(dòng)物，所述哺乳動(dòng)物的腫瘤負(fù)荷至少占總體重1.5％。
本發(fā)明還涉及一種方法，該方法可用于篩選從患者處得到的新鮮腫瘤細(xì)胞或組織，并測(cè)定該細(xì)胞或組織對(duì)病毒殺傷力的敏感性，包括應(yīng)用干擾素敏感性病毒，采用差異細(xì)胞毒試驗(yàn)，檢測(cè)細(xì)胞或組織。
本發(fā)明還涉及在哺乳動(dòng)物中鑒別病毒抗腫瘤活性的方法，包括a)應(yīng)用備檢病毒感染i)有干擾素介導(dǎo)的抗病毒活性缺陷的細(xì)胞，和ii)具有干擾素介導(dǎo)的抗病毒活性的細(xì)胞，和b)測(cè)定備選病毒是否優(yōu)先殺傷有干擾素介導(dǎo)的抗病毒活性缺陷的細(xì)胞，而非具有干擾素介導(dǎo)的抗病毒活性的細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及制備用于抗腫瘤治療的病毒的方法，包括a)修飾現(xiàn)有病毒，以降低或消除病毒滅活干擾素抗病毒作用的病毒機(jī)制，并任選b)創(chuàng)建一種減毒突變，結(jié)果使其較現(xiàn)有病毒的毒力弱。
本發(fā)明還涉及一種在哺乳動(dòng)物中控制病毒復(fù)制的方法，該哺乳動(dòng)物應(yīng)用選自RNA病毒、腺病毒、痘病毒、虹彩病毒、細(xì)小病毒、嗜肝DNA病毒，水痘病毒、β皰疹病毒和γ皰疹病毒的病毒治療，包括給予抗病毒化合物。
本發(fā)明還涉及篩查腫瘤細(xì)胞、腫瘤組織或組織切片的方法，該方法可以測(cè)定哪些腫瘤細(xì)胞或組織允許病毒結(jié)合，包括將腫瘤細(xì)胞、組織或組織切片應(yīng)用免疫試驗(yàn)或免疫染色，顯示腫瘤細(xì)胞或腫瘤組織上存在的病毒受體量。
本發(fā)明還涉及應(yīng)用病毒感染哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，包括在隨后的至少一次大劑量病毒給予前，將脫敏劑量的具有復(fù)制能力的干擾素敏感性克隆病毒系統(tǒng)給予。
本發(fā)明還涉及應(yīng)用病毒感染哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，包括將具有復(fù)制能力的干擾素敏感性克隆病毒給予哺乳動(dòng)物，整個(gè)過程至少持續(xù)4分鐘。
本發(fā)明還涉及應(yīng)用病毒感染哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，包括將具有復(fù)制能力的克隆病毒給予，所述病毒選自新城疫病毒株MK107，新城疫病毒株NJ Roakin，新培斯病毒和皰疹性口炎病毒。
本發(fā)明包括i)應(yīng)用無(wú)沉淀超速離心法純化的克隆副粘病毒；ii)一種純化至至少2×109PFU/mg蛋白水平的克隆副粘病毒；iii)一種純化至至少1×1010PFU/mg蛋白水平的克隆副粘病毒；iv)一種純化至至少6×1010PFU/mg蛋白水平的克隆副粘病毒；v)一種純化至至少2×109PFU/mg蛋白水平的克隆RNA病毒；vi)一種純化至至少1×1010PFU/mg蛋白水平的克隆RNA病毒；vii)一種純化至至少6×1010PFU/mg蛋白水平的克隆RNA病毒；viii)一種細(xì)胞致死性克隆DNA病毒，所述病毒對(duì)干擾素敏感，純化至至少2×109PFU/mg蛋白水平；ix)一種具有復(fù)制能力的痘苗病毒，所述病毒a)在一個(gè)或多個(gè)K3L、E3L和B18R基因中含有一個(gè)或多個(gè)突變，和b)在編碼胸腺嘧啶脫氧核苷激酶、核苷酸還原酶、痘苗生長(zhǎng)因子、胸苷酸激酶、DNA連接酶、dUTP酶的基因中具有一個(gè)或多個(gè)減毒突變；x)一種具有復(fù)制能力的痘苗病毒，所述病毒在選自K3L、E3L和B18R的兩個(gè)或多個(gè)基因中含有一個(gè)或多個(gè)突變；xi)一種(2’-5’)A類似物表達(dá)被修飾的皰疹病毒，該修飾使皰疹病毒對(duì)干擾素的敏感性增強(qiáng)；以及xii)一種在ω-3存在減毒突變的呼腸病毒，所述突變使病毒對(duì)干擾素敏感；xiii)一種具有復(fù)制能力的細(xì)胞致死性病毒，所述病毒干擾素敏感，并純化至至少2×109PFU/mg蛋白水平；
xiv)一種純化至至少2×109PFU/mg蛋白水平的呼腸病毒。
本發(fā)明還包括下述方法i)一種純化RNA病毒的方法，包括以下步驟a)產(chǎn)生克隆病毒；以及b)應(yīng)用無(wú)沉淀超速離心法純化所述病毒；或c)應(yīng)用切線層流過濾法純化所述克隆病毒，隨后可進(jìn)行或不進(jìn)行凝膠滲透層析；以及ii)一種純化副粘病毒的方法，包括應(yīng)用無(wú)沉淀超速離心法純化所述病毒，或應(yīng)用切線層流過濾法純化所述病毒，隨后可進(jìn)行或不進(jìn)行凝膠滲透層析。
本發(fā)明還涉及在哺乳動(dòng)物中治療疾病的方法，在所述疾病中致病細(xì)胞對(duì)干擾素介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答有缺陷，所述方法包括將治療有效劑量的具有復(fù)制能力的干擾素敏感性克隆病毒給予哺乳動(dòng)物。
本發(fā)明還涉及應(yīng)用病毒感染哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，包括將具有復(fù)制能力的干擾素敏感性克隆RNA病毒給予哺乳動(dòng)物。
本發(fā)明還涉及哺乳動(dòng)物病毒性疾病的治療，包括將治療有效劑量的具有復(fù)制能力的克隆病毒給予哺乳動(dòng)物。
本發(fā)明還涉及感染哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，包括給予選自副粘病毒科、正粘病毒科、棒狀病毒科、披膜病毒科、黃病毒科、細(xì)小核糖核酸病毒科、冠狀病毒科、呼腸病毒科、痘病毒科、皰疹病毒科和細(xì)小病毒科的病毒。
本發(fā)明還涉及治療腫瘤腹水的方法，包括給予具有復(fù)制能力的干擾素敏感性克隆病毒。
本發(fā)明還涉及減輕哺乳動(dòng)物疼痛的方法，包括給予具有復(fù)制能力的干擾素敏感性克隆病毒。
本發(fā)明還涉及治療哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，包括應(yīng)用免疫試驗(yàn)方法測(cè)定從所述哺乳動(dòng)物獲得的樣本病毒受體的存在量，并且如果受體存在，將能與受體結(jié)合的具有復(fù)制能力的干擾素敏感性克隆病毒給予哺乳動(dòng)物。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了抗β干擾素抗體對(duì)病毒抗原表達(dá)和NHEK(正常人上皮角化細(xì)胞)細(xì)胞內(nèi)感染滴度的影響。
圖2顯示了β干擾素對(duì)不同細(xì)胞中(正常人皮膚成纖維細(xì)胞CCD922-sk和兩種類型的頭頸部腫瘤細(xì)胞(KB和Hep2細(xì)胞))病毒抗原表達(dá)的影響。
圖3A顯示了干擾素對(duì)CCD922-sk細(xì)胞中病毒抗原表達(dá)的影響，圖3B顯示了干擾素對(duì)KB細(xì)胞中病毒抗原表達(dá)的影響。
圖4顯示了攜帶人卵巢ES-2腫瘤的無(wú)胸腺小鼠在生理鹽水或NDV治療下的生存曲線。
圖5顯示了一組人腫瘤細(xì)胞系和正常細(xì)胞系對(duì)干擾素的反應(yīng)性。
圖6顯示了SW620腫瘤細(xì)胞系對(duì)PPMK107和PPSINDBIS-Ar339感染的劑量反應(yīng)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種新機(jī)制的發(fā)現(xiàn)，通過該機(jī)制，病毒復(fù)制可以選擇性殺傷對(duì)干擾素(IFN)介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答具有缺陷的腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明還提供了篩選、設(shè)計(jì)、純化和應(yīng)用病毒治療包括癌癥和巨大腫瘤在內(nèi)的腫瘤性疾病的方法。基于腫瘤細(xì)胞具有選擇性干擾素介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答缺陷，本發(fā)明的病毒在這些腫瘤細(xì)胞中可以選擇性復(fù)制并殺傷這些細(xì)胞。將適宜劑量的病毒給予后可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，而正常細(xì)胞由于擁有完整的干擾素介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答，可以限制病毒的復(fù)制，從而不被殺傷。本發(fā)明的主題包括應(yīng)用副粘病毒，如NDV和其他病毒治療包括腫瘤性疾病如癌癥在內(nèi)的疾病。本發(fā)明還教導(dǎo)如何篩選和制備適用于腫瘤性疾病治療的其他病毒。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括鑒定備選腫瘤組織是否適用病毒治療的方法。最后，本發(fā)明還闡述了高純度病毒的制備方法。
應(yīng)用干擾素敏感性病毒包括NDV治療腫瘤性疾病的理論基礎(chǔ)NDV顯示對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷作用新城疫病毒對(duì)多種人腫瘤細(xì)胞具有選擇性細(xì)胞毒作用，而對(duì)絕大多數(shù)正常人細(xì)胞的作用明顯趨弱。在差異細(xì)胞毒試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，源于腎癌、胰腺癌、肉瘤、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌以及成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的人腫瘤細(xì)胞對(duì)NDV較很多正常人細(xì)胞腎上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角化細(xì)胞、黑色素細(xì)胞以及上皮細(xì)胞(見實(shí)施例1)敏感3-4個(gè)數(shù)量級(jí)。差異細(xì)胞毒試驗(yàn)還可用以新鮮分離患者細(xì)胞或腫瘤組織。
實(shí)施例1描述了用以界定NDV腫瘤殺傷活性的體外試驗(yàn)。試驗(yàn)測(cè)定了殺傷50％在5天內(nèi)培養(yǎng)的試驗(yàn)細(xì)胞所需的病毒量。實(shí)施例2和3顯示了體內(nèi)試驗(yàn)的結(jié)果，試驗(yàn)中，病毒通過瘤體內(nèi)(實(shí)施例2)或靜脈內(nèi)(實(shí)施例3)途徑給予攜帶人腫瘤異種移植物的無(wú)胸腺小鼠。結(jié)果顯示，在檢測(cè)化療藥物潛力的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物模型中，NDV可以使多種類型的人類腫瘤消退。
應(yīng)用病毒抗原免疫組化染色顯示了NDV在腫瘤中特異性復(fù)制的證據(jù)(實(shí)施例2)。瘤體內(nèi)注射病毒30分鐘內(nèi)，病毒抗原在腫瘤組織中呈現(xiàn)陰性。但治療2天后，腫瘤內(nèi)加強(qiáng)免疫染色可以看見病毒抗原，提示病毒在腫瘤內(nèi)復(fù)制。重要的是，病毒在腫瘤組織內(nèi)特異性復(fù)制，因?yàn)榕c腫瘤鄰近的結(jié)締組織和皮膚，病毒抗原呈陰性。
重要的是，如應(yīng)用UV滅活的非克隆病毒進(jìn)行的研究所示(Lorence，R.等，1994，國(guó)立癌癥研究所雜志，861228-1233)，NDV的有效復(fù)制對(duì)于病毒殺傷感染細(xì)胞至關(guān)重要。
NDV瘤體內(nèi)或靜脈內(nèi)給予后還可導(dǎo)致巨大腫瘤的消退(實(shí)施例4-9)。無(wú)胸腺小鼠瘤體內(nèi)NDV治療巨大皮內(nèi)A375人類黑色素瘤異種移植物(最大徑≥10mm；腫瘤體積≥300mm3)導(dǎo)致腫瘤的高消退率(實(shí)施例4-8)。無(wú)胸腺小鼠靜脈內(nèi)NDV治療巨大皮下HT1080人類纖維肉瘤異種移植物(最大徑≥10mm)，結(jié)果在6只小鼠中有5只發(fā)生了腫瘤完全或部分消退(實(shí)施例9)。
細(xì)胞因子I類干擾素家族是病毒感染的重要負(fù)性調(diào)節(jié)因子I類干擾素包括主要從原始造血細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的α干擾素和主要從成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的β干擾素。Joklik，W.K.1990，干擾素，383-410頁(yè)。病毒學(xué)，第2版，B.N.Fields，D.M.Knipe等編輯，Raven出版有限公司，紐約；以及Sreevalsan，T.1995，應(yīng)用α和β干擾素進(jìn)行生物治療臨床預(yù)試驗(yàn)研究，347-364頁(yè)。癌癥的生物治療，第2版，V.T.DeVita，Jr.，S.Hellman，和S.A.Rosenberg，J.B.LiPPincott公司，費(fèi)城。兩種類型的干擾素通過基本相同的作用機(jī)制發(fā)揮功能，包括降解病毒復(fù)制的中間產(chǎn)物雙鏈RNA，抑制通過雙鏈RNA激活的蛋白激酶的活性，從而抑制細(xì)胞翻譯(Joklik，W.K.1990，干擾素，383-410頁(yè)。病毒學(xué)，第2版，B.N.Fields，D.M.Knipe等編輯，Raven出版有限公司，紐約；以及該書引用的參考文獻(xiàn))。其他幾種病毒(流感病毒，EB病毒，SV40，腺病毒，痘苗)通過一個(gè)或多個(gè)途徑抑制干擾素系統(tǒng)的機(jī)制，也使病毒可以有效復(fù)制(Katze，M.G.，1995，微生物趨勢(shì)，375-78)。
多種腫瘤細(xì)胞缺乏通過干擾素依賴機(jī)制限制病毒感染的能力人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)在用干擾素預(yù)處理后，對(duì)皰疹性口炎病毒復(fù)制的抑制敏感性較未轉(zhuǎn)化的成纖維對(duì)照細(xì)胞系弱300多倍(Maheshwari R.K.，1983，生物化學(xué)與生物物理學(xué)研究評(píng)論，17161-168)。本專利發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，感染共同培養(yǎng)的致瘤性人頭頸部腫瘤細(xì)胞(KB)和正常人皮膚成纖維細(xì)胞(CCD922-sk)，結(jié)果顯示開始時(shí)病毒在兩種細(xì)胞內(nèi)均有復(fù)制，然后，在正常細(xì)胞內(nèi)感染受到限制，而在腫瘤細(xì)胞中，病毒持續(xù)復(fù)制，并殺傷腫瘤細(xì)胞(實(shí)施例10)。而且，盡管正常細(xì)胞向培養(yǎng)基中分泌干擾素，但在建立的抗病毒狀態(tài)下，腫瘤細(xì)胞在產(chǎn)生的濃度下對(duì)干擾素?zé)o反應(yīng)。通過兩個(gè)分離的試驗(yàn)，獲得了干擾素在NDV殺傷腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞不同敏感性中所起作用的進(jìn)一步證據(jù)，在所述試驗(yàn)中，正常成纖維細(xì)胞(CCD922-sk)或正常上皮角化細(xì)胞(NHEK)在干擾素中和抗體存在的情況下，對(duì)NDV感染變得更加敏感(實(shí)施例11和12)。最后，在干擾素存在的情況下，平行感染正常成纖維細(xì)胞(CCD922-sk)和人腫瘤細(xì)胞(KB)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常細(xì)胞對(duì)添加的干擾素的抗病毒作用較之腫瘤細(xì)胞敏感至少100倍(實(shí)施例13和14)。多個(gè)腫瘤細(xì)胞系(總共9個(gè))的相似測(cè)試發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞系對(duì)NDV的殺傷相對(duì)敏感性與該細(xì)胞系對(duì)干擾素介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答無(wú)能之間存在清晰的相互關(guān)聯(lián)(實(shí)施例26)。
干擾素和細(xì)胞生長(zhǎng)目前存在幾種類型的干擾素(IFN)，包括天然和重組形式的α干擾素、β干擾素、ω干擾素和γ干擾素，以及合成同質(zhì)形式的干擾素(如，Zhang等(1996)癌癥基因治療，331-38所述)。除了導(dǎo)致其被發(fā)現(xiàn)的抗病毒活性，眾所周知，干擾素在細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的自然調(diào)節(jié)中起重要作用。干擾素被認(rèn)為是一種負(fù)性生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，幾種參與干擾素活性功能發(fā)揮和調(diào)節(jié)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)業(yè)已顯示在正常細(xì)胞中作為腫瘤抑制蛋白存在(Tanaka等，1994，細(xì)胞，77829-839)。而且，其他幾種拮抗干擾素抗病毒活性的蛋白質(zhì)業(yè)已顯示，在表達(dá)不當(dāng)時(shí)，具有致瘤潛力(見下，Barber，GN，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，914278-4282)。源于多種人類癌癥的細(xì)胞業(yè)已顯示編碼干擾素的基因缺失(James，CD等，癌癥研究，511684-1688)，并且在人宮頸癌(Petricoin，E等，1994，分子細(xì)胞生物學(xué)，141477-1486)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(Xu，B等，1994，血液，841942-1949)、和惡性黑色素瘤細(xì)胞(Linge，C.等，1995，癌癥研究，554099-4104)中觀察到干擾素功能的部分或完全喪失。
業(yè)已顯示，干擾素誘導(dǎo)性激酶(p68，PKR)是一種細(xì)胞和病毒蛋白合成的重要調(diào)節(jié)因子。將p68激酶的表達(dá)與活性和細(xì)胞分化狀態(tài)聯(lián)系起來(lái)的相互關(guān)系業(yè)已顯見。因此，分化不好的細(xì)胞，如那些在許多癌癥中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞，往往有p68功能的缺陷(Haines，G.K.等，1993，Virchows Arch B CeU Pathol.，63289-95)。缺乏p68活性的細(xì)胞通常對(duì)病毒介導(dǎo)的殺傷敏感，因?yàn)閜68激酶是干擾素誘導(dǎo)的抗病毒狀態(tài)的一種重要效應(yīng)物質(zhì)。p68的抗病毒活性可以通過與被定義為p58的細(xì)胞蛋白直接作用而被拮抗。當(dāng)在NIH3T3細(xì)胞中克隆并過量表達(dá)時(shí)，p58可使細(xì)胞表現(xiàn)轉(zhuǎn)化表型并呈非錨定依賴型生長(zhǎng)(BarberGN等，1994，Proc Natl Acad Sci USA，914278-4282)，并且很多人白血病細(xì)胞系業(yè)已顯示過量表達(dá)p58(Korth MJ等，1996，基因，170181-188)。p68激酶活性還可被Ras蛋白拮抗。表達(dá)突變、激活形式Ras的細(xì)胞顯示，不能通過雙鏈RNA激活p68激酶(Mundshau，L.J.，和Faller，D.V.，1992，生物化學(xué)雜志，26723092-23098)。
未分化細(xì)胞對(duì)病毒殺傷的敏感性可通過給予分化程度高的表型而逆轉(zhuǎn)(Kalvakolanu，DVR和Sen，G.C.1993，Proc Natl Acad SciUSA，903167-3171)。
定義具有干擾素介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答能力的細(xì)胞。這里應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“具有干擾素介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答能力的細(xì)胞”是指對(duì)低水平(如，10單位/ml)外源性干擾素有反應(yīng)的細(xì)胞，所述反應(yīng)是指相對(duì)于沒有干擾素存在的情況，干擾素敏感性病毒的復(fù)制能力顯著下降(至少10倍，更優(yōu)選至少100倍，更優(yōu)選至少1000倍，最優(yōu)選至少10,000倍)。病毒復(fù)制的程度通過檢測(cè)病毒量來(lái)測(cè)定(如，感染病毒，病毒抗原，病毒核酸)。正常成纖維細(xì)胞CCD922是具有干擾素介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答能力的細(xì)胞。
干擾素介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答缺陷細(xì)胞。這里應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“干擾素介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答缺陷細(xì)胞”是指不符合上述具有干擾素介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答能力的細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞，即，這些細(xì)胞對(duì)低水平(如，10單位/ml)外源性干擾素?zé)o反應(yīng)，所述反應(yīng)是指相對(duì)于沒有干擾素存在的情況，干擾素敏感性病毒的復(fù)制能力顯著下降?？谇荒[瘤細(xì)胞KB是干擾素介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答缺陷細(xì)胞。
克隆的。應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“克隆的”病毒定義為從單個(gè)感染病毒顆粒獲得的病毒，并且單獨(dú)的分子克隆具有顯著的核酸序列同源性。例如，序列同源是指在病毒中選取至少8個(gè)單獨(dú)的分子克隆，在300個(gè)以上相鄰核苷酸范圍內(nèi)，序列特異性高于95％，更優(yōu)選高于97％，更優(yōu)選高于99％，最優(yōu)選為100％。
細(xì)胞致死性。這里應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞致死性”病毒是指能夠感染細(xì)胞并導(dǎo)致細(xì)胞死亡的病毒。
脫敏。這里應(yīng)用的詞組脫敏是指應(yīng)用一種制劑進(jìn)行預(yù)處理，以減輕病毒給予引起的副作用。
脫敏劑量。這里應(yīng)用的詞組“脫敏劑量”是指為減輕隨后給予病毒引起的副作用而需要的病毒量。
差異細(xì)胞毒試驗(yàn)。這里應(yīng)用的詞組“差異細(xì)胞毒試驗(yàn)”是應(yīng)用病毒篩查腫瘤細(xì)胞或組織，指a)病毒感染腫瘤細(xì)胞以及一種或多種對(duì)照細(xì)胞或組織；b)在感染一天或多天以后，測(cè)定每個(gè)樣本的細(xì)胞存活力或死亡量(如，實(shí)施例1詳細(xì)描述的應(yīng)用染色指示劑測(cè)定細(xì)胞的活力)；以及c)根據(jù)結(jié)果，就可以估計(jì)樣本相對(duì)于對(duì)照組對(duì)病毒的敏感性(如，實(shí)施例1詳細(xì)描述的IC50測(cè)定)。
感染腫瘤。這里應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“感染腫瘤”是指將病毒核酸給予腫瘤細(xì)胞或組織。
干擾素敏感。這里應(yīng)用的詞組“干擾素敏感”病毒(如NDV)是指相對(duì)于無(wú)干擾素的情況，在有干擾素存在的情況下，復(fù)制能力顯著減弱(至少減弱10倍，優(yōu)選至少減弱100倍，更優(yōu)選至少減弱1000倍，最優(yōu)選至少減弱10,000倍)的病毒。在有或無(wú)低水平外源性干擾素(如10單位/ml)的情況下，收獲具有干擾素介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答能力的細(xì)胞中的病毒，通過檢測(cè)病毒量(如感染病毒，病毒抗原，病毒核酸)來(lái)確定上述病毒復(fù)制能力。
干擾素反應(yīng)性。這里應(yīng)用的詞組“干擾素反應(yīng)性”病毒(如NDV)是指在1.0moi(多樣性感染)感染后的病毒，在經(jīng)500單位/ml外源性α干擾素持續(xù)預(yù)處理24小時(shí)的細(xì)胞表達(dá)的病毒抗原，較未處理細(xì)胞至少少50％。測(cè)定是在感染后至少24小時(shí)，具有干擾素介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答能力的細(xì)胞中進(jìn)行的，并且，在第1天，就會(huì)檢測(cè)到病毒抗原表達(dá)50％的下降。
腫瘤和腫瘤性疾病。這里應(yīng)用的“腫瘤”是指新生的組織，包括腫瘤、良性生長(zhǎng)(如濕疣，乳頭瘤)和惡性生長(zhǎng)(如癌癥)。這里應(yīng)用的“腫瘤性疾病”是指表現(xiàn)為腫瘤的疾病。
具有復(fù)制能力。這里應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“具有復(fù)制能力”的病毒是指在腫瘤細(xì)胞中可以產(chǎn)生感染后代的病毒。
基本無(wú)污染雞卵蛋白。術(shù)語(yǔ)“基本無(wú)污染雞卵蛋白”是指病毒純度的水平，這里本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)用Western印跡法檢測(cè)不到卵白蛋白，所述方法包括1)每孔(寬3.3cm)病毒量為1.7×109PFU，進(jìn)行SDS-PAGE(十二烷基硫代硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)凝膠(厚1mm)；2)將病毒蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上；以及3)應(yīng)用兔抗卵白蛋白抗體兔IgG片段，將4mg/ml抗體濃度(購(gòu)自Cappel公司)1∶200稀釋，或多克隆抗體等價(jià)物進(jìn)行卵白蛋白的免疫染色，以及，更優(yōu)選，應(yīng)用敏感度為2.4ng/ml的電化學(xué)發(fā)光試驗(yàn)檢測(cè)不到卵白蛋白。
治療有效劑量。這里應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“治療有效劑量”是指在治療腫瘤性疾病時(shí)，可以產(chǎn)生預(yù)期效應(yīng)，如腫瘤生長(zhǎng)停止、腫瘤消退、臨床病情改善或存活增加的病毒數(shù)量。
本發(fā)明化合物多組病毒被用來(lái)選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞。自然存在的或工程學(xué)生產(chǎn)的病毒均可作為抗腫瘤劑發(fā)揮作用。這些病毒i)感染腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致其死亡；ii)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)具有復(fù)制能力；以及iii)由于干擾素的抗病毒效應(yīng)，在正常細(xì)胞中的殺傷作用受限。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，具有上述三種特征(i)感染腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致其死亡；(ii)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)具有復(fù)制能力；以及(iii)由于干擾素的抗病毒效應(yīng)，在正常細(xì)胞中的殺傷作用受限的病毒也可誘導(dǎo)干擾素。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，具有上述三種特征的病毒也可導(dǎo)致人類腫瘤的消退；和/或在靶定人群中，不會(huì)由于已經(jīng)存在的免疫而被中和。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，具有上述三種特征的病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞來(lái)說，是細(xì)胞致死性的。
根據(jù)本發(fā)明，副粘病毒(這里應(yīng)用的“副粘病毒”指副粘病毒科中的一員)可用來(lái)治療腫瘤，包括巨大腫瘤或宿主腫瘤負(fù)荷大。副粘病毒科科包括三類(1)副粘病毒；(2)麻疹樣病毒(麻疹病毒)；以及(3)呼吸道合胞病毒(肺病毒)。這些病毒含有RNA基因組。應(yīng)用細(xì)胞致死性副粘病毒科病毒，特別是副粘病毒，如新城疫病毒(“NDV”)和其他禽類副粘病毒如II型禽類副粘病毒，是實(shí)踐本發(fā)明的優(yōu)選方法。根據(jù)本發(fā)明，這些病毒的減毒株在腫瘤治療中特別有用。
根據(jù)本發(fā)明，NDV是一種特別優(yōu)選的病毒。根據(jù)其對(duì)雞和雞胚的影響，NDV可分為不同的三型?！暗投玖Α敝暧址Q為lentogenic，是指在最低致死劑量(MLD)下需要90-150小時(shí)殺死雞胚；“中等毒力”株又稱為mesogenic，是指在MLD下需要60-90小時(shí)殺死雞胚；“高毒力”株又稱為velogenic，是指在MLD下需要40-60小時(shí)殺死雞胚。見如Hanson和Brandly，1955(科學(xué)，122156-157)；以及Dardiri等，1961(Am.J.Vet.Res.，918-920)。這三型病毒都可應(yīng)用，優(yōu)選NDV的中等毒力株，如MK107株，NJ Roakin株和Connecticut-70726株(見實(shí)施例21-23)。其他中等毒力株明細(xì)單見如Schloer和Hanson，1968(病毒學(xué)雜志，240-47)。
為了某種目的，希望通過去除缺陷的干擾顆粒獲得克隆病毒以保證或增加某一病毒株的遺傳同質(zhì)性。通過克隆的方法去除缺陷的干擾顆?？梢栽黾咏K產(chǎn)物的純度，該純度通過每感染顆粒中病毒顆粒的總數(shù)(如顆粒數(shù)/PFU)來(lái)評(píng)價(jià)。
技術(shù)人員可利用任何可行的方法生產(chǎn)克隆病毒。如噬斑純化法是獲得克隆病毒的常規(guī)方法。見如Maassab等，Plotkin和Mortimer編輯，疫苗，費(fèi)城W.B.Saunders公司，1994，781-801頁(yè)。特別推薦三重噬斑純化法，該方法在每輪純化過程中選擇一塊符合預(yù)期特征的平板，如優(yōu)選的大小、形狀、外觀或代表親本株。生產(chǎn)克隆病毒的其他方法可應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的重組DNA技術(shù)。生產(chǎn)克隆病毒的另一種方法是應(yīng)用限制稀釋技術(shù)(如將病毒樣本稀釋液加入含單層易感細(xì)胞的微孔板內(nèi)，并使每孔平均感染病毒顆粒數(shù)等于或少于1)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，純化病毒被用來(lái)治療腫瘤性疾病。下面給出了純化雞卵獲得性病毒的優(yōu)選方法(在這些方法的任何步驟中，病毒都沒有聚集呈顆粒狀)。
純化方法Aa)生產(chǎn)克隆病毒(如噬斑純化法)b)用克隆病毒接種雞卵c)孵育雞卵d)冷藏雞卵e)從雞卵中收獲尿囊液f)從尿囊液中去除細(xì)胞殘留g)用無(wú)沉淀超速離心法離心尿囊液(如用不連續(xù)蔗糖梯度超速離心法)在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，在超速離心之前和(從尿囊液)中去除細(xì)胞殘留之前，增加了一些步驟，包括●冷凍然后解凍尿囊液●從病毒懸液中去除污染物質(zhì)(如通過離心的方法)在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，超速離心是通過連續(xù)層流超速離心法完成的。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及純化具有復(fù)制能力的RNA病毒的方法，包括的步驟a)生產(chǎn)克隆病毒，以及b)通過無(wú)沉淀超速離心法純化所述克隆病毒。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及純化副粘病毒(如NDV)的方法，包括應(yīng)用無(wú)沉淀超速離心法純化病毒。在超速離心之前，可以任選的其他純化步驟包括a)噬斑純化生產(chǎn)克隆病毒，b)用克隆病毒接種雞卵，
c)孵育雞卵，d)冷藏雞卵，e)從雞卵中收獲尿囊液，以及f)從尿囊液中去除細(xì)胞殘留。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及從雞卵或細(xì)胞培養(yǎng)液中純化具有復(fù)制能力的克隆病毒的方法，包括超速離心的步驟，但不包括產(chǎn)生病毒沉淀顆粒的步驟(實(shí)施例31)。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及純化副粘病毒(如NDV)的方法，包括應(yīng)用連續(xù)切線層流過濾法(TFF)純化病毒。還可任選另外的凝膠滲透層析純化病毒，其中，所述每一步驟均在穩(wěn)定緩沖液的存在下完成(實(shí)施例15)a)噬斑純化生產(chǎn)克隆病毒，b)用克隆病毒接種雞卵，c)孵育雞卵，d)冷藏雞卵，e)從雞卵中收獲尿囊液并用緩沖液稀釋尿囊液，f)通過TFF從尿囊液中去除細(xì)胞殘留g)通過TFF純化病毒h)通過凝膠滲透層析純化病毒通過凝膠滲透層析收獲的病毒還可任選應(yīng)用TFF濃縮。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及從雞卵或細(xì)胞培養(yǎng)液中純化具有復(fù)制能力的克隆病毒的方法，包括應(yīng)用連續(xù)切線層流過濾法(TFF)純化病毒，之后任選凝膠滲透層析，層析后也可任選TFF濃縮病毒。
克隆病毒應(yīng)用這些方法可以將克隆病毒包括副粘病毒(如NDV)純化至至少2×109PFU/mg蛋白質(zhì)，優(yōu)選至少3×109PFU/mg蛋白質(zhì)，更優(yōu)選至少5×109PFU/mg蛋白質(zhì)，更優(yōu)選至少1.0×1010PFU/mg蛋白質(zhì)，更優(yōu)選至少2.0×1010PFU/mg蛋白質(zhì)，更優(yōu)選至少3×1010PFU/mg蛋白質(zhì)，更優(yōu)選至少4×1010PFU/mg蛋白質(zhì)，更優(yōu)選至少5×1010PFU/mg蛋白質(zhì)，最優(yōu)選至少6×1010PFU/mg蛋白質(zhì)。
應(yīng)用這些方法可以將克隆病毒包括副粘病毒(如NDV)純化至某一水平，在該水平，每PFU病毒顆粒數(shù)少于10，更優(yōu)選少于5，更優(yōu)選少于3，更優(yōu)選少于2，最優(yōu)選少于1.2。(每PFU病毒顆粒數(shù)低代表純度高)。
RNA病毒在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些方法可以純化(至上述克隆病毒水平)RNA病毒包括(a)細(xì)胞致死性RNA病毒；(b)未分段、無(wú)包膜的單鏈RNA病毒；(c)有片段、有包膜的單鏈RNA病毒；(d)有片段、無(wú)包膜的雙鏈RNA病毒；(e)以及未分段、有包膜的單鏈RNA病毒(如副粘病毒(如NDV)以及如逆轉(zhuǎn)錄病毒)。
DNA病毒在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些方法可以純化(至上述克隆病毒水平)干擾素敏感性細(xì)胞致死性病毒，所述病毒選自(a)有包膜的雙鏈DNA病毒(包括痘病毒)；(b)無(wú)包膜的單鏈DNA病毒；以及(c)無(wú)包膜的雙鏈DNA病毒。
雞卵獲得性病毒在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些方法可以將雞卵獲得性病毒純化至基本不含污染雞卵蛋白的水平。在人類治療性應(yīng)用的病毒制劑中，優(yōu)選限制雞卵蛋白量，因?yàn)榇蟛糠蛛u卵蛋白如卵白蛋白是致敏原。
× × × ×表1顯示了用于治療包括癌癥在內(nèi)的腫瘤性疾病的病毒。在“Murphy A和Kingsbury DW，1990，病毒學(xué)，第2版(Ed.Fields，B.N.)，Raven出版社，紐約”中可以發(fā)現(xiàn)其他病毒科成員的實(shí)例，在此全文引入。任選這些病毒篩查自然發(fā)生的變異(特定病毒株和分離株)，所述變異導(dǎo)致變異病毒株與親本病毒株在干擾素產(chǎn)生方面不同。
在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)無(wú)論自然發(fā)生還是工程學(xué)生產(chǎn)的備選病毒，在腫瘤治療方面，均進(jìn)行了治療能力的檢測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，比較了殺傷50％干擾素介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答缺陷性細(xì)胞，如頭頸部腫瘤細(xì)胞KB所需的備選病毒量和殺傷50％相同數(shù)量的具有干擾素介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答能力的細(xì)胞，如正常皮膚成纖維細(xì)胞所需的病毒量。殺傷量可以應(yīng)用包括臺(tái)盼蘭排除法或MTT試驗(yàn)的任一方法進(jìn)行定量(見實(shí)施例1)。殺傷干擾素介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答缺陷性細(xì)胞所需病毒量較殺傷具有干擾素介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答能力的細(xì)胞所需病毒量顯著減少(如至少5倍)，說明受檢病毒具有腫瘤治療所需的治療能力。其他NDV病毒和新培斯病毒就是具有腫瘤選擇性殺傷能力的自然發(fā)生的病毒(見實(shí)施例21-23，和25)。
表1.用于癌癥治療的自然發(fā)生的病毒
了解在抗病毒狀態(tài)建立時(shí)涉及的因子可以創(chuàng)建篩查可能對(duì)病毒治療發(fā)生反應(yīng)的腫瘤的方法。原則上，可以篩查通過活檢獲得的患者腫瘤組織p68激酶、p58或其他與抗病毒狀態(tài)或細(xì)胞分化調(diào)節(jié)有關(guān)的因子的表達(dá)。其他因子包括但不限于干擾素反應(yīng)因子-1(IRF-1)，干擾素刺激基因因子-3(ISGF-3)，c-Myc，c-Myb和干擾素受體。如果c-Myc，c-Myb或p58高水平表達(dá)，表示腫瘤組織或細(xì)胞可備選用于病毒治療。如果，IRF-1，ISGF-3和干擾素受體低水平表達(dá)，表示腫瘤組織或細(xì)胞可備選用于病毒治療。
至少30％的人類腫瘤具有激活的Ras表型特征(Bos，J.L.，1989，癌癥研究，494682)。Ras表型的激活可由于下述原因?qū)е?，i)突變激活Ras蛋白表達(dá)，ii)野生型Ras蛋白高表達(dá)，或iii)酪氨酸激酶受體或其他Ras信號(hào)途徑成員如Grb2或Sos不受調(diào)控的表達(dá)。具有激活Ras表型的細(xì)胞較沒有激活Ras表型的相同細(xì)胞，對(duì)NDV(Lorence，R.M.等，1994，癌癥研究，546017-6021)和呼腸病毒(Strong，J.E.S.等，1998，EMBO，173351-3362)的殺傷更加敏感。激活的Ras業(yè)已顯示可以抑制干擾素誘導(dǎo)的反應(yīng)基因(Zullo，J.N.和Faller，D.V.，1988，分子細(xì)胞生物學(xué)，85080-5085)和dsRNA誘導(dǎo)的PKR活化(Mundschau，L.J.和Faller，D.V.，1992，生物化學(xué)雜志，26723092-23098)。設(shè)定PKR在干擾素介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答的誘導(dǎo)過程中起關(guān)鍵作用，具有激活Ras表型的細(xì)胞對(duì)NDV和呼腸病毒的殺傷敏感性增強(qiáng)，這一事實(shí)為利用本發(fā)明病毒選擇性殺傷干擾素介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答缺陷性細(xì)胞提供了更多的證據(jù)。
通過活檢獲得的患者腫瘤組織可用來(lái)篩查i)激活的Ras蛋白，ii)Ras的GTP結(jié)合片段(活性形式)，iii)MAPK的活性形式(如ERK1或ERK2)，或其他Ras途徑激活指示物質(zhì)的表達(dá)?；颊邩?biāo)本激活Ras表型的存在提示腫瘤組織可備選病毒治療。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，將活檢獲得的患者原代腫瘤組織或細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增，然后測(cè)定對(duì)適宜病毒療法的殺傷敏感性。在一個(gè)實(shí)施方案中，如上述，比較了殺傷50％腫瘤組織培養(yǎng)細(xì)胞所需的病毒量和殺傷50％正常培養(yǎng)細(xì)胞所需的病毒量，用以篩選備選病毒。腫瘤細(xì)胞對(duì)病毒制劑的殺傷敏感性較正常細(xì)胞高10倍或以上，說明該腫瘤細(xì)胞對(duì)病毒治療的細(xì)胞致死性效應(yīng)特別敏感。在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，還測(cè)定了靶腫瘤細(xì)胞對(duì)內(nèi)源性或外源添加的干擾素(應(yīng)用α或β干擾素，如10單位/ml，見實(shí)施例27)的反應(yīng)能力，測(cè)定方法是在干擾素存在的情況下，進(jìn)行上述篩選。
理解病毒粘附或進(jìn)入所需的細(xì)胞受體，可以進(jìn)一步篩查受體高表達(dá)從而對(duì)干擾素敏感性病毒更加敏感的腫瘤。這是對(duì)可能對(duì)病毒治療有反應(yīng)的患者進(jìn)行的另一水平篩查。優(yōu)選應(yīng)用干擾素敏感性病毒進(jìn)行治療，患者的腫瘤可能對(duì)干擾素有耐藥性，同時(shí)高表達(dá)病毒的細(xì)胞受體。原則上，患者的血清、腫瘤細(xì)胞、組織或組織切片均應(yīng)通過免疫試驗(yàn)或免疫染色的方法篩查血清、腫瘤細(xì)胞或腫瘤組織上的病毒受體量。例如，新培斯病毒就是通過高親和力的層粘連蛋白受體感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞(Wang等，1992，病毒學(xué)雜志，664992-5001)?，F(xiàn)已得知，這種受體在多種轉(zhuǎn)移癌上大量表達(dá)。這種高親和力的層粘連蛋白受體mRNA在胰腺癌細(xì)胞系Panc-1和結(jié)腸腺癌細(xì)胞系SW620上表達(dá)水平很高(Campo等，1992，美國(guó)病理學(xué)雜志，141107301983；Yow等，(1988)Proc.Natl Acad Sci，85，6394-6398)，而且這兩種細(xì)胞對(duì)新培斯病毒表達(dá)高度敏感(實(shí)施例25)。相反，直腸腺癌細(xì)胞系SW1463表達(dá)的高親和力層粘連蛋白受體mRNA水平很低(Yow等，(1988)Proc.Natl Acad Sci，85，6394-6398)，對(duì)PPSINDBIS-Ar339的殺傷耐受性較SW620細(xì)胞高4個(gè)數(shù)量級(jí)。
篩查或工程學(xué)合成了在正常細(xì)胞中對(duì)干擾素反應(yīng)不同(如，優(yōu)選對(duì)干擾素反應(yīng)增強(qiáng))的現(xiàn)存NDV，或其他病毒，包括RNA和DNA病毒。除了具有對(duì)干擾素很強(qiáng)的反應(yīng)能力，還篩查了其他病毒特征，或通過工程學(xué)手段，將其他病毒特征給予病毒。受體特異性發(fā)生改變(如新培斯病毒PPSINDBIS-Ar339，見實(shí)施例25)或神經(jīng)毒性降低的病毒也包括在本發(fā)明內(nèi)(如NDV病毒PPNJROAKIN，見實(shí)施例24)。本發(fā)明優(yōu)選具有通過細(xì)胞直接接觸進(jìn)行傳播能力的病毒。
這里描述的本發(fā)明包括很寬泛的病毒類型(見表1)，所述病毒通過與NDV很相似的方式用于腫瘤治療。另外，由于在正常細(xì)胞中抑制干擾素反應(yīng)的機(jī)制存在，一些不宜應(yīng)用的天然病毒可以任選工程學(xué)手段來(lái)規(guī)避上述限制。如果不經(jīng)修飾，具有抑制干擾素反應(yīng)機(jī)制的病毒對(duì)正常細(xì)胞的毒性較那些去除了該機(jī)制的病毒大。本發(fā)明提供(1)易于操作的載體的研發(fā)；以及(2)創(chuàng)建一系列治療病毒。操作包括添加干擾素基因，使病毒轉(zhuǎn)基因表達(dá)干擾素或其他干擾素反應(yīng)途徑激活因子。其他的改變還包括利用工程學(xué)手段表達(dá)前藥激活酶，如皰疹病毒胸腺嘧啶脫氧核苷激酶或胞嘧啶脫胺酶(Blaese RM等，1994，歐洲癌癥雜志，30A1190-1193)，以及表達(dá)適宜的標(biāo)記抗原，使免疫系統(tǒng)可以瞄準(zhǔn)腫瘤細(xì)胞。另外的改變包括應(yīng)用工程學(xué)手段使之表達(dá)靶細(xì)胞攜帶的這些受體的配體如，一些病毒感染靶細(xì)胞，就表達(dá)這些病毒的受體(見Mebastsion等，1997，細(xì)胞，90841-847；以及Schnell MJ等，1997，細(xì)胞，90849-857)。
除了上述的一種新城疫病毒，還有幾種新城疫病毒株顯示可以選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞。在應(yīng)用第二株中等毒力的新城疫病毒進(jìn)行差異細(xì)胞毒試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，對(duì)該病毒的殺傷，腫瘤細(xì)胞較正常細(xì)胞敏感3個(gè)數(shù)量級(jí)(實(shí)施例21)。另外，在應(yīng)用第三株中等毒力的新城疫病毒進(jìn)行差異細(xì)胞毒試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，對(duì)該病毒的殺傷，腫瘤細(xì)胞較正常細(xì)胞敏感80-5000倍(實(shí)施例22)。將這兩種中等毒力的新城疫病毒直接給予攜帶人腫瘤異種移植物的無(wú)胸腺小鼠腫瘤瘤體后，可導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)消退(實(shí)施例23)。
在分離的實(shí)驗(yàn)中，通過給具有免疫能力的無(wú)胸腺小鼠腦內(nèi)接種，分別研究了這三種不同新城疫病毒的安全性。研究結(jié)果顯示，具有完整免疫系統(tǒng)的小鼠可以很好地耐受這三種病毒。無(wú)胸腺小鼠腦內(nèi)接種揭示，其中一種病毒的耐受性顯著優(yōu)于其他兩種(實(shí)施例24)。這些結(jié)果顯示，在單一的病毒科中，可以存在病毒特性的重要差異，并可在治療方面開發(fā)，使其具有更好的療效和更高的安全性。
應(yīng)用溶瘤細(xì)胞性病毒治療后，另一種提高療效、減低毒性的方法是使用干擾素敏感性病毒，這需要腫瘤細(xì)胞優(yōu)選表達(dá)特定的細(xì)胞表面受體。Sinbdis病毒為這種限制提供了一個(gè)實(shí)例。新培斯病毒通過高親和力層粘連蛋白受體哺乳動(dòng)物細(xì)胞(Wang等，(1992)病毒學(xué)雜志，664992-5001)。在差異細(xì)胞毒試驗(yàn)中，當(dāng)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞同時(shí)感染新培斯病毒時(shí)發(fā)現(xiàn)，致瘤性和表達(dá)高親和力層粘連蛋白受體的細(xì)胞對(duì)該病毒的殺傷較其他細(xì)胞更敏感(實(shí)施例25)。在該試驗(yàn)中，表達(dá)高親和力層粘連蛋白受體的正常角化細(xì)胞(Hand等，(1985)癌癥研究，452713-2719)對(duì)新培斯病毒的殺傷具有耐受性。而且，對(duì)正常角化細(xì)胞和兩種不同腫瘤細(xì)胞系的干擾素敏感性和層粘連蛋白受體表達(dá)水平的分析發(fā)現(xiàn)，PPSINDBIS-Ar339選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞，所述腫瘤細(xì)胞i)對(duì)干擾素介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答有缺陷，并且ii)表達(dá)高親和力層粘連蛋白受體。
在皮下攜帶腺癌細(xì)胞SW620的無(wú)胸腺小鼠的體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PPSINDBIS-Ar339具有很強(qiáng)的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用(實(shí)施例32)。
皰疹性口炎病毒(VSV)為溶瘤細(xì)胞性病毒選擇性殺傷腫瘤的一般假說提供了證據(jù)，該假說是指腫瘤細(xì)胞對(duì)干擾素反應(yīng)的固有性缺陷致使這些細(xì)胞對(duì)具有復(fù)制能力的干擾素敏感性病毒的殺傷作用敏感。在有外源性干擾素存在的情況下，應(yīng)用VSV感染人非致瘤性細(xì)胞WISH和致瘤性細(xì)胞HT1080或KB，結(jié)果致瘤性細(xì)胞被選擇性殺傷(實(shí)施例26)。其他證據(jù)在實(shí)施例33中提供。在該實(shí)施例中，兩種不相關(guān)病毒在感染腫瘤細(xì)胞系是，表現(xiàn)了基本相同的行為。該細(xì)胞系對(duì)這兩種病毒的相似反應(yīng)顯示，這兩種不相關(guān)病毒在該腫瘤細(xì)胞系中的生長(zhǎng)受相似機(jī)制的控制。
下面列出了病毒明細(xì)單，這些病毒經(jīng)除去自然發(fā)生的抗干擾素活性修飾后，可用于病毒癌癥治療(見表2)。內(nèi)源性抗干擾素活性被摧毀或減弱的修飾病毒(優(yōu)選但非必須，除抗干擾素外還有減毒修飾，見表3)可用于癌癥治療。該明細(xì)列表包括但不限于下述病毒。由于同一類型的病毒間具有相似性，下面列出的每種特定病毒已經(jīng)鑒定的機(jī)制，也存在于該類病毒的其他成員中，表現(xiàn)為相同或功能類似的機(jī)制。更寬泛的病毒組在圓括號(hào)內(nèi)添加。通過任何方法，包括自然發(fā)生的突變，以及應(yīng)用工程學(xué)手段去除或點(diǎn)突變獲得的如下具有抗干擾素活性功能喪失的病毒，可用于本發(fā)明的方法。
特別優(yōu)選自然發(fā)生或通過工程學(xué)手段獲得的較野生型病毒生長(zhǎng)率生長(zhǎng)緩慢的分離病毒株，因?yàn)椴《旧L(zhǎng)緩慢，可以在病毒復(fù)制殺傷細(xì)胞或細(xì)胞群之前，使具有干擾素反應(yīng)能力的細(xì)胞或細(xì)胞群建立有效的抗病毒狀態(tài)。
本發(fā)明還包括，作為病毒特征的特定改變，病毒抗干擾素活性無(wú)能導(dǎo)致感染細(xì)胞干擾素反應(yīng)的增強(qiáng)，但病毒仍可在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制。
表2顯示了應(yīng)用工程學(xué)手段去除抗干擾素活性的現(xiàn)存病毒。
表3列舉了應(yīng)用工程學(xué)手段使毒性減弱的病毒。
表2.應(yīng)用工程學(xué)手段去除抗干擾素活性的現(xiàn)存病毒
表3.篩選病毒中目前所知的減毒突變
腫瘤治療本發(fā)明涉及腫瘤的病毒治療，特別是患有癌癥的動(dòng)物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及最大徑測(cè)量大小≥1厘米(cm)的腫瘤的治療。腫瘤應(yīng)用的“1cm腫瘤”是指腫瘤至少一個(gè)徑的長(zhǎng)度為1cm。這種腫瘤對(duì)病毒治療較預(yù)期更加敏感，較之更小的腫瘤，如果對(duì)病毒不是更加敏感，通常也與之相同。本發(fā)明更優(yōu)選的一個(gè)方面，是治療超過1cm的腫瘤，如≥2cm的腫瘤，2-5cm的腫瘤，以及超過5cm的腫瘤。
本發(fā)明還可用來(lái)治療腫瘤負(fù)荷高的宿主。這里應(yīng)用的詞組“腫瘤負(fù)荷”是指機(jī)體內(nèi)腫瘤的總量，用體重的百分比表示。對(duì)于腫瘤負(fù)荷約為總體重1％-2％的宿主，病毒治療驚人的有效，如導(dǎo)致腫瘤消退或腫瘤總負(fù)荷的降低。這一點(diǎn)原來(lái)根本沒有想到，因?yàn)槟[瘤負(fù)荷約為總體重2％(如一個(gè)60公斤的人將有一個(gè)1公斤的腫瘤)，幾乎是生命可以承受的最大瘤體。見如Cotran等，羅賓遜疾病病理學(xué)基礎(chǔ)，第4版，WB Saunders，1989，252頁(yè)。在實(shí)施例中，攜帶體積高達(dá)397mm3黑色素瘤(如A375)的小鼠宿主，在用新城疫病毒(如經(jīng)三重噬斑純化的病毒)治療后，顯示了完全消退反應(yīng)。設(shè)定1000mm3的組織重量相當(dāng)于1克，體積為397mm3的腫瘤大約相對(duì)于一只20克小鼠總體重的2％。
如下實(shí)施例4-9所示，大小至少1cm的腫瘤治療后獲得了消退，而未治療的對(duì)照動(dòng)物卻在數(shù)周內(nèi)死于腫瘤。但是，盡管兩周內(nèi)就會(huì)死亡，這些患病動(dòng)物還是得到成功救治。因此，根據(jù)本發(fā)明，一個(gè)處于腫瘤終末期的動(dòng)物可以應(yīng)用病毒療法有效治療。因而，本發(fā)明可被用來(lái)治療對(duì)傳統(tǒng)療法無(wú)反應(yīng)的患者，所述傳統(tǒng)療法如化療，如氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶，和放療。
還檢測(cè)了NDV通過腹膜內(nèi)給藥治療腫瘤的療效。應(yīng)用卵巢癌的腹水預(yù)防模型，給攜帶ES-2人卵巢癌的小鼠腹膜內(nèi)注射NDV，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，較之用生理鹽水治療的小鼠，生存率提高(實(shí)施例16)。當(dāng)ES-2細(xì)胞用于腹水陽(yáng)性模型，應(yīng)用病毒治療的動(dòng)物較之生理鹽水處理的對(duì)照組，腹水產(chǎn)量明顯減少(實(shí)施例17)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，應(yīng)用病毒導(dǎo)致1)腫瘤相關(guān)性癥狀的緩解，如但不限于腹水生產(chǎn)率的降低，疼痛的緩解，以及梗阻性疾病的緩解，和2)生命的延長(zhǎng)。
52名患者通過靜脈途徑接受了噬斑純化的NDV分離病毒株。腫瘤反應(yīng)包括5名患者中獨(dú)立腫瘤的消退；2名患者病情穩(wěn)定7個(gè)月，2名患者5個(gè)月，在1名以上的患者中，在3個(gè)月時(shí)疾病繼續(xù)發(fā)展；疼痛治療減少(實(shí)施例20)。
給藥方法和制劑在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，體外篩查腫瘤細(xì)胞或組織以鑒定這些腫瘤患者對(duì)病毒治療是否敏感。從患者患處取出的腫瘤細(xì)胞(提取細(xì)胞的方法，如實(shí)體瘤的細(xì)針穿刺或卵巢腹水腫瘤的腹水穿刺法)體外生長(zhǎng)并與病毒共同孵育。在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，如果病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞有高活性，這些患者就入選治療。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，給予的病毒量導(dǎo)致腫瘤或多個(gè)腫瘤的消退。這里應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“消退”是指腫瘤萎縮，如大小、重量或體積。腫瘤大小的萎縮可用多種方法測(cè)定，包括體檢，胸片或其他x線檢查，超聲，CT掃描，MRI或放射性核苷掃描。
根據(jù)本發(fā)明，包括癌癥在內(nèi)的多種類型的腫瘤都是可以治療的。本發(fā)明的病毒可用于治療多種癌癥，包括但不限于肺癌，乳腺癌，前列腺癌，結(jié)腸腺癌，宮頸癌，子宮內(nèi)膜癌，卵巢癌，膀胱癌，Wilm腫瘤，纖維細(xì)胞肉瘤，骨肉瘤，黑色素瘤，惡性滑膜瘤，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，淋巴瘤，白血病，腦癌包括成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，腎癌，頭頸部腫瘤，胃癌，食管癌，女性外陰腫瘤，肉瘤，皮膚癌，甲狀腺胰腺癌，以及間皮瘤。本發(fā)明病毒還可用于治療多種良性腫瘤，包括但不限于濕疣，乳頭瘤，腦脊膜瘤以及腺瘤。
將治療有效劑量的病毒給予腫瘤宿主。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，給予病毒的劑量由于以下因素而有差異，這些因素包括所選的病毒，腫瘤的類型，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)范圍或轉(zhuǎn)移，腫瘤生長(zhǎng)的生物位置或機(jī)體屏障，病毒株，給藥途徑，給藥時(shí)間，給藥方式，并鑒定哺乳動(dòng)物正在接受的其他藥物或治療，如放療、化療或手術(shù)治療。這些參數(shù)通過最大耐受劑量(MTD)定義，MTD是通過動(dòng)物模型測(cè)定的，并通過相對(duì)體表面積或體重功能換算出人用劑量。還應(yīng)理解，在某些特定情況下，病毒給藥會(huì)超過1次。病毒多劑量給藥的最適間隔時(shí)間屬于本領(lǐng)域已經(jīng)掌握的技術(shù)，可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)決定。NDV通常的給藥劑量約為3×106-5×1012PFU病毒。對(duì)于局部給藥(如直接注入瘤體)，典型應(yīng)用總量至少為3×106PFU，更優(yōu)選至少3×107PFU，更優(yōu)選至少3×108PFU，更優(yōu)選至少3×109PFU，更優(yōu)選至少3×1010PFU，更優(yōu)選至少3×1011PFU，最優(yōu)選至少5×1012PFU。對(duì)于系統(tǒng)給藥，應(yīng)用劑量至少為1×108PFU病毒/m2體表面積，更優(yōu)選至少為1×109PFU病毒/m2體表面積，更優(yōu)選至少為5.9×109PFU病毒/m2體表面積，更優(yōu)選至少為1.2×1010PFU病毒/m2體表面積，更優(yōu)選至少為4.8×1010PFU病毒/m2體表面積，更優(yōu)選至少為7.2×1010PFU病毒/m2體表面積，更優(yōu)選至少為9.6×1010PFU病毒/m2體表面積，最優(yōu)選至少為3.0×1011PFU病毒/m2體表面積。
對(duì)于靜脈內(nèi)給藥，給藥劑量時(shí)間可應(yīng)用每周一次，每周兩次或每周三次。根據(jù)本發(fā)明的病毒，任選與化療藥物共同應(yīng)用時(shí)，可通過多種途徑給藥，如經(jīng)腸道，不經(jīng)腸道，口服，鼻腔，直腸，胸腔內(nèi)，靜脈內(nèi)(如應(yīng)用導(dǎo)管)，皮下，腫瘤瘤體內(nèi)(如直接給予腫瘤組織或給予供血血管)，圍腫瘤，局部，舌下，口腔，局部外用，肌內(nèi)，吸入給藥，經(jīng)皮，陰道，動(dòng)脈內(nèi)，顱內(nèi)，皮內(nèi)，硬腦膜外，系統(tǒng)，局部外用，腹膜內(nèi)，胸膜內(nèi)，囊內(nèi)(膀胱癌)等。對(duì)于肺癌，可以應(yīng)用支氣管途徑(如支氣管給藥)，皮內(nèi)途徑，或內(nèi)鏡途徑。在適宜的情況下，還可應(yīng)用內(nèi)鏡注射治療胃腸道腫瘤，以及栓劑治療直腸腫瘤。
NDV鼠毒性研究顯示靜脈內(nèi)給予病毒后的急性毒性反應(yīng)與細(xì)胞因子介導(dǎo)的反應(yīng)非常相似。眾所周知，在首次誘導(dǎo)事件之后，細(xì)胞因子對(duì)重復(fù)刺激的反應(yīng)下調(diào)，或脫敏(Takahashi等，(1991)癌癥研究，512366-2372)。接受脫敏劑量病毒的小鼠，較接受生理鹽水處理的對(duì)照小鼠，可以更好地耐受隨后給予的大劑量病毒(實(shí)施例18)。接受靜脈內(nèi)注射脫敏劑量病毒的小鼠，較在第一次注射時(shí)僅接受介質(zhì)的小鼠，在接受第二次靜脈內(nèi)給藥時(shí)，可以多耐受大約10倍的病毒。
病毒靜脈途徑給藥的速率可以顯著影響其毒性。給兩組無(wú)胸腺小鼠靜脈注射相同劑量的NDV，一組給藥較慢(4分鐘0.2ml)，一組較快(30秒0.2ml)。比較兩組體重減輕最大值發(fā)現(xiàn)，緩慢注射組體重減輕較快速注射組少50％(實(shí)施例19)。
在臨床試驗(yàn)中，患者在一周內(nèi)接受3次噬斑純化NDV分離株注射。在這種情況下，首劑脫敏治療減輕了第二和第三劑相關(guān)性毒性，甚至在第二和第三劑比首劑劑量高2-8倍時(shí)(實(shí)施例20)。實(shí)施例18和28顯示了這些數(shù)據(jù)以及在動(dòng)物研究中獲得的相似數(shù)據(jù)。在臨床試驗(yàn)中還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)用小劑量脫敏從而可以應(yīng)用更高劑量治療時(shí)，腫瘤的消退率也更高(見表19，實(shí)施例20)。這與在動(dòng)物模型試驗(yàn)中獲得的數(shù)據(jù)一致(實(shí)施例29)。
應(yīng)用溶瘤細(xì)胞性病毒治療腫瘤的一個(gè)令人關(guān)注的問題是體液免疫反應(yīng)的潛在抑制可能對(duì)治療有所影響。在臨床研究中，1個(gè)月后仍顯示疾病穩(wěn)定的患者可以進(jìn)行第二療程的治療。因此，第二以及隨后療程的治療是在存在NDV中和抗體的情況下進(jìn)行的。但是，在第二療程給藥后，可以在患者的尿中發(fā)現(xiàn)感染病毒，并在第二療程后觀察到腫瘤消退，這些現(xiàn)象提供了給予大劑量病毒可以克服中和抗體的作用，并在患者體內(nèi)發(fā)生感染的證據(jù)(實(shí)施例20)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，給予了多療程病毒治療。一個(gè)療程的實(shí)例包括給予病毒每周3次，共1周，隨后休息3周；給予病毒每周3次，共4周，隨后休息2周；給予病毒1劑，隨后休息4周；給予病毒每周3次，共6周，隨后休息2周。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在給予首劑病毒后，給藥病毒2周以上。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在隨后給予高劑量之前，先給予一劑脫敏劑。脫敏劑量水平可通過臨床毒性指征如低血壓、疲勞、肝臟轉(zhuǎn)氨酶升高或其他適宜指標(biāo)來(lái)決定，其中脫敏劑量水平等于或低于單次給藥的最大耐受劑量(MTD)。脫敏之后，再給予高于脫敏劑量的病毒。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，隨后的病毒劑量等于或大于單次給藥的MTD。例如，應(yīng)用的脫敏劑量至少為1×108PFU/m2，更優(yōu)選至少3×108PFU/m2，更優(yōu)選至少1×109PFU/m2，更優(yōu)選至少5.9×109PFU/m2，最優(yōu)選至少1.2×1010PFU/m2。脫敏后，應(yīng)用的再次給予的病毒劑量至少為1×108PFU/m2，更優(yōu)選至少3×108PFU/m2，更優(yōu)選至少1×109PFU/m2，更優(yōu)選至少5.9×109PFU/m2，更優(yōu)選至少2.4×1010PFU/m2，更優(yōu)選至少4.8×1010PFU/m2，更優(yōu)選至少9.6×1010PFU/m2，最優(yōu)選至少3.0×1011PFU/m2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，脫敏還單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用了α腫瘤壞死因子，IL-2或其他細(xì)胞因子。
給藥劑量之間的時(shí)間框架包括脫敏劑量和下一次給藥之間的時(shí)間框架為1-14天，優(yōu)選1-7天。脫敏劑量可通過多種途徑給藥，如靜脈內(nèi)，經(jīng)腸道，不經(jīng)腸道，口服，鼻腔，直腸，胸腔內(nèi)，靜脈內(nèi)，皮下，腫瘤瘤體內(nèi)，圍腫瘤，局部，舌下，口腔，局部外用，肌內(nèi)，吸入給藥，皮內(nèi)，陰道，動(dòng)脈內(nèi)，顱內(nèi)，皮內(nèi)，硬腦膜外，系統(tǒng)，局部外用，腹膜內(nèi)，胸膜內(nèi)，內(nèi)鏡，支氣管內(nèi)等。隨后的劑量可通過與脫敏劑量相同的途徑給藥，或通過任一途徑給藥，如靜脈內(nèi)，經(jīng)腸道，不經(jīng)腸道，口服，鼻腔，直腸，胸腔內(nèi)，靜脈內(nèi)，皮下，腫瘤瘤體內(nèi)，圍腫瘤，局部，舌下，口腔，局部外用，肌內(nèi)，吸入給藥，皮內(nèi)，陰道，動(dòng)脈內(nèi)，顱內(nèi)，皮內(nèi)，硬腦膜外，系統(tǒng)，局部外用，腹膜內(nèi)，胸膜內(nèi)，內(nèi)鏡，支氣管內(nèi)等。實(shí)施例28顯示了應(yīng)用靜脈注射給予脫敏劑，應(yīng)用其他途徑給予隨后的劑量。靜脈注射脫敏劑量病毒的小鼠較之在第一次注射時(shí)僅接受介質(zhì)的小鼠，在腹膜內(nèi)給予第二劑量時(shí)，可多耐受大約5倍的病毒。
實(shí)施例29描述了在臨床預(yù)試驗(yàn)中，應(yīng)用脫敏方法可以增加最大耐受劑量，從而使抗腫瘤療效增加。
任選的，可以序貫或同時(shí)應(yīng)用一種以上的給藥途徑。同時(shí)或序貫給藥的途徑包括但不限于靜脈內(nèi)，經(jīng)腸道，不經(jīng)腸道，口服，鼻腔，直腸，胸腔內(nèi)，靜脈內(nèi)，皮下，腫瘤瘤體內(nèi)，圍腫瘤，局部，舌下，口腔，局部外用，肌內(nèi)，吸入給藥，皮內(nèi)，陰道，動(dòng)脈內(nèi)，顱內(nèi)，皮內(nèi)，硬腦膜外，系統(tǒng)，局部外用，腹膜內(nèi)，胸膜內(nèi)，內(nèi)鏡，支氣管內(nèi)等。一個(gè)實(shí)例就是靜脈內(nèi)給藥脫敏劑量，最后腹膜內(nèi)給予另一劑量。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，病毒通過緩慢注入的方式給予，包括應(yīng)用靜脈泵，泵式注射器，靜脈點(diǎn)滴或緩慢注射，注射時(shí)程4分鐘-24小時(shí)，優(yōu)選20-60分鐘。
一種病毒可與任選的一種或多種化療藥物同時(shí)注射、分開多次注射或連續(xù)注射。病毒可與化療藥(如但不限于白消安，環(huán)磷酰胺，氨甲蝶呤，阿糖胞苷，爭(zhēng)光霉素，鉑復(fù)合物如卡鉑或順鉑，阿霉素，氮烯咪胺，gemcitabine，馬法蘭，巰基嘌呤，長(zhǎng)春堿，5-氟尿嘧啶，taxol，和維甲酸)同時(shí)、或在化療藥注射之前或之后注射。根據(jù)本發(fā)明的病毒還可任選與其他治療聯(lián)合，包括手術(shù)治療、放療、化療(見如，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)診斷與治療，Tierney等編輯，Appleton & Lange，1997，特別是78-94頁(yè))、以及生物治療。病毒可以在給予生物物質(zhì)之前、同時(shí)或之后給予，所述生物物質(zhì)如(1)其他溶瘤細(xì)胞制劑如但不限于其中一個(gè)基因在前列腺細(xì)胞特異性反應(yīng)元素轉(zhuǎn)錄控制下的腺病毒(見RodriqRes，R.等，1997，癌癥研究，572559-2563)；不編碼能夠與p53結(jié)合的E1b多肽的腺病毒(見Bischoff，J.R.等，1996，科學(xué)，274373-376)；不表達(dá)γ34.5功能性基因產(chǎn)物的單純皰疹病毒(見Mineta，T.等，1995，自然醫(yī)學(xué)，1938-943)；(2)細(xì)胞因子(如但不限于集落刺激因子如GM-CSF，腫瘤壞死因子，和白血病介素如IL-1，IL-2，IL-6和IL-10)；(3)病毒載體如但不限于編碼p53的腺病毒(見Zhang，WW等，1994，癌癥基因治療，15-13)；以及(4)癌癥疫苗。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，治療包括應(yīng)用具有獨(dú)特抗原的病毒的系列治療，所述病毒通過干擾素機(jī)制具有細(xì)胞毒性和腫瘤選擇性。該實(shí)施方案使病毒治療可以在沒有免疫干擾的情況下延長(zhǎng)一段時(shí)間。
另一個(gè)實(shí)施方案涉及應(yīng)用NDV(或其他病毒)治療患者，在給予病毒之前、同時(shí)或之后應(yīng)用干擾素(如α干擾素，β干擾素或γ干擾素)。干擾素選自I類(α干擾素，β干擾素和ω干擾素)或II類(γ干擾素)，以及重組干擾素及其類似物，例如Sreevalsoun，T.1995所述(癌癥的生物治療，第2版，V.T.DeVita，Jr.，S.Hellman，和S.A.Rosenberg編輯，J.B.Lippincott公司，費(fèi)城，347-364頁(yè))。對(duì)干擾素有反應(yīng)的正常細(xì)胞在應(yīng)用加強(qiáng)干擾素預(yù)處理后，對(duì)給予的病毒感染更加安全。干擾素信號(hào)途徑缺陷性腫瘤細(xì)胞則仍然對(duì)病毒的殺傷作用敏感。這使我們可以應(yīng)用更高劑量的病毒進(jìn)行治療。干擾素的劑量和給藥方案按照有效治療病毒感染的標(biāo)準(zhǔn)臨床規(guī)范給予。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，已知可以影響干擾素反應(yīng)途徑的其他藥物也可任選應(yīng)用，旨在增加腫瘤細(xì)胞的敏感性，或增強(qiáng)正常細(xì)胞對(duì)病毒感染細(xì)胞殺傷效應(yīng)的耐受性。這類藥物包括但不限于酪氨酸激酶抑制劑，西咪替叮和線粒體抑制劑。增強(qiáng)本發(fā)明治療性病毒溶瘤細(xì)胞活性的策略涉及阻斷線粒體的氧化磷酸化作用。優(yōu)選的制劑是抑制呼吸鏈功能或線粒體蛋白合成的能夠臨床應(yīng)用的藥物。4-quinolone抗生素，甲萘醌，氯霉素，氯喹和四環(huán)素均可用于增強(qiáng)抗癌病毒的溶瘤細(xì)胞活性。這些制劑以臨床耐受劑量在給予溶瘤細(xì)胞病毒前0-24小時(shí)給予。線粒體抑制劑還可任選在病毒給藥后給予，目的是進(jìn)一步支持病毒在敏感腫瘤中的復(fù)制。
組織缺氧和高熱已知也可調(diào)節(jié)干擾素反應(yīng)。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在腫瘤暴露于治療性溶瘤細(xì)胞病毒之前或期間，氧化腫瘤的缺氧區(qū)域。達(dá)成的方法包括但不限于，系統(tǒng)給予氧化碳氟血紅蛋白替代物，促紅細(xì)胞生成素，或血管擴(kuò)張劑。腫瘤的氧化還可通過肺呼吸氧濃度高于正常值的空氣達(dá)成。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，在給予病毒的同時(shí)或之前、之后應(yīng)用免疫抑制劑，如環(huán)胞菌素A，咪唑硫嘌呤，來(lái)氟米特，抗CD40配體抗體(Foy，T.M.等，1993，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，1781567-1575)，以及多種皮質(zhì)類固醇制劑，如氫化可的松，強(qiáng)的松，氫化波尼松，6α-甲基氫化波尼松，氟氫可的松，腎上腺酮，去炎松，醋酸對(duì)氟米松，倍他米松，以及地塞米松。此外，免疫刺激劑，如脂多肽也可與病毒共同應(yīng)用。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，在給予病毒的同時(shí)或之前、之后應(yīng)用能抑制TNF-α活性的制劑，如抗TNF-α抗體(見實(shí)施例30)，可溶性TNF-α受體，皮質(zhì)類固醇，或其他化合物。
通過應(yīng)用核苷(Machida，H.，1979，微生物免疫學(xué)，23643-650)、核苷前體或可以增加細(xì)胞內(nèi)一種或多種核苷濃度的藥物，可以增加病毒感染所致的干擾素生成量，這一獨(dú)立機(jī)制可在病毒治療中任選作為佐劑。
某種嘌呤核苷類似物，如2-氯脫氧腺嘌呤和2’-脫氧助間型霉素，體內(nèi)可以減少干擾素的產(chǎn)量。這些化合物可以用來(lái)進(jìn)一步影響腫瘤細(xì)胞相對(duì)于正常細(xì)胞對(duì)干擾素敏感性的差異，并可任選作為病毒治療的佐劑。
一方面，有效劑量的病毒可以再分裝為更小劑量單位，并同時(shí)注射到同一腫瘤的不同部位。對(duì)于連續(xù)給藥，可以通過埋植的微量泵將所需藥物給予，也可將它注入預(yù)期的聚合物，然后移植到所需部位(如直接移植到腫瘤瘤體)，緩慢或延遲釋放。
本發(fā)明病毒作為藥用制劑來(lái)制備，包括將之與至少一種賦形劑或輔助劑制成適宜的劑量形式，并且如果需要，還可與一種或多種進(jìn)一步活性化合物組合。所得制劑可用于人類和獸醫(yī)。適宜的賦形劑包括，如適于腸道或非腸道給藥的有機(jī)或無(wú)機(jī)物質(zhì)，如水、生理鹽水、組織培養(yǎng)基、緩沖液、賴氨酸、檸檬酸鹽、三醋酸甘油和其他脂肪酸甘油、白明膠、大豆卵磷脂、碳水化合物如甘露醇、蔗糖、乳糖或淀粉、硬脂酸鎂、云母、纖維素或蛋白載體、或前述化合物的組合物，如甘露醇/賴氨酸、或甘露醇/賴氨酸/蔗糖。制劑經(jīng)消毒，并/或含有添加劑，如防腐劑或穩(wěn)定劑。用于非腸道給藥，如系統(tǒng)給藥或局部注射，病毒制劑制備成如水性懸液或乳劑。
本發(fā)明還涉及一種治療哺乳動(dòng)物疾病的方法，所述疾病的致病細(xì)胞具有干擾素介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答缺陷，所述方法包括給哺乳動(dòng)物應(yīng)用治療有效劑量的具有復(fù)制能力的干擾素敏感性克隆病毒。例如，很多病毒發(fā)展了消除宿主細(xì)胞干擾素介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答的機(jī)制。乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒是導(dǎo)致世界范圍內(nèi)肝功能障礙的首要原因。這些病毒與進(jìn)行性肝損傷、肝硬化和肝細(xì)胞癌有關(guān)。目前應(yīng)用干擾素是治療這些疾病的標(biāo)準(zhǔn)療法，但有大部分人對(duì)該療法沒有反應(yīng)，或在治療終止后復(fù)發(fā)。乙型肝炎病毒(HBV)的終末蛋白業(yè)已顯示可以抑制細(xì)胞對(duì)干擾素和雙鏈RNA的反應(yīng)，雙鏈RNA已知是PKR的激活劑(Foster，G.R.等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，882888-2892)。此外，HBV的核心抗原業(yè)已顯示抑制β干擾素基因的表達(dá)(Whitten，T.M.等，1991，病毒學(xué)雜志，654699-4704)，并且HBV相關(guān)性Δ物質(zhì)業(yè)已顯示阻斷PKR在兔reticulolysates中的活性(Robertson，H.D.等，1996，病毒學(xué)雜志，705611-5617)。丙型肝炎病毒(HCV)也具有抑制PKR蛋白激酶的活性。HCV的NS5A蛋白業(yè)已顯示可以直接抑制PKR蛋白激酶活性(Gale，M.J.等，1998，病毒學(xué)臨床診斷，10157-162)。HBV或HCV感染患者首次干擾素治療失敗后，可以備選應(yīng)用本發(fā)明病毒治療。可以應(yīng)用任何上述方法給予治療性病毒，但優(yōu)選靜脈內(nèi)或肝動(dòng)脈內(nèi)給藥。
有證據(jù)顯示，人免疫缺損病毒(HIV)感染細(xì)胞也對(duì)干擾素的作用耐受，而且這種耐受與艾滋病的存在相關(guān)(Kunzi，M.S.等，1995，感染性疾病雜志，171822-828；Edlin B.R.等，1992，內(nèi)科學(xué)紀(jì)事，117457-460)。從機(jī)制上講，HIV的TAR RNA區(qū)域業(yè)已顯示可與PKR作用，并依賴TAR RNA濃度，或激活或抑制PKR激酶的活性(Maitra，R.K.等，1994，病毒學(xué)，204823-827)。此外，細(xì)胞TRBP和病毒Tat蛋白已知可與HIV TAR RNA區(qū)域結(jié)合，并抑制PKR活性(Davies，P.H.等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.，914713-4717；Jbrand，S.R.等，1997，生物化學(xué)雜志，2728388-8395)。耐受干擾素效應(yīng)的HIV感染細(xì)胞可作為靶向細(xì)胞被本發(fā)明的病毒殺傷。
很多其他人類致病病毒已知抑制一種或多種干擾素介導(dǎo)的抗病毒狀態(tài)組分。已知腺病毒和EB病毒均表達(dá)大量在感染細(xì)胞中阻斷PKR活性的小RNA(綜述見Clemens，M.J.等，1994，Biochimie，76770-778)。EB病毒除與分化不良或未分化鼻咽癌相關(guān)外，還與地方性Burkitt淋巴瘤幾乎100％相關(guān)，并是感染性單核細(xì)胞增多癥的致病物質(zhì)。痘苗病毒業(yè)已顯示編碼蛋白E3L和K3L，它們可以分別阻斷PKR激活，并充當(dāng)假性PKR激酶激活物質(zhì)(Davies，M.V.，1993，病毒學(xué)雜志，671688-1692)。E3L蛋白還可抑制細(xì)胞抗病毒應(yīng)答2’-5’合成酶組分(Rivas，C.等，1998，病毒學(xué)，243406-414)。
痘苗病毒E3L蛋白同質(zhì)類似物在人類副痘病毒中曾有描述(McInnes，C.J.，1998，病毒基因，17107-115)。痘苗病毒還編碼可溶性I型干擾素受體，該受體抑制干擾素誘導(dǎo)的抗病毒狀態(tài)(Symons，J.A.，1995，細(xì)胞，81551-560)。流感病毒(Lee，T.G.等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，876208-6212)或脊髓灰質(zhì)炎病毒(Black，T.L.等，1989，病毒學(xué)雜志，632244-2251)感染細(xì)胞可誘導(dǎo)PKR激酶細(xì)胞抑制因子。I型單純皰疹病毒編碼的一種蛋白(γ34.5)可以拮抗在感染細(xì)胞中PKR介導(dǎo)的蛋白合成關(guān)閉(Chou，J.等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9210516-10520)。流感病毒的NS1蛋白和呼腸病毒的ω-3蛋白業(yè)已顯示，通過雙鏈RNA抑制PKR的激活(Lu，Y.等，1995，病毒學(xué)，214222-228；Imani，F(xiàn).和Jacobs，B.L.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，857887-7891)。在上述每個(gè)病毒干擾細(xì)胞建立抗病毒狀態(tài)的實(shí)例中，應(yīng)用本發(fā)明病毒治療感染細(xì)胞均可導(dǎo)致感染細(xì)胞的選擇性殺傷。
除非另外指明，本發(fā)明病毒治療的細(xì)節(jié)和條件與美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)08/260,536相同，該專利公開內(nèi)容的全文在此引入，作為參考。上述所有申請(qǐng)、專利和發(fā)表文章的全部公開內(nèi)容在此引入，作為參考。
× × × ×下述實(shí)施例闡述了本發(fā)明的方法和組合物，但非對(duì)它們的限制。對(duì)于在臨床治療中遇到的多種情況的其他適宜修改和調(diào)整也在本發(fā)明的意旨和范圍之內(nèi)，所述調(diào)整和修改對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說顯而易見。
實(shí)施例1PPMK107(NDV株MK107的三重噬斑純化分離株)顯示了相對(duì)于正常人類細(xì)胞，對(duì)多種人類腫瘤細(xì)胞的選擇性細(xì)胞毒作用。
在24孔組織培養(yǎng)平板上，人類腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞生長(zhǎng)至大約80％匯合。移去生長(zhǎng)基質(zhì)，以10倍稀釋比例加入PPMK107，范圍為106平板形成單位(PFU)/孔-10-1PFU/孔。每個(gè)平板都包括未加入病毒的對(duì)照孔。在搖擺平臺(tái)上37℃吸收病毒90分鐘。在孵育期結(jié)束時(shí)，移去病毒稀釋液，加入1ml的生長(zhǎng)基質(zhì)。然后在37℃5％CO2條件下孵育5天，定性測(cè)定細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)的量。細(xì)胞毒性應(yīng)用MTT(2-[4，5-二甲基噻唑-2-yll-2，5-聯(lián)苯四唑溴)比色法(細(xì)胞滴度96，分類號(hào)#G4000，Promega公司，Madison WI 53711)定量測(cè)定，在570nm測(cè)定線粒體酶活性(Mosman，T.，1983，免疫學(xué)方法雜志，6555)。病毒處理孔的活力用未接受病毒處理對(duì)照孔活性的百分比表示。數(shù)據(jù)應(yīng)用PFU/孔比對(duì)照活力百分比繪圖。IC50應(yīng)用導(dǎo)致存活細(xì)胞50％下降的每孔病毒的PFU量來(lái)計(jì)算。
結(jié)果如表4，5和6所示。PPMMK107顯示了對(duì)多種人類腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，在39中惡性細(xì)胞系中，有30種IC50值較相對(duì)不敏感的正常人類細(xì)胞系低1000。大部分人類腫瘤細(xì)胞的IC50值較絕大多數(shù)人類正常細(xì)胞低2-3個(gè)數(shù)量級(jí)。
表4.細(xì)胞毒性結(jié)果概要
表5.應(yīng)用正常人類細(xì)胞細(xì)胞毒試驗(yàn)結(jié)果概要
表6.應(yīng)用快速增殖性正常人類細(xì)胞細(xì)胞毒試驗(yàn)結(jié)果概要
a-測(cè)試的人類乳腺上皮細(xì)胞(HMEC)在牛垂體提取物和人類上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的刺激下增殖速率高。恰恰相反，在患有癌癥的成年女性體內(nèi)，正常乳腺上皮細(xì)胞的增殖速率通常非常低。
實(shí)施例2應(yīng)用PPMK107瘤體內(nèi)治療無(wú)胸腺小鼠人類腫瘤異種移植物(＜10mm和＞5mm)無(wú)胸腺小鼠皮內(nèi)注射1千萬(wàn)人類腫瘤細(xì)胞。在腫瘤大小達(dá)到5-10mm時(shí)，給予單劑PPMK107(劑量為3×108PFU)或生理鹽水。在應(yīng)用PPMK107腫瘤的小鼠中，幾乎所有類型的腫瘤都呈現(xiàn)50％-100％的完全或部分消退(見表7)。唯一的例外是應(yīng)用U87MG的試驗(yàn)的實(shí)例(試驗(yàn)I)盡管應(yīng)用PPMK107治療的9例腫瘤中只有1例完全消退，超過2例的病毒處理腫瘤顯示32％和20％消退，相對(duì)于生理鹽水處理的所有8例對(duì)照腫瘤，有超過2例的病毒處理的腫瘤顯示腫瘤生長(zhǎng)緩慢。在生理鹽水處理的對(duì)照腫瘤中，腫瘤消退完全缺如。在所有這些試驗(yàn)中(表7顯示的試驗(yàn)A-I)，73例對(duì)照腫瘤中只有1例顯示消退。這些結(jié)果提示多種類型的腫瘤都對(duì)瘤體內(nèi)PPMK107治療有反應(yīng)。
為檢測(cè)病毒在腫瘤內(nèi)的復(fù)制，應(yīng)用HT1080皮下纖維肉瘤模型進(jìn)行了病毒抗原(應(yīng)用抗NDV P蛋白單克隆抗體)的免疫組化染色。腫瘤瘤體內(nèi)注射3×108PFU PPMK107 30分鐘內(nèi)，腫瘤組織沒有病毒抗原。但是，治療后2天，加強(qiáng)免疫染色可以在腫瘤內(nèi)看到病毒抗原，提示病毒在腫瘤內(nèi)復(fù)制。重要的是，病毒復(fù)制具有腫瘤組織特異性，因?yàn)猷徑慕Y(jié)締組織和皮膚病毒抗原陰性。表7.PPMK107瘤體內(nèi)治療無(wú)胸腺小鼠皮下人類腫瘤異種移植物(＜10mm并＞5mm)
實(shí)施例3應(yīng)用PPMK107靜脈內(nèi)治療無(wú)胸腺小鼠人類腫瘤異種移植物(＜8.5mm并＞5.5mm)無(wú)胸腺小鼠皮內(nèi)注射1千萬(wàn)人類HT1080纖維肉瘤細(xì)胞。在腫瘤生長(zhǎng)大小達(dá)到5-8mm時(shí)，靜脈注射PPMK107或生理鹽水。如表8所示，在最高病毒劑量水平(1×109PFU)，在所有的7只小鼠中均出現(xiàn)腫瘤完全消退。單劑注射3×108和6×107可導(dǎo)致腫瘤消退率超過90％。在單劑靜脈注射3×108，只有55％腫瘤消退率時(shí)，以該劑量水平靜脈注射3次，可產(chǎn)生100％的反應(yīng)率。靜脈生理鹽水處理的小鼠，沒有顯示腫瘤消退的證據(jù)。這些結(jié)果提示皮下HT1080腫瘤對(duì)PPMK107靜脈治療具有非常反應(yīng)性。表8.PPMK107靜脈內(nèi)治療無(wú)胸腺小鼠皮下人類HT1080纖維肉瘤異種移植物(＜8.5mm并＞5.5mm)
實(shí)施例4應(yīng)用PPMK107瘤體內(nèi)治療無(wú)胸腺小鼠大型A375黑色素瘤異種移植物的首次試驗(yàn)無(wú)胸腺小鼠皮內(nèi)注射1千萬(wàn)A375人類黑色素瘤細(xì)胞。10天后，單劑注射PPMK107(劑量為3×108，9×108和1.5×109PFU)或生理鹽水治療不同大小的腫瘤。對(duì)于最長(zhǎng)單徑10-11mm的這些腫瘤，應(yīng)用所述劑量PPMK107瘤體內(nèi)治療的所有9例腫瘤完全消退，而對(duì)于最長(zhǎng)單徑為8-9.5mm的這些腫瘤，24例中有12例對(duì)病毒治療發(fā)生反應(yīng)，完全消退(P＜0.008，表9，A部分)。應(yīng)用生理鹽水處理的小鼠，沒有治療消退。
根據(jù)腫瘤體積分類的這些相同腫瘤還提示，腫瘤體積大的腫瘤，完全消退百分比高。對(duì)所述劑量PPMK107發(fā)生的反應(yīng)，在腫瘤體積＞300mm3(范圍為304-397mm3)的17例腫瘤中有14例完全消退，在腫瘤體積＜300mm3(范圍為144-295；P＜0.023；表9，B部分)的16例腫瘤中有7例完全消退。
這些結(jié)果提示長(zhǎng)度至少為1cm或體積300mm3的腫瘤，對(duì)瘤體內(nèi)PPMK107治療較較小的腫瘤，如果不是更加敏感，至少也同樣敏感。
表9.瘤體內(nèi)PPMK107治療皮內(nèi)A375黑色素瘤異種移植物
a-應(yīng)用PPMK107治療的10-11mm組較8-9.5mm組完全消退P＜0.008。
b-體積＞300mm3的PPMK107治療組較＜300mm3的PPMK107治療組完全消退P＜0.023。
實(shí)施例5應(yīng)用PPMK107瘤體內(nèi)治療無(wú)胸腺小鼠大型A375黑色素瘤異種移植物的第二次試驗(yàn)如實(shí)施例4，腫瘤細(xì)胞接種后10天形成腫瘤。治療包括多種劑量的PPMK107(3×106PFU，3×107，3×108，和1.5×109)或生理鹽水。對(duì)于最長(zhǎng)單徑10-11mm的腫瘤，應(yīng)用所述劑量PPMK107治療的所有28例腫瘤發(fā)生了完全或部分消退(至少50％)，而生理鹽水處理的小鼠，卻沒有消退(表10，A部分)。
當(dāng)這些相同的腫瘤根據(jù)腫瘤體積進(jìn)行分類時(shí)，所有腫瘤體積＞300mm3(范圍為309-525mm3)的26例腫瘤對(duì)PPMK107發(fā)生反應(yīng)，完全或部分消退(至少50％)，而生理鹽水處理的小鼠，卻沒有一例消退(表10，B部分)。
這些結(jié)果確證，長(zhǎng)度至少為1cm或體積300mm3的腫瘤對(duì)瘤體內(nèi)PPMK107腫瘤敏感。
表10.瘤體內(nèi)PPMK107治療皮內(nèi)A375黑色素瘤異種移植物
實(shí)施例6應(yīng)用PPMK107瘤體內(nèi)治療無(wú)胸腺小鼠大型A375黑色素瘤異種移植物的第三次試驗(yàn)如實(shí)施例4，腫瘤細(xì)胞接種后10天形成腫瘤。瘤體內(nèi)治療包括多種劑量的PPMK107(3×108，3×106，3×105，3×104，3×103，3×102PFU)或生理鹽水。最長(zhǎng)單徑為12.5-14mm的腫瘤(體積范圍632-787mm3，平均體積698mm3)，應(yīng)用3×108PFU治療，3只小鼠中有2只發(fā)生至少50％的腫瘤消退，相反，在生理鹽水處理的2只小鼠中無(wú)消退(表11)。應(yīng)用相同劑量的PPMK107(3×108PFU)治療最長(zhǎng)單徑為10-12mm的腫瘤(體積范圍320-600mm3，平均體積411mm3)，8只小鼠中有7只發(fā)生至少25％的腫瘤消退(至少消退25％相對(duì)于生理鹽水處理的小鼠無(wú)消退，p＜0.001，表11)。應(yīng)用3×106PFU，3×105PFU，3×104PFU，3×103PFU治療，腫瘤長(zhǎng)徑為10-12mm的小鼠也發(fā)生了至少25％的腫瘤消退，但應(yīng)用3×102PFU或生理鹽水處理的小鼠沒有消退(表11)。
這些結(jié)果確證，長(zhǎng)度至少為1cm或體積300mm3的腫瘤對(duì)瘤體內(nèi)PPMK107腫瘤敏感。
表11.應(yīng)用PPMK107瘤體內(nèi)治療A375黑色素瘤異種移植物(大小至少10mm)的第三次試驗(yàn)
a-部分消退的定義是消退小于100％，但大于或等于50％。
b-“消退＞25％和＜50％”定義為腫瘤消退大于25％并小于50％。
c-包括所有消退小于25％的腫瘤。
d-腫瘤消退大于25％在3E+08組相對(duì)于生理鹽水組P＜0.0001。
實(shí)施例7應(yīng)用PPMK107瘤體內(nèi)治療無(wú)胸腺小鼠大型A375黑色素瘤異種移植物的第四次試驗(yàn)如實(shí)施例4，腫瘤細(xì)胞接種后13天形成最大徑10-12mm的腫瘤。瘤體內(nèi)治療包括單劑注射3×108PFU PPMK107或生理鹽水。應(yīng)用PPMK107治療的腫瘤體積范圍為295-600mm3(平均腫瘤體積437mm3)。每一治療組的小鼠分別在0，2，3，4，7和14天應(yīng)用無(wú)痛致死術(shù)處死，進(jìn)行治療組織學(xué)檢測(cè)。在那些觀察最短時(shí)間為4天的小鼠中，應(yīng)用PPMK107治療的12只小鼠有11只出現(xiàn)腫瘤至少25％的消退，而8只生理鹽水組沒有一只出現(xiàn)腫瘤消退(P＜0.0001，表12)。PPMK107治療后2天，有2例腫瘤已經(jīng)顯示消退征象，但消退程度小于25％。
實(shí)施例8應(yīng)用PPMK107瘤體內(nèi)治療無(wú)胸腺小鼠大型A375黑色素瘤異種移植物的第五次試驗(yàn)如實(shí)施例4，腫瘤細(xì)胞接種后20天形成最大徑10-12mm的腫瘤。瘤體內(nèi)治療包括單劑注射3×108PFU PPMK107或生理鹽水。應(yīng)用PPMK107治療的腫瘤體積范圍為361-756mm3(平均腫瘤體積551mm3)。應(yīng)用PPMK107治療的10只小鼠中有9只出現(xiàn)腫瘤至少25％的消退，而10只生理鹽水組沒有一只出現(xiàn)腫瘤消退(P＜0.0001，表13)。
實(shí)施例9應(yīng)用PPMK107靜脈內(nèi)治療大型HT1080纖維肉瘤異種移植物的第一次試驗(yàn)無(wú)胸腺小鼠皮下注射1千萬(wàn)HT1080人類纖維肉瘤細(xì)胞。6天后，應(yīng)用單劑PPMK107(劑量為1.5×109PFU)或生理鹽水注射治療。對(duì)于最大單徑為10-11mm的腫瘤，應(yīng)用單劑靜脈注射PPMK107治療的6例腫瘤中，5例出現(xiàn)完全或部分消退，而生理鹽水處理的腫瘤卻無(wú)一例消退(表14，P＜0.025)。這些結(jié)果提示，長(zhǎng)度至少為1cm的腫瘤對(duì)靜脈內(nèi)PPMK107治療敏感。
表12.應(yīng)用PPMK107瘤體內(nèi)治療A375黑色素瘤異種移植物的第四次試驗(yàn)(大小至少10mm)
a-部分消退的定義是消退小于100％，但大于或等于50％。
b-“消退＞25％和＜50％”定義為腫瘤消退大于25％并小于50％。
c-包括所有消退小于25％的腫瘤。
d-12只PPMK107治療組小鼠完全或部分消退，相對(duì)于8只生理鹽水組小鼠，P＜0.03。
e-12只PPMK107治療組小鼠所有腫瘤至少25％消退，相對(duì)于8只生理鹽水組小鼠，P＜0.0001。
表13.應(yīng)用PPMK107瘤體內(nèi)治療A375黑色素瘤異種移植物的第五次試驗(yàn)(大小至少10mm)
a-部分消退的定義是消退小于100％，但大于或等于50％。
b-“消退＞25％和＜50％”定義為腫瘤消退大于25％并小于50％。
c-包括所有消退小于25％的腫瘤。
d-PPMK107治療組完全或部分消退，相對(duì)于生理鹽水組，P＜0.05。
e-PPMK107治療組所有腫瘤至少25％消退，相對(duì)于生理鹽水組，P＜0.0001。表14.靜脈內(nèi)治療無(wú)胸腺小鼠皮下HT1080人類纖維肉瘤異種移植物。腫瘤大?。?0-11mm
aPPMK107治療組完全或部分消退(消退至少50％)，相對(duì)于生理鹽水組，P＜0.025(應(yīng)用Fisher精確檢測(cè)法)。
實(shí)施例10正常細(xì)胞而非腫瘤細(xì)胞可以特異清除PPMK107感染為檢測(cè)NDV株P(guān)PMK107特異性殺傷腫瘤機(jī)制，根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)選擇代表性腫瘤細(xì)胞a)具有在無(wú)胸腺小鼠體內(nèi)形成腫瘤異種移植物的能力；b)給予PPMK107后，體內(nèi)腫瘤異種移植物可被特異性殺傷；c)PPMK107體外殺傷腫瘤細(xì)胞的病毒濃度低于殺傷耐受、正常細(xì)胞濃度的幾個(gè)對(duì)數(shù)值；以及d)在共同培養(yǎng)時(shí)，腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞易于區(qū)分。
包括KB頭頸部腫瘤細(xì)胞的異種移植物腫瘤，在單劑腫瘤瘤體內(nèi)注射PPMK107后顯示83％的完全或部分消退率，較PPMK107體外殺傷正常原代皮膚纖維細(xì)胞(CCD922-sk)敏感4個(gè)對(duì)數(shù)值，而且KB頭頸部腫瘤細(xì)胞在與CCD922-sk細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí)，非常易于區(qū)分。
因此，共同培養(yǎng)的KB和CCD922-sk細(xì)胞在0.0005多樣性感染(m.o.i.，每孔添加病毒的比例)中被感染，感染后5天，應(yīng)用免疫組化染色顯示病毒抗原(NDV P蛋白)。正常細(xì)胞的感染在2天時(shí)達(dá)峰值，通過觀察單層細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，只有很少的細(xì)胞死亡或沒有明顯細(xì)胞死亡。感染后第3天，正常細(xì)胞中病毒表達(dá)量顯著下降，而腫瘤細(xì)胞的感染則非常明顯。正常細(xì)胞病毒抗原的量在第4、5天基本消失，而腫瘤細(xì)胞的感染則通過腫瘤細(xì)胞群發(fā)展迅速，導(dǎo)致在共同培養(yǎng)基中，大部分腫瘤細(xì)胞的破壞。
因此，正常細(xì)胞感染后，可以通過與干擾素抗病毒效應(yīng)相同的方式容易地清除感染。雖然正常細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中的干擾素呈現(xiàn)生理有效濃度，但腫瘤細(xì)胞不能建立抗病毒狀態(tài)應(yīng)答，由于病毒不受遏制的生長(zhǎng)而導(dǎo)致自身死亡。
實(shí)施例11顯示在正常CCD922-sk細(xì)胞中干擾素是一種重要的病毒清除成分干擾素介導(dǎo)CCD922-sk細(xì)胞清除PPMK107感染這一假說受到檢測(cè)。單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用抗人α干擾素或β干擾素多克隆中和抗體，每日將抗體加入感染了PPMK107的CCD922-sk細(xì)胞培養(yǎng)基中，moi為0.0005，追蹤感染進(jìn)程3天。細(xì)胞呈現(xiàn)的病毒抗原量與中和抗體濃度呈比例增加，而且抗β干擾素抗體較抗α干擾素抗體的效果顯著；與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)成纖維細(xì)胞主要產(chǎn)生干擾素一致。
通過添加抗干擾素中和抗體，使正常不敏感細(xì)胞對(duì)PPMK107感染更加易感的能力，支持了一個(gè)假說，該假說認(rèn)為正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞對(duì)PPMK107殺傷的敏感性差異主要在于正常細(xì)胞，而非腫瘤細(xì)胞，具有建立干擾素介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答能力。
實(shí)施例12顯示在其他正常細(xì)胞中β干擾素是一種重要的病毒清除成分在此試驗(yàn)中，另一種已知對(duì)PPMK107殺傷具有非常抵抗能力的正常細(xì)胞(NHEK，正常人上皮細(xì)胞)受到檢測(cè)，通過在感染細(xì)胞培養(yǎng)基中添加抗β干擾素多克隆抗體，可以使該細(xì)胞更加敏感。moi0.0005或0.05感染NHEK(正常人上皮角化細(xì)胞)，每日添加抗體，共5天。
在低moi(0.0005)感染培養(yǎng)基中，抗體依賴性病毒抗原表達(dá)增加在感染后5天清晰顯示，但在試驗(yàn)更早期不明顯。在以moi 0.05感染PPMK107的培養(yǎng)基中添加抗體，導(dǎo)致感染后第4、5天病毒抗原顯著增加。感染后第2、3天添加中和抗體導(dǎo)致病毒抗原的少量積聚(圖1)。
高moi樣本的培養(yǎng)上清應(yīng)用人HT1080纖維肉瘤腫瘤細(xì)胞平板試驗(yàn)滴定測(cè)量感染病毒的量；應(yīng)用我們實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)體系。這一分析結(jié)果顯示，感染后5天，相對(duì)于模仿處理對(duì)照組，抗體處理培養(yǎng)基的感染病毒量增加了19倍(圖1)。
這些結(jié)果提示，正常細(xì)胞不被PPMK107殺傷的通用保護(hù)機(jī)制是由干擾素介導(dǎo)的機(jī)制。
實(shí)施例13比較β干擾素對(duì)PPMK107感染腫瘤和正常細(xì)胞的影響添加外源性β干擾素對(duì)感染正常細(xì)胞(CCD922-sk)、PPMK107高度敏感(KB)或中度敏感(HEp2)腫瘤細(xì)胞的影響進(jìn)行了比較。三種細(xì)胞的分離培養(yǎng)基在moi 0.0005感染前1天、感染后2天，應(yīng)用20，200或2000單位/mlβ干擾素處理。感染后3天，正常細(xì)胞表達(dá)的低水平病毒抗原，在干擾素所有劑量組均消失。相反，高度敏感的KB腫瘤細(xì)胞在添加濃度為2或200單位/ml干擾素后，病毒抗原表達(dá)相對(duì)水平降低了2倍，而在1000單位/ml干擾素的處理下受到完全抑制。中等敏感的HEp2細(xì)胞對(duì)外源性干擾素的反應(yīng)是在所有干擾素應(yīng)用劑量組，病毒抗原表達(dá)消失(圖2)。
KB和CCD922-sk細(xì)胞對(duì)外源性添加的β干擾素的抗病毒效應(yīng)敏感性與這些細(xì)胞對(duì)PPMK107殺傷敏感性成反比。HEp2細(xì)胞對(duì)干擾素效應(yīng)具有應(yīng)答能力提示，這些細(xì)胞可以有效利用本試驗(yàn)應(yīng)用濃度的干擾素。相似地，KB細(xì)胞對(duì)高劑量干擾素有應(yīng)答提示，KB細(xì)胞不能建立干擾素介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答并非在于干擾素途徑上絕對(duì)缺陷，而是相對(duì)于正常細(xì)胞不敏感。
實(shí)施例14低濃度β干擾素對(duì)PPMK107感染正常和腫瘤細(xì)胞的影響在本試驗(yàn)中，在PPMK107moi 0.05感染前1天、感染后2天，應(yīng)用濃度為0.2，2或20單位/mlβ干擾素處理。
在這些情況下，正常細(xì)胞顯示了病毒抗原量的劑量依賴性降低，而腫瘤細(xì)胞的病毒抗原相對(duì)水平卻不受添加外源性干擾素的影響(圖3)。
實(shí)施例15PPMK107的純化方法A通過三重噬斑純化法從中等毒力的新城疫病毒株Mass-MK107獲得PPMK107。將大約1000PFUs(平板形成單位)的活PPMK107接種到10天的雞胚尿囊中。36℃孵育46小時(shí)后，冷藏雞卵，然后收獲尿囊液。通過1750×g離心30分鐘，去除細(xì)胞和細(xì)胞殘留。將澄清的尿囊液(含病毒的上清液)置于20％/55％不連續(xù)蔗糖梯度基質(zhì)中，以大約100,000×g離心30分鐘。在20％/55％界面上收獲純化的病毒，并通過生理鹽水透析去除蔗糖。
方法B在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，澄清的尿囊液在-70℃冷凍。解凍后，液體在1-4℃下過夜，然后通過離心(1750×g，30分鐘)從病毒懸液中去除污染物質(zhì)。獲得的物質(zhì)進(jìn)一步應(yīng)用上述不連續(xù)蔗糖梯度超速離心法處理。
方法C在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，不連續(xù)蔗糖梯度超速離心法通過連續(xù)層流超速離心法完成。
方法D在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，收獲的尿囊液用含有5％甘露醇和1.0％l-賴氨酸，pH8.0的緩沖液(ML緩沖液)稀釋，并應(yīng)用ML緩沖液，通過切線層流過濾法(TFF)澄清、交換尿囊液，濾器的過濾孔大小為0.45。收集含有澄清病毒的ML滲透緩沖液，再次通過TFF純化ML緩沖液中的病毒，所用濾器的過濾分離點(diǎn)是300,000道爾頓。收集通過此步驟被保留的物質(zhì)，即溶于ML緩沖液中的濃縮純化病毒，用ML緩沖液稀釋后，上到用ML緩沖液平衡的Sephacryl S500(Pharmacia公司)凝膠滲透柱上。集中收集含純化病毒的部分，應(yīng)用ML緩沖液通過TFF再次濃縮含純化病毒的部分，所用濾器的過濾分離點(diǎn)是300,000道爾頓。
結(jié)果*克隆病毒通過噬斑純化法制備PPMK107后，發(fā)現(xiàn)病毒群落中有8種獨(dú)立分子克隆，在NDV融合蛋白基因超過300個(gè)相鄰核苷區(qū)域具有相同序列(如，100％同源)。PPMK107是一種具有高度遺傳同質(zhì)性的克隆病毒。
*PFU/mg蛋白檢測(cè)純度的一種定量方法是測(cè)定PFU/mg蛋白。病毒制劑的活性通過應(yīng)用HT1080的平板試驗(yàn)法測(cè)定，病毒制劑的蛋白含量通過改良Lowrey法(伯樂公司，Hercules，CA)測(cè)定，在該方法中，牛血清作為蛋白標(biāo)準(zhǔn)物。所得值越高，提示純度水平越高。應(yīng)用方法A，獲得的PFU/mg蛋白值至少為4.8×1010(見表15)。應(yīng)用方法C，獲得的PFU/mg蛋白值至少為2.0×1010(見表15)。對(duì)于中等毒力的NDV病毒株，應(yīng)用這種純度測(cè)定方法獲得的文獻(xiàn)值尚未發(fā)現(xiàn)。對(duì)于中等毒力的NDV病毒株最好的評(píng)估是病毒制劑(NDVMassMK107，標(biāo)號(hào)RU2，如Faaberg KS和Peeples，ME所述方法制備，1988，病毒學(xué)雜志，62586；以及Bratt，MA和Rubin，H.，1967，病毒學(xué)，33598-608)。這種標(biāo)號(hào)RU2的病毒PFU/mg蛋白為1.3×109PFU/mg蛋白。應(yīng)用方法A獲得的純度值大約大約好于應(yīng)用Peeples方法獲得的純度值的40倍(見表15)。
*顆粒/PFU比率檢測(cè)純度的另一種定量方法是測(cè)定顆粒/PFU比率。比值越低，說明純度水平越高。顆粒計(jì)數(shù)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法通過電子顯微鏡完成。應(yīng)用方法A或方法B，得到的顆粒/PFU值接近1(表15)。
表15.病毒純度
aNT，未測(cè)定。
應(yīng)用方法A和C制備的病毒還可使NDV的純度達(dá)到幾乎不含污染雞卵蛋白的水平。對(duì)于應(yīng)用方法A制備的標(biāo)號(hào)7的PPMK107制劑，應(yīng)用Western印跡法檢測(cè)不到卵白蛋白，所述Western印跡法應(yīng)用(1)每孔(寬3.3cm)純化病毒量為1.7×109PFU，進(jìn)行SDS-PAGE(十二烷基硫代硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)凝膠(厚1mm)；(2)轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上；以及(3)應(yīng)用兔抗卵白蛋白抗體(Cappel公司兔IgG片段，抗體濃度4mg/ml，1∶200稀釋)。方法D制備的PPMK107應(yīng)用SDS-PAGE分析后銀染，未觀察到卵白蛋白相關(guān)性染帶。
實(shí)施例16PPMK107治療無(wú)胸腺小鼠腹水形成ES-2卵巢癌在該試驗(yàn)中，所有無(wú)胸腺小鼠(雌性，NCR nu/nu，8周齡)腹膜內(nèi)注射106ES-2細(xì)胞。7天后，腹水產(chǎn)生前，應(yīng)用生理鹽水或PPMK107(1×109PFU)腹膜內(nèi)治療。如圖4所示，應(yīng)用PPMK107治療的動(dòng)物較生理鹽水處理的動(dòng)物，生存顯著改善。生理鹽水處理組大部分小鼠治療后7天產(chǎn)生腹水，所有試驗(yàn)動(dòng)物在第38天全部死亡。與其恰恰相反，應(yīng)用PPMK107治療的小鼠在第38天，有92％存活，其中的25％獲得長(zhǎng)期存活(存活＞120天)。
實(shí)施例17PPMK107治療已存在腹水的無(wú)胸腺小鼠ES-2卵巢癌在該試驗(yàn)中，所有無(wú)胸腺小鼠(雌性，NCR nu/nu，8周齡)腹膜內(nèi)注射106ES-2細(xì)胞。14天后，大多數(shù)小鼠產(chǎn)生腹水，排除未產(chǎn)生腹水的小鼠，將有腹水的小鼠隨機(jī)分為7個(gè)腹膜內(nèi)治療組(在第0天給予1次PPMK107治療；在第1周給予2次PPMK107治療；每周1次PPMK107治療；每周2次PPMK107治療；在第0天給予1次生理鹽水治療；在第1周給予2次生理鹽水治療；每周2次生理鹽水治療)。每次病毒治療應(yīng)用的劑量是1×109PFU/鼠。所有小鼠在第一次治療以及所有添加治療前排腹水。
腹水程度按以下定量、記錄
如表16所示，在第7天和第10天，所有生理鹽水處理的試驗(yàn)動(dòng)物較PPMK107治療的動(dòng)物有更多腹水。首次治療后7天，每個(gè)生理鹽水處理組的腹水評(píng)分均高于3.5，而所有PPMK107治療動(dòng)物腹水評(píng)分等于或低于3.0。相似地，首次治療后10天，每個(gè)生理鹽水處理組的腹水評(píng)分均高于4.5，而所有PPMK107治療動(dòng)物腹水評(píng)分等于或低于4.1。這些結(jié)果提示相對(duì)于生理鹽水處理的對(duì)照組，病毒治療的動(dòng)物腹水產(chǎn)量顯著減少。
表16.PPMK107治療已存在腹水的無(wú)胸腺小鼠ES-2卵巢癌
實(shí)施例18應(yīng)用脫敏劑量PPMK107降低隨后劑量PPMK107的致死性第0天給C57BL/6小鼠(7周齡)靜脈注射生理鹽水或脫敏劑量的PPMK107(3×108PFU/鼠)。2天后，每批小鼠再進(jìn)一步分成若干亞組，靜脈給予生理鹽水或PPMK107(劑量為1×109，2.5×109，5×109，和1×1010PFU/鼠)。如下表16所示，當(dāng)應(yīng)用生理鹽水預(yù)處理小鼠時(shí)，隨后給予劑量2.5×109，5×109，和1×1010PFU的小鼠有死亡記錄。對(duì)于生理鹽水預(yù)處理的小鼠，5×109，和1×1010PFU的劑量是100％致死性的。相反，在第0天給予脫敏劑量PPMK107、2天后注射PPMK107的任意一組小鼠中，甚至在劑量高達(dá)1×1010PFU時(shí)，也沒有小鼠死亡。這些數(shù)據(jù)提示PPMK107可被用來(lái)脫敏，降低隨后給予的相同制劑的致死性。而且，當(dāng)應(yīng)用該病毒作為脫敏劑時(shí)，PPMK107的最大耐受劑量可以增加大約一個(gè)數(shù)量級(jí)。表17.應(yīng)用脫敏劑量PPMK107降低隨后劑量PPMK107的致死性
實(shí)施例19緩慢靜脈注射降低PPMK107的毒性22只無(wú)胸腺小鼠(8周齡)應(yīng)用氯胺酮/甲苯噻嗪聯(lián)合麻醉，然后置于控制裝置中，以抑制小鼠在注射過程中的掙扎，使緩慢或快速注射PPMK107成為可能。緩慢注射組是將溶于生理鹽水的4×109PFU的PPMK107 0.2ml在4分鐘內(nèi)靜脈注射，也就是每10-15秒給予0.01ml。而快速注射組則在30秒內(nèi)接受相同劑量、體積的病毒。如表18所示，在4分鐘內(nèi)接受PPMK107的動(dòng)物，最大體重減輕(在給藥后2天記錄)幾乎是在30秒內(nèi)接受相同靜脈注射劑量的動(dòng)物的一半。這些結(jié)果提示，靜脈給予PPMK107，如果注射速度如此緩慢，PPMK107是較少毒性，比較安全的。
表18.緩慢靜脈注射PPMK107導(dǎo)致毒性降低
實(shí)施例20應(yīng)用PPMK107治療癌癥晚期患者
PPMK107目前正在美國(guó)進(jìn)行I期臨床試驗(yàn)，給藥途徑是靜脈內(nèi)。到目前為止，總共有52例用現(xiàn)有療法無(wú)法控制的晚期實(shí)體瘤患者，應(yīng)用PPMK107進(jìn)行治療。其中17名患者在第一療程時(shí)接受了單劑治療。另外13名患者在第一療程時(shí)，接受了每周3次相同劑量的治療1周。22患者在第一療程時(shí)，接受了每周3次劑量的治療1周，首劑為脫敏劑量的120億PFU/m2，隨后兩劑給予更高劑量為240-960億PFU/m2。每名患者的腫瘤大小每月隨訪一次。至少保持疾病穩(wěn)定狀態(tài)的患者(在沒有任何新病變的情況下，所有可測(cè)定腫瘤產(chǎn)物的總量增加少于25％，降低少于50％)，每月可以接受另外的療程。
癌癥患者獨(dú)立腫瘤的消退在5名患者中(1名患者應(yīng)用單劑治療方案，1名患者應(yīng)用重復(fù)相同劑量方案，3名患者應(yīng)用脫敏劑量方案；表19)觀察到獨(dú)立腫瘤的消退。應(yīng)當(dāng)注意，在接受作為脫敏方案一部分的高劑量第2、3劑的患者中，腫瘤消退率(16％的患者)較在重復(fù)相同劑量方案中接受3劑相同劑量的患者(8％腫瘤消退)高。
表19.應(yīng)用PPMK107治療癌癥晚期患者的獨(dú)立腫瘤消退
這些病例總結(jié)如下(A)有明顯轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌的腫瘤消退一名患有廣泛轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌的68歲婦女，在腹部有一個(gè)可觸及的轉(zhuǎn)移腫瘤。在單劑靜脈注射120億PFU/m2的PPMK1072周后，這名患者經(jīng)歷了該單獨(dú)腹壁腫瘤91％的消退(下表20)。給藥后1天測(cè)量的腫瘤大小(3.75×3cm)與基線測(cè)量值(4×3cm)相似。但是，給藥后7天，腫瘤縮小到2×2cm，并持續(xù)縮小到給予PPMK107 14天后的1.5×1.5cm。在給予PPMK107治療前，該腫瘤生長(zhǎng)迅速，在給予PPMK107前2周，該腫瘤體積的增長(zhǎng)是1065％。該患者由于其他部位腫瘤的生長(zhǎng)增大而從此項(xiàng)研究中取消。
表20.123號(hào)患者(68歲，女性，患有轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌)在接受單劑靜脈注射120億PFU/m2PPMK107后腹壁可觸摸腫瘤的大小
(B)患有乳腺癌的婦女胸壁腫瘤的消退患有乳腺癌的58歲婦女在胸壁上有一個(gè)肉眼可見、可以觸及的腫塊。在應(yīng)用59億PFU/m2的PPMK107治療的第二療程中，通過肉眼觀察和觸摸，患者胸壁腫瘤大小降低～90％。該患者在第3療程的治療后，也由于其他部位腫瘤的生長(zhǎng)增大而從此項(xiàng)研究中取消。
(C)腹膜間皮瘤患者腹部腫瘤的消退患有腹膜間皮瘤的46歲男性患者，在接受第一療程的PPMK107治療后，3個(gè)巨大(8-10cm)腫塊分別消退50％，42％和10％，所述治療包括120億PFU/m2的脫敏劑量，以及隨后兩劑480億PFU/m2。第一療程治療后，該患者的另一個(gè)巨大腫瘤(9.8cm大小)仍保持穩(wěn)定狀態(tài)。該患者目前仍在研究中。該患者最近一次的CT檢查提示，他的兩個(gè)轉(zhuǎn)移瘤較基線有顯著消退，至少30-36％，整體疾病狀態(tài)保持穩(wěn)定。
(D)黑色素瘤患者轉(zhuǎn)移腫瘤的消退患有黑色素瘤的57歲男性患者，在接受第一療程的PPMK107治療后，有2個(gè)腫瘤完全消退，所述治療包括120億PFU/m2的脫敏劑量，以及隨后兩劑480億PFU/m2。在PPMK107治療后消失的2個(gè)腫瘤，一個(gè)是腹股溝處1cm大小的可觸及腫塊，另一個(gè)是肺轉(zhuǎn)移瘤。該患者由于其他部位腫瘤的生長(zhǎng)增大而從此項(xiàng)研究中取消。
(E)結(jié)腸癌患者肝轉(zhuǎn)移瘤的持續(xù)消退患有結(jié)腸癌的79歲男性患者，在接受第一療程的PPMK107治療后，肝尾葉的一個(gè)轉(zhuǎn)移瘤消退59％，在第二療程后，消退97％。所述治療包括120億PFU/m2的脫敏劑量，以及隨后兩劑720億PFU/m2。治療前，該腫瘤的基線大小為3×3cm(腫瘤體積為13.5cm3，計(jì)算公式為1/2×長(zhǎng)×寬2)。第一療程PPMK107治療后，該腫瘤縮小59％，至2.8×2cm(腫瘤體積為5.6cm3)。第二療程PPMK107治療后3周，這一位于肝尾葉的同一腫瘤大小報(bào)告為3×0.5cm(腫瘤體積為0.38cm3)，相對(duì)于基線值，縮小97％。
癌癥穩(wěn)定其他21名以前應(yīng)用傳統(tǒng)癌癥療法，腫瘤持續(xù)進(jìn)展的患者，在應(yīng)用PPMK107治療后，晚期癌癥進(jìn)入穩(wěn)定狀態(tài)，使這些患者受益。這些進(jìn)入疾病穩(wěn)定狀態(tài)的患者代表包括腎癌、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、膽管癌和肺癌的多種癌癥類型。這些病例包括(1)腎癌患者疾病穩(wěn)定7個(gè)月；(2)肺癌患者疾病穩(wěn)定7個(gè)月；(3)胰腺癌患者疾病穩(wěn)定5個(gè)月；(4)另一胰腺癌患者疾病穩(wěn)定5個(gè)月；(5)腎癌患者疾病持續(xù)穩(wěn)定3個(gè)月；(6)膽管癌患者疾病持續(xù)穩(wěn)定2個(gè)月。
疼痛用藥減少一個(gè)患者應(yīng)用單劑59億PFU/m2劑量水平的PPMK107治療后，由于鎮(zhèn)痛藥用量減少，說明患者由于癌癥疼痛癥狀減輕而受益。
脫敏在脫敏方案中，首劑(120億PFU/m2)的脫敏效應(yīng)在同一周隨后用藥后可以清晰顯現(xiàn)。通常，第二劑和第三劑給藥報(bào)告的副作用更輕微，發(fā)生率更低，甚至在這些劑量較首劑高2-8倍時(shí)(240-960億PFU/m2)。例如，首劑后，曾有68％的患者報(bào)告發(fā)熱(包括9％的患者3度高熱)，但在第二劑后僅有32％的患者報(bào)告發(fā)熱(沒有3度發(fā)熱)，第三劑后僅有5％的患者報(bào)告。另一個(gè)實(shí)例是，首劑后50％的患者寒戰(zhàn)，而第二劑后寒戰(zhàn)的患者為18％，第三劑后僅有14％的患者寒戰(zhàn)。
另一個(gè)實(shí)例是，在重復(fù)相同劑量的研究中，接受這一多劑量治療方案(每周三劑59億PFU/m2，一周)的頭4個(gè)患者在首劑后，盡管接受了應(yīng)用對(duì)乙酰氨基酚和布洛芬的預(yù)防性退熱治療，還是出現(xiàn)了發(fā)熱。這些患者的大部分在甚至沒有接受退熱治療的情況下，在接受第二劑和第三劑后沒有發(fā)熱。因此，有強(qiáng)有力的證據(jù)表明，每周三次方案的首劑給藥可以降低第二劑和第三劑的毒性。
血清存在中和抗體的給藥該I期研究應(yīng)用的劑量范圍(≥59億PFU/m2)清楚顯示，即使患者已經(jīng)產(chǎn)生了中和抗體，還是能夠有效地將病毒傳遞給患者。一個(gè)患有胰腺癌的72歲女性患者，自從接受120億PFU/m2單劑PPMK107治療后，疾病處于穩(wěn)定狀態(tài)2個(gè)月。第二療程是在首劑后一個(gè)月進(jìn)行的(包括單劑PPMK107靜脈注射)，當(dāng)時(shí)在患者血清中已產(chǎn)生中和抗體。第二療程后7天，患者尿樣檢測(cè)PPMK107呈陽(yáng)性，滴度至少為。
其他證據(jù)也提示盡管存在中和抗體，應(yīng)用該試驗(yàn)劑量范圍(≥59億PFU/m2)可以獲得抗腫瘤效應(yīng)，這一證據(jù)是從一例58歲乳腺癌患者得到的，該患者的癌癥已擴(kuò)展到胸壁。如在探討腫瘤消退的部分所示，在第二療程的治療中，該患者胸壁腫瘤消退～90％。這一效應(yīng)發(fā)生在第一療程后5-6周，也就是該患者的抗體滴度從1∶256(第5周開始時(shí))上升到＞1∶2560(第6周開始時(shí))時(shí)。其他證明盡管存在中和抗體，但病毒依然有效地傳遞給該患者的證據(jù)是，在第5周末(該患者在第5周開始時(shí)的基線尿檢為陰性)，尿樣檢測(cè)陽(yáng)性(20-40PFU/mL)。
這些結(jié)果提示，第二療程這些患者血清中的抗PPMK107中和抗體即不能完全抑制病毒，也不能抑制病毒的抗腫瘤效應(yīng)。
實(shí)施例21新城疫病毒PPNJROAKIN細(xì)胞毒試驗(yàn)結(jié)果總結(jié)在24孔組織培養(yǎng)平板上，人類腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞生長(zhǎng)至大約80％匯合。移去生長(zhǎng)基質(zhì)，以10倍稀釋比例加入噬斑純化的中等毒力新城疫病毒株新澤西Roakin-1946，即PPNJROAKIN，范圍為107平板形成單位(PFU)/孔-1PFU/孔。每個(gè)平板都包括未加入病毒的對(duì)照孔。在搖擺平臺(tái)上37℃吸收病毒90分鐘。在孵育期結(jié)束時(shí)，移去病毒稀釋液，加入1ml的生長(zhǎng)基質(zhì)。然后在37℃5％CO2條件下孵育5天。細(xì)胞毒性應(yīng)用MTT(2-[4，5-二甲基噻唑-2-yI]-2，5-聯(lián)苯四唑溴)比色法(細(xì)胞滴度96，分類號(hào)#G4000，Promega公司，MadisonWI 53711)定量測(cè)定，在570nm測(cè)定線粒體酶活性(Mosman，T.，1983，免疫學(xué)方法雜志，6555)。病毒處理孔的活力用未接受病毒處理對(duì)照孔活性的百分比表示。數(shù)據(jù)應(yīng)用PFU/孔比對(duì)照活力百分比繪圖。IC50應(yīng)用導(dǎo)致存活細(xì)胞50％下降的每孔病毒的PFU量來(lái)計(jì)算。
表21.PPNJROAKIN細(xì)胞毒試驗(yàn)結(jié)果總結(jié)
這些結(jié)果提示，PPNJROAKIN顯示了相對(duì)于正常皮膚成纖維細(xì)胞，對(duì)至少兩種不同的人類腫瘤細(xì)胞(HT1080和KB)具有腫瘤選擇性殺傷作用。對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞系的IC50值較正常細(xì)胞低800-5000倍。
實(shí)施例22新城疫病毒PPCONN70726細(xì)胞毒試驗(yàn)結(jié)果總結(jié)在24孔組織培養(yǎng)平板上，人類腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞生長(zhǎng)至大約80％匯合。移去生長(zhǎng)基質(zhì)，以10倍稀釋比例加入噬斑純化的中等毒力新城疫病毒株Connecticut 70726-1946，即PPCONN70726，范圍為107平板形成單位(PFU)/孔-1PFU/孔。每個(gè)平板都包括未加入病毒的對(duì)照孔。在搖擺平臺(tái)上37℃吸收病毒90分鐘。在孵育期結(jié)束時(shí)，移去病毒稀釋液，加入1ml的生長(zhǎng)基質(zhì)。然后在37℃5％CO2條件下孵育5天。細(xì)胞毒性應(yīng)用MTT(2-[4，5-二甲基噻唑-2-yl]-2，5-聯(lián)苯四唑溴)比色法(細(xì)胞滴度96，分類號(hào)#G4000，Promega公司，Madison WI 53711)定量測(cè)定，在570nm測(cè)定線粒體酶活性(Mosman，T.，1983，免疫學(xué)方法雜志，6555)。病毒處理孔的活力用未接受病毒處理對(duì)照孔活性的百分比表示。數(shù)據(jù)應(yīng)用PFU/孔比對(duì)照活力百分比繪圖。IC50應(yīng)用導(dǎo)致存活細(xì)胞50％下降的每孔病毒的PFU量來(lái)計(jì)算。
表22.PPCONN70726細(xì)胞毒試驗(yàn)結(jié)果總結(jié)
這些結(jié)果提示，PPCONN70726顯示了相對(duì)于正常皮膚成纖維細(xì)胞，對(duì)至少三種不同的人類腫瘤細(xì)胞(KB，U87MG和U373MG)具有腫瘤選擇性殺傷作用。對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞系的IC50值較正常細(xì)胞低80-5000倍。
實(shí)施例23應(yīng)用PPMK107，PPNJROAKIN或PPCONN70726瘤體內(nèi)治療無(wú)胸腺小鼠HT1080纖維肉瘤異種移植物在該試驗(yàn)中，無(wú)胸腺小鼠(雌性，NCR nu/nu，5-6周齡)皮下注射107HT1080腫瘤細(xì)胞。4天后，當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)達(dá)到6-8.5mm大小時(shí)，瘤體內(nèi)應(yīng)用PPMK107(1×108PFU)，PPNJROAKIN(1×108PFU)或PPCONN70726(1×108PFU)治療小鼠。如下表23所示，應(yīng)用三種病毒(PPMK107，PPNJROAKIN和PPCONN70726)治療的小鼠出現(xiàn)腫瘤消退。PPMK107治療后，12只小鼠中有4只腫瘤完全消退，6只部分消退。PPNJROAKIN治療后，12只小鼠中有1只腫瘤完全消退，2只部分消退。PPCONN70726治療后，12只小鼠中有3只腫瘤完全消退，2只部分消退。應(yīng)用生理鹽水處理的小鼠中，沒有一只出現(xiàn)腫瘤消退。
表23.應(yīng)用三種病毒(PPMK107，PPNJROAKIN和PPCONN70726)中的一種治療無(wú)胸腺小鼠HT1080纖維肉瘤的腫瘤消退。每種病毒的治療劑量為1×108PFU。
實(shí)施例24免疫缺損的無(wú)胸腺小鼠(nu/nu)和有免疫能力的雜合體小鼠(nu/+)腦內(nèi)注射PPMK107，PPNJROAKIN或PPCONN70726的效應(yīng)56只無(wú)胸腺小鼠(nu/nu)和56只有免疫能力的雜合體小鼠(nu/+)應(yīng)用腦內(nèi)空間定位技術(shù)給予腦內(nèi)注射生理鹽水，PPMK107，PPNJROAKIN或PPCONN70726。每種小鼠中都有另外8只作為無(wú)治療對(duì)照組。應(yīng)用的病毒劑量是兩種劑量水平中的一種(2×104或3.5×106PFU/鼠)。如下表24所示，所有應(yīng)用兩種劑量水平的三種病毒處理的雜合體小鼠(nu/+)在39天內(nèi)存活，只有1只應(yīng)用低劑量PPCONN70726處理的小鼠被無(wú)痛處死，處死原因不是因?yàn)樯窠?jīng)系統(tǒng)癥狀。應(yīng)用PPMK107或PPCONN70726處理的無(wú)胸腺nu/nu動(dòng)物較雜合體生存顯著減少。特別是對(duì)于最高劑量的PPMK107或PPCONN70726病毒，所用劑量為3.5×106PFU/鼠，在每個(gè)病毒處理組中，在39天內(nèi)只有13％(8只小鼠中有1只)無(wú)胸腺動(dòng)物存活。相反，相同劑量水平(3.5×106PFU/鼠)PPNJROAKIN處理的無(wú)胸腺小鼠有75％存活。這些數(shù)據(jù)顯示，PPNJROAKIN較其他兩種病毒株在無(wú)胸腺小鼠大腦內(nèi)可以更好地耐受。
表24.腦內(nèi)注射PPMK107，PPNJROAKIN或PPCONN70726后的小鼠存活
*該治療組未存活的一只小鼠由于非神經(jīng)系統(tǒng)癥狀被無(wú)痛致死。
實(shí)施例25新培斯病毒PPSINDBIS-Ar339細(xì)胞毒試驗(yàn)結(jié)果總結(jié)在24孔組織培養(yǎng)平板上，人類腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞生長(zhǎng)至大約80％匯合。移去生長(zhǎng)基質(zhì)，以10倍稀釋比例加入噬斑純化的新培斯病毒株Ar-339，即PPSINDBIS-Ar339，范圍為107平板形成單位(PFU)/孔-1PFU/孔。每個(gè)平板都包括未加入病毒的對(duì)照孔。在搖擺平臺(tái)上37℃吸收病毒90分鐘。在孵育期結(jié)束時(shí)，移去病毒稀釋液，加入1ml的生長(zhǎng)基質(zhì)。然后在37℃5％CO2條件下孵育5天。細(xì)胞毒性應(yīng)用MTT(2-[4，5-二甲基噻唑-2-yl]-2，5-聯(lián)苯四唑溴)比色法(細(xì)胞滴度96，分類號(hào)#G4000，Promega公司，Madison WI 53711)定量測(cè)定，在570nm測(cè)定線粒體酶活性(Mosman，T.，1983，免疫學(xué)方法雜志，6555)。病毒處理孔的活力用未接受病毒處理對(duì)照孔活性的百分比表示。數(shù)據(jù)應(yīng)用PFU/孔比對(duì)照活力百分比繪圖。IC50應(yīng)用導(dǎo)致存活細(xì)胞50％下降的每孔病毒的PFU量來(lái)計(jì)算。
表25.PPSINDBIS-Ar339細(xì)胞毒試驗(yàn)結(jié)果總結(jié)
*已知細(xì)胞過量表達(dá)高親和力層粘連蛋白受體mRNA。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)新培斯病毒的細(xì)胞受體是高親和力層粘連蛋白受體，該受體主要在上皮系細(xì)胞中表達(dá)，但通常在多種轉(zhuǎn)移癌癥細(xì)胞上過量表達(dá)，如胰腺癌Panc-1細(xì)胞系，以及結(jié)腸腺癌SW620細(xì)胞系(Campo等，(1992)美國(guó)病理學(xué)雜志，1411073-1083；Yow等，(1988)Proc.Natl Acad Sci，856394-6398)。相反，已知直腸腺癌SW1463細(xì)胞系高親和力層粘連蛋白受體mRNA表達(dá)水平非常低(Yow等，(1988)Proc.Natl Acad Sci，856394-6398)，對(duì)PPSINDBIS-Ar339的殺傷耐受性較SW620細(xì)胞高4個(gè)數(shù)量級(jí)。這些結(jié)果提示具有致癌性并表達(dá)高親和力層粘連蛋白受體的細(xì)胞，較其他腫瘤或正常細(xì)胞對(duì)新培斯病毒克隆PPSINDBIS-Ar339的殺傷更加敏感。
實(shí)施例26
在干擾素存在的情況下，VSV殺傷致癌和非致癌細(xì)胞在有系列稀釋?duì)粮蓴_素的96孔板接種致癌細(xì)胞KB、HT1080(3×104細(xì)胞/孔)以及非致癌細(xì)胞WISH(2.5×104細(xì)胞/孔)，α干擾素的范圍為2800-22單位/ml，37℃孵育24小時(shí)。如何用皰疹性口炎病毒(VSV，Indiana株)以moi 10感染這些細(xì)胞。對(duì)照組包括沒有干擾素的孔，以及沒有干擾素或病毒的孔。細(xì)胞37℃孵育24小時(shí)。細(xì)胞毒性應(yīng)用MTT(2-[4，5-二甲基噻唑-2-yl]-2，5-聯(lián)苯四唑溴)比色法(細(xì)胞滴度96，分類號(hào)#G4000，Promega公司，Madison WI53711)定量測(cè)定，在570nm測(cè)定線粒體酶活性(Mosman，T.，1983，免疫學(xué)方法雜志，6555)。病毒處理孔的活力用未接受病毒處理對(duì)照孔活性的百分比表示。
表26.VSV對(duì)外源性干擾素處理細(xì)胞的殺傷活性比較
這些結(jié)果顯示VSV可以選擇性殺傷具有干擾素應(yīng)答缺陷的腫瘤細(xì)胞(見實(shí)施例27)。WISH(人類羊膜細(xì)胞)細(xì)胞是已經(jīng)良好建立的用于干擾素生物試驗(yàn)的細(xì)胞系，因?yàn)樗鼈兙哂袑?duì)干擾素有效應(yīng)答的能力。
實(shí)施例27對(duì)PPMK107殺傷作用敏感或耐受細(xì)胞的干擾素反應(yīng)性各種細(xì)胞系在96微孔板內(nèi)生長(zhǎng)至接近匯合，應(yīng)用5和5000單位/mlα干擾素處理24小時(shí)。然后用PPMK107以moi 1.0感染培養(yǎng)細(xì)胞，并繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。化學(xué)固定后，病毒表達(dá)量用可溶性指示劑免疫組化法量化。病毒生長(zhǎng)量用相對(duì)于未接受干擾素處理的對(duì)照孔P抗原表達(dá)百分比代表(圖5)。在此試驗(yàn)中，干擾素反應(yīng)性細(xì)胞對(duì)干擾素作出應(yīng)答，表達(dá)抗原顯示至少50％的下降。
該試驗(yàn)結(jié)果顯示，在細(xì)胞系對(duì)外源性干擾素抗病毒效應(yīng)的耐受性和這些細(xì)胞對(duì)PPMK殺傷敏感性(見圖5，用在圖例細(xì)胞系名稱后面圓括號(hào)內(nèi)顯示的IC50值表示)之間有強(qiáng)關(guān)聯(lián)。例如，在5單位/mlα干擾素預(yù)處理后，對(duì)干擾素?zé)o反應(yīng)能力的7個(gè)細(xì)胞系中有6個(gè)(86％)對(duì)PPMK殺傷敏感；在500單位/ml干擾素預(yù)處理后，對(duì)干擾素?zé)o反應(yīng)能力的所有細(xì)胞系(4個(gè)中有4個(gè))對(duì)PPMK殺傷敏感。
上述數(shù)據(jù)還為鑒定對(duì)PPMK107或其他干擾素敏感病毒的殺傷敏感的備選細(xì)胞提供了篩查試驗(yàn)方法。例如，在外源性干擾素預(yù)處理后，感染細(xì)胞明顯表達(dá)(如，超過對(duì)照50％以上)病毒抗原可以認(rèn)為是干擾素缺陷，因此對(duì)病毒的溶瘤細(xì)胞作用敏感。
實(shí)施例28靜脈應(yīng)用脫敏劑量PPMK107可以降低隨后腹膜內(nèi)給予PPMK107的致死性第0天給小鼠靜脈注射生理鹽水或脫敏劑量的PPMK107(3×108PFU/鼠)。2天后，每批小鼠再進(jìn)一步分成若干亞組，腹膜內(nèi)給予生理鹽水或PPMK107(劑量為1×109，2.5×109，5×109，和1×1010PFU/鼠)。如下表27所示，當(dāng)應(yīng)用生理鹽水預(yù)處理小鼠時(shí)，隨后給予劑量2.5×109，5×109，和1×1010PFU的小鼠有死亡記錄。對(duì)于生理鹽水預(yù)處理的小鼠，劑量2.5×109，5×109，和1×1010PFU的致死性分別為25％，50％和100％。相反，應(yīng)用靜脈脫敏的小鼠，在劑量為2.5×109，5×109PFU的組中沒有死亡，在劑量為1×1010PFU組中死亡率僅為38％。這些數(shù)據(jù)提示靜脈給予PPMK107可被用來(lái)脫敏，降低隨后通過其他方式(在此實(shí)施例中，是腹膜內(nèi)途徑)給予的相同制劑的毒性。而且，當(dāng)應(yīng)用該病毒作為脫敏劑時(shí)，PPMK107的最大耐受劑量可以增加大約5倍。
表27.靜脈應(yīng)用脫敏劑量PPMK107可以降低隨后腹膜內(nèi)給予PPMK107的致死性
實(shí)施例29應(yīng)用脫敏劑量的PPMK107增加隨后腹膜內(nèi)給予的PPMK107的抗腫瘤效應(yīng)在該實(shí)施例中，具有肉眼可見腹水腫瘤的無(wú)胸腺小鼠應(yīng)用腹膜內(nèi)給予的PPMK107治療，所述腹水腫瘤來(lái)源于人卵巢癌細(xì)胞系ES-2，治療前2天，或者靜脈應(yīng)用3×108PFU/鼠脫敏，或者不脫敏。如表28所示，腹膜內(nèi)應(yīng)用生理鹽水處理的對(duì)照小鼠迅速死于腹水腫瘤，處理后第9天的存活率僅為8％。腹膜內(nèi)給予最大耐受劑量PPMK107可以在第9天增加存活百分比至46％。應(yīng)用靜脈脫敏，較未脫敏小鼠可以耐受更高劑量的PPMK107，如2.5×109和5×109PFU，導(dǎo)致存活率幾乎翻番(分別為83％和79％)，而未脫敏小鼠可以達(dá)到的最高劑量是1.0×109PFU。
表28.攜帶人卵巢癌ES-2腹水腫瘤的小鼠應(yīng)用腹膜內(nèi)PPMK107治療后的存活
a-未脫敏時(shí)，劑量高于MTD，但脫敏后，劑量低于MTD。
實(shí)施例30抗重組鼠αTNF抗血清可以阻斷小鼠靜脈注射PPMK107的致死性在該試驗(yàn)中，16只雌性C57BL/6小鼠一組，靜脈注射5.0×109PFU的PPMK107。在處理前5小時(shí)，不同組的16只小鼠分別接受抗重組鼠αTNF抗血清(100ul兔血清，用生理鹽水1∶10稀釋)、相同數(shù)量的對(duì)照兔血清或生理鹽水。如下表29所示，應(yīng)用兔抗鼠αTNF抗血清可以完全阻斷該劑量PPMK107的致死性。
表29.靜脈注射5.0E+09PPMK107前應(yīng)用抗重組鼠αTNF抗血清預(yù)處理小鼠的死亡率
a-死亡率與生理鹽水和兔血清對(duì)照處理組有顯著差異(P＜0.05，F(xiàn)isher精確檢測(cè)法)。
實(shí)施例31克隆病毒的純化很多RNA病毒是通過無(wú)沉淀超速離心病毒或隨后的切線層流過濾法純化的。應(yīng)用下述方法之一純化方法1如實(shí)施例15的方法A。
方法2如實(shí)施例15的方法B。
方法3Vero細(xì)胞在生長(zhǎng)至大約70％匯合時(shí)，以moi 0.01感染Vero細(xì)胞，37℃孵育18小時(shí)。然后將裝有感染細(xì)胞的長(zhǎng)頸瓶-70℃冷藏。室溫下解凍細(xì)胞，然后冰浴至收獲。收獲時(shí)，將細(xì)胞刮下，放入感染培養(yǎng)基，4℃1750×g離心澄清30分鐘。收集上清液，并置于20％/55％不連續(xù)梯度中，以大約100,000×g離心30分鐘。在20％/55％界面上收獲純化的病毒，并通過不含鈣、鎂的PBS透析去除蔗糖。
病毒制劑的活性通過平板試驗(yàn)法測(cè)定，新城疫病毒應(yīng)用HT1080細(xì)胞，皰疹性口炎病毒應(yīng)用Veco細(xì)胞。病毒制劑中的蛋白含量通過NanoOrange蛋白定量試劑盒(分子探針股份有限公司，Eugene，OR)測(cè)定，應(yīng)用牛血清白蛋白作為蛋白標(biāo)準(zhǔn)。
表30.通過無(wú)沉淀超速離心法或切線層流過濾法純化的多種克隆RNA病毒的特異活性
這些結(jié)果顯示了應(yīng)用本發(fā)明所述方法純化不同克隆RNA病毒至高特異活性的能力。
實(shí)施例32新培斯病毒PPSINDBIS-Ar339可以導(dǎo)致攜帶人腫瘤細(xì)胞異種移植物無(wú)胸腺小鼠的腫瘤抑制無(wú)胸腺小鼠皮下注射1千萬(wàn)人類腺癌腫瘤細(xì)胞SW620。5天后，單劑PPSINDBIS-Ar339(10只小鼠，5×106PFU)或生理鹽水(9只小鼠)注射治療腫瘤(平均大小＝78mm3)。每周兩次測(cè)量腫瘤大小和小鼠體重，直至研究結(jié)束。治療后12天，生理鹽水處理組小鼠平均腫瘤大小增長(zhǎng)平均為896％(從71.3mm3到639.1mm3)。
表31.應(yīng)用PPSINDBIS-Ar339瘤體內(nèi)治療人結(jié)腸腺癌SW620異種移植物
a-腫瘤生長(zhǎng)抑制％＝(對(duì)照組增長(zhǎng)％-腫瘤組增長(zhǎng)％)×100/對(duì)照組增長(zhǎng)％這些數(shù)據(jù)顯示單劑注射PPSINDBIS-Ar339較生理鹽水可以顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。小鼠對(duì)PPSINDBIS-Ar339治療耐受良好，證據(jù)是無(wú)論在生理鹽水組還是病毒治療組，均未出現(xiàn)體重減輕。
實(shí)施例33屬于不相關(guān)科的病毒顯示了對(duì)人類腫瘤細(xì)胞系的相似活性如實(shí)施例1和25所述，應(yīng)用SW620腺癌細(xì)胞系和PPMK107(副粘病毒科)或PPSINDBIS-Ar339(披膜病毒科)進(jìn)行了細(xì)胞毒試驗(yàn)(見圖6)。這兩種不相關(guān)病毒通過不同受體進(jìn)入宿主細(xì)胞，并通過每種病毒獨(dú)特的機(jī)制復(fù)制。但是，SW620細(xì)胞系對(duì)這兩種病毒感染的反應(yīng)卻及其相似，提示這些病毒殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制可能通過共同的要素。
實(shí)施例34應(yīng)用PPMK107聯(lián)合化療系統(tǒng)治療無(wú)胸腺小鼠人類腫瘤異種移植物無(wú)胸腺小鼠皮下注射1千萬(wàn)人纖維肉瘤細(xì)胞HT1080。在腫瘤生長(zhǎng)達(dá)到5-7mm大小后，將小鼠隨機(jī)分組。小鼠在第0，2，4天接受腹膜內(nèi)注射生理鹽水媒介基質(zhì)。在第2天，腹膜內(nèi)注射1小時(shí)后，靜脈注射PPMK107，劑量為2×107pFU或生理鹽水。在第0，2或4天腹膜內(nèi)注射卡鉑(carbo)，劑量為160mg/kg。每組完全消退(CR)和部分消退(PR)的百分比顯示如下。每個(gè)治療組有9只攜帶腫瘤的小鼠。表32.PPMK107聯(lián)合卡鉑系統(tǒng)治療無(wú)胸腺小鼠皮下人類HT1080纖維肉瘤異種移植物
表32顯示的這些結(jié)果提示，皮下HT1080腫瘤對(duì)靜脈注射PPMK107治療有反應(yīng)，在PPMK107處理前2天、同一天或處理后2天聯(lián)合卡鉑治療，腫瘤消退(CR+PR)百分比較單獨(dú)應(yīng)用PPMK107或單獨(dú)應(yīng)用卡鉑高。
實(shí)施例35應(yīng)用PPMK107聯(lián)合卡鉑系統(tǒng)治療無(wú)胸腺小鼠人類HT1080腫瘤異種移植物的第二次試驗(yàn)如實(shí)施例34，無(wú)胸腺小鼠皮下注射1千萬(wàn)人纖維肉瘤細(xì)胞HT1080。在治療的第0天，給小鼠腹膜內(nèi)注射卡鉑(carbo)，劑量為80mg/kg或120mg/kg，或生理鹽水媒介基質(zhì)，然后在治療的第2天，靜脈注射PPMK107(劑量為，6×106，或2×107PFU)。每組完全消退(CR)和部分消退(PR)的百分比顯示如下。每個(gè)治療組有9只攜帶腫瘤的小鼠。表33.PPMK107聯(lián)合卡鉑系統(tǒng)治療無(wú)胸腺小鼠皮下人類HT1080纖維肉瘤異種移植物
表33顯示的這些結(jié)果提示，皮下HT1080腫瘤對(duì)每個(gè)劑量水平的靜脈注射PPMK107治療均有反應(yīng)，在PPMK107處理前2天聯(lián)合任一劑量的卡鉑治療，腫瘤消退(CR+PR)百分比較單獨(dú)應(yīng)用PPMK107或單獨(dú)應(yīng)用卡鉑高。
實(shí)施例36應(yīng)用PPMK107聯(lián)合卡鉑系統(tǒng)治療無(wú)胸腺小鼠人類HT1080腫瘤異種移植物的第三次試驗(yàn)如實(shí)施例34，無(wú)胸腺小鼠皮下注射1千萬(wàn)人纖維肉瘤細(xì)胞HT1080。在治療的第0天，給小鼠腹膜內(nèi)注射卡鉑(carbo)，劑量為60mg/kg，或生理鹽水媒介基質(zhì)，然后在治療的第2天，靜脈注射PPMK107(劑量為6×106PFU)。每組完全消退(CR)和部分消退(PR)的百分比顯示如下。每個(gè)治療組有9只攜帶腫瘤的小鼠，但卡鉑單獨(dú)治療組有8只小鼠。
表34.PPMK107聯(lián)合卡鉑系統(tǒng)治療無(wú)胸腺小鼠皮下人類HT1080纖維肉瘤異種移植物
表34顯示的這些結(jié)果提示，皮下HT1080腫瘤對(duì)靜脈注射PPMK107治療有反應(yīng)，在PPMK107處理前2天聯(lián)合卡鉑治療，腫瘤消退(CR+PR)百分比較單獨(dú)應(yīng)用PPMK107或單獨(dú)應(yīng)用卡鉑高。
實(shí)施例37應(yīng)用皮質(zhì)類固醇(地塞米松)降低靜脈注射PPMK107的致死性雌性無(wú)胸腺小鼠(6-7周齡)在第0，1，2，3和4天腹膜內(nèi)注射地塞米松(一組的劑量為25mg/kg，另一組的劑量為10mg/kg)或生理鹽水。所有動(dòng)物在第2天(腹膜內(nèi)注射地塞米松或生理鹽水1小時(shí)后)靜脈注射(劑量為3×109PFU/鼠)。觀察動(dòng)物，并將致死性列于下表33。
表35.應(yīng)用地塞米松降低靜脈注射PPMK107的致死性
腹膜內(nèi)給予生理鹽水的對(duì)照小鼠，劑量為3×109的PPMK107可使67％小鼠致死。地塞米松可以顯著降低PPMK107的致死性，給予25mg/kg地塞米松的小鼠，觀察到的死亡率僅為7％，而給予10mg/kg地塞米松的小鼠，觀察到的死亡率為0％。這些數(shù)據(jù)提示皮質(zhì)類固醇如地塞米松可用于降低靜脈注射PPMK107的毒性。
× × × ×前述內(nèi)容旨在描述本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。在不背離本發(fā)明真正意旨和范圍的情況下，可以進(jìn)行多種改變和修飾。
權(quán)利要求
1.應(yīng)用病毒感染哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，包括將具有復(fù)制能力的干擾素敏感性克隆RNA病毒給予所述哺乳動(dòng)物。
2.應(yīng)用病毒感染哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，包括將具有復(fù)制能力的克隆RNA病毒給予所述哺乳動(dòng)物，其中所述病毒對(duì)干擾素具有敏感性。
3.治療哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，包括給所述哺乳動(dòng)物應(yīng)用治療有效劑量的具有復(fù)制能力的干擾素敏感性克隆RNA病毒。
4.權(quán)利要求1的方法，其中RNA病毒在有干擾素存在的情況下，相對(duì)于無(wú)干擾素存在的情況，復(fù)制減少至少100倍。
5.權(quán)利要求1的方法，其中RNA病毒在有干擾素存在的情況下，相對(duì)于無(wú)干擾素存在的情況，復(fù)制減少至少1000倍。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述給予病毒的步驟是系統(tǒng)性給予。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述腫瘤是癌癥。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人類。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述克隆病毒是經(jīng)噬斑純化的。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述克隆病毒源于重組克隆病毒。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述RNA病毒是副粘病毒。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述副粘病毒純化至至少2×109PFU/mg蛋白水平。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述副粘病毒純化至至少1×1010PFU/mg蛋白水平。
14.權(quán)利要求11的方法，其中所述副粘病毒純化至至少6×1010PFU/mg蛋白水平。
15.權(quán)利要求11的方法，其中所述副粘病毒純化至顆粒/PFU比率不大于5的水平。
16.權(quán)利要求11的方法，其中所述副粘病毒純化至顆粒/PFU比率不大于3的水平。
17.權(quán)利要求11的方法，其中所述副粘病毒純化至顆粒/PFU比率不大于1.2的水平。
18.權(quán)利要求11的方法，其中所述副粘病毒是II型禽副粘病毒。
19.權(quán)利要求11的方法，其中所述副粘病毒是NDV。
20.權(quán)利要求11的方法，其中所述副粘病毒是流行性腮腺炎病毒。
21.權(quán)利要求11的方法，其中所述副粘病毒是人類副流感病毒。
22.權(quán)利要求1的方法，其中所述RNA病毒選自棒狀病毒，披膜病毒，黃病毒，呼腸病毒，細(xì)小核糖核酸病毒和冠狀病毒。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述披膜病毒是新培斯病毒。
24.權(quán)利要求22的方法，其中所述呼腸病毒在ω-3上有修飾。
25.權(quán)利要求22的方法，其中所述呼腸病毒在ω-1上有減毒突變。
26.權(quán)利要求22的方法，其中所述呼腸病毒是減毒輪狀病毒。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述輪狀病毒是輪狀病毒W(wǎng)C3。
28.應(yīng)用病毒感染哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，包括將具有復(fù)制能力的干擾素敏感性克隆痘苗病毒給予所述哺乳動(dòng)物，所述痘苗病毒在一個(gè)或多個(gè)病毒基因上具有一個(gè)或多個(gè)突變，所述病毒基因選自K3L，E3L和B18R基因。
29.應(yīng)用病毒感染哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，包括將具有復(fù)制能力的克隆痘苗病毒給予所述哺乳動(dòng)物，所述痘苗病毒在一個(gè)或多個(gè)病毒基因上具有一個(gè)或多個(gè)突變，所述病毒基因選自K3L，E3L和B18R基因，其中，所述病毒對(duì)干擾素敏感。
30.應(yīng)用病毒感染哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，包括將有效治療劑量的具有復(fù)制能力的干擾素敏感性克隆痘苗病毒給予所述哺乳動(dòng)物，所述痘苗病毒在一個(gè)或多個(gè)病毒基因上具有一個(gè)或多個(gè)突變，所述病毒基因選自K3L，E3L和B18R基因。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人類。
32.權(quán)利要求30的方法，其中所述痘苗病毒是具有減毒突變的痘苗病毒，突變基因選自編碼痘苗生長(zhǎng)因子，胸腺嘧啶脫氧核苷激酶、胸苷酸激酶、DNA連接酶、核苷酸還原酶、和dUTP酶的基因。
33.應(yīng)用病毒感染哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，包括將具有復(fù)制能力的干擾素敏感性克隆DNA病毒給予所述哺乳動(dòng)物，所述DNA病毒選自腺病毒，細(xì)小病毒，乳多空病毒和虹彩病毒。
34.應(yīng)用病毒感染哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，包括將具有復(fù)制能力的克隆DNA病毒給予所述哺乳動(dòng)物，所述DNA病毒選自腺病毒，細(xì)小病毒，乳多空病毒和虹彩病毒，其中，所述病毒對(duì)干擾素敏感。
35.治療哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，包括將治療有效劑量的具有復(fù)制能力的干擾素敏感性克隆DNA病毒給予所述哺乳動(dòng)物，所述DNA病毒選自腺病毒，細(xì)小病毒，乳多空病毒和虹彩病毒。
36.權(quán)利要求33的方法，其中所述哺乳動(dòng)物為人類。
37.權(quán)利要求33的方法，其中所述腺病毒在VA1轉(zhuǎn)錄本上有修飾，導(dǎo)致所述腺病毒對(duì)干擾素敏感。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述腺病毒選自Ad-4，Ad-7和Ad-21疫苗株。
39.應(yīng)用病毒感染哺乳動(dòng)物治療的方法，包括將具有復(fù)制能力的干擾素敏感性克隆皰疹病毒給予所述哺乳動(dòng)物。
40.應(yīng)用病毒感染哺乳動(dòng)物治療的方法，包括將具有復(fù)制能力的克隆皰疹病毒給予所述哺乳動(dòng)物，其中所述病毒對(duì)干擾素敏感。
41.治療哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，包括將治療有效劑量的具有復(fù)制能力的干擾素敏感性克隆皰疹病毒給予所述哺乳動(dòng)物。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述皰疹病毒是β皰疹病毒或γ皰疹病毒亞科中的成員。
43.權(quán)利要求41的方法，其中所述皰疹病毒是α皰疹病毒亞科中的成員，但不是HSV-1。
44.權(quán)利要求41的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人類。
45.權(quán)利要求41的方法，其中所述皰疹病毒是α皰疹病毒亞科中的成員，其(2’-5’)An類似物表達(dá)降低。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述皰疹病毒是具有減毒突變的皰疹病毒，減毒突變選自編碼胸腺嘧啶脫氧核苷激酶、核苷酸還原酶的基因或在b’a’c’倒轉(zhuǎn)重復(fù)位點(diǎn)存在缺失。
47.權(quán)利要求45的方法，其中所述皰疹病毒在γ34.5基因有修飾。
48.權(quán)利要求41的方法，其中所述皰疹病毒在γ34.5基因有修飾，在編碼胸腺嘧啶脫氧核苷激酶的基因上存在減毒突變，或在b’a’c’倒轉(zhuǎn)重復(fù)位點(diǎn)或功能類似物位點(diǎn)存在缺失。
49.權(quán)利要求41的方法，其中所述皰疹病毒是具有減毒突變的皰疹病毒，減毒突變選自編碼胸腺嘧啶脫氧核苷激酶、核苷酸還原酶的基因或在b’a’c’倒轉(zhuǎn)重復(fù)位點(diǎn)存在缺失。
50.權(quán)利要求1的方法，其中所述腫瘤是一種癌癥，所述癌癥選自肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌和腦癌。
51.權(quán)利要求1的方法，其中所述腫瘤是一種實(shí)體瘤。
52.權(quán)利要求50的方法，其中所述腦癌是成膠質(zhì)細(xì)胞瘤。
53.權(quán)利要求1的方法，其中所述病毒含有編碼干擾素的基因，使病毒表達(dá)干擾素。
54.權(quán)利要求1的方法，其中所述病毒含有編碼前藥激活酶的基因。
55.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在給予所述病毒之前、期間或之后，給予干擾素。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所述干擾素選自·-干擾素，·-干擾素，·-干擾素，·-干擾素和合成的同質(zhì)形式干擾素。
57.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在給予所述病毒之前、期間或之后，給予酪氨酸激酶抑制劑。
58.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括給予一種化合物，所述化合物選自嘌呤核苷類似物、酪氨酸激酶抑制劑、西咪替叮和線粒體抑制劑。
59.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在給予所述病毒之前、期間或之后，給予一種化療藥物。
60.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在給予所述病毒之前、期間或之后，給予一種細(xì)胞因子。
61.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在給予所述病毒之前、期間或之后，給予一種免疫抑制劑。
62.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括給予病毒復(fù)制控制劑量的化合物，所述化合物選自干擾素，利巴韋林，無(wú)環(huán)鳥苷，方昔洛韋(famciclovir)和更昔洛韋。
63.權(quán)利要求1的方法，其中所述給藥方法是靜脈內(nèi)和腫瘤瘤體內(nèi)。
64.應(yīng)用病毒感染哺乳動(dòng)物大小至少1厘米腫瘤的方法，包括將選自(1)RNA病毒；(2)嗜肝DNA病毒；(3)細(xì)小病毒；(4)乳多空病毒；(5)皰疹病毒；(6)痘病毒；和(7)虹彩病毒的克隆病毒給予所述哺乳動(dòng)物。
65.治療哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，包括給所述哺乳動(dòng)物應(yīng)用治療有效劑量的克隆病毒，所述病毒選自(1)RNA病毒；(2)嗜肝DNA病毒；(3)細(xì)小病毒；(4)乳多空病毒；(5)皰疹病毒；(6)痘病毒；和(7)虹彩病毒，其中所述腫瘤大小至少1厘米。
66.權(quán)利要求64的方法，其中所述腫瘤體積至少300mm3。
67.權(quán)利要求64的方法，其中所述RNA病毒是副粘病毒。
68.權(quán)利要求67的方法，其中所述副粘病毒是NDV。
69.權(quán)利要求64的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人類。
70.權(quán)利要求64的方法，其中所述給藥方法是靜脈內(nèi)或腫瘤瘤體內(nèi)。
71.權(quán)利要求64的方法，其中所述副粘病毒純化至至少2×109PFU/mg蛋白水平。
72.權(quán)利要求68的方法，其中所述NDV是中等毒力株。
73.權(quán)利要求65的方法，其中所述腫瘤是癌性的。
74.治療哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，包括將治療有效劑量的細(xì)胞毒性RNA病毒給予所述哺乳動(dòng)物的所述腫瘤，其中所述哺乳動(dòng)物的腫瘤負(fù)荷占所述哺乳動(dòng)物總體重的至少1.5％。
75.權(quán)利要求74的方法，其中所述腫瘤對(duì)化療無(wú)反應(yīng)。
76.篩選從患者處得到的新鮮腫瘤細(xì)胞或組織的方法，可以測(cè)定該細(xì)胞或組織對(duì)病毒殺傷力的敏感性，包括應(yīng)用干擾素敏感性病毒，采用差異細(xì)胞毒試驗(yàn)，檢測(cè)組織樣本。
77.權(quán)利要求76的方法，還進(jìn)一步包括篩查所述細(xì)胞或組織中蛋白或編碼蛋白的mRNA，Ras過量表達(dá)，含有活化突變的Ras，其他Ras信號(hào)途徑介導(dǎo)因子過量表達(dá)，不受調(diào)控的酪氨酸激酶受體的步驟，所述蛋白選自p68蛋白激酶，C-Myc，C-Myb，ISGF-3，IRF-1，干擾素受體，以及p58。
78.鑒定病毒在哺乳動(dòng)物中抗腫瘤活性的方法，包括a)應(yīng)用測(cè)試病毒感染i)干擾素介導(dǎo)的抗病毒活性缺陷性細(xì)胞；以及ii)具有干擾素介導(dǎo)的抗病毒活性能力的細(xì)胞，并且b)測(cè)定所述測(cè)試病毒是否優(yōu)先殺傷所述干擾素介導(dǎo)的抗病毒活性缺陷性細(xì)胞，而非所述具有干擾素介導(dǎo)的抗病毒活性能力的細(xì)胞。
79.權(quán)利要求78的方法，其中所述干擾素介導(dǎo)的抗病毒活性缺陷性細(xì)胞是人類頭頸部腫瘤細(xì)胞KB。
80.權(quán)利要求78的方法，其中所述具有干擾素介導(dǎo)的抗病毒活性能力的細(xì)胞是人類皮膚成纖維細(xì)胞。
81.制備用于抗腫瘤治療的病毒的方法，包括a)通過降低或消除滅活干擾素抗病毒效應(yīng)的病毒機(jī)制修飾現(xiàn)存病毒，并任選b)創(chuàng)建減毒突變
82.控制病毒在病毒處理的哺乳動(dòng)物中復(fù)制的方法，包括應(yīng)用抗病毒化合物，所述病毒選自RNA病毒，腺病毒，痘病毒，虹彩病毒，細(xì)小病毒，嗜肝DNA病毒，水痘病毒，β皰疹病毒和γ皰疹病毒。
83.權(quán)利要求82的方法，其中所述抗病毒化合物是干擾素。
84.權(quán)利要求82的方法，其中所述抗病毒制劑選自利巴韋林，無(wú)環(huán)鳥苷，方昔洛韋和更昔洛韋。
85.權(quán)利要求82的方法，其中所述抗病毒制劑是針對(duì)該病毒的中和抗體。
86.應(yīng)用無(wú)沉淀超速離心法純化的克隆副粘病毒。
87.純化至至少2×109PFU/mg蛋白的克隆副粘病毒。
88.權(quán)利要求87的克隆副粘病毒，其中所述副粘病毒在雞卵內(nèi)生長(zhǎng)，基本不含污染雞卵蛋白。
89.權(quán)利要求87的克隆副粘病毒，其中所述副粘病毒顆粒/PFU比率不大于5。
90.權(quán)利要求87的克隆副粘病毒，其中所述副粘病毒顆粒/PFU比率不大于3。
91.權(quán)利要求87的克隆副粘病毒，其中所述副粘病毒顆粒/PFU比率不大于1.2。
92.純化至至少1×1010PFU/mg蛋白的克隆副粘病毒。
93.純化至至少6×1010PFU/mg蛋白的克隆副粘病毒。
94.權(quán)利要求87的副粘病毒，其中所述病毒是細(xì)胞致死性的。
95.權(quán)利要求87的副粘病毒，其中所述副粘病毒是新城疫病毒。
96.權(quán)利要求95的NDV病毒，其中所述NDV是細(xì)胞致死性的。
97.權(quán)利要求95的NDV病毒，其中所述NDV是中等毒力株。
98.純化至至少2×109PFU/mg蛋白的克隆RNA病毒。
99.權(quán)利要求98的RNA病毒，其中所述病毒具有復(fù)制能力。
100.具有復(fù)制能力的細(xì)胞致死性病毒，所述病毒對(duì)干擾素敏感，并純化至至少2×109PFU/mg蛋白水平。
101.權(quán)利要求100的細(xì)胞致死性病毒，其中所述病毒是克隆的。
102.細(xì)胞致死性克隆DNA病毒，所述病毒對(duì)干擾素敏感，并純化至至少2×109PFU/mg蛋白水平。
103.權(quán)利要求102的細(xì)胞致死性DNA病毒，其中所述病毒是痘病毒。
104.權(quán)利要求103的痘病毒，其中所述痘病毒是痘苗病毒，所述痘苗病毒在一個(gè)或多個(gè)病毒基因上具有一個(gè)或多個(gè)突變，所述病毒基因選自K3L，E3L和B18R基因。
105.具有復(fù)制能力的痘苗病毒，含有a)在一個(gè)或多個(gè)K3L、E3L和B18R基因中含有一個(gè)或多個(gè)突變，和b)在編碼胸腺嘧啶脫氧核苷激酶、核苷酸還原酶、痘苗生長(zhǎng)因子、胸苷酸激酶、DNA連接酶、dUTP酶的基因中具有一個(gè)或多個(gè)減毒突變。
106.具有復(fù)制能力的痘苗病毒，所述病毒在選自K3L、E3L和B18R的兩個(gè)或多個(gè)基因中含有一個(gè)或多個(gè)突變。
107.在(2’-5’)A類似物表達(dá)上有修飾的皰疹病毒。
108.在ω-3上有突變的呼腸病毒，并純化至至少2×109PFU/mg蛋白水平。
109.在ω-1和ω-3上有突變的呼腸病毒。
110.純化RNA病毒的方法，包括以下步驟a)產(chǎn)生克隆病毒，以及b)應(yīng)用無(wú)沉淀超速離心法純化所述克隆病毒。
111.權(quán)利要求110所述方法，其中所述RNA病毒具有復(fù)制能力。
112.純化副粘病毒的方法，包括應(yīng)用無(wú)沉淀超速離心法純化所述病毒。
113.權(quán)利要求112的方法，其中在所述超速離心之前的其他純化步驟包括a)噬斑純化產(chǎn)生克隆病毒，b)用克隆病毒接種雞卵，c)孵育雞卵，d)冷藏雞卵，e)從雞卵中收獲尿囊液，以及f)從尿囊液中去除細(xì)胞殘留。
114.權(quán)利要求112的方法，其中所述副粘病毒是NDV。
115.應(yīng)用病毒感染哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，包括將具有復(fù)制能力的干擾素敏感性RNA病毒給予所述哺乳動(dòng)物。
116.權(quán)利要求1的方法，其中所述病毒選自新城疫病毒MK107病毒株，新城疫病毒NJRoakin病毒株，新培斯病毒和皰疹性口炎病毒。
117.應(yīng)用病毒感染哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，包括給予選自新城疫病毒MK107病毒株，新城疫病毒NJRoakin病毒株，新培斯病毒和皰疹性口炎病毒的克隆病毒。
118.權(quán)利要求1或權(quán)利要求28或權(quán)利要求33的方法，其中所述病毒給予超過1劑。
119.權(quán)利要求118的方法，其中首劑是脫敏劑量。
120.權(quán)利要求119的方法，其中所述首劑通過靜脈給藥，隨后的劑量也通過靜脈給藥。
121.權(quán)利要求119的方法，其中所述首劑通過靜脈給藥，隨后的劑量腹膜內(nèi)給藥。
122.權(quán)利要求119的方法，其中所述首劑通過靜脈給藥，隨后的劑量動(dòng)脈內(nèi)給藥。
123.治療哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，包括通過免疫試驗(yàn)方法檢測(cè)所述哺乳動(dòng)物樣本的病毒受體存在量，如果該受體存在，就將能與該受體結(jié)合的具有復(fù)制能力的干擾素敏感性克隆病毒給予所述哺乳動(dòng)物。
124.權(quán)利要求123的方法，這里所述病毒是新培斯病毒，所述受體是高親和力層粘連蛋白受體。
125.權(quán)利要求1或權(quán)利要求28或權(quán)利要求33的方法，其中所述病毒在至少4分鐘內(nèi)給予。
126.治療腹水腫瘤的方法，包括給予具有復(fù)制能力的干擾素敏感性克隆病毒。
127.減輕哺乳動(dòng)物疼痛的方法，包括給予具有復(fù)制能力的干擾素敏感性克隆病毒。
128.權(quán)利要求1的方法，其中所述病毒在至少20分鐘內(nèi)給予。
129.權(quán)利要求1的方法，其中所述病毒劑量至少為5.9×109PFU/m2。
130.權(quán)利要求1的方法，其中所述病毒劑量至少為9.6×1010PFU/m2。
131.權(quán)利要求1的方法，其中所述病毒純化至至少3×109PFU/mg蛋白水平。
132.權(quán)利要求120的方法，其中所述隨后劑量至少為4.8×1010PFU/m2。
133.權(quán)利要求120的方法，其中所述隨后劑量至少為9.6×1010PFU/m2。
134.感染哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，包括給予選自副粘病毒科，正粘病毒科，棒狀病毒科，披膜病毒科，黃病毒科，細(xì)小核糖核酸病毒科，冠狀病毒科，呼腸病毒科，痘病毒科，皰疹病毒科和細(xì)小病毒科的病毒。
135.權(quán)利要求134的方法，其中所述披膜病毒是新培斯病毒。
136.權(quán)利要求1的方法，其中所述RNA病毒是單鏈RNA病毒。
137.治療哺乳動(dòng)物病毒性疾病的方法，包括將治療有效劑量的具有復(fù)制能力的克隆病毒給予所述哺乳動(dòng)物。
138.權(quán)利要求136的方法，其中所述給藥步驟是系統(tǒng)性的。
139.權(quán)利要求137的方法，其中所述疾病由選自乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或人類免疫缺損病毒的病毒導(dǎo)致。
140.權(quán)利要求137的方法，其中所述病毒是副粘病毒。
141.權(quán)利要求137的方法，其中所述RNA病毒選自棒狀病毒，披膜病毒，黃病毒，細(xì)小核糖核酸病毒和冠狀病毒。
142.權(quán)利要求137的方法，其中所述RNA病毒選自DNA病毒，所述DNA病毒選自腺病毒，細(xì)小病毒，乳多空病毒和虹彩病毒，至所述哺乳動(dòng)物。
143.權(quán)利要求1的方法，其中進(jìn)一步包括在給予步驟之前，篩查所述腫瘤中蛋白或編碼蛋白的mRNA，Ras過量表達(dá)，含有活化突變的Ras，其他Ras信號(hào)途徑介導(dǎo)因子過量表達(dá)，不受調(diào)控的酪氨酸激酶受體，所述蛋白選自p68蛋白激酶，C-Myc，C-Myb，ISGF-3，IRF-1，干擾素受體，以及p58。
144.應(yīng)用病毒感染哺乳動(dòng)物腫瘤的方法，包括將具有復(fù)制能力的干擾素敏感性克隆RNA病毒給予所述哺乳動(dòng)物。
145.權(quán)利要求1的方法，其中，給予多療程的病毒。
146.權(quán)利要求1的方法，其中所述病毒在首次給藥后超過2周，再給予。
147.權(quán)利要求1的方法，其中，在給予所述病毒之前、期間或之后給予TNF抑制劑。
148.權(quán)利要求147的方法，其中所述抑制劑是TNF抗體。
149.權(quán)利要求120的方法，其中所述的隨后劑量至少大于首劑2倍。
150.權(quán)利要求1的方法，其中，在給予所述病毒前，給予一種脫敏劑。
151.權(quán)利要求150的方法，其中所述的脫敏劑是TNF或TNF誘導(dǎo)劑。
152.權(quán)利要求151的方法，其中所述TNF誘導(dǎo)劑是IL-2，內(nèi)毒素或另一種病毒。
153.權(quán)利要求59的方法，其中所述化療藥物是鉑配位化合物。
154.權(quán)利要求153的方法，其中所述鉑配位化合物是卡鉑。
155.權(quán)利要求61的方法，其中所述的免疫抑制劑是皮質(zhì)類固醇。
156.權(quán)利要求155的方法，其中所述皮質(zhì)類固醇是地塞米松。
全文摘要
本發(fā)明涉及可以復(fù)制并可在干擾素介導(dǎo)的抗病毒應(yīng)答中殺傷腫瘤細(xì)胞的病毒，以及這些病毒在治療腫瘤性疾病中的應(yīng)用，所述腫瘤性疾病包括癌癥和巨大腫瘤。在這一點(diǎn)上，RNA和DNA病毒均可應(yīng)用。本發(fā)明還涉及這些病毒的篩選、設(shè)計(jì)、純化和在腫瘤治療方面的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K45/00GK1477964SQ00809101
公開日2004年2月25日 申請(qǐng)日期2000年4月17日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月15日
發(fā)明者M·S·羅伯茨, M S 羅伯茨, R·M·羅倫斯, 羅倫斯, W·S·格雷尼, 格雷尼, H·拉賓, 馮波爾斯特, R·W·馮波爾斯特 申請(qǐng)人:病毒防御公司