專利名稱：人源化抗ErbB2抗體及用抗ErbB2抗體進行的治療的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及人源化抗ErbB2抗體和用例如人源化抗ErbB2抗體等抗ErbB2抗體治療癌癥的方法。
背景技術：
受體酪氨酸激酶的ErbB家族是細胞生長、分化和生存中重要的介體。該受體家族包括4個不同的成員，即表皮生長因子受體(EGFR或ErbB1)、HER2(ErbB2或p185neu)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4或tyro2)。
有證據表明由erbB1基因編碼的EGFR與人類的惡性腫瘤有關。尤其是在乳腺癌、膀胱癌、肺癌、頭部腫瘤、頸部腫瘤和胃癌以及膠質母細胞瘤等腫瘤中觀察到EGFR的增高表達。EGFR受體表達增加通常與同一癌細胞中EGFR配體，轉化生長因子α(TGF-α)的產生增加相關，導致通過自分泌刺激途徑活化受體。Baselga和Mendelsohn，Pharmac.Ther.64127-154(1994)。針對EGFR或其配體、TGF-α和EGF的單克隆抗體已經在這些惡性腫瘤的治療中作為治療藥物被評價。例如見Baselga和Mendelsohn，出處同上；Masui等，癌癥研究441002-1007(1984)；和Wu等，J.Clin.Invest.951897-1905(1995)。
ErbB家族的第二個成員p185neu最初確定為經化學處理的大鼠的神經母細胞瘤中轉化基因的產物。neu原癌基因的活化形式是由編碼蛋白的跨膜結構域中點突變(纈氨酸突變?yōu)楣劝彼?引起。在乳腺癌和卵巢癌中檢測到neu的人類同系物的擴增，并且與預后不良相關(Slamon等，科學，235177-182(1987)；Slamon等，科學，244707-712(1989)；和美國專利4968603)。到目前為止，在人類癌癥中還沒有報道與neu原癌基因點突變相類似的點突變。在其它癌癥，包括胃、子宮內膜、唾液腺、肺、腎、結腸、甲狀腺、胰腺和膀胱的癌癥中，也觀察到ErbB2的過度表達(常見原因(但并非一律)是由于基因擴增)。參見，如King等，科學，229974(1985)；Yokata等，柳葉刀1765-767(1986)；Fukushigi等，分子細胞生物學，6955-958(1986)；Geurin等，癌基因研究，321-31(1988)；Cohen等，癌基因，481-88(1989)；Yonemura等，癌癥研究，511034(1991)；Borst等，Gynecol.Oncol.，38364(1990)；Weiner等，癌癥研究，50421-425(1990)；Kem等，癌癥研究，505184(1990)；Park等，癌癥研究，496605(1989)；Zhau等，Mol.Carcinog.，3354-357(1990)；Aasland等，英格蘭癌癥雜志，57358-363(1988)；Williams等，Pathiobiology 5946-52(1991)；和McCann等，癌癥，6588-92(1990)。ErbB2可在前列腺癌中過度表達(Gu等，Cancer Lett.99185-9(1996)；Ross等，Hum.Pathol.28827-33(1997)；Ross等，癌癥792162-70(1997)；和Sadasivan等，J.Urol.150126-31(1993))。
針對大鼠p185neu和人ErbB2蛋白產物的抗體已有報道。Drebin及其同事已經制備了抗大鼠neu基因產物p185neu的抗體。例如見Drebin等，細胞，41695-706(1985)；Myers等，酶學方法，198277-290(1991)；和WO94/22478。Drebin等(癌基因2273-277(1988))報道與p185neu的兩種不同區(qū)域反應的抗體混合物對移植入裸鼠體內的neu轉化型NIH-3T3細胞有協(xié)同抗癌作用。另見1998年10月20日發(fā)布的美國專利5824311。
Hudziak等(分子細胞生物學9(3)1165-1172(1989))報道了一組用人乳腺癌細胞系SK-BR-3鑒定的抗ErbB2抗體的制備。暴露于所述抗體72小時之后，SK-BR-3細胞單層通過結晶紫染色確定相對細胞增殖。利用這種檢測方法，用稱為4D5的抗體得到了最大抑制率，該抗體抑制細胞增殖達56％。在此檢測中，該組其它抗體降低細胞增殖的程度較低。進一步發(fā)現(xiàn)抗體4D5使ErbB2過度表達的乳腺癌細胞系對TNF-α的細胞毒作用敏感。另見1997年10月14日發(fā)布的美國專利5677171。在文獻中進一步描繪了Hudziak等所討論的抗ErbB2抗體，所述文獻為Fendly等，癌癥研究501550-1558(1990)；Kotts等，In Vitro 26(3)59A(1990)；Sarup等，生長調節(jié)17272-82(1991)；Shepard等，臨床免疫學雜志11(3)117-127(1991)；Kumar等，分子細胞生物學11(2)979-986(1991)；Lewis等，CancerImmunol.Immunother.37255-263(1993)；Pietras等，癌基因91829-1838(1994)；Vitetta等，癌癥研究545301-5309(1994)；Sliwkowski等，生物化學雜志269(20)14661-14665(1994)；Scott等，生物化學雜志26614300-5(1991)；D’souza等，美國國家科學院院刊917202-7206(1994)；Lewis等，癌癥研究561457-1465(1996)；和Schaefer等，癌基因151385-1394(1997)。
鼠抗ErbB2抗體4D5的重組人源化抗體(huMAb4D5-8，rhuMAbEHR2或HERCEPTIN；美國專利號5821337)對已經接受過廣泛抗癌治療的ErbB2過度表達的轉移性乳腺癌患者可進行有效臨床治療(Baselga等，J.Clin.Oncol.14737-744(1996))。HERCEPTIN在1998年9月25日獲得了食品和藥品管理局的市場準入批準，用于治療過度表達ErbB2蛋白的轉移性乳腺癌的患者。
具有各種特點的其它抗ErbB2抗體在下述文獻中敘述，Tagliabue等，國際癌癥雜志47933-937(1991)；McKenzie等，癌基因4543-548(1989)；Maier等，癌癥研究515361-5369(1991)；Bacus等，分子致癌作用3350-362(1990)；Stancovski等，PNAS(USA)888691-8695(1991)；Bacus等，癌癥研究522580-2589(1992)；Xu等，國際癌癥研究53401-408(1993)；WO94/00136；Kasprzyk等，癌癥研究522771-2776(1992)；Hancock等，癌癥研究514575-4580(1991)；Shawver等，癌癥研究541367-1373(1994)；Arteaga等，癌癥研究543758-3765(1994)；Harwerth等，生物化學雜志26715160-15167(1992)；美國專利號5783186；和Klapper等，癌基因142099-2109(1997)。
同源性篩選導致了其它兩個ErbB受體家族成員的鑒定ErbB3(美國專利5183884和5480968以及Kraus等，PNAS(USA)869193-9197(1989))和ErbB4(歐洲專利申請599274；Plowman等，美國國家科學院院刊，901746-1750(1993)；和Plowman等，自然，366473-475(1993))。所有這些受體在至少部分乳腺癌細胞系上表現(xiàn)為表達增加。
ErbB受體通常以各種組合方式存在于細胞中，而且認為異二聚體化增加了對各種ErbB配體的細胞應答的多樣性(Earp等，乳腺癌研究和治療35115-132(1995))。EGFR可被六種不同的配體結合表皮生長因子(EGF)，轉化生長因子α(TGF-α)，雙調蛋白(amphiregulin)，肝素結合表皮生長因子(HB-EGF)，betacellulin和表皮調節(jié)素(epiregulin)(Groenen等，生長因子11235-257(1994))。由單基因的選擇性剪接產生的heregulin蛋白家族是ErbB3和ErbB4的配體。該heregulin家族包括α、β和γ-heregulins(Holmes等，科學，2561205-1210(1992)；美國專利5641869；和Schaefer等，癌基因151385-1394(1997))；neu分化因子(NDFs)，神經膠質生長因子(GGFs)；乙酰膽堿誘導活性(ARIA)；以及感覺和運動神經元衍生因子(SMDF)。關于其綜述見Groenen等，生長因子11235-257(1994)；Lemke，G分子和細胞神經學，7247-262(1996)和Lee等，Pharm.Rev.4751-85(1995)。最近鑒定了另外三個ErbB配體neuregulin-2(NRG-2)，據報道其與ErbB3或ErbB4結合(Chang等，自然387509-512(1997)和Garraway等，自然387512-516(1997))；與ErbB4結合的neuregulin-3(Zhang等，PNAS(USA)94(18)9562-7(1997))；和與ErbB4結合的neuregulin-4(Harari等，癌基因182681-89(1999))。HB-EGF、betacellulin和表皮調節(jié)素也與ErbB4結合。
雖然EGF和TGFα不結合ErbB2，但EGF刺激EGFR和ErbB2形成異二聚體，其活化EGFR并導致異二聚體中ErbB2的轉磷酸化作用。二聚體化和/或轉磷酸化作用可活化ErbB2酪氨酸激酶。見Earp等，出處同上。同樣，當ErbB3與ErbB2共表達時，形成活性信號傳導復合物，并且針對ErbB2的抗體能破壞這種復合物(Sliwkowski等，生物化學雜志，269(20)14661-14665(1994))。另外，當與ErbB2共表達時，ErbB3對heregulin(HRG)的親和力增加到更高的親和力狀態(tài)。關于ErbB2-ErbB3蛋白復合物，另見Levi等，神經學雜志151329-1340(1995)；Morrissey等，美國國家科學院院刊921431-1435(1995)；和Lewis等，癌癥研究，561457-1465(1996)。同ErbB3相似，ErbB4可與ErbB2形成活性信號傳導復合物(Garraway和Cantley，細胞785-8(1994))。
發(fā)明概述首先，本發(fā)明提供了治療人體腫瘤的方法，包括向人體給藥治療有效量的與ErbB2結合的抗體，其中所述腫瘤表達表皮生長因子受體(EGFR)。
本文涉及利用與ErbB2結合的抗體治療所述癌癥時與EGFR-靶向藥物相比的各種優(yōu)點。尤其是在肝和皮膚中EGFR高度表達，這給活性藥物提供了與EGFR結合的廣泛部位。另外，對于其它靶向EGFR的藥物如嵌合抗EGFR抗體C225以及與EGFR結合的小分子藥物ZD1839，已經觀察到皮膚毒性。預計結合ErbB2的抗體具有比這些藥物更好的安全性。
當本文中用于治療的抗體能阻斷ErbB受體的配體活化作用和/或具有單克隆抗體2C4的生物學特點時，可實現(xiàn)更多的優(yōu)點。例如靶向EGFR的藥物僅干擾EGFR，但本文中具體目的抗體(例如2C4，包括其人源化變體和/或其親和力成熟的變體)將干擾EGFR/ErbB2、ErbB3/ErbB4和ErbB2/ErbB3異二聚體。另外，本文中結合ErbB2并阻斷ErbB受體的配體活化作用的抗體將與靶向EGFR的藥物互補，而此時靶向EGFR的藥物相互之間并不互補。
本發(fā)明進一步提供了治療人體癌癥的方法，其中所述癌癥的特點不是ErbB2受體的過度表達，所述方法包括向人體給藥治療有效量的與ErbB2結合并阻斷ErbB受體的配體活化作用的抗體。
另外，本發(fā)明提供了治療人體中激素非依賴性癌癥的方法，包括向人體給藥治療有效量的、結合ErbB2受體并阻斷ErbB受體之配體活化作用的抗體。
本發(fā)明進一步提供了治療人體癌癥的方法，包括向人體給藥治療有效量的(a)結合ErbB2并抑制過度表達ErbB2的癌細胞生長的第一種抗體；和(b)結合ErbB2并阻斷ErbB受體的配體活化作用的第二種抗體。
本發(fā)明還提供了治療人體癌癥的方法，其中所述癌癥選自結腸、直腸和結腸直腸的癌癥，包括給人體給藥治療有效量的結合ErbB2并阻斷ErbB受體的配體活化作用的抗體。
在另外的實施方案中，本發(fā)明提供了用于上述方法的產品(在其它物品之中)。例如，本發(fā)明提供了包括容器和其中所組合物的產品，其中所述組合物包括結合ErbB2的抗體，該產品進一步包括包裝插頁(a package insert)，其說明所述組合物能用來治療表達表皮生長因子受體(EGFR)的癌癥。
本發(fā)明另外還涉及包括容器和其中所含組合物的產品，其中所述組合物包括結合ErbB2并阻斷ErbB受體的配體活化作用的抗體，該產品進一步包括包裝插頁，其說明所述組合物能用來治療癌癥，其中所述癌癥的特點不是ErbB2受體過度表達。
本發(fā)明還涉及包括容器和其中所含組合物的產品，其中所述組合物包括結合ErbB2并阻斷ErbB受體的配體活化作用的抗體，該產品進一步包括包裝插頁，其說明所述組合物能用來治療激素非依賴性癌癥。
在另一個實施方案中，提供的產品包括(a)裝有組合物的第一個容器，其中所述組合物包括結合ErbB2并抑制過度表達ErbB2的癌細胞生長的第一種抗體；和(b)裝有組合物的第二個容器，其中所述組合物包括結合ErbB2并阻斷ErbB受體的配體活化作用的第二種抗體。
本發(fā)明提供了包括容器和其中所含組合物的另一產品，其中所述組合物包括結合ErbB2并阻斷ErbB受體的配體活化作用的抗體，并且該產品進一步包括包裝插頁，其說明所述組合物能用來治療選自結腸癌、直腸癌和結腸直腸癌的癌癥。
本發(fā)明另外還提供了結合ErbB2并阻斷ErbB受體的配體活化作用的人源化抗體；包括該人源化抗體和可藥用載體的組合物；包括與細胞毒藥物偶聯(lián)的人源化抗體的免疫偶聯(lián)物。
而且，本發(fā)明提供了分離的編碼該人源化抗體的核酸；包含該核酸的載體；包含所述核酸或載體的宿主細胞；以及制備所述人源化抗體的方法，包括培養(yǎng)含所述核酸的宿主細胞，使所述核酸表達，并任選進一步包括從所述宿主細胞培養(yǎng)物(例如所述宿主細胞的培養(yǎng)基)中回收該人源化抗體。
本發(fā)明進一步涉及含有與ErbB2結合的抗體的免疫偶聯(lián)物，該抗體與一個或多個加利車霉素分子偶聯(lián)，還涉及在人體中利用所述偶聯(lián)物治療表達ErbB2的癌，例如ErbB2過度表達的癌。偶聯(lián)物中的抗體優(yōu)選單克隆抗體4D5，例如人源化4D5(并且優(yōu)選huMAb4D5-8(HERCEPTIN))；或者優(yōu)選單克隆抗體2C4，例如人源化2C4。免疫偶聯(lián)物中的抗體可以是完整的抗體(例如完整的IgG1抗體)或者是抗體片段(例如Fab、F(ab)2、二價抗體(diabody)等)。
附圖簡述

圖1A和1B描述了在ErbB2細胞外結構域(ECD)中殘基22-645(包括信號序列的氨基酸序列，見圖1和SEQ ID NO13所示)的表位作圖，它是通過截短突變分析和定點誘變的方法確定(Nakamura等，病毒學雜志(67(10)6179-6191)(1993)；和Renz等，細胞生物學雜志，125(6)1395-1406(1994))。各種ErbB2-ECD截短突變體體或點突變體是利用聚合酶鏈式反應從cDNA產生。ErbB2突變體在哺乳動物的表達質粒中表達為gD融合蛋白。這種表達質粒使用了巨細胞病毒啟動子/增強子和SV40終止序列以及位于cDNA插入片段下游的聚腺苷酸信號。用質粒DNA轉染293細胞。轉染一天后，將細胞在無甲硫氨酸和半胱氨酸的低糖DMEM培養(yǎng)基中通過代謝(metabolically)標記過夜，所述DMEM培養(yǎng)基中含1％經透析的胎牛血清和25μCi35S甲硫氨酸以及25μCi35S半胱氨酸。收獲上清，并向上清中加入抗ErbB2單克隆抗體或對照抗體，4℃培育2-4、時。沉淀復合物，在10-20％Iricine SDS梯度凝膠上用100V電壓進行電泳。將該凝膠電印跡到膜上并通過放射自顯影進行分析。如圖1B所示，抗ErbB2抗體7C2、7F3、2C4、7D3、3E8、4D5、2H11和3H4結合各種ErbB2 ECD表位。
圖2A和2B表明抗ErbB2單克隆抗體2C4和7F3對MCF7細胞的rHRGβ1活化作用的影響。圖2A表明2C4或7F3抑制HRG刺激酪氨酸磷酸化的劑量-應答曲線。圖2B表明2C4或7F3抑制125I標記的rHRGβ1177-244與MCF7細胞結合的劑量-應答曲線。
圖3描述了抗ErbB2單克隆抗體2C4或7F3抑制125I標記的特異性rHRGβ1177-244與一組人腫瘤細胞系的結合。對照單克隆抗體是不阻斷rHRG結合的同種型匹配的鼠單克隆抗體。在100nM rHRGβ1存在的條件下通過平行溫育確定125I標記的非特異性rHRGβ1177-244的結合。125I標記的非特異性rHRGβ1177-244的結合小于所有檢測的細胞系的總結合的1％。
圖4A和圖4B表明單克隆抗體2C4和4D5對MDA-MB-175(圖4A)和SK-BR-3(圖4B)細胞的增殖的影響。將MDA-MB-175和SK-BR-3細胞接種至96孔培養(yǎng)板中，并使其粘附2小時。在含1％血清的培養(yǎng)基中進行實驗。加入抗ErbB2抗體或僅加入培養(yǎng)基，將細胞在37℃中培養(yǎng)2小時。隨后加入rHRGβ1(1nM)或僅加入培養(yǎng)基并培養(yǎng)細胞4天。洗滌單層細胞并用0.5％結晶紫染色/固定。在540nm處檢測吸光度來確定細胞的增殖。
圖5A和5B表明在以低/正常水平表達ErbB2的MCF7細胞(圖5A)和高水平表達ErbB2的SK-BR-3細胞(圖5B)中，單克隆抗體2C4，HERCEPTIN抗體或抗EGFR抗體對ErbB2與ErbB3的heregulin(HRG)依賴性結合的影響，見下述實施例2。
圖6A和圖6B比較了完整的鼠單克隆抗體2C4(mu 2C4)和嵌合型2C4Fab片段的活性。圖6A表明嵌合型2C4 Fab或完整的鼠單克隆抗體2C4對125I-HRG與MCF7細胞結合的抑制。將MCF7細胞接種在24孔培養(yǎng)板中(1×105細胞/孔)并培養(yǎng)2天致約85％細胞匯合。按Lewis等(癌癥研究561457-1465(1996))所述方法進行實驗。圖6B描述了對MCF7細胞中對rHRGβ1活化p180酪氨酸磷酸化的作用的抑制，按Lewis等(癌癥研究561457-1465(1996))所述方法進行。
圖7A和圖7B描述了對下述序列的排列對比(alignment)，即小鼠單克隆抗體2C4的輕鏈可變區(qū)(VL)(圖7A)和重鏈可變區(qū)(VH)(圖7B)氨基酸序列(分別見SEQ ID NOs 1和2)；人源化2C4抗體574的VL和VH區(qū)(分別見SEQID Nos 3和4)，以及人VL和VH的共有框架(humκ1，輕鏈κ亞群I；humIII，重鏈亞群III)(分別見SEQ ID Nos 5和6)。星號表明人源化2C4抗體574和鼠單克隆抗體2C4之間或人源化2C4抗體574和人的框架之間的差異?；パa決定區(qū)(CDR)用括號標出。
圖8A-C表明按實施例3的ELISA法檢測的嵌合型Fab 2C4(Fab.vl)和幾種人源化2C4變體與ErbB2細胞外結構域(ECD)的結合。
圖9是單克隆抗體2C4的VL和VH的帶狀圖，其中對白色的CDR骨架作標記(L1、L2、L3、H1、H2、H3)。還給出了人源化期間用誘變法評估的VH側鏈(參見實施例3，表2)。
圖10描述了單克隆抗體2C4或HERCEPTIN對EGF、TGF-α或HRG介導的促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)活化作用的影響。
圖11是表明抗ErbB2抗體(單獨或聯(lián)合)對Calu3肺腺癌異種移植瘤(3+ErbB2過度表達)的作用的條圖。注治療在第24天終止。
圖12描述了重組人源化單克隆抗體2C4(rhuMAb 2C4)或HERCEPTIN對MDA-175細胞生長的影響，用Alamar Blue檢測法測定。
圖13表明rhuMAb 2C4抗MCF7異種移植物的效果。
優(yōu)選實施方案詳述I.定義“ErbB受體”是受體蛋白酪氨酸激酶，屬于ErbB受體家族并且包括EGFR、ErbB2、ErbB3和ErbB4受體和在將來被鑒定的此家族其它成員。ErbB受體通常包括可結合ErbB配體的細胞外結構域；親脂性跨膜結構域；保守的細胞內酪氨酸激酶結構域；和含幾個可被磷酸化的酪氨酸殘基的羧基末端信號結構域。ErbB受體可以是“天然序列”ErbB受體或其“氨基酸序列變體”。優(yōu)選該ErbB受體是天然序列人ErbB受體。
術語“ErbB1”、“表皮生長因子受體”和“EGFR”在本文中可互換應用，是指如Carpenter等(Ann.Rev.Biochem.56881-914(1987))公開的EGFR，包括其天然突變型(例如Humphrey等(PNAS(USA)874207-4211(1990))所述缺失突變型EGFR)。erbB1是指編碼EGFR蛋白產物的基因。
詞語“ErbB2”和“HER2”在本文中可互換應用，是指如Semba等(PNAS(USA)826497-6501(1985))和Yamamoto等(自然319230-234(1986))所述的HER2蛋白(Genebank登記號X03363)。術語“erbB2”是指編碼人ErbB2的基因，而“neu”是指編碼大鼠p185neu的基因。優(yōu)選的ErbB2是具有天然序列的人ErbB2。
“ErbB3”和“HER3”是指如美國專利5183884和5480968以及Kraus等(PNAS(USA)869193-9197(1989))公開的受體多肽。
本文中“ErbB4”和“HER4”是指在下述文獻中公開的受體多肽，如歐洲專利申請599274、Plowman等，美國國家科學院院刊，901746-1750(1993)、和Plowman等，自然，366473-475(1993)，包括其同種型，如在1999年4月22公開的WO99/19488中所述。
“ErbB配體”是指結合和/或活化ErbB受體的多肽。本文中特定目的ErbB配體是天然序列的人ErbB配體，例如表皮生長因子(EGF)(Savage等，生物學化學雜志2477612-7621(1972))；轉化生長因子(TGF-α)(Marquardt等，科學2231079-1082(1984))；雙調蛋白，也稱為神經鞘瘤(Schwanoma)或角質細胞自分泌生長因子(Shoyab等，科學2431074-1076(1989)；Kimura等，自然348257-260(1990)；Cook等，分子細胞生物學112547-2557(1991))；betacellulin(Shing等，科學2591604-1607(1993)；和Sasada等，Biochem.Biophys.Res.Commun.1901173(1993))；肝素結合型表皮生長因子(HB-EGF)(Higashiyama等，科學251936-939(1991))；表皮調節(jié)素(Toyoda等，生物學化學雜志2707495-7500(1995)；和Komurasaki等，癌基因152841-2848(1997))；heregulin(見下述)；neuregulin-2(NRG-2)(Garraway等，自然387512-516(1997))；neuregulin-3(NRG-3)(Zhang等，美國國家科學院院刊949562-9567(1997))；neuregulin-4(NRG-4)(Harari等，癌基因182681-89(1999))或cripto(CR-1)(Kannan等，生物學化學雜志272(6)3330-3335(1997))。結合EGFR的ErbB配體包括EGF，TGF-α，amphiregulin，betacellulin，HB-EGF和表皮調節(jié)素。結合ErbB 3的ErbB配體包括hereglin。能結合ErbB4的ErbB配體包括betacellulin、表皮調節(jié)素、HB-EGF、NRG-2、NRG-3、NRG-4和heregulin。
“Heregulin”(HRG)在本文中是指如美國專利5641869或Marchionni等(自然，362312-318(1993))公開的heregulin基因編碼的多肽。heregulin的實例包括heregulin-α、heregulin-β1、heregulin-β2和heregulin-β3(Holmes等，科學2561205-1210(1992)；和美國專利5641869)；neu分化因子(NDE)(Peles等，細胞69205-216(1992))；乙酰膽堿受體誘導活性(ARIA)(Falls等，細胞72801-815(1993))；神經膠質生長因子(GGF)(Marchionni等，自然，362312-318(1993))；感覺和運動神經元衍生的因子(SMDF)(Ho等，生物學化學雜志27014523-14532(1995))；γ-heregulin(Schaefer等，癌基因151385-1394(1997))。該術語包括天然序列HRG多肽的生物學活性片段和/或其氨基酸序列變體，例如其EGF樣結構域片段(如HRGβ1117-244)。
本文中“ErbB異寡聚體”是指包括至少兩種不同ErbB受體的非共價結合型寡聚體。當表達兩種或多種ErbB受體的細胞暴露于ErbB配體時，可形成這樣的復合物，其可通過免疫沉淀法分離并可通過SDS-PAGE進行分析，例如Sliwkowski等(生物學化學雜志269(20)14661-14665(1994))所述。這類ErbB異寡聚體的實例包括EGFR-ErbB2、ErbB2-ErbB3和ErbB3-ErbB4復合物。而且，所述ErbB異寡聚體可包括兩種或多種與不同ErbB受體(例如ErbB3、ErbB4或EGFR)組合的ErbB2受體。在該異寡聚體中可包括其它蛋白如細胞因子受體亞單位(如gp130)。
“ErbB受體的配體活化作用”是指由與含目的ErbB受體的ErbB異寡聚體結合的ErbB配體所介導的信號傳導(例如由ErbB受體的細胞內激酶結構域使ErbB受體或底物多肽中酪氨酸殘基磷酸化所引起的信號傳導)。這通常涉及ErbB配體與ErbB異寡聚體的結合，該結合可活化異寡聚體中一個或多個ErbB受體的激酶結構域，并且因此導致一個或多個ErbB受體中酪氨酸殘基的磷酸化，和/或其它底物多肽中酪氨酸殘基的磷酸化。ErbB受體活化可利用各種酪氨酸磷酸化試驗定量。
“天然序列”多肽是指其氨基酸序列與天然來源多肽(例如ErbB受體或ErbB配體)相同的多肽。此天然序列多肽可從自然中分離，或者可通過重組或合成方法制備。因此，天然序列多肽可具有天然發(fā)生的人多肽、鼠多肽或其它哺乳動物物種來源多肽的氨基酸序列。
術語“氨基酸序列變體”是指其氨基酸序列與天然序列多肽有一定程度的差異的多肽。通常，氨基酸序列變體與天然ErbB配體的至少一個受體結合結構域或與天然ErbB受體的至少一個配體結合結構域，有至少約70％的同源性，優(yōu)選所述同源性至少約80％，更優(yōu)選至少約90％。所述氨基酸序列變體在天然氨基酸序列中某些位點上具有取代、缺失和/或插入。
“同源性”定義為在將序列排列對比并引入缺口(如果需要)而得到同源性的最大百分率之后，氨基酸序列變體中相同殘基的百分率。用于排列的方法和計算機程序在本領域眾所周知。一種這樣的計算機程序是由Genentech，Inc.享有主權的“Align 2”，它和用戶文件于1991年12月10日提交至美國版權局(Washington，DC 20559)。
本文中術語“抗體”是指最廣義上的抗體，具體包括完整的單克隆抗體，多克隆抗體，由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段，只要其顯示所需生物學活性。
本文中術語“單克隆抗體”是指來自基本上同質的抗體群的抗體，即除了可能少量存在的天然突變以外，該抗體群中的各個抗體均相同。單克隆抗體具有高度的特異性，針對單個抗原位點。而且，與包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑相反，每種單克隆抗體是針對抗原上的單個表位。除了其特異性之外，單克隆抗體的優(yōu)點在于它們可被合成并不受其它抗體的污染。修飾詞“單克隆”表明該抗體的特點，即其來自基本上同質的抗體群，不解釋為需通過任何特殊方法產生該抗體。例如，根據本發(fā)明應用的單克隆抗體可通過由Kohler等(自然，256495(1975))首先描述的雜交瘤法進行制備，或者可通過重組DNA法進行制備(例如見美國專利4816567)?！皢慰寺】贵w”還可利用例如Clackson等(自然，352624-628(1991))和Marks等(分子生物學雜志，222581-597(1991))所述技術從噬菌體抗體文庫中分離。
本文中單克隆抗體特別包括“嵌合”抗體，其重鏈和/或輕鏈的一部分與源自特殊物種或屬于特殊抗體種類或亞類的抗體的相應序列相同或同源，但所述鏈的剩余部分的序列與源自另一個物種或屬于另一個抗體種類或亞類的抗體(以及此抗體的片段，只要它們顯示所需的生物學活性)的相應序列相同或同源(美國專利4816567；和Morrison等，美國國家科學院院刊，816851-6855(1984))。本文中目的嵌合抗體包括“靈長類化”抗體，其包括源自非人類靈長類動物(如Old World Monkey，Ape等)的可變區(qū)抗原結合序列和人恒定區(qū)序列。
“抗體片段”包括完整抗體的一部分，優(yōu)選包括其抗原結合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的實例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；二價抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。
“完整”抗體是包括抗原結合可變區(qū)以及輕鏈恒定區(qū)(CL)和重鏈恒定區(qū)CH1、CH2和CH3的抗體。所述恒定區(qū)可以是天然序列恒定區(qū)(例如人天然序列恒定區(qū))或其氨基酸序列變體。優(yōu)選完整抗體具有一種或多種效應功能。
抗體的“效應功能”是指那些可歸因于抗體Fc段(天然序列Fc段或氨基酸序列變體Fc段)的生物學活性?？贵w效應功能的實例包括Clq結合；補體依賴性細胞毒作用；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(如B細胞受體；BCR)等的下調。
根據其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，可將完整抗體分成不同的“類”。主要有5類完整抗體IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些抗體可進一步分成“亞類”(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。對應于不同類抗體的重鏈恒定區(qū)分別稱為α、δ、ε、γ和μ。免疫球蛋白不同類的亞單位結構和三維構象眾所周知。
“抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用”和“ADCC”是指由細胞介導的反應，其中表達Fc受體(FcR)的非特異性細胞毒細胞(例如自然殺傷(NK)細胞，中性粒細胞和巨噬細胞)識別結合在靶細胞上的抗體，隨后引起該靶細胞裂解。介導ADCC作用的主要細胞NK細胞僅表達FcγRIII，而單核細胞則表達FcγRI、FcγRII和FcγRIII。關于造血細胞上FcR表達的總結見Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9457-92(1991)的464頁上的表三。為了評價目的分子的ADCC活性，可進行體外ADCC檢測，例如美國專利5500362或5821337中所述。用于這類檢測的有效效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細胞。或者(或另外)，可在體內，例如在Clynes等(PNAS(USA)，95652-656(1998))所述的動物模型中，評估目的分子的ADCC活性。
“人類效應細胞”是表達一或多種FcR并執(zhí)行效應功能的白細胞。優(yōu)選所述細胞至少表達FcγRIII并執(zhí)行ADCC效應功能。介導ADCC作用的人類白細胞的實例包括外周血單核細胞(PBMC)，自然殺傷(NK)細胞，單核細胞，細胞毒T細胞和中性粒細胞；優(yōu)選PBMC和NK細胞。所述效應細胞可從其天然來源中分離，例如從本文所述血液或PBMC中分離。
術語“Fc受體”或“FcR”用來描述與抗體Fc段結合的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列人FcR。而且，優(yōu)選的FcR是結合IgG抗體的受體(γ受體)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亞類(包括這些受體的等位基因變體和選擇性剪接型)。FcγRII受體包括具有相似的氨基酸序列的FcγRIIA(“活化受體”)和FcγRIIB(“抑制受體”)，其主要區(qū)別在于其細胞漿結構域。活化受體FcγRIIA在其細胞漿結構域中含有免疫受體酪氨酸為基礎的活化基序(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其胞漿結構域中含有免疫受體酪氨酸為基礎的抑制基序(ITIM)。(見綜述M.in Daeron，Annu.Rev.Immunol.15203-234(1997))。FcR的綜述見Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9457-92(1991)；Capel等，免疫學方法425-34(1994)；和de Haas等，J.Lab.Clin.Med.126330-41(1995)。本文中術語“FcR”函蓋其它FcR，包括那些在將來將被鑒定的FcR。該術語還包括負責將母體IgG轉移到胎兒的新生期受體FcRn(Guyer等，免疫學雜志117587(1976)和Kim等，免疫學雜志24249(1994))。
“補體依賴性細胞毒作用”或“CDC”是指在補體存在的條件下分子裂解靶的能力。補體系統(tǒng)的第一個組分(C1q)與結合相關(cognate)抗原的分子(例如抗體)的結合可起始補體激活途徑。為了評價補體活化作用，可進行CDC檢測，如Gazzano-Santoro等(免疫學方法雜志202163(1996))所述。
“天然抗體”通常是約150000道爾頓的異四聚體糖蛋白，由兩個相同的輕鏈(L)和兩個相同的重鏈(H)組成。每個輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈連接，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈之間的二硫鍵數目并不相同。每個重鏈和輕鏈中還具有規(guī)則間隔的鏈內二硫鍵。每個重鏈在其一個末端有可變區(qū)(VH)，其后是多個恒定區(qū)。每個輕鏈在其一個末端有可變區(qū)(VL)，而另一端是恒定區(qū)。輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個恒定區(qū)相對應(align)，而輕鏈可變區(qū)與重鏈可變區(qū)相對應。特殊的氨基酸殘基被認為在輕鏈和重鏈可變區(qū)之間形成界面。
術語“可變”是指可變區(qū)某些部分的序列在抗體之間有很大差異，它們可在各個抗體對其特殊抗原的結合和特異性方面發(fā)揮作用。然而，該變異性不是均勻的分布于整個抗體的可變區(qū)。它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中三個稱為超變區(qū)的節(jié)段中?？勺儏^(qū)中保守性較高的區(qū)域稱為框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)各包括4個FR，主要采取β折疊構象，被三個超變區(qū)相連接，形成環(huán)狀連接，而在一些情況中形成β折疊結構的一部分。各個鏈的超變區(qū)通過FR緊密的靠近在一起，并且與其它鏈的超變區(qū)一起形成抗體的抗原結合位點(見Kabat等，具有免疫學意義的蛋白的序列，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結合，但是表現(xiàn)出各種效應功能，例如在抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(ADCC)中抗體的參與。
術語“超變區(qū)”在本文中是指抗體上負責結合抗原的氨基酸序列。所述超變區(qū)通常包括“互補決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(例如輕鏈可變區(qū)的殘基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)和重鏈可變區(qū)的殘基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，具有免疫學意義的蛋白的序列，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))和/或那些“超變環(huán)”的氨基酸殘基(例如輕鏈可變區(qū)的殘基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重鏈可變區(qū)的殘基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，分子生物學雜志196901-917(1987))?！翱蚣軈^(qū)”或“FR”殘基是那些除了本文所定義的超變區(qū)殘基以外的可變區(qū)殘基。
木瓜蛋白酶消化抗體可產生兩個相同的各帶有單個抗原結合位點的抗原結合片段(稱為“Fab”片段)和殘余的“Fc”片段，F(xiàn)c段的名稱反應了其易于結晶的能力。經胃蛋白酶處理可產生具有兩個抗原結合位點并仍然能交聯(lián)抗原的F(ab’)2片段。
“Fv”段是含有完整的抗原識別和抗原結合位點的最小抗體片段。此區(qū)由緊密地非共價連接的一個重鏈可變區(qū)與一個輕鏈可變區(qū)的二聚體組成。在這個構象中每個可變區(qū)的三個超變區(qū)相互作用，在VH-VL二聚體表面限定一個抗原結合位點。這六個超變區(qū)共同賦予抗體以抗原結合特異性。然而，即使是單個可變區(qū)(或Fv上僅含有二個抗原特異性高變區(qū)的那一半)也具有識別和結合抗原的能力，但與完整的結合位點相比其親和力較低。
Fab段還包括輕鏈恒定區(qū)和重鏈的第一個恒定區(qū)(CH1)。Fab’與Fab的差別在于Fab’在重鏈CH1的羧基末端多出幾個殘基，包括抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。Fab’-SH在本文中是指恒定區(qū)半胱氨酸殘基中至少有一個游離巰基的Fab’。F(ab’)2抗體片段在最初產生為Fab’片段對，在它們之間具有鉸鏈區(qū)半胱氨酸?？贵w片段的其它化學偶聯(lián)是眾所周知的。
脊椎動物任何物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可以是兩種完全不同的型(κ和λ)之一，型別區(qū)分的依據是其恒定區(qū)氨基酸序列。
“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包括抗體的VH和VL結構域，這些結構域存在于單個多肽鏈上。優(yōu)選Fv多肽在VH和VL結構域之間還包含一個多肽接頭，它能使scFv形成抗原結合所需的結構。關于scFv的綜述見Pluckthun在《單克隆抗體的藥理學》，第113卷，Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag，New York，第269-315頁(1994)?？笶rbB2抗體scFv片段見WO93/16185、美國專利5571894和美國專利5587458中所述。
術語“二價抗體(diabodies)”是指具有兩個抗原結合位點的小分子抗體片段，這些片段在一條多肽鏈(VH-VL)上含有相連的一個重鏈可變區(qū)(VH)和一個輕鏈可變區(qū)(VL)。利用一種非常短的接頭，其使得同一條鏈上的兩個結構域無法配對，不得不與另一條鏈上的互補結構域配對，從而形成兩個抗原結合位點。在EP 404,097；WO93/11161；和Hollinger等，美國國家科學院院刊，906444-6448(1993)中有對二價抗體的更詳細描述。
非人類(例如嚙齒類動物)抗體的“人源化”型是嵌合抗體，其包括最小限度的源自非人類免疫球蛋白的序列。在很大程度上，人源化抗體是人類的免疫球蛋白(接受體抗體)，其中接受體的超變區(qū)殘基被具有所需特異性、親和力和性能的小鼠、大鼠、家兔或非人類靈長類等非人類物種的(供體抗體)超變區(qū)殘基所取代。在一些實例中，人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基由相應的非人類殘基所取代。而且，人源化抗體可包括在接受體抗體或供體抗體中不存在的殘基。這些修飾旨在進一步改善抗體的性能。通常，人源化抗體基本上包括至少一個(通常包括兩個)可變區(qū)的全部，其中超變環(huán)的全部或基本上全部對應于非人類免疫球蛋白的相應部分，而FR序列的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列。人源化抗體還任選包括免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常為人免疫球蛋白的恒定區(qū)的至少一部分。詳見Jones等，自然，321522-525(1986)；Riechmann等，自然332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。
人源化抗ErbB2抗體包括美國專利5821337(引入作參考)的表3中所述的huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7和huMAb4D5-8(HERCEPTIN)；人源化520C9(WO93/21319)和如下所述的人源化2C4抗體。
“分離的”抗體是已從其天然環(huán)境的組成中鑒定、分離和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染成分是干擾抗體的診斷或治療應用的物質，可包括酶、激素和其它蛋白性或非蛋白性溶質。在優(yōu)選的實施方案中，該抗體的純度應達到(1)經Lowery法確定的抗體重量的95％以上，最優(yōu)選所述重量的99％以上，(2)足以獲得用旋轉杯狀(spinning cup)序列分析儀所測至少15個殘基的N端或內部氨基酸序列，(3)通過還原或非還原條件下的SDS-PAGE以及考馬斯亮藍染色、優(yōu)選銀染所證實的同質性。分離的抗體包括重組細胞內的原位抗體，因為該抗體的自然環(huán)境中的至少一種組分已不存在。一般情況下分離的抗體可通過至少一個純化步驟來制備。
“結合”目的抗原(例如ErbB2抗原)的抗體是能以足夠的親和力結合該抗原，而使該抗體在靶向表達該抗原的細胞中作為有效的治療藥物那些抗體。在所述抗體為結合ErbB2的抗體時，與其它ErbB受體相比，它通常優(yōu)選結合ErbB2，并且它可以是與EGFR、ErbB3或ErbB4等其它蛋白沒有顯著的交叉相互作用的抗體。在這類實施方案中，當用熒光活化細胞分揀術(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)等方法進行檢測時，該抗體與這些非ErbB2蛋白的結合(例如與內源性受體的細胞表面結合)程度將小于10％。有時，抗ErbB2抗體與大鼠neu蛋白不發(fā)生顯著的交叉相互作用，例如Schecter等，自然312513(1984)和Drebin等，自然312545-548(1984)中所述。
“阻斷”ErbB受體的配體活化作用的抗體是降低或防止上述這種活化作用的抗體，其中該抗體能以遠比單克隆抗體4D5更為有效地(例如與單克隆抗體7F3或2C4或其Fab片段一樣有效，優(yōu)選與單克隆抗體2C4或其Fab片段一樣有效)阻斷ErbB受體的配體活化作用。例如，阻斷ErbB受體的配體活化作用的抗體可以是在阻斷ErbB異寡聚體形成的方面比4D5的有效性約高50-100％的抗體。對ErbB受體的配體活化作用的阻斷可通過任何方式發(fā)生，例如通過干擾配體與ErbB受體的結合、ErbB復合物的形成、ErbB復合物中ErbB受體的酪氨酸激酶活性和/或ErbB受體的酪氨酸激酶殘基的磷酸化。阻斷ErbB受體的配體活化作用的抗體實例包括單克隆抗體2C4和7F3(其阻斷ErbB2/ErbB3和ErbB2/ErbB4異寡聚體的HRG活化作用；和EGFR/ErbB2異寡聚體的EGF、TGF-α、amphiregulin、HB-EGF和/或表皮調節(jié)素的活化作用)；和L26、L96和L288抗體(Klapper等，癌基因142099-2109(1997))，其阻斷EGF和NDF與表達EGFR、ErbB2、ErbB3和ErbB4的T47D細胞的結合。
具有所指抗體(例如稱為2C4的單克隆抗體)的“生物學特性”的抗體，是指具有所指抗體的一種或多種生物學特性的抗體，這些特性使此抗體區(qū)別于結合相同抗原(例如ErbB2)的其它抗體。例如，具有2C4的生物學特性的抗體可阻斷含ErbB2和ErbB3或ErbB4的ErbB異寡聚體被HRG活化的作用；阻斷ErbB受體(包括EGFR和ErbB2)被EGF、TGF-α、HB-EGF、表皮調節(jié)素和/或amphiregulin活化的作用；阻斷MAPK被EGF、TGF-α和/或HRG介導活化的作用；和/或與ErbB2的胞外結構域中可被2C4結合的表位結合(例如其阻斷單克隆抗體2C4與ErbB2的結合)。
除非另外指明，詞語“單克隆抗體2C4”是指具有下述實施例中鼠2C4抗體(或衍生自該2C4抗體)的抗原結合殘基的抗體。例如，該單克隆抗體2C4可以是鼠單克隆抗體2C4或其具有鼠單克隆抗體2C4的抗原結合氨基酸殘基的變體，例如人源化抗體2C4。人源化2C4抗體的實例見下述實施例3。除非另外指明，在本文中詞語“rhuMAb 2C4”是指含有分別示于SEQ ID No.3和4的輕鏈可變區(qū)(VL)和重鏈可變區(qū)(VH)序列，并且這些序列已與任選由中國倉鼠卵(CHO)細胞表達的人的輕鏈和重鏈IgG1(非A同種異型)恒定區(qū)融合的那些抗體。
除非另外指明，術語“單克隆抗體4D5”指具有鼠4D5(ATCC CRL 10463)抗體(或衍生自4D5抗體)的抗原結合殘基的抗體。例如，該單克隆抗體4D5可以是鼠單克隆抗體4D5或其具有鼠單克隆抗體4D5的抗原結合氨基酸殘基的變體，例如人源化抗體4D5。4D5抗體實例包括如美國專利5,821,337中所述的huMAb 4D5-1、huMAb 4D5-2、huMAb 4D5-3、huMAb 4D5-4、huMAb 4D5-5、huMAb 4D5-6、huMAb 4D5-7和huMAb 4D5-8(HERCEPTIN)，其中huMAb4D5-8(HERCEPTIN)是優(yōu)選的人源化4D5抗體。
本文中“生長抑制劑”是指在體內或體外抑制細胞生長，尤其抑制表達ErbB的癌癥細胞生長的化合物或組合物。因此，生長抑制劑可以是顯著降低S期ErbB表達細胞百分比的藥物。生長抑制劑的實例包括阻斷細胞周期(在除S期以外的某個階段)進展的藥物，例如誘導G1停滯和M期停滯的藥物。經典的M期阻斷劑包括長春花類(長春新堿和長春花堿)，紫杉烷(taxane)和topo II抑制劑如阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素、依托泊甙(etoposide)和博來霉素等。那些使G1期停滯的藥物還連帶(spill over)使S期停滯，例如DNA烷化劑象他莫昔芬、強的松、達卡巴嗪、氮芥(mechlorethamine)、順鉑、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷等。詳見《癌癥的分子基礎》Mendelsohn和Israel編，第一章，Murakami等的題為“細胞周期的調節(jié)、癌基因和抗腫瘤藥”的文章(WB SaundersPhiladephia，1995)，尤其見13頁。
“生長抑制性”抗體實例是與ErbB2結合并抑制過度表達ErbB2的癌細胞的生長的那些抗體。優(yōu)選的生長抑制性抗ErbB2抗體在約0.5-30μl/ml的濃度下可使細胞培養(yǎng)中SK-BR-3乳腺癌細胞的生長抑制20％以上，優(yōu)選50％以上(例如從約50％到約100％)，其中的生長抑制是使SK-BR-3細胞暴露于所述抗體6天后檢測的(見1997年10月14日公布的美國專利5677171)。SK-BR-3細胞生長抑制試驗詳見該專利以及下文。優(yōu)選的生長抑制性抗體是單克隆抗體4D5，例如人源化4D5。
“誘導細胞死亡”的抗體是使活細胞失去活性的抗體。所述細胞通常是表達ErbB2受體的細胞，尤其是過度表達ErbB2受體的細胞。優(yōu)選所述細胞為癌細胞，例如乳腺、卵巢、胃、子宮內膜、唾液腺、肺、腎、結腸、甲狀腺、胰腺或膀胱的細胞。在體外，所述細胞可以是SK-BR-3、BT474、Calu3、MDA-MB-453、MDA-MB-361或SKOV3細胞。在體外的細胞死亡可在無補體和免疫效應細胞的條件下進行檢測，以便與抗體依賴性細胞介導的細胞毒(ADCC)或補體依賴性細胞毒作用(CDC)誘導的細胞死亡進行區(qū)分。因此，可使用熱滅活的血清(即在無補體的條件下)并在無免疫效應細胞的條件下進行細胞死亡檢測。為了檢測抗體能否誘導細胞死亡，可通過評價相對于未處理細胞，對propidium iodide(PI)、臺盼藍(見Moore等，細胞技術171-11(1995))或7AAD的吸收來評估膜完整性的喪失。優(yōu)選的細胞死亡誘導抗體是那些在BT474細胞的PI攝入試驗中誘導PI攝入的抗體(見下述)。
“誘導凋亡”的抗體是指那些可誘導細胞程序性細胞死亡的抗體，所述凋亡可通過annexin V的結合，DNA片段化，細胞皺縮，內織網膨脹，細胞碎裂，和/或膜泡(稱為凋亡小體)的形成確定。所述細胞通常是過度表達ErbB2受體的細胞。優(yōu)選所述細胞為癌細胞，例如乳腺、卵巢、胃、子宮內膜、唾液腺、肺、腎、結腸、甲狀腺、胰腺或膀胱的細胞。在體外，所述細胞可以是SK-BR-3、BT474、Calu 3、MDA-MB-453、MDA-MB-361或SKOV3細胞?？捎酶鞣N方法檢測與凋亡相關的細胞事件。例如，磷脂酰絲氨酸(PS)易位可通過annexin結合來測定；DNA片段化可通過DNA序列梯(laddering)來評估；與DNA片段化相伴的核/染色體濃縮可通過亞二倍體細胞中的任何增加來評估。優(yōu)選凋亡誘導抗體是在BT474細胞的annexin結合試驗中，導致對annexin的結合為未處理細胞的約2-50倍，優(yōu)選約5-50倍，最優(yōu)選約10-50倍的那些抗體(見下述)。有時前凋亡性(pro-apoptotic)抗體是進一步阻斷ErbB受體的ErbB配體活化作用的抗體(例如7F3抗體)，即所述抗體與單克隆抗體2C4有共同的生物學特點。在其它情況中，所述抗體是不明顯阻斷ErbB受體的ErbB配體活化作用的抗體(例如7C2抗體)。而且，該抗體可以是與7C2相似的抗體，其在誘導細胞凋亡時，不引起S期細胞的百分比大幅下降(例如與對照相比僅引起這些細胞的百分比下降約0-10％的抗體)。
“表位2C4”是ErbB2細胞外結構域中與抗體2C4結合的區(qū)域。為了篩選與2C4表位結合的抗體，可進行常規(guī)的交叉阻斷試驗，例如《抗體》，實驗室指南，冷泉港實驗室，Harlow和David Lane編(1998)所述方法?；蛘?，可進行表位作圖來評定抗體是否與ErbB2的2C4表位結合(例如ErbB2上從約殘基22到殘基584的區(qū)域中的任何一個或多個殘基，包括這兩個端點殘基，見圖1A-B)。
“表位4D5”是ErbB2細胞外結構域中與抗體4D5(ATCC CRL 10463)結合的區(qū)域。該表位靠近ErbB2的跨膜結構域。為了篩選與4D5表位結合的抗體，可進行常規(guī)的交叉阻斷試驗，例如《抗體》，實驗室指南，冷泉港實驗室，Harlow和David Lane編(1998)所述方法?；蛘撸蛇M行表位作圖來評定抗體是否與ErbB2的4D5表位結合(例如ErbB2上從約殘基529到殘基625的區(qū)域中的任何一個或多個殘基，包括這兩個端點殘基，見圖1A-B)。
“表位3H4”是ErbB2細胞外結構域中與抗體3H4結合的區(qū)域。該表位包括ErbB2細胞外結構域的氨基酸序列中從約541到約599(包括這兩個端點殘基)的殘基，見圖1A-B。
“表位7C2/7F3”是與7C2和/或7F3抗體(均在ATCC保存，見下述)結合的ErbB2細胞外結構域N末端區(qū)域。為了篩選與7C2/7F3表位結合的抗體，可進行常規(guī)的交叉阻斷試驗，例如《抗體》，實驗室指南，冷泉港實驗室，Harlow和David Lane編(1998)所述方法?；蛘?，可進行表位作圖來評定抗體是否與ErbB2的7C2/7F3表位結合(例如ErbB2上從約殘基22到殘基53的區(qū)域中的任何一個或多個殘基，見圖1A-B)。
“治療”即指治療性處理也指預防性措施。需要治療者包括已患病者以及需要對疾病進行預防者。因此，將要接受本文所述治療哺乳動物可能被診斷為已患病或對所述疾病易感。
需要治療的“哺乳動物”是指歸為哺乳動物的任何動物，包括人、家畜和農場動物，以及動物園里的動物、參與運動項目的動物或寵物如狗、馬、貓、牛等。優(yōu)選所述哺乳動物為人類。
“疾病”是將從抗BrbB2抗體的治療中受益的任何情況。這包括慢性和急性疾病，包括哺乳動物易感的特定疾病的病理狀況。在此將被治療的疾病的非限定實例包括良性和惡性腫瘤；白血病和淋巴樣惡性腫瘤；神經元、神經膠質細胞、星型細胞、下丘腦和其它腺體、巨噬細胞、上皮細胞、間質和囊胚腔的疾病；炎性、血管原性和免疫性疾病。
術語“治療有效量”是指有效治療哺乳動物疾病的藥物的量。如果是治療癌癥，則藥物的治療有效量可減少癌細胞的數量；減少腫瘤的大?。灰种?即減慢至一定程度，優(yōu)選終止)癌細胞浸潤到外周器官中；抑制(即減慢至一定程度，優(yōu)選終止)腫瘤轉移；在一定程度上，抑制腫瘤生長；和/或在一定程度上，緩解與癌癥相關的一或多種癥狀。至于所述藥物阻止生長和/或殺傷現(xiàn)存癌細胞的程度，可以是抑制細胞和/或具有細胞毒性。至于腫瘤治療，可通過例如評估疾病進展時間(TTP)和/或確定應答率(RR)來測定其效力。
術語“癌癥”和“癌性質的”是指或描述哺乳動物中以細胞生長失控為典型特點的病理狀態(tài)。癌癥的實例包括但不限定于癌(carcinoma)，淋巴瘤，母細胞瘤，肉瘤和白血病或淋巴樣惡性腫瘤。更具體而言，這些癌包括鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)，肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌和肺鱗狀上皮癌)，腹膜癌，肝細胞癌(hepatocellular cancer)，胃癌(包括胃腸癌)，胰腺癌，膠質母細胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌(liver cancer)，膀胱癌，肝細胞瘤(hepatoma)，乳腺癌，結腸癌，直腸癌，結直腸癌，子宮內膜或子宮癌，唾液腺癌，腎癌，前列腺癌，外陰癌，甲狀腺癌，肝癌(hepaticcrcinoma)，肛門癌，陰莖癌以及頭頸癌。
“表達ErbB的癌”含有于細胞表面攜帶ErbB蛋白的細胞?！氨磉_ErbB的癌”在其細胞表面產生足夠水平的ErbB2，而使抗ErbB2抗體能與其結合并對所述癌癥產生治療作用。
“以ErbB受體過度活化為特點”的癌是這樣的癌，其中癌細胞中的ErbB受體活化程度顯著高于相同組織類型的非癌性細胞中該受體的活化水平。此過度活化可起因于癌細胞中ErbB受體的過度表達和/或有效活化ErbB受體的ErbB配體高于正常水平。此過度活化可引起癌細胞的惡性狀態(tài)，和/或被癌細胞的惡性狀態(tài)引起。在一些實施方案中，可對所述癌癥進行診斷性或預后性檢測，來確定導致此ErbB受體過度活化的ErbB受體擴增和/或過度表達是否存在。或者(或另外)對所述癌癥進行診斷性或預后性檢測，來確定促使此受體過度活化的ErbB配體擴增和/或過度表達是否存在。在這些癌的一個亞群中，所述受體的過度活化可由自分泌刺激途徑引起。
在“自分泌”刺激途徑中，自我刺激的發(fā)生是因為所述癌癥細胞即產生ErbB配體又產生其相關的ErbB受體。例如，所述癌癥可表達或過度表達EGFR而且還表達或過度表達EGFR配體(例如EGF、TGF-α、或HB-EGF)。在另一個實施方案中，所述癌癥可表達或過度表達ErbB2而且還表達或過度表達heregulin(如γ-HGR)。
“過度表達”ErbB受體的癌是在其細胞表面上的ErbB受體(例如ErbB2)水平顯著高于相同組織類型的非癌性細胞的那些癌。此過度表達可由基因擴增或增加的轉錄或翻譯而引起。ErbB受體的過度表達可在通過評估細胞表面ErbB蛋白水平的增加(例如通過免疫組化試驗；IHC)而進行的診斷性或預后性檢測中確定。或者(或另外)，細胞中ErbB核酸的水平可通過如原位熒光雜交(FISH；見1998年10月公開的WO98/45479)，Southern印跡或實時定量PCR(RT-PCR)等聚合酶鏈式反應測定。也可通過檢測血漿等生物體液中的脫落抗原(例如ErbB細胞外結構域)來研究ErbB受體過度表達(例如見1990年6月12日公布的美國專利4933294；1991年4月18日公開的WO91/05264；1995年3月28日公布的美國專利5401638；和Sias等，免疫學方法雜志13273-80(1990))。除了上述試驗，熟練的技術人員還可利用各種體內試驗。例如，可將患者體內的細胞暴露于已任選用可檢測的標記物(例如放射性同位素)標記的抗體，然后通過例如體表放射活性掃描，或通過對在暴露于抗體之前從患者體內取的活體組織進行分析來評估患者細胞與抗體的結合。
相反，“不以ErbB2受體過度表達為特點”的癌在診斷性檢測中，與其相同組織類型的非癌性細胞相比，表達的ErbB2受體水平不高于正常水平。
“過度表達”ErbB配體的癌是產生的ErbB配體水平顯著高于相同組織類型的非癌性細胞的那些癌。此過度表達可由基因擴增或增加的轉錄或翻譯而引起。通過檢測患者(例如腫瘤活體標本)中該配體(或其編碼核酸)的水平，或通過診斷性檢測如IHC、FISH、southern印跡、PCR或上述體內試驗等，可確診ErbB配體過度表達。
“激素非依賴性”癌是其不依賴于與該癌癥中細胞表達的受體結合的激素的存在而增殖的那些癌癥。這些癌癥不因實施能降低腫瘤內或其附近的激素濃度的藥理學或手術方案而出現(xiàn)臨床消退。激素非依賴性癌的實例包括雄激素非依賴性前列腺癌，雌激素非依賴性乳腺癌、子宮內膜癌和卵巢癌。這些癌可能始于激素依賴性腫瘤，然后在抗激素治療后由激素敏感期而發(fā)展為激素耐受性腫瘤。
本文中術語“細胞毒藥物”是指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞破壞的物質。該術語意在包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)，化療藥物，毒素如細菌、真菌、植物或動物來源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或變體。
“化療藥物”是在腫瘤治療中使用的化學化合物。化療藥物實例包括烷化劑，如噻替哌(thiotepa)；環(huán)磷酰胺(cyclosphamide)(CYTOXANTM)；烷基磺酸酯如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶(aziridine)如苯并多巴(benaodopa)，卡波醌(carboquone)，美妥替哌(meturedopa)和尿烷亞胺(uredopa)；氮丙啶和methylamelamine包括六甲蜜胺(altretamine)，三亞胺嗪(triethylenemelamine)，三亞乙基磷酰胺，三亞乙基硫代磷酰胺和三羥甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥(nitrogenmustards)如苯丁酸氮芥，萘氮芥，膽磷酰胺(cholophosphamide)，雌氮芥(estramustine)，異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)，氮芥(mechlorethamine)，鹽酸氧氮芥；左旋苯丙氨酸氮芥(melphalan)，新氮芥(novembichin)，膽甾醇苯乙酸氮芥，松龍苯芥(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥；亞硝基脲(nitrosureas)如亞硝基脲氮芥(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)，雷莫司汀(ranimustine)；抗生素如阿克拉霉素，放線菌素，authramycin，重氮絲氨酸，博來霉素，放線菌素C(cactinomycin)，加利車霉素(calicheamicin)，carabicin，洋紅霉素(chromomycin)，嗜癌素(carzinophilin)，色霉素，放線菌素D，柔紅菌素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，阿霉素(doxorubicin)，表阿霉素(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊達比星(idarubicin)，發(fā)波霉素(marcellomycin)，絲裂霉素，霉酚酸，諾加霉素(nogalamycin)，橄欖霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，potfiromycin，嘌呤霉素，三鐵阿霉素(quelamycin)，羅多比星(rodorubicin)，鏈黑菌素；鏈脲霉素(streptozocin)，殺結核菌素，烏苯美司(ubenimex)，凈司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代謝藥如氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物如二甲葉酸(denopterin)，氨甲蝶呤，蝶羅呤，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物氟達拉濱(fludarabine)，6-巰基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鳥嘌呤；嘧啶類似物如安西他濱(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷，雙脫氧尿苷，去氟氧尿苷(doxifluridine)，依諾他濱(enocitabine)，氟尿苷，5-FU；雄激素類如二甲睪酮(calusterone)，丙酸甲雄烷酮(dromostanolong propionate)，環(huán)硫雄醇(epitiostanol)，美雄氨(mepitiostane)，睪內酯(testolactone)；抗腎上腺類如氨魯米特(aminoglutethimide)，米托坦(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑如frolinic acid；醋葡內酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(biasntrene)；依達曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋銨(elliptinium acetate)；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；硝呋旦(nitracrine)；噴司他丁(pintostatin)；phenamet；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼樹酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；西索菲蘭(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺(trichlorrotriethylamine)；烏拉坦(urethan)；長春堿酰胺；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；環(huán)磷酰胺；三胺硫磷(thiotepa)；紫杉烷(紫杉烷)，如紫杉醇(TAXOL，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)和docetaxel(TAXOTERE，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，F(xiàn)rance)；苯丁酸氮芥；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫代鳥嘌呤；巰基嘌呤；氨甲蝶呤；鉑類似物如順鉑和卡鉑；長春花堿；鉑；依托泊甙(etoposide)(VP-16)；異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素C；米托蒽醌；長春新堿；長春瑞賓(vinorelbine)；新霉酰胺(navelbine)；novantrone；替尼泊甙(teniposide)；柔紅霉素；氨基蝶呤；xeloda；伊拜膦酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；維甲酸；esperamicins；capecitabine；以及上述任何物質的可藥用鹽，酸或衍生物。此定義還包括能調節(jié)或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素制劑，如抗雌激素制劑包括他莫昔芬(tamoxifen)，雷洛昔芬(raloxifene)，芳香酶抑制劑4(5)-咪唑，4-羥基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，keoxifene，LY117018，onapristone，和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素制劑如氟他氨(flutamide)，尼魯米特(nilutamide)，bicalutamide，亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；和上述任何物質的可藥用鹽，酸或衍生物。
本文中術語“靶向EGFR的藥物”是指與EGFR結合并任選抑制EGFR活化的治療藥物。這些藥劑的實例包括與EGFR結合的抗體和小分子。與EGFR結合的抗體實例包括Mab 579(ATCC CRL HB8506)、MAb 455(ATCCCRL HB 8507)、Mab 225(ATCC CRL HB 8508)、Mab 528(ATCC CRL HB8509)(見美國專利4943533，Mendelsohn等)及其變體，例如嵌合型225(C225)和重塑型人225(H225)(見WO96/40210，Imclone Systems Inc.)；結合EGFR II型突變體的抗體(美國專利5212290)；美國專利5891996中所述與EGFR結合的人源化抗體和嵌合抗體；和與EGFR結合的人抗體(見WO98/50433，Abgenix)。所述抗EGFR抗體可與細胞毒藥劑偶聯(lián)，從而產生免疫偶聯(lián)物(見例如EP 659,439A2，Merck Patent GmbH)。與EGFR結合的小分子的實例包括ZD 1839(Astra Zeneca)、CP-358774(OSI/Pfizer)和AG 1478。
“抗血管生成藥劑”是指在一定程度上阻斷或干擾血管發(fā)育的化合物。例如，抗血管生成因子可以是與參與促進血管生成的生長因子或生長因子受體結合的小分子或抗體。本文中優(yōu)選的抗血管生成因子是與血管內皮生長因子(VEGF)結合的抗體。
術語“細胞因子”是一般性術語，指由一個細胞群釋放的對另一個細胞群起細胞間介質作用的蛋白。這些細胞因子包括生長激素，如人生長激素，N-甲二磺酰人生長激素，和牛生長激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；前胰島素；松馳素；前松馳素；糖蛋白激素如卵泡刺激素(FSH)，甲狀腺刺激素(TSH)，促黃體(生成)激素(LH)；肝細胞生長因子；成纖維細胞生長因子；催乳激素；胎盤催乳素；腫瘤壞死因子-α和β；mullerian-抑制物；小鼠促性腺激素相關肽；抑制素；苯丙酸諾龍；血管內皮細胞生長因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO)；神經生長因子如NGF-β；血小板生長因子；轉化生長因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長因子-I和-II；促紅細胞生成素(EPO)；骨誘導因子(osteoinductive factors)；干擾素如干擾素-α，-β，-γ；集落刺激因子(CSF)如巨噬細胞-CSF(M-CSF)；粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF)；粒細胞-CSF(G-CSF)；白細胞介素(IL)如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12；腫瘤壞死因子如TNF-α或TNF-β；和其它多肽因子包括LIF和kit配體(KL)。本文中術語細胞因子包括天然蛋白或來自重組細胞培養(yǎng)物的蛋白以及天然序列細胞因子的生物活性等效物。
本申請使用的術語“前體藥物”是指藥物活性物質的前體或衍生物形式，其相對于親本藥物對腫瘤細胞的細胞毒作用較小且可酶促活化或被轉換成更具活性的親本形式。例見Wilman，“癌癥化療中的前體藥物”Biochemical Society Transaction，14，pp.375-382，615thMeeting Belfast(1986)和Stella等，“前體藥物一種藥物定向運送的化學方法”定向藥物運送，Borchardt等(編)，pp.247-267，Humana press(1985)。本發(fā)明的前體藥物包括，但不限于含有磷酸鹽的前體藥物，含有硫代磷酸鹽的前體藥物，含有硫酸鹽的前體藥物，含有肽的前體藥物，D-氨基酸修飾的前體藥物，糖基化的前體藥物，含有β-內酰胺的前體藥物，任選含有取代的苯氧乙酰胺的前體藥物或任選含有取代的苯基乙酰胺的前體藥物，5-氟胞嘧啶和可轉化為更具細胞毒活性的游離藥物的其它5-氟尿嘧啶前體藥物?？裳苌鸀楸景l(fā)明所用前體藥物形式的細胞毒藥物包括，但不限于上述化療藥物。
“脂質體”是由能向哺乳動物有效運送藥物(如本文公開的抗ErbB2抗體，和，任選，一種化療藥物)的各類脂質、磷脂和/或表面活性劑組成的小分子囊泡。脂質體的組分通常排列為雙層形式，與生物膜的脂質排列相似。
所用的術語“包裝插頁”是指通常包括在治療產品的商業(yè)包裝中，含有與這些治療產品的使用有關的說明，用法，劑量，給藥，禁忌和/或警示等的說明書。
“心臟保護劑”是能預防或減少與向患者給藥(如蒽環(huán)霉素抗生素和/或抗ErbB2抗體)相關的心肌功能障礙(即心肌病和/或充血性心臟衰竭)的化合物或組合物。心臟保護劑可，例如阻斷或減少自由基介導的心臟毒性作用和/或預防或減少氧化應激損傷。本定義包括的心臟保護劑的實例包括鐵螯合劑右丙亞胺(dexrazoxane)(ICRF-187)(Seifert等，Annals of Pharmacotherapy281063-1072(1994))；降脂藥和/或抗氧化劑，如丙丁酚(probucol)(Singal等，J.Mol.Cell.Cardiol.271055-1063(1995))；氨磷汀(氨基硫醇2-[(3-氨丙基)氨基]乙烷硫醇-二氫磷酸酯，也稱為WR-2721，其脫磷酸化的細胞吸收型稱為WR-1065)和S-3-(3-甲基氨基丙基氨基)丙基硫代磷酸(WR-151327)，見Green等，癌癥研究54738-741(1994)；地高辛(Bristow，M.R.在Bristow，M.R.主編的《藥物誘導的心臟病》中，紐約Elsevier 191-215(1980))；β阻斷劑如美托洛爾(Hjalmarson等，藥物47增刊431-9(1994)；和Shaddy等，美國心臟雜志129197-9(1995))；維生素E；抗壞血酸(維生素-C)；自由基清除劑，如齊墩果酸、烏蘇酸和N-乙酰半胱氨酸(NAC)；spin trapping化合物，如α-苯基-叔丁基硝酮(PBN)；(Paracchini等，抗癌研究131607-1612(1993))；selenoorganic化合物，如P251(Elbesen)等等。
“分離的”核酸分子是從抗體核酸的天然來源中通常與其結合的至少一種雜質核酸分子中鑒定并分離的核酸分子。分離的核酸分子不同于其天然形式或組合(setting)。因此分離的核酸分子區(qū)別于其在天然細胞中的存在形式。然而，分離的核酸分子包括通常能表達該抗體的細胞中所含核酸分子，例如在此細胞中所述核酸分子的染色體定位與其在天然細胞中的定位不相同。
術語“調控序列”指在特定宿主生物中使可操作連接的編碼序列表達所需的DNA序列。適于原核生物的調控序列可包括如啟動子，任選操縱子序列，和核糖體結合位點。已知真核生物細胞利用啟動子，聚腺苷酸化信號和增強子。
當一種核酸與另一種核酸序列處于功能相關的位置時，該核酸與該另一種核酸“可操作相連”。例如如果一種多肽表達為參與該多肽的分泌的前體蛋白，則將前序列或分泌前導序列的DNA與該多肽的DNA可操作相連；啟動子或增強子當能影響編碼序列的轉錄時可與該編碼序列可操作相連；或核糖體結合位點當其位置能促進翻譯時可與編碼序列可操作相連。通?！翱刹僮飨噙B”指被連接的DNA序列是相鄰的，而且，如果是分泌前導序列，則相鄰且為閱讀狀態(tài)。然而，增強子不必是相鄰的。連接可通過在方便的限制性位點相連而實現(xiàn)。如果不存在這樣的位點，可根據常規(guī)實踐使用合成的寡核苷酸銜接子或接頭。
本文中，詞語“細胞”、“細胞系”和“細胞培養(yǎng)”可互換應用，而且所有這些名稱均包括子代。因此，單詞“轉化體”或“轉化的細胞”包括原代主體細胞和從其衍生的培養(yǎng)物，不必考慮轉移的次數。還應明白由于有意或無意的突變，所有子代的DNA含量可能不完全相同。具有與原始轉化細胞中所篩選的功能或生物學活性相同的功能或生物學活性的突變子代也包括在內。名稱不同之處，將在文中指明。
II.抗ErbB2抗體的制備下面是關于本發(fā)明所用抗體的制備技術實例的敘述。用于制備抗體的ErbB2抗原可以是例如ErbB2的可溶型細胞外結構域或其含所需表位的一部分。或者，可用在其表面表達ErbB2的那些細胞(例如轉化為過度表達ErbB2的NIH-3T3細胞；或SK-BR-3細胞等癌細胞系，見Srancovski等，PNAS(USA)888691-8695(1991))來制備抗體。ErbB2的可用于制備抗體的其它形式對于本領域技術人員是顯而易見的。
(i)多克隆抗體多克隆抗體優(yōu)選通過多次給動物皮下(sc)或腹膜內(ip)注射相關抗原和佐劑而產生。將所述相關抗原與針對所免疫的物種具有免疫原性的蛋白(如匙孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)用雙功能試劑或衍生試劑，如馬來酰亞氨苯甲?；虼牾啺孵?通過半胱氨酸殘基結合)、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR(R和R1是不同烷基，進行偶聯(lián)是有效的。
用所述抗原、免疫原性偶聯(lián)物或衍生物免疫動物，方法是，將100μg或5μg蛋白或偶聯(lián)物(分別針對兔或鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑混合，在多位點皮內注射該溶液。1個月后，多位點皮內注射起始量的1/5-1/10的肽或與弗氏完全佐劑的偶聯(lián)物來加強免疫。7-14天后，對動物采血，測定血清中的抗體效價。對動物的加強免疫直到效價達到平臺期為止。優(yōu)選給動物加強注射相同抗原的偶聯(lián)物，但也可以是偶聯(lián)至不同蛋白和/或通過不同的交聯(lián)劑偶聯(lián)的偶聯(lián)物。偶聯(lián)物還可以是重組細胞培養(yǎng)物產生的融合蛋白。此外，可用明礬等聚集劑增強免疫應答。
(ii)單克隆抗體單克隆抗體來自基本均一的抗體群，即該群體中的每個抗體除了可能的很小量天然突變外都相同。因此，修飾詞“單克隆”指所述抗體的并非不同抗體混合物的特性。
例如，單克隆抗體可用由Kohler等，自然(1975)首次描述的雜交瘤技術制備，或用重組DNA方法制備(美國專利4,816,567)。
在雜交瘤方法中，如上述免疫小鼠或其它適合的宿主動物如倉鼠，以激發(fā)那些產生或能產生與用于免疫之蛋白特異性結合的抗體的淋巴細胞。另外，可體外免疫淋巴細胞。然后用適當融合劑，如聚乙二醇，使淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，形成雜交瘤細胞(Goding，單克隆抗體原理及應用，pp.59-103(Academic Press，1986))。
將如此制備的雜交瘤細胞接種至適當培養(yǎng)基中并培養(yǎng)，優(yōu)選該培養(yǎng)基含有一或多種能抑制未融合的親本骨髓瘤細胞生長或存活的物質。例如，如果親本骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT或HPRT)，雜交瘤培養(yǎng)基通常將包含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質阻止HGPRT-缺陷型細胞的生長。
優(yōu)選骨髓瘤細胞是那些能有效融合、支持所選抗體生成細胞以穩(wěn)定的高水平產生抗體，并對諸如HAT培養(yǎng)基等類似培養(yǎng)基敏感的細胞。其中，優(yōu)選的骨髓瘤細胞系是鼠骨髓瘤系，如由Salk Institute Cell DistreibutionCenter，San Diego，California USA提供的MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤細胞和由美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，Maryland USA提供的SP-2或X63-Ag8-653細胞。也有報道稱人骨髓瘤以及小鼠-人異質性骨髓瘤細胞系可用于產生人單克隆抗體(Kozbor，免疫學雜志1333001(1984)；Brodeur等，單克隆抗體制備技術及應用，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))可在含有生長的雜交瘤細胞培養(yǎng)基中分析直接針對所述抗原的單克隆抗體的產生。雜交瘤細胞所產生的單克隆抗體的結合特異性通過免疫沉淀或通過體外結合試驗，如放射免疫分析(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)來分析。
單克隆抗體的結合親和力可通過如Muson等，Anal.Biochem.，107220(1980)所述Scatchard分析來測定。
一旦鑒定出能產生具有所需特異性、親和力、和/或活性的抗體的雜交瘤細胞后，將這些克隆通過有限稀釋法進一步克隆并用標準方法進行培養(yǎng)(Goding，單克隆抗體原理及應用，pp.59-103(Academic Press，1986))。適于此目的的培養(yǎng)基包括如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細胞可作為腹水中腫瘤的形式在動物體內生長。
由亞克隆分泌的單克隆抗體可用常規(guī)免疫球蛋白純化方法如蛋白-A-Sepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析從培養(yǎng)基、腹水或血清中分離。
編碼單克隆抗體的DNA可用常規(guī)方法很容易的分離和測序(如利用能與編碼小鼠抗體重鏈和輕鏈的基因特異結合的寡核苷酸探針)。雜交瘤細胞是這類DNA的優(yōu)選來源。DNA分離后，可將其插入表達載體中，然后用此表達載體轉染宿主細胞，如大腸桿菌細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或不產生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞，以便在重組宿主細胞中合成單克隆抗體。編碼抗體的DNA在細菌中的重組表達的綜述見Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.，5256-262(1993)和Pluckthun，Immunol.Revs.，130151-188(1992)。
在另一實施方案中，可從用McCafferty等，自然，348552-554(1990)所述技術產生的抗體噬菌體文庫中分離抗體或抗體片段。Clackson等，自然，352624-628(1991)和Marks等，分子生物學雜志222581-597(1991)分別描述了用噬菌體文庫分離鼠和人的抗體。后來的文獻描述了通過鏈改組制備高親和力(nM范圍)的人型抗體(Marks等，生物/技術10779-783(1992))，以及用于構建大規(guī)模噬菌體文庫的組合感染和體內重組方法(Waterhouse等，核酸研究212265-2266(1993))。因此，這些技術都可取代傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術來分離克隆抗體。
DNA也可通過用人類重鏈和輕鏈的恒定區(qū)編碼序列取代小鼠同源序列來修飾(美國專利4,816,567；Morrison等，美國國家科學院學報816851(1984))，或通過將非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價結合來修飾。
通常用所述非免疫球蛋白多肽取代抗體恒定區(qū)，或取代抗體上一個抗原結合點的可變區(qū)，形成二價嵌合抗體，其中一個抗原結合位點特異于一種抗原而另一個抗原結合位點特異于另一種抗原。
(iii)人源化抗體本領域已有關于人源化非人類抗體的制備方法的描述。優(yōu)選人源化抗體中已導入一或多個源自非人類的氨基酸殘基。這些非人類氨基酸殘基常稱為“引進的”殘基，它們通常來自“引進的”可變區(qū)。人源化過程基本如Winter及其同事(Jones等，自然，321522-525(1986)；Riechmann等，自然，332323-327(1988)；Verhoeyen等，科學，2391534-1536(1988))所述，用高變區(qū)序列取代人類抗體的相應序列來進行。因此，這樣的“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利4,816,567)，其中完整人類可變區(qū)的很少一部分被非人類物種的相應序列取代。實踐中，人源化抗體通常是人的抗體，其中高變區(qū)殘基且可能有部分FR殘基被嚙齒類抗體中類似位點的殘基取代。
對用于制備人源化抗體的人類可變區(qū)(包括重鏈和輕鏈)的選擇，對降低抗原性非常重要。根據所謂“最適應”方法，針對已知人類可變區(qū)序列的整個文庫篩選嚙齒類抗體可變區(qū)序列。將與嚙齒類的序列最相似的人類序列作為人源化抗體的人框架區(qū)(FR)(Sims等，免疫學雜志，1512296(1993)；Chothia等，分子生物學雜志，196901(1987))。另一種方法是用人類輕鏈或重鏈特定亞型的所有抗體的共有序列作為特定框架區(qū)。相同的框架可用于幾種不同的人源化抗體(Carter等，美國國家科學院學報，894285(1992)；Presta等，免疫學雜志，1512623(1993))。
更重要的是，將抗體人源化后保留了對抗原的高親和力和其它有利的生物特性。為達到此目的，在一種優(yōu)選方法中，通過用親本序列和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產物來制備人源化抗體。免疫球蛋白三維模型已有商品，是本領域技術人員所熟悉的。還有用于描述和展示所選免疫球蛋白序列可能的三維構象的計算機程序。通過觀察這些展示結果可分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能發(fā)揮的作用，即分析能影響候選免疫球蛋白與其抗原結合的能力的殘基，通過這種方法，可從受者和引進序列中選出FR殘基并組合，從而得到所需抗體性質，如對靶抗原的親和力增加?？傊?，高變區(qū)殘基直接并且最主要涉及對抗原結合的影響。
下述的實施例3敘述了結合ErbB2并阻斷ErbB受體的配體活化作用的人源化抗ErbB2抗體實例的制備。本文中特定目的人源化抗體基本上與小鼠單克隆抗體2C4(或其Fab片段)一樣有效地阻斷MAPK的由EGF、TGF-α和/或HRG介導的活化作用，和/或與小鼠單克隆抗體2C4(或其Fab片段)一樣有效地結合ErbB2。例如，此處的人源化抗體可包括引入人重鏈可變區(qū)的非人類超變區(qū)殘基，并且可進一步包括在選自69H、71H和73H(使用在Kabat等，具有免疫學意義的蛋白的序列，第5版.Public Health Serive.National Institute of Health，Bethesda，MD(1991)中提出的編號系統(tǒng))的位點上的框架區(qū)(FR)取代。在一個實施方案中，所述人源化抗體在69H，71H和73H的兩個或所有位置包含F(xiàn)R取代。
本文中目的人源化抗體的一個實例包括重鏈可變區(qū)的互補決定區(qū)殘基GFTFTDYTMX，其中X優(yōu)選D或S(SEQ ID NO7)；DVNPNSGGSIYNQRFKG(SEQ ID NO8)；和/或NLGPSFYFDY(SEQ IDNO9)，任選包括這些CDR殘基的氨基酸修飾，例如所述修飾基本上維持或提高該抗體的親和力。例如，目的抗體變體在上述重鏈可變區(qū)CDR序列中可具有約1-7或5個氨基酸取代。通過如下所述親和力成熟可制備這樣的抗體變體。最優(yōu)選的人源化抗體包括SEQ ID NO4中的重鏈可變區(qū)氨基酸序列。
除了例如在先段落的那些重鏈可變區(qū)CDR殘基之外，人源化抗體可包括輕鏈可變區(qū)的互補決定區(qū)殘基KASQDVSIGVA(SEQ ID NO10)；SASYX1X2X3，其中X1優(yōu)選R或L，X2優(yōu)選Y或E，X3優(yōu)選T或S(SEQ IDNO11)；和/或QQYYIYPYT(SEQ ID NO12)。這樣的人源化抗體任選包括上述CDR殘基的氨基酸修飾，例如所述修飾基本上維持或提高該抗體的親和力。例如，目的抗體的變體在上述輕鏈可變區(qū)CDR序列中可具有約1-7或5個氨基酸取代。通過如下所述親和力成熟可制備這樣的抗體變體。最優(yōu)選的人源化抗體包括SEQ ID NO3中的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。
本申請還考慮了親和力成熟的結合ErbB2并阻斷ErbB受體的配體活化作用的抗體。親本抗體可以是人抗體或人源化抗體，例如包括輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)序列(分別見SEQ ID NO 3和4)的抗體(即變體574)。所述親和力成熟的抗體優(yōu)選以高于鼠2C4或變體574的親和力與ErbB2受體結合(例如用ErbB2-細胞外結構域(ECD)ELISA法檢測時，親和力提高約2或4倍到約100-1000倍)。用于取代的重鏈可變區(qū)CDR殘基實例包括H28、H30、H34、H35、H64、H96和H99，或者這些殘基的兩個或多個(例如2、3、4、5、6或者7個殘基)的組合。可被改變的輕鏈可變區(qū)CDR殘基包括L28、L50、L53、L56、L91、L92、L93、L94、L96、L97或這些殘基的兩個或多個(例如2到3、、4、5直到10個殘基)的組合。
本申請還考慮了人源化抗體或親和力成熟的抗體的各種形式。例如，所述人源化抗體或親和力成熟的抗體可以是抗體片段，如Fab，其可任選與一個或多個細胞毒藥物偶聯(lián)以制備免疫偶聯(lián)物?；蛘?，所述人源化抗體或親和力成熟的抗體可以是完整的抗體，例如完整的IgG1抗體。
(iv)人類抗體除了進行人源化以外還可制備人類抗體。例如現(xiàn)在已能產生如下轉基因動物(如小鼠)，它們通過免疫能產生人類抗體的所有成分而不產生內源免疫球蛋白。例如，有報道稱，嵌合及種系(germ-line)突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合缺失導致內源抗體的產生被完全抑制。將人類種系免疫球蛋白基因陣列轉移到這類種系突變小鼠中將導致因抗原攻擊而誘導人類的抗體產生。見Jakobovits等，美國國家科學院學報，902551(1993)；Jakobovits等，自然，362255-258(1993)；Bruggermann等，Year in Immuno.733(1993)；和美國專利5591669，5589369和5545807。
或者，可用噬菌體展示技術(McCafferty等，自然348552-553(1990))從未免疫供者的免疫球蛋白可變(V)區(qū)基因的所有組成而體外產生人類抗體和抗體片段。依據此技術，將抗體V區(qū)基因克隆在與絲狀噬菌體(如M13或fd)主要或次要衣殼蛋白基因相同的框架內，并在噬菌體顆粒的表面展示為功能性抗體片段。因為絲狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，根據抗體的功能特點進行的選擇也導致對顯示這些性質的抗體的編碼基因進行選擇。因此，噬菌體模仿了B細胞的部分特點。噬菌體展示可以以多種形式進行；這些綜述見Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，結構生物學的最新觀點(Current Opinion in Structural Biology)3564-571(1993)?？墒褂肰基因片段的多個來源進行噬菌體展示。Clackson等，自然，352624-628(1991)從免疫小鼠脾臟來源的V基因的隨機組合小文庫中分離了抗-惡唑酮抗體的一個多樣性陣列?？苫救鏜arks等，分子生物學雜志222581-597(1991)，或Griffith等，EMBO J.12725-734(1993)所述構建未經免疫的人類供者V基因的所有組成，并分離針對抗原多樣性陣列(包括自身抗原)的抗體。亦參見美國專利5565332和5573905。
人類抗體也可通過體外活化的B細胞而產生(見美國專利5,567,610和5,229,275)。
人類抗ErbB2抗體在1998年6月30日公布的美國專利5772997和1997年1月3日公開的WO97/00271中敘述。
(v)抗體片段已開發(fā)了生成抗體片段的多種技術。傳統(tǒng)上，這些片段通過對完整抗體的蛋白水解性消化獲得(見Morimoto等，生物化學和生物物理學方法雜志(Journal of Biochemical and Biophysical Methods)24107-117(1992))和Brennan等，科學，22981(1985))。但現(xiàn)在可直接通過重組宿主細胞產生這些片段。例如，可從上述抗體噬菌體庫分離抗體片段。另外，可從大腸桿菌直接回收Fab’-SH片段，并經化學連接形成F(ab’)2片段(Carter等，生物/技術10163-167(1992))。依據另一種方法，可直接從重組宿主細胞培養(yǎng)中分離F(ab’)2片段。其它產生抗體片段的技術對本領域技術人員是顯而易見的。在其它實施方案中，所選抗體是單鏈Fv片段(scFv)。見WO93/16185；美國專利5,571,894；和美國專利5,587,458?？贵w片段也可以是“線性化抗體”，如美國專利5,641,870所述。這類線性化抗體片段可以是單特異性或雙特異性的。
(vi)雙特異性抗體雙特異性抗體是具有針對至少兩種不同表位的結合特異性的抗體。如雙特異性抗體可以與ErbB2蛋白的兩種不同表位結合。其它這種抗體可將ErbB2結合位點與針對EGFR、ErbB3和/或ErbB4的結合位點組合?；蛘?，可將抗ErbB2臂與結合白細胞上引發(fā)分子的臂結合，從而集中針對ErbB2表達細胞的細胞防御機制，所述引發(fā)分子如T細胞受體分子(CD2或CD3)，或IgG Fc受體(FcγR)如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。雙特異性抗體還可用于將細胞毒制劑定位至表達ErbB2的細胞。這些抗體具有ErbB2結合臂和結合細胞毒制劑(例如皂草素，抗INF-α，長春花生物堿，蓖麻毒蛋白A鏈，氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。雙特異性抗體可制備成全長抗體或抗體片段(如F(ab’)2雙特異性抗體)。
WO 96/16673敘述了雙特異性抗ErbB2/抗FcγRIII抗體，而在美國專利5837234中公開了雙特異性抗ErbB2/抗FcγRI抗體。雙特異性抗ErbB2/Fcα抗體見WO98/02463。美國專利5821337中敘述了雙特異性抗ErbB2/抗CD3抗體。
制備雙特異性抗體的方法是本領域已知的。完整雙特異性抗體的傳統(tǒng)制備方法是基于兩種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達，其中這兩條鏈具有不同特異性(Millstein等，自然，305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈輕鏈隨機分配，這些雜交瘤(細胞雜交瘤(quadroma))可能產生10種不同抗體分子的混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結構。對所述正確分子的純化(通常通過親和層析步驟來進行)非常復雜，且產量很低。類似的方法見WO93/08829和Traunecker等，EMBO J，103655-3659(1991)。
依據另一種方法，可將具有所需結合特異性(抗體-抗原結合位點)的抗體可變區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。該融合優(yōu)選與包含鉸鏈區(qū)的至少一部分、CH2及CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)融合。優(yōu)選使含有輕鏈結合所需位點的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)出現(xiàn)在至少在一種融合中。可將編碼免疫球蛋白重鏈融合體，以及必要時，編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA插入不同表達載體，共轉染至適當宿主生物。這使得在使用非等比的三種多肽鏈進行構建的實施方案中，能較靈活地調整三種多肽片段的相互比例，以獲得最佳產量。但也可在至少兩種多肽鏈以等比例表達而獲得高產時或所述比例無特別意義時，將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入同一表達載體。
在該方法的一個優(yōu)選實施方案中，所述雙特異性抗體由一條臂上的帶有第一結合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈和另一條臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)構成。已發(fā)現(xiàn)這種不對稱結構有利于從非必要免疫球蛋白鏈的混合中分離出所需雙特異性化合物，因為只有該雙特異性分子的一半上存在免疫球蛋白輕鏈，這使得分離更加容易。此方法公開于WO94/04690中。制備雙特異性抗體的進一步細節(jié)，見Suresh等，酶學方法，121210(1986)。
根據美國專利5,731,168所述的另一種方法，可改造一對抗體分子之間的界面，使得從重組細胞培養(yǎng)中獲得的異源二聚體的百分比最大。優(yōu)選的界面包括抗體恒定區(qū)CH3結構域的至少一部分。在該方法中，源于第一抗體分子界面上的一條或多條氨基酸小側鏈被較大側鏈(如酪氨酸或色氨酸)取代。與所述大側鏈大小相同或相近的互補“溝”可通過將氨基酸大側鏈用小側鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)取代而在第二抗體分子的界面上形成。這使得異二聚體的產量比不想要的終產物如同型二聚體的高。
雙特異性抗體包括交聯(lián)抗體或“異源偶聯(lián)的”抗體。例如，可使異源偶聯(lián)物中的抗體之一與抗生物素蛋白偶聯(lián)，使另一抗體與生物素偶聯(lián)。有觀點認為，這類抗體可用于將免疫細胞導向不想要的細胞(美國專利4676980)，也可用于治療HIV感染(WO91/00360，WO92/200373，EP03089)。異源偶聯(lián)抗體可通過任何適當的交聯(lián)方法制備。適當的交聯(lián)制劑和多種交聯(lián)技術為本領域已知，可在美國專利4676980號中獲得。
從抗體片段制備雙特異性抗體的技術已有文獻。例如，雙特異性抗體可利用化學連接制備。Brennan等，科學22981(1985)中描述了將完整抗體經蛋白水解制備F(ab′)2片段的方法。這些片段在二巰基復合劑亞砷酸鈉存在時被還原，從而穩(wěn)定相鄰的巰基，并阻止分子間二硫鍵的形成。生成的Fab′片段被轉化為硫硝基苯甲酸鹽(TNB)衍生物。其中一種Fab′-TNB衍生物經巰基乙胺還原成Fab′-硫醇，再與等分子量的其它Fab′-TNB衍生物混合形成雙特異性抗體。如此產生的雙特異性抗體可作為酶的選擇性固相化中所用的試劑。
近期的進展促進了Fab′-SH片段從大腸桿菌的直接回收，該片段可經化學偶聯(lián)形成雙特異性抗體。Shalaby等，實驗醫(yī)學雜志，175217-225(1992)中描述了完全人源化雙特異性抗體F(ab′)2分子的產生。每一Fab′片段分別從大腸桿菌中分泌出來，體外直接化學偶聯(lián)形成雙特異性抗體。如此制備的雙特異性抗體能與過度表達ErbB2受體的細胞和正常人T細胞結合，還能引發(fā)人類細胞毒淋巴細胞對人乳腺腫瘤細胞的裂解活性。
直接從重組細胞培養(yǎng)中制備并分離雙特異性抗體片段的多種技術也已有描述。例如，可用亮氨酸拉鏈制備雙特異性抗體。Kostelny等，免疫學雜志，148(5)1547-1553(1992))。將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽與兩種不同抗體的Fab′部分通過基因融合而連接。使抗體的同型二聚體在鉸鏈區(qū)被還原成單體，然后被再氧化形成抗體的異二聚體。該方法也可用于制備抗體同型二聚體。由Hollinger等，美國國家科學院學報，906444-6448(1993))描述的“二價抗體”技術提供了另一種制備雙特異性抗體片段的方法。所述片段中含有重鏈可變區(qū)(VH)，其通過接頭與輕鏈可變區(qū)(VL)相連，該接頭非常短，使得同一鏈的兩個結構域之間無法配對。因此，同一片段上的VH和VL結構域被迫與另一片段上的互補VL和VH結構域配對，從而形成兩個抗原結合位點。此外還報道了另一種用單鏈Fv(sFv)二聚體來制備雙特異性抗體的策略。見Gruber等，免疫學雜志，1525368(1994)。
還考慮了二價以上的抗體。如可制備三特異性抗體。Tutt等，免疫學雜志，14760(1991)。
(vii)其它氨基酸序列修飾本申請考慮了本文所述抗ErbB2抗體的氨基酸序列修飾。例如，可能需要改進抗體的結合親和力和/或其它生物學特點?？笶rbB2抗體的氨基酸序列變體可通過在抗ErbB2抗體核酸中引入適當的核苷酸變化或通過肽合成制備。這類修飾包括例如抗ErbB2抗體的氨基酸序列內殘基的缺失、和/或插入和/或取代。可進行缺失、插入和取代的任何組合以獲得最終的構建體，只要最終的構建體具有所需的特性。所述氨基酸變化還可改變抗ErbB2抗體的翻譯后加工過程，例如改變糖基化位點的數目或位置。
一種鑒別抗ErbB2抗體中處于誘變優(yōu)選位置的特定殘基或區(qū)域的有效方法是Cunningham和Wells，科學2441081-1085(1989)所述的“丙氨酸掃描誘變”。這里，鑒定一個殘基或一組靶殘基(例如，帶電的殘基如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和谷氨酸)并用中性或帶負電的氨基酸取代(最優(yōu)選丙氨酸或多聚丙氨酸)取代，以便影響氨基酸與ErbB2抗原的相互作用。那些證實對取代具有功能敏感性的氨基酸位置通過在取代點引入進一步的或其他的變體而改進。故，盡管引入氨基酸序列變異的位點是預先決定的，但突變本身不必是預定的。例如，為分析在指定位點處突變的作用，在所述靶密碼子或區(qū)域實行丙氨酸掃描或隨機誘變，并篩選所表達的具有預期活性的抗ErbB2抗體變體。
氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-端的融合(其長度從一個殘基至包括100個或更多殘基的多肽)，以及序列內單個或多個氨基酸殘基的插入。末端插入的例子包括帶有N-末端甲硫氨酰殘基的抗ErbB2抗體或與細胞毒性多肽融合的該抗體?？笶rbB2抗體分子的其它插入變體包括使抗ErbB2抗體的N-或C-末端與能增加該抗體的血清半衰期的酶或多肽融合。
另一類變體是氨基酸取代變體。這些變體使抗ErbB2抗體分子中至少一個氨基酸殘基被不同殘基取代。最有興趣進行取代誘變的位點包括高變區(qū)，也可以考慮FR的改變。保守取代見表1的“優(yōu)選取代”欄。如果這些取代引起生物學活性的改變，則可引入表1中“取代舉例”欄的更實質性改變，或進一步在下文的氨基酸分類中所述的更實質性改變，并篩選產物。
表1
對所述抗體的生物學特性的實質性修改可通過選擇性取代來完成，所述取代的效應在維持(a)取代區(qū)多肽骨架的結構，例如片層結構或螺旋構象，(b)該分子靶位點的電荷或疏水性，(c)側鏈的大小這幾方面有顯著差異。天然殘基根據共有的側鏈特性可分為(1)疏水性正亮氨酸，蛋氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸異亮氨酸
(2)中性親水半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸(3)酸性天冬氨酸，谷氨酸(4)堿性天冬酰胺，谷氨酰胺，組氨酸，賴氨酸，精氨酸(5)影響側鏈定向的殘基甘氨酸，脯氨酸(6)芳香族色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。非保守取代將限定上述某一類的成員被另一類取代。
不參與維持抗ErbB2抗體的正確構象的任何半胱氨酸殘基也可被取代，通常被絲氨酸取代，以提高該分子的氧化穩(wěn)定性，并阻止異常交聯(lián)。相反，可在該抗體中添加半胱氨酸連接以提高其穩(wěn)定性(特別當該抗體為抗體片段如FV片段時)。
取代變體的特別優(yōu)選類型包括取代親本抗體高變區(qū)的一或多個殘基。通常，所選用于進一步開發(fā)的變體相對于其親本抗體應具有改進的生物學活性。產生這種取代變體的一個方便方法是利用了噬菌體展示的親和力成熟。簡單地說，使高變區(qū)的幾個位點(如6-7個位點)突變以便在每一位點產生所有可能的氨基酸取代。這樣產生的抗體變體以單價形式展示在絲狀噬菌體顆粒上，其為與每個顆粒內包裝的M13基因III產物的融合體。然后篩選噬菌體展示的變體是否具有本文所述生物學活性(如結合親和力)。為了鑒定備選的高變區(qū)修飾位點，可通過丙氨酸掃描誘變來鑒定對抗原結合作出主要貢獻的高變區(qū)殘基。此外，分析抗原-抗體復合物的晶體結構以確定抗原與抗體之間的接觸點也較有利。這些接觸殘基及其鄰近殘基是根據本文所述技術進行取代的候選位點。一旦產生這樣的變體，如本文所述對它們全部進行篩選，選出在一或多個相關實驗中具有優(yōu)勢特性的抗體以便進一步開發(fā)。
所述抗體的另一種氨基酸變體改變了該抗體原來的糖基化模式。所謂改變就是去掉該抗體中的一或多個碳水化合物部分，和/或添加一或多個原本不存在于該抗體中的糖基化位點。
抗體的糖基化通常為N-連接或O-連接。N-連接指將碳水化合物部分與天冬酰胺殘基的側鏈相連。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是使碳水化合物部分與天冬酰胺側鏈酶促相連的識別序列。因此，多肽中存在上述任一種三肽序列都可產生潛在的糖基化位點。O-連接糖基化指將N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖附著于羥基氨基酸，主要是絲氨酸、蘇氨酸，但也可用5-羥脯氨酸和5-羥賴氨酸。
在抗體中添加糖基化位點可通過改變氨基酸序列，使其包含一或多個上述三肽序列而實現(xiàn)(在添加N-連接糖基化位點的情況下)。這種改變也可通過在原始抗體的序列中添加或取代一或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基來實現(xiàn)(在添加O-連接的情況下)。
編碼抗ErbB2抗體的氨基酸序列變體的核酸分子由本領域已知的各種方法制備。這些方法包括但不限于從天然來源分離(在天然氨基酸序列變體的情況下)，或通過對抗ErbB2抗體之早期制備的變體或非變體形式進行寡核苷酸介導的(或定點)誘變，PCR誘變和盒式誘變來制備。
也可預期修飾該抗體的效應物功能，例如使該抗體的抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(ADCC)和/或補體依賴的細胞毒作用(CDC)增強。這可以通過在抗體FC區(qū)引入一或多個氨基酸取代而獲得。此外，可在FC區(qū)引入半胱氨酸殘基，使得在此區(qū)形成鏈間二硫鍵。由此產生的同型二聚體抗體可提高內在化能力和/或增強補體介導的細胞殺傷作用和ADCC。見Caron等，實驗醫(yī)學雜志1761191-1195(1992)和Shopes，B.免疫學雜志1482918-2922(1992)。具有增強的抗腫瘤活性的同型二聚體抗體也可用Wolffe等，癌癥研究532560-2565(1993)所述異源雙功能交聯(lián)劑制備?；蛘?，可通過工程改造產生具有雙FC區(qū)并因此具有增強的補體裂解效應及ADCC能力的抗體。見Stevenson等，抗癌藥物的設計(Anti-Cancer drug design)3219-230(1989)。
為了延長該抗體的血清半衰期，可在該抗體(尤其抗體片段)中摻入一個補救受體結合表位，如美國專利5,739,277所述。本文中術語“補救受體結合表位”是指IgG分子(例如IgG1，IgG2、IgG3、或IgG4)Fc區(qū)中負責延長該IgG分子的體內血清半衰期的表位。
(viii)篩選具有所需特性的抗體制備抗體的技術如上述?？筛鶕枰M一步篩選具有特定生物學特性的抗體。
為了確定阻斷ErbB受體的配體活化作用的抗體，可測定該抗體阻斷ErbB配體與表達ErbB受體(例如與另一ErbB受體結合，該受體與目的ErbB受體形成ErbB異寡聚體)的細胞結合的能力。可將天然表達或通過轉染而表達ErbB異寡聚體中ErbB受體的細胞與所述抗體進行溫育，然后將其暴露于標記的ErbB配體。之后可估測抗ErbB2抗體阻斷ErbB異寡聚體中ErbB受體的配體結合的能力。
例如，抗ErbB2抗體抑制HRG與MCF7乳腺癌細胞系的結合的作用可基本上按實施例1所述方法，利用冰浴24孔培養(yǎng)板中的單層MCF7培養(yǎng)物來進行。向每孔中加入抗ErbB2單克隆抗體，并溫育30分鐘。然后加入125I標記的rHRGβ1177-224(25pm)，并繼續(xù)溫育4-16小時?？衫L制劑量應答曲線并計算目的抗體的IC50值。在一個實施方案中，阻斷ErbB受體的配體活化作用的抗體在此檢測中抑制HRG與MCF細胞的結合的IC50值約為50nM或更低，優(yōu)選10nM或更低。當所述抗體為抗體片段如Fab段時，該檢測中抑制HRG與MCF7細胞的結合的IC50值可為例如約100nM或更低，更優(yōu)選50nM或更低。
或者(或另外)，可檢測抗ErbB2抗體阻斷ErbB異寡聚體中ErbB受體的ErbB配體活化型酪氨酸磷酸化作用的能力。例如，可將內源性表達ErbB受體或通過轉染表達它們的細胞與所述抗體溫育，然后利用抗磷酸酪氨酸單克隆抗體(其任選與可檢測的標記物偶聯(lián))，檢測ErbB配體依賴性酪氨酸磷酸化活性。美國專利5766863中所述的激酶受體活化試驗也可用于測定ErbB受體活化作用，并可用抗體阻斷該活化作用。
在一個實施方案中，可基本如實施例1所述篩選能抑制MCF7細胞中p180酪氨酸磷酸化之HRG刺激作用的抗體。例如，將MCF7細胞鋪于24孔培養(yǎng)板中，每孔加入ErbB2的單克隆抗體，室溫溫育30分鐘；然后每孔加入rHRGβ1177-224致終濃度0.2nM，繼續(xù)溫育8分鐘。從各個孔中吸出培養(yǎng)基，加入100μl SDS樣品緩沖液(5％SDS，25mM DTT和25Mm Tris-HCl，pH6.8)終止反應。將每份樣品(25μl)在4-12％梯度凝膠(Novex)上進行電泳，然后電轉到聚偏二氟乙烯膜上。使抗磷酸酪氨酸免疫印跡膜顯色，通過反射比密度測定法(reflectance densitometry)定量處于Mr-180000位置的主要反應帶的密度。所選抗體優(yōu)選能將p180酪氨酸磷酸化的HRG刺激作用在此試驗中顯著抑制為對照的約0-35％?？筛鶕瓷涿芏葴y定法確定的對p180酪氨酸磷酸化之HRG刺激的抑制作用繪制劑量應答曲線，并計算目的抗體的IC50值。在一個實施方案中，阻斷ErbB受體的配體活化作用的抗體在此檢測中抑制p180酪氨酸磷酸化之HRG刺激的IC50值約為50nM或更低，優(yōu)選10nM或更低。在所述抗體為抗體片段如Fab段時，在此檢測中抑制p180酪氨酸磷酸化之HRG刺激的IC50值可為例如約100nM或更低，更優(yōu)選50nM或更低。
也可估測所述抗體對MDA-MB-175細胞的生長抑制作用，例如基本上按Schaefer等，癌基因151385-1394(1997)中所述。根據該項試驗，MDA-MB-175細胞可用抗ErbB2單克隆抗體(10μl/ml)處理4天，再用結晶紫染色。與抗ErbB2抗體一起溫育對此細胞系顯示出類似于單克隆抗體2C4的生長抑制作用。在另一個實施方案中，外源性HRG不能顯著逆轉此抑制作用。優(yōu)選所述抗體在外源性HRG存在和不存在的條件下，均能以高于單克隆抗體4D5(并任選高于單克隆抗體7F3)的水平抑制MDA-MB-175細胞的增殖。
在一個實施方案中，抗ErbB2目的抗體在MCF7和SK-BR-3細胞中均可阻斷ErbB2與ErbB3的heregulin依賴性結合，如實施例2中所述免疫共沉淀實驗所測，其效力遠高于單克隆抗體4D5，優(yōu)選遠高于單克隆抗體7F3。
為了鑒定生長抑制性抗ErbB2抗體，可篩選能抑制過度表達ErbB2的癌細胞生長的抗體。在一個實施方案中，所選生長抑制性抗體在約0.5-30μg/ml的抗體濃度下能使細胞培養(yǎng)中SK-BR-3細胞的生長被抑制約20-100％，優(yōu)選被抑制50-100％。為了鑒定這樣的抗體，可實施美國專利5677171中所述的SK-BR-3試驗。根據該項試驗，將SK-BR-3細胞培養(yǎng)在F12與DMEM(添加了10％胎牛血清、谷氨酰胺和青霉素、鏈霉素)以1∶1混合的培養(yǎng)基中。將20000個SK-BR-3細胞置于35mm培養(yǎng)皿中(2mls/35mm培養(yǎng)皿)。每皿加入0.5-30μg/ml抗ErbB2抗體。6天之后，利用電子COULTERTM細胞計數儀計數細胞數目，并與未經處理的細胞進行比較。那些能將SK-BR-3細胞的生長抑制約20-100％或50-100％的抗體被選為生長抑制性抗體。
為了篩選誘導細胞死亡的抗體，可評價相對于對照的膜完整性喪失，其可由例如PI、臺盼藍或7AAD攝入來指示。優(yōu)選的試驗是利用BT474細胞進行的PI攝入試驗。根據該試驗，將BT474細胞(可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，MD)獲得)培養(yǎng)在含10％熱滅活的FBS(Hyclone)和2mML-谷氨酰胺的Dulbeco’s改良型Eagle培養(yǎng)基(D-MEM)Ham’sF-12(50∶50)中。(因此，該檢測是在無補體和免疫效應細胞的條件下進行)。將BT474細胞以3×106/皿的濃度接種至100×20mm的培養(yǎng)皿中，并使其粘附過夜。然后棄去培養(yǎng)基，僅用新鮮培養(yǎng)基或用含10μg/ml適當單克隆抗體的培養(yǎng)基取代。細胞以3天為一周期進行培養(yǎng)。每次處理后，單層細胞用PBS洗滌，并用胰酶消化使其脫附。然后將細胞在4℃以1200rpm離心5分鐘，將沉淀重懸于3ml冰冷的Ca2+結合緩沖液(10mM Hepes，pH7.4，140mMNaCl，2.5mM CaCl2)中，再分裝到35mm濾器封蓋的12×75試管中(每管1ml，每處理組3管)以去除細胞團塊。然后向試管中加入PI(10μg/ml)。樣品利用FACSCANTM流式細胞儀和FACSCONVERTTMCellQuest軟件(BectonDickinson)分析?？蓪⒛切┱T導統(tǒng)計顯著水平的細胞死亡(如PI攝入法所測)的抗體選為誘導細胞死亡的抗體。
為了篩選凋亡誘導抗體，可利用BT474細胞進行annexin結合試驗。將BT474細胞按上段所述接種并培養(yǎng)。然后棄去培養(yǎng)基，僅用新鮮培養(yǎng)基或用含10μg/ml單克隆抗體的培養(yǎng)基取代。細胞以3天為一周期進行培養(yǎng)后，將單層用PBS洗滌，并用胰酶消化使其脫附。然后如上文細胞死亡試驗所述將細胞離心，重懸于Ca2+結合緩沖液中，并分裝到試管中。向試管中加入標記的annexin(例如annexin V-FTIC)(1μg/ml)。利用FACSCANTM流式細胞儀和FACSCONVERTTMCellQuest軟件(Becton Dickinson)分析樣品。在用PI攝入法檢測時，可將那些誘導統(tǒng)計顯著水平的annexin結合(如PI攝入法所測)的抗體選為凋亡誘導抗體。
除了annexin結合試驗，可利用BT474細胞進行DNA染色試驗。為此，將已如前兩段所述用目的抗體處理過的BT474細胞與9μg/ml HOECHST33342TM于37℃溫育2小時，然后在EPICS ELITETM流式細胞儀(CoulterCorporation)上用MODFITLTTM軟件(Verity Software House)進行分析。引起凋亡細胞百分率改變(比未處理細胞高兩倍或更多(優(yōu)選高3倍或更多)(直到100％的凋亡細胞))的抗體可用此試驗篩選為前凋亡抗體。
為了篩選能與結合目的抗體之ErbB2上某一表位結合的抗體，可如《抗體，實驗室指南》，冷泉港實驗室，Ed Harlow和David Lane(1998)所述進行常規(guī)交叉阻斷試驗?；蛘?或另外)，可通過本領域已知技術進行表位作圖(見，例如本文中圖1A和1B)。
(ix)免疫偶聯(lián)物本發(fā)明還涉及免疫偶聯(lián)物，其中含有與細胞毒藥物偶聯(lián)的抗體，所述細胞毒藥物如化療藥物、毒素(例如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素，包括其片段和/或變體)或放射性同位素等。
可有效用于制備這類免疫偶聯(lián)物的化療藥物如上述。本文還涉及抗體與一或多種小分子毒素，如加利車霉素，美登素(美國專利5,208,020)，單端孢霉烯(trichothene)，CC1065的偶聯(lián)物。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，使抗體與一或多個美登素分子偶聯(lián)(如每個抗體分子與約1-10個美登素分子偶聯(lián))。美登素可轉化成May-SS-Me，然后還原成May-SH3，并與修飾過的抗體反應(Chari等，癌癥研究52127-131(1992))產生美登木素生物堿-抗體偶聯(lián)物。
另外，抗體可以與一或多個加利車霉素分子結合。加利車霉素家族的抗生素能在亞pM濃度水平產生雙鏈DNA斷裂?？墒褂玫募永嚸顾亟Y構類似物包括，但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙?；?γ1I、PSAG以及θ1I(Hinmam等，癌癥研究533336-3342(1993)和Lode等，癌癥研究582925-2928(1998))。
可以應用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單孢菌)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-帚曲毒素、油桐(Aleutites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸(Phytolaca Americana)蛋白(PAPI，PAPII，PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制因子、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑，白樹毒素，米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依諾霉素和單端孢菌毒素(tricothecenes)。例見1993年10月28日公開的WO93/21232。
本發(fā)明還涉及一種免疫偶聯(lián)物，其由抗體與具有核裂解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA內切核酸酶如脫氧核糖核酸酶；DNase)偶聯(lián)。
多種放射性同位素可用于制備放射性偶聯(lián)的抗體，實例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32以及Lu的放射性同位素。
抗體與細胞毒制劑的偶聯(lián)物可通過多種雙功能蛋白偶聯(lián)劑來連接，所述雙功能蛋白偶聯(lián)劑如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二巰基)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亞氨基-4-(N-馬來酰亞氨甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯，iminothiolane(IT)，亞氨酸酯的雙功能衍生物(如亞氨基己二酸二甲酯鹽酸鹽)，活性酯類(如二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)，醛類(如戊二醛(glutareldehyde))，雙-疊氮化合物(如雙(對-疊氮基苯甲?；?己二胺)，雙-重氮衍生物(如雙-(對-重氮苯甲?；?-乙二胺)，二異氰酸酯(如亞甲代苯基2，6-二異氰酸酯)，和雙-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等，科學2381098(1987)所述制備。C14標記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三氨五乙酸酯(MX-DTPA)是將放射性核苷酸偶聯(lián)至抗體的偶聯(lián)劑之一。見WO94/11026。這種接頭可能是有利于細胞毒藥物在細胞內釋放的“可斷開的接頭”。例如，可使用酸不穩(wěn)定型接頭，肽酶敏感型接頭，二甲基接頭或含二硫鍵的接頭(Chari等，癌癥研究52127-131(1992))。
或者，可通過重組技術或肽合成來獲得抗體與細胞毒制劑的融合蛋白。
在另一實施方案中，抗體可與腫瘤預靶向中應用的“受體”(如鏈霉抗生物素蛋白)偶聯(lián)，將該抗體-受體偶聯(lián)物給予患者，之后用清除劑除去循環(huán)中未結合的偶聯(lián)物，再給予已偶聯(lián)了細胞毒制劑(如放射性核苷酸)的“配體”(如抗生物素蛋白)。
(x)抗體依賴性酶介導的前體藥物治療(ADEPT)本發(fā)明的抗體還可與前體藥物活化酶相結合，然后用于ADEPT，所述活化酶可以將前體藥物(如肽基化療劑，見WO81/01145)轉化為活性抗癌藥物。見WO88/07378和美國專利4,975,278。
這些用于ADEPT的偶聯(lián)物中的酶組分包括能作用于前體藥物使其轉化為活性更強的細胞毒形式的任何酶。
本發(fā)明的方法中用到的酶包括，但不限于，能將含磷酸基的前體藥物轉化為游離藥物的堿性磷酸酶；可將含硫酸基的前體藥物轉化為游離藥物的芳香基硫酸酯酶；將無毒的5-氟胞嘧啶轉化為抗癌藥物，如5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨酶；能將含肽的前體藥物轉化為游離藥物的蛋白酶，如沙雷氏菌屬蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶和組織蛋白酶(如組織蛋白酶B和L)等；可轉化含D-氨基酸取代基的前體藥物的D-丙氨酰羧肽酶；能將糖基化前體藥物轉化為游離藥物的碳水化合物裂解酶類如β-半乳糖苷酶和神經氨酸酶；能將β-內酰胺衍生的藥物轉化為游離藥物的β-內酰胺酶；能在藥物中的氨基氮處分別用苯氧乙?；虮揭阴；D化而使藥物游離的青霉素酰胺酶如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，可用本領域稱為“抗體酶”的具有酶活性的抗體，將本發(fā)明的前體藥物轉化為游離的活性藥物(見Massey，自然328457-458(1987))?？扇绫疚乃鲋苽淇贵w-抗體酶偶聯(lián)物以便將抗體酶運送至腫瘤細胞群。
本發(fā)明的酶可通過本領域已知的技術，如上述異源雙功能交聯(lián)試劑的使用而與抗體共價結合。或者，可以通過本領域已知的DNA重組技術(如Neuberger等，自然，312604-608(1984))構建含至少本發(fā)明抗體的抗原結合區(qū)的融合蛋白，所述抗體與本發(fā)明酶的至少一個功能活性部分連接。
(xi)其它抗體修飾本文還涉及對抗體的其它修飾。例如，可以使抗體與一種非蛋白多聚物，如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯(polyoxyalkylene)、或聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物交聯(lián)。還可將抗體包被于微囊(可通過凝聚技術或界面聚合作用制備，如分別制成羥甲基纖維素或明膠微囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯(methylmethacylate)))、膠體藥物傳遞系統(tǒng)(如脂質體、白蛋白小球體、微乳膠、納米顆粒和納米膠囊)或巨乳膠(macroemulsions)。這些技術見Remingtons’s Pharmaceutical Sciences，16版，Oslo，A.，Ed.(1980)。
本文公開的抗-ErbB2抗體還可配成免疫脂質體。含抗體的脂質體可通過本領域已知方法制備，如Epstein等，美國國家科學院學報823688(1985)；Hwang等，美國國家科學院學報774030(1980)；美國專利4,485,045和4,544,545及1997年10月23日公開的WO97/38731。在美國專利5,013,566中公開了循環(huán)時間已增加了的脂質體。
特別有效的脂質體可利用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質組合物經反相蒸發(fā)法產生。脂質體通過一定孔徑大小的濾膜擠壓可獲得具有所需直徑的脂質體。本發(fā)明抗體的Fab’片段可如Martin等，生物學化學雜志，257286-288(1982)所述，經二硫化物交換反應與脂質體偶聯(lián)。可任選在所述脂質體中包含一種化療藥物。見Gabizon等，J.National Cancer Inst，81(19)1484(1989)。
III.載體、宿主細胞和重組方法本發(fā)明還提供了分離的編碼人源化抗ErbB2抗體的核酸、含所述核酸的載體和宿主細胞、制備所述抗體的重組技術。
為了對抗體進行重組制備，分離其編碼核酸并插入到可復制載體中，來進一步克隆(DNA擴增)或表達。利用傳統(tǒng)方法(例如利用能與編碼單克隆抗體重鏈或輕鏈的基因特異性結合的探針)，可容易的分離并測序編碼所述抗體的DNA。許多載體可應用。載體組分通常包括但不限于一個或多個下述組分信號序列，復制起始點，一個或多個標記基因，增強子元件，啟動子和轉錄終止序列。
(i)信號序列組分本發(fā)明的抗ErbB2抗體不僅可直接重組制備，而且還可制備成與異源多肽的融合多肽，優(yōu)選所述異源多肽為信號序列或在成熟蛋白或多肽的N末端上具有特異性裂解位點的其它多肽。優(yōu)選的異源信號序列是被宿主細胞識別并加工(即通過信號肽酶裂解)的信號序列。對于不能識別并加工天然抗ErbB2抗體信號序列的原核宿主細胞，用選自例如堿性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或熱穩(wěn)定腸毒素II前導區(qū)的原核信號序列取代所述天然信號序列。對于酵母分泌，可用例如酵母轉化酶前導區(qū)、α因子前導區(qū)(包括糖酵母屬和克魯維酵母屬的α因子前導區(qū))、酸性磷酸酶前導區(qū)、白色念珠菌葡萄糖淀粉酶前導區(qū)或WO90/13646中所述信號序列等取代上述天然信號序列。在哺乳動物細胞表達時，可使用哺乳動物信號序列以及如單純皰疹gD信號序列等病毒分泌前導區(qū)。
將這些前導區(qū)DNA在閱讀框架內與編碼抗ErbB2抗體的DNA連接。
(ii)復制起始點組分表達載體和克隆載體中均含有能使載體在一或多種所選宿主細胞中進行復制的核酸序列。通常，在克隆載體中，此序列是能使載體獨立于宿主染色體DNA而進行復制的序列，它包括復制起始點或自主復制序列。在多種細菌、酵母和病毒中，這樣的序列眾所周知。來自質粒pBR322的復制起始點適合于大多數革蘭氏陰性細菌，2μ質粒起始點適合于酵母，而各種病毒(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)復制起始點可用于哺乳動物細胞中的克隆載體。通常，哺乳動物表達載體不需要復制組分的復制起始點(只有SV40起始點常用，因為它含有早期啟動子)。
(iii)篩選基因組分表達載體和克隆載體可包含篩選基因(也稱為可篩選標記)。典型的篩選基因編碼蛋白，該蛋白(a)提供對抗生素或其它毒素，如氨芐青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四環(huán)素等的抗性，(b)彌補營養(yǎng)缺陷，或(c)提供從復合培養(yǎng)基中不能得到的關鍵營養(yǎng)物質，例如編碼芽孢桿菌屬D-丙氨酸消旋酶的基因。
篩選方案的一個實例是利用藥物阻滯宿主細胞的生長。那些被異源基因成功轉化的細胞產生能賦予藥物抗性的蛋白，從而在篩選過程中存活。這樣的顯性篩選實例使用新霉素、霉酚酸和潮霉素。
另一種適于哺乳動物細胞的可篩選標記實例是那些能對可吸收抗ErbB2抗體核酸的感受態(tài)細胞進行鑒定的標記，例如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白I和II(優(yōu)選靈長類金屬硫蛋白基因)、腺苷脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶等等。
例如，首先通過在含氨甲喋呤(Mtx)(DHFR的競爭性拮抗劑)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所有轉化體，鑒定被DHFR篩選基因轉染的細胞。當使用野生型DHFR時，適當的宿主細胞是DHFR活性缺陷的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系。
或者，通過在含針對可篩選標記的氨基糖苷抗生素(例如卡那霉素、新霉素或G418)等篩選藥物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，可篩選用編碼抗ErbB2抗體、野生型DHFR蛋白和另一個可篩選標記(如氨基糖苷3’-磷酸轉移酶(APH))的DNA序列轉化或共轉化的宿主細胞。見美國專利4965199。
適用于酵母的適當篩選基因是存在于酵母質粒YRp7中的trpl基因(Stinchcomb等，自然，28239(1979))。trpl基因為不能在色氨酸中生長的酵母突變株(例如ATCC 44076或PEP4-1)提供了篩選標記。Jones，Genetics，8512(1977)。酵母宿主細胞基因組中trp損傷的存在，為通過在無色氨酸的條件下的培養(yǎng)對轉化進行檢測提供了有效的環(huán)境。同樣，Leu2缺陷的酵母株(ATCC 20622或38626)被含有Leu2基因的已知質粒彌補。
另外，可將源自1.6μm環(huán)狀質粒pKD1的載體用于轉化克魯維酵母屬的酵母。另有關于用乳酸克魯維酵母大規(guī)模制備重組牛凝乳酶的表達系統(tǒng)的報道。Van den Berg.Bio/Technology，8135(1990)。用于通過克魯維酵母工業(yè)菌株分泌成熟的重組人血清白蛋白的穩(wěn)定型多拷貝表達載體也被發(fā)現(xiàn)。Fleer等，Bio/Technology 9968-975(1991)。
(iv)啟動子組分表達載體和克隆載體通常含有可被宿主生物識別并與抗ErbB2抗體核酸可操作相連的啟動子。適合于在原核宿主中應用的啟動子包括phoA啟動子，β-內酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)，堿性磷酸酶，色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)和雜合啟動子如tac啟動子。然而，其它已知的細菌啟動子也是適合的。用于細菌系統(tǒng)的啟動子還含有Shine-Dalgamo(S.D.)序列，它與編碼抗ErbB2抗體的DNA可操作連接。
用于真核生物的啟動子序列是已知的。幾乎所有的真核基因在轉錄起始位點上游約25-30個堿基處具有一個富含AT的區(qū)域。在許多基因的轉錄起始點上游70-80個堿基處發(fā)現(xiàn)的另一個序列是CNCAAT區(qū)，其中N可以是任何核苷酸。在大多數真核基因的3’末端是AATAAA序列，它是用于在編碼序列3’末端添加poly A尾的信號。所有這些序列均被適當地插入到真核表達載體。
適于在酵母宿主中應用的啟動序列實例包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動子，例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構酶、磷酸葡糖異構酶和葡糖激酶。
其它的酵母啟動子，即那些能通過生長條件控制轉錄的誘導型啟動子，是下述基因的啟動子區(qū)，即乙醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶。在EP73657中進一步敘述了用于酵母表達系統(tǒng)的適當載體和啟動子。酵母增強子與酵母啟動子一起使用更有利。
在哺乳動物宿主細胞中，由載體轉錄抗ErbB2抗體可受下述啟動子調控，所述啟動子來自病毒基因組(如多瘤病毒、雞痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、乙型肝炎病毒，最優(yōu)選猴病毒40(SV40))啟動子，或來自肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子等異源哺乳動物啟動子，或來自熱休克啟動子，只要這些啟動子與宿主細胞系統(tǒng)相容。
SV40病毒的早期和晚期啟動子可方便地以SV40限制性片段的形式獲得，它還包括SV40病毒的復制起始點。人巨細胞病毒的即早期啟動子方便地以Hind IIIE限制性片段的形式獲得。在美國專利4419446中公開了在哺乳動物宿主中用牛乳頭瘤病毒作為載體的表達系統(tǒng)。在美國專利4601978中敘述了對這個系統(tǒng)改進。另見Reyes等，自然297598-601(1982)中關于在單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子控制下在小鼠細胞中表達人β干擾素cDNA。或者，勞氏肉瘤病毒長末端重復序列可作為啟動子使用。
(v)增強子元件組分在載體中插入增強子序列通?？稍黾泳幋a本發(fā)明抗ErbB2抗體的DNA在高等真核生物中的轉錄。已經知道很多哺乳動物基因(珠蛋白，彈性蛋白酶、白蛋白、α胎蛋白和胰島素)的增強子序列。然而人們通常使用真核細胞病毒的增強子。實例包括在其復制起始點晚期側的SV40增強子(bp100-270)，巨細胞病毒早期啟動子增強子，在其復制起始點晚期側的多瘤增強子，和腺病毒增強子。另見Yaniv，自然29717-18(1982)中所述的用于活化真核啟動子的增強元件。所述增強子可以剪接入抗ErbB2抗體編碼序列的5’或3’端，但優(yōu)選位于啟動子的5’端。
(vi)轉錄終止組分用于真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或來自其它多細胞生物的有核細胞)的表達載體，還包括對轉錄終止和穩(wěn)定mRNA結構所必須的序列。這些序列通常來自真核或病毒DNA或cDNA的5’(偶爾為3’)非翻譯區(qū)。這些區(qū)域包含核苷酸片段，其轉錄為編碼抗ErbB2抗體的mRNA的非翻譯區(qū)中的聚腺苷酸化片段。一種有效的轉錄終止組分是牛生長激素聚腺苷酸區(qū)。見WO94/11026及其所公開的表達載體。
(vii)宿主細胞的篩選和轉化用于克隆或表達本發(fā)明載體中DNA的合適的宿主細胞是上述原核細胞、酵母或高等真核細胞。用于此目的的適合的原核細胞包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌等真細菌，如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的埃希菌屬(例如大腸桿菌)、腸桿菌屬、歐文菌屬、克雷白菌屬、變形菌桿屬、沙門菌屬(例如鼠傷寒沙門菌)、沙雷菌屬(粘質沙雷菌)和志賀菌屬等，以及芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌(例如1989年4月12日出版的DD266710中所述地衣芽孢桿菌41P)等，假單胞菌屬的銅綠菌假單胞菌，及鏈霉菌。優(yōu)選大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(ATCC31446)，份聲明大腸桿菌B、大腸桿菌X177(ATCC31537)和大腸桿菌W3110(ATCC27325)等其它菌株也適合。這些實例是用于說明而不是限制于此。
除了原核生物，絲狀真菌或酵母等真核微生物也是適于使編碼抗ErbB2抗體的載體克隆或表達的宿主。釀酒酵母，或常用的面包酵母，在低等真核宿主微生物中最為常用。然而，多種其它屬、種和株也是可公開得到的并可用于本發(fā)明，例如粟酒裂殖酵母；克魯維酵母屬，例如乳酸克魯維酵母(K.lactis)、脆壁克魯維酵母(K.fragilis)(ATCC 12424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)(ATCC16045)、成克曼氏克魯維酵母(K.wickeramll)(ATCC24178)、K.waltii(ATCC 56500)、果蠅克魯維酵母(K.drosophilarum)(ATCC36906)、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)和馬克斯克魯維酵母(K.marxianus)等；yarrowia(EP402226)；巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183070)；念珠菌屬；Trichoderma reesia(EP244234)；粗糙鏈孢霉；許旺氏酵母屬(schwanniomyces)如西方許旺氏酵母(schwanniomyces occidentalis)等；和絲狀真菌，例如鏈孢霉屬、青霉屬、Tolypocladium以及曲霉屬如構巢曲霉和黑曲霉等。
用于表達糖基化抗體的適合宿主細胞來自多細胞生物。無脊椎動物細胞的實例包括植物和昆蟲細胞。已經從下述宿主中鑒定了大量的桿狀病毒株和變體以及相應的容許型昆蟲宿主細胞，所述宿主包括草地夜蛾(毛蟲)、埃及伊蚊(蚊子)、白紋伊蚊(蚊子)、Drosophila melanogaster(果蠅)和家蠶蛾等。用于轉染的各種病毒株可以公開地獲得，例如加利福尼亞Y級夜蛾(autographa california)NPV的L-1變體和家蠶蛾NPV的Bm-5株，并且這些病毒可以在此用作為根據本發(fā)明的病毒，尤其是用于草地夜蛾細胞的轉化。
棉花、玉米、土豆、大豆、牽牛花、西紅柿和煙草的植物細胞培養(yǎng)物也可以用作宿主。
然而，關注最多的是脊椎動物細胞，而且在培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中繁殖脊椎動物細胞已經成為常規(guī)方法。有效哺乳動物宿主細胞的實例是用SV40轉化的猴腎CV1細胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚腎細胞系(293細胞或亞克隆培養(yǎng)成懸浮培養(yǎng)液的293細胞，Graham等，普通病毒新雜志(J.GenVirol.)3659(1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，美國國家科學院院刊774216(1980))；小鼠足細胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23243-251(1980))；猴腎細胞(CV1 ATCCCCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK ATCC CCL 34)；布法羅(buffalo)大鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI細胞(Mather等，紐約科學院年鑒(Annals N.Y.Acad.Sci.)38344-68(1982))；MRC5細胞；FS4細胞；和人肝細胞癌細胞系(Hep G2)。
宿主細胞用上述用于抗ErbB2抗體制備的表達或克隆載體轉化，并在改進型傳統(tǒng)營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基經改進已適于誘導啟動子、篩選轉化體或擴增編碼所需序列的基因。
(viii)培養(yǎng)宿主細胞用于制備本發(fā)明的抗ErbB2抗體的宿主細胞可在各種培養(yǎng)基中培養(yǎng)。市售培養(yǎng)基如Ham’s F10(Sigma)、最小基本培養(yǎng)基((MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco氏改良型Eagle氏培養(yǎng)基((DMEM)，Sigma)均適合于培養(yǎng)所述宿主細胞。另外，在Ham等，酶學方法5844(1979)；Barnes等，生物化學年鑒102255(1980)；美國專利4767704、4657866、4927762、4560655或5122469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國專利Re.30985中所述任何培養(yǎng)基可作為所述宿主細胞的培養(yǎng)基。任何所述培養(yǎng)基可在需要時補充激素和/或其它生長因子(例如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(如氯化鈉，鈣，鎂，和磷酸)、緩沖液(例如HEPES)，核苷酸(例如腺苷和胸苷嘧啶)、抗生素(例如遺傳霉素(GENTAMYCINTM))、痕量元素(定義為通常以微摩爾級終濃度出現(xiàn)的無機化合物)、葡萄糖或一種等價能源。還包括任何其它必須補充物，其相應濃度為本領域已知。培養(yǎng)條件如溫度、pH等是現(xiàn)有技術中應用于表達型宿主細胞的那些，本領域技術人員對此很熟悉。
(ix) 抗ErbB2抗體的純化當使用重組技術時，抗體可以在細胞內胞質空間中產生，或直接分泌到培養(yǎng)基中。如果所述抗體在細胞內產生，第一步通過離心或超濾除去顆粒狀碎片，即宿主細胞或其裂解片段。Carter等，生物/技術10163-167(1992)中敘述了用于分離分泌到大腸桿菌周質空間中的抗體的方法。簡言之，在醋酸鈉(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)存在的條件下融解細胞團超過30分鐘。通過離心可以將細胞碎片除去。在抗體分泌到培養(yǎng)基的情況中，通常首先用市售的蛋白濃縮濾膜(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單位)濃縮此類表達系統(tǒng)的上清。在任何上述步驟中可以包括抑制蛋白裂解的PMSF等蛋白酶抑制劑，并且可以包括抑制外來污染物生長的抗生素。
從所述細胞中制備的抗體組合物可利用例如羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析等方法純化，優(yōu)選親和層析。蛋白A作為親和配體的適合性取決于該抗體上任何免疫球蛋白Fc區(qū)的種類和同種型。蛋白A可用于純化基于人γ1、γ2或γ4重鏈的抗體(Lindmark等，免疫學方法雜志，621-13(1983))。蛋白G被建議用于所有的小鼠同種型和人γ3(Guss等，EMBO J.51567-1575(1986))。與親和配體結合的基質最常用瓊脂糖，但也可利用其它基質。具有機械穩(wěn)定性的基質如控制孔徑的玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯等，比瓊脂糖允許更快的流速且耗時更短。在所述抗體包括CH3結構域的情況中，Bakerbond ABXTM樹脂(J.T.Baker，PhilliPBSurg，NJ)有利于純化。根據待回收的抗體，還可以應用其它蛋白純化技術，例如在離子交換柱上的分級分離、乙醇沉淀、反向HPLC、硅層析、在陽離子或陰離子交換樹脂層析(例如聚天冬氨酸柱)上進行的肝素SEPHAROSETM層析、聚焦層析、SDS-PAGE和硫酸銨沉淀。
在任何最初純化步驟之后，利用pH約2.5-4.5的洗脫緩沖液，可以對包括所述目的抗體和污染物的混合物進行低pH疏水相互作用層析，優(yōu)選在低鹽濃度條件下進行(例如大約0-0.25M鹽濃度)。
IV.藥物制劑形式根據本發(fā)明使用的抗體的藥用制劑通過將具有所需純度的抗體與任選的藥用載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(雷氏藥學(Remington’s PharmaceuticalSciences)第16版，Osol，A.編(1980))混合而制備，然后以凍干劑或含水劑的形式保存?？伤幱幂d體、賦形劑、穩(wěn)定劑在所用劑量及濃度下對受者無毒性，并包括緩沖劑例如磷酸鹽，檸檬酸鹽及其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化己烷雙胺；氯化芐烷銨(benzalkonium chloride)，苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；烷基對羥基苯甲酸酯如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；間甲酚)；低分子量多肽(少于10個殘基)；蛋白質如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖類如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；金屬復合物(例如鋅-蛋白復合物)；和/或非離子表面活性劑如吐溫TM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。WO97/04801敘述了優(yōu)選的凍干型抗ErbB2抗體劑型，在此引入本文作為參考。
所述制劑還可根據所治療的具體情況而包含一種以上活性成分，優(yōu)選具有互補活性但相互無負面影響的那些。例如，可能需要在一種制劑中進一步提供與EGFR、ErbB2(例如結合ErbB2上不同表位的抗體)、ErbB3、ErbB4或血管內皮生長因子(VEGF)結合的抗體?；蛘?或另外)，所述組合物可進一步包括化療藥、細胞毒性藥、細胞因子、生長抑制劑、抗激素藥、EGFR-靶向藥、抗血管生成藥、和/或心臟保護劑。這些分子以對所需目的有效的總量在組合中適當地存在。
活性成分也可容納在通過凝聚技術或界面聚合作用制備的微膠囊中，如分別在膠體性質的藥物運送系統(tǒng)(如脂質體，白蛋白小球體，微乳劑，納米顆粒及納米膠囊)或大乳劑(macroemulsions)的羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(異丁烯酸甲酯)微膠囊。這些技術見雷氏藥學，第16版Osol，A.編(1980)。
也可制備控釋制劑。控釋制劑的適當實例包括含有抗體的固態(tài)疏水聚合物的半通透性基質，所述基質為具有一定形狀的制品，如膜或微膠囊?？蒯屩苿嵗ň埘ァ⑺z(如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)或聚(乙烯醇)，聚交酯(美國專利3,773,919)，L-谷氨酸與γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物，不可降解的乙烯乙酸乙酯，可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和亮氨酰脯氨酸(leuprolide)乙酸酯組成的可注射的微球體)，以及聚D-(-)-3-羥丁酸。
用于體內給藥的制劑必須是無菌的。這可以通過除菌濾膜過濾而輕易實現(xiàn)。
V.用抗ErbB2抗體進行的治療根據本發(fā)明，可將抗ErbB2抗體用于治療各種疾病。疾病實例包括良性或惡性腫瘤；白血病和淋巴的惡性疾??；其它疾病，如神經細胞、神經膠質細胞、星形膠質細胞、下丘腦、腺體、巨噬細胞、上皮、基質、囊胚腔、炎癥性、血管生成性和免疫性的疾病。
通常，所治疾病是癌癥。在此所治癌癥的實例包括但不限于癌(carcinoma)，淋巴瘤，母細胞瘤，肉瘤和白血病或淋巴的惡性病。這些癌的更具體實例包括鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)，肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌和肺鱗癌)，腹膜癌，肝細胞癌，胃癌(包括胃腸癌)，胰腺癌，成膠質細胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌(liver cancer)，膀胱癌，肝細胞瘤，乳腺癌，結腸癌，結直腸癌，直結腸癌，子宮內膜或子宮癌，唾液腺癌，腎癌，前列腺癌，外陰癌，甲狀腺癌，肝癌(hepatic carcinoma)，肛門癌，陰莖癌以及頭頸癌。
所述癌癥通常含有ErbB2表達細胞，從而使本文所述抗ErbB2抗體能與癌結合。雖然所述癌癥的特點是ErbB2受體過度表達，但本申請進一步提供了對不被認為是ErbB2過度表達的癌的治療方法。為了測定癌中的ErbB2表達，可應用各種診斷性/預后性檢測。在一個實施方案中，ErbB2過度表達可通過IHC(例如利用HERCEPTEST(Dako))進行檢測?？蓪δ[瘤活檢的石蠟包埋組織切片進行IHC檢測，ErbB蛋白染色強度的標準如下分值0沒有觀察到染色，或在少于10％的腫瘤細胞中觀察到膜染色。
分值1+在多于10％的腫瘤細胞中檢測到微弱/勉強看得見的膜染色。所述細胞僅有膜的一部分被染色。
分值2+在多于10％的腫瘤細胞中觀察到從弱到中等強度的完全膜染色。
分值3+在多于10％的腫瘤細胞中觀察到從中度到很強的完全膜染色。
可將ErbB2過度表達評估分值為0或1+的那些腫瘤鑒定為并未過度表達ErbB2，而將分值為2+或3+的那些腫瘤鑒定為過度表達ErbB2。
或者(或另外)，可在甲醛固定且石蠟包埋的腫瘤組織上進行例如INFORMTM(購自Ventana，Arizona)或PATHVISIONTM(Vysis，Illinois)等FISH檢測，確定腫瘤中ErbB2過度表達的程度(如果有)。
在一個實施方案中，所述癌癥是表達(并且可能過度表達)EGFR的癌?？杀磉_/過度表達EGFR的癌實例包括鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)，肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌和肺鱗癌)，腹膜癌，肝細胞癌，胃癌(包括胃腸癌)，胰腺癌，成膠質細胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌(livercancer)，膀胱癌，肝細胞瘤，乳腺癌，結腸癌，結直腸癌，直結腸癌，子宮內膜或子宮癌，唾液腺癌，腎癌，前列腺癌，外陰癌，甲狀腺癌，肝癌(hepaticcarcinoma)，肛門癌，陰莖癌以及頭頸癌。
在此所治療的癌可以是以ErbB受體(例如EGFR)的過度活化為特點的癌。此過度活化的原因可能是ErbB受體或ErbB配體的過度表達或產量增加。在本發(fā)明的一個實施方案中，進行診斷性或預后性檢測，以確定患者的癌是否是以ErbB受體過度活化為特點。例如，可檢測所述癌癥中ErbB基因的擴增和/或ErbB受體的過度表達?？蓽y定這種擴增/過度表達的各種試驗為本領域現(xiàn)有，包括IHC、FISH和上述脫落抗原試驗?；蛘?或另外)，可根據已知方法檢測腫瘤中的或與腫瘤相關的TGF-α等ErbB配體的水平。這些試驗可檢測待檢樣品中的蛋白或其編碼核酸。在一個實施方案中，利用免疫組化法(IHC)可檢測腫瘤中ErbB配體的水平；見例如Scher等，臨床癌癥研究1545-550(1995)?；蛘?或另外)，可通過例如FISH、southern印跡或PCR技術，等評估待檢樣品中編碼ErbB配體的核酸的水平。
而且，ErbB受體或ErbB配體的過度表達或擴增可利用體內診斷試驗評估，如給藥能與待檢分子結合并帶有可檢測標記(如放射性同位素)的分子，并從外部對患者進行掃描以定位該標記。
在所治療癌癥是激素非依賴性癌的情況中，可利用上述各種試驗評估腫瘤中激素(如雄激素)和/或其同源受體的表達?；蛘?或另外)，可以因為患者對抗激素治療不再產生應答而將其診斷為患有激素非依賴性癌。
在某些實施方案中，將包括與細胞毒藥物偶聯(lián)的抗ErbB2抗體的免疫偶聯(lián)物給藥至患者。優(yōu)選所述免疫偶聯(lián)物和/或與它結合的ErbB2蛋白被細胞攝入(internalize)，導致在殺傷與它結合的癌細胞時增加免疫偶聯(lián)物的治療效果。在優(yōu)選的實施方案中，細胞毒藥物在癌細胞中靶向或干擾核酸。此細胞毒藥物的實例包括美登素、加利車霉素、核糖核酸酶和DNA內切核酸酶。
抗ErbB2抗體或免疫偶聯(lián)物可用已知方法向人類患者給藥，如靜脈給藥(例如作為大丸劑給藥或通過持續(xù)輸注一段時間而給藥)等，通過肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節(jié)內、滑膜內、鞘內、口服、局部或吸入途徑給藥。優(yōu)選將抗體靜脈內或皮下給藥。
其它治療方案也可與抗ErbB2抗體的給藥聯(lián)合進行。這種聯(lián)合給藥包括用分別不同的制劑或單個藥物制劑共同給藥，以及以任何次序連續(xù)給藥，其中優(yōu)選有一段時間為兩種(或所有)活性藥物同時發(fā)揮其生物學活性。
在一個優(yōu)選的實施方案中，用兩種不同的抗ErbB2抗體對所述患者進行治療。例如，可用阻斷ErbB受體的配體活化作用的第一種抗ErbB2抗體或具有單克隆抗體2C4的生物學特點的抗體，以及能抑制生長的第二種抗ErbB2抗體(例如HERCEPTIN)或能誘導ErbB2過度表達細胞凋亡的抗ErbB2抗體(例如7C2、7F3或其人源化變體)，對患者進行治療。優(yōu)選這種聯(lián)合治療引起協(xié)同治療效果。例如，可用HERCEPTIN治療患者，之后，例如當該患者對HERCEPTIN治療沒有應答的情況下，用rhuMAb 2C4進行治療。在另一個實施方案中，患者首先用rhuMAb 2C4治療，之后接受HERCEPTIN治療。在另外的實施方案中，同時用rhuMAb 2C4和HERCEPTIN對患者進行治療。
可能還需要將抗ErbB2抗體(或多種抗ErbB2抗體)的給藥與針對另一種腫瘤相關抗原的抗體的給藥聯(lián)合。在這種情況中，所述另一種抗體可與例如EGFR、ErbB3、ErbB4或血管內皮生長因子(VEGF)等結合。
在一個實施方案中，本發(fā)明的治療涉及將抗ErbB2抗體(或多種抗ErbB2抗體)與一或多種化療藥或生長抑制藥聯(lián)合給藥，包括組合不同的化療藥共同給藥。優(yōu)選的化療藥包括紫杉烷(如紫杉醇(paclitaxel)和紫杉萜(docetaxel))和/或蒽環(huán)類抗生素。這些化療藥的制劑和給藥方案可根據廠商的說明進行，或根據熟練醫(yī)生的經驗確定。這類化療的制劑和給藥分案亦參見Chemotherapy Service Ed.，M.C.Perry，Williams和Wilkins，Baltimore，MD(1992)。
可將抗激素化合物(例如他莫昔芬等抗雌激素化合物；奧那司酮(onapristone)等抗黃體酮藥物(EP 6168 12)；或氟他胺等抗雄激素)以這些分子的已知劑量與所述抗體組合給藥。當所治療的癌是激素非依賴性癌時，所述患者可先接受抗激素治療，在所述癌癥變?yōu)榧に胤且蕾囆园┲?，可向該患者給藥抗ErbB2抗體(和任選的本文所述其它藥物)。
有時，向患者同時給藥心臟保護劑(以阻止或減少與該治療相關的心肌功能障礙)或一個或多種細胞因子，可能也是有益的。還可同時給藥靶向EGFR的藥物或抗血管生成劑。除了上述治療方案外，可對患者進行切除癌的手術和/或放療。
本文所述抗ErbB2抗體還可與如上文定義部分所述的那些EGFR靶向藥物聯(lián)合，產生互補而強效的協(xié)同治療效果。
如上述共給藥的任何藥物的適當劑量是目前應用的劑量，而且由于所述藥物和抗ErbB2抗體的聯(lián)合作用(協(xié)同作用)可降低使用劑量。
進行疾病的預防或治療時，抗體的適當劑量依賴于所治疾病的類型(如上所述)，疾病的嚴重程度和進程，抗體給藥的目的是預防還是治療，先前的治療，患者的臨床病史和對抗體的應答，以及主治醫(yī)生的判斷。抗體可一次或分多次向患者給藥。無論是例如一次或多次分別給藥，還是連續(xù)輸注給藥，向患者給藥的起始候選劑量是約1μg/kg-15mg/kg(例如0.1-20mg/kg)抗體，其取決于疾病的類型或嚴重程度。典型的每日給藥劑量范圍是從1μg/kg到100mg/kg或更多，取決于上述因素。重復給藥數天或更長時間時，視具體情況而將治療持續(xù)至出現(xiàn)對疾病癥狀的所需抑制為止?？贵w的優(yōu)選劑量范圍是約0.05mg-10mg/kg。因而，可以以約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何組合)向患者給藥一或多劑。所述劑量可間歇給與，如每周一次或每三周一次，(例如使患者接受約2-20劑(如6劑)抗ErbB2抗體)。可以以較大劑量起始給藥，然后以較小劑量給藥一或多劑。劑量方案的實例包括給藥劑量約4mg/kg的抗ErbE2抗體起始，之后給藥約2mg/kg的每周持續(xù)劑量。但其它劑量方案也有效。此治療的進展可通過傳統(tǒng)的技術和檢測容易地監(jiān)控。
除了向患者給藥抗體蛋白，本申請考慮了通過基因治療而給藥抗體。編碼抗體的核酸的這種給藥方式包含在術語“給藥治療有效量的抗體”中。見例如1996年3月14日公布的WO96/07321，其中涉及利用基因治療來產生細胞內抗體。
有兩種主要途徑使所述核酸(任選包括在載體中)進入患者的細胞中體內和回體(ex vivo)。在體內運輸中，直接向患者注射所述核酸，通常在需要所述抗體的部位注射。在回體治療中，取出患者的細胞，將核酸導入這些離體的細胞中，然后將改良的細胞直接回輸給患者或將其包被在多孔膜中移植至患者體內(見例如美國專利4892538和5283187)。有許多技術可用于將核酸引入活細胞中。根據所述核酸是在體外轉移入培養(yǎng)細胞中，還是在體內轉移入目的宿主細胞中，所應用的技術不同。適于在體外將核酸轉移入哺乳動物細胞中的技術包括脂質體的使用，電穿孔，顯微注射，細胞融合，DEAE-葡聚糖，磷酸鈣沉淀法等?；虻幕伢w傳遞常用的載體是逆轉錄病毒。
目前優(yōu)選的體內核酸轉移技術包括用病毒載體(例如腺病毒、單純皰疹病毒I型或腺伴隨病毒)和基于脂質的系統(tǒng)(用于脂質介導的基因轉移的有效脂質體是例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)進行轉染。在一些情況中，需要提供核酸來源，及靶向靶細胞的藥劑，例如對細胞表面膜蛋白或靶細胞具有特異性的抗體、靶細胞上受體的配體等等。在使用脂質體的情況中，與內吞作用相關型表面膜蛋白結合的蛋白可用于靶向和/或促進攝取，例如對特殊細胞類型具有向性的衣殼蛋白或其片段，在循環(huán)中內在化的蛋白的抗體，靶向細胞內部位并延長細胞內半衰期的蛋白。受體介導的胞飲作用的技術參見Wu等，生物學化學雜志2624429-4432(1987)；Wagner等，美國國家科學院院刊873410-3414(1990)。關于目前已知的基因標記和基因治療方案的綜述見Anderson等，科學256808-813(1992)。另見WO93/25673，在此引入本文作為參考。
VI.產品在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了含用于治療上述疾病的物質的產品。所述產品包括一個容器和位于該容器表面的或與該容器相關的標簽或包裝插頁。適當的容器有瓶子，小瓶，注射器等。容器可由各種材料如玻璃或塑料制成。該容器可內含一種能有效治療目標疾病或紊亂的組合物，并具有無菌存取口(例如該容器可以是靜脈注射袋或帶有能通過皮下注射針穿刺的塞子的小瓶)。組合物中至少一種活性藥劑是抗ErbB2抗體。所述標簽或包裝插頁說明，所述組合物可用于治療指定的疾病(例如癌)。在一個實施方案中，所述標簽和包裝插頁說明，內含與ErbB2結合的抗體的所述組合物可用于治療能表達選自表皮生長因子(EGFR)、ErbB3和ErbB4(優(yōu)選表達EGFR)的ErbB受體的癌癥。另外，標簽或包裝插頁可說明，所要治療的患者是患有以ErbB受體(選自EGFR、ErbB3或ErbB4)過度活化為特點的癌的患者。例如，所述癌癥可以是過度表達一種這類受體或過度表達ErbB配體(例如TGF-α)的癌。所述標簽和包裝插頁還可說明，所述組合物可用于治療不以ErbB受體過度表達為特征的癌癥。例如，當HERCEPTIN的包裝插頁說明該抗體可用于治療轉移性乳腺癌患者(其腫瘤過度表達ErbB2蛋白)時，本發(fā)明的包裝插頁可能說明，上述抗體或組合物可用于治療癌癥而不必考慮ErbB2抗體過度表達的程度。在其它實施方案中，所述包裝插頁可能說明，所述抗體或組合物可用于治療乳腺癌(例如轉移性乳腺癌)；激素非依賴性癌；前列腺癌(例如雄激素非依賴性前列腺癌)；肺癌(例如小細胞肺癌)；結腸、直腸或結直腸癌；或本文所述的任何疾病。而且，所述產品可包括(a)其中裝有組合物的第一個容器，所述組合物含有能結合ErbB2并抑制過度表達ErbB2的癌生長的第一抗體；和(b)其中裝有組合物的第二個容器，所述組合物含有能結合ErbB2并阻斷ErbB受體的配體活化作用的第二抗體。本發(fā)明的此實施方案中的產品可進一步包括包裝插頁，其說明第一和第二抗體組合物可用于治療癌癥。而且，該包裝插頁可指導所述組合物(包括結合ErbB2并阻斷ErbB受體的配體活化作用的抗體)的使用者將用抗體進行的治療與前面段落中所述的任何輔助治療(例如，化療藥，EGFR靶向藥，抗血管生成藥，抗激素化合物，心臟保護劑和/或細胞因子)進行組合?；蛘?或另外)，所述產品可進一步包括第二個(或第三個)容器，其中含可藥用的緩沖液，例如用于注射的抑細菌水(BWFI)，磷酸鹽緩沖液，Ringer’s溶液和葡萄糖溶液。還可包括具有商業(yè)需要以及符合用戶需要的其它材料，如其它緩沖液、稀釋劑，濾器，針頭和注射器。
VII.抗ErbB2抗體的非治療性應用本發(fā)明的抗體(例如人源化抗ErbB2抗體)具有進一步的非治療性應用。
例如，所述抗體可用作親和純化試劑。在這個過程中，可利用本領域已知技術將抗體固定在Sephadex樹脂或濾紙等固相上。使固相化抗體與要純化的含ErbB蛋白(或其片段)的樣品接觸，之后用適當溶劑洗滌支持相，使得基本除去樣品中除了與固相化抗體結合的ErbB2蛋白外的所有其它物質。最后，用另一種適當溶液(例如甘氨酸緩沖液，pH 5.0)洗滌支持相，使ErbB2蛋白從抗體中釋放。
抗ErbB2抗體可用于ErbB2蛋白的診斷檢測，例如檢測其在特異性細胞、組織或血清中的表達。
對于診斷性應用，通常用可檢測的組分標記抗體。多種標記物可用，它們總體上分為下述幾類(a)放射性同位素，例如35S、14C、125I、3H和131I。利用例如在免疫學最新方案(Current Protocols in Immunology)，卷1和2，Coligen等編，Wiley-interscience，紐約，New York Pubs.(1991)中所述方法，用放射性同位素對所述抗體進行標記，并且可以利用閃爍計數器檢測放射活性。
(b)可以應用熒光標記，例如稀土元素螯合物(銪螯合物)或熒光素及其衍生物，例如羅丹明及其衍生物、丹磺酰、麗絲胺、藻紅蛋白和得克薩斯紅?？梢岳美缭诿庖邔W最新方案，出處同上，中所述技術，將所述熒光標記物與所述抗體連接。利用熒光計定量熒光。
(c)可以應用各種酶-底物標記，在美國專利號4275149中提供了對其中一些的綜述。所述酶通常催化發(fā)色底物的化學變化，可以利用各種技術測定這些變化。例如，所述酶可以催化底物的顏色變化，其可以被分光光度計所檢測?；蛘撸雒缚梢愿淖兊孜锏臒晒饣蚧瘜W發(fā)光。用于定量熒光改變的技術見上面的敘述?；瘜W發(fā)光底物通過化學反應激發(fā)電子，然后發(fā)出可以被檢測(例如，用化學發(fā)光儀)或給熒光受體提供能量的光。酶標記的實例包括螢光素酶(例如螢火蟲螢光素酶或細菌螢光素酶，美國專利號4737456)、螢光素、2，3-二氫二氮雜萘二酮、蘋果酸酯脫氫酶、脲酶、辣根過氧化物酶(HRPO)等過氧化物酶、堿性磷酸酶、β半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環(huán)氧化酶(例如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化物酶、微過氧化物酶等。在O’Sullivan等，制備酶免疫分析所用酶-抗體偶聯(lián)物的方法，酶學方法，(J.Langone和H.Van Vunakis編)，Academic press，紐約，73147-166(1981)中敘述了將酶與抗體偶聯(lián)的技術。
酶-底物組合的實例包括(i)辣根過氧化物酶(HRPO)，氫過氧化物酶為底物，由氫過氧化物酶氧化染料前體(例如鄰苯二胺(OPD)或3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺氫氯化物(TMB))；(ii)堿性磷酸酶(AP)，以對硝基苯磷酸鹽為發(fā)色底物；和(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)，有發(fā)色底物(例如對硝基苯-β-D-半乳糖苷酶)或發(fā)熒光底物4-甲基傘形基(umbelliferyl)-β-D-半乳糖苷酶。
本領域技術人員可以應用其它多種酶-底物組合。其綜述見美國專利號4275149和4318980。
有時，標記物與抗體間接連接。技術人員知道用于此的各種技術。例如，可使多肽與生物素偶聯(lián)，并使上述三類標記物之任一與抗生物素蛋白結合，反之亦然。生物素與抗生物素蛋白選擇性結合，使標記物能以這種方式間接與抗體偶聯(lián)?；蛘?，為使標記物與抗體間接連接，將抗體與小分子半抗原(例如地高辛)偶聯(lián)，并將上述不同類型標記物之一與抗半抗原抗體(例如抗地高辛抗體)偶聯(lián)。如此可實現(xiàn)標記物與抗體的間接偶聯(lián)。
在本發(fā)明另一實施方案中，抗體不需要標記，其存在可利用與該抗體結合的標記抗體檢測。
本發(fā)明抗體可用于任何已知的試驗方法，如競爭結合試驗、直接和間接夾心試驗，及免疫沉淀試驗。Zola，單克隆抗體技術指南，147-158頁(CRCPress，Inc.1987)。
在免疫組化方法中，腫瘤樣品可以是新鮮或冰凍樣品，或可包埋于石蠟中并用福爾馬林等防腐劑固定。
所述抗體還可以用于體內診斷試驗。通常用放射性核素(例如111In、99Tc、14C、131I、125I、3H、32P或35S)標記所述抗體，以便該抗原或其表達細胞可利用免疫閃爍成像術定位。為方便起見，本發(fā)明的抗體可以以試劑盒(即裝有預計量的試劑組合物和進行診斷性檢測的說明)的形式提供。在用酶對所述抗體進行標記的情況中，該試劑盒包括酶所需要的底物和輔助因子(如提供可檢測的發(fā)色團或熒光團的底物前體)。另外，其它的附加物包括例如穩(wěn)定劑、緩沖液(例如封閉緩沖液或裂解緩沖液)等等。各種試劑的相對量可廣泛變化，以提供使檢測的敏感性基本上最佳的試劑濃度。所述試劑尤其可以以干粉(通常為凍干劑)的形式提供，其包含賦形劑，使得其溶解后可提供具有適當濃度的試劑溶液。
VIII.材料的保藏下述雜交瘤細胞已保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，10801 UniversityBoulevard，Manassas，VA 20110-2209，美國(ATCC)抗體命名ATCC編號 保藏日7C2 ATCC HB-12215 1996年10月17日7F3 ATCC HB-12216 1996年10月17日4D5 ATCC CRL 10463 1990年5月24日2C4 ATCC HB-12697 1999年4月8日本發(fā)明的進一步細節(jié)通過下述非限定性實施例舉例說明。所有引文在此引入本文作為參考。
實施例1單克隆抗體2C4的制備和鑒定按Fendly等，癌癥研究501550-1558(1990)中所述方法，制備與ErbB2的細胞外結構域特異性結合的鼠單克隆抗體2C4、7F3和4D5。簡言之，用含25mM EDTA的磷酸鹽緩沖液(PBS)收獲按Hudziak等(美國國家科學院院刊847158-7163(1987))所述方法制備的NIH 3T3/HER2-3400細胞(約表達1×105ErbB2分子/細胞)，并用其免疫BALB/c小鼠。在第0、2、5和7周給小鼠腹腔注射107個細胞(于0.5ml PBS中)。在第9和13周給帶有特定抗血清(其可與32P-標記的ErbB2免疫共沉淀)的小鼠腹腔注射麥胚凝集素-Sepharose(WGA)純化的ErbB2膜提取物。之后靜脈注射0.1ml ErbB2制劑，并將脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞系X63-Ag8.653融合。
通過ELISA和放射性免疫沉淀法，篩選雜交瘤細胞上清液的ErbB2結合。
用競爭性結合檢測(Fendly等，癌癥研究501550-1558(1990))，確定與單克隆抗體4D5、7F3和2C4結合的ErbB2表位。通過利用PANDEXTM掃描儀定量完整細胞上的直接熒光，對抗體進行交叉阻斷研究。用已建立的方法(Wosfsy等，細胞免疫學中的篩選方法，287頁，Mishel和Schiigi(編)SanFrancisco；W.J.Freeman Co.(1980))，將每種單克隆抗體與異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián)。用胰蛋白酶消化匯合的單層NIH 3T3/HER2-3400細胞，并洗滌一次，然后重懸于含0.5％牛血清白蛋白(BSA)和0.1％NaN3的冷PBS中，濃度為1.75×106細胞/ml。加入終濃度為1％的乳膠顆粒(IDC，Portland，OR)，以降低PANDEXTM平板膜的阻塞。向PANDEXTM平板孔中加入20μl細胞懸液和20μl純化的單克隆抗體(100μg/ml-0.1μg/ml)，在冰上孵育30分鐘。向每孔中加入20μl預先稀釋的FITC-標記的單克隆抗體，在冰上孵育30分鐘，洗滌后，用PANDEXTM定量熒光。與無關單克隆抗體對照相比，如果每個抗體阻斷50％或更多的另一抗體的結合，那么這些單克隆抗體被認為共享一個表位。在本實驗中，單克隆抗體4D5、7F3和2C4分別帶有表位I、G/F和F。
用乳腺癌細胞系SK-BR-3(見Hudziak等，分子細胞生物學9(3)1165-1172(1989))可評估單克隆抗體4D5、7F3和2C4的生長抑制特性。簡言之，用0.25％(體積比)胰蛋白酶消化使SK-BR-3細胞脫附，并重懸于完全培養(yǎng)基，濃度為4×105細胞每毫升。將100μl(4×104細胞)等份試樣的細胞懸液接種于96孔微稀釋板中，使細胞粘附，然后只加入100μl培養(yǎng)基或加入含單克隆抗體(終濃度5μg/ml)的培養(yǎng)基。72小時之后，用PBS(pH7.5)洗滌平板兩次，用結晶紫(溶于甲醇，濃度為0.5％)染色，然后按Sugarman等，科學230943-945(1985)中所述方法分析相對細胞增殖。相比于單克隆抗體4D5的約56％的抑制率，單克隆抗體2C4和7F3分別抑制SK-BR-3的相對細胞增殖約20％和38％。
估測單克隆抗體2C4、4D5和7F3對MCF7的全細胞裂解物中Mr180000范圍內的蛋白的HRG活化酪氨酸磷酸化進行抑制的能力(Lewis等，癌癥研究561457-1465(1996))。已經報道MCF7表達所有已知的ErbB受體，但其表達水平較低。因為ErbB2、ErbB3和ErbB4具有幾乎相同的分子大小，所以當用Western雜交法估測全細胞裂解物時，鑒別哪種蛋白發(fā)生酪氨酸磷酸化是不可能的。
然而這些細胞是酪氨酸磷酸化檢測的理想細胞，因為在所使用的檢測條件下，在無外源性HRG加入時，在Mr180000范圍內，它們呈現(xiàn)低水平到不可檢測水平的酪氨酸磷酸化蛋白。
將MCF7細胞接種于24孔平板中，向每孔中加入抗ErbB2單克隆抗體，在室溫下孵育30分鐘；然后向每孔加入rHRGβ1177-244，終濃度為0.2nM，然后持續(xù)孵育8分鐘。從各個孔中小心地吸出培養(yǎng)基，加入100μl SDS樣品緩沖液(5％SDS，25mM DTT，和25mM Tris-Hcl，pH6.8)終止反應。將每份樣品在4-12％梯度膠(Vovex)上進行電泳，然后電轉到聚偏二氟乙烯膜上。使抗磷酸酪氨酸(4G10，來源于UBI，濃度為1μg/ml)免疫雜交顯色，并按先前報道的反射密度測定法(Holmes等，科學2561205-1210(1992)；Sliwkowski等，生物學化學雜志26914661-14665)，定量Mr-180000位置處主要反應帶的強度。
單克隆抗體2C4、7F3和4D5顯著地抑制Mr180000的蛋白的HRG誘導型酪氨酸磷酸化信號的產生。在無HGR的條件下，這些抗體不能激活Mr180000范圍內的蛋白的酪氨酸磷酸化。另外，這些抗體不與EGFR(Fendly等，癌癥研究501550-1558(1990))、ErbB3或ErbB4發(fā)生交叉反應?？贵w2C4和7F3顯著地抑制對p180酪氨酸磷酸化的HRG活化作用，使其小于對照的25％。單克隆抗體4D5能阻斷50％酪氨酸磷酸化的HRG活化。圖2A表明用反射密度測定法測定的2C4或7F3抑制p180酪氨酸磷酸化的HRG活化的劑量應答曲線。用4參數吻合法(fit)估測這些抑制曲線，得2C4和7F3的IC50值分別為2.8±0.7nM和29.0±4.1nM。
用冰上24孔板中的單層培養(yǎng)細胞實施抗ErbB2抗體對HRG與MCF7乳腺癌細胞結合的抑制(Lewis等，癌癥研究561457-1465(1996))。向每孔中加入ErbB2單克隆抗體，并孵育30分鐘。加入125I標記的rHRGβ177- 244(25pm)，繼續(xù)孵育4-16小時。圖2B給出了2C4或7F3抑制HRG與MCF7細胞結合的劑量應答曲線。在125I標記的rHRGβ1177-244存在的條件下，將不同濃度的2C4或7F3與MCF7細胞進行孵育，抑制曲線見圖2B。分析這些資料，得到2C4和7F3的IC50值分別為2.4±0.3nM和19.0±7.3nM。2C4和7F3的最大抑制率為約74％，其與酪氨酸磷酸化的數據相符。
為了確定在MCF7細胞上觀察到的抗ErbB2抗體的效應是否是普遍現(xiàn)象，將人腫瘤細胞系與2C4或7F3共同孵育，并檢測125I標記的rHRG β1177-244特異性結合的程度(Lewis等，癌癥研究561457-1465(1996))。研究結果見圖3。除了已經報道的少量表達或不表達ErbB2的乳腺癌細胞系MDA-MB-468之外，121I標記型rHRG β1177-244的結合在所有細胞系中均可被2C4或7F3顯著抑制。報道表明其余的細胞系均表達ErbB2，在這些細胞系中ErbB2表達水平差別很大。實際上，在所檢測的細胞系中ErbB2表達程度的差異超過2個數量級。例如，BT-20、MCF7和Caov3表達約104 ErbB2受體/細胞，而BT-474和SK-BR-3表達約106ErbB2受體/細胞。由這些細胞中ErbB2表達程度的較大差異及上述資料，推斷ErbB2和ErbB3或ErbB4之間的相互作用本身是高親和力的相互作用，其發(fā)生在胞漿膜的表面。
在外源rHRGβ1存在或不存在的條件下，估測了單克隆抗體2C4和4D5對MDA-MB-175和SK-BR-3細胞的生長抑制作用(Achaefer等，癌基因151385-1394(1997))。MDA-MB-175細胞中ErbB2水平比正常乳腺上皮細胞中的水平高4-6倍，并且ErbB2-ErbB4受體在MDA-MB-175細胞中被組成性磷酸化。用抗ErbB2單克隆抗體2C4和4D5(10μg/ml)處理MDA-MB-175細胞4天。在結晶紫染色檢測中，與2C4保溫表現(xiàn)出很強的對此細胞系的生長抑制作用(圖4A)。外源性HRG不能顯著地逆轉此抑制。在另一方面，2C4顯示對ErbB2過度表達的細胞系SK-BR-3沒有抑制作用(圖4B)。在外源性HRG存在或不存在的條件下，單克隆抗體2C4能抑制MDA-MB-175細胞的增殖，其程度大于單克隆抗體4D5的抑制程度。4D5對細胞增殖的抑制依賴于ErbB2的表達水平(Lewis等，Cancer Immunol.Immunother.37255-263(1993))。在SK-BR-3細胞中檢測到的最大抑制率為66％(圖4B)。但是此作用可被外源HRG克服。
實施例2單克隆抗體2C4阻斷ErbB2與ErbB3的HRG依賴性結合用免疫共沉淀實驗檢測ErbB3與ErbB2結合的能力。將1.0×106MCF7或SK-BR-3細胞接種在6孔組織培養(yǎng)板中并使其粘附過夜，培養(yǎng)基為含10％胎牛血清(FBS)和10mM HEPES(pH 7.2)的5050DMEM/Ham’s F12培養(yǎng)基(生長培養(yǎng)基)。在實驗開始前，將所述細胞在無血清的生長培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)2小時。
用PBS簡單地洗滌所述細胞，然后用100nM所指抗體(在含10mMHEPES的0.2％w/v牛血清白蛋白(BSA)RPMI培養(yǎng)基(pH 7.2)(結合緩沖液)中稀釋)或只用結合緩沖液(對照)孵育所述細胞。室溫下1小時之后，向一半的孔中加入HRG，終濃度為5nM(+)。向其它孔中加入相似體積的結合緩沖液(-)。持續(xù)孵育近10分鐘。
吸出上清，在含0.2mM PMSF、10μg/ml亮抑酶肽和10TU/ml抑酶肽的RPMI、10mM HEPES、pH7.2、1.0％v/v TRITON X-100TM、1.0％w/v CHAPS(裂解緩沖液)中裂解細胞。離心去除裂解物中不溶性物質。
用與親和凝膠(Affi-Prep10，Bio-Rad)共價偶聯(lián)的單克隆抗體使ErbB2免疫沉淀。該抗體(Ab-3，Oncogene Sciences)識別胞漿區(qū)表位。向每份裂解物中加入含約8.5μg固定抗體的10μl凝膠混懸液，進行免疫沉淀，使樣品在室溫下混合2小時。然后通過離心收集凝膠。用裂解緩沖液逐批洗滌凝膠3次，去除未結合物質。然后加入SDS樣品緩沖液，并將樣品在沸水浴中簡單加熱。
將上清在4-12％聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，并電轉到硝酸纖維素膜上。通過用針對ErbB3的胞漿區(qū)表位的多克隆抗體(c-17，Santa Cruz Biotech)檢測這些印跡膜，估測ErbB3的存在。用化學發(fā)光底物(ECL，Amersham)使這些印跡膜顯色。
如圖5A和圖5B(分別為MCF和SK-BR-3細胞)中對照泳道結果所示，只有當用HRG活化細胞時，ErbB2免疫沉淀中才存在ErbB3。如果首先用單克隆抗體2C4孵育細胞，那么ErbB3信號在MCF7細胞中消失(圖5A泳道2C4+)，或在SK-BR-3細胞中明顯下降(圖5B泳道2C4+)。如圖5A-B所示，在MCF7和SK-BR-3細胞中，單克隆抗體2C4基本上比HERCEPTIN更有效地阻斷ErbB3與ErbB2的heregulin依賴性結合。用HERCETIN預溫育可降低MCF7裂解物中的ErbB3信號，但對SK-BR-3裂解物中ErbB3共沉淀的量幾乎沒有或完全沒有影響。用針對EGF受體(Ab-1，OncogeneSciences)的抗體預溫育，對ErbB3在這兩種細胞中與ErbB2免疫共沉淀的能力沒有影響。
實施例3
人源化2C4抗體首先將鼠單克隆抗體2C4的可變區(qū)克隆到允許產生小鼠/人嵌合Fab片段的載體中。用Stratagene RNA提取試劑盒，按照產品說明書，從雜交瘤細胞中分離總RNA。用RT-PCR法擴增可變區(qū)，凝膠純化，插入到含人κ恒定區(qū)和CH1區(qū)的pUC119衍生質粒中，如先前所述(Carter等，PNAS(USA)894285(1992)；美國專利5821337)。用得到的質粒轉化大腸桿菌16C9，用于表達Fab片段。按先前所述方法(Werther等，免疫學雜志1574986-4995(1996)；Presta等，癌癥研究574593-4599(1997))，進行培養(yǎng)、誘導蛋白表達和純化Fab片段。
對純化的嵌合2C4 Fab段和鼠親本抗體2C4抑制125I-HRG與MCF7細胞結合的能力及其在MCF7細胞中抑制p180酪氨酸磷酸化的rHRG活化的能力進行比較。如圖6A中所示，在破壞人乳腺癌細胞系MCF7上高親和力ErbB2-ErbB3結合位點的形成時，該嵌合2C4 Fab段非常有效。完整鼠抗體2C4的IC50值為4.0±0.4nM，而Fab段的IC50值為7.7±1.1nM。如圖6B所示，單價嵌合抗體2C4 Fab段在破壞HRG依賴性ErbB2-ErbB3活化作用中非常有效。完整鼠單克隆抗體2C4的IC50值為6.0±2nM，而Fab段的IC50值為15.0±2nM。
嵌合克隆的DNA測序使得可鑒定CDR殘基(Kabat等，免疫相關蛋白的序列，5thPublic Health Service，National Institute of Health，Bethesda，MD(1991))(圖7A和B)。按先前所述方法(Presta等，癌癥研究574593-4599(1997))，利用寡核苷酸定點誘變，將所有6個CDR區(qū)域引入質粒VX4上的完整人框架(VLκ亞基I和VH亞基III)中。按上述方法表達并純化“CDR-交換(swap)”后的蛋白。進行結合研究來比較所述兩種蛋白。簡言之，用溶于50mM碳酸緩沖液(pH9.6)中的1微克每毫升的ErbB2細胞外結構域(ECD；按WO90/14357中所述方法制備)包被NUNC MAXISORPTM平板，4℃過夜，然后用ELISA稀釋劑(0.5％BSA，0.05聚山梨酸酯(polysorbate)20，PBS)在室溫下封閉1小時。將溶于ELISA稀釋劑中的一系列樣品稀釋液在平板上溫育2小時。洗滌之后，用生物素化鼠抗人κ抗體(ICN634771)，隨后用鏈親和素偶聯(lián)的辣根過氧化酶(Sigma)檢測結合的Fab片段，以3，3’，5，5’，-四甲基聯(lián)苯胺(Kirkegaar和Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)作為底物。測定450nm處吸收值。如圖8A所示，在CDR-交換的人Fab片段的構建體上，所有的結合均缺失。
為了恢復人源化Fab段的結合，利用源自CDR-交換的DNA作為模板構建突變體。利用計算機產生的模型(圖9)，設計這些突變，使改變后可能影響CDR構象或抗體-抗原界面的人框架區(qū)殘基改變?yōu)樗鼈兊氖笤磳铩Ｍ蛔凅w見表2。
表2人源化2C4FR突變的設計
各種突變體的結合曲線見圖8A-C。人源化Fab段574(帶有ArgH71Val、AspH73Arg和IleH69Leu的改變)表明恢復了原始嵌合2C4 Fab段的結合。為了進一步精煉或增加人源化抗體的結合，可修飾其它的FR和/或CDR殘基(如L2、L54、L55、L56、H35和/或H48)(例如如下取代IleL2Thr；ArgL54Leu；TyrL55Glu；ThrL56Ser；AspH35Ser；和ValH48Ile)。或者(或另外)，為了改善或精煉所述人源化抗體的親和力和/或其它生物學活性，可對其進行親和力成熟(見上述)。
利用噬菌體展示方法，進行人源化2C4抗體574的親和力成熟。簡言之，將人源化2C4.574 Fab克隆到噬菌體展示載體中，作為geneIII融合蛋白。當通過與M13KO7輔助噬菌體感染而誘導噬菌體顆粒時，該融合蛋白允許Fab在噬菌體尾纖維蛋白geneIII的N末端上展示(Baca等，生物學化學雜志27210678(1997))。
對上面鑒定的6個CDR中的每個CDR，單獨構建文庫。在這些文庫中，利用含“NNS”’的寡核苷酸(oligo)作為密碼子，使CDR中用計算機模型確定為在與ErbB2結合中可能具有重要作用的氨基酸隨機化。然后針對包被在NUNC MAXISORPTM板上的ErbB2 ECD(用溶于含0.2％土溫20(MPBST)的PBS中的3％干牛奶代替所有的封閉液)篩選文庫。為了篩選親和力高于2C4.574的噬菌體，在第3、4和5輪篩選中，在洗滌期間加入可溶性ErbB2 ECD或可溶性Fab 2C4.574作為競爭劑。洗滌時間延長到室溫1小時。
5輪篩選之后，用噬菌體-ELISA法再一次分析單個克隆。在Costar 96-孔U形底組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)單個克隆，通過加入輔助噬菌體誘導該噬菌體。過夜培養(yǎng)之后，將大腸桿菌聚集成團，并將含噬菌體的上清轉入96孔板而使所述噬菌體用MPBST在室溫下封閉1小時。按上述方法將ErbB2 ECD包被的NUNC MAXISORPTM板也用MBPST封閉。將封閉的噬菌體在平板上溫育2小時。洗滌之后，用在MPBST中1∶5000稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)型抗M13單克隆抗體(Amersham Pharmacia Biotech，Inc.27-9421-01)檢測結合的噬菌體。以3，3’，5，5’，-四甲基聯(lián)苯胺作為底物。測定450nm處吸收值。
對每個文庫中給出最強信號的48個克隆進行DNA測序。將序列出現(xiàn)頻率最高的那些克隆亞克隆到上述允許表達可溶性Fab的載體中。對這些Fabs進行誘導、蛋白純化，用上述的ELISA法分析純化的Fab的結合，并將該結合與起始的人源化2C4.574抗體的結合進行比較。
在確定了單個CDR中目的突變之后，構建另外的突變，其為這些突變的各種組合，并按上述方法進行檢測。相對于574改善了結合力的突變體見表3。
表3來源于2C4.574親和力成熟的突變體的命名突變體名稱相對于574的改變突變體/574*H3.A1 serH99trp，metH34leu0.380L2.F5 serL50trp，tyrL53gly，metH34leu 0.087H1.3.B3 thrH28gln，thrH30ser，metH34leu 0.572L3.G6 tyrL92pro，ileL93lys，metH34leu 0.569L3.G11tyrL92ser，ileL93arg，tyrL94gly，metH34leu 0.561L3.29 tyrL92phe，tyrL96asn，metH34leu 0.552L3.36 tyrL92phe，tyrL94leu，tyrL96pro，metH34leu 0.215654 serL50trp，metH34leu0.176655 metH34ser 0.542659 serL50trp，metH34ser0.076L2.F5.H3.A1 serL50trp，tyrL53gly，metH34leu，serH99trp 0.175L3G6.H3.A1tyrL92pro，ileL93lys，metH34leu，serH99trp 0.218H1.3.B3.H3.A1 thrH28gln，thrH30ser，metH34leu，serH99trp 0.306L3.G11.H3.A1 tyrL92ser，ileL93arg，tyrL94gly，metH34leu，serH99trp 0.248654.H3.A1 serL50trp，metH34leu，serH99trp 0.133654.L3.G6 serL50trp，metH34leu，tyrL92pro，ileL93lys 0.213654.L3.29 serL50trp，metH34leu，tyrL92phe，tyrL96asn 0.236654.L3.36 serL50trp，metH35leu，tyrL92phe，tyrL94leu，tyrL96pro 0.141*在ErbB2-ECD ELISA中，給出標準曲線的中間OD值所需要的突變體總量與給出標準曲線的中間OD值所需要的574的總量之間的比率。數字小于1.0表明突變體比574更好地結合ErbB2。
已構建了下述突變體，并且目前進行評估659.L3.G6 serL50trp，metH34ser，tyrL92pro，ileL93lys659.L3.G11 serL50trp，metH34ser，tyrL92ser，ileL93arg，tyrL94gly659.L3.29 serL50trp，metH34ser，tyrL92phe，tyrL96asn659.L3.36 serL50trp，metH34ser，tyrL92phe，tyrL94leu，tyrL96proL2F5.L3G6 serL50trp，tyrL53gly，metH34leu，tyrL92pro，ileL93lysL2F5.L3G11 serL50trp，tyrL53gly，metH34leu，tyrL92ser，ileL93arg，tyrL94glyL2F5.L29 serL50trp，tyrL53gly，metH34leu，tyrL92phe，tyrL96asnL2F5.L36 serL50trp，tyrL53gly，metH34leu，tyrL92phe，tyrL94leu.tyrL96proL2F5.L3G6.655 serL50trp，tyrL53gly，metH35ser，tyrL92pro，ileL93lysL2F5.L3G11.655 serL50trp，tyrL53gly，metH34ser，tyrL92ser，ileL93arg，tyrL94glyL2F5.L29.655 serL50trp，tyrL53gly，metH34ser，tyrL92phe，tyrL96asnL2F5.L36.655 serL50trp，tyrL53gly，metH34ser，tyrL92phe，tyrL94leu，tyrL96pro
下述突變體(由同源性掃描提示得到)目前正在被構建678 thrH30ala679 thrH30ser680 lysH64arg681 leuH96val682 thrL97ala683 thrL97ser684 tyrL96phe685 tyrL96ala686 tyrL91phe687 thrL56ala688 glnL28ala689 glnL28glu在H34上優(yōu)選的氨基酸是甲硫氨酸。如果發(fā)現(xiàn)在此位置被氧化，可變?yōu)榱涟彼帷?br> 發(fā)現(xiàn)AsnH52和asnH53對于結合是強烈優(yōu)選的氨基酸。將這些殘基變?yōu)楸彼峄蛱於彼峥娠@著降低結合。
已制備包括人源化抗體574的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)和人IgG1重鏈恒定區(qū)的完整抗體(見美國專利5821337)。用中國倉鼠卵巢細胞(CHO)制備所述完整抗體。該分子在本文中被稱為rhuMAb 2C4。
實施例4單克隆抗體2C4阻斷EGF、TGF-α或HRG介導的MAPK活化作用許多生長因子受體通過促分裂原介導的蛋白激酶(MAPK)途徑傳遞信號。這些雙特異性激酶是信號傳導途徑中最終觸發(fā)腫瘤細胞分裂的關鍵終點之一。按下述方法估測單克隆抗體2C4或HERCEPTIN抑制MAPK的EGF、TGF-α或HRG活化作用的能力。
將MCF細胞(105細胞/孔)置于12孔細胞培養(yǎng)板中的含血清培養(yǎng)基中。第二天，去除細胞培養(yǎng)基，并向各個孔中加入含0.1％血清的新鮮培養(yǎng)基。在下一天重復此過程，并在檢測之前，用無血清的結合緩沖液取代所述培養(yǎng)基(Jones等，生物學化學雜志27311667-74(1998)；Schaefer等，生物學化學雜志274859-66(1999))。使細胞在室溫下平衡，然后用0.5ml 200nMHERCEPTIN或單克隆抗體2C4溫育30分鐘。之后將細胞用1nM EGF、1nMTGF-α或0.2nM HRG處理15分鐘。吸出細胞培養(yǎng)基，終止反應，然后加入0.2ml含1％DTT的SDS-PAGE樣品緩沖液。按先前所述方法(Jones等，生物學化學雜志27311667-74(1998))，利用抗活性MAPK抗體(Promega)通過Western雜交估測MAPK活性。
如圖10所示，單克隆抗體2C4顯著地阻斷MAPK的EGF、TGF-α或HRG介導型活化作用，其程度大于HERCEPTIN。這些數據表明單克隆抗體2C4與ErbB2上用于結合EGFR或ErbB3的表面結合，因而阻止了信號傳遞受體復合物的形成。
單克隆抗體2C4還表明抑制heregulin(HGR)依賴性Akt活化作用。PI3激酶信號傳導途徑的活化對于細胞存活是重要的(Carraway等，生物學化學雜志2707111-6(1995))。在腫瘤細胞中，PI3激酶活化在浸潤表型中發(fā)揮作用(Tan等，癌癥研究591620-1625(1999))。存活途徑主要由絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT介導(Bos等，Trends Biochem Sci.20441-442(1995))。ErbB2和ErbB3或EGFR之間形成的復合物能分別應答heregulin或EGF而起始這些途徑(Olayioye等，分子和細胞生物學185042-51(1998)；Karunagaran等，EMBO雜志15254-264(1996)；Krymskaya等，美國生理學雜志276L 246-55(1999))。用2C4溫育MCF7乳腺癌細胞可抑制heregulin介導的AKT活化作用。而且，加入2C4可進一步降低在無heregulin加入的條件下存在的AKT活化的基本水平。這些數據表明2C4可抑制PI3激酶的ErbB配體活化，并且此抑制可導致細胞凋亡。腫瘤細胞對化療藥物毒性作用的更高的敏感性，可證實對細胞凋亡的敏感性增加。
因而，單克隆抗體2C4通過兩個主要信號傳遞途徑-MAP激酶(主要增殖途徑)和PI3激酶(主要存活/抗凋亡途徑)，抑制配體起始的ErbB信號傳導。
實施例5單克隆抗體2C4和HERCEPTIN在體內的組合將用肺腺癌細胞系Calu-3建立的異體移植物模型，用于估測抗HER2單克隆抗體(單獨或聯(lián)合)抑制腫瘤生長的效果。將0.1ml 2.0×106細胞接種于雌性NCR裸鼠皮下。每周測量腫瘤兩次，并且在腫瘤結節(jié)體積達到100mm3時，將動物隨機分為7個治療組。所述治療組是(a)對照單克隆抗體，MAb 1766；(b)HERCEPTIN，10mg/kg；
(c)單克隆抗體7C2，10mg/kg；(d)單克隆抗體2C4，10mg/kg；(e)HERCEPTIN和7C2，各10mg/kg；(f)HERCEPTIN和2C4，各10mg/kg；(g)單克隆抗體2C4和7C4，各10mg/kg。
每周對動物處理兩次，直到第24天。每周測量腫瘤體積兩次，直到第38天。
如圖11中條圖所示，用2C4或HERCEPTIN治療Calu-3荷瘤小鼠，可顯著抑制腫瘤的生長。HERCEPTIN和2C4或HERCEPTIN和7C2組合治療效果好于單獨給藥任一單克隆抗體。
實施例6用單克隆抗體2C4治療結直腸癌按Sheng等，J.Clin.Invest.992254-2259(1997)中所述方法，將人結直腸癌細胞系HCA-7、LS174T或CaCo-2等皮下接種于無胸腺裸鼠。一旦腫瘤體積達到約100mm3，用10-50mg/kg單克隆抗體2C4通過腹腔注射給藥各組動物，每周兩次。單克隆抗體2C4在體內抑制結直腸異體移植物的生長。
實施例7用人源化抗體2C4治療乳腺癌用一項3日Alamar Blue檢測，估測了rhuMAb或HERCEPTIN對ErbB2不過度表達的人乳腺癌細胞的作用(Ahmed，S.A.免疫學方法雜志170211-224(1994)；和Page等，國際腫瘤學雜志3473-476(1996))。用于此檢測的細胞是ErbB2表達水平為1+的MDA-175人乳腺癌細胞。如圖12所示，與HERCEPTIN治療相比，加入rhuMAb 2C4以劑量依賴性方式顯著抑制乳腺癌細胞系MDA-175的生長。
估測了rhuMAb 2C4抗MCF7異體移植物的效果，所述MCF7異體移植物為雌激素受體陽性(ER+)并表達低水平ErbB2。使用了補充雌激素的雌性小鼠。rhuMAb 2C4以30mg/kg/周的劑量給藥。如圖13所示，rhuMAb 2C4可有效地抑制乳腺癌的體內生長，其中該乳腺癌的特點不是過度表達ErbB2。
實施例82C4的藥代動力學、代謝和毒理學
rhuMAb 2C4在人血清中是穩(wěn)定的。在生物物質中沒有觀察到復合物形成的跡象或聚集。在小鼠中rhuMAb 2C4的清除比HERCEPTIN快。藥代動力學研究表明每周給藥約2-6mg/kg rhuMAb將導致其血清濃度與按目前劑量給藥的HERCEPTIN相似。所得血清與2C4接觸將大大提高體外測定的IC50值。
在恒河猴(cynomolgus)中(每組中2雄性和2雌性)進行毒理學研究。靜脈給藥0、10、50或100mg/kg的rhuMAb 2C4，每周兩次，給藥4周。毒理學研究中檢測體重(-2、-1周及其后每周)；食物消耗(定量，每日)；體檢并評估血壓、心電圖(ECG)和體溫(-2、-1周及第2和4周，該周第二次給藥后4小時(4 hours post-dose following that weeks second dose))等；心臟超聲檢測(第一周第一次給藥后，及研究的末期，第四周)；臨床病理學(基線水平和第2周及第4周末)；尿液分析(基線和第2周及第4周末)；抗體分析采樣(基線和第2周及第4周末)；以及尸檢和組織病理學分析。
所有組的全部動物均存活到研究結束。沒有觀察到明顯的臨床癥狀或各組間的差異。尸檢結果表明任何動物的器官中沒有顯著的大體(gross)異常。在任何動物的組織中沒有觀察到顯著的鏡下異常。從本研究的開始到結束，沒有觀察到顯著的ECG變化。另外，在各組之間沒有見到差異。
實施例9劑量逐級提高(Escalation)向腫瘤患者給藥5個劑量水平(0.05、0.5、2.0、4.0或10mg/kg；每個劑量水平6個受試者)之一的首劑量的rhuMAb 2C4，隨后4周停藥(wash-out)。第5周，向患者給藥相同劑量，一周4次，隨后4周停藥。具有完全應答、部分應答或穩(wěn)定疾病的患者適合于進一步研究。
實施例10復發(fā)性或不應性轉移型前列腺癌的治療rhuMAb 2C4是針對ErbB2的全長人源化單克隆抗體(由CHO細胞產生)。rhuMAb 2C4阻斷ErbB2與其它ErbB家族成員的結合，因而抑制細胞內ErbB途徑的信號傳導。與HERCEPTIN相反，rhuMAb 2C4不但抑制ErbB2過度表達型腫瘤的生長，還阻斷需要ErbB配體依賴性信號傳導的腫瘤的生長。
rhuMAb 2C4可作為治療激素不應性(雄激素非依賴性)前列腺癌患者的單一藥物。效力的主要終點包括相對于提供最佳護理(米托蒽醌/潑尼松)(作為單一藥物)的總存活率和安全性。效力的次要終點包括疾病進展時間，應答率，生命質量、疼痛和/或應答持續(xù)時間。rhuMAb 2C4每周或每三周靜脈內(IV)給藥，劑量分別為2或4mg/kg，直到疾病進展(progression)。所述抗體以多劑液體劑型提供(20ml裝，濃度為20mg/ml或更高)。
rhuMAb 2C4還可與化療聯(lián)合用于治療激素不應性(雄激素非依賴性)前列腺癌患者。效力的主要終點包括相對于化療的總存活率和安全性。效力的次要終點包括疾病進展時間，應答率，生命質量、疼痛和/或應答持續(xù)時間。rhuMAb 2C4每周或每三周靜脈內(IV)給藥，劑量分別為2或4mg/kg，直到疾病進展。所述抗體以多劑液體劑型提供(20ml裝，濃度為20mg/ml或更高)。
可與抗ErbB2抗體(其阻斷ErbB2受體的配體活化作用)聯(lián)合治療前列腺癌(例如雄激素非依賴性前列腺癌)的藥物實例包括法呢基轉移酶抑制劑；抗血管生成藥(例如抗VEGF抗體)；EGFR靶向藥物(例如C225或ZD1839)；另一抗ErbB2抗體(生長抑制性抗ErbB2抗體如HERCEPTIN等，或誘導凋亡的抗ErbB2抗體如7C2或7F3等，包括其人源化變體和/或親和力成熟變體)；細胞因子(例如IL-2、IL-12、G-CSF或GM-CSF)；抗雄激素(如氟他胺或環(huán)丙孕酮乙酸酯)；亮丙瑞林；蘇拉明；化療藥如長春新堿、雌莫司汀、米托蒽醌、liarozole(視黃酸代謝阻斷藥)、環(huán)磷酰胺、阿霉素等蒽環(huán)霉素類抗生素、紫杉烷(例如紫杉醇或紫杉萜)或氨甲蝶呤，或者上述藥物的任何組合，例如長春新堿/雌莫司汀或環(huán)磷酰胺/阿霉素/氨甲蝶呤；潑尼松；氫化可的松；或其組合。可給藥這些藥物的標準劑量，例如40mg/m2/wk紫杉萜(TAXOTERE)；6(AUC)卡鉑；和200mg/m2紫杉醇(TAXOL)。
實施例11轉移乳腺癌的治療rhuMAb 2C4可作為治療轉移型乳腺癌癌患者(其腫瘤并不過度表達ErbB2)的單一藥物。效力的主要終點包括應答率和安全性。效力的次要終點包括總存活率，疾病進展時間，生命質量、和/或應答持續(xù)時間。rhuMAb2C4每周或每三周靜脈內(IV)給藥，劑量分別為2或4mg/kg，直到疾病進展。所述抗體以多劑液體劑型提供(20ml裝，濃度為20mg/ml或更高)。
rhuMAb 2C4還可與化療聯(lián)合用于治療轉移型乳腺癌癌患者(其腫瘤并不過度表達ErbB2)。效力的主要終點包括相對于單獨使用化療的總存活率和安全性。效力的次要終點包括疾病進展時間，應答率，生命質量、和/或應答持續(xù)時間。rhuMAb 2C4每周或每三周靜脈內(IV)給藥，劑量分別為2或4mg/kg，直到疾病進展。所述抗體以多劑液體劑型提供(20ml裝，濃度為20mg/ml或更高)。
可與抗ErbB2抗體(其阻斷ErbB2受體的配體活化作用)聯(lián)合用于治療乳腺癌(例如不以ErbB2過度表達為特征的轉移型乳腺癌)的藥物實例包括化療藥，如蒽環(huán)霉素類抗生素(例如阿霉素)、環(huán)磷酰胺、紫杉烷(例如紫杉醇或紫杉萜)、navelbine、xeloda、絲裂霉素C、鉑化合物、奧沙利鉑、吉西他濱，或這些藥物中兩種或更多種的組合，如阿霉素/環(huán)磷酰胺；另一抗ErbB2抗體(生長抑制性抗ErbB2抗體如HERCEPTIN等，或誘導凋亡的抗ErbB2抗體如7C2或7F3等，包括它們的人源化變體和/或親和力成熟變體)；抗雌激素(例如他莫昔芬)；法呢基轉移酶抑制劑；抗血管生成藥(例如抗VEGF抗體)；EGFR靶向藥物(例如C225或ZD1839)；細胞因子(例如IL-2、IL-12、G-CSF或GM-CSF)；或上述藥物的組合。可用這些附加藥物的標準劑量。
另外，rhuMAb 2C4還可與HERCEPTIN聯(lián)合用于治療轉移型乳腺癌癌患者(其腫瘤并不過度表達ErbB2)。效力的主要終點包括應答率和安全性。效力的次要終點包括疾病進展時間，相對于單獨使用HERCEPTIN的總存活率，生命質量、和/或應答持續(xù)時間。rhuMAb 2C4每周或每三周靜脈內(IV)給藥，劑量分別為2或4mg/kg，直到疾病進展。所述抗體以多劑液體劑型提供(20ml裝，濃度為20mg/ml或更高)。HERCEPTIN可靜脈內給藥，第一劑為4mg/kg，其后每周維持劑量為2mg/kg。HERCEPTIN以凍干粉形式提供。每瓶HERCEPTIN含440mg HERCEPTIN、9.9mg鹽酸L-組氨酸、6.4mg L-組氨酸、400mgα-α-海藻糖二水合物、1.8mg聚山梨酸酯20。用20ml含1.1％苯甲醇(作為防腐劑)的注射用無菌水(BWFI)重建，產生含21mg/ml HERCEPTIN的21ml多劑量溶液(pH為約6.0)。
實施例12肺癌的治療rhuMAb 2C4可作為治療IIIb或IV期非小細胞肺癌的單一藥物。效力的主要終點包括應答率和安全性。效力的次要終點包括總存活率，疾病進展時間，生命質量、和/或應答持續(xù)時間。rhuMAb 2C4每周或每三周靜脈內(IV)給藥，劑量分別為2或4mg/kg，直到疾病進展。所述抗體以多劑液體劑型提供(20ml裝，濃度為20mg/ml或更高)。
rhuMAb 2C4還可與化療聯(lián)合用于治療轉移型非小細胞肺癌。效力的主要終點包括相對于常規(guī)治療的總存活率和安全性。效力的次要終點包括疾病進展時間，應答率，生命質量和/或應答持續(xù)時間。rhuMAb 2C4每周或每三周靜脈內(IV)給藥，劑量分別為2或4mg/kg，直到疾病進展。所述抗體以多劑液體劑型提供(20ml裝，濃度為20mg/ml或更高)。
可與抗ErbB2抗體(其阻斷ErbB受體的配體活化作用)聯(lián)合治療肺癌的藥物實例包括化療藥，如卡鉑、紫杉烷(例如紫杉醇或紫杉萜)、吉西他濱、navelbine、順鉑、奧沙利鉑，或這些藥物的任何組合，例如卡鉑/紫杉萜；另一抗ErbB2抗體(生長抑制性抗ErbB2抗體如HERCEPTIN等，或誘導凋亡的抗ErbB2抗體如7C2或7F3等，包括它們的人源化變體和/或親和力成熟變體)；法呢基轉移酶抑制劑；抗血管生成藥(例如抗VEGF抗體)；EGFR靶向藥物(例如C225或ZD1839)；細胞因子(例如IL-2、IL-12、G-CSF或GM-CSF)；或上述藥物的組合。
實施例13結直腸癌的治療rhuMAb 2C4可作為治療轉移型結直腸癌的單體藥物。效力的主要終點包括應答率和安全性。效力的次要終點包括總存活率，疾病進展時間，生命質量、和/或應答持續(xù)時間。rhuMAb 2C4每周或每三周靜脈內(IV)給藥，劑量分別為2或4mg/kg，直到疾病進展。所述抗體以多劑液體劑型提供(20ml裝，濃度為20mg/ml或更高)。
rhuMAb 2C4還可與化療聯(lián)合用于治療轉移型結直腸癌患者。效力的主要終點包括相對于常規(guī)治療的總存活率和安全性。效力的次要終點包括疾病進展時間，應答率，生命質量和/或應答持續(xù)時間。rhuMAb 2C4每周或每三周靜脈內(IV)給藥，劑量分別為2或4mg/kg，直到疾病進展。所述抗體以多劑液體劑型提供(20ml裝，濃度為20mg/ml或更高)。
可與抗ErbB2抗體(其阻斷ErbB受體的配體活化作用)聯(lián)合用于治療結直腸癌的化療藥物實例包括5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氫葉酸(LV)、CPT-11、左旋咪唑，或這些藥物中兩種或多種的組合如5-FU/LV/CPT-11?？山o藥這些化療藥的標準劑量?？膳c抗ErbB2抗體聯(lián)合用于治療結直腸癌的其它藥物包括法呢基轉移酶抑制劑；抗血管生成藥(例如抗VEGF抗體)；EGFR靶向藥物(例如C225或ZD1839)；細胞因子(例如IL-2、IL-12、G-CSF或GM-CSF)；另一抗ErbB2抗體(生長抑制性抗ErbB2抗體如HERCEPTIN等，或誘導凋亡的抗ErbB2抗體如7C2或7F3等，包括它們的人源化變體和/或親和力成熟變體)；或上述藥物的組合。
序列表<110>杰南技術公司(Genentech，Inc.)<120>人源化抗ErbB2抗體及用抗ErbB2抗體進行的治療<130>P1467R2PCT.1<140>PCT/US00/17366<141>2000-06-23<150>US 60/141,316<151>1999-06-25<160>13<210>1<211>107<212>PRT<213>鼠(Mus Musculus)<400>1Asp Thr Val Met Thr Gln Ser His Lys Ile Met Ser Thr Ser Val1 5 10 15Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser20 25 30Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys35 40 45Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp50 55 60Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile65 70 75Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln80 85 90Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu95 100 105Ile Lys<210>2<211>119<212>PRT<213>鼠(Mus Musculus)<400>2Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly1 5 10 15Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr20 25 30Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu35 40 45Glu Trp Ile Gly Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr50 55 60Asn Gln Arg Phe Lys Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Arg Ser65 70 75Ser Arg Ile Val Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Phe Glu Asp80 85 90Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr95 100 105Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser110 115<210>3<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>人源化VL序列<400>3Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val15 10 15Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser20 25 30Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys35 40 45Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile65 70 75Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln80 85 90Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu95 100 105Ile Lys<210>4<211>119<212>PRT<213>人工序列<220><223>人源化VH序列<400> 4Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr20 25 30Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu35 40 45Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr50 55 60Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser65 70 75Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr95 100 105Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser110 115<210>5<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>輕鏈共有序列<400>5Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val1 5 10 15Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser20 25 30Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys35 40 45Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile65 70 75Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln80 85 90Tyr Asn Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu95 100 105Ile Lys<210>6<211>119<212>PRT<213>人工序列<220><223>重鏈共有序列<400> 6Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser20 25 30Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu35 40 45Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr50 55 60Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser65 70 75Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Val Gly Tyr Ser Leu95 100105Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser110 115<210>7<211>10<212>PRT<213>鼠(Mus Musculus)<220><221>不確定<222>10<223>未知氨基酸<400>7Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met Xaa15 10<210>8<211>17<212>PRT<213>鼠(Mus Musculus)<400>8Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe1 5 10 15Lys Gly<210>9<211>10<212>PRT<213>鼠(Mus Musculus)<400>9Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr1 5 10<210>10<211>11<212>PRT<213>鼠(Mus Musculus)<400>10Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala1 5 10<210>11<211>7<212>PRT<213>鼠(Mus Musculus)<220><221>不確定<222>5-7<223>未知氨基酸<400>11Ser Ala Ser Tyr Xaa Xaa Xaa1 5<210>12<211>9<212>PRT<213>鼠(Mus Musculus)<400>12Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr1 5<210>13<211>645<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400> 13Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu1 5 10 15Leu Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp20 25 30Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met35 40 45Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu50 55 60Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln65 70 75Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln80 85 90Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr95 100105Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly110 115120Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly125 130135Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys140 145 150Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp155 160165Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala
170 175 180Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys185 190 195Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu200 205 210Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala215 220 225Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys230 235 240Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys245 250 255Leu His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala260 265 270Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro275280 285Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro290295 300Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys305310 315Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg320325 330Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu335340 345Gly Mer Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn350355 360Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala365370 375Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala380 385390Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu395 400405Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro410 415420Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile425 430435Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile440 445450Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu455 460465Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val470 475480Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His
485 490 495Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala500 505 510Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro515 520 525Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys530 535 540Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val545 550 555ASn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln560 565 570Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val575 580 585Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys590 595 600Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys605 610 615Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys620 625 630Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu635 640 64權利要求
1.在人體中治療癌癥的方法，其中所述癌癥表達表皮生長因子受體(EGFR)，所述方法包括向人體給藥治療有效量的與ErbB2結合的抗體。
2.權利要求1的方法，其中所述抗體阻斷ErbB受體的配體活化作用。
3.權利要求2的方法，其中所述抗體阻斷單克隆抗體2C4與ErbB2的結合。
4.權利要求1的方法，其中所述癌癥的特點是EGFR過度活化。
5.權利要求4的方法，其中所述癌癥過度表達ErbB配體。
6.權利要求5的方法，其中所述ErbB配體是轉化生長因子α(TGF-α)
7.權利要求1的方法，其中所述抗體阻斷促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的TGF-α活化作用。
8.權利要求1的方法，其中所述癌癥不以過度表達ErbB2受體為特征。
9.權利要求1的方法，其中所述癌癥選自結腸癌、直腸癌和結直腸癌。
10.權利要求9的方法，其進一步包括向人體給藥化療藥物。
11.權利要求10的方法，其中所述化療藥物選自5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氫葉酸(LV)、CPT-11和左旋咪唑。
12.權利要求1的方法，其中所述癌癥是肺癌。
13.權利要求12的方法，其中所述癌癥是非小細胞肺癌。
14.權利要求12的方法，其進一步包括向人體給藥化療藥。
15.權利要求14的方法，其中所述化療藥物選自紫杉烷、吉西他濱、新霉酰胺、順鉑、奧沙利鉑和卡鉑。
16.權利要求1的方法，其中所述抗體具有單克隆抗體2C4的生物學特點。
17.權利要求16的方法，其中所述抗體包含單克隆抗體2C4或人源化2C4。
18.權利要求1的方法，其中所述抗體是抗體片段。
19.權利要求18的方法，其中所述抗體片段是Fab片段。
20.權利要求1的方法，其中所述抗體不與細胞毒藥物偶聯(lián)。
21.權利要求18的方法，其中所述抗體片段不與細胞毒藥物偶聯(lián)。
22.權利要求1的方法，其中所述抗體與細胞毒藥物偶聯(lián)。
23.權利要求1的方法，進一步包括向人體給藥治療有效量的第二種治療藥物，該藥物選自與ErbB2結合的第二種不同抗體、化療藥物、靶向EGFR的藥物、抗血管生成藥物、抗激素化合物、心臟保護劑和細胞因子。
24.權利要求1的方法，包括向人體給藥至少一劑所述抗體，其量從約0.5mg/kg到約10mg/kg。
25.權利要求24的方法，包括約每周給藥所述劑量。
26.權利要求24的方法，包括約每3周給藥所述劑量。
27.在人體中治療癌癥的方法，其中所述癌癥不以ErbB2受體的過度表達為特征，所述方法包括向人體給藥治療有效量的與ErbB2結合并阻斷ErbB受體的配體活化作用的抗體。
28.權利要求27的方法，其中所述癌癥是乳腺癌。
29.權利要求28的方法，其中所述癌癥是轉移性乳腺癌。
30.權利要求28的方法，進一步包括向人體給藥化療藥物。
31.權利要求30的方法，其中所述化療藥物選自蒽環(huán)霉素類抗生素、環(huán)磷酰胺、紫杉烷、新霉酰胺、xeloda、絲裂霉素C、奧沙利鉑、吉西他濱和鉑化合物。
32.在人體中治療癌癥的方法，包括向人體給藥治療有效量的(a)結合ErbB2并抑制過度表達ErbB2的癌生長的第一種抗體；(b)結合ErbB2并阻斷ErbB受體的配體活化作用的第二種抗體。
33.權利要求32的方法，其中所述第一種抗體包括單克隆抗體4D5或人源化4D5，而所述第二種抗體包括單克隆抗體2C4或人源化2C4。
34.在人體中治療癌癥的方法，其中所述癌癥選自結腸癌、直腸癌和結腸直腸癌，所述方法包括向人體給藥治療有效量的能結合ErbB2并阻斷ErbB受體的配體活化作用的抗體。
35.一種包括容器和其中組合物的產品，其中所述組合物包括結合ErbB2的抗體，該產品還包括包裝插頁，其說明所述組合物可用于治療表達生長因子受體(EGFR)的癌癥。
36.一種包括容器和其中組合物的產品，其中所述組合物包括與ErbB2結合并阻斷ErbB受體的配體活化作用的抗體，該產品還包括包裝插頁，其說明所述組合物可用于治療癌癥，其中所述癌癥的特點不是ErbB2受體的過度表達。
37.一種產品，其包括(a)第一個容器，其中含組合物，該組合物包括與ErbB2結合并抑制過度表達ErbB2的癌細胞生長的第一種抗體；(b)第二個容器，其中包含組合物，該組合物包括能與ErbB2結合并阻斷ErbB受體的配體活化作用的第二種抗體。
38.權利要求37的產品，進一步包括一種包裝插頁，其說明所述第一和第二種抗體組合物可用于治療癌癥。
39.一種產品，其包括一種容器和其中所含組合物，其中所述組合物包括與ErbB2結合并阻斷ErbB受體的配體活化作用的抗體，該產品還包括一種包裝插頁，其說明所述組合物可用于治療選自結腸癌、直腸癌和結腸直腸癌的癌癥。
40.與ErbB2結合并阻斷ErbB受體的配體活化作用的人源化抗體。
41.權利要求40的人源化抗體，其基本上以與鼠單克隆抗體2C4等效的能力結合ErbB2。
42.包括重鏈可變區(qū)(VH)的權利要求40所述人源化抗體，其中已將非人類超變區(qū)殘基引入到人VH區(qū)中，并且進一步包括在選自69H、71H和73H的位點上的框架區(qū)(FR)取代，這里利用Kabat提出的編號系統(tǒng)(1991)。
43.權利要求42所述人源化抗體，其在位點69H、71H和73H上包含F(xiàn)R取代。
44.權利要求40所述人源化抗體，其包括VH互補決定區(qū)(CDR)殘基GFTFTDYTMX(SEQ ID NO7)、DVNPNSGGSIYNQRFKG(SEQ ID NO8)和NLGPSFYFDY(SEQ ID NO9)。
45.權利要求40所述人源化抗體，其包括SEQ ID NO4中的VH區(qū)氨基酸序列。
46.權利要求40所述人源化抗體，其包括VL互補決定區(qū)(CDR)殘基KASQDVSIGVA(SEQ ID NO10)、SASYXXX(SEQ ID NO11)和QQYYIYPYT(SEQ ID NO12)。
47.權利要求40所述人源化抗體，其包括SEQ ID NO3中的VL區(qū)氨基酸序列。
48.權利要求40所述人源化抗體，其為完整的IgG1抗體。
49.權利要求40所述人源化抗體，其為抗體片段。
50.權利要求49所述人源化抗體，其為Fab片段。
51.一種親和力成熟的抗體，其與ErbB2結合并阻斷ErbB受體的配體活化作用。
52.一種組合物，其包括權利要求40所述人源化抗體和一種可藥用載體。
53.一種免疫偶聯(lián)物，其包括與細胞毒藥物偶聯(lián)的權利要求40所述人源化抗體。
54.分離的編碼權利要求40所述人源化抗體的核酸。
55.包括權利要求54所述核酸的載體。
56.包括權利要求55所述載體的宿主細胞。
57.制備人源化抗體的方法，包括培養(yǎng)權利要求56所述宿主細胞，從而使所述核酸表達。
58.權利要求57所述方法，其進一步包括從宿主細胞培養(yǎng)中回收所述人源化抗體。
59.權利要求58的方法，其中所述人源化抗體是從宿主細胞培養(yǎng)基中回收。
全文摘要
本申請描述了人源化抗ErbB2抗體,以及用抗ErbB2抗體,如人源化抗ErbB2抗體治療癌癥的方法。
文檔編號A61P35/00GK1370082SQ00811898
公開日2002年9月18日 申請日期2000年6月23日 優(yōu)先權日1999年6月25日
發(fā)明者卡梅利亞·W·亞當斯, 倫納德·G·普雷斯塔, 馬克·斯利科斯基 申請人:杰南技術公司