專利名稱：綴合物及其制備方法和用于跨生物膜轉(zhuǎn)運分子的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供綴合物、它們的制備方法和這些綴合物用于跨生物膜轉(zhuǎn)運低分子量化合物與大分子的用途，特別是轉(zhuǎn)運分子進入細胞。本發(fā)明還提供藥物與診斷助劑和試驗試劑盒，其中含有或使用這些綴合物。
靶在細胞內(nèi)的分子的治療應(yīng)用的限制性因素經(jīng)常是它們的細胞攝取是不理想的，細胞內(nèi)分布是不適宜的。典型的實例是諸如核酸等大分子，它們以序列特異性方式與細胞DNA或RNA結(jié)合，因而抑制基因表達。反義寡核苷酸是短的單鏈核酸，它們經(jīng)由Watson-Crick堿基對與互補mRNA結(jié)合，抑制后者轉(zhuǎn)譯為相應(yīng)的蛋白質(zhì)。形成三股螺旋的寡核苷酸經(jīng)由所謂的“Hoogsteen堿基配對”與DNA雙螺旋深溝結(jié)合，形成三螺旋，因而以序列特異性方式抑制基因轉(zhuǎn)錄。其他細胞內(nèi)作用性寡核苷酸例如所謂的“圈套(decoy)”寡核苷酸，它們模擬轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合區(qū)域。通過圈套寡核苷酸的處理，能夠以序列特異性方式攔截某些轉(zhuǎn)錄因子，因而抑制轉(zhuǎn)錄的活化作用。另一組細胞內(nèi)作用性寡核苷酸是chimeraplast，用于定向基因校正(Cole-Strauss等《科學(xué)》273(1996)1386-1389)。關(guān)于這種基因校正，chimeraplast寡核苷酸攝取進入細胞也是必需的。其他細胞內(nèi)作用性核酸的實例是與細胞酶、特別是端粒酶發(fā)生相互作用的那些(Norton等《天然生物技術(shù)》(1996)14，615)。在基因療法的意義上，另一類核酸、優(yōu)選為雙鏈DNA，能夠編碼某些細胞內(nèi)表達的蛋白質(zhì)。
例如，寡核苷酸體外攝取進入細胞是相對低效的過程，例如簡單地向細胞培養(yǎng)基中加入寡核苷酸，這是因為實際上僅有一小部分所加入的寡核苷酸被攝入細胞。攝取過程花費很多小時，在多數(shù)情況下，僅在8至16小時后達到平臺期。推定寡核苷酸是在胞飲作用樣過程中被攝入的。不過，經(jīng)由胞飲作用攝取所面臨的一個普遍問題是大比例的寡核苷酸不是游離于細胞質(zhì)中，而是被包封在某些細胞結(jié)構(gòu)中，即溶酶體和內(nèi)體。在熒光標記的寡核苷酸的情況下，通過熒光顯微法的確能夠觀察到這種定位分布。由于這種囊性定位作用，實際上可用于與mRNA雜交的游離寡核苷酸濃度大為減少。而且，根據(jù)細胞類型和現(xiàn)有條件，首先僅有某一部分的細胞攝入寡核苷酸。因此，關(guān)于反義寡核苷酸的有效利用，普遍采用與透入增強劑，例如陽離子脂質(zhì)的混合物(Bennett等《分子藥理學(xué)》41(1992)1023)。
本發(fā)明的目的是提高分子、特別是大分子的細胞攝取，例如寡核苷酸。
寡核苷酸細胞攝取的檢查普遍是利用放射性標記或熒光標記的寡核苷酸進行的。寡核苷酸的熒光標記例如是通過寡核苷酸的氨基官能與異硫氰酸熒光素(FITC)的反應(yīng)進行的。熒光素例如可以經(jīng)由商業(yè)上可得到的熒光素類固相載體而引入到寡核苷酸的3’末端，或者經(jīng)由商業(yè)上可得到的熒光素亞磷酸化試劑而引入到5’末端。在所有情況下，由于羧酸官能，與寡核苷酸結(jié)合的熒光素都是帶負電的強熒光性結(jié)構(gòu)單元。 與熒光素相反，熒光素二乙酸酯(fluorescein diacetate，F(xiàn)DA)是一種中性活體染劑，它僅在兩個酯基的除去和內(nèi)酯環(huán)的打開之后才轉(zhuǎn)化為熒光性熒光素，但是內(nèi)酯形式不是熒光性的。
已知FDA(以下也稱“F3”)作為一種中性、非熒光性分子，經(jīng)由被動擴散而被活體細胞攝入，被酯酶細胞內(nèi)裂解得到熒光性熒光素(Breeuwer等《應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)》(1995)61，1614；Maeda等《細胞結(jié)構(gòu)與功能》(1982)7，177)。迄今，所述唯一FDA衍生物是含有胺反應(yīng)性基團的那些，例如異硫氰酸酯；這些FDA衍生物用于染色細胞內(nèi)蛋白質(zhì)或細胞組分。FDA與其他分子的綴合物迄今尚未被描述過；相應(yīng)地，F(xiàn)DA-標記的寡核苷酸(FDA與寡核苷酸的綴合物)同樣迄今尚未被描述過。
在細胞質(zhì)中，F(xiàn)DA被酯酶裂解；相應(yīng)地，有可能通過寡核苷酸的FDA標記測定“游離”寡核苷酸的比例，也就是有多少寡核苷酸存在于細胞質(zhì)中——可用于雜交——關(guān)于存在于囊泡中的寡核苷酸(“被捕獲的”寡核苷酸)——相應(yīng)地不可用于雜交的寡核苷酸。由于寡核苷酸中的負電荷總數(shù)高和FDA-標記與熒光素-標記的寡核苷酸的區(qū)別僅在于一個凈電荷這一事實，預(yù)期FDA-標記與熒光素-標記的寡核苷酸將表現(xiàn)非常相似的細胞攝取和分布。
不過，已經(jīng)驚人地發(fā)現(xiàn)FDA-標記與熒光素-標記的寡核苷酸關(guān)于攝取進入細胞是大不相同的，也就是關(guān)于寡核苷酸攝取的持續(xù)時間和效率，另外關(guān)于已被攝入的寡核苷酸的細胞定位作用。FDA-標記的寡核苷酸比相應(yīng)的熒光素-標記的寡核苷酸更加迅速地被細胞攝入。放射性標記與熒光素標記的寡核苷酸的攝取要求若干小時，而FDA-標記的寡核苷酸在簡單的例如與人細胞培養(yǎng)之后能夠僅在五分鐘之后在細胞內(nèi)檢測到。也驚人的是，F(xiàn)DA-標記的寡核苷酸事實上被攝入任何細胞(＞90％細胞)，而迄今關(guān)于轉(zhuǎn)移寡核苷酸或多核苷酸進入細胞所述方法中的攝取率普遍偏低；在后者情況下，經(jīng)常僅有約30至60％的細胞荷載寡核苷酸。FDA-標記的寡核苷酸的細胞內(nèi)分布更加均勻，這也是有利的。這種更均勻的分布表明寡核苷酸不是——如上所述——主要被包封在囊泡(例如內(nèi)體、溶酶體)內(nèi)，而是分布在整個細胞中——也就是在細胞溶質(zhì)和細胞核中；這是存在大部分“游離”寡核苷酸的象征。僅有這些“游離”寡核苷酸可用于與靶(靶分子、靶核酸)結(jié)合或者用作活性化合物。另一個優(yōu)點是當使用FDA-標記的寡核苷酸時，觀察到?jīng)]有細胞損害；相反，脂陽離子透入增強劑的使用經(jīng)常導(dǎo)致細胞膜的損害。作為這些意外性質(zhì)的結(jié)果，F(xiàn)DA-標記的寡核苷酸與迄今關(guān)于向細胞內(nèi)引入寡核苷酸或多核苷酸所述方法相比，具有決定性的優(yōu)點，它們能夠被更有效地引入細胞，在那里它們的可利用性也更好。有鑒于此，F(xiàn)DA-標記的寡核苷酸的生物活性大為提高。因為提高了生物活性，所用的寡核苷酸更少。有鑒于此和FDA-標記的寡核苷酸被更有效地攝入細胞——關(guān)于量和時間——這一事實，減少了(毒)副作用。
已經(jīng)驚人地發(fā)現(xiàn)這些有利性質(zhì)并不限于FDA-標記的寡核苷酸，事實上借助FDA-標記——也就是偶聯(lián)所要轉(zhuǎn)運的分子與FDA或綴合之(“FDA綴合物”)，任何分子都能夠被有效引入細胞或者跨生物膜轉(zhuǎn)運。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這種理論并不限于FDA綴合物，也適用于某一化學(xué)結(jié)構(gòu)的所有芳基酯綴合物。因而，本發(fā)明是新穎的關(guān)于跨生物膜轉(zhuǎn)運分子的理論。由于這些化合物(除一例外)迄今尚未在現(xiàn)有技術(shù)中描述過，相應(yīng)的綴合物——所要轉(zhuǎn)運的分子與某一化學(xué)結(jié)構(gòu)的芳基酯偶聯(lián)或綴合——同樣構(gòu)成本發(fā)明主題的一部分。這些綴合物不能用已知方法制備；本發(fā)明因此還提供制備這些綴合物的方法。
作為寡核苷酸前體藥物而被提出的生物可逆性O(shè)-?；蓟Y合物是已知的(Iyer等《生物有機與醫(yī)藥化學(xué)快報》7(1997)871-876)。這些化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)——在芳基原子團是芳族6-元環(huán)的情況下——類似于根據(jù)本發(fā)明的綴合物。不過，在生物可逆性O(shè)-酰基芳基綴合物中，酯的水解導(dǎo)致芳基原子團與寡核苷酸的磷酸三酯之間的鍵的去穩(wěn)定作用，以致生物可逆性O(shè)-?；蓟Y合物裂解為它的組分，即游離寡核苷酸和O-?；蓟訄F。這種前體藥物概念適合屏蔽核苷酸間磷酸酯橋的負電荷，因而促進寡核苷酸攝取進入細胞。不過，與根據(jù)本發(fā)明的綴合物相反，關(guān)于這些前體藥物已經(jīng)發(fā)現(xiàn)寡核苷酸攝取進入細胞沒有加速，寡核苷酸的細胞內(nèi)分布沒有改變。此外，寡核苷酸攝取進入其他生物體尚未見諸報道。相反，在根據(jù)本發(fā)明的綴合物中，芳基原子團與寡核苷酸之間的共價鍵在攝取進入細胞期間得以保留；如果芳族單元只在酯的裂解之后是熒光性的，例如在FDA的情況下，那么芳基原子團與寡核苷酸之間的共價鍵的保留可以通過熒光顯微法輕易測定。
本發(fā)明提供一種綴合物，它包含至少一個所要轉(zhuǎn)運的分子和至少一個式I芳基原子團，
其中芳基是這樣的基團，它含有至少一個具有芳族特征的環(huán)；X是O或N；優(yōu)選地X＝O；Y是O、S或NH-R2；優(yōu)選地Y＝O；R1是取代或未取代的C1-C23烷基原子團，它可以是直鏈或支鏈的，并且可以含有雙鍵和/或叁鍵；例如芳基烷基原子團；R2是取代或未取代的C1-C18烷基原子團，它可以是直鏈或支鏈的，并且可以含有雙鍵和/或叁鍵；n是大于或等于1的整數(shù)，其中該芳基原子團與該所要轉(zhuǎn)運的分子是直接經(jīng)由化學(xué)鍵或間接經(jīng)由化學(xué)基團連接的，其中如果通過該所要轉(zhuǎn)運的分子的核苷酸間磷酸二酯鍵連接，那么該化學(xué)基團不是CH2-S基團。
所要轉(zhuǎn)運的分子可以是任何分子。所要轉(zhuǎn)運的分子優(yōu)選地具有≥350道爾頓的分子量。本發(fā)明的一種實施方式涉及這樣的綴合物，其中所要轉(zhuǎn)運的分子是一種大分子，例如分子量≥500道爾頓，優(yōu)選地＞1000道爾頓，特別優(yōu)選地＞2000道爾頓或以上。
所要轉(zhuǎn)運的分子也可以是低分子量化合物，例如分子量＜500道爾頓，優(yōu)選地具有350至500道爾頓的分子量。低分子量化合物可以是一種單核苷酸。
所要轉(zhuǎn)運的分子可以屬于不同的化學(xué)物質(zhì)種類；例如，它可以是一種生物聚合物，例如多核苷酸、優(yōu)選為寡核苷酸，多肽、優(yōu)選為肽或蛋白質(zhì)，包含三個芳環(huán)咪唑、吡咯和羥基吡咯的聚酰胺或肽-核酸(PNA)(Kielkopf等《科學(xué)》282，111-115(1998))，或多糖、優(yōu)選為寡糖，或者所述化合物的衍生物。所要轉(zhuǎn)運的分子可以是一種肽模擬物。
多核苷酸、寡核苷酸和單核苷酸是天然存在的核酸或其已知的衍生物。衍生物被認為尤其表示從綴合物或所要轉(zhuǎn)運的分子衍生的鹽，特別是其生理學(xué)上可接受的鹽，還例如是經(jīng)過修飾或穩(wěn)定化的核酸。
所要轉(zhuǎn)運的分子可以是如下物質(zhì)的抑制劑轉(zhuǎn)錄因子，例如NF-κB、c-fos或c-jun，細胞周期蛋白質(zhì)，例如細胞周期蛋白D，激酶，例如c-Src-、酪氨酸或MAP激酶，細胞內(nèi)離子通道，親免素，例如FK506結(jié)合蛋白，脯氨酰-4-羥基化酶，拓撲異構(gòu)酶，病毒蛋白酶，多藥耐受蛋白，磷酸酶，例如蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶。
所要轉(zhuǎn)運的分子可以與一個或多個芳基原子團綴合，例如二、三、四、五、六、七、八、九、十、十五、二十個或以上的芳基原子團。
芳基原子團(“芳基原子團”特別是式I芳基原子團和/或式II芳基原子團)可以與所要轉(zhuǎn)運的分子連接一次或一次以上，其中的鍵可以定位于芳基原子團的不同位置。如果大量芳基原子團與所要轉(zhuǎn)運的分子連接，那么它們可以是相同或不同的。
芳基原子團含有芳基(在式I和II中稱為“芳基”)；芳基可以包含一個或多個環(huán)，其中至少一個環(huán)具有芳族特征。芳基還可以含有雜環(huán)，雜環(huán)可以具有或沒有芳族特征。芳基例如含有1至8個或以上的環(huán)(也稱“環(huán)系”)，優(yōu)選為1、2、3、4、5、6、7或8個環(huán)。各環(huán)具有3至7個環(huán)原子，優(yōu)選為5至6個環(huán)原子。環(huán)系的實例是苯基環(huán)、吡啶基環(huán)、嘧啶基環(huán)、吡咯基環(huán)、呋喃基環(huán)、苯硫基(thiophenyl)環(huán)、5-元內(nèi)酯、6-元內(nèi)酯、螺甾內(nèi)酯、苯醌、環(huán)己二烯基環(huán)和環(huán)己烯基環(huán)。這些環(huán)系、芳基或芳基的各環(huán)可以是單或多取代的。優(yōu)選地，芳基的至少一個環(huán)攜帶?；訄F。
?；缈梢跃哂惺紽1’、F2’、F3’、F4’、F6’、F7’、F8’、F9’、F10’、F11’之一。這些結(jié)構(gòu)式如

圖1所示。
芳基原子團可以直接或經(jīng)由化學(xué)基團與所要轉(zhuǎn)運的分子連接。本發(fā)明提供一種綴合物，其中該化學(xué)基團與該芳基原子團一起具有式II
其中芳基、X、Y和R1是如上所定義的，R3是該化學(xué)基團，R3例如是-C(＝O)基團或-NH-C(＝S)基團。
式II芳基原子團的實例是式F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8、F9、F10和F11的芳基原子團；這些結(jié)構(gòu)式如圖2a和圖2b所示。
在確切的實施方式中，所要轉(zhuǎn)運的分子是一種寡核苷酸。寡核苷酸例如可以完全由如下核苷酸構(gòu)成磷酸腺苷、磷酸鳥苷、磷酸肌苷、磷酸胞苷、磷酸尿苷和磷酸胸苷。在本發(fā)明的其他實施方式中，如果適當?shù)脑?，寡核苷酸可以含有一種或多種修飾，例如化學(xué)修飾。寡核苷酸可以具有大量相同和/或不同的修飾。
化學(xué)修飾的實例是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如參見E.Uhlmann和A.Peyman《化學(xué)評論》90(1990)543；“關(guān)于寡核苷酸與類似物的協(xié)議”《合成與性質(zhì)和合成與分析技術(shù)》S.Agrawal，Ed.，HumanaPress，Totowa，USA 1993；J.Hunziker和C.Leumann“核酸類似物合成與性質(zhì)”《現(xiàn)代合成方法》(Ed.Beat Ernst和C.Leumann)，Verlag Helvetica Chimica Acata，Basle，pp.331-417。
寡核苷酸的化學(xué)修飾例如可以包含a)磷酸二酯橋例如完全或部分被硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯、NR1R1’-氨基磷酸酯、硼烷磷酸酯、磷酸(C1-C21)-O-烷基酯、磷酸[(C6-C12)芳基-(C1-C21)-O-烷基]酯、(C1-C8)烷基膦酸酯和/或(C6-C12)芳基膦酸酯橋取代，其中R1和R1’彼此獨立地是氫、(C1-C18)烷基、(C6-C20)芳基、(C6-C14)芳基-(C1-C8)烷基，優(yōu)選為氫、(C1-C8)烷基和/或甲氧基乙基，特別優(yōu)選為氫、(C1-C4)烷基和/或甲氧基乙基，或者R1和R1’與攜帶它們的氮一起構(gòu)成5-至6-元雜環(huán)，該雜環(huán)可以另外含有選自O(shè)、S和N的雜原子；b)3’-和/或5’-磷酸二酯橋完全或部分被“脫磷酸”橋取代(例如參見Uhlmann，E.和Peyman，A.《分子生物學(xué)方法》Vol.20“關(guān)于寡核苷酸與類似物的協(xié)議”S.Agrawal，Ed.，Humana Press，Totowa 1993，16章，355ff.)，例如被formacetal、3’-thioformacetal、甲基羥胺、肟、亞甲基二甲基亞肼基、二亞甲基砜和/或甲硅烷基取代；c)磷酸糖主鏈例如完全或部分被“嗎啉”寡聚物(例如參見E.P.Stirchak等《核酸研究》17(1989)6129；J.Summerton和D.Weller《反義與核酸藥物開發(fā)》7(1997)187-195)和/或聚酰胺核酸(PNA)(例如參見P.E.Nielsen等《生物綴合物化學(xué)》5(1994)3)和/或膦酸一酯核酸(PHONA)(例如參見Peyman等《應(yīng)用化學(xué)國際英文版》35(1996)2632-2638)取代；d)β-D-2’-脫氧核糖單元例如完全和/或部分被如下取代α-D-2’-脫氧核糖、L-2’-脫氧核糖、2’-F-2’-脫氧核糖、2’-O-(C1-C6)烷基-核糖、2’-O-(C2-C6)烯基-核糖、2’-[O-(C1-C6)烷基-O-(C1-C6)烷基]-核糖、2’-NH2-2’-脫氧核糖、β-D-木呋喃糖、α-阿拉伯呋喃糖、2，4-二脫氧-β-D-赤型-吡喃己糖、構(gòu)象限制的糖類似物，例如LNA(鎖定核酸；Singh等《化學(xué)通報》4(1998)455；Singh等《化學(xué)通報》12(1998)1247)和碳環(huán)的(例如參見Froehler《美國化學(xué)會志》114(1992)8320)和/或開鏈的糖類似物(例如參見Vandendriessche等《四面體》49(1993)7223)和/或二環(huán)糖類似物(例如參見M.Tarkov等《瑞士化學(xué)學(xué)報》76(1993)481)；e)天然核苷堿基例如被如下修飾和/或完全或部分取代5-(羥甲基)尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、假尿嘧啶、假異胞嘧啶、二氫尿嘧啶、5-(C1-C6)烷基-尿嘧啶、5-(C2-C6)烯基-尿嘧啶、5-(C2-C6)炔基-尿嘧啶、5-(C1-C6)烷基-胞嘧啶、5-(C2-C6)烯基-胞嘧啶、5-(C2-C6)炔基-胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴胞嘧啶或7-去氮雜-7-取代的嘌呤。
寡核苷酸的化學(xué)修飾進一步涵蓋寡核苷酸與一個或多個其他分子連接，這些分子對寡核苷酸的特定性質(zhì)具有有利的影響，例如對核酸酶的穩(wěn)定性、對靶序列的親合性和藥動學(xué)，例如在經(jīng)過修飾的寡核苷酸與靶序列雜交期間與靶序列結(jié)合和/或交聯(lián)。這類其他分子的實例是聚賴氨酸，嵌入劑、例如芘、吖啶、吩嗪或菲啶，熒光化合物、例如熒光素，交聯(lián)劑、例如補骨脂素或疊氮基硫酸原黃素(azidoproflavine)，親脂性分子、例如(C12-C20)烷基、優(yōu)選為(C12-C20)烷基，脂質(zhì)、例如1，2-二-十六烷基-外-甘油(1，2-dihexadecyl-rac-glycerol)，類固醇、例如膽固醇或睪酮，維生素、例如維生素E，多或寡乙二醇，(C12-C18)烷基磷酸二酯、優(yōu)選為(C14-C18)烷基磷酸二酯，和-O-CH2-CH(OH)-O-(C12-C18)烷基、優(yōu)選為-O-CH2-CH(OH)-O-(C12-C16)烷基。這些其他分子可以在5’-和/或3’-末端和/或序列內(nèi)例如與核苷堿基綴合。用于制備這些經(jīng)過修飾的寡核苷酸的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如參見Uhlmann，E.和Peyman，A.《化學(xué)評論》90(1990)543和/或M.Manoharan《反義研究與應(yīng)用》Crooke和Lebleu，Eds.，CRC Press，Boca Raton，1993，17章，p.303ff.和/或EP-A 0 552766。
在本發(fā)明的其他具體實施方式
中，寡核苷酸可以在3’-和/或5’-末端具有3’-3’和/或5’-5’反轉(zhuǎn)。這種類型的化學(xué)修飾是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如參見M.Koga等《有機化學(xué)雜志》56(1991)3757。
在由一個或多個寡核苷酸和一個或多個芳基原子團組成的綴合物、優(yōu)選為式I或II的綴合物中，芳基原子團與寡核苷酸的綴合例如可以發(fā)生在寡核苷酸的5’-末端(A)、3’-末端(F)、雜環(huán)堿基(E和G)、糖(C)或核苷間橋(B)。不過，綴合例如還可以經(jīng)由非核苷酸構(gòu)件發(fā)生，例如在(D)的情況下。這些實例如圖3所示。
所述修飾當然還可以相應(yīng)適用于相對長的多核苷酸，如果適合的話，還適用于一-或二-核苷酸或-核苷。
寡核苷酸例如長8至50個核苷酸，優(yōu)選為10-20個核苷酸。不過，具有更長寡或多核苷酸的寡核苷酸、例如長50至10,000個核苷酸、優(yōu)選為100至1000個核苷酸也是適合的，如果適當?shù)脑?，它們也可以呈雙鏈形式。
寡核苷酸可以具有任意序列。寡核苷酸的序列根據(jù)所選擇的靶加以選擇或設(shè)計，也就是說，如果靶是核酸，那么根據(jù)它的序列，或者如果靶是蛋白質(zhì)，那么根據(jù)編碼該靶蛋白質(zhì)的核酸序列。例如，如果靶是病毒，例如CMV、HIV、HSV-1、HSV-2、流感病毒、VSV、乙肝病毒或乳頭瘤病毒，那么寡核苷酸例如可以具有下列序列之一a)抗CMVSEQ ID NO.125′-G C G T T T G C T C T T C T T C T T G C Gb)抗HIV，例如SEQ ID NO.135′-A C A C C C A A T T C T G A A A A T G G-3′或SEQ ID NO.145′-A G G T C C C T G T T C G G G C G C C A-3′或c)抗HSV-1，例如SEQ ID NO.155′-G C G G G G C T C C A T G G G G G T C G-3′靶例如可以是參與癌的形成或負責癌的生長的蛋白質(zhì)。這類靶的實例是1)核癌蛋白，例如c-myc、N-myc、c-myb、c-fos、c-fos/jun、PCNA、p120；2)胞質(zhì)/膜結(jié)合癌蛋白，例如EJ-ras、c-Ha-ras、N-ras、rrg、bcl-2、cdc-2、c-raf-1、c-mos、c-src、c-abl、c-ets；3)細胞受體，例如EGF受體、Her-2、c-erbA、VEGF受體(KDR-1)、視黃醛受體、蛋白激酶的調(diào)節(jié)性亞單位、c-fms、Tie-2、c-raf-1激酶、PKC-α、蛋白激酶A(R1α)；4)細胞因子、生長因子、細胞外基質(zhì)，例如CSF-1、IL-6、IL-1a、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、bFGF、VEGF、成髓細胞素、纖連蛋白。
定向于這些靶的寡核苷酸例如可以具有下列堿基序列a)抗c-Ha-ras，例如SEQ ID NO.165′-C A G C T G C A A C C C A G C-3′或SEQ ID NO.175′-T A T T C C G T C A T-3′或SEQ ID NO.185′-T T C C G T C A T C G C T C C T C A G G G G-3′b)bFGF，例如SEQ ID NO.195′-G G C T G C C A T G G T C C C-3′c)c-myc，例如
SEQ ID NO.205′-G G C T G C T G G A G C G G G G C A C A C-3′SEQ ID NO.215′-A A C G T T G A G G G G C A T-3′d)c-myb，例如SEQ ID NO.225′-G T G C C G G G G T C T T C G G G C-3′e)c-fos，例如SEQ ID NO.235′-C G A G A A C A T C A T C G T G G-3′SEQ ID NO.245′-G G A G A A C A T C A T G G T C G A A A G-3′SEQ ID NO.255′-C C C G A G A A C A T C A T G G T C G A A G-3′SEQ ID NO.265′-G G G G A A A G C C C G G C A A G G G G-3′f)p120，例如SEQ ID NO.275′-C A C C C G C C T T G G C C T C C C A C-3′g)EGF受體，例如SEQ ID NO.285′-G G G A C T C C G G C G C A G C G C-3′SEQ ID NO.295′-G G C A A A C T T T C T T T T C C T C C-3′h)p53腫瘤抑制基因，例如SEQ ID NO.305′-G G G A A G G A G G A G G A T G A G G-3′SEQ ID NO.315′-G G C A G T C A T C C A G C T T C G G A G-3′i)bcl-2SEQ ID NO.325′-TCTCCCAGCGTGCGCCATk)VEGFSEQ ID NO.335′-G C G C T G A T A G A C A T C C A T GSEQ ID NO.343′-CCAGCCCGGAGG-5′，5′-GGAGGCCCGACC-3′SEQ ID NO.353′-CGGAGGCTTTGG-5′，5′-GGTTTCGGAGGC-3′；SEQ ID NO.363′-GATGGAGGTGGT-5′，5′-TGGTGGAGGTAG-3′SEQ ID NO.373′-GGAGGTGGTACG-5′，5′-GCATGGTGGAGG-3′SEQ ID NO.383′-GGTGGTACGGTT-5′，5′-TTGGCATGGTGG-3′SEQ ID NO.393′-CACCAGGGTCCG-5′，5′-GCCTGGGACCAC-3′SEQ ID NO.403′-CCAGGGTCCGAC-5′，5′-CAGCCTGGGACC-3′SEQ ID NO.413′-AGGGTCCGACGT-5′，5′-TGCAGCCTGGGA-3′
SEQ ID NO.423′-GGGTCCGACGTG-5′，5′-GTGCAGCCTGGG-3′SEQ ID NO.433′-GGTCCGACGTGG-5′，5′-GGTGCAGCCTGG-3′SEQ ID NO.443′-CCGACGTGGGTA-5′，5′-ATGGGTGCAGCC-3′SEQ ID NO.453′-GTAGAAGTTCGG-5′，5′-GGCTTGAAGATG-3′SEQ ID NO.463′-ACGCCCCCGACG-5′，5′-GCAGCCCCCGCA-3′或SEQ ID NO.473′-CCCCCGACGACG-5′，5′-GCAGCAGCCCCC-3′l)c-raf激酶SEQ ID NO.48 5′-TCCCGCCTGTGACATGCATTm)PKC-αSEQ ID NO.49 5′-GTTCTCGCTGGTGAGTTTCAn)蛋白激酶ASEQ ID NO.50 5′-GCGTGCCTCCTCACTGGC如果靶是整聯(lián)蛋白或細胞-細胞粘著受體，例如VLA-4、VLA-2、ICAM、VCAM或ELAM，那么寡核苷酸例如可以具有下列序列之一a)VLA-4，例如SEQ ID NO.515′-G C A G T A A G C A T C C A T A T C-3′或b)ICAM-1，例如SEQ ID NO.525′-G C C C A A G C T G G C A T C C G T C ASEQ ID NO.535′-C C C C C A C C A C T T C C C C T C T C-3′SEQ ID NO.545′-C T C C C C C A C C A C T T C C C C T C-3′SEQ ID NO.555′-G C T G G G A G C C A T A G C G A G G-3′c)ELAM-1，例如SEQ ID NO.565′-A C T G C T G C C T C T T G T C T C A G G-3′SEQ ID NO.575′-C A A T C A A T G A C T T C A A G A G T T C-3′d)整聯(lián)蛋白α(V)SEQ ID NO.585′-GCGGCGGAAAAGCCATCG如果靶是負責增殖或遷移或參與這些/這種過程的蛋白質(zhì)，例如1)核反式激活蛋白和細胞周期蛋白，例如c-myc、c-myb、c-fos、c-fos/jun、細胞周期蛋白和cdc2激酶；
2)促分裂原或生長因子，例如PDGF、bFGF、VEGF、EGF、HB-EGF和TGF-β；3)細胞受體，例如bFGF受體、EGF受體和PDGF受體；那么寡核苷酸例如可以具有下列堿基序列之一a)c-mybSEQ ID NO.595′-G T G T C G G G G T C T C C G G G C-3′b)c-mycSEQ ID NO.605′-C A C G T T G A G G G G C A T-3′c)cdc2激酶SEQ ID NO.615′-G T C T T C C A T A G T T A C T C A-3′d)PCNA(大鼠增殖性細胞核抗原)SEQ ID NO.625′-G A T C A G G C G T G C C T C A A A-3′.
如果靶例如是腺苷A1受體、腺苷A3受體、緩激肽受體或IL-13，那么例如可能是堿基序列SEQ ID NO.635′-GATGGAGGGCGGCATGGCGGG制備了下列寡核苷酸(5’--＞3’)ON15′-d(G*C G A C*G C*C A T*G A C*G*G)SEQ ID NO.1ON25′-d(C*G A C*G C*C A T*G*A*C) SEQ ID NO.2ON35′-d(A*T*G A C*G G A A*T*T*C) SEQ ID NO.3ON45′-d(T A T T C C G T C A T)SEQ ID NO.4ON55′-(dA)20SEQ ID NO.5ON65′-(dA)50SEQ ID NO.6ON75′-(dA)80SEQ ID NO.7ON85′-T*T*C C*A T*G G*T G*G*CSEQ ID NO.8ON95′-T*T*C A*C T*G T*G G*G*CSEQ ID NO.9ON105′-T*G*G C*G C*C G*G G*C*C SEQ ID NO.10ON115′-T*G*C C*G G*C C*G G*G*C SEQ ID NO.11其中*表示磷酸二酯橋被硫代磷酸酯核苷間橋取代的位置。
將這些序列轉(zhuǎn)化為下列綴合物(CO)CO_1F3-Li1-ON1CO_2F0-Li1-ON1CO_3F3-Li1-ON2CO_4F0-Li1-ON2CO_5F3-Li1-ON3CO_6F9-Li1-ON3CO_7F2-Li-1ON3CO_8F0-Li1-ON3CO_9F3-Li1-ON3-若丹明CO_10 F9-Li1-ON3-若丹明CO_11 F6-Li1-ON3-若丹明CO_12 F0-Li1-ON3-若丹明CO_13 F3-Li1-ON4CO_14 F3-Li1-ON5CO_15 F3-Li1-ON6CO_16 F3-Li1-ON7CO_17 F3-Li1-ON8CO_18 F3-Li1-ON9CO_19 F3-Li1-ON10CO_20 F3-Li1-ON11CO_21 F7-Li1-ON3其中“F1至F11”是式F1至F11的芳基原子團(例如圖2)；“Li1”是6-氨基己基磷酸酯原子團，它與寡核苷酸的5’-末端連接(例如見附圖4)；“ON1至ON11”是所述序列SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.11的寡核苷酸；“若丹明”是寡核苷酸3’-末端的若丹明標記，除了熒光素以外，它也是可檢測的。
本發(fā)明還提供用于制備根據(jù)本發(fā)明的綴合物的方法。本發(fā)明涉及用于制備綴合物的方法，該綴合物包含所要轉(zhuǎn)運的分子和至少一個芳基原子團，優(yōu)選為式I或II，其中a)制備所要轉(zhuǎn)運的分子，它在將與芳基原子團連接的位置含有反應(yīng)性官能團；b)制備芳基原子團；和c)使該所要轉(zhuǎn)運的分子與該芳基原子團反應(yīng)，得到綴合物。
反應(yīng)性官能團優(yōu)選為氨基、巰基、氯乙酰基、異氰酸酯基、異硫氰酸酯基、羧酸基、N-羥基琥珀酰亞胺基或碳酰氯基。所要轉(zhuǎn)運的分子與芳基原子團的反應(yīng)在pH≤7.5下進行；優(yōu)選為pH≤7.3，特別優(yōu)選為pH≤7.0或更低的pH，例如pH＜7，優(yōu)選為pH≤6.5。在這些偶聯(lián)反應(yīng)中，所有其他反應(yīng)性基團必須在反應(yīng)之前用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的保護基團加以保護。在該方法的特別優(yōu)選的實施方式中，所要轉(zhuǎn)運的分子是多核苷酸、寡核苷酸或單核苷酸。
制備方法在第一步中包括所要轉(zhuǎn)運的分子的制備。在本文中，本發(fā)明還涉及制備寡核苷酸的方法。寡核苷酸可以借助各種已知的化學(xué)方法加以制備，例如參見Eckstein，F(xiàn).(1991)《寡核苷酸與類似物實用方法》IRL Press，Oxford。如果適當?shù)脑?，寡核苷酸也可以用包括一個或多個酶步驟的方法加以制備。寡核苷酸綴合物的制備原則上如文獻所述(J.Goodchild《生物綴合物化學(xué)》1(1990)165；S.Beaucage和R.Iyer《四面體》49(1993)1925；S.Agrawal《分子生物學(xué)方法》Vol.26“關(guān)于寡核苷酸綴合物的方法(Protocols foroligonucleotide conjugates)”(1994)Humana Press)。
不過，在合成根據(jù)式I的寡核苷酸綴合物時，必須注意它們可能在堿性介質(zhì)中分解這一事實。因此例如不可能利用習(xí)慣方法在寡核苷酸合成儀中合成FDA-標記的寡核苷酸，因為FDA基團的酯基將在氨處理期間水解，而從載體上裂解寡核苷酸和裂解雜環(huán)堿的氨基保護基團都需要氨的處理。因而，最初所制備的寡核苷酸是脫保護形式的前體，在最后一步中與式I基團融合(圖5)。寡核苷酸前體具有反應(yīng)性或可活化的官能，隨后通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，將該官能用含有根據(jù)本發(fā)明的式I基團的試劑衍生。適合的反應(yīng)性或可活化的官能例如氨基、巰基、氯乙酰基、異(硫)氰酸酯和羧酸官能。借助商業(yè)上可得到的試劑，向寡核苷酸引入所謂的氨基連接子是特別容易的。然后使帶有氨基連接子的寡核苷酸例如與含有式I基團的反應(yīng)性試劑反應(yīng)。這樣的反應(yīng)性試劑例如是相應(yīng)的異硫氰酸酯。式I基團在這種情況下經(jīng)由硫脲官能連接(附圖4)。其他反應(yīng)性試劑是例如碳酰氯。溫和的反應(yīng)性試劑是例如相應(yīng)羧酸的N-羥基琥珀酰亞胺。可活化的試劑是例如相應(yīng)的羧酸，它們能夠與肽偶聯(lián)試劑偶聯(lián)，例如HBTU、TBTU或TOTU。在這種情況下，式I基團經(jīng)由酰胺官能連接。原則上，根據(jù)本發(fā)明的式I基團可以被引入寡核苷酸的任何位置。優(yōu)選為圖3所示位置。
經(jīng)過修飾的寡核苷酸是這樣合成的，通過標準方法構(gòu)造寡核苷酸鏈，例如亞磷酰胺法固相合成，再用商業(yè)上可得到的5’-氨基-改性劑C6(例如來自Eurogentec，Seraing，Belgium)衍生5’-末端。 5’-氨基-改性劑C6(Mmt＝4-一甲氧基三苯甲基)從載體上裂解寡核苷酸衍生物和通過氨處理去保護所有堿不穩(wěn)定性保護基團之后，在環(huán)境溫度下用80％乙酸處理，除去一甲氧基三苯甲基，得到5’-氨基己基-磷酸酯-修飾的寡核苷酸。然后使這種寡核苷酸衍生物的氨基官能與FDA-異硫氰酸酯在0.2M三乙銨碳酸氫鹽緩沖液(TBK緩沖液)pH7/DMF中反應(yīng)。僅二至三小時后，帶有氨基連接子的寡核苷酸就已經(jīng)完全轉(zhuǎn)化為所需的FDA衍生物(圖4)。與熒光素異硫氰酸酯的反應(yīng)通常在pH8下進行。不過，在該pH下，F(xiàn)DA基的二乙酸酯水解。
使用其他氨基連接子試劑當然也是可能的，例如5’-氨基-改性劑C3、5’-氨基-改性劑C12、5’-氨基-改性劑C5或5’-巰基-改性劑C6(均來自Eurogentec)。
利用3’-氨基-改性劑固相，例如3’-氨基-改性劑C3 CPG(來自Eurogentec)，有可能制備具有3’-氨基烷基的寡核苷酸衍生物，隨后使其與FDA-異硫氰酸酯反應(yīng)，得到寡核苷酸衍生物，它含有連接在3’-末端的根據(jù)本發(fā)明的式I基團。 3’-氨基-改性劑C3 CPG(Fmoc＝芴基甲氧羰基)為了在核苷的雜環(huán)堿引入綴合物，有可能在合成中使用相應(yīng)的從胸苷衍生的氨基改性劑C6 dT(來自Eurogentec)代替正常的亞磷酰胺構(gòu)件。在寡核苷酸合成結(jié)束時，通過氨的處理除去三氟乙酰基保護基團，使游離的氨基官能在溶液中與FDA-異硫氰酸酯反應(yīng)。 氨基改性劑C6 dT按照類似的方式，有可能在寡核苷酸的任何位置引入根據(jù)本發(fā)明的式I基團?？梢暂p易看到，即使多次引入相同或不同的基團也是可能的。
在其中所要轉(zhuǎn)運的分子是肽核酸(PNA)的綴合物的制備方法中，有可能例如使氨基乙基的伯氨基官能與FDA-異硫氰酸酯反應(yīng)。
在用于制備其中所要轉(zhuǎn)運的分子是多肽的綴合物的方法中，有可能例如用多肽的氨基末端或賴氨酸側(cè)鏈的氨基官能與FDA-異硫氰酸酯反應(yīng)。
本發(fā)明還提供綴合物的用途，特別是基于該綴合物的上述有利性質(zhì)的用途。本發(fā)明的確切實施方式涉及綴合物用于跨生物膜轉(zhuǎn)運分子的用途。本發(fā)明還涉及芳基原子團(優(yōu)選為式I或II)用于轉(zhuǎn)運與該芳基原子團連接的分子、用于跨生物膜轉(zhuǎn)運該分子的用途。生物膜優(yōu)選為細胞組分、囊泡或細胞器。
本發(fā)明還提供用于跨膜轉(zhuǎn)運分子的方法，其中a)制備一種綴合物，其中所要轉(zhuǎn)運的分子與至少一個式I或II芳基原子團連接，b)溫育該綴合物與該膜。
確切地提供了用于轉(zhuǎn)運分子進入細胞的方法，其中a)制備一種綴合物，其中所要轉(zhuǎn)運的分子與至少一個式I或II芳基原子團連接，b)將該綴合物與該細胞溫育，于是c)該綴合物被轉(zhuǎn)運進入細胞，且沒有裂解除去該芳基原子團。
本發(fā)明確切地涉及這樣的方法，其中該細胞是真核生物或原核生物細胞，例如細菌細胞、酵母細胞或哺乳動物細胞，優(yōu)選為人細胞。在確切的實施方式中，該細胞是病理改變的細胞，例如腫瘤細胞。
不僅在哺乳動物細胞中觀察到綴合物的細胞攝取提高，而且在其他真核生物、甚至原核生物中都已得到證明。
用顯微鏡檢查根據(jù)本發(fā)明的綴合物攝取進入活體細胞的情況。最初，檢查FDA-標記的寡核苷酸CO_1和CO_3進入細胞的能力。使用相應(yīng)的熒光素-標記的寡核苷酸CO_2和CO_4作為現(xiàn)有技術(shù)已知的化合物。所有所研究的活體動物細胞培養(yǎng)物都在5至10分鐘內(nèi)攝入CO_1和CO_3(FDA-綴合物)，而在此時間后在活體細胞中不可能檢測到CO_2和CO_4(熒光素綴合物)(表1)。
即使攝取進入細菌和酵母大大慢于哺乳動物細胞，有些細胞在兩小時后也已攝入根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸，而正常熒光素-標記的寡核苷酸在這些條件未被攝入。驚人的是，原則上所有迄今所研究的生物體攝入根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸都好于已知的寡核苷酸衍生物。這些生物體尤其包括動物細胞、鞭毛蟲、酵母、真菌和細菌(表3)。
此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)癌細胞攝入這些寡核苷酸特別充分。根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸的用途因此特別適合于腫瘤療法。FDA-標記的反義寡核苷酸CO_1定向于eg5，它在簡單地加入到培養(yǎng)基中后可抑制A549細胞的增殖，而相應(yīng)的未經(jīng)修飾的反義寡核苷酸ON1和熒光素-標記的寡核苷酸CO_2僅在與透入增強劑、例如CellFectin配制之后才抑制癌細胞的增殖。
本發(fā)明涉及其中所要轉(zhuǎn)運的分子是寡核苷酸的綴合物的用途，用于與單鏈和/或雙鏈核酸、例如DNA(例如基因、cDNA)和/或RNA(例如pre-mRNA、mRNA)雜交。這些綴合物還能夠序列特異性地與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合，例如酶，例如聚合酶或端粒酶，或者與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。本發(fā)明此外涉及這些綴合物用于調(diào)節(jié)和完全或部分抑制某些靶基因表達的用途，例如用于轉(zhuǎn)錄和/或轉(zhuǎn)譯的完全或部分抑制。本發(fā)明還涉及這些綴合物作為反義寡核苷酸、核酶、有義寡核苷酸、形成三螺旋的寡核苷酸、chimeraplast和/或圈套寡核苷酸的用途。另外，這些綴合物可以用作分子生物學(xué)中的助劑。
本發(fā)明此外涉及寡核苷酸作為藥物和/或診斷助劑的用途和寡核苷酸用于制備藥物和/或診斷助劑的用途。確切地說，在用于與某些基因的表達或過度表達有關(guān)的疾病的預(yù)防和/或治療的藥物中可以采用所述寡核苷酸。此外，寡核苷酸可以用于診斷這樣的疾病或者用于早期檢測它們。由于根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸進入細胞的能力非常之好，因此它們可以用于體內(nèi)診斷，例如用于在整個器官或完整生物體中就地雜交。
本發(fā)明還提供包含一種或多種根據(jù)本發(fā)明的綴合物的藥物。本發(fā)明還提供包含一種或多種根據(jù)本發(fā)明的綴合物的診斷助劑。本發(fā)明還提供包含一種或多種根據(jù)本發(fā)明的綴合物的試驗試劑盒。
本發(fā)明還涉及寡核苷酸用于核酸及其類似物的檢測、分離和擴增的用途。綴合物特別適合于檢測細胞、特別是活體細胞中的核酸。這些細胞可以是人或動物來源的。綴合物還特別適合于表3所列生物體，特別適合于病原性生物體的檢測。根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸可以用在已知的核酸擴增技術(shù)中，特別是LMPCR(連接反應(yīng)介導(dǎo)的聚合酶鏈反應(yīng))、“Invader Assay”(商標，Third Wave Technologies，Inc.，Wisconsin)、TaqMan System(商標)和多樣性基因定型。借助光循環(huán)器用寡核苷酸擴增核酸的用途也是有利的，可實時進行擴增檢測。根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸的進一步可能的用途是基于分子“信標”原理的檢測，其中熒光性染劑在未被結(jié)合時不發(fā)出熒光，因為它被寡聚物中的第二基團猝火。例如有可能使FDA衍生物(例如在寡核苷酸的5’-末端)與Dabcyl原子團(例如在3’-末端綴合的)組合，后者猝火未結(jié)合狀態(tài)下的熒光信號，即使在FDA衍生物轉(zhuǎn)化為熒光素衍生物之后也是如此。這些FDA-修飾的信標僅在攝取進入細胞和與靶mRNA雜交之后才發(fā)出熒光信號。
本發(fā)明還涉及寡核苷酸或包含這些寡核苷酸的藥物的用途，用于治療由確定基因的過度表達所導(dǎo)致的或與之有關(guān)的疾病。本發(fā)明的藥物例如可以用于治療由病毒例如CMV、HIV、HSV-1、HSV-2、流感病毒、VSV、乙肝病毒或乳頭狀瘤病毒所導(dǎo)致的機能障礙。本發(fā)明的藥物例如還適合于治療癌癥。本發(fā)明的藥物此外例如適合于治療受整聯(lián)蛋白或細胞-細胞粘著受體影響的機能障礙，例如VLA-4、VLA-2、ICAM、VCAM或ELAM。本發(fā)明的藥物例如還適合于預(yù)防再狹窄，用于白斑和其他脫色素疾病或脫色素紊亂(例如皮膚、頭發(fā)、眼)的治療，例如白化病和牛皮癬，和哮喘的治療。
藥物例如涉及藥物制劑，它們的給藥可以是a)口服方式，例如劑型是片劑、糖衣片、硬或軟膠囊劑、溶液、乳劑或懸液，b)直腸方式，例如劑型是栓劑，或c)腸胃外方式，例如劑型是注射溶液。關(guān)于制備藥物，綴合物例如可以被加工在治療學(xué)上的惰性有機和/或無機載體中；適合于片劑、糖衣片和硬膠囊劑的載體例如乳糖、玉米淀粉或其衍生物、動物脂肪(tallow)和硬脂酸或其鹽。適合于溶液的載體是水、多元醇、蔗糖、轉(zhuǎn)化糖和葡萄糖，適合于注射溶液的載體是水、醇、多元醇、甘油和植物油，適合于栓劑的載體是氫化和植物油、蠟、脂肪和半液體多元醇。藥物此外可以包含防腐劑、溶劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑、乳化劑、甜味劑、著色劑、矯味劑、改變滲透壓的鹽、緩沖劑、包衣劑、抗氧化劑，如果適當?shù)脑挘€可包含其他治療學(xué)上的活性化合物。藥物優(yōu)選地是局部用藥的，例如借助導(dǎo)管，或者吸入，或者通過注射或輸注給藥。關(guān)于注射，將綴合物配制在液體溶液中，優(yōu)選為生理學(xué)上可接受的緩沖液，例如漢克氏溶液或林格氏溶液。不過，綴合物也可以配制成固體劑型，使用前溶解或懸浮。全身給藥所優(yōu)選的劑量從大約0.01mg/kg至大約50mg/kg體重每天。
綴合物和/或其生理學(xué)上可接受的鹽作為藥物可以獨自、彼此混合或以藥物制劑形式對動物給藥，優(yōu)選為哺乳動物，特別是人，該藥物制劑允許局部、經(jīng)皮、腸胃外或腸內(nèi)使用，包含有效劑量的至少一種綴合物作為活性組分，以及慣用的藥學(xué)上可接受的載體和添加劑。制劑通常包含大約0.1至90重量％的治療學(xué)上的活性化合物。關(guān)于皮膚疾病的治療，例如牛皮癬或白斑，優(yōu)選為局部使用，例如劑型是軟膏劑、洗劑或酊劑、乳劑、懸液。藥物是按照本身已知的方式制備的(例如《Remingtons藥物科學(xué)》Mack Publ.Co.，Easton，PA.)，并使用藥學(xué)上惰性的無機和/或有機載體。關(guān)于丸劑、片劑、糖衣片和硬膠囊劑的制備，有可能使用例如乳糖、玉米淀粉和/或其衍生物、滑石、硬脂酸和/或其鹽等。適合于軟膠囊劑和/或栓劑的載體是例如脂肪、蠟、半固體與液體多元醇、天然和/或氫化油等。適合于溶液和/或糖漿劑制備的載體是例如水、蔗糖、轉(zhuǎn)化糖、葡萄糖、多元醇等。適合于注射溶液制備的載體是水、醇、甘油、多元醇、植物油等。適合于微囊、植入物和/或藥條的載體是乙醇酸與乳酸的混合聚合物。此外適合的是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的脂質(zhì)體制劑(N.Weiner《Drug Develop Ind Pharm》15(1989)1523；《皮膚脂質(zhì)體制劑》Springer Verlag 1992)，例如HVJ脂質(zhì)體(Hayashi《基因療法》3(1996)878)。
除了活性化合物和載體以外，藥物還可以包含添加劑，例如填充劑、膨脹劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑、濕潤劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、防腐劑、甜味劑、著色劑、矯味劑或芳香劑、增稠劑、稀釋劑、緩沖物質(zhì)、進一步的溶劑和/或增溶劑和/或達到藥庫效果的試劑，和改變滲透壓的鹽、包衣劑和/或抗氧化劑。藥物還可以包含兩種或多種不同的寡核苷酸和/或其生理學(xué)上可接受的鹽，此外除了至少一種寡核苷酸以外，還包含一種或多種其他治療學(xué)上的活性物質(zhì)。劑量可以在寬限內(nèi)變化，必須根據(jù)具體情況加以調(diào)整。
附1顯示式I芳基原子團的實例。
圖2a和2b顯示式II芳基原子團的實例。
圖3顯示所要轉(zhuǎn)運的分子(這里是寡核苷酸)與式I芳基原子團之間的綴合作用的不同實例(A，B，C，D，E，F(xiàn)，G)?！癛”是式I原子團；“B”是雜環(huán)堿。
圖4顯示制備根據(jù)本發(fā)明的綴合物(這里由FDA-異硫氰酸酯和寡核苷酸組成)的可能性。
圖5顯示綴合物CO_5經(jīng)過一定時間從培養(yǎng)基攝取進入REH細胞，其中在一種情況下使用不含血清的培養(yǎng)基(◆)，在另一種情況下使用含有血清的培養(yǎng)基(●)。借助FACS測定進入細胞的攝取量。
圖6顯示通過FACS測量的CO_1(FDA綴合物；◆)和CO_2(FITC寡聚物；▲)攝取進入細胞的測定圖。細胞外寡核苷酸綴合物的最初濃度為1μM；○和□是對照。
圖7顯示REH細胞中與FDA綴合的聚A-核苷酸的轉(zhuǎn)染作為長度的函數(shù)。
圖8顯示熒光素二乙酸酯與熒光素二新戊酸酯寡核苷酸綴合物攝取進入細胞的對比。K39來自實施例15的羧基熒光素二乙酸酯(F3等于FDS)；K41來自實施例10的羧基熒光素二新戊酸酯(F2)。
圖9顯示用熒光顯微法檢查雙重標記的Cy3寡核苷酸F3綴合物[1μM]在與REH細胞培養(yǎng)期間攝取進入細胞。4小時后攝取。左熒光標記；中花青染劑；右相差圖；頂寡核苷酸K33；底寡核苷酸K34。
實施例實施例1寡核苷酸合成利用標準亞磷酰胺化學(xué)法和碘氧化作用，在自動DNA合成儀(Applied Biosystems 380B或394)上合成寡核苷酸(F.Eckstein，Ed《寡核苷酸與類似物實用方法》IRL Press，Oxford，1991)。關(guān)于在混合的硫代磷酸酯與磷酸二酯寡核苷酸中引入硫代磷酸酯橋，利用TETD(二硫化四乙基秋蘭姆)或Beaucage試劑代替碘進行氧化作用。從固體載體(CPG或Tentagel)上裂解，在55℃下用濃NH3處理18h以除去保護基團，寡核苷酸先經(jīng)過丁醇沉淀純化(Sawadogo，VanDyke《核酸研究》19(1991)674)。寡核苷酸再經(jīng)過制備型凝膠電泳或FPLC純化。然后利用2.5體積份乙醇，從0.5M NaCl溶液中沉淀得到鈉鹽。
寡核苷酸經(jīng)過如下分析a)分析型凝膠電泳20％丙烯酰胺，8M尿素，454M Tris-硼酸緩沖液pH 7.0，和/或b)HPLC分析Waters GenPak FAX，梯度CH3CN(400ml)，H2O(1.6l)，NaH2PO4(3.1g)，NaCl(11.7g)，pH 6.8(0.1M NaCl)至CH3CN(400ml)，H2O(1.6l)，NaH2PO4(3.1g)，NaCl(175.3g)，pH 6.8(1.5MNaCl)和/或c)毛細管凝膠電泳Beckmann毛細管eCAPTM，U100P凝膠柱，長65cm，I.D.100mm，窗口距一端15cm，緩沖液含140μM Tris、360mM硼酸、7M尿素，和/或d)電噴射質(zhì)譜法。
寡核苷酸的分析顯示純度均大于90％，在多數(shù)情況下大于95％。
實施例2向寡核苷酸引入5’-氨基-連接子如實施例1所述合成寡核苷酸。偶聯(lián)最后一個核苷酸之后，裂解除去5’-末端的二甲氧基三苯甲基。使游離羥基與商業(yè)上可得到的5’-氨基-改性劑C6(來自Eurogentic，Seraing，Belgium)在四唑催化下反應(yīng)，用碘水氧化。然后在50℃下用濃氨處理過夜，從載體上裂解下寡核苷酸，裂解除去所有核苷間基團上的堿不穩(wěn)定性保護基團和雜環(huán)堿的氨基官能。在最后一步中，在環(huán)境溫度下用80％乙酸處理3小時，裂解除去一甲氧基三苯甲基保護基團。如實施例1所述分析所得寡核苷酸。
實施例3帶有氨基-連接子的寡核苷酸與FDA-異硫氰酸酯的綴合將10 OD(260)來自實施例2的帶有5’-氨基-連接子的寡核苷酸溶于16μl 0.2M三乙銨碳酸氫鹽(TBK)緩沖液，與125μl二甲基甲酰胺(DMF)混合。向該混合物中加入1.5mg FDA-異硫氰酸酯，然后在避光下?lián)u動混合物3小時。用HPLC檢查反應(yīng)結(jié)果。然后加入2μl濃乙酸，將混合物在減壓下濃縮。產(chǎn)物然后經(jīng)過丁醇沉淀純化。用ESI質(zhì)譜法測定正確的質(zhì)量。為了避免芳族酯的水解，樣本總是保持在pH小于7。
實施例4CO_1(5′-F3-G*CGAC*GC*CAT*GAC*G*G-3′；F3＝FDA)的合成從經(jīng)由3’-末端連接有1μmol脫氧鳥苷的CPG載體開始，如實施例1所述合成寡核苷酸。將標有*的位置用Beaucage試劑氧化，以引入硫代磷酸酯橋。然后如實施例2所述進行與5’-氨基-改性劑C6的偶聯(lián)。用濃氨和80％乙酸去保護，得到96 OD(260)5’-氨基-連接子-G*CGAC*GC*CAT*GAC*G*G-3′。
然后使10 OD(260)帶有5’-氨基-連接子的寡核苷酸與FDA-異硫氰酸酯如實施例3所述反應(yīng)。用丁醇沉淀，得到8.4 OD(260)所需的FDA-標記的寡核苷酸。關(guān)于二鈉鹽的ESI-MS5395.93(二鈉鹽計算值5395.09)。
實施例5CO_13(5′-F3-TATTCCGTCAT-3′)的合成從經(jīng)由3’-末端連接有1μmol胸苷的CPG載體開始，如實施例1所述合成寡核苷酸。利用碘水進行所有氧化作用。然后如實施例2所述進行與5’-氨基-改性劑C6的偶聯(lián)。用濃氨和80％乙酸去保護，得到72 OD(260)5’-氨基-連接子-TATTCCGTCAT-3’。經(jīng)過制備型聚丙烯酰胺凝膠純化，得到43 OD(260)。
然后使10 OD(260)帶有5’-氨基-連接子的寡核苷酸與FDA-異硫氰酸酯如實施例3所述反應(yīng)。用丁醇沉淀，得到9.1 OD(260)所需的FDA-標記的寡核苷酸。ESI-MS3934.1(MW計算值3933.8)。
實施例6CO_21(5′-F7-A*T*G A C*G G A A*T*T*C) 的合成從經(jīng)由3’-末端連接有1μmol N6-苯甲酰胞苷的CPG載體開始，如實施例1所述合成寡核苷酸。利用碘水進行所有氧化作用。然后如實施例2所述進行與5’-氨基-改性劑C6的偶聯(lián)。用濃氨和80％乙酸去保護，得到145 OD(260)5’-氨基-連接子-A*T*G A C*G G A A*T*T*C-3′。
然后將10 OD(260)帶有5’-氨基-連接子的寡核苷酸溶于16μl0.2M TBK緩沖液與95μl DMF，使混合物與30μl預(yù)先制備的對-乙酰氧基苯甲酸的活化酯反應(yīng)?；罨ナ沁@樣制備的，在DMF的情況下，將50μl 0.2M對-乙酰氧基苯甲酸與50μl 0.3M TBTU混合，然后在環(huán)境溫度下反應(yīng)一小時。氨基-連接子-寡核苷酸與活化酯反應(yīng)4小時后，加入2μl半濃縮的乙酸，將混合物在減壓下濃縮。用丁醇沉淀以除去過量試劑。得到10.7OD(260)所需的寡核苷酸綴合物。ESI-MS4109.2(MW計算值4108.2)。
實施例7寡核苷酸綴合物的細胞攝取檢查為了檢查細胞攝取，在顯微鏡檢控制下，在Bachofer腔內(nèi)，將在培養(yǎng)基中的1ml細胞懸液(或者在培養(yǎng)基具有固有熒光的情況下，在PBS中清洗之后)與1ml 1μmol寡核苷酸綴合物溶液混合，混合是利用取液器進行的，并且搖動腔。按照相差模式，借助Zeiss Axiovert135 TV儀器(100×Plan-Neofluar)進行顯微鏡檢查。所用熒光濾器是09(450-490/FT 510/LP 520)/HBO 59W濾器。所用參照是FDA(Aldrich Chem.Co.，F(xiàn)W.416.39)在丙酮/PBS緩沖液中(1∶1000；v∶v)的2.4μM溶液。在FDA綴合物的情況下，在攝取之后可以監(jiān)測由酯裂解所生成的熒光素配體的固有熒光。在非熒光性配體的情況下，例如乙酰氧基萘羧酸，另外將適合的熒光標記物(FITC、若丹明、花青染劑Dy3或Dy5)與寡核苷酸連接。如CO_9中的雙重標記用來證明FDA不從寡核苷酸中裂解。在加入寡核苷酸綴合物2至120分鐘之后評價各樣本。在Reh細胞的情況下，5至10分鐘后清楚地顯現(xiàn)熒光，在K562和粘附細胞以及昆蟲細胞的情況下，熒光在加入后長達60分鐘才有所增加。在自由活體原生動物的情況下，攝取花費1小時。在酵母的情況下，攝取僅在長時間后才發(fā)生，并且在所有細胞中不是均勻的。FDA寡核苷酸綴合物攝取進入真菌孢子好于菌絲細胞。結(jié)果總結(jié)在表1至3中。
實施例8寡核苷酸綴合物的抗增殖作用檢查在37℃和5％CO2下，將REH細胞(人白血病前B細胞，DSM ACC 22)或A549腫瘤細胞在含有10％胎牛血清(FCS；GIBCO-BRL)的OptiMEM中培養(yǎng)。實驗前一天，將細胞進行傳代培養(yǎng)，以便細胞濃度在24小時后達到大約1×106/ml。將寡核苷酸或其綴合物溶于蒸餾水，得到1mM儲備溶液，貯存在-20℃冰箱內(nèi)。將細胞接種在24-孔平板上(含10％FCS的OptiMEM中1×106個細胞/ml)。關(guān)于檢查，將寡核苷酸衍生物稀釋至2μM(在不含F(xiàn)CS的OptiMEM中)。在每孔中，將100μl寡核苷酸溶液與100μl細胞懸液混合(總體積200μl/孔；寡聚物濃度1μM，血清濃度5％FCS，細胞濃度0.5×106個細胞/ml)。在37℃和5％CO2下培養(yǎng)4小時后，每孔加入800μl含11％FCS的OptiMEM(細胞濃度現(xiàn)在是1×105個細胞/ml，血清濃度現(xiàn)在是10％FCS)，繼續(xù)培養(yǎng)。在37℃和5％CO2下96小時后，用Casy 1(來自Scharfe)測量細胞濃度。為此，將每孔中的細胞吸入1000μl取液器再吹出各10次，進行混合，立即用Casyton稀釋1∶100(在細胞生長更強的情況下稀釋1∶200)。測定細胞密度的平均值，在每種情況下一批有3份相同的樣本。
實施例95′-F4′(CO-NH)-A*T*G A C*G G A A*T*T*C的合成從經(jīng)由3’-末端連接有1μmol N-苯甲酰胞苷的CPG載體開始，如實施例1所述合成寡核苷酸。為了引入硫代磷酸酯原子團(如果*存在于序列中)，利用碘水或Beaucage試劑進行氧化作用。然后如實施例2所述進行與5’-氨基-改性劑C6的偶聯(lián)。用濃氨和80％乙酸去保護，得到145 OD(260)5’-氨基-連接子-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-3’。
然后將10 OD(260)5’-氨基-連接子-寡核苷酸溶于16μl 0.2MTBK緩沖液與95μl DMF，使混合物與12.5μl二氯熒光素二乙酸酯羥基琥珀酰亞胺(MW626.36)反應(yīng)。氨基-連接子-寡核苷酸與羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)3小時后，加入2μl半濃縮的乙酸，將混合物在減壓下濃縮。經(jīng)過NAP柱TM(Pharmacia)脫鹽后，用丁醇進行沉淀。得到2.8OD(260)所需的寡核苷酸二氯熒光素二乙酸酯綴合物。ESI-MS4403.3(MW計算值4403.2)。
實施例105′-F2′-(CO-NH)-A*T*G A C*G G A A*T*T*C的合成如實施例9所述制備5’-氨基-連接子-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-3’寡聚物。將10 OD(260)5’-氨基-連接子-寡核苷酸溶于16μl 0.2M TBK緩沖液與95μl DMF，使混合物與12.5μl羧基熒光素二新戊酸酯羥基琥珀酰亞胺(MW641.64)反應(yīng)。氨基-連接子-寡核苷酸與羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)2小時后，另加入12.5μl羥基琥珀酰亞胺，繼續(xù)反應(yīng)2小時。然后加入2μl半濃縮的乙酸，將混合物在減壓下濃縮。經(jīng)過NAP柱TM(Pharmacia)脫鹽后，用丁醇沉淀。得到8.1 OD(260)所需的寡核苷酸熒光素二新戊酸酯綴合物。ESI-MS4472.9(MW計算值4471.6)。
實施例115′-F9-A*T*G A C*G G A A*T*T*C的合成如實施例9所述制備5’-氨基-連接子-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-3’寡聚物。將10 OD(260)5’-氨基-連接子-寡核苷酸溶于16μl 0.2M TBK緩沖液與95μl DMF，使混合物與25μl乙酰氧基萘羧酸的活化酯反應(yīng)?；罨ナ沁@樣制備的，將12.5μl 0.2M乙酰氧基萘羧酸(2.5mg的50μlDMF溶液)與12.5μlTBTU(4mg的50μl DMF溶液)混合，然后在環(huán)境溫度下反應(yīng)一小時。氨基-連接子-寡核苷酸與活化酯反應(yīng)17小時后，加入2μl半濃縮的乙酸，將混合物在減壓下濃縮。經(jīng)過NAP柱TM(Pharmacia)脫鹽后，用丁醇沉淀。得到8.5 OD(260)所需的寡核苷酸乙酰氧基萘基綴合物。ESI-MS4158.2(MW計算值4157.2)。
實施例125′-F8-A*T*G A C*G G A A*T*T*C的合成如實施例9所述制備5’-氨基-連接子-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-3’寡聚物。將10 OD(260)5’-氨基-連接子-寡核苷酸溶于16μl 0.2M TBK緩沖液與95μl DMF，使混合物與25μl乙酰氧基香豆素羧酸的活化酯反應(yīng)?；罨ナ沁@樣制備的，將12.5μl 0.2M乙酰氧基香豆素羧酸(2.7mg的50μl DMF溶液)與12.5μl TBTU(4mg的50μl DMF溶液)混合，然后在環(huán)境溫度下反應(yīng)一小時。氨基-連接子-寡核苷酸與活化酯反應(yīng)17小時后，加入2μl半濃縮的乙酸，將混合物在減壓下濃縮。經(jīng)過NAP柱TM(Pharmacia)脫鹽后，用丁醇沉淀。得到8.0 OD(260)所需的寡核苷酸乙酰氧基香豆素綴合物。ESI-MS4178.5(MW計算值4175.2)。
實施例135’-F3-(dA)ndA*dA*dA(n＝17、47和77；F3＝FDA)的合成從經(jīng)由3’-末端用N6-苯甲?；?2’-脫氧腺苷衍生的CPG載體開始，如實施例1所述合成寡核苷酸。前兩步偶聯(lián)之后，利用Beaucage試劑進行氧化，以引入硫代磷酸酯原子團(在序列中用*標記)，利用碘水進行所有其他氧化作用。然后如實施例2所述進行與5’-氨基-改性劑C6的偶聯(lián)。用濃氨和80％乙酸去保護，經(jīng)過制備型聚丙烯酰胺凝膠純化，得到2.95 OD(260)5’-氨基-連接子-(dA)17dA*dA*dA、4.9 OD(260)5’-氨基-連接子-(dA)47dA*dA*dA和5 OD(260)5’-氨基-連接子-(dA)77dA*dA*dA。在每種情況下，將5’-氨基-連接子-寡核苷酸溶于8μl 0.2M TBK緩沖液與62μl DMF，使混合物與1.6μl FDA異硫氰酸酯反應(yīng)。反應(yīng)3小時后，另加入FDA異硫氰酸酯，繼續(xù)反應(yīng)2小時。然后加入2μl半濃縮的乙酸，將混合物在減壓下濃縮。經(jīng)過NAP柱TM(Pharmacia)脫鹽后，用丁醇沉淀。得到1.5 OD(260)5’-F3-(dA)17dA*dA*dA、2.2 OD(260)5’-F3-(dA)47dA*dA*dA和0.9OD(260)5’-F3-(dA)77dA*dA*dA。
實施例14雙重標記的寡核苷酸5’-Cy3-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-C6-F3(F3＝FDA)的合成從允許在3’-末端引入C6-氨基-連接子的CPG載體(Petrie等(1992)《生物綴合物化學(xué)》3，85-87)開始，如實施例1所述合成寡核苷酸。利用碘水或Beaucage試劑進行氧化，以引入硫代磷酸酯原子團(如果*存在于序列中)。裂解除去最后一個二甲氧基三苯甲基保護基團后，使寡核苷酸的5’-末端與Cy3-CE亞磷酰胺(來自GlenResearch，Sterlin，VA；Catalog No.10-5913-xx)反應(yīng)，用碘水氧化。用濃氨去保護(在70℃下2小時)，得到64 OD(260)粗產(chǎn)物。經(jīng)過制備型聚丙烯酰胺凝膠純化，得到3.8 OD5’-Cy3-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-C6-氨基-連接子-3’，將3.5 OD(260)溶于8μl 0.2M TBK緩沖液與62μl DMF，使混合物與1.6μmol FDA異硫氰酸酯反應(yīng)。氨基-連接子-寡核苷酸與羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)3.5小時后，加入1μl半濃縮的乙酸，將混合物在減壓下濃縮。經(jīng)過NAP柱TM(Pharmacia)脫鹽后，用丁醇沉淀。得到3.5 OD(260)所需的雙重標記的寡核苷酸5’-Cy3-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-C6-F3。ESI-MS4926.2(MW計算值4927.1)。
實施例155’-F3-A*T*GAC*GGAA*T*T*C(F3＝FDA)的合成如實施例9所述制備5’-氨基-連接子-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-3’寡聚物。將10 OD(260)5’-氨基-連接子-寡核苷酸溶于16μl 0.2M TBK緩沖液與95μl DMF，使混合物與25μl FDA異硫氰酸酯(5mg的100μlDMF溶液)反應(yīng)。氨基-連接子-寡核苷酸與異硫氰酸酯反應(yīng)3小時后，另加入5μl異硫氰酸酯，繼續(xù)反應(yīng)2小時。然后加入2μl半濃縮的乙酸，將混合物在減壓下濃縮。經(jīng)過NAP柱TM(Pharmacia)脫鹽后，用丁醇沉淀。得到8.5 OD(260)所需的寡核苷酸熒光素二乙酸酯綴合物。ESI-MS4418.4(MW計算值4418.5)。
實施例16不同長度寡核苷酸綴合物5’-F3-(dA)ndA*dA*dA(n＝17、47和77；F3＝FDA)的細胞攝取對比利用REH細胞，原則上如實施例7所述進行來自實施例12的不同長度與分子量的綴合物的細胞攝取。借助流式細胞計進行量化。60分鐘后，5’-F3-(dA)17dA*dA*dA(“A20”)的相對熒光信號是49，5’-F3-(dA)47dA*dA*dA(“A50”)的相對熒光信號是34，5’-F3-(dA)77dA*dA*dA(“A80”)的相對熒光信號是91。驚人的是，REH細胞對具有最大寡核苷酸部分、即包含總計80個核苷酸的FDA綴合物的攝入是最有效的。
實施例17不同衍生化的寡核苷酸綴合物的細胞攝取對比熒光素二新戊酸酯是與熒光素二乙酸酯(FDA)有聯(lián)系的化合物，它增加了酯基的穩(wěn)定性。利用流式細胞計檢查相應(yīng)寡核苷酸綴合物的攝取。新戊酸酯對堿和酯酶的穩(wěn)定性增加導(dǎo)致相應(yīng)寡核苷酸綴合物的攝取減少。因而，60分鐘后測量熒光素二乙酸酯綴合物的相對熒光為195，而相應(yīng)熒光素二新戊酸酯綴合物的相對熒光僅為55。
實施例18來自實施例13的雙重標記的寡核苷酸綴合物5’-Cy3-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-C6-FDA的細胞攝取檢查FAC Scan顯示Cy3寡核苷酸F3綴合物被REH細胞迅速攝入。將細胞用寡核苷酸綴合物/Cellfectin復(fù)合物處理，得到相似但更不均勻的攝取。FDA綴合物的效果大大干擾Cellfectin寡核苷酸復(fù)合物的效果。
還檢查了寡核苷酸中兩種不同的標記基團在與細胞培養(yǎng)中的共同定位作用，以排除所測量的熒光僅基于所裂解的FDA或熒光素的可能性。Cy3寡核苷酸F3綴合物具有與5’-末端共價結(jié)合的花青染劑和與3’-末端共價結(jié)合的FDA。圖9顯示REH細胞與Cy3寡核苷酸F3綴合物培養(yǎng)4小時后的綠色與紅色熒光。由于可以觀察到細胞中兩種標記物的共同定位作用，可以斷定寡核苷酸是以完整形式被攝入的。僅有FDA部分的乙?；蟾疟货ッ杆猓驗榉菬晒庑訤DA原子團明顯轉(zhuǎn)化為熒光性熒光素原子團。Cy3/FDA綴合物的攝取是非常迅速的，因為加入后僅7分鐘即可檢測到兩種標記物。
檢查了四種濃度的來自實施例4的寡核苷酸FDA綴合物CO_1對A549腫瘤細胞的抗增殖活性。沒有加入透入增強劑，綴合物即抑制增殖。沒有F3綴合物的相應(yīng)寡核苷酸(ON1)僅在與透入增強劑(CellFectin，Gibco-BRL)形成復(fù)合物之后才抑制增殖。結(jié)果如表4所示。
表1FDA-標記的寡核苷酸(寡核苷酸-FDA綴合物)攝取進入哺乳動物細胞的熒光顯微檢查
A與FDA-標記的寡核苷酸CO_1和CO_3培養(yǎng)B與熒光素-標記的寡核苷酸CO_2和CO_4培養(yǎng)(+)弱攝取+ 中等攝取++ 非常強的攝取- 沒有攝取* 僅攝取進入受損細胞表2FDA-標記的寡核苷酸攝取進入昆蟲細胞的熒光顯微檢查(關(guān)于圖例說明見表1)
表3FDA-標記的寡核苷酸攝取進入各種生物體的熒光顯微檢查
A與FDA-標記的寡核苷酸CO_1和CO_3培養(yǎng)B與熒光素-標記的寡核苷酸CO_2和CO_4培養(yǎng)(關(guān)于評價的圖例說明見表1)#僅被攝入這些迅速分裂生物體的一些細胞表4實施例8結(jié)果
表5FDA綴合物(來自實施例15的A20、A50、A80)的轉(zhuǎn)染作為長度的函數(shù)時間[分鐘] 熒光 熒光 熒光A20A50 A800 0.01030.01030.010310 11.71 8.9 43.3120 39.68 28.06 88.3630 48.59 34.38 91.2840 54.7 38.75 92.3550 58.66 41.64 93.1960 62.13 44.33 93.62表6熒光素二乙酸酯與熒光素二新戊酸酯寡核苷酸綴合物的細胞攝取對比(實施例16，圖8)時間[分鐘]熒光 熒光K39 K410 2,662.7510 72.37 8.4920 112.34 18.1730 142.97 28.6740 164.64 38.3450 184.96 46.6260 195.57 55.267080 218.12 68.0290100 231.04 83.7110120 253.84 97
序列表<110>Aventis Pharma Deutschland GmbH<120>綴合物及其制備方法和用于跨生物膜轉(zhuǎn)運分子的用途<130>1999/L045<140><141><150>19935302.6<151>1999-07-28<160>63<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>16<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列描述經(jīng)修飾的寡核苷酸<220><221>misc feature<222>(1)..(16)<400>1dgcgacgcca tgacgg 16<210>2<211>13<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列描述經(jīng)修飾的寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(13)<400>2dcgacgccat gac 13<210>3<211>13<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列描述經(jīng)修飾的寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(13)<400>3datgacggaa ttc 13<210>4<211>12<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列描述寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(12)<400>4dtattccgtc at 12<210>5<211>2<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列描述寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(2)<400>5da 2<210>6<211>2<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列描述寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(2)<400>6da 2<210>7<211>2<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列描述寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(2)<400>7da 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1.一種綴合物，它包含所要轉(zhuǎn)運的分子和至少一個式I芳基原子團， 其中芳基是這樣的基團，它含有至少一個具有芳族特征的環(huán)；X是O或N；Y是O、S或NH-R2；R1是取代或未取代的C1-C23烷基原子團，它可以是直鏈或支鏈的，并且可以含有雙鍵和/或叁鍵；R2是取代或未取代的C1-C18烷基原子團，它可以是直鏈或支鏈的，并且可以含有雙鍵和/或叁鍵；n是大于或等于1的整數(shù)，其中該芳基原子團與該所要轉(zhuǎn)運的分子是直接經(jīng)由化學(xué)鍵或間接經(jīng)由化學(xué)基團連接的，其中如果通過該所要轉(zhuǎn)運的分子的核苷酸間磷酸二酯鍵連接，那么該化學(xué)基團不是CH2-S基團。
2.如權(quán)利要求1所要求保護的綴合物，其中該所要轉(zhuǎn)運的分子是分子量＞500道爾頓的大分子。
3.如權(quán)利要求1和2一項或多項所要求保護的綴合物，其中該所要轉(zhuǎn)運的分子是多核苷酸、多肽或多糖。
4.如權(quán)利要求1至3一項或多項所要求保護的綴合物，其中該所要轉(zhuǎn)運的分子是寡核苷酸。
5.如權(quán)利要求4所要求保護的綴合物，其中該寡核苷酸是經(jīng)過修飾的。
6.如權(quán)利要求1所要求保護的綴合物，其中該所要轉(zhuǎn)運的分子是分子量＜500道爾頓的低分子量化合物。
7.如權(quán)利要求6所要求保護的綴合物，其中該低分子量化合物是單核苷酸。
8.如權(quán)利要求1至7一項或多項所要求保護的綴合物，其中該化學(xué)基團與該芳基原子團一起具有式II 其中芳基、X、Y和R1是如上所定義的，并且R3是該化學(xué)基團，R3優(yōu)選為-C(＝O)基團或-NH-C(＝S)基團。
9.如權(quán)利要求1至8一項或多項所要求保護的綴合物，其中該化學(xué)基團與該芳基原子團一起具有式F1至F11之一
10.一種綴合物，它包含a)多核苷酸、寡核苷酸或單核苷酸，和b)一個或多個式I芳基原子團，其中該芳基原子團直接經(jīng)由化學(xué)鍵或者間接經(jīng)由化學(xué)基團與如下連接5’-末端，和/或3’-末端，和/或一個或多個核堿，和/或一個或多個糖原子團，和/或一個或多個核苷間鍵，其中如果經(jīng)由核苷酸間磷酸二酯鍵連接，那么該化學(xué)基團不是CH2-S基團。
11.用于制備一種綴合物的方法，該綴合物包含所要轉(zhuǎn)運的分子和至少一個芳基原子團，其中a)制備所要轉(zhuǎn)運的分子，它在將與芳基原子團連接的位置具有反應(yīng)性官能；b)制備芳基原子團；和c)使該所要轉(zhuǎn)運的分子與該芳基原子團反應(yīng)，得到綴合物。
12.如權(quán)利要求11所要求保護的方法，其中該反應(yīng)性官能是氨基、巰基、氯乙?；?、異氰酸酯基、異硫氰酸酯基、羧酸基、N-羥基琥珀酰亞胺基或碳酰氯基。
13.如權(quán)利要求11和12一項或多項所要求保護的方法，其中所要轉(zhuǎn)運的分子與芳基原子團的反應(yīng)是在pH≤7.5下進行的。
14.如權(quán)利要求11至13一項或多項所要求保護的方法，其中所要轉(zhuǎn)運的分子與芳基原子團的反應(yīng)是在pH 7.0下進行的。
15.如權(quán)利要求11至14一項或多項所要求保護的方法，其中所要轉(zhuǎn)運的分子是多核苷酸、寡核苷酸或單核苷酸。
16.與所要轉(zhuǎn)運的分子連接的式I或II芳基原子團的用途，用于跨生物膜轉(zhuǎn)運該分子。
17.用于跨膜轉(zhuǎn)運分子的方法，它包括a)制備一種綴合物，在該綴合物中所要轉(zhuǎn)運的分子與至少一個式I或II芳基原子團連接，和b)將該綴合物與該膜溫育。
18.用于轉(zhuǎn)運分子進入細胞的方法，其中包括a)制備一種綴合物，在該綴合物中所要轉(zhuǎn)運的分子與至少一個式I或II芳基原子團連接，b)將該綴合物與該細胞溫育，于是c)該綴合物被轉(zhuǎn)運進入細胞，且沒有裂解除去該芳基原子團。
19.如權(quán)利要求18所要求保護的方法，其中該細胞是真核生物或原核生物細胞。
20.如權(quán)利要求18和19一項或多項所要求保護的方法，其中該細胞是細菌細胞、酵母細胞或哺乳動物細胞。
21.如權(quán)利要求18至20一項或多項所要求保護的方法，其中該細胞是人細胞。
22.如權(quán)利要求18至21一項或多項所要求保護的方法，其中該細胞是腫瘤細胞。
23.用于制備藥物的方法，它包括a)制備藥學(xué)上的活性化合物或其衍生物，其中所述藥學(xué)上的活性化合物或所述衍生物在將與芳基原子團連接的位置含有至少一個反應(yīng)性官能，b)制備式I或II芳基原子團，c)使該藥學(xué)上的活性化合物或其衍生物與該芳基原子團反應(yīng)，得到綴合物，如果適當?shù)脑?，將該綴合物d)與其他添加劑和/或賦形劑混合。
24.藥物，其包含如權(quán)利要求1至10一項或多項所要求保護的綴合物。
25.診斷助劑，其包含如權(quán)利要求1至10一項或多項所要求保護的綴合物。
26.試驗試劑盒，其包含如權(quán)利要求1至10一項或多項所要求保護的綴合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及綴合物、它們的制備方法和這些綴合物用于經(jīng)由生物膜轉(zhuǎn)運低分子量化合物與大分子的用途,特別是轉(zhuǎn)運分子進入細胞。本發(fā)明還涉及藥物、診斷劑和試驗試劑盒,其中含有或引入這些綴合物。
文檔編號A61K47/48GK1360507SQ00809175
公開日2002年7月24日 申請日期2000年7月20日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月28日
發(fā)明者E·尤爾曼, B·格雷納, E·安格, G·高瑟, M·施沃德爾 申請人:阿文蒂斯藥物德國有限公司