專利名稱：人聚(adp－核酸)聚合酶2的物質(zhì)和方法
本申請要求1999年6月16日提交的美國臨時(shí)申請系列號(hào)60/139,543的權(quán)益。
本發(fā)明總體上涉及具有聚(ADP-核糖)聚合酶活性的人多肽，編碼該多肽的多核苷酸，以及應(yīng)用這些物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
真核細(xì)胞的基因功能調(diào)控是通過多種機(jī)制發(fā)生的。這些機(jī)制包括基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、mRNA翻譯調(diào)控，以及蛋白質(zhì)的翻譯后修飾。蛋白質(zhì)的翻譯后修飾包括幾種方法，如共價(jià)改變蛋白質(zhì)以影響其細(xì)胞、亞細(xì)胞定位，穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)運(yùn)，相互作用的特異性，酶活性，以及多種其他特征。
比較常見并得到廣泛研究的共價(jià)修飾方法包括乙酰化、糖基化和磷酸化。了解較少的一種方法包括在靶蛋白上共價(jià)添加ADP-核糖聚合物。該聚合物被定義為“聚(ADP-核糖)”，導(dǎo)致此活性的酶被稱為聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)，聚(ADP-核糖)合成酶(PARS)或ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶(ADPRT)[Althaus and Richter，ADP-Ribosylation ofProteinsEnzymology and Biochemical Significance，MolecularBiochemistry and Biophysics，Springer-Verlag(1987)]。一種以前鑒定的PARP基因產(chǎn)物(以下稱為PARP1)在細(xì)胞核中高水平表達(dá)，其活化有賴于DNA損傷[Szabo and Dawson，Trends Pharmacol Sci 19(7)287-98(1998)]。目前的模型假設(shè)，PARP1通過DNA結(jié)合功能區(qū)的氨基末端與斷裂的單鏈或雙鏈DNA結(jié)合。這種結(jié)合激活了催化功能區(qū)的羧基末端，并導(dǎo)致靶分子ADP-核糖聚合物的形成。PARP1本身由于具有位于中央部位的自動(dòng)修飾功能區(qū)而稱為聚ADP-核糖化的靶作用底物。PARP1的核糖化導(dǎo)致PARP1分子從DNA上脫離。結(jié)合、核糖化和脫離的全過程進(jìn)行非常迅速。業(yè)已顯示，PARP1與DNA損傷位點(diǎn)的短暫結(jié)合可能導(dǎo)致DNA修復(fù)機(jī)制的恢復(fù)，或者通過抑制重組分子過長來恢復(fù)修復(fù)機(jī)制[Satoh and Lindahl，Nature，356(6367)356-8(1992)]。
PARP反應(yīng)的ADP-核糖來源是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)。細(xì)胞中NAD的合成來源于細(xì)胞ATP儲(chǔ)備，因此PARP活性的高水平激活可以導(dǎo)致細(xì)胞能源儲(chǔ)備的迅速耗竭。業(yè)已顯示，誘導(dǎo)PARP活性可以導(dǎo)致細(xì)胞死亡，所述細(xì)胞死亡與細(xì)胞NAD和ATP儲(chǔ)備的耗竭相關(guān)[Yamamoto et al.，Nature 294(5838)284-6(1981)；Sims et al.，Biochemistry 22(22)5188-94(1983)]。在氧化應(yīng)激或炎癥的多種情況下，可以誘導(dǎo)PARP活性。例如，在缺血組織再灌注過程中，可以產(chǎn)生反應(yīng)性一氧化氮，而一氧化氮可以導(dǎo)致額外反應(yīng)性氧化物的產(chǎn)生，所述氧化物包括過氧化氫、過氧化氮和羥基[Szabo，Eur J Pharmacol 350(1)1-19(1998)]。這些后述氧化物可以直接損傷DNA，而所述損傷可以誘導(dǎo)PARP活性的激活。通常情況下，發(fā)生PARP活性的充分激活似乎可以導(dǎo)致細(xì)胞能源儲(chǔ)備的耗竭，并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
相信在炎癥過程中也是相似的機(jī)制發(fā)揮作用，在該過程中，內(nèi)皮細(xì)胞和前炎癥細(xì)胞合成一氧化氮，導(dǎo)致周圍細(xì)胞DNA氧化損傷，然后導(dǎo)致PARP活性的激活[Szabo 1998，如上]。在與一過性腦缺血有關(guān)的組織損傷中，相信該機(jī)制也發(fā)揮一定作用，在這種情況下，過量NMDA受體的激活介導(dǎo)了DNA損傷，而DNA損傷則誘導(dǎo)了PARP的過量激活[Lo et al.，Stroke 29830-6(1998)]。相信由PARP激活導(dǎo)致的細(xì)胞死亡是組織損傷程度的主要決定因素，所述組織損傷由缺血/再灌注損傷或炎癥導(dǎo)致。
有兩個(gè)證據(jù)提示，在這些過程中，PARP活性是關(guān)鍵因素。首先，業(yè)已成功應(yīng)用PARP活性化學(xué)抑制劑降低缺血/再灌注或炎癥動(dòng)物模型的組織損傷。其次，兩個(gè)PARP1等位基因失能的小鼠(敲除PARP1的小鼠)可以抵抗多種形式的缺血/再灌注損傷和炎癥的有害影響。由于這些觀察，有效的PARP活性小分子抑制劑作為臨床備選藥物，在幾種適應(yīng)證中具有很大的應(yīng)用潛力。
從敲除PARP1小鼠獲得的實(shí)驗(yàn)資料提示，PARP1功能抑制劑可能具有臨床利益。但是，近期的一項(xiàng)報(bào)導(dǎo)顯示，敲除PARP1小鼠不能避免DNA損傷誘導(dǎo)的PARP活性[Shieh et al.，J Biol Chem 273(46)30069-72(1998)]。業(yè)已顯示，一種近期鑒定的基因產(chǎn)物tankyrase，具有聚(ADP)核糖化活性[Smith et al.，Science 282(5393)1484-7(1998)]。但是，DNA損傷似乎不能誘導(dǎo)tankyrase活性，因此，tankyrase活性可能并不能說明在敲除PARP1小鼠中觀察到的活性。業(yè)已顯示，在敲除PARP1小鼠中，殘余DNA損傷誘導(dǎo)的PARP活性可能是由于存在第二個(gè)PARP基因的活性，所述第二個(gè)基因已在小鼠中得到鑒定，并被命名為鼠PARP2[Shieh et al.(1998)，如上]。哺乳動(dòng)物中存在多種PARP基因提示，適于人類治療應(yīng)用的藥物設(shè)計(jì)需要鑒定其他具有PARP活性的人類基因產(chǎn)物?？膳c鼠PARP2相比的基因還未在人類中得到鑒定。
考慮到上述事項(xiàng)，很明顯，一些現(xiàn)存知識(shí)是匱乏的，包括有關(guān)細(xì)胞DNA修復(fù)的機(jī)制、由于DNA損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和信號(hào)、炎癥的機(jī)制和炎癥介導(dǎo)性疾病狀態(tài)的治療。因此，本領(lǐng)域存在一種需求，即鑒定其他的人類PARP樣分子，用于決定篩選設(shè)計(jì)用來抑制PARP功能的治療制劑，以及作為靶底物干預(yù)治療人類疾病。其他PARP基因產(chǎn)物的PARP抑制劑的特征考慮到PARP選擇性藥物，所述藥物對特定適應(yīng)證有益，可以降低不需要的副作用，或者將治療制劑定向到所選組織。同樣的，hPARP2的鑒定也考慮到hPARP2特異性治療制劑的研發(fā)，所述治療制劑對某些疾病適應(yīng)證有益，可以降低不需要的副作用，或者將治療制劑定向到特定組織。人類hPARP2的鑒定也考慮到藥物的研發(fā)，所述藥物具有抑制兩種PARP活性的能力，因而具有治療利益。本發(fā)明的其他目的和優(yōu)勢對本領(lǐng)域具有一般技術(shù)的技術(shù)人員來說是顯而易見的。
發(fā)明簡述業(yè)已發(fā)現(xiàn)，這些和其它目的可以通過本發(fā)明達(dá)成，一方面，本發(fā)明是一種純化分離的hPARP2多肽，所述多肽包括序列2定義的氨基酸序列，或其功能衍生物。本發(fā)明還包括由一種多核苷酸編碼的hPARP2多肽，所述多核苷酸在嚴(yán)格(中度或高度)條件下可以與序列2公開的多核苷酸互補(bǔ)鏈雜交，或者該多核苷酸在嚴(yán)格(中度或高度)條件下可以與編碼序列1公開的多肽的多核苷酸互補(bǔ)鏈雜交。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明還進(jìn)一步提供了編碼序列2定義的hPARP2多肽的多核苷酸。優(yōu)選地，該多核苷酸包括序列1定義的核苷酸序列。此外，編碼hPARP2多肽的多核苷酸可以在中等嚴(yán)格的雜交條件下，與序列1多核苷酸的編碼鏈或非編碼鏈雜交，或者能夠與編碼序列2公開多肽的多核苷酸互補(bǔ)鏈雜交。在優(yōu)選情形下，該多核苷酸在嚴(yán)格(中度或高度)的雜交條件下，能夠與序列1定義的多核苷酸的互補(bǔ)鏈雜交，并編碼一種具有聚(ADP)聚合酶活性或能與損傷DNA相互作用的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA分子，也可以是RNA分子，并可進(jìn)一步可選地包括一種可檢測的標(biāo)記部分。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括hPARP2編碼多核苷酸的表達(dá)構(gòu)建物，所述多核苷酸具有序列1定義的核苷酸序列，或者能夠與編碼序列2公開多肽的多核苷酸互補(bǔ)鏈雜交。hPARP2編碼多核苷酸可以與異源啟動(dòng)子操作性連接。本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染了基于hparp2表達(dá)構(gòu)建物的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供了制備具有序列2定義的氨基酸序列的多肽的方法，包括以下步驟a)在適于多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)表達(dá)hPARP2的宿主細(xì)胞；并b)從宿主細(xì)胞或培養(yǎng)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中分離多肽。
本發(fā)明還進(jìn)一步提供了可以與本文描述的hPARP2多肽發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗體。本文應(yīng)用的“特異性免疫反應(yīng)”抗體包括那些只識(shí)別本發(fā)明多肽(或下述抗體)的抗體。所述抗體可以選自單克隆抗體、多克隆抗體、單鏈抗體(scFv抗體)、嵌合抗體、多功能/多特異性抗體、人源化抗體、人類抗體、CDR-移植物抗體、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、雙抗體(diabodies)、線形抗體、單鏈抗體分子、以及由多個(gè)抗體片段構(gòu)成的多特異性抗體。本發(fā)明還提供產(chǎn)生這些抗體的細(xì)胞系。與hPARP2特異性抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗獨(dú)特型抗體也在考慮之列。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了鑒定hPARP2多肽特異性結(jié)合配體的方法，包括a)在一定條件下，將hPARP2多肽與待測化合物混和，所述條件允許待測化合物與hPARP2多肽結(jié)合；b)檢測待測化合物與hPARP2多肽的結(jié)合；并c)鑒定待測化合物是hPARP2多肽的特異性結(jié)合配體。
特異性結(jié)合配體優(yōu)選是一種能夠修飾hPARP2多肽生物活性的化合物。因此，特異性結(jié)合配體可以是抑制hPARP2多肽生物活性的化合物。此外，特異性結(jié)合配體可以是增強(qiáng)hPARP2多肽生物活性的化合物。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了鑒定hparp2多核苷酸特異性結(jié)合配體的方法，包括a)在一定條件下，將hparp2多核苷酸與待測化合物混和，所述條件允許待測化合物與hparp2多核苷酸結(jié)合；b)檢測待測化合物與hparp2多核苷酸的結(jié)合；并c)鑒定待測化合物是hparp2多核苷酸的特異性結(jié)合配體。
因此，通過該方法鑒定的特異性結(jié)合配體優(yōu)選是一種可以修飾hPARP2多肽表達(dá)的化合物。所述特異性結(jié)合配體可以是抑制hPARP2多肽表達(dá)的化合物，也可以是增強(qiáng)hPARP2多肽表達(dá)的化合物。
而且，在另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了一種治療由聚(ADP-核糖)聚合酶介導(dǎo)的人類疾病的方法，包括給研究對象應(yīng)用有效劑量的hPARP2抑制化合物，該劑量可以有效抑制研究對象的hPARP2活性。該方法進(jìn)一步包括給研究對象應(yīng)用有效劑量的hPARP1抑制化合物，該劑量可以有效抑制研究對象的hPARP1活性。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種治療人類疾病的方法，所述疾病選自炎癥性疾病、神經(jīng)病變、心血管疾病和新生組織生長紊亂。疾病優(yōu)選是一種炎癥性疾病，或者與炎癥細(xì)胞的激活有關(guān)。例如，疾病可以是以再灌注損傷為特征的疾病。以再灌注損傷為特征的示例性疾病包括缺血性腦卒中，出血性休克，心肌缺血或心肌梗塞，移植和腦血管痙攣。其他與炎癥細(xì)胞激活有關(guān)并可根據(jù)本發(fā)明方法治療的疾病包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，骨關(guān)節(jié)炎，痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎，脊柱炎；Behcet?。荒摱狙Y，感染性休克，內(nèi)毒素性休克，革蘭陰性菌膿毒血癥，革蘭陽性菌膿毒血癥，中毒性休克綜合征；繼發(fā)于敗血癥、創(chuàng)傷或出血的多器官損傷綜合征；過敏性結(jié)膜炎，春季結(jié)膜炎，葡萄膜炎，甲狀腺相關(guān)性眼??；嗜酸性粒細(xì)胞肉芽腫；哮喘，慢性支氣管炎，過敏性鼻炎，ARDS，慢性阻塞性肺病，硅肺，肺結(jié)節(jié)病，胸膜炎，齒槽炎，脈管炎，肺炎，支氣管擴(kuò)張，肺氧毒性；心肌、腦或四肢的再灌注損傷；囊性纖維化；瘢痕疙瘩形成，瘢痕組織形成；動(dòng)脈硬化；系統(tǒng)性紅斑狼瘡，自身免疫性甲狀腺炎，多發(fā)性硬化；雷諾綜合征；移植物抗宿主病，同種移植物排斥反應(yīng)；慢性腎小球性腎炎；炎癥性腸病，局限性回腸炎，潰瘍性結(jié)腸炎，壞死性小腸結(jié)腸炎；炎癥性皮膚病，接觸性皮炎，遺傳性過敏性皮炎，銀屑病，風(fēng)疹，感染導(dǎo)致的發(fā)熱和肌痛；腦膜炎，腦炎，由于輕微損傷導(dǎo)致的腦、脊髓損傷；Sjogren’s綜合征；涉及白細(xì)胞滲出的疾病；酒精性肝炎；細(xì)菌性肺炎；抗原抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾??；低血容量性休克；I型糖尿??；急性和遲發(fā)性過敏反應(yīng)；由于白細(xì)胞不調(diào)或轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的疾病狀態(tài)；熱損傷；粒細(xì)胞輸注相關(guān)性綜合征；以及細(xì)胞因子誘導(dǎo)的毒性。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了抑制細(xì)胞中聚(ADP-核糖)聚合酶活性的方法，包括將所述細(xì)胞與有效劑量的hPARP2拮抗劑混和，所述劑量可以有效抑制hPARP2多肽的表達(dá)或活性。
本發(fā)明的這些和其他特征及優(yōu)勢將由下面公開的細(xì)節(jié)描述和實(shí)施例給予評價(jià)。本文提供的細(xì)節(jié)描述和實(shí)施例旨在加深對本發(fā)明的理解，而非有意限制本發(fā)明的范圍。
優(yōu)選實(shí)施例詳述通常，本發(fā)明涉及先前未知特征的核酸，該核酸編碼一種新的人類蛋白，其命名為“人聚(ADP-核糖)聚合酶2”(以下簡稱為“hPARP2”)。本文例示的hPARP2與已知蛋白都具有聚(ADP-核糖)聚合酶活性。本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)，包括編碼hPARP2蛋白的新基因，和核酸序列，寡核苷酸，片段，及其反義分子。
本發(fā)明提供的核苷酸序列信息，可以通過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)和常用方法，使編碼的hPARP2多肽大規(guī)模表達(dá)成為可能。本發(fā)明還可通過眾所周知的技術(shù)，鑒定、分離編碼hPARP2相關(guān)多肽的多核苷酸，所述技術(shù)包括Southern (DNA)和/或northern(mRNA)雜交，以及擴(kuò)增技術(shù)，如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，連接酶鏈反應(yīng)(LCR)等。相關(guān)多肽的示例包括人類和非人類parp2基因組序列，包括等位基因變異以及多核苷酸，所述多核苷酸編碼hPARP2同源多肽，或編碼與hPARP2共享一種或多種生物、免疫和/或物理特性的結(jié)構(gòu)相關(guān)性多肽。
本發(fā)明包括天然和非天然hPARP2多核苷酸及其多肽產(chǎn)物。天然hPARP2產(chǎn)物包括在人類中天然存在的hPARP2種類的多核苷酸和多肽。但是，本發(fā)明還包括通過序列同源性分析定義的其他種類的人類hPARP2。本發(fā)明還進(jìn)一步包括在其他種類動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的人類hPARP2同系化合物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物同系化合物，更優(yōu)選靈長類動(dòng)物同系化合物。在每種hPARP2種類中，本發(fā)明還進(jìn)一步提供了剪接變異體，該變異體由相同的基因組DNA編碼，但由不同的mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物得來。非天然hPARP2產(chǎn)物包括天然hPARP2產(chǎn)物的變異體，如多核苷酸類似物和多肽類似物(即，添加、取代或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸)。非天然hPARP2產(chǎn)物還包括共價(jià)修飾的hPARP2產(chǎn)物，如水溶性聚合物修飾，糖基化變異體等。
hPARP2多肽和編碼該多肽的核酸為正確而迅速的診斷方法提供了基礎(chǔ)，所述診斷方法可用于探測和/或定量hPARP2表達(dá)，以及診斷與hPARP2活性過量或不足相關(guān)的疾病。而且，本文公開的核苷酸序列還可用于探測編碼hPARP2的基因畸變，如突變和缺失。例如，本文公開的核苷酸序列可用來鑒定、分離hparp2的基因組序列。PCR引物可以根據(jù)基因組hparp2核酸序列的內(nèi)含子和外顯子的多個(gè)部分進(jìn)行設(shè)計(jì)，這樣，可以檢測基因組序列的畸變。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了應(yīng)用hPARP2和經(jīng)基因工程學(xué)修飾的表達(dá)重組hPARP2的宿主細(xì)胞來評價(jià)、篩查聚(ADP-核糖)聚合酶活性調(diào)節(jié)子的方法。這些篩查方法可用來鑒定hPARP2活性的變構(gòu)類似物和拮抗劑，以及鑒定這種活性的直接作用物(如競爭性抑制劑)。hPARP2蛋白的拮抗劑和抑制劑，如抗hPARP2抗體和hparp2反義分子，為治療和改善與聚(ADP-核糖)聚合酶活性過強(qiáng)有關(guān)的癥狀提供了藥物組合物的基礎(chǔ)。而hPARP2的類似物則為治療和改善與聚(ADP-核糖)聚合酶活性不足有關(guān)的癥狀提供了藥物組合物的基礎(chǔ)。hparp2多核苷酸本發(fā)明提供了編碼人類hPARP2多肽的新的純化、分離多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸包括DNA序列和RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，正義鏈和互補(bǔ)反義鏈，及其剪接變異體。本發(fā)明的DNA序列包括但不限于cDNA和基因組序列。本文應(yīng)用的小寫“hparp2”指核酸序列，而大寫“hPARP2”指氨基酸序列。
本文應(yīng)用的“核酸”是指寡核苷酸或多核苷酸序列，及其片段或部分，以及源于基因組或合成的DNA或RNA，可以是雙鏈，也可以是單鏈，可以代表正義鏈，也可以代表反義鏈。根據(jù)本發(fā)明的一種示例雙鏈多核苷酸，具有一條編碼hPARP2多肽序列的第一條鏈(即編碼鏈)，以及根據(jù)Watson-Crick的DNA堿基配對原則從第一條鏈推導(dǎo)出的第二條鏈(即“互補(bǔ)”或“非編碼”鏈)。雙鏈或“雙重”結(jié)構(gòu)可以是DNADNA，DNARNA或RNARNA核酸。優(yōu)選的雙鏈多核苷酸是具有序列1定義的核苷酸序列的cDNA。根據(jù)本發(fā)明的一種示例單鏈多核苷酸是編碼hPARP2多肽的信使RNA(mRNA)。另一種示例單鏈多核苷酸是一種寡核苷酸探針或引物，可以與序列1定義的多核苷酸的編碼鏈或非編碼鏈雜交。其他一些核酸結(jié)構(gòu)，如三重結(jié)構(gòu)，也在考慮之列。
本發(fā)明的基因組DNA含有hPARP2多肽的蛋白編碼區(qū)，并包括本發(fā)明優(yōu)選多核苷酸的等位基因變異體，如單核苷酸多態(tài)性。本發(fā)明基因組DNA與編碼非hPARP2多肽的基因組DNAs的區(qū)別在于，本發(fā)明基因組DNA包括在本發(fā)明hparp2 cDNA中發(fā)現(xiàn)的hPARP2編碼區(qū)?；蚪MDNA可以轉(zhuǎn)錄成RNA，獲得的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)過一次或多次剪接，除去轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子(即非編碼區(qū))，或“剪除”。通過不同機(jī)制進(jìn)行剪接并導(dǎo)致不同非編碼RNA序列被剪除，但仍然編碼hPARP2多肽的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，在本領(lǐng)域稱為“剪接變異體”，包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明所指的剪接變異體由相同的DNA編碼，但產(chǎn)生不同的氨基酸序列。這些剪接變異體可以包括閱讀框移碼區(qū)，這樣，RNA序列的下游部分翻譯發(fā)生變化，在最終獲得的多肽中，氨基酸序列也發(fā)生變化。本領(lǐng)域眾所周知，等位基因變異體是野生型(主要)基因序列的修飾形式。這些修飾來源于在染色體分離或暴露于導(dǎo)致基因突變的條件下產(chǎn)生的重組。等位基因變異體與野生型基因一樣，是天然序列，與非天然變異體不同，后者是經(jīng)體外處理獲得的。
本發(fā)明還包括cDNA，通過逆轉(zhuǎn)錄編碼hPARP2的RNA多核苷酸，然后合成互補(bǔ)鏈作為第二條鏈，最終形成雙鏈DNA。例如，本發(fā)明提供了一種cDNA序列，該序列編碼具有序列2定義的氨基酸序列的多肽。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括序列1定義的核苷酸序列的多核苷酸。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼多肽的多核苷酸，所述多肽包括序列2定義的氨基酸序列的49-583氨基酸，并優(yōu)選1-583氨基酸。此外，本發(fā)明還提供編碼多肽的多核苷酸，所述多肽包括序列2定義的氨基酸序列的1-49氨基酸。涉及本發(fā)明該方面的示例多核苷酸包括含有序列1定義的核苷酸序列的至少209-1811核苷酸的多核苷酸，優(yōu)選63-1811核苷酸的多核苷酸。多核苷酸的另一個(gè)示例包括序列1定義的核苷酸序列的1-209或63-209核苷酸。優(yōu)選地，所述多核苷酸編碼hPARP2多肽或具有hPARP2催化活性的片段。
應(yīng)該指出，根據(jù)本發(fā)明，高度優(yōu)選的核酸序列被定義為序列1。但是，由于遺傳密碼在其信息編碼方面是冗余或“變性”的，因此，不同的核苷酸序列可以編碼相同的多肽序列。因此，本發(fā)明包括其他(變性)核苷酸序列，所述序列編碼本發(fā)明hPARP2多肽，或其功能等價(jià)物。例如，本發(fā)明包括多種多核苷酸，所述多核苷酸含有與序列1 hparp2序列基本同源的核苷酸序列。更具體的說，本發(fā)明包括的多核苷酸，其相應(yīng)的核苷酸序列與序列1定義的核苷酸序列至少90％一致，優(yōu)選至少95％一致，更優(yōu)選至少98％一致，更優(yōu)選至少99％一致。
本發(fā)明多核苷酸變異體還進(jìn)一步包括序列1定義的核苷酸序列的片段及其同系化合物。編碼hPARP2多肽的全長多核苷酸序列的公開，使本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可以獲得全長多核苷酸的每一個(gè)可能片段。優(yōu)選地，本發(fā)明多核苷酸片段含有hPARP2編碼核苷酸序列的特異序列，因此，可以在高度嚴(yán)格或中度嚴(yán)格的條件下，只(即特異地)與含有該特異序列的編碼hPARP2的多核苷酸或其片段雜交。本發(fā)明基因組序列的多核苷酸片段不僅包括編碼區(qū)的特異序列，而且包括全長序列的片段，該全長序列源于內(nèi)含子、調(diào)控區(qū)和/或其他非翻譯序列。本發(fā)明多核苷酸特異序列可以通過與其他已知多核苷酸序列的比較進(jìn)行識(shí)別，并可應(yīng)用本領(lǐng)域常規(guī)使用的計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行鑒定，所述軟件如公共序列數(shù)據(jù)庫中應(yīng)用的序列對比程序。
本發(fā)明還提供片段多核苷酸，該片段多核苷酸保存于hPARP2多肽家族的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸編碼成員中。這些片段包括hPARP2多肽家族的特征性序列，又被稱為“署名”序列。該保守署名序列可以在與hPARP2家族編碼成員多核苷酸進(jìn)行簡單序列比較后進(jìn)行識(shí)別。本發(fā)明多核苷酸片段可以一種方式進(jìn)行標(biāo)記，使其檢測成為可能，標(biāo)記包括放射性標(biāo)記和非放射性標(biāo)記。
雜交可以定義為包括以下過程，即通過互補(bǔ)單鏈核酸分子之間的序列特異性作用，形成部分或完全的雙鏈核酸分子。因此，本發(fā)明還進(jìn)一步包括核酸種類的應(yīng)用，所述核酸種類可以與編碼hPARP2蛋白的多核苷酸的編碼鏈或非編碼鏈進(jìn)行雜交。優(yōu)選雜交種類與序列1定義的核苷酸序列的編碼鏈或非編碼鏈雜交?？紤]到遺傳密碼的冗余性，本發(fā)明還包括能夠與hPARP2編碼多核苷酸雜交的種類，即編碼相同氨基酸序列的多核苷酸，但應(yīng)用不同的密碼子。
雜交種類包括，例如，核酸雜交或擴(kuò)增探針(寡核苷酸)，該探針能夠探測編碼hPARP2或其緊密相關(guān)分子，如等位基因，的核苷酸序列(如基因組序列)。探針的特異性，即它是否來源于高度保守、保守或不保守區(qū)或功能區(qū)，以及雜交或擴(kuò)增條件的嚴(yán)格程度(高度、中度或低度)，將決定該探針是否只能鑒定天然hparp2，或其相關(guān)序列。用于檢測相關(guān)核苷酸序列的探針應(yīng)選自hparp2家族成員的保守或高度保守區(qū)，并且這些探針可用于變性探針池。當(dāng)用于檢測完全一致的核苷酸序列，或需要達(dá)到最高特異性時(shí)，寡核苷酸探針選自hparp2多核苷酸的非保守核苷酸區(qū)或特異區(qū)。本文應(yīng)用的術(shù)語“非保守核苷酸區(qū)”是指本文公開的hparp2特異核苷酸區(qū)，而不存在于相關(guān)hparp2家族成員中。
雜交特異性的典型特征在于進(jìn)行雜交的條件的嚴(yán)格性。雜交條件嚴(yán)格性的程度可以定義為核酸結(jié)合體的解鏈溫度(Tm)[見，如Berger andKimmel，“Guide to Molecular Cloning Techniques”，Methods inEnzymology，Vol.152，Academic Press，San Diego CA(1987)]。典型的“最嚴(yán)格”條件發(fā)生在大約Tm-5℃(比探針Tm低5℃)；“高度嚴(yán)格”比Tm低大約5-10℃；“中度嚴(yán)格”比Tm低大約10-20℃；“低度嚴(yán)格”比Tm低大約20-25℃。
此外，雜交嚴(yán)格性還可定義為在處理過程中應(yīng)用的理化條件。為了舉例說明，示例的中度嚴(yán)格雜交條件為在3X檸檬酸鈉鹽水(SSC)，0.1％ sarkosyl，20mM磷酸鈉，pH6.8，65℃的條件下雜交；并應(yīng)用含0.1％十二烷基硫酸鈉(SDS)的2X SSC，在65℃洗滌。示例的高度嚴(yán)格雜交條件為在50％甲酰胺，5X SSC，42℃過夜的條件下雜交；并應(yīng)用0.5X SSC和0.1％ SDS，在50℃洗滌。應(yīng)該理解，本領(lǐng)域等價(jià)嚴(yán)格條件可以通過改變溫度和緩沖液或鹽濃度達(dá)到[見，Ausubel et al.(Eds.)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons(1994)，at pp.6.0.3-6.4.10]。雜交條件的改良可以憑經(jīng)驗(yàn)決定，也可通過準(zhǔn)確計(jì)算決定，后者有賴于寡核苷酸探針的長度和探針含有的鳥嘌呤/胞嘧啶(GC)堿基對的百分比。雜交條件可以根據(jù)Sambrook et al.，(Eds.)，Molecular Cloning，A Laboratory Mannual，Cold Spring Harbor LaboratoryPressCold Spring Harbor，New York(1989)，at pp.9.47-9.51所描述的方法進(jìn)行計(jì)算。
技術(shù)人員應(yīng)該理解，在更加嚴(yán)格的條件下進(jìn)行雜交，可以鑒定與靶序列有高度同源性或一致性的種類。相反，在不嚴(yán)格的條件下進(jìn)行雜交，能夠鑒定雖然與靶序列同源性或一致性較小，但仍然有意義的種類。因此，在本發(fā)明范圍之內(nèi)還包括能夠在中度(中等)到最高嚴(yán)格條件下，與序列1的核苷酸序列雜交的核酸種類。優(yōu)選地，雜交種類能夠在高度嚴(yán)格的條件下，與序列1定義的編碼鏈或非編碼鏈多核苷酸雜交。優(yōu)選的多核苷酸包括，在中度嚴(yán)格的條件下，能夠與含有序列1定義的1-209核苷酸的核酸序列雜交的種類，或者與該區(qū)域互補(bǔ)鏈雜交的種類，更優(yōu)選的多核苷酸包括，在高度嚴(yán)格的條件下，能夠完成上述雜交的種類。其他優(yōu)選多核苷酸是在中度嚴(yán)格的條件下，能夠與含有序列1定義的63-209核苷酸的核酸序列雜交的種類，或者與該區(qū)域互補(bǔ)鏈雜交的種類，更優(yōu)選的多核苷酸包括，在高度嚴(yán)格的條件下，能夠完成上述雜交的種類。
本發(fā)明多核苷酸包括寡核苷酸(即，核酸寡聚體，典型的長度大約為10-60核苷酸)，所述寡核苷酸能夠與編碼hPARP2氨基酸序列的核酸編碼鏈或非編碼鏈雜交。特別是，本發(fā)明包括能夠與序列1定義的多核苷酸編碼鏈或非編碼鏈雜交的寡核苷酸。只要它能夠與靶核酸分子雜交，寡核苷酸的長度并不是最關(guān)鍵的。但是，較長的核酸分子通常較難制備，而且需要較長的雜交時(shí)間。因此，寡核苷酸不應(yīng)超過必需長度。這樣，寡核苷酸應(yīng)該含有至少10個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少15個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少20個(gè)核苷酸。通常情況下，寡核苷酸不超過60個(gè)核苷酸，優(yōu)選不超過30個(gè)核苷酸，更優(yōu)選不超過25個(gè)核苷酸。這些寡核苷酸可用作本文描述的DNA合成的引物(如，PCR中的引物；“擴(kuò)增體”)，探測標(biāo)本中靶DNA存在的探針(如，northern或Southern印跡和原位雜交)，治療制劑(如，在反義治療中)，或用于其他目的。寡核苷酸可以是單鏈，也可以是雙鏈，其中雙鏈形式的一端或兩端呈現(xiàn)鈍性或階梯狀。
寡核苷酸可以通過眾所周知的方法，從自然資源中獲得。此外，寡核苷酸也可根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法通過合成來制備。這些方法包括，例如，通過任何適宜的方法，進(jìn)行適宜序列的克隆和限制性內(nèi)切，或直接化學(xué)合成。制備寡核苷酸的多種化學(xué)方法是本領(lǐng)域眾所周知的，包括磷酸三酯法，磷酸二酯法；二乙基亞磷酰胺法；固相支持物法，和H-膦酸酯法[綜述見，Caruthers，Science 230281-5(1985)；Caruthers et al.，Methods Enzymol 2113-20(1992)]。典型地，寡核苷酸的制備是在聚合物支持物上進(jìn)行的自動(dòng)亞磷酰胺合成。包括100個(gè)以上核苷酸的核酸分子也可以通過這些方法制備。
本發(fā)明hparp2多核苷酸包括變異體，所述變異體是編碼hPARP2或其功能等價(jià)物的多核苷酸，可包括核苷酸殘基的缺失、插入或取代。本文應(yīng)用的“缺失”是指核苷酸或氨基酸序列的一種變化，在該變化中，分別缺少一個(gè)或多個(gè)核苷酸或氨基酸殘基。本文應(yīng)用的“插入”或“添加”是指核苷酸或氨基酸序列的一種變化，該變化分別導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)核苷酸或氨基酸殘基的增加。本文應(yīng)用的“取代”是指核苷酸或氨基酸序列的一種變化，在該變化中，一個(gè)或多個(gè)核苷酸或氨基酸分別被不同的核苷酸或氨基酸代替。
在本發(fā)明范圍內(nèi)，多核苷酸變異體還包括hparp2的等位基因或其他自然發(fā)生的變異形式。等位基因是在基因組核苷酸序列中自然發(fā)生的突變的結(jié)果，所述突變即缺失、插入或取代，突變可以改變也可以不改變表達(dá)多肽的結(jié)構(gòu)或功能。這些基因突變的每一種可以單獨(dú)發(fā)生，也可以與其他突變共同發(fā)生，并在給定等位基因序列中發(fā)生一次或多次?？梢园l(fā)生單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，其中，單個(gè)堿基的突變可以定義一種改變的多肽，而這種改變的多肽可能與明顯的表型變化相關(guān)。當(dāng)然，SNPs也可能是靜默的，因?yàn)樗鼈兛赡懿桓淖兙幋a多肽，或它們編碼的任何改變對表型沒有影響。
本發(fā)明還包括人parp2 DNA的天然同系化合物，該天然同系化合物發(fā)生在其他動(dòng)物種類中，優(yōu)選其他哺乳動(dòng)物種類，更優(yōu)選其他靈長類動(dòng)物種類。這些種類同系化合物通常在蛋白編碼區(qū)，在核苷酸水平，具有顯著同源性。因此，本發(fā)明包括與編碼人hPARP2多肽的多核苷酸蛋白編碼區(qū)具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，或至少99％核苷酸一致性的多核苷酸，所述編碼人hPARP2多肽的多核苷酸如序列1所定義的多核苷酸。與本發(fā)明多核苷酸的序列“同源”百分比被定義為在序列和引入間隔配比后，候選序列核苷酸堿基與hPARP2編碼序列核苷酸一致的百分比，如果需要，可以獲得最大序列一致百分比。計(jì)算機(jī)軟件可以用來(通過商業(yè)渠道購買或利用公共資源)自動(dòng)計(jì)算一致百分比(如FASTA)。
本發(fā)明還包括經(jīng)工程學(xué)選擇性修飾的多核苷酸，所述選擇性修飾為hPARP2基因產(chǎn)物的克隆、制備和/或表達(dá)。可以應(yīng)用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，如位點(diǎn)指引的突變來引入突變，插入新的限制性位點(diǎn)，改變糖基化模式，或者應(yīng)用某些表達(dá)系統(tǒng)來改變密碼子固有的優(yōu)先選擇模式，同時(shí)保持對表達(dá)多肽產(chǎn)物氨基酸序列的控制。例如，可選擇特定原核或真核宿主細(xì)胞優(yōu)先選擇的密碼子來增加hPARP2的表達(dá)率，或產(chǎn)生具有所需性質(zhì)的重組RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，如半衰期較長的產(chǎn)物。
可應(yīng)用本領(lǐng)域熟知的化學(xué)方法全部或部分合成hparp2多核苷酸。本領(lǐng)域應(yīng)該理解，本文應(yīng)用的“化學(xué)合成”是指與酶法相反的純粹的制備多核苷酸的化學(xué)方法。因此，“全部”化學(xué)合成DNA序列是完全由化學(xué)方法制備的，而“部分”化學(xué)合成DNAs包括那些所得DNA中只有一部分是通過化學(xué)方法制備的多核苷酸。
DNA分子可以修飾以增加其細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性和半衰期。可能的修飾包括但不限于在分子的5’端和/或3’端增加側(cè)翼序列，或者應(yīng)用硫代磷酸酯或2’O-甲基而不是磷酸二酯與分子的主干連接。
本發(fā)明還提供hPARP2多肽核酸(PNA)分子。這些hPARP2 PNAs是具有核堿基中性“肽樣”主干的信息分子，所述核堿基允許該分子與hPARP2編碼DNA或RNA互補(bǔ)鏈雜交，而且比相應(yīng)的寡核苷酸(PerSeptive Biosystems)的親和力核特異性高。多肽表達(dá)系統(tǒng)有關(guān)hPARP2編碼DNA序列的知識(shí)使技術(shù)人員能夠修飾細(xì)胞，允許或增加hPARP2的表達(dá)。因此，通過引入本發(fā)明多核苷酸，允許編碼hPARP2多肽表達(dá)，而使宿主細(xì)胞被穩(wěn)定或暫時(shí)修飾，所述宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。本發(fā)明還提供了能夠自主復(fù)制的重組表達(dá)構(gòu)建物，如整合了hPARP2編碼序列的質(zhì)粒和病毒DNA載體。
提供的表達(dá)構(gòu)建物還包括將hPARP2編碼多核苷酸操作性連接于內(nèi)源性或外源性表達(dá)調(diào)控DNA序列和轉(zhuǎn)錄終止子上。表達(dá)調(diào)控DNA序列包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和操作子，其選擇通?；诒磉_(dá)構(gòu)建物所用的表達(dá)系統(tǒng)。所選的優(yōu)選啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列通常具有增加基因表達(dá)的能力，而所選的優(yōu)選操作子序列則通常具有調(diào)控基因表達(dá)的能力。本發(fā)明優(yōu)選構(gòu)建物還包括在宿主細(xì)胞中復(fù)制所必需的序列。表達(dá)構(gòu)建物優(yōu)選用來制備編碼hPARP2多肽，但也可用于構(gòu)建物本身的擴(kuò)增。
本發(fā)明的多核苷酸可以環(huán)狀質(zhì)粒部分、或含有分離的蛋白編碼區(qū)的線形DNA或病毒載體的形式導(dǎo)入宿主細(xì)胞。將DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、電穿孔、核內(nèi)注射或與載體融合，所述載體如脂質(zhì)體、膠態(tài)離子、ghost細(xì)胞和原生質(zhì)體。本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)包括，例如，細(xì)菌、酵母、真菌、植物、昆蟲、非脊椎動(dòng)物、兩棲類動(dòng)物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)。一些適宜的原核宿主細(xì)胞包括，例如，大腸桿菌菌株SG-936，HB101，W3110，X1776，X2282，DHI和MRCl，假單胞菌屬，桿菌屬如枯草桿菌，以及鏈霉菌屬。適宜的真核宿主細(xì)胞包括酵母，如釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、巴斯德畢赤酵母和其他真菌，昆蟲細(xì)胞如sf9或sf21細(xì)胞(Spodoptera frugiperda)，動(dòng)物細(xì)胞如中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，人類細(xì)胞如JY，293和NIH3T3細(xì)胞，以及植物細(xì)胞如Arabidopsis thaliana細(xì)胞。hparp2核苷酸序列或其任意一部分，均可克隆到載體內(nèi)，以制備mRNA探針。這些載體是本領(lǐng)域眾所周知的，并可通過商業(yè)渠道購買，并可通過添加標(biāo)記的核苷酸和一個(gè)適宜的RNA聚合酶，如T7，T3或SP6，用于體外合成RNA探針。
宿主細(xì)胞的類型，表達(dá)hPARP2產(chǎn)物的形式，培養(yǎng)條件等可以根據(jù)已知的標(biāo)準(zhǔn)，由技術(shù)人員選擇。應(yīng)用哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞預(yù)期可以提供這樣的翻譯后修飾(如糖基化，切斷，脂質(zhì)化，和磷酸化)，即本發(fā)明重組表達(dá)產(chǎn)物需要賦予最佳生物活性。hPARP2多肽的糖基化形式和非糖基化形式都在包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。由重組細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可以分泌到細(xì)胞外，也可存在于細(xì)胞內(nèi)，這些有賴于應(yīng)用的序列和/或載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，包括hparp2的表達(dá)載體可以設(shè)計(jì)成含有信號(hào)序列，該信號(hào)序列指導(dǎo)hPARP2通過特定的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞膜分泌。
表達(dá)構(gòu)建物可以包括一些序列，這些序列可以使宿主細(xì)胞內(nèi)同源重組更加容易，也可以促進(jìn)宿主細(xì)胞內(nèi)的同源重組。這一點(diǎn)可以通過以下方式達(dá)成，即將全部或部分天然hPARP2的啟動(dòng)子置換成全部或部分異源啟動(dòng)子，這樣，細(xì)胞就會(huì)以更高的水平表達(dá)hPARP2。插入的異源啟動(dòng)子應(yīng)該與hPARP2編碼序列操作性連接[見，例如，PCT國際公開號(hào)WO 94/12650，WO 92/20808和WO 91/09955]。
本發(fā)明的宿主細(xì)胞對于大規(guī)模生產(chǎn)hPARP2多肽產(chǎn)物非常有用。例如，本發(fā)明宿主細(xì)胞可以成為研發(fā)針對hPARP2多肽具有免疫活性的抗體的有價(jià)值的免疫原。另一個(gè)實(shí)例是，重組hPARP2可以從宿主細(xì)胞中產(chǎn)生并分離，用于體外結(jié)合試驗(yàn)，如藥物篩選試驗(yàn)。在這些方法中，宿主細(xì)胞生長于適宜的培養(yǎng)基中，然后從細(xì)胞或細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中分離所需多肽產(chǎn)物。
多肽產(chǎn)物可以通過本領(lǐng)域熟知的純化方法分離，如常規(guī)應(yīng)用的層析法，包括免疫親和層析，受體親和層析，疏水相互作用層析，植物血凝素親和層析，物質(zhì)大小排除過濾，陽離子或陰離子交換層析，高效液相層析(HPLC)，反向HPLC等。
其他純化方法包括那些純化所需蛋白的方法，該所需蛋白以融合蛋白的形式表達(dá)并純化，在所述融合蛋白中，hPARP2多肽與一個(gè)異源氨基酸序列連接。適宜的異源序列可以包括一個(gè)特異性標(biāo)簽、標(biāo)記或螯合部分，所述部分可以被特異性結(jié)合配體或物質(zhì)識(shí)別。例如，為在肽文庫中篩選hPARP2活性的調(diào)節(jié)子，可以將表達(dá)的hPARP2蛋白融合到所選異源蛋白上，該異源蛋白可以應(yīng)用探針抗體特異性鑒定。融合蛋白還可經(jīng)工程學(xué)修飾，包括一個(gè)位于hPARP2序列和異源蛋白序列之間的裂解位點(diǎn)(如，因子XA或腸激酶敏感序列)，這樣，hPARP2蛋白可以從異源蛋白上裂解下來，然后純化。融合成分的裂解可以產(chǎn)生所需蛋白形式，該蛋白具有來自裂解過程的其他氨基酸殘基。
示例的異源肽功能區(qū)包括金屬螯合肽，如允許純化固定金屬的組氨酸-色氨酸模塊[Porath，Protein Expr Purif 3263-81(1992)]，以及允許純化固定免疫球蛋白的蛋白A功能區(qū)。另一個(gè)有用的系統(tǒng)是用于肽延伸/免疫親和純化系統(tǒng)的二價(jià)陽離子結(jié)合功能區(qū)和特異性抗體，如美國專利號(hào)4,703,004，4,782,137，4,851,431和5,011,912所述。該系統(tǒng)可以從Immunex Corp.(Seattle，WA)公司購買，如FLAG系統(tǒng)。另一種適宜的異源融合體是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，該酶可應(yīng)用固定的谷胱甘肽親和純化。其他有用的融合體包括免疫球蛋白及其片段，如Fc段。
鑒定表達(dá)重組hPARP2的宿主細(xì)胞是鑒定適宜表達(dá)系統(tǒng)的關(guān)鍵。因此，本發(fā)明表達(dá)構(gòu)建物還可以包括編碼一個(gè)或多個(gè)可選擇標(biāo)記物的序列，這些標(biāo)記物可以用來在操作條件下，鑒定攜帶構(gòu)建物的宿主細(xì)胞。還應(yīng)考慮的是，除了插入異源啟動(dòng)子DNA，與異源啟動(dòng)子DNA共同插入的還可以有可擴(kuò)增標(biāo)記DNA(如，ada，dhfr和編碼氨基甲酰磷酸合成酶、天門冬氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶和氨甲酰天冬氨酸脫水酶的多功能CAD基因)和/或內(nèi)含子DNA。如果與hPARP2編碼序列相連，通過標(biāo)準(zhǔn)選擇法選擇的標(biāo)記DNA，其擴(kuò)增會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)hPARP2編碼序列的同時(shí)擴(kuò)增。探測標(biāo)記基因?qū)φT導(dǎo)或選擇的表達(dá)反應(yīng)，通常也提示了hPARP2的表達(dá)。此外，如果hparp2多核苷酸插入到標(biāo)記基因序列之中，含有hparp2的重組細(xì)胞就可以通過標(biāo)記基因功能的喪失來鑒定。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以應(yīng)用多種熟知的其他方法，鑒定含有hPARP2編碼序列并表達(dá)hPARP2的宿主細(xì)胞。這些方法包括但不限于DNA-DNA或DNA-RNA雜交，以及蛋白生物試驗(yàn)或免疫試驗(yàn)技術(shù)，包括基于膜、溶液或碎片的探測和/或定量核酸或蛋白的技術(shù)。
hparp2多核苷酸序列的存在可以通過下列方法檢測，如應(yīng)用DNA-DNA或DNA-RNA雜交，或者應(yīng)用序列1公開的hparp2片段作為探針來擴(kuò)增?；诤怂釘U(kuò)增的試驗(yàn)包括應(yīng)用基于hparp2序列的寡核苷酸，探測含有hparp2 DNA或RNA的轉(zhuǎn)化體。探測hparp2多核苷酸序列的標(biāo)記雜交或PCR探針可以通過多種方法制備，包括寡核苷酸標(biāo)記，缺口翻譯，末端標(biāo)記，或應(yīng)用標(biāo)記核苷酸的PCR擴(kuò)增。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以應(yīng)用hPARP2或其變異體和/或表達(dá)hPARP2或其變異體的宿主細(xì)胞系篩選抗體、肽或其他分子，如有機(jī)或無機(jī)分子，所述物質(zhì)可以作為hPARP2生物或免疫活性的調(diào)節(jié)子。例如，能夠中和hPARP2聚合酶或DNA結(jié)合活性的抗hPARP2抗體，可以用來抑制hPARP2介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。此外，應(yīng)用組合化學(xué)篩查肽文庫或有機(jī)物文庫，選擇重組表達(dá)的hPARP2或其變異體和/或表達(dá)hPARP2或其變異體的宿主細(xì)胞系，對于鑒定具有治療意義的分子非常重要，所述具有治療意義的分子通過調(diào)節(jié)hPARP2的生物或免疫活性發(fā)揮作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過多種常規(guī)方法篩選合成化合物、天然產(chǎn)物和其他具有生物活性潛能的物質(zhì)。例如，編碼hPARP2 DNA結(jié)合功能區(qū)的核苷酸序列可以在宿主細(xì)胞中表達(dá)，可以用來篩選hPARP2活性的變構(gòu)調(diào)節(jié)子，可以是類似物，也可以是拮抗劑。此外，編碼hPARP2保守催化功能區(qū)的核苷酸序列也可以在宿主細(xì)胞中表達(dá)，并可用于篩選ADP-核糖聚合反應(yīng)的抑制劑。hPARP2多肽本發(fā)明還提供了純化和分離的哺乳動(dòng)物hPARP2多肽。hPARP2多肽的一個(gè)示例具有序列2定義的氨基酸序列。本發(fā)明hPARP2多肽可以從天然細(xì)胞源中分離，也可以化學(xué)合成，但優(yōu)選應(yīng)用本發(fā)明宿主細(xì)胞的重組方法制備。本發(fā)明的hPARP2產(chǎn)物可以是全長多肽，也可以是多肽產(chǎn)物的變異體，如保留了hPARP2特異性生物活性的多肽片段、截短的多肽、缺失突變體、以及其他變異體。本文應(yīng)用的“生物活性”是指具有天然hPARP2蛋白結(jié)構(gòu)、調(diào)控或生化功能的hPARP2多肽。具體地說，本發(fā)明hPARP2蛋白對細(xì)胞內(nèi)DNA損傷的反應(yīng)是，能夠與DNA結(jié)合，并使ADP-核糖亞單位聚合。
本發(fā)明的蛋白及其片段可以通過本領(lǐng)域熟知的方法制備。這些方法包括從細(xì)胞中直接分離蛋白，分離或合成編碼蛋白的DNA并應(yīng)用該DNA制備重組蛋白，以及應(yīng)用化學(xué)方法，利用氨基酸合成蛋白。
hPARP2多肽可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法從生物標(biāo)本中分離，如溶解的細(xì)胞部分。適宜的方法包括沉淀，以及液相層析方法，如離子交換，疏水相互作用，和凝膠過濾[見，如Deutscher(Ed.)，Methods Enzymol(Guide toProtein Chemistry，Section VII)182309(1990)；Scopes，ProteinPurification，Springer-Verlag，New York(1987)]。此外，還可通過在預(yù)先制備的SDS-PAGE凝膠上分離蛋白獲得純化物質(zhì)，剪去目標(biāo)帶，通過本領(lǐng)域熟知的方法用電洗脫將蛋白從聚丙烯酰胺基質(zhì)中分離。去污劑SDS可以應(yīng)用眾所周知的方法從蛋白中去除，如通過透析或應(yīng)用適宜的柱，如Extracti-Gel柱(Pierce)。
本發(fā)明hPARP2多肽還可應(yīng)用本領(lǐng)域眾所周知的方法通過化學(xué)方法全部或部分合成。適宜的合成蛋白質(zhì)的方法在本領(lǐng)域有所描述[如，Stuart and Young，Solid Phase Peptide Synthesis，2d ed.，Pierce ChemicalCo.(1984)]。例如，肽可應(yīng)用固相技術(shù)合成，然后從樹脂上裂解，并通過預(yù)先準(zhǔn)備的高效液相層析(HPLC)進(jìn)行純化[見，如Roberge et al.，Science 269202-4(1995)]。例如，按照生產(chǎn)廠家提供的說明書應(yīng)用ABI431A肽合成儀(Perkin Elmer，Norwalk，CT)可以達(dá)到自動(dòng)合成。合成肽組合物可以通過氨基酸分析或序列分析(如，Edman降解法)來認(rèn)定。
如上詳細(xì)所述，重組hPARP2蛋白可以從宿主細(xì)胞中產(chǎn)生并分離，所述宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化了含有hparp2核苷酸序列的表達(dá)載體，并在細(xì)胞培養(yǎng)基中生長。本文描述的宿主細(xì)胞，可以是原核細(xì)胞，也可以是真核細(xì)胞，以一種方式穩(wěn)定或暫時(shí)轉(zhuǎn)染(真核細(xì)胞)或轉(zhuǎn)化(原核細(xì)胞)本發(fā)明hPARP2編碼多核苷酸，該方式允許hPARP2多肽的表達(dá)。在這些方法中，宿主細(xì)胞生長于適宜培養(yǎng)基中，所需多肽產(chǎn)物可以從細(xì)胞中分離，也可以從細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中分離。多肽的分離可以通過，例如免疫親和純化完成。應(yīng)用轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞優(yōu)選大規(guī)模生產(chǎn)hPARP2多肽。
本發(fā)明包括多種多肽，所述多肽含有的氨基酸序列與本文描述的hPARP2多肽序列基本同源。例如，本發(fā)明包括的多肽，其相應(yīng)氨基酸序列與序列2定義的多肽序列至少90％一致，優(yōu)選至少95％一致，更優(yōu)選至少98％一致，更優(yōu)選至少99％一致。
關(guān)于本發(fā)明優(yōu)選多肽的序列“同源”百分比可以定義為在序列和引入間隔配比后，候選序列氨基酸殘基與hPARP2序列一致的百分比，如果需要，可以獲得最大序列一致百分比，并且作為序列一致的一部分，不考慮任何的保守取代。
關(guān)于本發(fā)明優(yōu)選多肽的序列“同源”百分比可以定義為在序列和引入間隔配比后，候選序列氨基酸殘基與hPARP2序列一致的百分比，如果需要，可以獲得最大序列一致百分比，并且作為序列一致的一部分，可以考慮任何的保守取代。
測定兩個(gè)氨基酸序列是否基本同源可以根據(jù)FASTA研究[Pearsonet al.，Proc Natl Acad Sci USA 852444-8(1988)]。此外，同源百分比還可按如下百分比計(jì)算，即兩個(gè)序列中較短序列的氨基酸殘基與備比序列中氨基酸殘基相同的百分比，所述較短序列可以引入4個(gè)長度為100的氨基酸間隔，以使配比最大化。見Dayhoff，in Atlas of Protein Sequenceand Structure，Vol.5，National Biochemical Research Foundation，Washington，D.C.(1972)，at p.124。
一種多肽可以認(rèn)為與本發(fā)明hPARP2多肽同源，如果編碼這兩種多肽的多核苷酸可以彼此雜交。如果雜交可以在更加嚴(yán)格的雜交條件下發(fā)生，那么同源程度就更高。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知道如何控制雜交條件，以及雜交條件與同源程度的關(guān)系。見，如Sambrook et al.(1989)。因此，同源多肽是這樣一種多肽，其編碼多核苷酸可以在特定嚴(yán)格的雜交條件下，與本發(fā)明多肽的編碼多核苷酸雜交。
這些結(jié)構(gòu)同源的多肽能夠展現(xiàn)同源功能是眾所期待的，也就是同源多肽與本發(fā)明多肽具有基本相同的功能。例如，如果結(jié)構(gòu)同源多肽能夠與相似的配體結(jié)合，或顯示相似的免疫反應(yīng)性等，那么，就可以認(rèn)為它們也有功能同源性。
但是，眾所周知，被認(rèn)為結(jié)構(gòu)基本同源的兩種多肽或兩種多核苷酸，在功能上可以相差甚遠(yuǎn)。例如，等位基因中單核苷酸多態(tài)性(SNPs)表達(dá)的多肽，其功能在一個(gè)或多個(gè)可檢測參數(shù)方面具有顯著差異，所述參數(shù)如抗體或配體結(jié)合的親和力，或酶底物特異性等。其他結(jié)構(gòu)差異，如取代、缺失、剪接變異體等，也可影響其他結(jié)構(gòu)相同或同源多肽的功能。
本發(fā)明hPARP2多肽包括序列2定義的hPARP2多肽的功能衍生物。這些功能衍生物包括多肽產(chǎn)物，其擁有的結(jié)構(gòu)特征或生物活性與hPARP2蛋白的結(jié)構(gòu)特征或生物活性基本類似。因此，功能衍生物包括親本hPARP2蛋白的變異體、片段以及化學(xué)衍生物。
本文應(yīng)用的“變異體”是指這樣的分子，其結(jié)構(gòu)和功能與完整的hPARP2分子或其片段基本類似。如果兩個(gè)分子具有基本類似的結(jié)構(gòu)，或兩個(gè)分子擁有類似的生物活性，那么一個(gè)分子就被認(rèn)為與另一個(gè)分子“基本類似”。因此，如果兩個(gè)分子擁有類似的活性，它們就被認(rèn)為是如本文所指的變異體，即使一個(gè)分子擁有的一種結(jié)構(gòu)沒有在另一個(gè)分子中發(fā)現(xiàn)，或者其氨基酸殘基序列不一致。
在本發(fā)明提供的多肽變異體中，變異體含有hPARP2多肽氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)改變。這些基于序列的改變包括hPARP2序列中的缺失、取代或插入，以及各種改變的組合形式。
hPARP2多肽的缺失變異體是序列中除去至少一個(gè)氨基酸殘基的多肽。缺失可以通過在蛋白的一端或兩端，或者在hPARP2氨基酸序列中去除一個(gè)或多個(gè)殘基來達(dá)成。缺失變異體包括，例如，本發(fā)明hPARP2多肽的所有不完全片段。本文應(yīng)用的“片段”是指hPARP2蛋白的任何多肽子集。一種優(yōu)選片段是純化分離的hPARP2多肽，含有序列2定義的氨基酸序列的1-49個(gè)氨基酸。另一種優(yōu)選片段包括純化分離的hPARP2多肽，含有至少一個(gè)氨基酸殘基，該殘基源于含有序列2定義的氨基酸序列的1-49個(gè)氨基酸的區(qū)域。這些片段包括，例如，含有序列2定義的氨基酸序列的49-583個(gè)氨基酸的片段，以及該序列N端延伸的片段，及其C端截短的片段。
具有hPARP2生物活性特征的可溶性(即，非膜結(jié)合性)hPARP2片段是眾所期待的?？梢酝ㄟ^去除任何親本分子的跨膜區(qū)或去除親水氨基酸殘基或以疏水殘基取代親水氨基酸殘基來優(yōu)選生成可溶性片段。這些殘基的鑒定是本領(lǐng)域眾所周知的。
本發(fā)明還提供了取代變異體，包括應(yīng)用一個(gè)替代殘基置換hPARP2多肽中至少一個(gè)氨基酸殘基的多肽。任何取代都可進(jìn)行，優(yōu)選保守取代。指導(dǎo)的氨基酸取代可以基于以下條件進(jìn)行，這些條件包括定義良好的規(guī)范和其他氨基酸的理化參數(shù)(如大小、形狀、極性、電荷、氫鍵結(jié)合力、溶解性、化學(xué)反應(yīng)性、疏水性、親水性或殘基的兩性分子特征)以及它們對蛋白質(zhì)二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)的作用。取代變異體可以包括含有一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸取代的多肽，即按照需要，一個(gè)氨基酸被另一個(gè)具有類似理化特征的氨基酸所取代。為了舉例說明，按照下述類別，規(guī)范氨基酸可以分組脂肪族支鏈甘氨酸，丙氨酸；纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸芳香族支鏈苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸脂肪族羥基支鏈絲氨酸，蘇氨酸堿性支鏈 賴氨酸，精氨酸，組氨酸酸性支鏈 天門冬氨酸，谷氨酸氨基化合物支鏈天門冬酰胺，谷氨酰胺含硫支鏈 半胱氨酸，蛋氨酸二級(jí)氨基 脯氨酸當(dāng)想要控制hPARP2分子的定義特征時(shí)，優(yōu)選按照下表1進(jìn)行取代。
表1原來殘基 保守取代示例丙氨酸 甘氨酸，絲氨酸精氨酸 賴氨酸天門冬酰胺 谷氨酰胺，組氨酸天門冬氨酸 谷氨酸半胱氨酸 絲氨酸谷氨酰胺 天門冬酰胺谷氨酸 天門冬氨酸甘氨酸 丙氨酸，脯氨酸組氨酸 天門冬酰胺，谷氨酰胺異亮氨酸 亮氨酸，纈氨酸亮氨酸 異亮氨酸，纈氨酸賴氨酸 精氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸蛋氨酸 亮氨酸，酪氨酸，異亮氨酸苯丙氨酸 蛋氨酸，亮氨酸，酪氨酸絲氨酸 蘇氨酸蘇氨酸絲氨酸色氨酸酪氨酸酪氨酸色氨酸，苯丙氨酸纈氨酸亮氨酸，異亮氨酸功能或免疫一致性上的實(shí)質(zhì)改變可以通過選擇比表1更加顯著的取代完成，即選擇的取代殘基在維持下述作用方面具有顯著差異，(a)取代區(qū)主干多肽的結(jié)構(gòu)，例如，折疊片狀構(gòu)型或螺旋狀構(gòu)型；(b)在靶位點(diǎn)分子的電荷或疏水性；或者(c)支鏈的大小。取代在下述情況下通常更加顯著(a)甘氨酸和/或脯氨酸被其他氨基酸取代，或者缺失或插入；(b)親水殘基被疏水殘基取代；(c)半胱氨酸殘基被其他殘基取代，或半胱氨酸殘基取代其他殘基；(d)具有正電荷支鏈的殘基被具有負(fù)電荷的殘基取代，或具有正電荷支鏈的殘基取代具有負(fù)電荷的殘基；(e)具有較大支鏈的殘基被沒有這種支鏈的殘基取代，或具有較大支鏈的殘基取代沒有這種支鏈的殘基。最優(yōu)選的是影響hPARP2溶解性的氨基酸取代。這些取代最優(yōu)選由親水性氨基酸取代疏水性氨基酸。
但是，取代變異體還包括應(yīng)用非規(guī)范或非天然氨基酸殘基取代原則序列中的氨基酸殘基。取代變異體包括引入氨基酸取代的多肽，所述氨基酸取代是通過修飾hPARP2多肽編碼多核苷酸達(dá)成的。
本發(fā)明還提供了插入變異體，在該變異體中，至少有一個(gè)氨基酸殘基添加到hPARP2氨基酸序列中。插入可以位于多肽的任意一端，也可以位于多肽的兩端，還可以位于hPARP2氨基酸序列中。插入變異體還包括融合蛋白，在該融合蛋白中，hPARP2多肽的氨基端或羧基端與另一個(gè)多肽融合。這些融合蛋白的示例包括免疫原性多肽，循環(huán)半衰期長的蛋白質(zhì)(如免疫球蛋白恒定區(qū))，標(biāo)記蛋白(如綠色熒光蛋白)，以及使所需hPARP2多肽的純化更加容易的蛋白或多肽(如FLAG標(biāo)簽或聚組氨酸序列)。末端插入的另一個(gè)示例是在分子的N端融合一種信號(hào)序列，使重組宿主分泌衍生物更加容易，該信號(hào)序列與宿主細(xì)胞可以同源，也可以異源。序列內(nèi)插入(即在hPARP2分子序列內(nèi)插入)的范圍通常是1-10個(gè)殘基，更優(yōu)選1-5個(gè)殘基。
本發(fā)明多肽變異體還包括成熟的hPARP2產(chǎn)物，即去除了前導(dǎo)或信號(hào)序列的hPARP2產(chǎn)物，以及具有其他氨基末端殘基的產(chǎn)物。在位置-1添加了一個(gè)蛋氨酸殘基的hPARP2產(chǎn)物(Met-1-hPARP2)也在考慮之列，以及在位置-2和-1添加了蛋氨酸和賴氨酸殘基的hPARP2產(chǎn)物(Met-2-Lys-1-hPARP2)。其他的這些變異體對在細(xì)菌宿主細(xì)胞中制備重組蛋白特別有用。
本發(fā)明還包括應(yīng)用特定表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的添加了氨基酸殘基的hPARP2變異體。例如，應(yīng)用可以通過商業(yè)渠道購買的表達(dá)所需多肽，如谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GST)融合產(chǎn)物的載體，在裂解作用下從所需多肽去除GST組分，可以產(chǎn)生在位置-1添加了甘氨酸殘基的所需多肽(Gly-1-hPARP2)。在其他載體系統(tǒng)表達(dá)的變異體也在考慮之列。
本發(fā)明還進(jìn)一步提供了hPARP2多肽產(chǎn)物，所述產(chǎn)物是序列2定義的hPARP2多肽的化學(xué)衍生物。本文應(yīng)用的術(shù)語“化學(xué)衍生物”是指含有其他添加化學(xué)部分的分子，所述化學(xué)部分并非天然存在的分子的正常部分。這些部分可能會(huì)賦予衍生物分子所需的特性，如溶解性、吸收、生物半衰期等增加。該部分也可以降低衍生物分子的毒性，或者消除或減輕衍生物分子的任何不欲副作用。因此，hPARP2多肽的化學(xué)衍生物包括經(jīng)過修飾的多肽，修飾不僅(除了)是氨基酸殘基的插入、缺失或取代。優(yōu)選地，該修飾是天然共價(jià)修飾，并包括，例如，與聚合物、脂質(zhì)、非天然氨基酸、以及其他有機(jī)和無機(jī)部分的化學(xué)連接。本發(fā)明衍生物可以制備，以增加hPARP2多肽的循環(huán)半衰期，或者可以設(shè)計(jì)，以改善多肽對所需細(xì)胞、組織或器官的定向能力。
例如，修飾一種多肽，使其包括一個(gè)或多個(gè)水溶性聚合附加基團(tuán)的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，所述水溶性聚合附加基團(tuán)如聚乙烯二醇、聚氧乙烯二醇或聚丙烯二醇。特別優(yōu)選的是與聚乙烯二醇(PEG)亞單位共價(jià)修飾的hPARP2產(chǎn)物。水溶性聚合物可以在hPARP2的特定位置與其相連，例如，在hPARP2產(chǎn)物的氨基末端，也可以與多肽的一個(gè)或多個(gè)支鏈隨機(jī)粘附。其他衍生物還包括固定在固體支持物、別針微粒狀載體或?qū)游鰳渲系膆PARP2種類，以及經(jīng)修飾包括一個(gè)或多個(gè)可探測標(biāo)記、標(biāo)簽、螯合劑等的hPARP2種類。
與兩種功能截然不同的制劑進(jìn)行衍生反應(yīng)可用來將TANK2交聯(lián)到不溶于水的支持基質(zhì)上。此外，反應(yīng)性不溶于水的基質(zhì)如氰溴活化的碳水化合物、和反應(yīng)性底物可以用來固定蛋白[見，如，美國專利號(hào)3,969,287，3,691,016，4,195,128，4,247,642，4,229,537和4,330,440]。
預(yù)期hPARP2變異體的表達(dá)能夠研究野生型hPARP2多肽的生物活性特征。hPARP2變異體可以設(shè)計(jì)成保留hPARP2的全部特征性生物或免疫性質(zhì)，也可以設(shè)計(jì)成使hPARP2的一種或多種特定生物或免疫性質(zhì)特異性失能。例如，hPARP2的片段或截短的hPARP2可以設(shè)計(jì)成去除一個(gè)與其特定性質(zhì)相關(guān)的功能區(qū)，或者取代和缺失也可以設(shè)計(jì)成使與某特定功能區(qū)相關(guān)的性質(zhì)失活。這些變異體(“顯性不表達(dá)”變異株)的強(qiáng)迫表達(dá)(過量表達(dá))可以通過觀察與變異株相關(guān)的表型來研究這些蛋白的體內(nèi)功能。
具有高達(dá)大約100個(gè)殘基的hPARP2功能衍生物可以通過體外合成方便地制備。如果需要，這些片段還可應(yīng)用本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行修飾，如通過將純化蛋白或天然蛋白的靶氨基酸殘基與有機(jī)衍生劑反應(yīng)，該有機(jī)衍生劑能夠與所選支鏈或末端殘基發(fā)生反應(yīng)。獲得的共價(jià)衍生物可以用來鑒定殘基對生物活性的重要性。
具有改變了的氨基酸序列的hPARP2功能衍生物還可通過編碼hPARP2的DNA突變來制備。氨基酸缺失、插入和取代的任意組合都可用來產(chǎn)生最終構(gòu)建物，只要最終構(gòu)建物擁有所需活性。顯然，在編碼功能衍生物DNA中引入的突變，序列必須位于閱讀框之內(nèi)，并優(yōu)選不產(chǎn)生互補(bǔ)區(qū)，該互補(bǔ)區(qū)可能使mRNA產(chǎn)生二級(jí)結(jié)構(gòu)[見EP專利公開號(hào)75,444]。
由于在氨基酸序列中引入變異的位點(diǎn)是事先設(shè)定的，因而突變本身不必預(yù)先決定。例如，為使在給定位點(diǎn)的突變表現(xiàn)最佳化，可以在靶密碼子或靶區(qū)域進(jìn)行隨機(jī)突變形成，如連接掃描突變形成，這樣可以創(chuàng)建大量突變衍生物，然后可以表達(dá)并篩選所需活性的最佳組合。此外，也可應(yīng)用位點(diǎn)導(dǎo)向突變形成和其他眾所周知的技術(shù)，在已知DNA序列的預(yù)先設(shè)定位點(diǎn)制造突變。
位點(diǎn)導(dǎo)向突變形成技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的[如，Sambrook et al.，Supra，and McPherson(Ed.)，Directed MutagenesisA Practical Approach，IRL Press，Oxford(1991)]。通過應(yīng)用編碼所需突變的DNA序列的特定寡核苷酸序列，位點(diǎn)導(dǎo)向突變形成可以產(chǎn)生hPARP2的功能衍生物。位點(diǎn)導(dǎo)向突變形成的方法和材料可以通過商業(yè)渠道購買，如從Stratagene(La Jolla，CA)可以購買QuikChangeTM試劑盒。應(yīng)用該方法，可以生成準(zhǔn)確的氨基酸缺失、插入或取代。氨基酸序列的缺失范圍通常為1-30個(gè)殘基，更優(yōu)選1-10個(gè)殘基，典型的是鄰近缺失。最優(yōu)選的缺失是那些處理后產(chǎn)生了催化片段或DNA結(jié)合片段的缺失。
為增加hPARP2的親和力而設(shè)計(jì)的突變可以通過引入氨基酸殘基達(dá)到目的，所述氨基酸殘基存在于其他聚(ADP-核糖)聚合酶蛋白的同源位點(diǎn)。同樣，這些突變hPARP2分子也可制備成缺乏某功能區(qū)殘基的分子，如缺乏催化功能區(qū)，從而產(chǎn)生顯性不表達(dá)蛋白。
推理預(yù)測任何特定修飾，如取代、缺失、插入等，將對hPARP2的生物活性產(chǎn)生怎樣的具體效應(yīng)是非常困難的。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，該效應(yīng)可以通過常規(guī)篩查試驗(yàn)來評價(jià)。例如，一個(gè)典型的衍生物通常是由編碼天然hPARP2分子的DNA通過連接掃描位點(diǎn)導(dǎo)向突變形成技術(shù)制備的。衍生物然后在重組宿主中表達(dá)，并且，可以選擇地，從細(xì)胞培養(yǎng)基中純化，例如，通過免疫親和層析法。然后，通過適宜的篩查試驗(yàn)篩檢細(xì)胞溶解液或純化衍生物的活性，看是否具有所需特征性活性。例如，功能衍生物免疫性質(zhì)的改變，如對某給定抗體的親和力，可以通過競爭性免疫試驗(yàn)來測定。表達(dá)產(chǎn)物在其他參數(shù)方面的改變可以通過適宜的試驗(yàn)方法來測定。抗體本發(fā)明通過了與hPARP2多肽特異性結(jié)合的抗體。本文應(yīng)用的“抗體”定義范圍廣泛，是一種能夠與hPARP2多肽特征性抗原決定簇(抗原決定物質(zhì))發(fā)生特征性免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)。如本文所指，如果抗體特異性識(shí)別抗原決定簇并與之結(jié)合，那么抗體就被認(rèn)為與抗原如一種多肽發(fā)生“免疫反應(yīng)”，所述抗原決定簇通過一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)或者一個(gè)或多個(gè)抗體補(bǔ)體決定區(qū)(CDRs)成為抗原的特征。
如果兩種多肽的每一種都含有定義同一特征性抗原決定簇的共同結(jié)構(gòu)特征，那么能夠與其中一種給定多肽發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體，也可能與另一種多肽發(fā)生交叉反應(yīng)。在這種相關(guān)多肽的情況下，交叉反應(yīng)性與共同結(jié)構(gòu)特征相關(guān)，如序列一致性、同源性或相關(guān)多肽間存在的相似性。因此，多肽家族通?？梢酝ㄟ^交叉反應(yīng)抗體來鑒定，即，一種抗體可以與具有共同抗原決定簇的多肽家族的某些或所有成員發(fā)生免疫反應(yīng)。因此，本發(fā)明包括與hPARP2多肽家族特定成員發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體，所述hPARP2多肽如含有序列2定義的氨基酸序列的多肽，或含有序列2定義的1-49個(gè)氨基酸殘基的多肽。本發(fā)明還進(jìn)一步包括與hPARP2多肽家族某些或全部成員發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體。測定抗體結(jié)合特異性的篩查試驗(yàn)是眾所周知的，并在本領(lǐng)域經(jīng)常應(yīng)用[見Harlow et al.(Eds.)，AntibodiesA Laboratory Manual，Ch.6，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor NY(1988)]。一種抗體與給定多肽抗原的免疫反應(yīng)特異性與該抗體與其他蛋白的相互作用不同，所述其他蛋白如金黃色葡萄球菌蛋白A或其他用于ELISA技術(shù)的抗體，該抗體與其他蛋白的相互作用是通過抗體的其他部位介導(dǎo)的，而不是抗體可變區(qū)，特別不是抗體恒定區(qū)。
抗體包括例如單克隆抗體、多克隆抗體、單鏈抗體(scFv抗體)、嵌合抗體、多功能/多特異性(如，兩種功能或兩種特異性)抗體、人源化抗體、人類抗體、以及CDR移植物抗體(包括含有CDR序列的部分，該CDR序列能夠與本發(fā)明多肽發(fā)生特異性免疫反應(yīng))。根據(jù)本發(fā)明，抗體還包括抗體片段，只要這些片段也具有所需生物活性?！翱贵w片段”包括一部分全長抗體，通常是全長抗體的抗原結(jié)合部位或可變區(qū)。抗體片段的示例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、以及Fv片段、雙抗體、線形抗體、單鏈抗體分子、以及由多個(gè)抗體片段構(gòu)成的多特異性抗體。
本發(fā)明抗體可以通過本領(lǐng)域任何已知方法制備。例如，根據(jù)本領(lǐng)域已知方法，應(yīng)用蛋白或功能類似物免疫哺乳動(dòng)物，然后從中分離多克隆抗體。簡而言之，多克隆抗體可以通過給哺乳動(dòng)物宿主(如兔、小鼠、大鼠或山羊)注射免疫原性hPARP2(免疫原)多肽而制備?？梢詰?yīng)用佐劑增強(qiáng)免疫反應(yīng)。提純從哺乳動(dòng)物宿主獲取的血清，并篩選收獲能夠與hPARP2多肽發(fā)生特異性反應(yīng)(免疫反應(yīng))的多克隆抗體。
優(yōu)選單克隆抗體(本文也稱為“mAbs”)。本文應(yīng)用的“單克隆抗體”是指從基本同源的抗體中獲得的一種抗體，即含有完全相同的抗體，除非含有少量可能天然發(fā)生的突變。單克隆抗體是高度特異的(“單特異性”)，只與一個(gè)抗原位點(diǎn)發(fā)生作用。而且，與傳統(tǒng)(多克隆)抗體制備不同，典型的多克隆抗體包括與不同決定物質(zhì)(抗原決定簇)發(fā)生作用的不同抗體，而每種多克隆抗體只與抗原的一種決定物質(zhì)發(fā)生作用。
修正“單克隆”提示，抗體的特性獲自基本同源的抗體，而不應(yīng)理解為通過任何具體方法需要制備的抗體。單克隆抗體可以應(yīng)用任何適宜的技術(shù)制備，所述技術(shù)能夠生成連續(xù)細(xì)胞系產(chǎn)生同源抗體。這些方法包括免疫學(xué)方法[Kohler and Milstein，Nature 256495-497(1975)；Campbell，“monoclonal antibody technology，the production andcharacterization of rodent and human hybridomas”in Burdon et al.(Eds.)，Laboratory Techniques in biochemistry and Molecular Biology，Vol.13，Elsevier Science Publishers，Amsterdam(1985)]或其他類似方法。單克隆抗體還可以從噬菌體抗體文庫中分離[Clackson et al.，Nature 352624-8(1991)；Marks et al.，J Mol Biol 222581-97(1991)]。
舉例說明，為產(chǎn)生單克隆抗體，給哺乳動(dòng)物宿主免疫注射免疫原性hPARP2多肽，然后加強(qiáng)免疫。在最后一次加強(qiáng)免疫后數(shù)日，從免疫哺乳動(dòng)物體內(nèi)收獲脾臟。脾臟細(xì)胞懸液與腫瘤細(xì)胞系融合，創(chuàng)建一種永生雜交細(xì)胞系或“雜交瘤”。通過限制性稀釋可以獲得單個(gè)克隆，然后檢測它們產(chǎn)生的抗體的特異性。然后培育被選擇的細(xì)胞，如通過腹水法，作為所需同源抗體的持續(xù)提供源。
抗體還可以經(jīng)工程學(xué)修飾，如應(yīng)用基因技術(shù)產(chǎn)生嵌合抗體，該嵌合抗體包括兩種以上種類的蛋白組分。如果抗體用于人類受體體內(nèi)，還需要進(jìn)行“人源化”，即抗體經(jīng)修飾包括源于一個(gè)物種的抗原結(jié)合區(qū)，該物種如嚙齒類動(dòng)物，以及用源于人類免疫球蛋白的序列置換抗體的大部分。在一個(gè)方法中，一個(gè)非人類物種如小鼠或兔的CDRs，被插入另一個(gè)物種如人類的框架序列，或被插入共有框架序列。還可將其他變化引入抗體框架，來修飾工程學(xué)抗體的親和力和免疫原性。在多種細(xì)胞類型中誘導(dǎo)工程學(xué)抗體表達(dá)的方法也是眾所周知的，所述多種細(xì)胞類型如哺乳動(dòng)物細(xì)胞和微生物細(xì)胞。本領(lǐng)域存在多種制備工程學(xué)抗體的技術(shù)描述[如，Owens and Young，J Immunol Meth 168149-65(1994)]。
抗體還包括重組多克隆或單克隆Fab片段[如Huse et al.，Science2461275-81(1989)]。此外，制備單鏈抗體的技術(shù)(如美國專利號(hào)4,946,778)也可用來制備hPARP2特異性單鏈抗體(如單鏈Fv片段，縮寫為“scFv”)?？梢圆捎醚杆?、大規(guī)模生產(chǎn)抗體的重組方法，如噬菌體陳列或核糖體陳列法，隨后可以可選地進(jìn)行親和突變[見，如Ouwehand et al.，Vox Sang 74(Suppl2)223-232(1998)；Rader et al.，ProcNatl Acad Sci USA 958910-8915(1988)；Dall’Acqua et al.，Curr OpinStruct Biol 8443-450(1998)]。
特別優(yōu)選完全人類抗體用于人類治療，但完全人類抗體難以制備。例如，當(dāng)免疫原是人類自身抗原時(shí)，人類不會(huì)針對抗原產(chǎn)生任何典型的免疫反應(yīng)。業(yè)已開發(fā)出制備完全人類抗體的方法，這些方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。因此，完全人類抗體可以應(yīng)用免疫原性hPARP2多肽免疫經(jīng)轉(zhuǎn)基因修飾的動(dòng)物(如小鼠)來制備，該動(dòng)物至少表達(dá)全部人類免疫球蛋白基因的一大部分[見如，Bruggemann et al.，Immunol Today 17391-7(1996)]。
應(yīng)該指出，本發(fā)明宿主細(xì)胞是研發(fā)hPARP2特異性免疫反應(yīng)抗體的免疫原的寶貴資源。為了成為制備多克隆或單克隆抗體的有用免疫原，hPARP2肽片段必須包括足夠的氨基酸殘基以形成免疫原抗原決定簇。如果片段太短，本身不能成為免疫原，就應(yīng)該與一個(gè)載體分子連接。適宜的載體分子包括，例如鎖眼帽貝血藍(lán)蛋白和牛血清白蛋白(BSA)。連接可以應(yīng)用本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行。其中一種方法是將片段的半胱氨酸殘基與載體分子的半胱氨酸殘基相連。
本發(fā)明抗體可用于治療(通過調(diào)節(jié)hPARP2活性)、診斷(通過測定樣本中的hPARP2)以及hPARP2的純化。這些抗體對于測定和/或定量hPARP2在下述物質(zhì)中的定量表達(dá)非常有用，如細(xì)胞、組織、器官及其裂解液、提取物，以及血清、血漿、腦脊液、尿液、痰液、腹水、胸水或支氣管灌洗液。用于本文所述任何目的的含有本發(fā)明抗體的試劑盒也在考慮之列。通常，本發(fā)明試劑盒還包括一種可與抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的對照抗原，還可以包括其他試劑、容器和說明書。
而且，本發(fā)明還包括中和抗體，即可以顯著抑制或破壞本發(fā)明蛋白質(zhì)或功能類似物的生物活性的抗體。具體地說，中和抗體抑制或破壞hPARP2的聚(ADP-核糖)聚合酶活性。中和抗體對于治療和診斷應(yīng)用特別需要。
功能等價(jià)物進(jìn)一步包括抗體的片段，這些抗體片段與完整抗體具有相同的結(jié)合特征，或其結(jié)合特征可與完整抗體相比。這些片段可以包括一個(gè)或兩個(gè)Fab片段，或F(ab’)2片段。盡管含有少于所有CDRs的片段，如含有3個(gè)，4個(gè)或5個(gè)CDRs的片段，也可能具有功能，但優(yōu)選包括完整抗體的所有6個(gè)補(bǔ)體決定區(qū)(CDRs)的抗體片段。片段可應(yīng)用本領(lǐng)域描述的方法制備[如Lamoyi et al.，J Immunol Meth 56235-43(1983)；Parham，J Immunol 1312895-902(1983)]。
而且，應(yīng)用分離的或重組的hPARP2產(chǎn)物、hPARP2變異體或表達(dá)這些產(chǎn)物的細(xì)胞可以開發(fā)特異性結(jié)合蛋白。應(yīng)用已知的免疫學(xué)方法，結(jié)合蛋白對于純化hPARP2產(chǎn)物，測定或定量體液和組織樣本中hPARP2產(chǎn)物非常有用。結(jié)合蛋白對于調(diào)節(jié)(即阻斷、抑制或刺激)hPARP2多肽的活性也非常有用，特別是涉及信號(hào)傳導(dǎo)的那些活性。因此，本發(fā)明提供了抑制hPARP2多肽活性的中和抗體。特異性抗hPARP2抗體的抗獨(dú)特型抗體也在考慮之列?？商綔y的多核苷酸和多肽探針本發(fā)明還提供了一種探測樣本中是否存在hPARP2編碼多核苷酸或hPARP2多肽的方法。該方法包括應(yīng)用能夠識(shí)別樣本中定義靶物質(zhì)的標(biāo)記探針。該探針可以是能夠識(shí)別hPARP2多肽的抗體，也可以是能夠識(shí)別編碼hPARP2多肽的多核苷酸的寡核苷酸。
本發(fā)明探針可根據(jù)本領(lǐng)域已知方法進(jìn)行可探測標(biāo)記。通常，探針可以通過連接一個(gè)可探測標(biāo)記(通訊子)部分來修飾，也可通過將可探測標(biāo)記部分整合其間來制備可探測探針?？商綔y標(biāo)記部分可以是任意可探測部分，其中多種是本領(lǐng)域已知的，包括放射性原子、電子密集原子、酶、色原體和有色化合物、熒光團(tuán)和熒光化合物、特異性結(jié)合派對中的成員等。
標(biāo)記寡核苷酸探針的方法在本領(lǐng)域業(yè)已有所描述[見，如Leary et al.，Proc Natl Acad Sci USA 804045-49(1983)；Renz and kurz，Nucleic AcidsRes 123435-44(1984)；Richardson and Gumport，Nucleic Acids Res 116167-84(1983)；Smith et al.，Nucleic Acids Res 132399-412(1985)；Meinkoth and Wahl，Anal Biochem 138267-84(1984)；以及美國專利號(hào)4,711,955，4,687,732，5,241,060，5,244,787，5,328,824，5,580,990和5,714,327]。
標(biāo)記抗體的方法業(yè)已有所描述[見，如Hunter et al.，Nature 144495-6(1962)；David et al.，Biochemistry 131014-21(1974)；以及美國專利號(hào)3,940,475和3,645,090]。
標(biāo)記部分可以是放射性物質(zhì)。一些有用的放射性標(biāo)記示例包括32P，125I，131I和3H。放射性標(biāo)記物質(zhì)的應(yīng)用業(yè)已有所描述[例如，美國專利文件2,034,475以及美國專利號(hào)4,358,535和4,302,204]。
一些非放射性標(biāo)記的示例包括酶、色原體、應(yīng)用電子顯微鏡可以探測的原子和分子、以及應(yīng)用其磁性來探測的金屬離子。
一些有用的酶標(biāo)記包括導(dǎo)致底物發(fā)生可探測改變的酶。一些有用的酶(及其底物)包括，例如，辣根過氧化物酶(焦酚和氧苯二胺)，β-牛乳酶(熒光素β-D-牛乳吡喃糖苷)，以及堿性磷酸酶(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/硝基四唑藍(lán))。酶標(biāo)記的應(yīng)用在本領(lǐng)域業(yè)已有所描述[見，如英國專利文件2,019,404，歐洲專利文件EP63,879，以及Rotman，ProcNatl Acad Sci USA471981-91(1961)]。
有用的通訊子部分包括，例如，熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光分子以及染料。本發(fā)明有用的一些特異性有色或熒光化合物包括，例如，熒光素、香豆素、若丹明、德州紅、藻紅蛋白、7-羥基香豆素、Luminol等。色原體或熒光團(tuán)是這樣一些分子，即通過修飾(如氧化)可以成為有色或熒光物質(zhì)，或改變其顏色或發(fā)射光譜，這些分子也能夠整合到探針中，在特定條件下發(fā)揮通訊子部分的作用。
標(biāo)記部分可以應(yīng)用本領(lǐng)域熟知的方法連接到探針上。標(biāo)記部分可以通過功能基團(tuán)直接粘附于探針。探針可以包括這樣一個(gè)功能基團(tuán)，也可以經(jīng)由反應(yīng)導(dǎo)致含有這樣一個(gè)功能基團(tuán)。一些適宜的功能基團(tuán)的示例包括，例如，氨基、羧基、巰基、順丁烯二酰亞胺、異氰酸鹽、異硫氰酸鹽。
此外，標(biāo)記部分如酶和色原體還可以通過配對制劑的方法與抗體或核苷酸相連，所述配對制劑如二醛、碳二酰亞胺、dimaleimides等。
標(biāo)記部分還可通過以下方法與探針連接，即通過上述方法粘附于探針的配體以及粘附于標(biāo)記部分的配體的受體。任何已知的配體-受體結(jié)合派對組合都是適宜的。一些適宜的配體-受體派對包括，例如生物素-抗生物素蛋白或-鏈霉抗生物素蛋白，以及抗體-抗原。優(yōu)選生物素-鏈霉抗生物素蛋白組合。應(yīng)用hparp2多核苷酸和hPARP2多肽的方法本發(fā)明公開的DNA和氨基酸序列的科學(xué)價(jià)值是顯而易見的。如系列實(shí)施例所示，hparp2 cDNA序列的公開使下述研究成為可能，即通過應(yīng)用Southern雜交或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，鑒定基因組DNA編碼hPARP2的序列，以及hPARP2的表達(dá)調(diào)控序列。在中度到高度嚴(yán)格的條件下，應(yīng)用本發(fā)明DNA序列進(jìn)行的DNA/DNA雜交試驗(yàn)，預(yù)期有可能分離得到編碼hPARP2等位基因變異體的DNAs。同樣，應(yīng)用Southern和/或PCR分析，還可以鑒定編碼hPARP2同源蛋白的非人種類基因。此外，互補(bǔ)研究可用于鑒定其他人類hPARP2產(chǎn)物和非人類蛋白，以及具有hPARP2一種或多種生物活性的DNAs編碼蛋白。本發(fā)明寡核苷酸還可用于測定細(xì)胞hPARP2表達(dá)能力的雜交試驗(yàn)。本發(fā)明多核苷酸還是診斷方法的基礎(chǔ)，可用于鑒定hparp2位點(diǎn)的基因變異，該基因變異是一種疾病狀態(tài)的基礎(chǔ)。
這里描述的本發(fā)明寡核苷酸還可用于為了多種目的擴(kuò)增DNA的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法，“擴(kuò)增”是指為檢測痕量特定核酸序列而應(yīng)用的任何分子生物學(xué)技術(shù)，該技術(shù)指數(shù)級(jí)擴(kuò)增模板核酸序列。具體地說，適宜的擴(kuò)增技術(shù)包括如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)及其改良變異的技術(shù)。PCR是一種已知的高度敏感的技術(shù)，應(yīng)用廣泛[見，例如，Innis et al.，PCR ProtocolsA Guide to Methods andApplications，Academic Press，Inc.，San Diego(1990)；Dieffenbach andDveksler，PCR PrimerA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Plainview NY(1995)；以及美國專利號(hào)4,683,195，4,800,195和4,965,188]。LCR是一種更近期開發(fā)的技術(shù)[Landegren et al.，Science 2411077-80(1988)and Barany et al.，PCR Methods andApplications 15-16(1991)；LCR試劑盒可以從Stratagene購買]。眾所周知，LCR特異性非常高，可以檢測點(diǎn)突變。在特定情況下，需要結(jié)合PCR和LCR技術(shù)來改善檢測的準(zhǔn)確性。根據(jù)本發(fā)明，還可應(yīng)用其他擴(kuò)增技術(shù)。
寡核苷酸擴(kuò)增引物通常以配對的單鏈寡核苷酸形式提供，一個(gè)是正義方向(5’→3’)，另一個(gè)是反義(3’←5’)方向。這些特定引物對在最佳條件下，可以用來鑒定特定基因或疾病。此外，還可應(yīng)用相同的引物對、巢式寡聚物、甚至寡聚物變性池，在不嚴(yán)格的條件下，探測和/或定量密切相關(guān)的DNA或RNA序列。
這些寡核苷酸還可用于多種本領(lǐng)域熟知的方法，來延長特定核苷酸序列。這些方法允許應(yīng)用一種已知序列測定其鄰近的未知序列，因此，能夠探測并測定上游序列，如啟動(dòng)子和調(diào)控元件。
例如，限制位點(diǎn)聚合酶鏈反應(yīng)是一種應(yīng)用普遍引物獲得已知位點(diǎn)鄰近未知序列的直接方法[見，如Gobinda et al.，PCR Methods Applic 2318-22(1993)]。在該方法中，基因組DNA首次在兩種引物的存在下擴(kuò)增，這兩種引物一種與連接序列配對，另一種與已知位點(diǎn)特異性配對。獲得的擴(kuò)增序列再進(jìn)行第二輪PCR，應(yīng)用的引物一種是與上一輪相同的連接引物，另一種特異性引物位于上一輪引物之內(nèi)。每一輪PCR的產(chǎn)物都應(yīng)用適宜的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄，并應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行序列分析。
反向PCR法應(yīng)用基于已知區(qū)域的分歧引物擴(kuò)增或延長序列[Trigliaet al.，Nucleic Acids Res 168186(1988)]。引物可以應(yīng)用Oligo 4.0(National Biosciences，Inc.，Plymouth MN)進(jìn)行設(shè)計(jì)，長度為22-30個(gè)核苷酸，GC含量≥50％，與靶序列的退火溫度大約為68℃-72℃。該方法應(yīng)用幾種限制性內(nèi)切酶，在一個(gè)基因的已知區(qū)域內(nèi)形成適宜的片段。該片段通過分子內(nèi)連接環(huán)化，用于PCR的模板。
俘獲PCR是擴(kuò)增人類或酵母(YAC)人工染色體已知序列的鄰近DNA片段的PCR方法[Lagerstrom et al.，PCR Methods Applic 1111-9(1991)]。俘獲PCR在進(jìn)行PCR以前，也需要多種限制性內(nèi)切酶消化、連接，將一段經(jīng)工程學(xué)修飾的雙鏈序列引入DNA分子的未知部分。游走PCR是以基因游走為靶向的方法，允許獲得未知序列[Parker et al.，Nucleic Acids Res 193055-60(1991)]。PromoterFinderTM試劑盒(Clontech，Palo Alto，CA)應(yīng)用PCR、巢式引物和特定文庫在基因組DNA中“游走”。該方法不必篩選文庫，對于發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子/外顯子的連接點(diǎn)非常有用。
這些方法可用于探測基因組文庫，延長5’序列，并獲得內(nèi)源性hparp2基因組序列，包括元件如啟動(dòng)子、內(nèi)含子、操作子、增強(qiáng)子、抑制子等。篩選全長cDNAs的優(yōu)選文庫是已經(jīng)大小選擇、并包括大型cDNAs的文庫。此外，優(yōu)選隨機(jī)備好的文庫，因?yàn)檫@些文庫可能包括更多含有5’和基因上游區(qū)域的序列。
寡核苷酸還可用于描繪內(nèi)源性基因組序列圖。應(yīng)用眾所周知的技術(shù)，可以將序列繪于某一染色體上，或某一染色體的具體區(qū)域。這些技術(shù)包括染色體延展原位雜交[Venna et al.，Human ChromosomesAmanual ofBasic Technique，Pergamon Press，New York(1988)]，流式分類染色體制備，或人工染色體構(gòu)建，如YACs、細(xì)菌人工染色體(BACs)、細(xì)菌P1構(gòu)建物或單染色體cDNA文庫。
在擴(kuò)展繪制基因圖的過程中，染色體制劑雜交和物理繪制技術(shù)，如應(yīng)用已經(jīng)建立的染色體標(biāo)記進(jìn)行連接分析，其價(jià)值是無法衡量的?；蚶L圖的實(shí)例見于Science 270410f(1995)和Science 2651981f(1994)。通常一個(gè)基因在另一種哺乳動(dòng)物染色體上的位置，可以揭示相關(guān)標(biāo)記，即使尚不知曉該基因位于人類哪條染色體上、或染色體的哪個(gè)臂上。應(yīng)用物理繪制技術(shù)，可以將這些序列定位于染色體的某一特定結(jié)構(gòu)區(qū)域。這為研究人員應(yīng)用定位克隆或其他基因發(fā)現(xiàn)技術(shù)探求疾病基因提供了非常有價(jià)值的信息。一旦通過基因連接技術(shù)將一種疾病或綜合征初步定位于某一基因組區(qū)域，任何經(jīng)基因繪圖技術(shù)定位于該區(qū)域的序列都可能成為進(jìn)一步研究的相關(guān)基因或調(diào)控基因[見，如Gatti et al.，Nature 336577-80(1988)]。本發(fā)明的多核苷酸也可用于在正常人、攜帶者或患病個(gè)體中探測由于轉(zhuǎn)位、插入等導(dǎo)致的染色體位置變異。
本發(fā)明提供的DNA序列信息還可用于開發(fā)不表達(dá)hPARP2或表達(dá)hPARP2變異體的動(dòng)物模型，如應(yīng)用同源重組或“敲除”策略[Capecchi，Science 2441288-92(1989)]。這些動(dòng)物可以成為體內(nèi)研究hPARP2活性及其調(diào)控因子的模型。
如本文所述，本發(fā)明還提供了可以識(shí)別編碼hPARP2多核苷酸并與之雜交的反義核酸序列?？梢酝ㄟ^設(shè)計(jì)針對hparp2基因調(diào)控區(qū)的反義序列來修飾基因表達(dá)，所述調(diào)控區(qū)如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和內(nèi)含子。優(yōu)選的寡核苷酸源自轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，如在前導(dǎo)序列的-10～+10之間。還可將反義RNA和DNA設(shè)計(jì)成通過抑制與核糖體的結(jié)合、防止轉(zhuǎn)錄來阻斷mRNA翻譯。一般技術(shù)人員應(yīng)該理解，本發(fā)明的反義分子包括那些能夠特異性識(shí)別hparp2 DNA并與之雜交的分子(通過比較hparp2 DNA和編碼其他已知分子的DNA來測定)。本發(fā)明反義分子還包括那些識(shí)別編碼hPARP2蛋白家族其他成員的DNA并與之雜交的分子。能夠與編碼hPARP2蛋白家族其他成員的多種DNA雜交的反義多核苷酸可以通過序列比較，鑒別hPARP2蛋白家族的特征性或署名序列來鑒定。因此，這些反義分子與靶hparp2序列優(yōu)選至少95％一致，更優(yōu)選至少98％一致，更優(yōu)選至少99％一致。
反義多核苷酸與表達(dá)hparp2 mRNA細(xì)胞的hPARP2表達(dá)調(diào)控特異相關(guān)。能夠與hparp2表達(dá)調(diào)控序列或hparp2 RNA特異結(jié)合的反義多核苷酸(優(yōu)選10-20bp寡核苷酸)可以通過如病毒載體、或膠質(zhì)擴(kuò)散系統(tǒng)如脂質(zhì)體，引入細(xì)胞。該反義寡核苷酸與細(xì)胞內(nèi)靶hparp2核苷酸序列結(jié)合，防止靶序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯。本發(fā)明的硫代磷酸酯和甲基磷酸化反義寡核苷酸特別可以考慮用于治療。反義寡核苷酸還可進(jìn)一步在其5’端修飾，攜帶聚-L-賴氨酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白聚賴氨酸或膽固醇部分[反義技術(shù)的近期綜述見，Delihas et al.，Nature Biotechnology 15751-3(1997)]。
本發(fā)明還包括應(yīng)用核糖酶技術(shù)調(diào)節(jié)hPARP2表達(dá)的方法[綜述見，Gibson and Shillitoe，Mol Biotechnol 7125-37(1997)]。核糖酶技術(shù)可以通過(i)互補(bǔ)RNA與靶mRNA雜交，以及(ii)通過互補(bǔ)RNA固有的核酸內(nèi)切酶活性裂解雜交mRNA，以序列特異性的方式抑制hparp2 mRNA的翻譯。核糖酶可以通過經(jīng)驗(yàn)性方法鑒定，如應(yīng)用互補(bǔ)寡核苷酸核糖核酸酶保護(hù)試驗(yàn)，但更優(yōu)選通過掃描靶分子尋求核糖酶裂解位點(diǎn)來特異性設(shè)計(jì)核糖酶[Bramlage et al.，Trends Biotechnol 16434-8(1998)]。可以應(yīng)用本領(lǐng)域眾所周知的外源性或內(nèi)源性導(dǎo)入技術(shù)，將核糖酶導(dǎo)入靶細(xì)胞。外源性技術(shù)包括應(yīng)用靶脂質(zhì)體或直接局部注射。內(nèi)源性方法包括應(yīng)用病毒載體或非病毒質(zhì)粒。
當(dāng)核糖酶被設(shè)計(jì)成與編碼hPARP2多核苷酸獨(dú)特區(qū)互補(bǔ)時(shí)，該核糖酶可以特異性調(diào)節(jié)hPARP2的表達(dá)。因此，“特異性調(diào)節(jié)”意味著，本發(fā)明核糖酶只識(shí)別編碼hPARP2的多核苷酸。同樣，核糖酶可以設(shè)計(jì)成調(diào)節(jié)全部或部分hPARP2蛋白家族的表達(dá)。這一類型的核糖酶可以設(shè)計(jì)成識(shí)別全部或部分編碼hPARP2家族成員的多核苷酸的保守核苷酸序列。
本發(fā)明還包括通過寡核苷酸指導(dǎo)的三螺旋結(jié)構(gòu)形成(也被稱為Hogeboom堿基配對法)來調(diào)節(jié)hparp2轉(zhuǎn)錄的方法[綜述見，Lavrovsky etal.，Biochem Mol Med 6211-22(1997)]。三螺旋結(jié)構(gòu)形成可以通過應(yīng)用序列特異性寡核苷酸達(dá)成，所述寡核苷酸可以在Watson-Crick模型定義的大裂隙與雙鏈DNA雜交。形成的三螺旋雜交體包括原來雙螺旋體的能力，如有充分的空間結(jié)合聚合酶、轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)節(jié)分子。優(yōu)選的雜交靶序列包括啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域，能夠轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)hPARP2的表達(dá)。能夠形成三螺旋結(jié)構(gòu)的寡核苷酸還可以與DNA損傷劑結(jié)合，然后用于DNA序列的位點(diǎn)特異性共價(jià)修飾。見Lavrovsky et al.，supra。
本發(fā)明的反義RNA和DNA分子以及核糖酶都可以按照本領(lǐng)域眾所周知的RNA分子合成法制備。這些包括化學(xué)合成寡核苷酸的技術(shù)，如固相亞磷酰胺合成法。此外，RNA分子還可通過體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄編碼反義RNA分子的DNA序列生產(chǎn)。這些DNA序列可以整合到多種含有適宜RNA聚合酶啟動(dòng)子的載體中，所述啟動(dòng)子如T7或SP6。此外，構(gòu)成或誘導(dǎo)合成反義RNA的反義cDNA構(gòu)建物也可以引入細(xì)胞系、細(xì)胞或組織。
導(dǎo)致基因產(chǎn)物正常功能喪失的基因突變可能是導(dǎo)致hPARP2相關(guān)性疾病狀態(tài)的基礎(chǔ)。本發(fā)明包括恢復(fù)hPARP2活性的基因治療，因此可用于治療與hPARP2酶相關(guān)的以聚(ADP-核糖)聚合酶活性缺乏或喪失為特征的疾病。通過應(yīng)用載體，特別是病毒載體(如，腺病毒、腺相關(guān)病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒)，或者活體外應(yīng)用物理DNA轉(zhuǎn)移方法(如脂質(zhì)體或化學(xué)治療)，可以在活體外、原位或體內(nèi)將功能性hparp2基因成功導(dǎo)入適宜細(xì)胞[見，如Anderson，Nature 392(6679Suppl)25-30(1998)]。此外，在其他一些疾病狀態(tài)也可考慮應(yīng)用，在這些疾病中，防止hPARP2表達(dá)或抑制hPARP2活性可以幫助治療這些疾病。反義治療或基因治療可用于負(fù)向調(diào)節(jié)hPARP2表達(dá)。
本發(fā)明提供的DNA和氨基酸序列信息還使系統(tǒng)分析hPARP2蛋白的結(jié)構(gòu)和功能成為可能。hPARP2的DNA和氨基酸序列信息還可以鑒定那些與hPARP2多肽可以發(fā)生相互作用的分子。調(diào)節(jié)(即增強(qiáng)、減弱或阻斷)hPARP2活性的制劑可以通過下面的方法鑒別，如將假定的調(diào)節(jié)子與hPARP2共同孵育，然后測定該假定調(diào)節(jié)子對hPARP2活性的作用。調(diào)節(jié)hPARP2活性的化合物的選擇性可以通過比較該化合物對hPARP2及其他蛋白的調(diào)節(jié)活性來評價(jià)。基于細(xì)胞的試驗(yàn)，如二次雜交或三次雜交試驗(yàn)(鑒定編碼結(jié)合配體DNA)、和分離雜交試驗(yàn)(鑒定抑制hPARP2多肽與眾所周知的結(jié)合配體相互作用的抑制劑)，以及體外方法，包括固定hPARP2多肽、hparp2多核苷酸或其結(jié)合配體的試驗(yàn)、和溶解試驗(yàn)均在本發(fā)明考慮之列。
選擇性調(diào)節(jié)子包括，例如與hPARP2多肽或hPARP2編碼多核苷酸特異性結(jié)合的抗體和其他多肽或蛋白，與hPARP2多肽或hPARP2編碼多核苷酸特異性結(jié)合的寡核苷酸，以及與hPARP2多肽或hPARP2編碼多核苷酸特異性反應(yīng)的其他非肽化合物物(如分離或合成的有機(jī)分子)。調(diào)節(jié)子還包括上述化合物，但與hPARP2多肽的特異性結(jié)合配體相互作用。hPARP2的突變形式，如那些影響野生型hPARP2生物活性或細(xì)胞定位的突變形式，也在本發(fā)明考慮之列。目前，開發(fā)選擇性調(diào)節(jié)子的優(yōu)選靶物質(zhì)包括，例如(1)hPARP2多肽的胞漿或跨膜區(qū)，該區(qū)域與其他蛋白接觸和/或?qū)PARP2定位于細(xì)胞內(nèi)；(2)hPARP2多肽的細(xì)胞外區(qū)，該區(qū)域與結(jié)合配體特異性結(jié)合；(3)與底物結(jié)合的hPARP2多肽區(qū)；(4)hPARP2多肽的變構(gòu)調(diào)節(jié)位點(diǎn)；(5)介導(dǎo)multimerization的hPARP2多肽區(qū)。
其他選擇性調(diào)節(jié)子包括那些特異性識(shí)別hPARP2編碼核苷酸序列調(diào)控區(qū)的因子。hPARP2活性的調(diào)節(jié)子可以用于治療多種涉及hPARP2活性異常的疾病和生理病況。
hPARP2編碼多核苷酸還可用于診斷由hPARP2表達(dá)或活性異常導(dǎo)致的疾病，或與hPARP2表達(dá)或活性異常相關(guān)的疾病。例如，編碼hPARP2的多核苷酸序列可用于生物樣本的雜交或PCR試驗(yàn)，檢測hPARP2表達(dá)的異常，所述生物樣本如源于活檢或尸檢的組織或體液樣本或提取物。這些定性或定量方法包括Southern或northern分析，點(diǎn)雜交印跡，或其他基于膜的技術(shù)；PCR技術(shù)；dipstick，pin或芯片技術(shù)；以及ELISA或其他多樣本形式技術(shù)。這些類型的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，并可通過購買診斷試劑盒進(jìn)行測定。
這些試驗(yàn)方法可以根據(jù)具體情況來評價(jià)一種特定治療方案的有效性，也可用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、臨床試驗(yàn)或監(jiān)測某個(gè)體患者的治療。為了提供診斷疾病的基礎(chǔ)，必須建立hPARP2表達(dá)的正?；驑?biāo)準(zhǔn)概況。為了達(dá)成這一目的，可以在適宜雜交或擴(kuò)增的條件下，將從正常受試者獲取的生物樣本與hparp2多核苷酸結(jié)合。標(biāo)準(zhǔn)雜交可以進(jìn)行量化，方法是在相同的試驗(yàn)條件下，應(yīng)用已知數(shù)量的純化hparp2多核苷酸，比較正常受試者與系列稀釋的陽性對照之間的數(shù)值。從正常樣本獲得的標(biāo)準(zhǔn)值可以同從與患者中獲得的樣本值進(jìn)行比較，所述患者的疾病或功能紊亂可能與hPARP2表達(dá)相關(guān)。標(biāo)準(zhǔn)值與測試值之間的差異說明疾病狀態(tài)的存在。如果所患疾病被確立，然后給予一種現(xiàn)有治療制劑，就可以產(chǎn)生治療效果或治療值。該試驗(yàn)還可以常規(guī)重復(fù)進(jìn)行，以評價(jià)測試值是繼續(xù)發(fā)展，還是回復(fù)到正?；驑?biāo)準(zhǔn)水平。持續(xù)的治療情況可以通過一段時(shí)期如數(shù)日或數(shù)月的治療效果來顯示。
抗hPARP2抗體可以用來診斷以hPARP2多肽異常表達(dá)為特征、或與hPARP2多肽異常表達(dá)相關(guān)的病況、功能紊亂或疾病。hPARP2多肽的診斷試驗(yàn)包括應(yīng)用標(biāo)記抗體，探測生物樣本中hPARP2多肽的方法，所述生物樣本如體液、細(xì)胞、組織、切除物或這些材料的提取物。本發(fā)明多肽或抗體可以經(jīng)修飾應(yīng)用，也可不經(jīng)修飾就直接應(yīng)用。優(yōu)選地，如本文所述，通過與一個(gè)可檢測標(biāo)記部分共價(jià)或非共價(jià)連接，來標(biāo)記多肽或抗體。
依靠本發(fā)明，可以應(yīng)用基于抗體的方法，探測生物樣本中hPARP2多肽的存在。應(yīng)用抗體探測蛋白質(zhì)存在的試驗(yàn)以前就有所描述，可以按照已知形式進(jìn)行，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，放射免疫試驗(yàn)(RIA)，以及熒光激活細(xì)胞分類技術(shù)(FACS)和流式細(xì)胞技術(shù)，western印跡，夾心試驗(yàn)等。這些方法通?；趯⒖贵w與可疑含有hPARP2蛋白的樣本共同孵育，然后檢測抗體、蛋白復(fù)合物的存在?？贵w可以在孵育步驟之前、期間或之后進(jìn)行標(biāo)記?？贵w的具體濃度、孵育溫度和時(shí)間、以及這些試驗(yàn)的其他條件，都可由于多種因子而發(fā)生變化，這些因子包括樣本中抗原的濃度、樣本的自然特性等。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)常規(guī)試驗(yàn)方法，決定每種試驗(yàn)的具體操作條件和最適試驗(yàn)條件[見，如Hampton etal.，Serological MethodsA Laboratory Manual，APS Press，St Paul，MN(1990)]。
為了提供量化樣本中hPARP2蛋白或疾病診斷的基礎(chǔ)，必須建立hPARP2多肽表達(dá)的正常值或標(biāo)準(zhǔn)值。為了達(dá)成這一目的，可以將從正常樣本或正常受試者中獲得的體液或細(xì)胞提取物與hPARP2多肽抗體結(jié)合，所述正常受試者可以是人，也可以是動(dòng)物。在已知數(shù)量的抗體與已知濃度的純化hPARP2多肽結(jié)合的情況下，標(biāo)準(zhǔn)復(fù)合物形成的量可以通過將其與系列稀釋的陽性對照進(jìn)行比較而量化。這樣，就可以將正常樣本獲得的標(biāo)準(zhǔn)值與受試樣本獲得的值進(jìn)行比較，如受試者可能受到hPARP2表達(dá)相關(guān)性疾病或功能紊亂的困擾。標(biāo)準(zhǔn)值與測試值之間的差異說明疾病狀態(tài)的存在。鑒定hPARP2活性調(diào)節(jié)子的方法hPARP2多肽及其具有生物活性的片段，可以在多種藥物篩選技術(shù)中用來篩選假定的調(diào)節(jié)化合物。本文應(yīng)用的術(shù)語“調(diào)節(jié)子”是指一種化合物，作為hPARP2活性的加強(qiáng)劑或拮抗劑。根據(jù)本發(fā)明，調(diào)節(jié)子包括活性的變構(gòu)調(diào)節(jié)子以及活性的抑制劑。hPARP2的“加強(qiáng)劑”是一種化合物，可以增強(qiáng)或提高h(yuǎn)PARP2所有生物功能的活性。這種加強(qiáng)劑的一個(gè)示例是增加hPARP2與損傷DNA或多聚ADP-核糖結(jié)合能力的制劑。hPARP2的“拮抗劑”是一種化合物，可以減弱或消除hPARP2所有生物功能的活性。這種拮抗劑的一個(gè)示例是抗hPARP2抗體。
因此，本發(fā)明提供了一種方法，用于篩選與hPARP2多肽具有特異性親和力的多種測試化合物，包括提供多種測試化合物；在適宜條件下，在充足的結(jié)合時(shí)間內(nèi)，將hPARP2多肽與多種測試化合物的每一種進(jìn)行結(jié)合；并檢測hPARP2多肽與每種測試化合物的結(jié)合，這樣就可以鑒定那些可以與hPARP2特異性結(jié)合的測試化合物。
本發(fā)明還提供了一種鑒定hPARP2多肽生物活性調(diào)節(jié)子的方法，包括以下步驟a)將化合物與hPARP2多肽接觸，b)在適宜生物活性表現(xiàn)的條件下，將步驟a)的混合物與底物孵育，c)測定生物活性的量；以及d)將步驟c)得出的生物活性量與沒有與化合物孵育的hPARP2的生物活性量進(jìn)行比較，因此可以測定該化合物是否刺激或抑制了hPARP2的生物活性。在該方法的一個(gè)實(shí)施方案中，hPARP2多肽是來自hPARP2非催化區(qū)的片段，提供了一種鑒定hPARP2變構(gòu)調(diào)節(jié)子的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，hPARP2多肽是來自hPARP2催化區(qū)的片段，提供了一種鑒定其生物活性抑制劑的方法。
因此，在這些方法中應(yīng)用的多肽可以自由溶于溶液中，固定于固體支持物，在細(xì)胞表面呈現(xiàn)，或位于細(xì)胞內(nèi)?？梢詼y定對活性的調(diào)節(jié)或?qū)PARP2多肽與待測試劑之間結(jié)合復(fù)合物形成的調(diào)節(jié)。根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法，hPARP2多肽可以進(jìn)行生化或基于細(xì)胞的高產(chǎn)量篩選(HTS)試驗(yàn)，包括研究受體配體相互作用的載黑素細(xì)胞試驗(yàn)系統(tǒng)，基于酵母的試驗(yàn)系統(tǒng)，和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)[綜述見Jayawickreme andKost，Curr Opin Biotechnol 8629-34(1997)]。自動(dòng)或小型HTS試驗(yàn)也在考慮之列[如Houston and Banks，Curr Opin Biotechnol 8734-40(1997)]。
這些HTS試驗(yàn)可以用于篩選化合物文庫，鑒定具有所需特征的特定化合物。任何化合物文庫都可應(yīng)用，包括化學(xué)文庫，天然產(chǎn)物文庫，包括隨機(jī)或設(shè)計(jì)寡肽、寡核苷酸或其他有機(jī)化合物的組合文庫。
化學(xué)文庫可以包括已知化合物，已知化合物的所有結(jié)構(gòu)類似物，或從天然產(chǎn)物篩選鑒定的化合物。
天然產(chǎn)物文庫是從天然材料中分類的物質(zhì)集合，典型的天然材料包括微生物、動(dòng)物、植物或海洋生物。天然產(chǎn)物可以通過以下方法從源材料中分離，如通過微生物發(fā)酵，然后分離并提取發(fā)酵肉湯，或從微生物或組織(植物或動(dòng)物)中直接提取。天然產(chǎn)物文庫包括聚酮化合物，非核糖體肽，及其變異體(包括非天然變異體)[綜述見Cane et al.，Science28263-8(1998)]。
組合文庫包括以混合物形式存在的大量相關(guān)化合物，如肽、寡核苷酸或其他有機(jī)化合物。這些化合物可以通過傳統(tǒng)自動(dòng)合成協(xié)議、PCR、克隆或所有合成方法相對簡單地設(shè)計(jì)和制備。具體的目標(biāo)是肽和寡核苷酸組合文庫。
其他目標(biāo)文庫還包括肽文庫、蛋白質(zhì)文庫、擬態(tài)肽文庫、多種類似合成集合文庫、重組文庫和多肽文庫[組合化學(xué)和因此創(chuàng)建的文庫綜述見Myers，Curr Opin Biotechnol 8701-7(1997)]。
一旦化合物經(jīng)鑒定顯示hPARP2功能調(diào)節(jié)子活性，就可以進(jìn)行最優(yōu)化程序，以提高這種活性的力度和/或選擇性。這一結(jié)構(gòu)活性關(guān)系(SAR)分析典型地包括一系列重復(fù)過程，即對化合物結(jié)構(gòu)的選擇性修飾和它們與生化或生物活性的相關(guān)性。可以設(shè)計(jì)顯示所需活性的相關(guān)化合物家族，家族中的某些成員可以作為治療備選物質(zhì)。
本發(fā)明還包括應(yīng)用競爭性藥物篩選試驗(yàn)，其中，能夠與hPARP2多肽結(jié)合的中和抗體與測試化合物，與hPARP2多肽特異性競爭性結(jié)合。在這種情況下，抗體可用于檢測任何化合物的存在，如與hPARP2多肽具有一個(gè)或多個(gè)相同抗原決定物質(zhì)的另一種肽。治療應(yīng)用hPARP2編碼多核苷酸和hPARP2多肽本發(fā)明提供了一種治療或預(yù)防性抑制hPARP2表達(dá)或活性的方法。該方法包括應(yīng)用有效劑量的hPARP2拮抗劑，抑制hPARP2的表達(dá)或活性。本發(fā)明還提供了一種治療組織損傷的方法，所述組織損傷來自于壞死或凋亡導(dǎo)致的細(xì)胞損傷或死亡，該方法包括給動(dòng)物應(yīng)用有效劑量的化合物，抑制hPARP2活性。這一方法還可用于治療人類疾病，所述疾病的癥狀或病理是由hPARP2表達(dá)或活性介導(dǎo)的。
該方法還可進(jìn)一步包括應(yīng)用另一種聚(ADP-核糖)聚合酶活性的拮抗劑，所述另一種活性如與酶PARP1、tankyrase等相關(guān)的活性。在本實(shí)施方案中適于應(yīng)用的PARP1拮抗劑示例包括，例如，Banasik et al.，J Biol Chem 2671569-75(1992)、PCT專利公開WO 99/11623和WO99/11649中所描述的化合物。此外，hPARP2抑制方法還可應(yīng)用同時(shí)拮抗hPARP2和其他具有PARP活性酶的化合物。
本文應(yīng)用的“治療”是指在易患動(dòng)物中預(yù)防一種功能紊亂的發(fā)生，盡管經(jīng)診斷該動(dòng)物尚未患該??；抑制功能紊亂，即使其停止發(fā)展；減輕功能紊亂，即導(dǎo)致其消退，或改善功能紊亂，即減輕功能紊亂相關(guān)癥狀的嚴(yán)重程度?！肮δ芪蓙y”包括醫(yī)學(xué)功能紊亂、疾病、病況、綜合征等，沒有限制。
具體地說，本發(fā)明的方法還可用于治療或預(yù)防已經(jīng)或可能罹患炎癥紊亂的人。本發(fā)明的一個(gè)方面源自hPARP2及其功能衍生物與損傷DNA相互作用、傳遞信號(hào)或誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的能力。沒有任一理論限制，目前認(rèn)為，因?yàn)檠装Y涉及的過程可能損傷DNA，而在這樣的條件下，hPARP2可能不適宜地誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，因此，hPARP2拮抗劑可以用來抑制炎癥相關(guān)性損傷。
本文應(yīng)用的“炎癥紊亂”可以指任意一種疾病、功能紊亂或綜合征，其中，過激或不受調(diào)控的炎癥應(yīng)答導(dǎo)致嚴(yán)重的炎癥癥狀，宿主組織損傷，或組織功能喪失?！把装Y紊亂”還可以指由于白細(xì)胞和/或中性粒細(xì)胞在趨化作用下的流入而介導(dǎo)的病理狀態(tài)。
本文應(yīng)用的“炎癥”是指由組織損傷或破壞引起的局部保護(hù)性反應(yīng)，可以破壞、稀釋或屏蔽(隔絕)損傷物質(zhì)和損傷組織。應(yīng)該指出，炎癥與在趨化作用下涌入的白細(xì)胞和/或中性粒細(xì)胞有關(guān)。炎癥可以由病原微生物和病毒引起的感染導(dǎo)致，也可通過非感染性途經(jīng)導(dǎo)致，如創(chuàng)傷或心肌梗塞或腦卒中后再灌注，對異體抗原的免疫應(yīng)答，以及自身免疫反應(yīng)。因此，與本發(fā)明有關(guān)的炎癥紊亂包括與特異性防御系統(tǒng)反應(yīng)或非特異性防御系統(tǒng)反應(yīng)相關(guān)的功能紊亂。
本文應(yīng)用的術(shù)語“特異性防御系統(tǒng)”是指與特異性抗原發(fā)生反應(yīng)的免疫系統(tǒng)組分。由特異性防御系統(tǒng)導(dǎo)致的炎癥的示例包括對異體抗原的經(jīng)典反應(yīng)，自身免疫性疾病，以及T細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)性超敏反應(yīng)。慢性炎癥性疾病，對實(shí)體移植組織或器官的排斥反應(yīng)，如腎臟和骨髓移植，以及移植物抗宿主病(GVHD)也是特異性防御系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的示例。
本文應(yīng)用的術(shù)語“非特異性防御系統(tǒng)”是指由不具有免疫記憶的白細(xì)胞(如粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞)介導(dǎo)的炎癥紊亂。至少部分由非特異性防御系統(tǒng)反應(yīng)導(dǎo)致的炎癥示例包括與下述疾病相關(guān)的炎癥，如成人(急性)呼吸窘迫綜合征(ARDS)或多器官損傷綜合征；再灌注損傷；急性腎小球腎炎；反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎；急性炎癥性組分導(dǎo)致的皮膚?。患毙曰撔阅X膜炎或其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥紊亂如腦卒中；熱損傷；炎癥性腸??；粒細(xì)胞輸注相關(guān)性綜合征；以及細(xì)胞因子誘導(dǎo)的毒性。
本文應(yīng)用的“自身免疫性疾病”是指任意一組疾病，其中，組織損傷與體液或細(xì)胞介導(dǎo)的對機(jī)體自身成分的反應(yīng)有關(guān)。本文應(yīng)用的“過敏性疾病”是指由過敏導(dǎo)致的任何綜合征、組織損傷或組織功能喪失。本文應(yīng)用的“關(guān)節(jié)炎性疾病”是指由多種原因?qū)е碌?、以關(guān)節(jié)炎癥性損害為特征的任何一種疾病。本文應(yīng)用的“皮炎”是指一大類皮膚病中的任意一種，該類皮膚病由多種原因?qū)е?，以皮膚炎癥為特征。本文應(yīng)用的“移植物排斥反應(yīng)”是指針對移植組織(包括器官或細(xì)胞(如骨髓))的任何免疫反應(yīng)，其特征是移植或周圍組織的功能喪失、疼痛、腫脹、白細(xì)胞增多或血小板減少。
本發(fā)明治療方法包括改善與炎癥細(xì)胞激活相關(guān)的功能紊亂的方法?！把装Y細(xì)胞激活”是指由刺激(包括但不限于細(xì)胞因子、抗原或自身抗體)誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖反應(yīng)，可溶性介質(zhì)的產(chǎn)生(包括但不限于細(xì)胞因子、氧基、酶、前列腺素類化合物或血管活性胺)，或在炎癥細(xì)胞(包括但不限于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞(多形核白細(xì)胞包括中性粒細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞和嗜酸細(xì)胞)、肥大細(xì)胞、樹突細(xì)胞、Langerhans細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)表面表達(dá)新的介質(zhì)或介質(zhì)表達(dá)量增加(包括但不限于主要組織相容性抗原或細(xì)胞粘附分子)。本領(lǐng)域技術(shù)人員指出，在這些細(xì)胞中一種或多種表型的聯(lián)合激活，可能導(dǎo)致了炎癥紊亂的發(fā)生、持續(xù)存在或惡化。
本發(fā)明方法能夠治療多種疾病，如關(guān)節(jié)炎性疾病，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎、脊柱炎；Behcet??；膿毒血癥，感染性休克，內(nèi)毒素性休克，革蘭陰性菌膿毒血癥，革蘭陽性菌膿毒血癥，以及中毒性休克綜合征；繼發(fā)于敗血癥、創(chuàng)傷或出血的多器官損傷綜合征；眼部疾病如過敏性結(jié)膜炎，春季結(jié)膜炎，葡萄膜炎，甲狀腺相關(guān)性眼?。皇人嵝粤＜?xì)胞肉芽腫；肺或呼吸系統(tǒng)疾病如哮喘，慢性支氣管炎，過敏性鼻炎，ARDS，慢性肺炎癥性疾病(如慢性阻塞性肺病)，硅肺，肺結(jié)節(jié)病，胸膜炎，齒槽炎，脈管炎，肺炎，支氣管擴(kuò)張和肺氧毒性；心肌、腦或四肢的再灌注損傷；纖維化如囊性纖維化；瘢痕疙瘩形成或瘢痕組織形成；動(dòng)脈硬化；自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，自身免疫性甲狀腺炎，多發(fā)性硬化，某些類型的糖尿病，和雷諾綜合征；移植排斥反應(yīng)如GVHD和同種移植物排斥反應(yīng)；慢性腎小球性腎炎；炎癥性腸病如局限性回腸炎，潰瘍性結(jié)腸炎和壞死性小腸結(jié)腸炎；炎癥性皮膚病如接觸性皮炎，遺傳性過敏性皮炎，銀屑病或風(fēng)疹；感染導(dǎo)致的發(fā)熱和肌痛；中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病如腦膜炎，腦炎，由于輕微損傷導(dǎo)致的腦、脊髓損傷；Sjogren’s綜合征；涉及白細(xì)胞滲出的疾病；酒精性肝炎；細(xì)菌性肺炎；抗原抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾??；低血容量性休克；I型糖尿?。患毙院瓦t發(fā)性過敏反應(yīng)；由于白細(xì)胞不調(diào)或轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的疾病狀態(tài)；熱損傷；粒細(xì)胞輸注相關(guān)性綜合征；以及細(xì)胞因子誘導(dǎo)的毒性。
本方法還可用于治療已經(jīng)經(jīng)歷或可能經(jīng)歷再灌注損傷的人，再灌注損傷即組織經(jīng)歷一段時(shí)間缺血后再灌注導(dǎo)致的損傷。術(shù)語“缺血”是指由于動(dòng)脈血流阻塞導(dǎo)致的局部組織貧血。短暫缺血后的再灌注可以特征性導(dǎo)致中性粒細(xì)胞激活，并通過血管壁內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入受累區(qū)域。激活中性粒細(xì)胞的不斷累積反過來導(dǎo)致反應(yīng)性氧代謝，進(jìn)一步損傷受累組織或器官。這一“再灌注損傷”現(xiàn)象通常與以下病況有關(guān)，如血管性腦卒中(包括全腦缺血和局灶性缺血)，出血性休克，心肌缺血或心肌梗塞，器官移植，以及腦血管痙攣。例如，再灌注損傷會(huì)在下述情況下發(fā)生，如在心臟搭橋術(shù)后或心臟搏動(dòng)停止期間，即在心臟停止血液供應(yīng)后開始再灌注時(shí)。在這些情況下，抑制hPARP2表達(dá)或活性預(yù)期可以導(dǎo)致再灌注損傷的減輕。
關(guān)于神經(jīng)系統(tǒng)，全腦缺血可以在全腦血液供應(yīng)停止一段時(shí)間的情況下發(fā)生。心臟停止搏動(dòng)也可導(dǎo)致全腦缺血。當(dāng)大腦的某部分正常血液供應(yīng)停止后，可以發(fā)生局灶性缺血。腦血管血栓阻塞、創(chuàng)傷性腦損傷、水腫或腦腫瘤可以導(dǎo)致局灶性腦缺血。即使是短暫的腦缺血，包括全腦性缺血和局灶性缺血，也可導(dǎo)致廣泛的神經(jīng)元損傷。盡管神經(jīng)組織損傷發(fā)生在缺血開始后的數(shù)小時(shí)或甚至數(shù)日，一些神經(jīng)組織的永久損傷可能在大腦停止血供后開始的幾分鐘就發(fā)生了。這種損傷大部分是由于谷氨酸酯的毒性和繼發(fā)組織再灌注，如由損傷內(nèi)皮細(xì)胞釋放的血管活性產(chǎn)物，以及由損傷組織釋放的毒性產(chǎn)物，如自由基和白三烯。
缺血還可發(fā)生于心臟的心肌梗塞和其他導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈阻塞的心血管疾病，冠狀動(dòng)脈阻塞可由動(dòng)脈硬化、血栓形成或血管痙攣導(dǎo)致。例如，相信本發(fā)明方法可用于治療心肌組織損傷，特別是哺乳動(dòng)物中由于心肌缺血或再灌注導(dǎo)致的損傷。
本發(fā)明還提供一種治療神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂的方法，包括應(yīng)用神經(jīng)保護(hù)性劑量的hPARP2拮抗劑?？蓱?yīng)用本發(fā)明方法治療的神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂包括如由于物理損傷或疾病導(dǎo)致的外周神經(jīng)病；頭部創(chuàng)傷如創(chuàng)傷性腦損傷，脊髓物理損傷，腦卒中相關(guān)性腦損傷，如與血管性腦卒中相關(guān)的缺氧和腦損傷，全腦性或局灶性腦缺血，以及腦再灌注損傷；脫髓鞘疾病如多發(fā)性硬化，以及與神經(jīng)變性相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂。神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂的示例進(jìn)一步包括但不限于，三叉神經(jīng)痛；舌咽神經(jīng)痛；Bell’s癱瘓；重癥肌無力；肌營養(yǎng)不良；肌萎縮性(脊髓)側(cè)索硬化(ALS)；進(jìn)行性肌萎縮；遺傳性進(jìn)行性延髓肌萎縮；herniated，ruptured orprolapsed invertebrate disk symdrome；頸椎關(guān)節(jié)強(qiáng)直；神經(jīng)叢功能紊亂；胸腔出口綜合征；周圍神經(jīng)病，如由鉛、氨苯砜、扁虱、卟啉癥或格林巴利綜合征導(dǎo)致的周圍神經(jīng)??；Alzheimer’s??；Huntington’s病和帕金森病。術(shù)語“神經(jīng)變性疾病”包括Alzheimer’s病，帕金森病，Huntington’s病和ALS。
本文應(yīng)用的“神經(jīng)保護(hù)性”是指能夠減輕、停止或改善神經(jīng)侵害的效果，或者是指能夠保護(hù)、復(fù)蘇或恢復(fù)受到神經(jīng)侵害的神經(jīng)組織的效果。
本文應(yīng)用的“神經(jīng)組織”是指構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)的多種組分，包括但不限于神經(jīng)元，神經(jīng)支持細(xì)胞，Schwann神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，這些結(jié)構(gòu)包括的脈管系統(tǒng)，或者支持這些結(jié)構(gòu)的脈管系統(tǒng)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)，腦，腦干，脊髓，中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)的連接部分，外周神經(jīng)系統(tǒng)，以及所有關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)。
本文應(yīng)用的“神經(jīng)侵害”是指任何對于神經(jīng)組織的損傷，以及由此導(dǎo)致的任何神經(jīng)失能或死亡。導(dǎo)致神經(jīng)侵害的原因可以是代謝性、毒性、神經(jīng)毒性、醫(yī)源性、熱或化學(xué)性損傷，包括但不限于血管腦卒中，全腦或局灶性腦缺血，缺氧，腦血管意外，創(chuàng)傷，手術(shù)，壓力，質(zhì)量效應(yīng)，出血，放射，血管痙攣，神經(jīng)變性疾病，感染，帕金森病，ALS，髓鞘形成/脫髓鞘疾病，癲癇，認(rèn)知障礙，谷氨酸酯異常及其繼發(fā)影響。
“預(yù)防神經(jīng)變性”包括預(yù)防患者變性的能力，所述患者已確診罹患神經(jīng)變性疾病，或者該患者有罹患神經(jīng)變性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。該術(shù)語還包括在已經(jīng)罹患神經(jīng)變性疾病或具有神經(jīng)變性疾病癥狀的患者中，預(yù)防神經(jīng)變性的進(jìn)一步發(fā)展。
本文應(yīng)用的“神經(jīng)功能”是指神經(jīng)系統(tǒng)的多種功能，包括提供機(jī)體內(nèi)部和外部環(huán)境的認(rèn)知，并使對多種感受的主動(dòng)和反射活動(dòng)成為可能。機(jī)體的結(jié)構(gòu)元件、以及機(jī)體對環(huán)境反應(yīng)的平衡發(fā)生了變化。
根據(jù)本發(fā)明，還提供了一種方法，包括給人應(yīng)用hPARP2拮抗劑，應(yīng)用劑量足以影響神經(jīng)元功能，特別是不通過NMDA神經(jīng)毒性介導(dǎo)的拮抗劑。這些神經(jīng)元活性可能包括刺激損傷的神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)元再生，預(yù)防神經(jīng)變性，并治療神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂。
本發(fā)明還涉及治療動(dòng)物心血管功能紊亂的方法，包括給動(dòng)物應(yīng)用治療有效劑量的抑制hPARP2活性的化合物。本文應(yīng)用的“心血管功能紊亂”是指任何可以導(dǎo)致心臟缺血或由心臟再灌注導(dǎo)致的功能紊亂。示例包括但不限于冠狀動(dòng)脈性疾病，心絞痛，心肌梗塞，由心臟停止搏動(dòng)導(dǎo)致的心血管組織損傷，由心臟搭橋?qū)е碌男难芙M織損傷，心源性休克，以及本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟知的相關(guān)病況，或者涉及心臟或脈管系統(tǒng)的功能障礙或組織損傷，特別是，但不限于與PARP激活相關(guān)的組織損傷。本發(fā)明方法在治療急性形式的上述心血管功能紊亂時(shí)特別有益。
本發(fā)明還涉及治療動(dòng)物腫瘤組織，如癌癥，生長的方法，包括給動(dòng)物應(yīng)用治療有效劑量的抑制hPARP2活性的化合物。在本實(shí)施方案中，該方法可能還包括同時(shí)給予化療或抗腫瘤藥物治療和/或放療。
瘤或腫瘤包括組織新生，在此過程中，細(xì)胞不受控制地進(jìn)行性擴(kuò)增。這種生長一些是良性的，但其他是“惡性的”，可以導(dǎo)致機(jī)體的死亡。惡性腫瘤或“癌癥”與良性增生的區(qū)別在于，癌癥除了快速細(xì)胞增殖外，還侵犯周圍組織，并轉(zhuǎn)移。而且，惡性腫瘤的特征在于它們顯著喪失分化特性(表現(xiàn)為顯著“未分化”)，同時(shí)喪失彼此之間、及與周圍組織之間的相對組織結(jié)構(gòu)。這一特征又稱為“間變”。
可以應(yīng)用本發(fā)明治療的腫瘤包括實(shí)體腫瘤，即癌和肉瘤。癌包括那些源自上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，趨向于周圍組織浸潤(侵犯)和轉(zhuǎn)移。腺癌是源自腺組織的癌，或者腫瘤細(xì)胞形成可識(shí)別的腺結(jié)構(gòu)。另一大類癌癥包括肉瘤，肉瘤細(xì)胞通常存在于纖維或均質(zhì)物質(zhì)中，如胚胎結(jié)締組織。本發(fā)明還能夠治療骨髓或淋巴系統(tǒng)的癌癥，包括白血病，淋巴瘤和其他癌癥，所述癌癥不呈現(xiàn)典型的腫瘤實(shí)體，而是廣泛分布于血管或淋巴網(wǎng)狀系統(tǒng)。
根據(jù)本發(fā)明可以治療的癌癥或腫瘤細(xì)胞類型包括，例如，產(chǎn)ACTH腫瘤，急性淋巴細(xì)胞性白血病，急性非淋巴細(xì)胞白血病，腎上腺皮質(zhì)腫瘤，膀胱癌，腦癌，乳腺癌，宮頸癌，慢性淋巴細(xì)胞白血病，慢性髓細(xì)胞白血病，結(jié)直腸癌，皮膚T細(xì)胞淋巴瘤，子宮內(nèi)膜癌，食管癌，Ewing’s肉瘤，膽囊癌，毛細(xì)胞白血病，頭頸部腫瘤，何杰金淋巴瘤，Kaposi’s肉瘤，腎癌，肝癌，肺癌(小細(xì)胞和非小細(xì)胞)，惡性腹水，惡性胸水，黑色素瘤，間皮瘤，多發(fā)性骨髓瘤，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，非何杰金淋巴瘤，骨肉瘤，卵巢癌，卵巢(生殖細(xì)胞)癌，胰腺癌，陰莖癌，前列腺癌，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，皮膚癌，軟組織肉瘤，鱗細(xì)胞癌，胃癌，睪丸癌，甲狀腺癌，滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤，子宮癌，陰道癌，外陰癌，以及Wilm’s腫瘤。
本發(fā)明還涉及腫瘤細(xì)胞的放射致敏作用。本文應(yīng)用的術(shù)語“放射致敏劑”定義為一種分子，優(yōu)選低分子量分子，當(dāng)給予人類或其他動(dòng)物有效治療劑量的該分子時(shí)，可以增加細(xì)胞對電磁輻射的敏感性和/或促進(jìn)可以應(yīng)用電磁輻射治療的疾病的療效。應(yīng)用電磁輻射可以治療的疾病包括腫瘤性疾病，良性和惡性腫瘤，以及腫瘤細(xì)胞。本文沒有列出的其他可以應(yīng)用電磁輻射治療的疾病也在本發(fā)明考慮之列。本文應(yīng)用的術(shù)語“輻射”包括但不限于電磁輻射，波長范圍為10-20-100米。本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案采用γ射線(米)，X射線(10-12-10-9)，紫外線(10nm-400nm)，可見光(400nm-)，紅外線(700nm-1.0mm)，或微波輻射(1.0mm-30cm)。
已知放射致敏劑可以增加腫瘤細(xì)胞對電磁輻射毒性作用的敏感性。在文獻(xiàn)中描述了幾種放射致敏劑的作用機(jī)制，包括缺氧細(xì)胞放射致敏劑(如2-硝基咪唑化合物，以及苯并三嗪二氧化合物)可以促進(jìn)缺氧組織的再次氧供應(yīng)和/或催化有害的氧自由基的產(chǎn)生；非缺氧細(xì)胞放射致敏劑(如鹵代嘧啶)可以作為DNA堿基類似物，優(yōu)先整合到腫瘤細(xì)胞DNA中，并因此促進(jìn)離子誘導(dǎo)的DNA分子輻射斷裂和/或預(yù)防正常DNA修復(fù)機(jī)制；其他多種可能的作用機(jī)制也假定，放射致敏劑可以用于疾病的治療。
目前，很多癌癥治療協(xié)議都采用通過X線電磁輻射激活的放射致敏劑。X線激活的放射致敏劑示例包括但不限于以下物質(zhì)甲硝唑，甲氧甲基硝基咪唑乙醇，desmethylmisonidazole，pimonidazole，etanidazole，nimorazole，絲裂霉素C，RSU 1069，SR 4233，EO9，RB 6145，煙堿，5-溴脫氧尿嘧啶(BUdR)，5-碘脫氧尿嘧啶(IUdR)，溴脫氧胞嘧啶，氟脫氧尿嘧啶(FudR)，羥基脲，順鉑，及其治療有效的類似物和衍生物。
腫瘤的光力學(xué)治療(PDT)采用可見光作為致敏劑的放射激活劑。光力學(xué)放射致敏劑的示例包括但不限于血卟啉衍生物，Photofrin，苯并卟啉衍生物，Npe6，錫本卟啉(SnET2)，pheoborbide-a，細(xì)菌葉綠素-a，naphthalocyanines，酞菁染料，鋅酞菁染料，及其治療有效的類似物和衍生物。
放射致敏劑還可以與其他治療有效劑量的一種或多種化合物聯(lián)合應(yīng)用，其他化合物包括但不限于促進(jìn)放射致敏劑整合到靶細(xì)胞中的化合物；對腫瘤有治療作用的化療藥物，合并或不合并放療；或其他可以有效治療腫瘤或其他疾病的化合物。可以與放射致敏劑聯(lián)合應(yīng)用的其他治療藥物示例包括但不限于5-氟尿嘧啶，甲酰四氫葉酸，5’-氨基-5’-脫氧胸腺嘧啶氧，卡波金，紅細(xì)胞輸注，全氟碳(如Fluosol-DA)，2，3-DPG，BW12C，鈣通道阻滯劑，己酮可可堿，抗血管生成化合物，肼苯噠嗪和L-BSO。可以與放射致敏劑聯(lián)合應(yīng)用的化療藥物示例包括但不限于阿霉素，喜樹堿，卡鉑，順鉑，正定霉素，docetaxel，阿霉素，干擾素(α，β，γ)，白細(xì)胞介素2，irinotecan，紫杉醇、托普替堪，及其治療有效的類似物和衍生物。
本發(fā)明還涉及在下述方法中應(yīng)用hPARP2拮抗劑a)治療或預(yù)防組織損傷，所述組織損傷來自于壞死或凋亡導(dǎo)致的細(xì)胞損傷或死亡，與之相關(guān)的病況和疾病包括但不限于腎功能衰竭，惡病質(zhì)，視網(wǎng)膜缺血，皮膚老化，骨關(guān)節(jié)炎，骨質(zhì)疏松，慢性疼痛，急性疼痛，神經(jīng)性疼痛，肌營養(yǎng)不良或其他涉及復(fù)制衰退的骨骼肌變性疾病，年齡相關(guān)性視網(wǎng)膜黃斑變性，AIDS和其他免疫能力減退的疾病，以及癌癥；b)延長細(xì)胞的預(yù)期壽命和增殖能力；c)改變衰老細(xì)胞的基因表達(dá)，如增加細(xì)胞特異性青春基因表達(dá)和/或降低衰老細(xì)胞特異性基因表達(dá)，來延長或增加細(xì)胞的預(yù)期壽命和增殖能力；以及d)治療由細(xì)胞衰老誘導(dǎo)或加重的疾病或病況，如皮膚老化。
本發(fā)明提供的hparp2多核苷酸還可用于治療性應(yīng)用，如應(yīng)用這些多核苷酸治療本文描述的疾病和功能紊亂，所述疾病和功能紊亂的病因涉及hPARP2表達(dá)或激活。例如，hparp2反義分子可能為治療多種異常病況提供了基礎(chǔ)，所述病況涉及聚(ADP-核糖)聚合酶活性過量或不欲表達(dá)。此外，編碼hparp2的多核苷酸序列可能為治療多種異常病況提供了基礎(chǔ)，所述病況涉及聚(ADP-核糖)聚合酶活性的不足。
可以應(yīng)用來自逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、皰疹病毒或牛痘病毒，或者細(xì)菌質(zhì)粒的表達(dá)載體，將重組hparp2正義或反義分子導(dǎo)入靶細(xì)胞?？梢詰?yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法構(gòu)建含有hparp2的重組載體[見，例如Sambrook et al.，supra，and Ausubel et al.，supra]。此外，重組hparp2還可應(yīng)用脂質(zhì)體導(dǎo)入靶細(xì)胞。
全長cDNA序列，和/或其調(diào)控元件，使研究人員可以應(yīng)用正義[Youssoufian and Lodish，Mol Cell Biol 1398-104(1993)]或反義[Eguchiet al.，Annu Rev Biochem 60631-52(1991)]hparp2多核苷酸作為工具，研究基因功能。可以應(yīng)用根據(jù)從基因組DNA獲得的cDNA或調(diào)控序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸，體外或體內(nèi)抑制表達(dá)。這些技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，而且正義或反義寡核苷酸或更大片段可以沿編碼或調(diào)控區(qū)的多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)。
此外，可以通過應(yīng)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞或組織來調(diào)節(jié)hPARP2表達(dá)，所述表達(dá)載體在優(yōu)選阻斷hPARP2生物活性的情況下，可以表達(dá)高水平hparp2多核苷酸。這些攜帶不可翻譯的正義或反義序列的構(gòu)建物充滿細(xì)胞。即使在未能整合到DNA的情況下，這些載體也可以持續(xù)轉(zhuǎn)錄RNA分子，直至所有拷貝的載體都在內(nèi)源性核酸酶的作用下失能。通過應(yīng)用非復(fù)制載體或整合了適宜復(fù)制元件的載體，可以達(dá)到暫時(shí)表達(dá)的目的。
將載體導(dǎo)入細(xì)胞或組織的方法包括本文論及的那些方法。此外，幾種轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染方法也同樣適用于活體外治療。而且，本文披露的hparp2多核苷酸序列還可用于尚未開發(fā)的分子生物學(xué)技術(shù)，這些新技術(shù)有賴于目前已知的核苷酸序列性質(zhì)，這些性質(zhì)包括但不限于，如遺傳密碼三個(gè)一組，以及堿基對的特異性相互作用。藥用組合物本發(fā)明還涉及藥用組合物，所述組合物包括一種具有活性的化學(xué)或生物化合物(制劑)以及生物兼容的藥用載體、佐劑或介質(zhì)，所述化學(xué)或生物化合物是hPARP2表達(dá)或活性的調(diào)節(jié)子。藥用組合物中的活性制劑可以選自全部或部分hparp2多核苷酸序列，hparp2反義分子，hPARP2多肽，蛋白，肽或hPARP2生物活性的有機(jī)調(diào)節(jié)子，如抑制劑、拮抗劑(包括抗體)或類似物。優(yōu)選地，該制劑具有治療疾病的活性，所述疾病通過hPARP2表達(dá)或激活介導(dǎo)，或者以hPARP2表達(dá)或激活為特點(diǎn)。組合物可以包括該制劑作為唯一活性部分，也可以包括該制劑與其他核苷酸序列、多肽、藥物或激素，并與賦形劑或其他藥用載體混和。
制備和應(yīng)用藥用組合物的技術(shù)見Remington’s PharmaceuticalSciences，18thEd.，Mack Publishing Co，Easton PA，1990。本發(fā)明藥用組合物可以應(yīng)用傳統(tǒng)方法生產(chǎn)，如混和、溶解、制粒、包裹糖衣、水磨制粉、乳化、裝入膠囊、俘獲、熔融紡絲、噴霧干燥、或凍干方法。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)根據(jù)藥物使用方法和所需劑量，決定最優(yōu)化藥物制備方法。這些制備方法可能影響所用藥物的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放率和體內(nèi)清除率。根據(jù)將要治療的疾病狀況，這些藥用組合物可以系統(tǒng)應(yīng)用，也可局部應(yīng)用，可以制備成系統(tǒng)應(yīng)用的形式，也可制備成局部應(yīng)用的形式。
藥用組合物可以通過任何一種傳統(tǒng)方法給予受試者，這些方法包括腸外應(yīng)用和腸內(nèi)應(yīng)用技術(shù)。腸外應(yīng)用方式包括那些通過胃腸道以外途經(jīng)給予組合物的方法，例如，靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、髓內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、鞘內(nèi)和心室內(nèi)注射。腸內(nèi)給藥方式包括，例如口服(包括口腔和舌下)和直腸給藥。經(jīng)上皮給藥方式包括，例如經(jīng)粘膜給藥和經(jīng)真皮給藥。經(jīng)粘膜給藥包括，例如腸道給藥以及經(jīng)鼻、吸入和肺內(nèi)深部給藥；陰道給藥；以及直腸給藥。經(jīng)真皮給藥包括被動(dòng)或主動(dòng)經(jīng)真皮或經(jīng)皮方式，包括例如，膏藥、離子電滲療法裝置以及糊劑、藥膏或油膏的局部外用。外科技術(shù)包括植入補(bǔ)給(儲(chǔ)備)組合物、滲透泵等。治療炎癥的優(yōu)選給藥途經(jīng)是，如果炎癥是局部炎癥，如關(guān)節(jié)炎，可以通過局部或外用給藥方式給藥；如果是再灌注損傷或系統(tǒng)性疾病，如敗血癥，可以通過靜脈內(nèi)給藥方式給藥。
藥用組合物可以制備成含有適宜的藥用載體，并可選地包括賦形劑和輔助劑，所述賦形劑和輔助劑使活性化合物制成可以藥用的制劑的過程更加容易。給藥方式通常會(huì)決定載體的性質(zhì)。例如，應(yīng)用腸外方式給予的制劑應(yīng)包括以水溶形式存在的活性化合物水溶液。用于腸外給藥的適宜載體可以選自鹽水、緩沖鹽溶液、葡萄糖、水和其他生理可兼容溶液。用于腸外給藥的優(yōu)選載體是生理可兼容緩沖液，如Hank’s溶液，Ringer’s溶液，或生理緩沖鹽水。對于組織或細(xì)胞應(yīng)用，可以在制劑中應(yīng)用能夠穿過特定屏障的適宜滲透劑。這些滲透劑在本領(lǐng)域是眾所周知的。對于含有蛋白質(zhì)的制劑，配方應(yīng)包括穩(wěn)定物質(zhì)，如多羥基化合物(如蔗糖)和/或表面活性劑(如非離子表面活性劑)等。
此外，腸外應(yīng)用的制劑還可包括活性化合物的懸液，制備成適于注射的油性懸液。適宜的親脂溶劑或載體包括脂肪油，如芝麻油，以及合成脂肪酸酯，如油酸乙酯，或甘油三酯，或脂質(zhì)體。水溶性注射懸液可以包括增加懸液粘性的物質(zhì)，如羧甲基纖維素鈉，山梨醇，或右旋糖苷。可以選擇地，該懸液還可以包括適宜的穩(wěn)定劑或增加化合物溶解性的物質(zhì)，這樣，制出的制劑可以是高濃度溶液。還可應(yīng)用乳劑，如水包油或油包水制劑，可以選擇性應(yīng)用乳化劑或分散劑(表面活性物質(zhì)，表面活性劑)使其穩(wěn)定。含有活性物質(zhì)的脂質(zhì)體也可用于腸外給藥。
此外，含有適于口服劑量的活性物質(zhì)的藥用組合物可以應(yīng)用本領(lǐng)域熟知的藥用載體進(jìn)行制備。制成口服的制劑可以是片劑、丸劑、膠囊、扁形膠囊劑、糖衣劑、錠劑、液體、凝膠、糖漿、漿、懸液或粉劑。例如，制備口服應(yīng)用的藥用制劑可以包括以下過程，混和活性化合物與固體賦形劑，可選擇性研磨該混合物，然后將化合物制粒，如果需要，在加入適宜輔助劑后，可以獲得片劑或糖衣劑的核心。需要指出，口服制劑也可以應(yīng)用液體載體，其類型與那些腸外應(yīng)用的描述相似，如緩沖水溶液、懸液等。
優(yōu)選的口服制劑包括片劑、糖衣劑和凝膠膠囊。這些制劑可以包括一種或多種賦形劑，所述賦形劑包括但不限于a)稀釋劑如糖類，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；b)結(jié)合劑如硅酸鎂鋁，玉米、小麥、水稻、馬鈴薯淀粉等；c)纖維素物質(zhì)如甲基纖維素，羥丙甲基纖維素，羧甲基纖維素鈉，聚乙烯吡咯烷酮，樹膠如阿拉伯樹膠和黃芪膠，以及蛋白質(zhì)如白明膠和膠原；d)分解劑或增溶劑，如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮，淀粉，瓊脂，褐藻酸或其鹽類、如褐藻酸鈉，或泡騰組分；e)潤滑劑如硅土，滑石，硬脂酸或其鎂鹽、鈣鹽，以及聚乙烯二醇；f)食用香料和甜料；g)著色劑或色素，如為鑒定產(chǎn)品或表現(xiàn)活性化合物量(劑量)的特征；以及h)其他成分如防腐劑，穩(wěn)定劑，膨脹劑，乳化劑，溶解啟動(dòng)劑，調(diào)節(jié)滲透壓的鹽類以及緩沖液。
凝膠膠囊包括由白明膠制成的推入配合膠囊，以及由白明膠制成的軟密封膠囊，外被如甘油或山梨醇衣。推入配合膠囊可以含有(多種)活性成分，以及填充劑、結(jié)合劑、潤滑劑和/或穩(wěn)定劑等。在軟膠囊中，活性化合物可以溶解或懸浮于適宜的液體中，如脂肪油，液體石蠟，或液體聚乙烯二醇，可以含有穩(wěn)定劑，也可以不含穩(wěn)定劑。
糖衣核心可以外被適宜的衣，如濃縮糖溶液，該溶液還可包括阿拉伯樹膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、carbopol膠、聚乙烯二醇和/或二氧化鈦、漆用溶液以及適宜的有機(jī)溶劑或溶劑混合物。
藥用組合物還可以活性物質(zhì)的鹽的形式提供，可以與很多種類的酸作用形成，所述酸包括但不限于鹽酸，硫酸，醋酸，乳酸，酒石酸，蘋果酸，琥珀酸等。鹽類在水或其他質(zhì)子溶劑中更易溶解，所述溶劑是相應(yīng)的自由堿形式。
為了達(dá)到調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的有效治療目的，用于本發(fā)明方法中的物質(zhì)在外周給藥時(shí)，應(yīng)該能夠穿過血腦屏障。這些藥物代謝動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)信息可以通過體外和體內(nèi)的臨床預(yù)試驗(yàn)獲得，最終在人類臨床試驗(yàn)中獲得確證。因此，用于本發(fā)明方法的任意化合物，其治療有效劑量可以從最開始的生化和/或基于細(xì)胞的試驗(yàn)結(jié)果來估算。然后，將劑量應(yīng)用于動(dòng)物模型，獲得調(diào)節(jié)hPARP2表達(dá)或活性所需的循環(huán)濃度范圍。在進(jìn)行人類試驗(yàn)時(shí)，還會(huì)出現(xiàn)有關(guān)治療多種疾病和病況的適宜劑量水平和療程的其他信息。
這些化合物的毒性和治療有效性可以通過在細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)藥理試驗(yàn)進(jìn)行測定，如測定LD50(50％的致死劑量)和(50％治療有效劑量)。毒性和治療有效性的劑量比為“治療指數(shù)”，典型的表達(dá)方式為LD50/ED50。優(yōu)選治療指數(shù)大的化合物。從這些細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)和其他動(dòng)物研究中獲得的數(shù)據(jù)可以用于換算人類應(yīng)用的劑量范圍。這些化合物的劑量優(yōu)選位于循環(huán)濃度范圍之內(nèi)，所述循環(huán)濃度包括沒有毒性或毒性很小的ED50。
對本發(fā)明方法來說，可以應(yīng)用任何調(diào)節(jié)給藥時(shí)間和劑量順序的有效給藥方案。制劑劑量優(yōu)選包括藥物劑量單位，該單位含有有效量的制劑。本文應(yīng)用的“有效量”是指通過給予受試者一劑或多劑藥物劑量單位，得到的足以調(diào)節(jié)hPARP2表達(dá)或活性的劑量，和/或在受試者中獲得可以測量的生理參數(shù)改變的劑量。
人類受試者應(yīng)用的示例劑量水平大約為0.001mg活性物質(zhì)/kg體重(mg/kg)-100mg/kg。典型地，根據(jù)適應(yīng)證、給藥途經(jīng)等，活性物質(zhì)劑量單位包括大約0.01mg-10,000mg，優(yōu)選0.1mg-1,000mg。根據(jù)給藥途經(jīng)，適宜的劑量可以根據(jù)體重、體表面積或器官大小來計(jì)算。最終的劑量方案應(yīng)由主治醫(yī)生在綜合考慮良好的醫(yī)療實(shí)踐、多種可能修飾藥物作用的因素后決定，所述多種可能修飾藥物作用的因素如物質(zhì)的特異活性、疾病的嚴(yán)重程度、患者的反應(yīng)性、患者的年齡、疾病狀態(tài)、體重、性別、患者的飲食、任何感染的嚴(yán)重程度等。其他應(yīng)該考慮的因素還包括給藥時(shí)間和頻率、藥物組合、反應(yīng)敏感性和對治療的耐受性/反應(yīng)。涉及本文述及的制備過程中對治療適宜劑量的進(jìn)一步細(xì)微修飾，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員按常規(guī)進(jìn)行，特別是按照公開的劑量信息和方法，以及在人類臨床試驗(yàn)中得到的藥物代謝動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。適宜的劑量可以應(yīng)用已經(jīng)建立的試驗(yàn)方法以及劑量反應(yīng)數(shù)據(jù)確認(rèn)，所述試驗(yàn)方法可以測定物質(zhì)在體液或其他樣本中的濃度。
給藥頻率有賴于制劑的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)和給藥途經(jīng)。應(yīng)用的劑量和給藥方法應(yīng)該調(diào)整到可以保證活性部分的充足水平或可以維持所需效果。因此，為了維持制劑所需的最低水平，藥物組合物可以單劑給藥，多次分散給藥，連續(xù)輸注，儲(chǔ)備持續(xù)釋放，或聯(lián)合應(yīng)用上述方法。短效藥用組合物(即半衰期短)可以每日給藥一次，也可每日給藥多次(如每日兩次、三次或四次)。長效藥用組合物可以每3-4天、每周或每兩周給藥一次。優(yōu)選給藥泵連續(xù)輸注，所述給藥泵如皮下、腹腔內(nèi)或硬膜下泵。
存在于藥用載體中的含有本發(fā)明化合物的組合物可以在適宜的容器中制備、儲(chǔ)存，并可貼上標(biāo)簽用于治療某種適應(yīng)疾病。在標(biāo)簽上標(biāo)示的適應(yīng)疾病可包括治療炎癥性疾病，腫瘤，神經(jīng)組織損傷等。試劑盒也在考慮之列，其中，試劑盒包括一個(gè)劑量形式的藥物組合物和一張產(chǎn)品說明書，說明書上包括在治療疾病時(shí)，該組合物的用法說明。
提供的下述實(shí)施例有助于進(jìn)一步理解本發(fā)明。實(shí)施例中所用的具體材料和條件只是為了示例本發(fā)明的某些方面，不應(yīng)認(rèn)為是對本發(fā)明合理范圍的限制。
這些實(shí)施例假設(shè)，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員理解那些眾所周知的傳統(tǒng)方法，這些方法是實(shí)施例采用的，如構(gòu)建載體和質(zhì)粒，將編碼多肽的基因插入這些載體和質(zhì)粒，或?qū)⑤d體或質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞。這些方法在多篇文獻(xiàn)中有詳細(xì)描述，如Sambrook et al.，Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Ausubel et al.，(Eds.)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.(1994)；and Ausubel et al.，(Eds.)，Short Protocols in Molecular Biology，4thed.，John Wiley & Sons，Inc.(1999)。
為了鑒定源于相同基因的其他EST序列，應(yīng)用AA568817和NCBIUniGene程序，在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索。UniGene程序?qū)enBank序列組合成非冗余系列基因?qū)虼?，每個(gè)簇含有來自相同基因的一組序列。應(yīng)用AA568817和UniGene，在人類GenBank數(shù)據(jù)庫中鑒定了34個(gè)屬于相同基因簇AA568817的人類EST序列。這些人類ESTs中被命名為R28358的一個(gè)序列(序列4)，克隆自人類胎盤，并含有源自I.M.A.G.E(基因組表達(dá)聯(lián)盟整合分子分析)克隆的命名為133650的3’序列。I.M.A.G.E是由Lawrence Livermore NationalLaboratory(Livermore，CA)協(xié)作的聯(lián)盟，致力于cDNAs序列分析，并使分析結(jié)果可以通過美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC；Rockville，MD)公開獲得。應(yīng)用R28358檢索ATCC數(shù)據(jù)庫，鑒定了EST R28562(序列5)，作為I.M.A.G.E克隆133650的5’序列。
比較R28358與鼠parp2反義序列。發(fā)現(xiàn)R28358的nt110-240與鼠parp2的nt1563-1692顯著同源(128個(gè)核苷酸中有108個(gè)完全相同；84％一致)。翻譯R28358(nt110-160)的反義鏈，將預(yù)計(jì)蛋白與鼠PARP2蛋白比較(nt1642-1692，翻譯成aa543-559)。比較后發(fā)現(xiàn)，兩種蛋白在17個(gè)相應(yīng)氨基酸位點(diǎn)上有16個(gè)相同(94％一致)。
比較R28562與鼠parp2發(fā)現(xiàn)，R28562的核苷酸4-186與鼠parp2nt952-1134具有同源性(183個(gè)核苷酸中有159個(gè)相同；84％一致)。當(dāng)R28562 nt4-186翻譯后，將預(yù)計(jì)蛋白與鼠PARP2蛋白的相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行比較(nt952-1134，翻譯成aa313-373)，發(fā)現(xiàn)，兩種蛋白在61個(gè)相應(yīng)氨基酸位點(diǎn)上有54個(gè)相同(89％一致)。
為了克隆人hparp25’端，應(yīng)用人類MarathonTM-Ready脾臟和睪丸cDNA文庫(Clontech)作為模板進(jìn)行5’RACE分析。合成與EST R28562(序列6)反義鏈相對應(yīng)的引物，并與AP1引物(Clontech，序列7)共同用于聚合酶鏈反應(yīng)，所述AP1引物被設(shè)計(jì)成與MarathonTMcDNA接頭(adapter)退火，所述接頭連接于cDNA文庫末端。
R28562反義鏈GTGTTGGTCCAATGGGTGTTCTGGGCTTTGTAGCTCTG(序列6)AP1 CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC(序列7)PCR反應(yīng)包括5uL人脾臟或睪丸MarathonTM-Ready cDNA，20uM每種引物，0.20mM dNTPs，1×PCR緩沖液，以及1uL AdvantagecDNATaq聚合酶混合物(Clontech)。反應(yīng)在GeneAmp系統(tǒng)9700PCR儀(PEApplied Biosystems，Norwalk，CT)上進(jìn)行，包括以下4個(gè)步驟1)94℃1分鐘，1輪；2)94℃ 30秒，5輪，72℃ 4分鐘；3)94℃ 30秒，5輪，70℃ 4分鐘；以及4)94℃ 30秒，25輪，60℃ 4分鐘。根據(jù)生產(chǎn)廠商說明書，應(yīng)用凝膠電泳和QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN，Valencia，CA)分離被命名為5’-hPARP2的PCR片段。
根據(jù)生產(chǎn)廠商說明書，將5’-hPARP2直接克隆到pCR2.1-TOPO載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)上。由于Taq聚合酶的錯(cuò)誤率為8.0×10-6突變/堿基對[Cline et al.，Nucleic Acids Res 24(18)3546-51(1996)]，因此，需要對4個(gè)獨(dú)特克隆進(jìn)行序列分析、比較，以消除5’-hPARP2序列中由Taq聚合酶誘導(dǎo)的錯(cuò)誤可能性。這4個(gè)克隆通過它們不同的長度來測定其獨(dú)特性。這4個(gè)克隆的長度差異提示，他們擴(kuò)增來自MarathonTM文庫的獨(dú)特克隆。
應(yīng)用引物對5’-hPARP2的4個(gè)獨(dú)特克隆進(jìn)行序列分析，所述引物可以與載體DNA雜交M13前導(dǎo)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT(序列8)M13反轉(zhuǎn)引物 GGAAACAGCTATGACCATG(序列9)設(shè)計(jì)與cDNA序列退火的引物3-P2-SEQ1 GGCTGTACACTCTGGGTCCACAGGAGC(序列10)3-P2-SEQ2 CTTCCATGAGAGCTCGTCCATGCTGGCC(序列11)5-P2-SEQ2 GGCCAGCATGGACGAGCTCTCATGGAAG(序列12)這4個(gè)獨(dú)立核苷酸序列被編輯整合成一個(gè)被命名為5’-hPARP2的共有核苷酸序列(序列13)。在5’-hPARP2的共有核苷酸序列中，每個(gè)相應(yīng)位置的堿基對出現(xiàn)在4個(gè)獨(dú)特克隆中的3個(gè)中，除了共有序列的625、632和881核苷酸，它們只在4個(gè)獨(dú)特克隆中的2個(gè)中出現(xiàn)。
為了證實(shí)5’-hPARP2共有序列中的625、632和881核苷酸是正確的，進(jìn)行了兩次分離的PCR反應(yīng)，應(yīng)用MarathonTM-Ready人類睪丸cDNA文庫(Clontech)作為模板。在上述條件下，應(yīng)用與5’-hPARP2正義鏈對應(yīng)的引物(5-P2-序列1，序列14)以及與EST R28358(命名為hPARP2L1(序列15))和hPARP2L2(序列16)相對應(yīng)的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。
5-P2-SEQ1 GCTCCTGTGGACCCAGAGTGTACAGCC(序列14)hPARP2L1 ACATTCACCACAGCTGAAGG(序列15)hPARP2L2 CCACAGCTGAAGGAAATTAAAC(序列16)根據(jù)生產(chǎn)廠商說明書，應(yīng)用凝膠電泳和QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN，Valencia，CA)分離被命名為P2-1(應(yīng)用5-P2-序列1和hPARP2 L1擴(kuò)增)和P2-9(應(yīng)用5-P2-序列1和hPARP2L2擴(kuò)增)的PCR片段。
根據(jù)生產(chǎn)廠商說明書，將P2-1和P2-9直接克隆到pCR2.1-TOPO載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)上。然后應(yīng)用能夠與載體DNA雜交的M13前導(dǎo)引物和M13反轉(zhuǎn)引物(分別為序列8和9)對P2-1和P2-9進(jìn)行序列分析，并且，P2-1和P2-9的部分序列分別如序列17和序列18所示。5’-hPARP2共有序列中的625、632和881核苷酸經(jīng)測定存在于克隆P2-1和P2-9中(分別為核苷酸267、274和523)，因此，共有序列中的核苷酸是正確的。經(jīng)測定，5’-hPARP2具有一個(gè)始于核苷酸63的開放閱讀框架(ORF)，共有1080個(gè)核苷酸。從5’-hPARP2核苷酸63-1142推導(dǎo)出的氨基酸序列如序列19所示。
為了克隆人hparp2的3’端，應(yīng)用人類MarathonTM-Ready睪丸cDNA文庫(Clontech)作為模板進(jìn)行兩次分離的PCR反應(yīng)。在上述條件下，應(yīng)用與5’-hPARP2正義鏈相對應(yīng)的引物(5-P2-序列2，序列14)以及與EST R28358反義鏈相對應(yīng)的引物(hPARP2L1，序列15；hPARP2L，序列16)進(jìn)行PCR反應(yīng)。根據(jù)生產(chǎn)廠商說明書，應(yīng)用凝膠電泳和QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN，Valencia，CA)分離被命名為3’-hPARP2-L1(應(yīng)用5-P2-序列2和hPARP2 L1擴(kuò)增)和3’-hPARP2-L2(應(yīng)用5-P2-序列2和hPARP2L2擴(kuò)增)的PCR片段。
根據(jù)生產(chǎn)廠商說明書，將3’-hPARP2-L1和3’-hPARP2-L2直接克隆到pCR2.1-TOPO載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)上。如上所述，應(yīng)用能夠與載體DNA雜交的引物(序列8和序列9)，對4個(gè)克隆的3’-hPARP2-L1和3個(gè)克隆的3’-hPARP2-L2進(jìn)行序列分析，以消除3’-hPARP2序列中由Taq聚合酶誘導(dǎo)的錯(cuò)誤可能性。將7個(gè)核苷酸序列編輯整合成一個(gè)共有序列，并被命名為3’-hPARP2，如序列20所示。
3’-hPARP2共有核苷酸序列中的每個(gè)堿基對，都出現(xiàn)在用于編輯共有序列的7個(gè)克隆中的至少6個(gè)中，除了nt856-864，只在7個(gè)克隆的至少3個(gè)克隆中出現(xiàn)過。但是，3’-hPARP2共有序列的nt856-864存在于EST R28358中，因此可以斷定，這一序列是正確的。經(jīng)測定，3’-hPARP2的核苷酸1-193與5’-hPARP2(nt951-1143)重疊。3’-hPARP2在重疊區(qū)(nt194-864)的3’端還有671個(gè)核苷酸。3’-hPARP2經(jīng)測定有一個(gè)始于nt1、含有861個(gè)核苷酸的ORF，終止密碼子始于nt862。從3’-hPARP2 nt1-861推導(dǎo)出的氨基酸序列如序列21所示。
將5’-hPARP2(nt1-1143)與3’-hPARP2(nt194-864)連接，獲得的多核苷酸序列被命名為“hparp2”(人parp2)，該序列如序列1所示。比較hparp2與鼠parp2(序列22)發(fā)現(xiàn)，hparp2的nt306-728與鼠parp2的nt199-621基本同源(423個(gè)核苷酸中有374個(gè)完全相同；88％一致)。此外，hparp2的nt744-1814與鼠parp2的nt625-1695基本同源(1071個(gè)核苷酸中有943個(gè)完全相同；88％一致)。
經(jīng)測定，hparp2具有一個(gè)始于nt63、含有1789個(gè)核苷酸的ORF，并有一個(gè)始于nt1812的終止密碼子。始于nt63的ATG經(jīng)測定是起始蛋氨酸密碼子，位于框架終止子的上游。從hparp2 nt63-1811推導(dǎo)出的氨基酸序列如序列2所示。hPARP2和鼠PARP2(序列23)，在558個(gè)氨基酸殘基中有489個(gè)相同(88％一致)。在序列對比中存在26個(gè)氨基酸殘基的缺口hPARP2的氨基酸殘基8，14，45-48，58，68-81和223-226與鼠PARP2不一致；鼠PARP2殘基34與hPARP2不一致。
人parp1基因(序列24)編碼蛋白hPARP1(序列25)，包括一個(gè)46kDa的氨基末端DNA結(jié)合功能區(qū)(序列25的aa1-373)，所述功能區(qū)包括兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)和一個(gè)核定位信號(hào)[見Molinete et al.，“Structureand function of the human poly(ADP-ribose)polymerase”，ADP-Ribosylation Reactions，Poirier and Moreau(Eds.)，Springer-Verlag，NewYork，1992，at pp.3-13]。hPARP2不包括明顯的鋅指DNA結(jié)合功能區(qū)，但可能包括一個(gè)不同的、至今尚未鑒定的DNA結(jié)合功能區(qū)。hPARP2還可以通過與DNA結(jié)合蛋白結(jié)合，而與DNA發(fā)生間接相互作用。也有可能，就是hPARP2與DNA既不發(fā)生直接相互作用，也不發(fā)生間接相互作用。
hPARP1包括一個(gè)中央22kDa的自動(dòng)修飾功能區(qū)(序列25的aa373-525)，該功能區(qū)含有15個(gè)谷氨酸殘基位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的一些或全部可以作為自動(dòng)修飾位點(diǎn)[Pieper et al.，Trends Pharmacol Sci 20171-81(1999)]。hPARP1的自動(dòng)修飾功能區(qū)與hPARP2不同，但hPARP2確實(shí)包括44個(gè)谷氨酸殘基，可以作為自動(dòng)修飾位點(diǎn)。
hPARP1包括一個(gè)40kDa的羧基末端催化功能區(qū)(序列25的aa655-1014)[Molinete et al.，supra]。當(dāng)將hPARP2(序列2)的aa224-583與hPARP1的aa655-1014排列時(shí)，364個(gè)氨基酸中有145個(gè)相同(40％一致)。涉及催化活性的“G-X-X-X-G-K-G”結(jié)構(gòu)在hPARP1(序列25的aa888-894)與hPARP2(序列2的aa454-460)之間也是保守的。
DNA激活hPARP2可以通過采用下述方法容易地檢測，所述方法在有或沒有DNA的情況下，測定PARP1的聚合酶活性[見，如Benjaminand Gill，J Biol Chem 25510502-8(1980)；Yoshihara，Biochem BiophysRes Commun 47119-25(1972)]。制備的DNA樣本可以含有單鏈或雙鏈DNA，環(huán)狀閉合DNA，或線形DNA，具有鈍性末端，3’縮進(jìn)末端或5’縮進(jìn)末端。應(yīng)用已經(jīng)建立的PARP1方法，hPARP2的自動(dòng)修飾可以通過檢測ADP-核糖與hPARP2蛋白共價(jià)結(jié)合的形式來測定[例如，Banasiket al.，supra]。
此外，在缺乏有關(guān)DNA結(jié)合活性或自動(dòng)修飾活性的信息時(shí)，一種測定hPARP2催化活性的方法是用hPARP1 cDNA中的hPARP1催化區(qū)取代hPARP2的催化區(qū)。這一點(diǎn)可通過應(yīng)用分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)工具實(shí)現(xiàn)。這種嵌合蛋白的表達(dá)和純化允許在沒有hPARP2特異性激活或底物的情況下，對hPARP2催化活性進(jìn)行評價(jià)。在這種情況下，hPARP1的DNA結(jié)合功能區(qū)允許DNA依賴性hPARP2催化功能區(qū)的激活。同樣，hPARP1的自動(dòng)修飾功能區(qū)可以作為hPARP2介導(dǎo)的ADP-核糖化靶物質(zhì)。
如果無論hPARP2是天然多肽形式，還是嵌合多肽形式，hPARP2的自動(dòng)修飾能力都不可檢測或很難檢測，可以采用另一種方法，即加入預(yù)期作為ADP-核糖化靶物質(zhì)的異源蛋白質(zhì)[見，Tsopanakis et al.，Eur JBiochem 90337-45(1978)]。
hPARP2生物活性的其他特征可以通過hPARP2多肽的異位表達(dá)獲得。異位表達(dá)可以包括，例如，轉(zhuǎn)染hPARP2表達(dá)載體到培養(yǎng)細(xì)胞系中。分析暫時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系表型可以用來測定其生物功能。這些試驗(yàn)在本領(lǐng)域非常常見[見，如Fritz et al.，Mutation Res 308127-33(1994)]。相反，例如，通過應(yīng)用基因激活、反義寡核苷酸或hPARP2特異性化學(xué)抑制劑，特異性干擾hPARP2的表達(dá)或活性，可以用來鑒定hPARP2特異性生物功能。構(gòu)建桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒hparp2的一級(jí)結(jié)構(gòu)提示，與hPARP1類似，hPARP2具有聚(ADP-核糖)聚合酶活性。hPARP2的PARP活性，或其亞結(jié)構(gòu)，可以通過下述能力來測定，所述能力是物質(zhì)將來自NAD的ADP-核糖亞單位整合成與蛋白底物連結(jié)的ADP-核糖聚合體的能力。在給定底物的情況下，這種活性的顯示可以由技術(shù)人員很容易地實(shí)現(xiàn)[見，例如Smith et al.，Science 2821484-1487(1998)]。
被命名為PARP1A/PARP2B的融合蛋白，包括hPARP1(序列25)的aa1-662與hPARP2(序列2)的aa230-583上游融合，可用于測定hPARP2的聚(ADP-核糖)聚合酶活性。PARP1A/PARP2B包括hPARP1的DNA結(jié)合功能區(qū)(序列25的aa1-373)和自動(dòng)修飾功能區(qū)(序列25的aa373-525)，以及hPARP2(序列2的aa224-583)的假定催化功能區(qū)。
融合蛋白的PARP1A片段可以通過PCR擴(kuò)增，在PCR中，應(yīng)用對應(yīng)于hparp1多核苷酸序列正義鏈(序列24的nt1-30)的引物(Sal-PARP1；序列26)，以及對應(yīng)于hparp1多核苷酸序列反義鏈(序列24的nt1957-1985)的引物(revMlu-PARP1；序列27)。
Sal-PARP1CGTCGACCCATGGCGGAGTCTTCGGATAAGCTCTATCGA(序列26)revMlu-PARP1GGAAACGCGTTTGGTGCCAGGATTTACTGTCAGCTTCTT(序列27)PCR反應(yīng)包括5uL人胸腺或睪丸QUICK-CloneTMcDNA(Clontech)，0.25uM每種引物，0.20mM dNTPs，1×PCR緩沖液，以及1uL Clontech Advantage聚合酶混合物。反應(yīng)在GeneAmp系統(tǒng)9700PCR儀(PE Applied Biosystems，Norwalk，CT)上進(jìn)行，包括以下步驟1)94℃ 1分鐘，1輪；2)94℃ 30秒，30輪，60℃ 2分鐘，以及72℃ 2分鐘；3)72℃ 7分鐘，1輪。根據(jù)生產(chǎn)廠商說明書，應(yīng)用凝膠電泳和QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN)分離PCR片段(被命名hparp1A)。然后根據(jù)生產(chǎn)廠商說明書，將hparp1A亞克隆到pTrcHis2TM-TOPOTM載體(Invitrogen)上。應(yīng)用SalI和MluI將hparp1A從pTrcHis2TM-TOPOTM上消化下來，應(yīng)用凝膠電泳和QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN)分離該片段，并保存，如下所述，進(jìn)行進(jìn)一步亞克隆。
融合蛋白的PARP2B片段通過PCR擴(kuò)增，PCR中應(yīng)用與hparp2多核苷酸序列正義鏈(序列1的nt750-776)相對應(yīng)的引物(forMlu-PARP2，序列28)，和與hparp2多核苷酸序列反義鏈(序列1的nt1771-1811)相對應(yīng)的引物(PARP2-Strep-Not，序列29)。
forMlu-PARP2TTGAAACGCGTTCCAGAGTCACAGCTAGATCTTCGGGTA(序列28)PARP2-Strep-NotCTCCACGCCCACAGCTGAAGGAAATTAAACTGAACCTTTAAAAGGTACC(序列29)PCR反應(yīng)包括100ng hparp2 cDNA，0.25uM每種引物，0.20mMdNTPs，1×PCR緩沖液，以及1uL Clontech Advantage聚合酶混合物。反應(yīng)在GeneAmp系統(tǒng)9700PCR儀(PE Applied Biosystems，Norwalk，CT)上進(jìn)行，包括以下步驟1)94℃ 1分鐘，1輪；2)94℃ 30秒，30輪，60℃ 2分鐘，以及72℃ 2分鐘；3)72℃ 7分鐘，1輪。根據(jù)生產(chǎn)廠商說明書，應(yīng)用凝膠電泳和QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN)分離PCR片段(被命名hparp2B)。然后根據(jù)生產(chǎn)廠商說明書，將hparp2B克隆到pcDNA3.1/NT-GFP-TOPOTM載體(Invitrogen)上。
應(yīng)用MluI和NotI將hparp2B從pcDNA3.1/NT-GFP-TOPOTM上消化下來，并與應(yīng)用SalI和MluI消化的hparp1A(如前述)一起亞克隆到pFASTBAC載體(Gibco BRL，Rockville，MD)上，所述pFASTBAC載體事先已經(jīng)MluI和NotI消化。獲得的質(zhì)粒被命名為pFB-PARP1A-PARP2B。
應(yīng)用經(jīng)設(shè)計(jì)與載體序列(序列30和31)發(fā)生退火反應(yīng)的引物和與cDNA序列(序列6，11，32-45)發(fā)生退火反應(yīng)的引物，對pFB-PARP1A-PARP2B進(jìn)行序列分析。pFB-PARP1A-PARP2B的載體引物FastBac for TTTGTTCGCCCAGACTC(序列30)FastBac rev TATGTTTCAGGTTCAGGGGGAG(序列31)pFB-PARP1A-PARP2B的cDNA引物P1 GCGGAAGCTGGAGGAGTGAC(序列32)P2 GTCACTCCTCCAGCTTCCGC(序列33)P3 AAGCCCTGAAGAAGCAGCTC(序列34)P4 GAGCTGCTTCTTCAGGGCTT(序列35)P5 CAGACACCCAACCGGAAGGA(序列36)
P6 TCCTTCCGGTTGGGTGTCTG(序列37)P7 TCCGCCTCCACCAAGAGCCT(序列38)P8 AGGCTCTTGGTGGAGGCGGA(序列39)P9 TGGCCTGGTGGACATCGTTA(序列40)P10 TAACGATGTCCACCAGGCCA序列41)3-P2-SEQ2 CTTCCATGAGAGCTCGTCCATGCTGGCC(序列11)3-PARP2GTGTTGGTCCAATGGGTGTTCTGGGCTTTGTAGCTCTG(序列6)AA#5 GTATTCTTTAGGCGAGAGGC(序列42)H23985-5 TGACGAAGTGGGCAGAACTG(序列43)PARP2U2 REV GAGCACCCCCTGGACCAGCAC(序列44)AA#3 ACAGCGACTAGACCATGACC(序列45)PARP1A/PARP2B的核苷酸序列在序列46中給出，PARP1A/PARP2B的氨基酸序列在序列47中給出。PARP1A/PARP2B包括以下區(qū)域在aa1-36是一個(gè)組氨酸標(biāo)簽前導(dǎo)區(qū)；aa37-698是hPARP1區(qū)；氨基酸699-700是間隔區(qū)；aa701-1054是hPARP2區(qū)；aa1055-1063是Strep標(biāo)簽區(qū)。
除了PARP1A/PARP2B，還構(gòu)建了融合到聚組氨酸標(biāo)簽上的全長hPARP2蛋白(FB-hPARP2)，用來檢測hPARP2的聚(ADP-核糖)聚合酶活性。FB-hPARP2的構(gòu)建如下所述。
應(yīng)用SalI和SacI消化pFB-PARP1A/PARP2B質(zhì)粒去除hPARP1區(qū)，分離hparp2的羧基區(qū)。應(yīng)用凝膠電泳和QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN)分離該hPARP2區(qū)(pFB-PARP2B-Sal/Sac)，并保存，如下所述，進(jìn)行進(jìn)一步亞克隆。
通過PCR擴(kuò)增hPARP2的氨基末端區(qū)，PCR應(yīng)用與hparp2多核苷酸序列正義鏈(序列1的nt63-92)相對應(yīng)的引物(Sal-PARP2，序列48)，以及與hparp2多核苷酸序列反義鏈(序列1的nt720-748)相對應(yīng)的引物(revMlu-PARP2)。
Sal-PARP2CGTCGACCCATGGCGGCGCGGCGGCGACGGAGCACCGGC(序列48)
revMlu-PARP2TGGAACGCGTTTCAAGGGAGATTTAAGAGATTCCTCTTT(序列49)PCR反應(yīng)包括100ng hparp2 cDNA，0.25uM每種引物，0.20mMdNTPs，1×PCR緩沖液，以及1uL Clontech Advantage聚合酶混合物。反應(yīng)在GeneAmp系統(tǒng)9700PCR儀(PE Applied Biosystems，Norwalk，CT)上進(jìn)行，包括以下步驟1)94℃ 1分鐘，1輪；2)94℃ 30秒，30輪，60℃ 2分鐘，以及72℃2分鐘；3)72℃ 7分鐘，1輪。根據(jù)生產(chǎn)廠商說明書，應(yīng)用凝膠電泳和QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN)分離PCR片段(被命名hparp2-Sal/Mlu)。然后根據(jù)生產(chǎn)廠商說明書，將hparp2-Sal/Mlu亞克隆到pTrcHis2TM-TOPOTM載體(Invitrogen)上。將獲得的重組質(zhì)粒pTrcHis2-hparp2-Sal/Mlu應(yīng)用SalI和AvaII消化，并應(yīng)用凝膠電泳和QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN)分離hparp2片段(被命名為hparp2-Sal/Ava)，并保存，如下所述，進(jìn)行進(jìn)一步亞克隆。
應(yīng)用AvaII和SacI消化，從hparp2 cDNA中分離hparp2的中央?yún)^(qū)。應(yīng)用凝膠電泳和QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN)分離該片段(被命名為hparp2-Ava/Sac)。
將pFB-PARP2B-Sal/Sac，hparp2-Sal/Ava和hparp2-AVa/Sac連接形成pFB-hparp/Strep-tag。應(yīng)用KpnI消化pFB-hparp/Strep-tag，去除Strep-tag，產(chǎn)生被命名為pFB-hparp/Kpn的質(zhì)粒。KpnI消化還去除了hPARP2的最后14個(gè)氨基酸。為了置換這一缺失區(qū)域，應(yīng)用PCR擴(kuò)增一個(gè)片段，PCR中應(yīng)用與hparp2多核苷酸序列正義鏈(序列1的nt1757-1776)相對應(yīng)的引物(5-P2-Kpn，序列50)，以及與hparp2多核苷酸序列反義鏈(序列1的nt1799-1814)相對應(yīng)的引物(3-P2-Kpn，序列51)。
5-P2-Kpn CCAGGTCCGTATGCGGTACC(序列50)3-P2-KpnGCCACGATGGGTACCGCGGCCGCTCACCACAGCTGAAGG(序列51)PCR反應(yīng)包括100ng hparp2 cDNA，0.5uM每種引物，0.25mMdNTPs，1×PCR緩沖液，以及2.5U PfuTurbo聚合酶混合物(Stratagene)。反應(yīng)在GeneAmp系統(tǒng)9700PCR儀(PE AppliedBiosystems，Norwalk，CT)上進(jìn)行，包括以下步驟1)94℃1分鐘，1輪；2)94℃ 30秒，25輪，55℃ 30秒，以及72℃ 30秒；3)72℃ 7分鐘，1輪。PCR片段應(yīng)用KpnI消化，然后應(yīng)用凝膠電泳和QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN)分離，并與pFB-hparp/Kpn連接以形成pFB-hparp2。
應(yīng)用設(shè)計(jì)成能夠與載體序列(序列30和31)發(fā)生退火反應(yīng)的引物和設(shè)計(jì)成能夠與cDNA序列(序列11，12，42，52-57)發(fā)生退火反應(yīng)的引物，進(jìn)行pFB-hparp2序列分析。
3-P2-SEQ2 CTTCCATGAGAGCTCGTCCATGCTGGCC(序列11)5-SEQ-2 GGCCAGCATGGACGAGCTCTCATGGAAG(序列12)AA#5 GTATTCTTTAGGCGAGAGGC(序列42)AA#1 GGTGACGAAGTGGGCAGAAC(序列52)AA#2 TTCTGCCCACTTCGTCACCC(序列53)AA#4 CGCAAGGCACAATGTAGGTT(序列54)AA#6 GCCTCTCGCCTAAAGAATAC(序列55)H2 AAGCAATCCTTCGGCCTTAG(序列56)H6 AGTTCTGCCCACTTCGTCAC(序列57)pFB-hparp2的核苷酸序列在序列58中給出，F(xiàn)B-hPARP2的相應(yīng)氨基酸序列則在序列59中給出。FB-hPARP2包括一個(gè)位于aa1-36的組氨酸標(biāo)簽前導(dǎo)區(qū)。FB-hPARP2的氨基酸37-619代表全長hPARP2。重組病毒庫的產(chǎn)生和蛋白質(zhì)純化PARP1A/PARP2B和FB-hPARP2重組病毒庫分別按照生產(chǎn)廠家提供的協(xié)議應(yīng)用FastBac系統(tǒng)(Gibco BRL)生產(chǎn)，蛋白質(zhì)表達(dá)則按如下步驟進(jìn)行。Sf9細(xì)胞在27℃生長于CCM3培養(yǎng)基(Hyclone，Logan，UT)中，所述培養(yǎng)基包括50U/mL青霉素和50ug/mL硫酸鏈霉素(GibcoBRL)。指數(shù)生長的細(xì)胞以每孔大約0.5病毒多樣性感染，并孵育48小時(shí)。以1000Xg離心15分鐘收集細(xì)胞，冷凍沉淀，并在-80℃凍存直至應(yīng)用。
蛋白質(zhì)純化的試劑除非有明確指示，否則均來自Sigma(St.Louis，MO)。通過超聲降解法將細(xì)胞在裂解緩沖液(25mM Tris-HCl，pH9.0，50mM葡萄糖，10mM EDTA，1mM 2-巰基乙醇，1mM PMSF，100uM鎮(zhèn)痛劑，以及2ug/mL抑肽酶)中裂解。在裂解緩沖液中添加Igepal CA-630(終濃度為0.2％)，Tween-20(終濃度為0.2％)，以及NaCl(終濃度為0.5M)，樣本在4℃攪動(dòng)30分鐘。以20,000Xg在4℃離心20分鐘后，收集上清，當(dāng)時(shí)應(yīng)用1mg/mL硫酸魚精蛋白處理上清，然后在4℃攪動(dòng)1小時(shí)。以4,000Xg在4℃離心20分鐘后，收集上清，并在當(dāng)時(shí)應(yīng)用70％硫酸銨在4℃處理1小時(shí)，沉淀蛋白。以20,000Xg在4℃離心15分鐘收集蛋白沉淀，并應(yīng)用再懸緩沖液(100mM Tris-HCl，pH7.4，0.5mM EDTA，10％甘油，1mM PMSF，和12mM 2-巰基乙醇)將蛋白沉淀再次懸浮。
根據(jù)生產(chǎn)廠家的說明書，通過組氨酸標(biāo)簽應(yīng)用TALONTMSuperflow金屬親和樹脂(Clontech)首次純化蛋白質(zhì)，并應(yīng)用200mM咪唑(Clontech)洗脫。然后按照文獻(xiàn)所述[D’Amours et al.，Anal Biochem 249106-8(1997)]，應(yīng)用3-氨基苯氨化合物Affi-Gel基質(zhì)(Bio-RadLaboratories)純化蛋白洗脫液。應(yīng)用溶于洗脫緩沖液(50mM Tris-HCl，pH7.5，0.3MNaCl，10mM 2-巰基乙醇，1mM PMSF，100uM鎮(zhèn)痛劑，以及2ug/mL抑肽酶)中的10mM 3-甲氧基苯甲酰胺洗脫蛋白。在1L透析緩沖液(50mM Tris-HCl，pH8.0，1mM dithiothreitol，4mM MgCl2，10mMEDTA，1mM PMSF，以及2ug/mL抑肽酶)中4X透析蛋白質(zhì)。加入甘油至終濃度10％，然后將蛋白質(zhì)凍存于-80℃。聚(ADP-核糖)聚合酶活性檢測聚(ADP-核糖)聚合酶活性試驗(yàn)所用試劑，除非有明確指示，否則均來自Sigma。PARP1A/PARP2B(250ng)或FB-hPARP2(25ng)蛋白在試驗(yàn)緩沖液(總?cè)萘?0uL)中室溫孵育10分鐘，所述試驗(yàn)緩沖液包括100mM Tris，pH8.0，1mM MgCl2，10％甘油，1.5mM dithiothreitol(Boehringer Mannheim/Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)，2.5uM未標(biāo)記NAD+，16.7ug/mL大腸桿菌菌株B DNA，以及0.33uCiγ-[32P]-NAD+(NEN，Boston，MA)。通過在SDS流動(dòng)緩沖液中煮沸停止反應(yīng)，并通過SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離。應(yīng)用放射自顯影技術(shù)使標(biāo)記蛋白顯現(xiàn)。在蛋白底物中加入聚(ADP-核糖)聚合物，可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子量的增加，并隨后導(dǎo)致蛋白在SDS-PAGE中跑得更高。同樣，加入蛋白底物的聚(ADP-核糖)聚合物水平可以根據(jù)每個(gè)單個(gè)蛋白分子而不同，導(dǎo)致標(biāo)記蛋白分子量不同，在放射自顯影膠片上呈現(xiàn)階梯狀或涂片狀[例如，見Smith et al.(1998)，supra]。PARP1A/PARP2B和FB-hPARP2都具有內(nèi)在聚(ADP-核糖)聚合酶活性，表現(xiàn)在它們產(chǎn)生聚(ADP-核糖)聚合物的能力。PARP1A/PARP2B的聚(ADP-核糖)聚合酶反應(yīng)產(chǎn)生的階梯狀標(biāo)記蛋白大約為174-200kDa。FB-hPARP2的聚(ADP-核糖)聚合酶反應(yīng)產(chǎn)生的階梯狀標(biāo)記蛋白大約為136-250kDa。
在開發(fā)抗體的時(shí)候，hPARP2羧基區(qū)的兩個(gè)區(qū)域(被命名為hPARP2U1和hPARP2 U2)被選擇作為免疫原。通過PCR擴(kuò)增hparp2 U1，在PCR中應(yīng)用與hparp2多核苷酸序列正義鏈(序列1的nt1074-1093)相對應(yīng)的引物(5-PARP2 U1，序列60)，以及與hparp2多核苷酸序列反義鏈(序列1的nt1790-1811)相對應(yīng)的引物(PARP2 L2，序列16)。通過PCR擴(kuò)增hparp2 U2，在PCR中應(yīng)用與hparp2多核苷酸序列正義鏈(序列1的nt1125-1145)相對應(yīng)的引物(5-PARP2 U2，序列61)，以及用于hparp2 U1的相同的反義引物(PARP2 L2，序列16)。
5-PARP2 U1 GGAGACATTGAAATTGCTAT(序列60)5-PARP2 U2 GAACACCCATTGGACCAACAC(序列61)PCR反應(yīng)包括100ng hparp2 cDNA，0.5uM每種引物，0.25mMdNTPs，1×PCR緩沖液，以及2.5U PfuTurbo聚合酶混合物(Stratagene)。反應(yīng)在GeneAmp系統(tǒng)9700PCR儀(PE AppliedBiosystems，Norwalk，CT)上進(jìn)行，包括以下步驟1)94℃1分鐘，1輪；2)94℃ 30秒，25輪，55℃ 2分鐘，以及72℃ 2分鐘；3)72℃ 7分鐘，1輪。根據(jù)生產(chǎn)廠商說明書，將獲得的PCR片段亞克隆到pTrcHis2TM-TOPOTM載體(Invitrogen)上。應(yīng)用能夠與載體(序列62和63)發(fā)生退火反應(yīng)的引物進(jìn)行hparp2 U1和hparp2 U2序列分析。
PTrcHis 前導(dǎo)引物 GAGGTATATATTAATGTATCG(序列62)pTrcHis 反轉(zhuǎn)引物 GATTTAATCTGTATCAGG(序列63)hparp2 U1的多核苷酸序列在序列64中給出，氨基酸序列(hPARP2U1)在序列65中給出。hPARP2 U1包括hPARP2(序列2)的aa338-583。hparp2 U2的多核苷酸序列在序列66中給出，氨基酸序列(hPARP2 U2)在序列67中給出。hPARP2 U2包括hPARP2(序列2)的aa355-583。
hPARP2 U1和hPARP2 U2的聚組氨酸融合蛋白在大腸桿菌中分別表達(dá)，并在37℃應(yīng)用1mM IPTG誘導(dǎo)。根據(jù)生產(chǎn)廠商的說明書，應(yīng)用B-PERTM細(xì)菌蛋白提取試劑(Pierce，Rockford，IL)從包含體中分離hPARP2 U1和hPARP2 U2蛋白。
5只6-12周齡Balb/c小鼠在第0天預(yù)采血，并每只小鼠注射30ug溶于Freund′s完全佐劑中的hPARP2 U1和hPARP2 U2混和物。隨后的加強(qiáng)免疫在第21天和第63天進(jìn)行，免疫原溶于Freund′s不完全佐劑。第73天給小鼠采血，血液應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)ELISA方法進(jìn)行篩檢，平板被覆PARP1A/PARP2B(如上述)。特異性抗體應(yīng)用羊抗鼠IgG(fc)辣根過氧化物酶進(jìn)行檢測。
ELISA反應(yīng)性鼠血清再應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)Western分析法進(jìn)行檢測。在Western分析中對FB-hPARP2具有反應(yīng)性的小鼠，取其脾臟，并應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法與NS-1細(xì)胞融合[Harlow and Lane，Antibodies，a LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]，制備單克隆抗體。
本文引用的所有文獻(xiàn)和專利文件，全文在此引入，作為參考。
本發(fā)明具體描述的那些優(yōu)選實(shí)施方案是為了便于闡述和理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，在本發(fā)明下述權(quán)利要求范圍內(nèi)可以進(jìn)行進(jìn)一步的變化和改良。因此，除了在權(quán)利要求中特別陳述的那些要求，不應(yīng)該對本發(fā)明施加任何的限制。
序列表<110>Christenson，Erik(E.克里斯滕森)DeMaggio，Anthony J(A.J.德馬吉奧)Goldman，Phyllis S(P.S.戈?duì)柕侣?McElligott，David L(D.L.麥埃利戈特)<120>人聚(ADP-核糖)聚合酶2的物質(zhì)和方法<130>hparp2<140><141><150>60/139,543<151>1999-06-16<160>67<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1814<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><220><221>CDS<222>(63)..(1811)<400>1gcctagtgac actgggcccg cgattccttg gagcgggttg atgacgtcag cgttcgaatt 60cc atg gcg gcg cgg cgg cga cgg agc acc ggc ggc ggc agg gcg aga107Met Ala Ala Arg Arg Arg Arg Ser Thr Gly Gly Gly Arg Ala Arg1 5 10 15gca tta aat gaa agc aaa aga gtt aat aat ggc aac acg gct cca gaa 155Ala Leu Asn Glu Ser Lys Arg Val Asn Asn Gly Asn Thr Ala Pro Glu20 25 30gac tct tcc cct gcc aag aaa act cgt aga tgc cag aga cag gag tcg 203Asp Ser Ser Pro Ala Lys Lys Thr Arg Arg Cys Gln Arg Gln Glu Ser35 40 45aaa aag atg cct gtg gct gga gga aaa gct aat aag gac agg aca gaa 251Lys Lys Met Pro Val Ala Gly Gly Lys Ala Asn Lys Asp Arg Thr Glu50 55 60gac aag caa gat ggt atg cca gga agg tca tgg gcc agc aaa agg gtc 299Asp Lys Gln Asp Gly Met Pro Gly Arg Ser Trp Ala Ser Lys Arg Val65 70 75tct gaa tct gtg aag gcc ttg ctg tta aag ggc aaa gct cct gtg gac 347Ser Glu Ser Val Lys Ala Leu Leu Leu Lys Gly Lys Ala Pro Val Asp80 85 90 95cca gag tgt aca gcc aag gtg ggg aag gct cat gtg tat tgt gaa gga 395Pro Glu Cys Thr Ala Lys Val Gly Lys Ala His Val Tyr Cys Glu Gly100 105 110aat gat gtc tat gat gtc atg cta aat cag acc aat ctc cag ttc aac 443Asn Asp Val Tyr Asp Val Met Leu Asn Gln Thr Asn Leu Gln Phe Asn115 120 125aac aac aag tac tat ctg att cag cta tta gaa gat gat gcc cag agg 491Asn Asn Lys Tyr Tyr Leu Ile Gln Leu Leu Glu Asp Asp Ala Gln Arg130 135 140aac ttc agt gtt tgg atg aga tgg ggc cga gtt ggg aaa atg gga cag 539Asn Phe Ser Val Trp Met Arg Trp Gly Arg Val Gly Lys Met Gly Gln145 150 155cac agc ctg gtg gct tgt tca ggc aat ctc aac aag gcc aag gaa atc 587His Ser Leu Val Ala Cys Ser Gly Asn Leu Asn Lys Ala Lys Glu Ile160 165 170 175ttt cag aag aaa ttc ctt gac aaa acg aaa aac aat tgg gaa gat cga 635Phe Gln Lys Lys Phe Leu Asp Lys Thr Lys Asn Asn Trp Glu Asp Arg180 185 190gaa aag ttt gag aag gtg cct gga aaa tat gat atg cta cag atg gac 683Glu Lys Phe Glu Lys Val Pro Gly Lys Tyr Asp Met Leu Gln Met Asp195 200 205tat gcc acc aat act cag gat gaa gag gaa aca aag aaa gag gaa tct 731Tyr Ala Thr Asn Thr Gln Asp Glu Glu Glu Thr Lys Lys Glu Glu Ser210 215 220ctt aaa tct ccc ttg aag cca gag tca cag cta gat ctt cgg gta cag 779Leu Lys Ser Pro Leu Lys Pro Glu Ser Gln Leu Asp Leu Arg Val Gln225 230 235gag tta ata aag ttg atc tgt aat gtt cag gcc atg gaa gaa atg atg 827Glu Leu Ile Lys Leu Ile Cys Asn Val Gln Ala Met Glu Glu Met Met240 245 250 255atg gaa atg aag tat aat acc aag aaa gcc cca ctt ggg aag ctg aca 875Met Glu Met Lys Tyr Asn Thr Lys Lys Ala Pro Leu Gly Lys Leu Thr260 265 270gtg gca caa atc aag gca ggt tac cag tct ctt aag aag att gag gat 923Val Ala Gln Ile Lys Ala Gly Tyr Gln Ser Leu Lys Lys Ile Glu Asp275 280 285tgt att cgg gct ggc cag cat gga cga gct ctc atg gaa gca tgc aat 971Cys Ile Arg Ala Gly Gln 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Gly Lys Ala Pro Val Asp Pro85 90 95Glu Cys Thr Ala Lys Val Gly Lys Ala His Val Tyr Cys Glu Gly Asn100 105 110Asp Val Tyr Asp Val Met Leu Asn Gln Thr Asn Leu Gln Phe Asn Asn115 120 125Asn Lys Tyr Tyr Leu Ile Gln Leu Leu Glu Asp Asp Ala Gln Arg Asn130 135 140Phe Ser Val Trp Met Arg Trp Gly Arg Val Gly Lys Met Gly Gln His145 150 155 160Ser Leu Val Ala Cys Ser Gly Asn Leu Asn Lys Ala Lys Glu Ile Phe165 170 175Gln Lys Lys Phe Leu Asp Lys Thr Lys Asn Asn Trp Glu Asp Arg Glu180 185 190Lys Phe Glu Lys Val Pro Gly Lys Tyr Asp Met Leu Gln Met Asp Tyr195 200 205Ala Thr Asn Thr Gln Asp Glu Glu Glu Thr Lys Lys Glu Glu Ser Leu210 215 220Lys Ser Pro Leu Lys Pro Glu Ser Gln Leu Asp Leu Arg Val Gln Glu225 230 235 240Leu Ile Lys Leu Ile Cys Asn Val Gln Ala Met Glu Glu Met Met Met245 250 255Glu Met Lys Tyr Asn Thr Lys Lys Ala Pro Leu Gly Lys Leu Thr Val260 265 270Ala Gln Ile Lys Ala Gly Tyr Gln Ser Leu Lys Lys Ile Glu Asp Cys275 280 285Ile Arg Ala Gly Gln His Gly Arg Ala Leu Met Glu Ala Cys Asn Glu290 295 300Phe Tyr Thr Arg Ile Pro His Asp Phe Gly Leu Arg Thr Pro Pro Leu305 310 315 320Ile Arg Thr Gln Lys Glu Leu Ser Glu Lys Ile Gln Leu Leu Glu Ala325 330 335Leu Gly Asp Ile Glu Ile Ala Ile Lys Leu Val Lys Thr Glu Leu Gln340 345 350Ser Pro Glu His Pro Leu Asp Gln His Tyr Arg Asn Leu His Cys Ala355 360 365Leu Arg Pro Leu Asp His Glu Ser Tyr Glu Phe Lys Val Ile Ser Gln370 375 380Tyr Leu Gln Ser Thr His Ala Pro Thr His Ser Asp Tyr Thr Met Thr385 390 395 400Leu Leu Asp Leu Phe Glu Val Glu Lys Asp Gly Glu Lys Glu Ala Phe405 410 415Arg Glu Asp Leu His Asn Arg Met Leu Leu Trp His Gly Ser Arg Met420 425 430Ser Asn Trp Val Gly Ile Leu Ser His Gly Leu Arg Ile Ala Pro Pro435 440 445Glu Ala Pro Ile Thr Gly Tyr Met Phe Gly Lys Gly Ile Tyr Phe Ala450 455 460Asp Met Ser Ser Lys Ser Ala Asn Tyr Cys Phe Ala Ser Arg Leu Lys465 470 475 480Asn Thr Gly Leu Leu Leu Leu Ser Glu Val Ala Leu Gly Gln Cys Asn485 490 495Glu Leu Leu Glu Ala Asn Pro Lys Ala Glu Gly Leu Leu Gln Gly Lys500 505 510His Ser Thr Lys Gly Leu Gly Lys Met Ala Pro Ser Ser Ala His Phe515 520 525Val Thr Leu Asn Gly Ser Thr Val Pro Leu Gly Pro Ala Ser Asp Thr530 535 540Gly Ile Leu Asn Pro Asp Gly Tyr Thr Leu Asn Tyr Asn Glu Tyr Ile545 550 555 560Val Tyr Asn Pro Asn Gln Val Arg Met Arg Tyr Leu Leu Lys Val Gln565 570 575Phe Asn Phe Leu Gln Leu Trp580<210>3<211>472<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><400>3tttttttttt ttttttttag acctgtacag tttttattac ataaaatatc acaaaattca 60caagtacaac actgcttatt ttcttgcttg aagatcagat ctctggttta tttaagatca 120acattcacca cagctgaagg aaattaaact gaacctttaa aaggtaccgc atacggacct 180ggttggggtt atatacaata tattcattgt agttgagggt ataaccatct ggattcagaa 240ttcctgtgtc acttgctggt cctaatggca ctgtactccc attcctgcca aatggaaaaa 300aagtgtgtca acatcagtct ctggttcaga agctgcaata gagaacgtag tcttatctgg 360ccaaaaggag tcttctagtc ctcctggttc tgagtactta cagggtgacg aagtgggcag 420aactgggagc catcttgccc agccccttgg ggctatgttt accttgaagc aa 472<210>4<211>476<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><400>4aganctgtac agtttttatt acataaaata 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權(quán)利要求
1.一種純化、分離的hPARP2多肽，包括序列2定義的氨基酸序列或其功能衍生物。
2.編碼權(quán)利要求1的hPARP2多肽的多核苷酸。
3.權(quán)利要求2的多核苷酸，包括序列1定義的核苷酸序列。
4.編碼hPARP2多肽的多核苷酸，選自a)權(quán)利要求2的多核苷酸b)權(quán)利要求3的多核苷酸，以及c)在中度嚴(yán)格的雜交條件下，能夠與a)或b)多核苷酸互補(bǔ)序列雜交的多核苷酸序列。
5.權(quán)利要求4的多核苷酸編碼的hPARP2多肽。
6.權(quán)利要求4的多核苷酸，可以是DNA分子，也可以是RNA分子。
7.權(quán)利要求6的多核苷酸，還進(jìn)一步包括可檢測標(biāo)記部分。
8.一種表達(dá)構(gòu)建物，包括權(quán)利要求4的多核苷酸。
9.應(yīng)用權(quán)利要求8的表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
10.權(quán)利要求4的多核苷酸，其中多核苷酸可以與異源啟動(dòng)子操作性連接。
11. 包括權(quán)利要求10多核苷酸的宿主細(xì)胞。
12.制備具有序列2定義的氨基酸序列的多肽的方法，包括以下步驟a)在適宜多肽表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求9或11的宿主細(xì)胞；以及b)從宿主細(xì)胞中或宿主細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中分離多肽。
13.能夠與權(quán)利要求1的多肽發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗體。
14.權(quán)利要求13的抗體，其中抗體選自單克隆抗體、多克隆抗體、單鏈抗體(scFv抗體)、嵌合抗體、多功能/多特異性抗體、人源化抗體、人類抗體、CDR-移植物抗體、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、雙抗體、線形抗體、單鏈抗體分子、以及由多個(gè)抗體片段構(gòu)成的多特異性抗體。
15.產(chǎn)生權(quán)利要求13的抗體的細(xì)胞系。
16.能夠與權(quán)利要求14的抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗獨(dú)特型抗體。
17.鑒定權(quán)利要求1的hPARP2多肽特異性結(jié)合配體的方法，包括a)在一定條件下，將hPARP2多肽與待測化合物混和，所述條件允許hPARP2多肽與待測化合物結(jié)合；b)檢測待測化合物與hPARP2多肽的結(jié)合；并c)確定待測化合物是hPARP2多肽的特異性結(jié)合配體。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述特異性結(jié)合配體可以調(diào)節(jié)hPARP2多肽的生物活性。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述特異性結(jié)合配體抑制hPARP2多肽的生物活性。
20.權(quán)利要求18的方法，其中所述特異性結(jié)合配體增強(qiáng)hPARP2多肽的生物活性。
21.鑒定權(quán)利要求2的hparp2多核苷酸特異性結(jié)合配體的方法，包括a)在一定條件下，將hparp2多核苷酸與待測化合物混和，所述條件允許hparp2多核苷酸與待測化合物結(jié)合；b)檢測待測化合物與hparp2多核苷酸的結(jié)合；并c)確定待測化合物是hparp2多核苷酸的特異性結(jié)合配體。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述特異性結(jié)合配體可以調(diào)節(jié)hPARP2多肽的表達(dá)。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述特異性結(jié)合配體抑制hPARP2多肽的表達(dá)。
24.權(quán)利要求21的方法，其中所述特異性結(jié)合配體增強(qiáng)hPARP2多肽的表達(dá)。
25.一種治療人類疾病的方法，該疾病由聚(ADP-核糖)聚合酶活性介導(dǎo)，方法包括給所述患病個(gè)體治療有效劑量的hPARP2拮抗劑，抑制權(quán)利要求1的多肽的表達(dá)或活性。
26.權(quán)利要求25的方法，其中hPARP1拮抗劑抑制hPARP1。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述疾病選自炎癥性疾病，神經(jīng)系統(tǒng)疾病，心血管系統(tǒng)疾病，以及腫瘤組織生長性疾病。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述疾病是一種炎癥性疾病。
29.權(quán)利要求25的方法，其中所述疾病以再灌注損傷為特征。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述疾病選自缺血性腦卒中，出血性休克，心肌缺血或梗塞，移植以及腦血管痙攣。
31.權(quán)利要求28的方法，其中所述疾病選自類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，骨關(guān)節(jié)炎，痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎，脊柱炎；Behcet?。荒摱狙Y，感染性休克，內(nèi)毒素性休克，革蘭陰性菌膿毒血癥，革蘭陽性菌膿毒血癥，中毒性休克綜合征；繼發(fā)于敗血癥、創(chuàng)傷或出血的多器官損傷綜合征；過敏性結(jié)膜炎，春季結(jié)膜炎，葡萄膜炎，甲狀腺相關(guān)性眼?。皇人嵝粤＜?xì)胞肉芽腫；哮喘，慢性支氣管炎，過敏性鼻炎，ARDS，慢性阻塞性肺病，硅肺，肺結(jié)節(jié)病，胸膜炎，齒槽炎，脈管炎，肺炎，支氣管擴(kuò)張，肺氧毒性；心肌、腦或四肢的再灌注損傷；囊性纖維化；瘢痕疙瘩形成，瘢痕組織形成；動(dòng)脈硬化；系統(tǒng)性紅斑狼瘡，自身免疫性甲狀腺炎，多發(fā)性硬化；雷諾綜合征；移植物抗宿主病，同種移植物排斥反應(yīng)；慢性腎小球性腎炎；炎癥性腸病，局限性回腸炎，潰瘍性結(jié)腸炎，壞死性小腸結(jié)腸炎；炎癥性皮膚病，接觸性皮炎，遺傳性過敏性皮炎，銀屑病，風(fēng)疹，感染導(dǎo)致的發(fā)熱和肌痛；腦膜炎，腦炎，由于輕微損傷導(dǎo)致的腦、脊髓損傷；Sjogren’s綜合征；涉及白細(xì)胞滲出的疾??；酒精性肝炎；細(xì)菌性肺炎；抗原抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾?。坏脱萘啃孕菘?；I型糖尿?。患毙院瓦t發(fā)性過敏反應(yīng)；由于白細(xì)胞不調(diào)和轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的疾病狀態(tài)；熱損傷；粒細(xì)胞輸注相關(guān)性綜合征；以及細(xì)胞因子誘導(dǎo)的毒性。
32.在細(xì)胞中抑制聚(ADP-核糖)聚合酶活性的方法，包括使所述細(xì)胞與有效劑量的hPARP2拮抗劑混和，抑制權(quán)利要求1的多肽的表達(dá)或活性。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的人聚(ADP－核糖)聚合酶(hPARP2)多肽,編碼該多肽的多核苷酸,包括所述多核苷酸的表達(dá)構(gòu)建物,以及轉(zhuǎn)化了該表達(dá)構(gòu)建物的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供了制備hPARP2多肽以及對hPARP2多肽具有免疫活性抗體的方法。此外,本發(fā)明還提供了鑒定hPARP2特異性結(jié)合配體的方法,以及多種鑒定可以修飾hPARP2生物活性的結(jié)合配體的具體方法。本發(fā)明還提供了體外和體內(nèi)修飾hPARP2生物活性的方法。
文檔編號(hào)A61P31/04GK1370238SQ00811768
公開日2002年9月18日 申請日期2000年6月16日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月16日
發(fā)明者E·克里斯滕森, A·J·德馬吉奧, P·S·戈?duì)柕侣? D·L·麥埃利戈特 申請人:艾科斯有限公司