專(zhuān)利名稱(chēng)：血液羰基化合物捕集劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血液中羰基化合物的清除方法，特別是涉及使用羰基化合物捕集劑除去血液中羰基化合物的方法。
背景技術(shù)：
血液透析是一種用于治療患有慢性腎衰竭的患者的典型療法，其中通過(guò)使血液經(jīng)半透膜與透析液接觸而除去血液中的廢物和毒性物質(zhì)。然而，腎衰竭的病情通過(guò)透析不能完全被抑制。這類(lèi)疾病癥狀包括腎衰竭患者體內(nèi)的高級(jí)糖基化終產(chǎn)物(AGEs)增加和羰基中間體(AGE前體)水平升高。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了AGEs可改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能并與發(fā)作諸如透析的淀粉樣變和動(dòng)脈粥樣硬化這樣的透析并發(fā)癥有關(guān)(Makita，Z.等《新英格蘭藥物雜志》(N.Engl.J.Med.)325836-842，1991；Miyata，T.等《臨床研究雜志》(J.Clin.Invest.)921243-1252，1993；Miyata，T.等《臨床研究雜志》(J.Clin.Invest.)93521-528，1994；Miyata，T.等《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)932353-2358，1996；Horie，K.等《臨床研究雜志》(J.Clin.Invest.)1002995-3004，1997；Miyata，T.等《FEBS通訊》(FEBS letters)445202-206，1999)。近來(lái)，人們認(rèn)識(shí)到諸如乙二醛、甲基乙二醛、3-脫氧葡糖醛酮和阿拉伯糖這樣的羰基中間體在血漿中的累積(稱(chēng)謂羰基應(yīng)激反應(yīng))(Odani等《生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊》(Biochem.Biophys.Res.Commun.)，25689-93，1999；Niwa等《腎單位》(Nephron)69438-443，1995；Miyata，T.等《國(guó)際腎臟學(xué)》(Kidney Int.)55389-399，1999；Miyata，T.等《美國(guó)腎臟學(xué)協(xié)會(huì)雜志》(J.Am.Soc.Nephrol.)92349-2356，1998)導(dǎo)致腎衰竭中的AGE水平升高(Miyata，T.等《美國(guó)腎贓學(xué)協(xié)會(huì)雜志》(J.Am.Soc.Nephrol.)92349-2356，1998；Miyata，T.等《國(guó)際腎臟學(xué)》(KidneyInt.)55389-399，1999)。各種羰基中間體(AGE前體)主要來(lái)源于碳水化合物和脂類(lèi)(Miyata，T.等《國(guó)際腎臟學(xué)》(Kidney Int.)55389-399，1999；Miyata，T.等《國(guó)際腎臟學(xué)》(Kidney Int.)541290-1295，1998；Miyata，T.等《國(guó)際腎臟學(xué)》(KidneyInt.)511170-1181，1997)。常規(guī)的血液透析不能有效地治療腎衰竭患者這些高指標(biāo)的AGE和羰基中間體，即“羰基應(yīng)激反應(yīng)”。
首先，本發(fā)明研究了用于血液透析的血液透析膜如何影響患者血液中羰基化合物的量。使用高效液相層析(HPLC)對(duì)透析患者使用的每種類(lèi)型的透析膜進(jìn)行定量，由此來(lái)比較作為累積羰基中間產(chǎn)物(即羰基應(yīng)激反應(yīng))的標(biāo)記的血液中戊糖啶(pentosidine)的含量。結(jié)果顯示游離的戊糖啶經(jīng)任一種透析膜透析均可明顯地除去，而蛋白質(zhì)結(jié)合的戊糖啶占體內(nèi)戊糖啶的主要部分，通過(guò)透析不能被有效地除去。
對(duì)透析膜類(lèi)型的比較顯示，用低通量纖維素、高通量聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和AN69的結(jié)合蛋白質(zhì)的戊糖啶和游離的戊糖啶的值沒(méi)有差異，而用高通量聚砜(PS)的值較低(p＜0.01)。該數(shù)值沒(méi)有差異，與患者是日本人還是比利時(shí)人，或與PS膜的制造商均無(wú)關(guān)。將3位患者使用的透析膜從AN69換成PS，降低了結(jié)合蛋白質(zhì)的戊糖啶的水平，而然后將透析膜換回AN69則使戊糖啶又恢復(fù)至原始水平。這些結(jié)果表明聚砜膜可有效地用作抑制羰基化合物產(chǎn)生的透析膜。
此外，本發(fā)明者認(rèn)為用羰基化合物捕集劑可有效地除去血液中的羰基化合物。由透析患者血液制備的血漿用已經(jīng)固定了羰基化合物捕集劑的載體培養(yǎng)，并對(duì)血液中的羰基化合物進(jìn)行定量。結(jié)果顯示使用已固定了羰基化合物捕集劑的載體進(jìn)行培養(yǎng)顯著減少了血液中羰基化合物的量。
以這些發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)，本發(fā)明者將研究集中在血液中累積的羰基化合物并認(rèn)為，為改善透析患者體內(nèi)羰基應(yīng)激反應(yīng)(主要是蛋白質(zhì)的改變)需要除去血液中累積的羰基化合物。本發(fā)明者隨后發(fā)現(xiàn)，用一種能與羰基化合物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)或能吸附羰基化合物的化合物，使該化合物具有消除或減少羰基化合物的蛋白質(zhì)修飾活性的功能，就可有效地達(dá)到所述目的，由此完成了本發(fā)明。在本發(fā)明中，固定了具有這類(lèi)功能的化合物的載體或該化合物本身稱(chēng)作“羰基化合物捕集劑”。
因此，本發(fā)明涉及一種可除去血液中羰基化合物的羰基化合物捕集劑以及一種用于改善活體內(nèi)羰基應(yīng)激狀態(tài)的方法和試劑，如下所述(1)一種可除去血液中羰基化合物的羰基化合物捕集劑；(2)根據(jù)(1)所述的羰基化合物捕集劑，其中所述的捕集劑用于血液透析；(3)根據(jù)(1)所述的羰基化合物捕集劑，其中將所述的捕集劑固定在不溶于血液的載體上；(4)根據(jù)(3)所述的羰基化合物捕集劑，其中所述的載體是一種透析膜。
(5)根據(jù)(4)所述的羰基化合物捕集劑，其中所述的透析膜是一種聚砜膜。
(6)根據(jù)(1)所述的羰基化合物捕集劑，其中所述的羰基化合物捕集劑是一種美拉德反應(yīng)抑制劑。
(7)根據(jù)(6)所述的羰基化合物捕集劑，其中所述的美拉德反應(yīng)抑制劑包含至少一種選自氨基胍、吡哆胺、肼、含SH基的化合物、及它們的衍生物組成的組的化合物；(8)根據(jù)(1)所述的羰基化合物捕集劑，其中所述的捕集劑包含一種不溶于血液的化合物；(9)根據(jù)(8)所述的羰基化合物捕集劑，其中所述的不溶于血液的化合物包含至少一種選自離子交換樹(shù)脂、活性炭、硅膠、氧化鋁和碳酸鈣的化合物；(10)一種用于改善活體內(nèi)羰基應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)的試劑，其中所述的試劑包括一種羰基化合物捕集劑作為活性組分；(11)一種用于改善血液中羰基應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)的試劑，其中所述的試劑包括一種羰基化合物捕集劑作為活性組分。
(12)根據(jù)(11)中用于改善所述的羰基應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)的試劑，其中將所述的試劑固定在血液循環(huán)中。
(13)根據(jù)(11)中用于改善所述的羰基應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)的試劑，其中所述的羰基化合物捕集劑是一種美拉德反應(yīng)抑制劑。
(14)根據(jù)(13)中用于改善所述的羰基應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)的試劑，其中所述的美拉德反應(yīng)抑制劑包括至少一種選自氨基胍、吡哆胺、肼、含SH基的化合物及其衍生物組成的組的化合物。
(15)一種用于改善羰基應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)的方法，其中所述的方法包括使血液循環(huán)中患者的血液與一種羰基化合物捕集劑接觸的步驟。
(16)根據(jù)(15)所述的方法，其中所述的方法包括將所述的羰基化合物捕集劑固定在不溶于血液的載體上的步驟。
本發(fā)明還涉及羰基化合物捕集劑清除血液中羰基化合物的用途。此外，本發(fā)明涉及羰基化合物捕集劑在制備用于改善血液中羰基應(yīng)激反應(yīng)的試劑中的用途。
在本發(fā)明中，所捕集的羰基化合物例如包括累積在帶有氧化性應(yīng)激反應(yīng)的腎衰竭患者血液中的下列化合物。來(lái)源于碳水化合物的羰基化合物·阿拉伯糖·乙二醛·甲基乙二醛·3-脫氧萄糖醛酮來(lái)源于抗壞血酸的羰基化合物·脫氫抗壞血酸來(lái)源于脂類(lèi)的羰基化合物·羥基壬烯醛·丙二醛(malondialdehyde)·丙烯醛本發(fā)明中優(yōu)選的羰基化合物捕集劑是一種能夠通過(guò)化學(xué)反應(yīng)或吸附作用完全抑制或減少所有這些羰基化合物的蛋白質(zhì)修飾活性的物質(zhì)。然而，本發(fā)明的羰基化合物捕集劑還包括對(duì)它們中的主要羰基化合物有效的試劑?？梢杂糜诒景l(fā)明的羰基化合物捕集劑例如包括下列化合物·氨基胍(Foote，E.F.等《美國(guó)腎病雜志》(Am.J.Kidney Dis.)25420-425(1995))·±2-異亞丙基亞肼基-4-氧-噻唑烷-5-基N-乙酰苯胺(OPB-9195；S.Nakamura，1997，《糖尿病》(Diabetes)46895-899)此外，所述的羰基化合物捕集劑例如包括能夠起羰基化合物捕集劑作用的下列化合物或其衍生物?！把苌铩敝傅氖桥c母體化合物相比在任何位上具有原子或分子取代的化合物。通過(guò)與載體連接有助于從血液中分離，從而可以將這些化合物用作本發(fā)明中的羰基化合物捕集劑。另一方面，如果所述化合物本身不溶于血液，那么可以將它用作本發(fā)明的羰基化合物捕集劑時(shí)不需固定在載體上。
(1)胍衍生物，諸如甲基胍(JP-A昭62-142114；JP-A昭62-249908；JP-A平1-56614；JP-A平1-83059；JP-A平2-156；JP-A平2-765；JP-A平2-42053；JP-A平6-9380；公開(kāi)的日文翻譯的國(guó)際公開(kāi)，5-505189)等。
(2)肼衍生物，諸如磺酰肼等。
(3)帶有兩個(gè)氮原子的五元雜環(huán)化合物，諸如吡唑啉酮(JP-A平6-287179)、吡唑啉(JP-A平10-167965)、吡唑(JP-A平6-192089；JP-A平6-298737；JP-A平6-298738)、咪唑烷(JP-A平5-201993；JP-A平6-135968；JP-A平7-133264；JP-A平10-182460)、乙內(nèi)酰脲(JP-A平6-135968)等。
(4)帶有三個(gè)氮原子的五元雜環(huán)化合物，諸如三唑(JP-A平6-192089)等。
(5)帶有一個(gè)氮原子和一個(gè)硫原子的五元雜環(huán)化合物，諸如噻唑啉(JP-A平10-167965)、噻唑(JP-A平4-9375；JP-A平9-595258)、噻唑烷(JP-A平5-201993；JP-A平3-261772；JP-A平7-133264；JP-A平8-157473)等。
(6)帶有一個(gè)氮原子和一個(gè)氧原子的五元雜環(huán)化合物，諸如噁唑(JP-A平9-59258)等。
(7)含氮的六元雜環(huán)化合物，諸如吡啶(JP-A平10-158244；JP-A平10-175954)和嘧啶(公開(kāi)的日文翻譯的國(guó)際公開(kāi)，7-500811)等。
(8)含氮的稠合雜環(huán)化合物，諸如吲唑(JP-A平6-287180)、苯并咪唑(JP-A平6-305964)、喹啉(JP-A平3-161441)等。
(9)含硫和氮的稠合雜環(huán)化合物，諸如苯并噻唑(JP-A平6-305964)等。
(10)含硫的稠合雜環(huán)化合物，諸如苯并噻吩(JP-A平7-196498)等。
(11)含氧的稠合雜環(huán)化合物，諸如苯并吡喃(JP-A平3-204874；JP-A平4-308586)等。
(12)含氮化合物，諸如咔唑基(JP-A平2-156；JP-A平2-753)、肼基甲酸(JP-A平2-167264)、肼(JP-A平3-148220)等。
(13)醌類(lèi)，諸如苯醌(JP-A平9-315960)和氫醌(JP-A平5-9114)等。
(14)脂族二羧酸類(lèi)(JP-A平1-56614；JP-A平5-310565)。
(15)含有硅氧烷的化合物(JP-A昭62-249709)。
(16)有機(jī)鍺化合物(JP-A平2-62885；JP-A平5-255130；JP-A平7-247296；JP-A平8-59485)。
(17)類(lèi)黃酮(JP-A平3-240725；JP-A平7-206838；JP-A平9-241165；WO94/04520)。
(18)烷基胺類(lèi)(JP-A平6-206818；JP-A平9-59233；JP-A平9-40626；JP-A平9-124471)。
(19)氨基酸(公開(kāi)的國(guó)際公開(kāi)4-502611日文翻譯文本；公開(kāi)的日文翻譯的國(guó)際公開(kāi)，7-503713)。
(20)芳香化合物，諸如殼二孢氯素(JP-A平6-305959)、苯甲酸(WO91/11997)、吡咯并二氮雜萘鎓(pyrrolo-naphthyridinium)(JP-A平10-158265)等。
(21)多肽類(lèi)(公開(kāi)的日文翻譯的國(guó)際公開(kāi)，7-500580)。
(22)維生素類(lèi)，諸如吡哆胺(WO97/09981)等。
(23)含SH基的化合物，諸如谷胱甘肽、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸等。
(24)含SH基的蛋白質(zhì)，諸如還原的清蛋白等。
(25)四環(huán)素類(lèi)(JP-A平6-256280)。
(26)脫乙酰殼多糖類(lèi)(JP-A平9-221427)。
(27)單寧類(lèi)(JP-A平9-40519)。
(28)含季銨離子的化合物。
(29)雙胍類(lèi)，諸如二甲雙胍、苯乙雙胍和丁二胍。
(30)聚合物，諸如離子交換樹(shù)脂。
(31)無(wú)機(jī)化合物，諸如活性炭、硅膠、氧化鋁和碳酸鈣。
上述化合物中的大部分通常稱(chēng)作美拉德反應(yīng)抑制劑。美拉德反應(yīng)指的是在諸如葡萄糖這樣的還原糖與氨基酸或蛋白質(zhì)之間發(fā)生的非酶糖化反應(yīng)。通過(guò)對(duì)加熱時(shí)由氨基酸和還原糖組成的混合物中的褐色顯色現(xiàn)象進(jìn)行的集中研究，美拉德在1912年報(bào)導(dǎo)了該反應(yīng)(Maillard L.C.Compt.Rend.Soc.Biol.，72599(1912))。美拉德反應(yīng)涉及食品的褐色顯色、芳香成分和味道的產(chǎn)生、和加熱或儲(chǔ)存過(guò)程中蛋白質(zhì)的變性。因此，主要在食品化學(xué)領(lǐng)域研究了該反應(yīng)。
在1968年，在體內(nèi)鑒定了血紅蛋白的顯微級(jí)分即糖化的血紅蛋白(HbAlc)，發(fā)現(xiàn)它可在患糖尿病的患者體內(nèi)增加(Rahbar.S.《臨床化學(xué)學(xué)報(bào)》(Clin.Chim.Acta)22296(1968))。這些發(fā)現(xiàn)有助于展開(kāi)對(duì)體內(nèi)美拉德反應(yīng)的顯著性和諸如糖尿病并發(fā)癥和動(dòng)脈粥樣硬化以及老化的發(fā)展這樣的成年人疾病發(fā)作中該反應(yīng)的參與性有重大意義的研究。抑制體內(nèi)美拉德反應(yīng)的活性劑得到了廣泛研究，從而導(dǎo)致開(kāi)發(fā)了上述作為抑制美拉德反應(yīng)的活性劑的化合物。
然而，過(guò)去并不知道這類(lèi)美拉德反應(yīng)抑制劑能夠通過(guò)從血液中消除羰基化合物來(lái)改善腹膜透析患者體內(nèi)的羰基應(yīng)激狀態(tài)。
對(duì)用于固定本發(fā)明羰基化合物捕集劑的載體類(lèi)型沒(méi)有特別的限制，只要它不溶于血液且對(duì)人體無(wú)害而且作為直接接觸血液的物質(zhì)也是安全和穩(wěn)定的。具體說(shuō)，這類(lèi)載體例如包括合成或天然的有機(jī)聚合物化合物；無(wú)機(jī)物質(zhì)，諸如玻璃珠、硅膠、氧化鋁和活性炭；以及那些表面被多糖或合成聚合物包覆的物質(zhì)。
包括聚合物化合物的載體以下列物質(zhì)為例聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯腈、聚砜、乙烯基聚合物、聚烯烴、氟、聚酯、聚酰胺、聚酰亞胺、聚氨基甲酸酯、聚丙烯酸、聚苯乙烯、聚酮、聚硅氧烷、纖維素、脫乙酰殼多糖；特別是多糖類(lèi)，諸如瓊脂糖、纖維素、甲殼質(zhì)、脫乙酰殼多糖、瓊脂糖、葡聚糖等、及其衍生物；和聚酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜、聚醚砜、聚丙烯、聚乙烯醇、聚芳基醚砜、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚碳酸酯、乙?；w維素、聚丙烯腈、聚對(duì)苯二甲酸乙二酯、聚酰胺、硅氧烷樹(shù)脂、氟樹(shù)脂、聚氨基甲酸酯、聚醚氨酯和聚丙烯酰胺及其衍生物。這些聚合物可以單獨(dú)使用或以?xún)煞N或多種類(lèi)型聚合物的組合形式使用。在后一種情況中，將所述的羰基化合物捕集劑固定在至少一種聚合物上。該固定的羰基化合物捕集劑可以單獨(dú)或以?xún)煞N或多種類(lèi)型化合物組合的形式使用。此外，能夠向這些聚合物物質(zhì)中添加合適的改性劑或諸如通過(guò)照射或過(guò)氧化物交聯(lián)對(duì)它們進(jìn)行變性處理。
對(duì)載體的形狀沒(méi)有限制。例如，所述的載體可以是膜樣、纖維樣、粒狀、中空纖維樣、無(wú)妨布樣、多孔或蜂窩狀?？梢酝ㄟ^(guò)改變載體的厚度、表面積、直徑、長(zhǎng)度、形狀和/或大小來(lái)控制載體與腹膜透析液接觸的面積。
羰基化合物捕集劑可以通過(guò)使用諸如物理吸附、特異性生化結(jié)合反應(yīng)、離子結(jié)合、共價(jià)結(jié)合、接枝等公知方法固定在上述載體上。如果必要，可以在所述載體與羰基化合物捕集劑之間插入間隔基。當(dāng)該羰基化合物捕集劑具有毒性時(shí)，所釋放的量將對(duì)生命產(chǎn)生影響。因此，優(yōu)選將所述的羰基化合物捕集劑通過(guò)共價(jià)鍵固定在所述載體上以便將釋放的量減小到最低限度。用載體上的官能基與羰基化合物捕集劑進(jìn)行共價(jià)結(jié)合。所述的官能基例如羥基、氨基、醛基、羧基、硫羥基、硅烷醇基、酰胺基、環(huán)氧基、琥珀酰亞氨基等；然而，所述的官能基并不限于這些基團(tuán)。作為共價(jià)鍵，可以舉出的例子是酯鍵、醚鍵、氨基鍵、酰胺鍵、硫鍵、亞氨基鍵、二硫鍵等。
一種市售的產(chǎn)品例如帶有磺酰肼基團(tuán)的聚苯乙烯載體(PS-TsNNH2、ARGONAUT TECHNOLOGIES CO.)可用作固定羰基化合物捕集劑的載體。
本發(fā)明固定羰基化合物捕集劑的載體可以通過(guò)合適的滅菌方法進(jìn)行滅菌，該滅菌法選自一些公知的滅菌方法，主要根據(jù)所用羰基化合物捕集劑和載體的類(lèi)型來(lái)選擇。所述的滅菌方法的例子包括高壓滅菌、γ-射線(xiàn)照射、氣體滅菌等。
可以用各種方法使固定有羰基化合物捕集劑的載體與血液接觸。所述方法的實(shí)例有一種是將采集的患者血液輸注入裝有固定了羰基化合物捕集劑的載體的血袋中捕集患者血液中的羰基化合物；另一種是使血液在裝填有珠粒載體或纖維載體的柱上循環(huán)，在所述載體上已經(jīng)固定了羰基化合物捕集劑。用于這種處理的不僅可以是全血而且可以是分離的血漿?？梢詫⒔?jīng)處理的血液輸注回患者體內(nèi)或如果需要可以將經(jīng)處理的血液儲(chǔ)存在血袋中等。由于在血袋中包含固定了羰基化合物捕集劑的載體，因而也可捕集在儲(chǔ)存過(guò)程中產(chǎn)生和累積在血袋的血液中的羰基化合物。
在血液純化步驟中可以使血液與已經(jīng)固定了本發(fā)明羰基化合物捕集劑的載體進(jìn)行接觸，所述血液的純化步驟包括血液透析、血液過(guò)濾、血液過(guò)濾透析、血液吸附和血漿分離。
例如，可以通過(guò)將已經(jīng)固定了羰基化合物捕集劑的載體置于血液透析循環(huán)中而使血液透析與捕集羰基化合物這兩個(gè)步驟在血液透析患者中同時(shí)進(jìn)行。在這種情況中，優(yōu)選使用血液透析膜作為固定羰基化合物捕集劑的載體?？梢詫⒁阎膸追N透析膜用作載體。實(shí)例有纖維素衍生物，諸如再生的纖維素和三乙酸纖維素；和聚甲基丙烯酸甲酯、聚烯烴、聚砜、聚丙烯腈(PAN)、聚酰胺、聚酰亞胺、聚醚尼龍、聚硅氧烷、和聚酯共聚物，但并不限于它們。正如從實(shí)施例中所示的，當(dāng)將聚砜用作透析膜時(shí)，羰基中間產(chǎn)物(戊糖啶)濃度降低。因此，在上述透析膜中，特別優(yōu)選用聚砜膜作載體。實(shí)際上可以將如上所述填充了已經(jīng)固定有羰基化合物捕集劑的載體的柱置于血液透析循環(huán)中而不使用透析膜作為載體。通過(guò)使患者血液與已經(jīng)固定了羰基化合物捕集劑的載體接觸從血液中捕集羰基化合物、消除其對(duì)活體的損害并使它們成為無(wú)毒性的?？梢酝瑫r(shí)使用抗凝劑以便防止體外循環(huán)中的血液凝固。這類(lèi)抗凝劑例如包括肝素、低分子量肝素和Futhan(萘莫司他甲磺酸鹽)。它們均可固定在載體上。
人們預(yù)計(jì)，如果接觸血液過(guò)程中使用的捕集劑的量過(guò)小，那么患者血液中的羰基化合物在透析過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)不能被完全處理的情況。由于對(duì)患者血液中羰基化合物的量預(yù)先難以測(cè)定，所以要在確?；颊甙踩姆秶鷥?nèi)有效地使盡可能多的捕集劑保持活性。捕集劑的劑量可以通過(guò)改變固定在載體上的捕集劑的量或已經(jīng)固定了捕集劑的載體的劑量來(lái)調(diào)節(jié)。
除由上述美拉德反應(yīng)抑制劑所代表的有機(jī)化合物外，還可以將諸如離子交換樹(shù)脂這樣的聚合物化合物或諸如活性炭、硅膠、氧化鋁和碳酸鈣這樣的無(wú)機(jī)化合物用作本發(fā)明的羰基化合物捕集劑。這些化合物用作層析的填充劑是已知的，而由于具有吸附能力它還可以捕集羰基化合物。這類(lèi)化合物自身可以起載體作用且由此可用它們來(lái)填充裝在體外血液循環(huán)路徑中的過(guò)濾器。還可以將這類(lèi)化合物用作“羰基化合物捕集劑”將其包含在一種藥中用于改善本發(fā)明羰基應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)。在這種情況中，這類(lèi)化合物自身已經(jīng)起了如上所述固定羰基化合物捕集劑的載體的作用。或者，可以再將另一種羰基化合物捕集劑固定在本身具有捕集羰基化合物能力的載體上。
一種吸附型血液純化裝置是已知的，其中使用活性炭。這種吸附型血液純化裝置用于與血液透析結(jié)合的補(bǔ)充方法，其目的在于對(duì)藥物中毒和肝昏迷中的血液進(jìn)行純化，并除去與多器官衰竭相關(guān)的急性腎衰竭發(fā)作早期所增加的各種內(nèi)毒素和外毒素血管活性物質(zhì)。然而，尚未完全了解到這類(lèi)吸附型血液純化裝置可有效地作為羰基化合物捕集劑。
附圖簡(jiǎn)述附

圖1表示改變血液透析膜的類(lèi)型對(duì)3位患者體內(nèi)血漿戊糖啶濃度(pmol/mg蛋白質(zhì))的影響。將各結(jié)果表示為占相應(yīng)起始值的％值(患者1是41.8pmol/mg蛋白質(zhì)(◇)；患者2是22.1pmol/mg蛋白質(zhì)()或患者3是28.5pmol/mg蛋白質(zhì)(Δ))。所獲得的各值是在各透析期結(jié)束后2周采集的兩份樣品的平均值(使用AN69在透析結(jié)束前2周和第0周中；在變換成PS后的第8周和第10周中；在恢復(fù)使用AN69后的第14周和第16周中)。
附圖2表示通過(guò)用已經(jīng)固定了羰基化合物捕集劑珠粒的培養(yǎng)對(duì)透析患者體內(nèi)血漿戊糖啶濃度的抑制作用。
附圖3表示二羰基化合物溶液中活性炭對(duì)羰基化合物的捕集作用。
附圖4表示腹膜透析液中的活性炭對(duì)二羰基化合物的捕集作用。
附圖5表示當(dāng)在37℃下培養(yǎng)來(lái)自透析患者的血漿時(shí)活性炭介導(dǎo)的對(duì)戊糖啶產(chǎn)生的抑制作用。
附圖6表示用活性炭或磺酰肼連接的聚苯乙烯珠除去腎衰竭患者血漿中的羰基化合物。在該附圖中，縱座標(biāo)表示羰基化合物的濃度。
附圖7表示用氨基胍除去腎衰竭患者血漿中的羰基化合物。在該附圖中，縱座標(biāo)表示羰基化合物的濃度。
附圖8表示一種二氨基胍連接的聚酰胺的制備方法。
附圖9表示用二氨基胍連接的聚酰胺除去二羰基化合物溶液中的羰基化合物。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方式以下參照具體的實(shí)施例來(lái)解釋本發(fā)明，但這些實(shí)施例并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。
血液透析膜的類(lèi)型對(duì)血漿戊糖啶濃度的影響1.患者總計(jì)對(duì)已經(jīng)進(jìn)行一周3次血液透析的126位患者(男性69人和女性57人)進(jìn)行試驗(yàn)，其中比利時(shí)患者29人且日本患者97人。他們的平均年齡為61.2±13(標(biāo)準(zhǔn)偏差)歲。他們中僅2位患有輕度的II型糖尿病。每位患者使用相同類(lèi)型的血液透析膜至少3個(gè)月(或者2或3位患者使用相同類(lèi)型的膜少于3個(gè)月，而從開(kāi)始進(jìn)行血液透析起)。在29位比利時(shí)患者中的26位中重新使用了透析膜，而在日本患者中沒(méi)有重新使用透析膜。從每位患者的臨床記錄中獲得剩余多尿(ml/天)、透析膜的表面積和血液透析期限的數(shù)據(jù)。2.膜的類(lèi)型使用下列血液透析膜高通量(UF指標(biāo)＞10ml/mmHg/小時(shí))AN69(Hospal；France)(AN69組)；高通量聚砜(Fresenius；Germany)(PS組)；高通量聚砜(Asahi Medical；Japan)(APS組)；高通量聚甲基丙烯酸甲酯(Toray；Japan)(PMMA組)；和低通量纖維素(Asahi Medical；Japan)(纖維素組)。3.血漿樣品在進(jìn)行第一次血液透析前從全部126位患者中采集血漿樣品，然后在透析后每周從66位患者中采集血漿樣品。
所有這些樣品立即進(jìn)行離心分離。對(duì)在-20℃下冷凍的血漿樣品進(jìn)行如下測(cè)試4.總的戊糖啶和游離戊糖啶的定量為了對(duì)總戊糖啶進(jìn)行定量，將樣品(50μl)凍干、溶于100μl的6N HCl、用氮?dú)饷芊?，然后?10℃下培養(yǎng)16小時(shí)、用100μl的5N NaOH和200μl的0.5N磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中和、隨后通過(guò)具有0.5μ孔徑的濾膜過(guò)濾并用PBS稀釋20倍。為了對(duì)游離戊糖啶進(jìn)行定量，將樣品(50μl)與等量的10％TCA混合，然后以5000×g離心10分鐘。將上清液通過(guò)具有0.5μ孔徑的濾膜過(guò)濾并用蒸餾水稀釋4倍。
使用C18反相柱(Waters，Tokyo，Japan)、通過(guò)反相HPLC分析這些樣品各自中的戊糖啶(Miyata，T.等《美國(guó)腎臟學(xué)協(xié)會(huì)雜志》(J.Am.Soc.Nephrol.)71198-1206，1996)。使用熒光檢測(cè)器(RF-10A；Shimadzu)在激發(fā)/檢測(cè)波長(zhǎng)＝335/385nm處監(jiān)測(cè)流出液。通過(guò)使用合成戊糖啶繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
通過(guò)[血漿中總戊糖啶濃度(pmol/ml)-游離戊糖啶(pmol/ml)]/[血漿蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)]計(jì)算蛋白質(zhì)結(jié)合的戊糖啶的濃度(戊糖啶/蛋白質(zhì))(pmol/mg蛋白質(zhì))。5.患者組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析將包括定量的戊糖啶濃度在內(nèi)的相應(yīng)值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差或百分比(％)。將剩余多尿的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)變換。通過(guò)單向(one-way)方差分析(單向ANOVA)(F-檢驗(yàn))來(lái)比較使用不同透析膜的血液透析患者組之間的各個(gè)數(shù)據(jù)和戊糖啶濃度。此外，比較各組透析膜并使用Bonferroni t-檢驗(yàn)進(jìn)行分析。通過(guò)chi 2檢驗(yàn)比較不同組之間剩余多尿的程度。
在5組患者中進(jìn)行的抽樣分析結(jié)果如表1中所示。在各組之間沒(méi)有與年齡相關(guān)的顯著性差異。在A(yíng)N69組和纖維素組中的血漿蛋白質(zhì)濃度較高。在A(yíng)PS組中，透析膜的面積較大，而在本研究前的血液透析期限和單一透析期限均較長(zhǎng)。另一方面，剩余多尿在PS組中較高。
表1使用不同透析膜的5組患者的透析結(jié)果APS PS AN69PMMA纖維素ANOVAn＝29 n＝28 n＝15 n＝25 n＝29 P值年齡(歲) 58±1261±13 64±7 61±13 64±16NS血液透析期限(年) 13.7±7.5α5.4±6.87.8±6.79.2±6.55.5±4.4 ＜.001血漿蛋白質(zhì)濃度(g/dl) 6.7±0.5**6.3±0.76.8±0.66.2±0.3*7.0±0.4***＜.001血漿清蛋白濃度(g/dl) 3.9±0.3◇◇ 3.6±0.4◇ 3.9±0.4Δ 3.6±0.34.2±0.3***＜.001血液透析期限(小時(shí))4.5±0.23β3.98±0.40 4.13±0.23 4.04±0.48 4.00±0.00＜.001血液透析膜表面積(m2) 1.8 1.28±0.36 1.42±0.34 1.31±0.32 1.32±0.24ND≠剩余多尿(ml/天)幾何平均值(SD)47(10)213(250)● 34(13) 47(8) 26(8) ＜.001(范圍)(0-800) (0-3050)(0-500) (0-400) (0-400)chi2P值剩余多尿(％)§ 33％ 50％20％28％17％ ＜0.001***＝與PS和PMMA組相比P＜0.001**＝與PMMA組相比P＜0.001*＝與AN69組相比P＜0.05◇＝與APS組相比P＜0.05◇◇＝與PMMA和纖維素組相比P＜0.01Δ＝與纖維素組相比P＜0.05α＝與纖維素組相比P，0.01β＝與所有其它組相比P，0.001●＝與纖維素組相比P＝0.05≠＝不能將血液透析膜的表面積看作是隨機(jī)可變的，因?yàn)樗驯会t(yī)師固定。因此不能將它通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)進(jìn)行比較。§無(wú)尿癥患者的百分比在透析前，在A(yíng)N69、PMMA和纖維素組中，血漿中蛋白質(zhì)結(jié)合的戊糖啶和游離戊糖啶的濃度是相似的，而在PS和APS組中明顯較低。在PS組與APS組之間沒(méi)有顯著性差異(表2)。
表25種膜的組透析前戊糖啶濃度APS PSAN69 PMMA 纖維素ANOVAn＝29 n＝28 n＝15 n＝25 n＝29 P值戊糖啶/蛋白質(zhì)(pmol/mg蛋白質(zhì)) 16.2±4.8 15±6.1 25.4±8.4**23.2±9.3**21.7±6.3**＜.001游離戊糖啶(pmol/ml) 32.4±11.3 41.4±22.976.4±28.5**68.8±26.7**53.7±18.2**＜.001**＝與PS和APS組相比P＜0.01
可能影響透析前血漿戊糖啶的各種因素的單變分析表明剩余多尿顯著影響了蛋白質(zhì)結(jié)合的和游離的戊糖啶剩余多尿越高，則戊糖啶濃度越低。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)戊糖啶濃度與血漿蛋白質(zhì)濃度、清蛋白濃度、年齡、或透析史之間的相關(guān)性(表3)。關(guān)于聚砜(PS和APS組)組，使用來(lái)自Fresenius或AsahiMedical co.的聚砜膜進(jìn)行透析的比利時(shí)患者或日本患者透析前的戊糖啶濃度彼此相似(表4)。
表3戊糖啶濃度與可能解釋的連續(xù)變量之間相關(guān)性的單變分析r值多尿?qū)?shù) 總蛋白清蛋白 年齡期限戊糖啶/蛋白質(zhì) -0.28 -0.08 0 0.140.03游離戊糖啶 -0.36 0.01 -0.12 0.150.02**＝p＜0.01***＝p＜0.001表4按照不同聚砜品牌和/或患者國(guó)籍測(cè)定的聚砜組中戊糖啶濃度和剩余多尿Fresenius Fresenius Asahi P值比利時(shí) 日本 日本戊糖啶/蛋白質(zhì) 14.6±6.2 15.3±6.3 16.2±4.8 NS(pmol/mg蛋白質(zhì))游離戊糖啶(pmol/ml) 37.3±19.6 45.4±25.932.4±11.3 NS剩余多尿(ml/天) 938(23) 49(14)47(10) 0.004如上所述，認(rèn)識(shí)到使用聚砜透析膜的透析患者體內(nèi)的戊糖啶濃度低于使用其它透析膜的透析患者體內(nèi)的戊糖啶濃度。在使用聚砜膜透析的患者中觀(guān)察到了戊糖啶濃度降低，這與患者的國(guó)籍或透析膜的制造廠(chǎng)無(wú)關(guān)。此外，盡管使用Asahi Medical聚砜透析膜進(jìn)行透析的患者基本上無(wú)尿，但是戊糖啶濃度同樣也較低。在使用Fresenius聚砜膜的組中，不同戊糖啶濃度在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性并沒(méi)有發(fā)生改變，即使不考慮尿量大于300ml/分鐘的患者時(shí)也是如此。
因?yàn)锳N69也是高通量類(lèi)型的，且在使用高通量AN69和低通量纖維素AN69的透析中的透析前戊糖啶濃度表現(xiàn)出相似的結(jié)果，所以據(jù)估計(jì)戊糖啶濃度的差異與透析膜的排出容量無(wú)關(guān)。
蛋白質(zhì)校正的戊糖啶濃度或游離戊糖啶濃度與剩余多尿之間的相關(guān)性用線(xiàn)性回歸分析法來(lái)分析。通過(guò)可變選擇-多重回歸分析(Forward逐步多重回歸分析)來(lái)測(cè)試各解釋變量對(duì)依賴(lài)性變量(蛋白質(zhì)校正的戊糖啶濃度或游離戊糖啶濃度)的影響。所有的分析均使用BMDP統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件(BMDP是New System Professional Edition的商標(biāo)Statistical Solutions Inc.，Universityof California Press，Berkeley，1995)進(jìn)行。將P值小于0.05看作具有顯著性。
分析結(jié)果表明透析膜的類(lèi)型和剩余多尿是蛋白質(zhì)結(jié)合的和游離的戊糖啶濃度的僅有的兩個(gè)獨(dú)立決定因素(表5)?？紤]到這些相互作用中沒(méi)有一種是顯著的，所以剩余多尿?qū)ξ焯青舛鹊挠绊懖皇芡肝瞿ゎ?lèi)型的影響。
表5確定戊糖啶濃度的可變選擇-多重回歸分析(Forward逐步多重回歸分析)戊糖啶/蛋白質(zhì) 游離戊糖啶R增加 P值 R增加 P值膜類(lèi)型 0.53＜0.001 0.59＜0.001多尿?qū)?shù)-0.21 ＜0.001 -0.36 ＜0.001總蛋白 -0.17 NS0.05NS清蛋白 -0.05 NS-0.1NS年齡0.12NS0.16NS血液透析期限-0.01 NS-0.08 NS6.透析膜對(duì)血液透析前后戊糖啶濃度的影響為了進(jìn)一步分析透析膜對(duì)透析前戊糖啶濃度的影響機(jī)理，測(cè)定透析前后使用高通量聚砜(Fresenius)、AN69、PMMA或低通量纖維素透析膜的4組患者的戊糖啶濃度(表6)。
表6單一血液透析時(shí)間對(duì)戊糖啶濃度的影響PS AN69PMMA纖維素n＝14 n＝15 n＝9n＝28戊糖啶/蛋白質(zhì)(pmol/mg蛋白質(zhì))前14.6±6.2 25.4±8.4 24.3±8.5 21.8±6.4后13.8±6.6 23.4±5.6 22.8±8.3 22.1±5.8游離戊糖啶(pmol/ml)前37.3±19.6 76.4±28.5 70.3±2653.5±18.5后10.9±6.6 17.5±4.9 21.7±7 14.7±6.9(減小比)(％) (71±11)(76±7) (67±9) (73±6)正如由上述實(shí)驗(yàn)所預(yù)測(cè)的，蛋白質(zhì)結(jié)合的戊糖啶濃度幾乎沒(méi)有改變并且還與透析膜的類(lèi)型無(wú)關(guān)。盡管僅是游離戊糖啶濃度明顯減小，但是76％(AN69)和67％(PMMA)的百分比在所有組中是相似的。在這些組中沒(méi)有顯著性差異。因此，認(rèn)識(shí)到在使用聚砜膜的透析患者中觀(guān)察到的透析前較低的戊糖啶濃度不可能是因膜的透析容量的差異所造成的。
本發(fā)明者以前曾指出血液透析本身不會(huì)影響總戊糖啶濃度或蛋白質(zhì)結(jié)合的戊糖啶濃度(Miyata，T.等《國(guó)際腎臟學(xué)》(Kidney Int.)51880-887，1997)。這一發(fā)現(xiàn)與95％的戊糖啶與不能通過(guò)透析消除的清蛋白結(jié)合這一事實(shí)一致(Miyata，T.等《美國(guó)腎臟學(xué)協(xié)會(huì)雜志》(J.Am.Soc.Nephrol.)71198-1206，1996)。這一發(fā)現(xiàn)得到了上述使用4種不同類(lèi)型透析膜的實(shí)施例中獲得的結(jié)果的支持。相反，使用每種透析膜觀(guān)察到由血液透析減少的游離戊糖啶的量和相似現(xiàn)象。這一結(jié)果是根據(jù)游離戊糖啶的分子量(379Da)推定的。血液透析前后戊糖啶濃度就所有透析膜而言是相似的，這一事實(shí)表明在使用聚砜或其它透析膜進(jìn)行透析的過(guò)程中不僅可以發(fā)生被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)、而且可以發(fā)生對(duì)戊糖啶的吸收。使用纖維素膜或聚砜膜對(duì)放射性標(biāo)記的游離戊糖啶的吸收水平在體外是極小的且實(shí)際上沒(méi)有差異。
因此，通過(guò)聚砜膜促進(jìn)清除戊糖啶這一事實(shí)不能解釋透析前戊糖啶濃度的降低?？赡艽嬖诹硪环N可能性是使用聚砜膜進(jìn)行透析與抑制戊糖啶產(chǎn)生相關(guān)。
正如上述指出的，戊糖啶濃度反映出由碳水化合物生成的羰基中間體的濃度。聚砜膜具有清除這些羰基化合物的特殊作用，且由此它可能對(duì)戊糖啶的產(chǎn)生具有影響?；蛘哌€有一種可能性是，聚砜膜降低了被假定認(rèn)為與尿毒癥相關(guān)的氧化性應(yīng)激反應(yīng)(Miyata，T.等《國(guó)際腎臟學(xué)》(Kidney Int.)541290-1295，1998；Miyata，T.等《國(guó)際腎臟學(xué)》(Kidney Int.)511170-1181，1997；Loughrey，CM.等《藥物問(wèn)題雜志》(Q.J.Med.)87679-683，1994；Ueda等《生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊》(Biochem.Biophys.Res.Commun.)，245785-790，1998；Kumano，K.等《腹膜透析進(jìn)展》(Adv.Perit.Dial.)1992；8127-130；Witko-Sarsat，V.等《國(guó)際腎臟學(xué)》(Kidney Int.)491304-1313，1996)。還有一種可能性是，氧化性應(yīng)激反應(yīng)的降低抑制了羰基化合物產(chǎn)生，而作為結(jié)果使戊糖啶的產(chǎn)生減少了(Miyata，T.等《國(guó)際腎臟學(xué)》(Kidney Int.)511170-1181，1997)。
7.變換透析膜對(duì)戊糖啶濃度的影響為了證明聚砜的降低戊糖啶的特定作用，在進(jìn)行長(zhǎng)期(＞5年)AN69透析的3位無(wú)尿患者中進(jìn)行縱向分析。10周透析后給患者變換相似表面積的聚砜(Fresenius)透析膜，隨后將透析膜換回用AN69。每次在變換PS前2周采集透析前樣品(2份樣品)、在PS透析過(guò)程中采集樣品(5份樣品)以及在換回成AN69后14-16周采集樣品(2份樣品)。
發(fā)現(xiàn)各位患者的蛋白質(zhì)結(jié)合的戊糖啶濃度在變換成PS透析后逐步降低，隨后因換回AN69透析而使所述濃度恢復(fù)至換成PS前使用AN69時(shí)的濃度(附圖1)。
通過(guò)將AN69換成PS透析，在患者中進(jìn)行的縱向研究觀(guān)察到的戊糖啶濃度降低僅是在抽樣研究中觀(guān)察到的PS與AN69組之間差異的三分之一(與3.6pmol/mg蛋白質(zhì)相比為10.4)。這種偏差可能是由于轉(zhuǎn)換成PS透析后觀(guān)察僅持續(xù)10周所導(dǎo)致的。如果聚砜減少了戊糖啶的生成率，那么就能夠解釋蛋白質(zhì)結(jié)合的戊糖啶減少得為何如此緩慢。在這類(lèi)情況中，蛋白質(zhì)結(jié)合的戊糖啶濃度降低可能僅是由于蛋白質(zhì)代謝所導(dǎo)致的。在成功地進(jìn)行腎移植后獲得了相似的觀(guān)察結(jié)果。在這類(lèi)情況中，蛋白質(zhì)結(jié)合的戊糖啶的減少顯著慢于血漿β2-微珠蛋白的減少，從而提示這種減少發(fā)生得極其緩慢且蛋白質(zhì)結(jié)合的戊糖啶的分解極為緩慢(Miyata，T.等《國(guó)際腎臟學(xué)》(Kidney Int.)51880-887，1997；Hricik，DE.等《臨床移植》(Clin.Transplantation)10568-573，1996)。
使用已經(jīng)固定了羰基化合物捕集劑的載體清除血液中的羰基化合物將結(jié)合了磺酰肼基因的交聯(lián)聚苯乙烯樹(shù)脂(PS-TsNHNH2，ARGONAUTTECHNOLOGIES)用作羰基化合物捕集珠來(lái)研究其在清除血液中羰基化合物中的作用。在37℃下培養(yǎng)來(lái)自透析患者的血漿和那些補(bǔ)充了羰基化合物捕集劑的血漿以便測(cè)試對(duì)戊糖啶生成的抑制作用。將100μl二甲亞砜加入到含有羰基化合物捕集珠的試管中使該珠粒膨脹，然后向其中加入來(lái)自透析前患者的過(guò)濾滅菌的血漿。在37℃下將該混合物培養(yǎng)1周。在培養(yǎng)后，用具有0.22μm孔徑的離心濾膜(微孔，UFC30GV00)除去所述的珠。接下來(lái)將50μl的10％三氟乙酸加入到50μl不含所述珠的溶液中并將該混合物離心沉淀出蛋白質(zhì)。將產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀用300μl的5％三氟乙酸洗滌且然后干燥。隨后將100μl的6N HCl加入到所述沉淀中并在110℃下加熱16小時(shí)，而接著通過(guò)HPLC對(duì)戊糖啶進(jìn)行定量(Miyata，T.等1996，《美國(guó)腎臟學(xué)協(xié)會(huì)雜志》(J.Am.Soc.Nephrol.)71198-1206；Miyata，T.等1996，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)932353-2358)。
在37℃下的培養(yǎng)過(guò)程中生成的戊糖啶的量如附圖2中所示。發(fā)現(xiàn)加羰基化合物捕集珠抑制了戊糖啶的生成。此外，對(duì)戊糖啶生成的抑制作用取決于所加羰基化合物捕集劑的量。
這些結(jié)果表明可以用已經(jīng)固定了羰基化合物捕集劑的載體除去血液中的羰基化合物。此外，認(rèn)識(shí)到聚砜膜是一種特別適合于改善羰基化合物的應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)的血液透析膜。
使用活性炭從二羰基化合物溶液中清除羰基化合物將已經(jīng)各自溶于PBS(-)的乙二醛、甲基乙二醛和3-脫氧葡糖醛酮(各100μM)的900μl二羰基溶液加入到含有25mg或50mg活性炭(Wako PureChemical Industries)的試管中并在室溫下用旋轉(zhuǎn)器將該混合物攪拌19小時(shí)。然后用具有0.22μm孔徑的離心濾管(微孔，UFC30GV00)過(guò)濾該溶液并通過(guò)高效液相層析測(cè)定濾液中乙二醛、甲基乙二醛和3-脫氧葡糖醛酮的濃度。
當(dāng)將900μl二羰基溶液加入到25mg活性炭中時(shí)，捕集了71％的乙二醛、96％的甲基乙二醛和97％的3-脫氧葡糖醛酮。當(dāng)使用50mg活性炭時(shí)，捕集了85％的乙二醛、98％的甲基乙二醛和98％的3-脫氧葡糖醛酮(附圖3)。
使用活性炭從腹膜透析液中清除二羰基化合物由于腹膜透析液通常含有高濃度的葡萄糖，所以在滅菌或儲(chǔ)存過(guò)程中產(chǎn)生葡萄糖衍生的羰基化合物。這些羰基化合物在透析過(guò)程中被轉(zhuǎn)入活體內(nèi)，它是導(dǎo)致羰基應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)的一個(gè)因素。因此，本發(fā)明羰基化合物捕集劑在從腹膜透析液中清除羰基化合物的作用得到了評(píng)價(jià)。
將900μl腹膜透析液(Baxter Ltd.；Dianeal PD-4，1.5)加入到含有25mg或50mg活性炭的試管中并在室溫下用旋轉(zhuǎn)器將該混合物攪拌19小時(shí)。然后用具有0.22μm孔徑大小的離心濾管(微孔，UFC30GV00)過(guò)濾該溶液并通過(guò)高效液相層析測(cè)定濾液中乙二醛、甲基乙二醛和3-脫氧葡糖醛酮的濃度。
當(dāng)將900μl腹膜透析液加入到25mg活性炭中時(shí)，捕集了56％的乙二醛、71％的甲基乙二醛和62％的3-脫氧葡糖醛酮。當(dāng)將900μl腹膜透析液加入到50mg活性炭中時(shí)，捕集了64％的乙二醛、78％的甲基乙二醛和77％的3-脫氧葡糖醛酮(附圖4)。
在37℃下培養(yǎng)來(lái)自透析患者的血漿時(shí)活性炭對(duì)戊糖啶生成的抑制作用將來(lái)自透析前透析患者的250μl過(guò)濾滅菌的血漿加入到含有12mg懸浮在PBS(-)中的活性炭的試管中并在37℃下將該混合物培養(yǎng)1周。在培養(yǎng)后，將50μl的12N HCl加入到50μl通過(guò)離心獲得的上清液中并在110℃下將該混合物加熱16小時(shí)以便水解。然后通過(guò)高效液相層析對(duì)戊糖啶進(jìn)行定量(Miyata，T.等1996，《美國(guó)腎臟學(xué)協(xié)會(huì)雜志》(J.Am.Soc.Nephrol.)71198-1206；Miyata，T.等1996，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)932353-2358)。
通過(guò)在37℃下培養(yǎng)生成的戊糖啶的量如附圖5中所示。當(dāng)與對(duì)照樣品進(jìn)行比較時(shí)，通過(guò)加活性炭抑制了51％的戊糖啶生成。這提示活性炭吸附了屬于戊糖啶前體的羰基化合物。
使用活性炭從血漿中清除羰基化合物將來(lái)自腎衰竭患者的500μl血漿加入到含有20或50mg活性炭(WakoPure Chemical Industries)的試管中，然后在室溫下將該化合物用旋轉(zhuǎn)器攪拌12小時(shí)。在通過(guò)離心分離出活性炭后，通過(guò)高效液相層析測(cè)定血漿中乙二醛和甲基乙二醛的濃度。
如下測(cè)定血漿中乙二醛和甲基乙二醛的濃度首先，將300μl的0.67M高氯酸加入到200μl血漿中，然后將該混合物攪拌并離心分離上清液。將20μl的1％鄰苯二胺和50μl的10μM 2，3-丁二酮(內(nèi)標(biāo))加熱到150μl所述上清液中。將該混合物攪拌并在25℃下培養(yǎng)1小時(shí)。根據(jù)Ohmori等所述的方法(Ohmori，S.等《層析雜志》(J.Chromatogr.)414149-155，1987)分離由乙二醛或甲基乙二醛與鄰苯二胺之間的反應(yīng)產(chǎn)生的喹喔啉衍生物以便使用反相柱的HPLC進(jìn)行定量。
結(jié)果如附圖6中所示。當(dāng)將20mg活性炭加入到血漿中時(shí)，捕集了58％的乙二醛和65％的甲基乙二醛。當(dāng)加入50mg活性炭時(shí)，捕集了75％的乙二醛和80％的甲基乙二醛。[實(shí)施例7]使用磺酰肼連接的聚苯乙烯珠粒(Ps-TsNHNH2)從血漿中清除羰基化合物將來(lái)自腎衰竭患者的500μl血漿加入到含有10或20mg連接了磺酰肼的聚苯乙烯珠的試管中，然后在室溫下將該混合物用旋轉(zhuǎn)器攪拌12小時(shí)。在通過(guò)離心分離出磺酰肼連接的聚苯乙烯珠后，按照與實(shí)施例6中相同的方法、通過(guò)高效液相層析測(cè)定血漿中乙二醛和甲基乙二醛的濃度。結(jié)果如附圖6中所示。當(dāng)將10mg磺酰肼連接的聚苯乙烯珠加入到血漿中時(shí)，捕集了45％的乙二醛和39％的甲基乙二醛。當(dāng)加入20mg磺酰肼連接的聚苯乙烯珠時(shí)，捕集了均為75％的乙二醛和甲基乙二醛。
使用氨基胍從血漿中清除羰基化合物將氨基胍(50mM或100mM)溶于0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)所得到的50μl溶液與來(lái)自腎衰竭患者的450μl血漿混合并將所得的混合物在室溫下保持12小時(shí)。12小時(shí)后，按照與實(shí)施例6中相同的方法、通過(guò)高效液相層析測(cè)定血漿中乙二醛和甲基乙二醛的濃度。
結(jié)果如附圖7中所示。當(dāng)?shù)窖獫{中氨基胍的濃度為5mM時(shí)，捕集了50％的乙二醛和46％的甲基乙二醛。當(dāng)氨基胍的濃度為10mM時(shí)，捕集了58％的乙二醛和70％的甲基乙二醛。
使用已經(jīng)固定了羰基化合物捕集劑的載體清除羰基化合物使用連接二氨基胍的聚酰胺評(píng)價(jià)已經(jīng)固定了羰基化合物捕集劑的載體在清除羰基化合物中的作用。通過(guò)使聚酰胺與表氯醇反應(yīng)并向其中添加二氨基胍水溶液(pH12)、隨后在80℃下培養(yǎng)約1小時(shí)來(lái)制備二氨基胍連接的聚酰胺(附圖8)。在反應(yīng)完成后，用水洗滌所得的二氨基胍連接的聚酰胺且然后將其干燥以用于隨后的實(shí)驗(yàn)。
將1ml二羰基化合物溶液(乙二醛、甲基乙二醛、3-脫氧葡糖醛酮；在PBS(pH7.4)中各為1μM)加入到含有30mg二氨基胍連接的聚酰胺的試管。在室溫下(25℃)將該混合物用旋轉(zhuǎn)器攪拌5小時(shí)并將它們中的100μl離心。將上清液中殘余的乙二醛、甲基乙二醛、3-脫氧葡糖醛酮轉(zhuǎn)化成其衍生物并通過(guò)高效液相層析測(cè)定。結(jié)果如附圖9中所示，捕集了30％的乙二醛、56％的甲基乙二醛和11％的3-脫氧葡糖醛酮。當(dāng)將不含二氨基胍的聚酰胺用作相同條件下的陰性對(duì)照時(shí)，沒(méi)有檢測(cè)到上述羰基化合物捕集作用。
上述結(jié)果證明實(shí)驗(yàn)已經(jīng)固定了羰基化合物捕集劑的載體可以從所述液體中有效地除去羰基化合物。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明能夠有效地清除血液中的羰基化合物。用于改善羰基應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)的本發(fā)明活性劑可以通過(guò)將其固定在血液透析用透析膜上，或者將其固定在其它載體上并將其置于血液循環(huán)中而可方便地使用。因此，本發(fā)明能夠緩解由來(lái)自長(zhǎng)期患腎衰竭患者的羰基化合物所導(dǎo)致的危害(即羰基應(yīng)激反應(yīng))。
權(quán)利要求
1.一種可除去血液中羰基化合物的羰基化合物捕集劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羰基化合物捕集劑，其中所述的捕集劑用于血液透析。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羰基化合物捕集劑，其中將所述的捕集劑固定在不溶于血液的載體上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的羰基化合物捕集劑，其中所述的載體是一種透析膜。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的羰基化合物捕集劑，其中所述的透析膜是一種聚砜膜。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羰基化合物捕集劑，其中所述的羰基化合物捕集劑是一種美拉德反應(yīng)抑制劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的羰基化合物捕集劑，其中所述的美拉德反應(yīng)抑制劑含有至少一種選自氨基胍、吡哆胺、肼、含SH基的化合物、及其衍生物組成的組的化合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羰基化合物捕集劑，其中所述的捕集劑含有一種不溶于血液的化合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的羰基化合物捕集劑，其中所述的不溶于血液的化合物含有至少一種選自離子交換樹(shù)脂、活性炭、硅膠、氧化鋁和碳酸鈣組成的組的化合物。
10.一種用于改善活體內(nèi)羰基應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)的試劑，其中所述的試劑含有一種羰基化合物捕集劑作為活性組分。
11.一種用于改善血液中羰基應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)的試劑，其中所述的試劑含有一種羰基化合物捕集劑作為活性組分。
12.權(quán)利要求11的一種用于改善羰基應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)的試劑，其中將所述的試劑固定在血液循環(huán)中。
13.權(quán)利要求11的一種用于改善羰基應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)的試劑，其中所述的羰基化合物捕集劑是一種美拉德反應(yīng)抑制劑。
14.權(quán)利要求13的一種用于改善羰基應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)的試劑，其中所述的美拉德反應(yīng)抑制劑包括至少一種選自氨基胍、吡哆胺、肼、含SH基的化合物及其衍生物組成的組的化合物。
15.一種用于改善羰基應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)的方法，其中所述的方法包括使血液循環(huán)中患者的血液與一種羰基化合物捕集劑接觸的步驟。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的方法包括將所述的羰基化合物捕集劑固定在不溶于血液的載體上的步驟。
全文摘要
含在患者血液中的羰基化合物可通過(guò)使該血液與羰基化合物的捕集劑接觸而有效地除去,由此可以緩解因該化合物而導(dǎo)致的疾病(例如羰基應(yīng)激反應(yīng))。
文檔編號(hào)A61K31/00GK1356912SQ00809291
公開(kāi)日2002年7月3日 申請(qǐng)日期2000年5月11日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月12日
發(fā)明者宮田敏男 申請(qǐng)人:宮田敏男, 黑川清