專利名稱：玻璃體結(jié)合蛋白受體拮抗劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物活性化合物，它抑制玻璃體結(jié)合蛋白，用于治療炎癥、癌癥和心血管疾病，例如動(dòng)脈粥樣硬化和再狹窄，和其中骨吸收是主因的疾病，例如骨質(zhì)疏松。
背景技術(shù)：
整合蛋白是細(xì)胞粘著受體的超家族，它是在各種細(xì)胞上表達(dá)的跨膜糖蛋白。這些細(xì)胞表面粘著受體包括gpIIb/IIIa(纖維蛋白原受體)和αvβ3(玻璃體結(jié)合蛋白受體)。纖維蛋白原受體gpIIb/IIIa在血小板表面表達(dá)，調(diào)解血小板聚集和在出血傷口位置形成止血凝塊。Philips等，Blood.，1988，71，831。玻璃體結(jié)合蛋白受體αvβ3在許多細(xì)胞上表達(dá)，包括內(nèi)皮的、平滑肌的、破骨的和腫瘤細(xì)胞，因此，它具有多種功能。在破骨細(xì)胞的膜上表達(dá)的αvβ3受體介導(dǎo)破骨細(xì)胞與骨基質(zhì)的粘著，是在骨吸收過(guò)程中的關(guān)鍵步驟。Ross等，J.Biol.Chem.，1987，262，7703。特征是過(guò)量骨吸收的疾病是骨質(zhì)疏松。在人體主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上表達(dá)的αvβ3受體介導(dǎo)它們向假內(nèi)膜(neointima)的移動(dòng)，一種會(huì)導(dǎo)致經(jīng)皮的冠狀血管成形術(shù)后的再狹窄。Brown等，Cardiovascular Res.，1994，28，1815。此外，Brooks等，Cell，1994，79，1157顯示αvβ3拮抗劑通過(guò)誘導(dǎo)血管源血管的細(xì)胞凋亡能夠促進(jìn)腫瘤退化。因此，阻斷玻璃體結(jié)合蛋白受體的藥物能用于治療疾病，例如骨質(zhì)疏松、再狹窄和癌癥。
現(xiàn)在已知玻璃體結(jié)合蛋白受體涉及三種不同整合蛋白，稱為αvβ1、αvβ3和αvβ5。Horton等，Int.J.Exp.Pathol.，1990，71，741。αvβ1結(jié)合纖連蛋白和玻璃體結(jié)合蛋白。αvβ3結(jié)合各種配位體，包括纖維蛋白、纖維蛋白原、層粘連蛋白、凝血酶致敏蛋白、玻璃體結(jié)合蛋白、馮維勒布蘭德氏因子、骨橋蛋白和骨涎蛋白I。αvβ5結(jié)合玻璃體結(jié)合蛋白。玻璃體結(jié)合蛋白受體αvβ5已顯示包括在各種細(xì)胞類型的細(xì)胞粘著中，包括微血管內(nèi)皮細(xì)胞，(Davis等，J.Cell.Biol.，1993，51，206)和它在血管生成中的作用已被證實(shí)。Brooks等，Science，1994，264，569。整合蛋白在人體創(chuàng)傷肉芽組織中血管中表達(dá)，但不在正常皮膚中表達(dá)。
已知玻璃體結(jié)合蛋白受體結(jié)合骨基質(zhì)蛋白質(zhì)，它含有三肽Arg-Gly-Asp(或RGD)基元。因此，Horton等，Exp.Cell Res.1991，195，368公開(kāi)了含有RGD的肽和抗玻璃體結(jié)合蛋白受體抗體(23C6)抑制牙質(zhì)的吸收和破骨細(xì)胞的細(xì)胞擴(kuò)散。此外，Sato等，J.Cell Biol.1990，111，1713公開(kāi)了echistatin，一種含有RGD序列的蛇毒液肽，是在組織中骨吸收的有效抑制劑，抑制破骨細(xì)胞與骨的附著。
我們現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)某些化合物是αvβ3和αvβ5受體的有效抑制劑。我們尤其發(fā)現(xiàn)該所述化合物是比纖維蛋白原受體更有效的玻璃體結(jié)合蛋白受體抑制劑。
發(fā)明概述本發(fā)明包括如下描述的式(I)化合物，它具有抑制玻璃體結(jié)合蛋白受體的藥物活性，用于治療炎癥、癌癥和心血管疾病，例如動(dòng)脈粥樣硬化和再狹窄，和其中骨吸收是主因的疾病，例如骨質(zhì)疏松。
本發(fā)明還提供含有式(I)化合物和藥物載體的藥物組合物。
本發(fā)明還提供治療由玻璃體結(jié)合蛋白受體介導(dǎo)的疾病的方法。在具體方面，本發(fā)明的化合物用于治療動(dòng)脈粥樣硬化、再狹窄、炎癥、癌癥和其中骨吸收是主因的疾病，例如骨質(zhì)疏松。
詳細(xì)描述本發(fā)明包括新化合物，它是比纖維蛋白原受體更有效的玻璃體結(jié)合蛋白受體抑制劑。本發(fā)明包括式(I)化合物 其中R1是Het-或Ar；R2是 或其可藥用的鹽。
本發(fā)明還包括本發(fā)明的化合物的可藥用的加成鹽和配合物。本發(fā)明的化合物具有一個(gè)或多個(gè)手性中心的情況下，除非另有說(shuō)明，本發(fā)明包括各個(gè)單個(gè)的非外消旋化合物，它可由常規(guī)技術(shù)合成和拆分。本發(fā)明優(yōu)選式(I)化合物的(S)構(gòu)型。
在其中化合物具有不飽和碳碳雙鍵時(shí)，順式(Z)和反式(E)異構(gòu)體在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在其中化合物以互變異構(gòu)的形式存在時(shí)，例如酮-烯醇互變異構(gòu)體，例如 每個(gè)互變異構(gòu)形式被認(rèn)為包括在本發(fā)明中，無(wú)論以平衡存在或通過(guò)用R’的合適取代固定。
式(I)化合物抑制玻璃體結(jié)合蛋白和其它含有RGD肽與玻璃體結(jié)合蛋白受體的結(jié)合。玻璃體結(jié)合蛋白受體對(duì)破骨細(xì)胞的抑制過(guò)程抑制破骨吸收，用于治療其中骨吸收與病理學(xué)有關(guān)的疾病，例如骨質(zhì)疏松和骨關(guān)節(jié)炎。
另一方面，本發(fā)明提供刺激骨形成的方法，其包括給藥導(dǎo)致骨鈣蛋白釋放的增加的化合物。增加的骨產(chǎn)生在其中存在礦化骨質(zhì)量的缺乏或需要骨質(zhì)重建的疾病癥狀中是明顯有效的，例如骨折愈合和預(yù)防骨折。導(dǎo)致骨結(jié)構(gòu)損失的疾病和代謝癥狀用該治療也是有效的。例如，甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)、佩吉特氏病、惡性高鈣血、骨轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的溶骨損害、由于免疫或性激素缺乏引起的骨損失、貝切特氏病、軟骨病、骨肥厚和骨硬化病通過(guò)給藥本發(fā)明的化合物是有效的。
此外，由于本發(fā)明的化合物抑制在許多不同類型細(xì)胞中的玻璃體結(jié)合蛋白受體，所述化合物能用于治療炎性疾病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和牛皮癬，和心血管疾病，例如動(dòng)脈粥樣硬化和再狹窄。本發(fā)明的式(I)化合物可用于治療和預(yù)防其它疾病，包括，但不限于，血栓栓塞綜合病癥、哮喘、變態(tài)反應(yīng)、成人呼吸窘迫綜合癥、對(duì)宿主疾病移植、器官移植排斥、膿毒性的休克、濕疹、接觸性皮炎、炎性腸病和其它自身免疫疾病。本發(fā)明的化合物還可用于創(chuàng)傷愈合。
本發(fā)明的化合物還用于治療，包括預(yù)防，血管源疾病。用于本文的術(shù)語(yǔ)血管源疾病包括包含不正常新血管形成的癥狀。在新血管形成是與疾病有關(guān)的病理學(xué)的原因或有關(guān)時(shí)，血管生成的抑制將降低疾病的有害作用。該疾病目標(biāo)的實(shí)例是糖尿病性視網(wǎng)膜病。當(dāng)新血管的生長(zhǎng)需要支持有害組織的生長(zhǎng)時(shí)，血管生成的抑制將降低向組織的血液供給，從而有助于基于供血需要的組織質(zhì)量。實(shí)例包括其中為腫瘤生長(zhǎng)和固體腫瘤轉(zhuǎn)移的確立，新血管形成是連續(xù)需要的腫瘤生長(zhǎng)。因此，本發(fā)明的化合物抑制腫瘤組織血管生成，從而預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移和腫瘤生長(zhǎng)。
因此，根據(jù)本發(fā)明的方法，使用本發(fā)明的化合物的血管生成的抑制可改善疾病癥狀，在某些情況下可治愈疾病。
本發(fā)明的化合物的另一治療目標(biāo)是以新血管生成為特征的眼疾病。該眼疾病包括角膜新血管疾病，例如角膜移植術(shù)、皰疹性角膜炎、梅毒角膜炎、翼狀胬肉和與隱形眼鏡有關(guān)的新血管角膜翳。其它眼疾病還包括與年齡有關(guān)的黃斑變性視網(wǎng)膜、假眼組織胞漿菌病、早熟視網(wǎng)膜病和青光眼。
本發(fā)明還提供抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法，其包括逐步或以物理結(jié)合形式給藥式(I)化合物和抗腫瘤藥，例如托泊替堪和順鉑。
對(duì)于式(I)，合適的R1是 其中R’是C1-4烷基和R”是苯基、芐基或-CH2CF3；或R’和R”連接形成嗎啉環(huán)。
合適的R2是 本發(fā)明的新化合物的代表如下(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]-1-乙氧基]苯基]-3-[4-(三氟甲基)苯基]丁酸；(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]-1-乙氧基]苯基]-3-[4-[(N-甲基-N-苯基氨基)羰基]-1，3-噁唑-2-基]丁酸；(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]-1-乙氧基]苯基]-3-[4-[(嗎啉-4-基)羰基]-1，3-噁唑-2-基]丁酸；(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]-1-乙氧基]苯基]-3-[4-[[N-甲基-N-(2，2，2-三氟乙基)氨基]羰基]-1，3-噁唑-2-基]丁酸；(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]-1-乙氧基]苯基]-3-[4-(三氟甲基)噻唑-2-基]丁酸；
(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]-1-乙氧基]苯基]-3-(3-甲基噻唑-2-基)丁酸；(S)-3-(3-氟苯基)-4-[4-[2-(5，6，7，8-四氫-1，8-萘啶-2-基)乙氧基]苯基]丁酸；(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]乙氧基]苯基]-3-(吡啶-3-基)丁酸；(S)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]乙氧基]苯基]-3-(吡啶-3-基)丁酸；和(S)-3-(吡啶-3-基)-4-[4-[2-(5，6，7，8-四氫-1，8-萘啶-2-基)乙氧基]苯基]丁酸；或其可藥用的鹽。
在本發(fā)明的化合物具有一個(gè)或多個(gè)手性中心的情況下，除非另有說(shuō)明，本發(fā)明包括各個(gè)單個(gè)的非外消旋化合物，它可由常規(guī)技術(shù)合成和拆分。
在化合物含有不飽和碳-碳雙鍵的情況下，順式(Z)和反式(E)異構(gòu)體在本發(fā)明的范圍。在任何一種情況下的任何取代基的含義與其含義或在任何其它情況下的任何其它取代基的含義無(wú)關(guān)。
同時(shí)包括在包括本發(fā)明中的是本發(fā)明的化合物的前藥，前藥被認(rèn)為是任何共價(jià)結(jié)合的載體，它在體內(nèi)釋放式(I)的活性母體藥物。因此，在本發(fā)明的另一方面是新前藥，它是在制備式(Ia)化合物中式(II)的中間體。
通常用于肽和化學(xué)技術(shù)中的縮寫(xiě)和符號(hào)用于本文以描述本發(fā)明的化合物。通常氨基酸縮寫(xiě)按照在Eur.J.Biochem.，158，9(1984)中所述的IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature。
用于本文的C1-4烷基是指1-4個(gè)碳原子的選擇性地取代的烷基，包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基和叔丁基。任何C1-4烷基可選擇性地被基團(tuán)Rx取代，Rx可在任何碳原子上形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，和由常規(guī)合成技術(shù)得到。Rx的合適基團(tuán)是C1-4烷基、OR*、SR*、C1-4烷基磺?；?、C1-4烷基亞硫?；?sulfoxyl)、-CN、N(R*)2、CH2N(R*)2、-NO2-、-CF3、-CO2R*、-CON(R*)2、-COR*、-SO2N(R*)2、-NR*C(O)R*、F、Cl、Br、I或CF3S(O)r-，其中r是0、1或2，和R*是H、C1-4烷基、苯基或芐基。
鹵素或鹵代是指F、Cl、Br和I。
用于本文的Ar或芳基是指苯基或萘基，或被1-3個(gè)取代基，例如用于如上烷基定義的取代基，尤其是C1-4烷基、C1-4烷氧基、C1-4烷硫基、CF3、NH2、OH、F、Cl、Br和I取代的苯基或萘基。
Het，或雜環(huán)表示選擇性地取代的5或6元單環(huán)或9或10元雙環(huán)，其含有1-3個(gè)選自氮、氧和硫的雜原子，它們是穩(wěn)定的和由常規(guī)化學(xué)合成得到。說(shuō)明性的雜環(huán)是苯并呋喃、苯并咪唑、苯并吡喃、苯并噻吩、苯并噻唑、呋喃、咪唑、吲哚、嗎啉、哌啶、哌嗪、吡咯、吡咯烷、四氫吡啶、吡啶、噻唑、噁唑、噻吩、喹啉、異喹啉、和四氫和全氫喹啉和異喹啉。在Het環(huán)上至多3個(gè)取代基的任何可使用的組合，例如用于烷基的如上定義的通過(guò)化學(xué)合成可得到的和穩(wěn)定的基團(tuán)在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
某些基團(tuán)在本文中用縮寫(xiě)表示。t-Bu是指叔丁基，Boc是指叔丁氧基羰基，F(xiàn)moc是指芴基甲氧基羰基，Ph是指苯基，Cbz是指芐氧基羰基，Bn是指芐基，Me是指甲基，Et是指乙基，Ac是指乙?；珹lk是指C1-4烷基，Nph是指1-或2-萘基和cHex是指環(huán)己基，Tet是指5-四唑基。
某些試劑在本文中用縮寫(xiě)表示。DCC是指二環(huán)己基碳化二亞胺，DMAP是指二甲基氨基吡啶，DIEA是指二異丙基乙胺，EDC是指1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺，鹽酸鹽，HOBt是指1-羥基苯并三唑，THF是指四氫呋喃，DIEA是指二異丙基乙胺，DEAD是指偶氮二羧酸二乙酯，PPh3是指三苯基膦，DIAD是指偶氮二羧酸二異丙酯，DMF是指二甲基甲酰胺，NBS是指N-溴琥珀亞胺，Pd/C是指鈀/碳催化劑，PPA是指多磷酸，DPPA是指二苯基磷酰疊氮化物，BOP是指苯并三唑-1-基氧基-三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸鹽，HF是指氫氟酸，TEA是指三乙胺，TFA是指三氟乙酸，PCC是指氯鉻酸吡啶鎓。
本發(fā)明的化合物用方案I-VI中描述的一般方法制備。
方案I (a)CH3NH(OCH3).HCl，EDC，HOBt.H2O，Et3N，DMF；(b)4-溴三氟甲苯，sec-BuLi，THF；(c)(EtO)2P(O)CH2CO2Et，NaH，甲苯；(d)H2，10％Pd/C，EtOH；(e)BBr3，CH2Cl2；(f)6-(甲基氨基)-2-吡啶基乙醇，DIAD，(Ph)3P，THF；(g)1.0NNaOH，MeOH，隨后酸化。
根據(jù)Weinreb(Tetrahedron Lett.1981，22，3815)的一般方法，通過(guò)使相應(yīng)的N-甲氧基-N-甲基酰胺(I-2)與金屬芳烴衍生物反應(yīng)，合適的烷氧基苯基乙酸，例如4-甲氧基苯基乙酸(I-1)轉(zhuǎn)化為脫氧苯偶姻I-3?；衔颕-3通過(guò)熟知的Wittig反應(yīng)轉(zhuǎn)化為α，β-不飽和酯I-4。反應(yīng)選擇性地使用膦?；宜崛阴ピ诤线m堿，通常是氫化鈉或二(三甲基甲硅烷基)氨基鋰存在下，在非質(zhì)子傳遞溶劑，例如甲苯、THF或它們的混合物中進(jìn)行。I-4的烯基的還原選擇性地通過(guò)在鈀催化劑，例如在活性炭上的鈀存在下，在合適溶劑，例如乙酸乙酯、甲醇、乙醇、異丙醇或它們的混合物中氫化完成。I-5的甲基醚可用三溴化硼(BBr3)，在惰性溶劑，優(yōu)選二氯甲烷中或用乙硫醇(EtSH)和三氯化鋁(AlCl3)在惰性溶劑，例如二氯甲烷中斷裂。用于除去甲基醚保護(hù)基團(tuán)的其它有用方法在Greene，“有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)”(Wiley-Interscience出版)中描述。得到的酚I-6與6-(甲基氨基)-2-吡啶基乙醇按照Mitsunobu型偶合反應(yīng)(有機(jī)反應(yīng)1992，42，335-656；合成1981，1-28)進(jìn)行反應(yīng)得到I-7。反應(yīng)通過(guò)在偶氮二羧酸二酯，例如偶氮二羧酸二乙酯或偶氮二羧酸二異丙酯和三苯基膦之間形成配合物作為媒介(mediate)，在非質(zhì)子傳遞溶劑，例如THF、二氯甲烷或DMF中進(jìn)行。I-7的乙基酯使用含水堿，例如LiOH在含水THF或NaOH在含水甲醇或乙醇中水解，中間體羧酸鹽用合適的酸，例如TFA或HCl酸化以得到羧酸I-8。此外，中間體羧酸鹽可根據(jù)需要分離，或游離羧酸的羧酸鹽可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法制備。
方案II (a)三異丙基甲硅烷基氯，咪唑，DMF；(b)3-(芐氧基羰基)-3-丁烯酸甲酯，Pd(OAc)2，P(tol)3，(i-Pr)2NEt，丙腈；(c)H2，10％Pd/C，EtOAc；(d)絲氨酸芐基酯鹽酸鹽，EDC，HOBt.H2O，Et3N，DMF；(e)Burgess試劑，THF；(f)Cl3CBr，DMU，CH2Cl2；(g)TBAF，THF；(h)(Boc)2O，吡啶，THF；(i)H2，10％Pd/C，EtOH；(j)N-甲基苯胺，EDC，BPFFH，(i-Pr)2NEt，吡啶，DMF；(k)4N HCl/二烷；(l)6-(甲基氨基)-2-吡啶基乙醇，DIAD，(Ph)3P，THF；(m)LiOH，THF，H2O，隨后酸化。
鹵代酚衍生物，例如4-溴苯酚(II-1)轉(zhuǎn)化為合適的保護(hù)的衍生物，例如4-溴-1-(三異丙基甲硅烷氧基)苯(II-2)。用于苯酚的保護(hù)基團(tuán)必須與隨后的化學(xué)相容，還必須通過(guò)在需要時(shí)進(jìn)選擇性地除去。用于保護(hù)苯酚的方法在標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)，例如Greene，“有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)”(Wiley-Interscience出版)中描述?；衔颕I-2與3-(芐氧基羰基)-3-丁烯酸甲酯按照Heck型反應(yīng)(參見(jiàn)Heck，Org.Reations，1982，27，345)進(jìn)行反應(yīng)得到II-3。反應(yīng)用鈀(0)物質(zhì)作為媒介，通常在惰性溶劑，例如乙腈、丙腈或甲苯中，在合適酸清除劑，例如三乙胺(Et3N)或二異丙基乙胺((i-Pr)2NEt)存在下進(jìn)行。鈀(0)物質(zhì)的通常來(lái)源包括乙酸鈀(II)(Pd(OAc)2)和氯化鈀(PdCl2)，有時(shí)包括膦配位體，例如三苯基膦((Ph)3P)或三鄰甲苯基膦(P(tol)3)。α，β-不飽和酯II-3通過(guò)與氫氣在合適催化劑，優(yōu)選在活性炭上的鈀金屬(Pd/C)存在下，在惰性溶劑，例如甲醇、乙醇、乙酸乙酯或它們的混合物中反應(yīng)還原為飽和化合物II-4。II-4的羧酸使用例如EDC和HOBt、SOCl2或1，1’羰基二咪唑(CDI)轉(zhuǎn)化為活性形式，活化形式隨后與合適的胺，例如絲氨酸芐基酯，在合適溶劑，例如DMF中反應(yīng)得到II-5。根據(jù)是否需要酸中和，加入堿，例如可使用三乙胺(Et3N)或二異丙基乙胺((i-Pr)2NEt)或吡啶。已知將羧酸轉(zhuǎn)化為酰胺的許多其它方法，可在標(biāo)準(zhǔn)參考書(shū)，例如“Compendium of Organic Synthetic Methods”，Vol.I-Vi(由Wiley-Interscience出版)或Bodansky，“The Practice of PeptideSynthesis”(由Springer-Verlag出版)中找到。II-5隨后轉(zhuǎn)化為唑衍生物II-7。已知用于將酰氨基醇轉(zhuǎn)化為唑的若干方法(Meyers，Tetrahedron 1994，50，2297-2360；Wipf，J.Org.Chem.1993，58，3604-3606)。例如，酰氨基醇II-5可首先轉(zhuǎn)化為 唑啉II-6，該轉(zhuǎn)化過(guò)程通常在脫水條件下，例如在THF中與Burgess試劑反應(yīng)完成。唑啉II-6隨后使用，例如在二氯甲烷中的溴三氯甲烷和DBU(Williams，Tetrahedron Letters 1997，38，331-334)或在合適溶劑，例如乙酸乙酯/氯仿或二氯甲烷中的CuBr2和DBU(Barrish，J.Org.Chem.1993，58，4494-4496)氧化為 唑II-7。在標(biāo)準(zhǔn)氟化物條件(參見(jiàn)上述Greene)下除去甲硅烷基保護(hù)基團(tuán)得到酚II-8，它使用焦碳酸二叔丁基酯(di-tert-butyldicarbonate)，在堿，通常吡啶存在下，在極性，中性溶劑，例如THF中轉(zhuǎn)化為叔丁氧基碳酸酯衍生物II-9。該新保護(hù)基團(tuán)如上所述選擇。化合物II-9通過(guò)如上所述氫化轉(zhuǎn)化為羧酸衍生物II-10，II-10根據(jù)Carpino和Ayman的一般方法(J.Am.Chem.Soc.1995，117，5401-5402)轉(zhuǎn)化為酰胺II-11。在這些條件下，羧酸II-10與合適的胺，例如N-甲基苯胺，在二(四亞甲基)氟甲脒六氟磷酸鹽(BPFFH)和合適堿，一般為例如Et3N或(i-Pr)2NEt、吡啶或它們的混合物存在下，在極性，中性溶劑，例如DMF中反應(yīng)。叔丁氧基氨基甲酸酯保護(hù)基團(tuán)在標(biāo)準(zhǔn)酸性條件下(參見(jiàn)上述Greene)除去，得到的II-12通過(guò)方案I中描述的方法轉(zhuǎn)化為II-14。
方案III (a)EtOH，回流；(b)4-(芐氧基)苯甲醛，NaOEt，EtOH；(c)Al2O3，NaOCl，CH3CN；(d)Et3SiH，BF3.OEt2，CH2Cl2；(e)n-Bu4NF，THF；(f)(EtO)2P(＝O)CH2CO2Et，NaH，THF，回流；(g)Mg，MeOH；(h)BF3.OEt2，EtSH；(i)6-(甲基氨基)-2-吡啶基乙醇，DIAD，(Ph)3P，THF；(j)LiOH，THF， H2O，隨后酸化。
噻唑衍生物III-3通過(guò)在回流乙醇中縮合2-氰基乙酰胺(III-1)和3-溴-1，1，1-三氟丙酮(III-2)制備，用Schaefer和Gewald的方法的合適改進(jìn)(J.Prakt.Chem.1974，316，684-692)制備4-苯基-2-(氰基甲基)噻唑。III-3與合適取代的苯甲醛衍生物，例如4-(芐氧基)苯甲醛醇醛縮合得到III-4。反應(yīng)用合適堿，優(yōu)選乙醇鈉催化反應(yīng)，在極性溶劑，通常乙醇中進(jìn)行。III-4環(huán)氧化得到III-5根據(jù)Foucaud的一般方法(Synthesis 1987，9，854-856)用次氯酸鈉在中性鋁存在下完成。也可以使用其它熟知的環(huán)氧化條件，例如mCPBA，堿性過(guò)氧化氫或堿性叔丁基氫過(guò)氧化物，只要條件與物質(zhì)中的官能團(tuán)相容。在合適路易斯酸，例如BF3.OEt2或合適質(zhì)子酸，例如TFA或HCl存在下與三乙基甲硅烷接觸，III-5的環(huán)氧化物環(huán)以高區(qū)域選擇性方式還原開(kāi)環(huán)得到酮III-6，與III-6的相應(yīng)三甲基甲硅烷基氰醇。該氰醇在合適溶劑，通常THF中與氟化四丁基銨接觸方便地轉(zhuǎn)化為酮III-6。該酮與磷?；宜崛阴ピ诤线m堿，例如LiN(TMS)2或NaH，在極性，非質(zhì)子傳遞溶劑，優(yōu)選THF中按照Wittig型反應(yīng)進(jìn)行反應(yīng)得到α，β-不飽和酯III-7，為烯烴異構(gòu)體的混合物。在與甲醇中的鎂金屬反應(yīng)后，III-7的烯烴選擇性地還原得到飽和衍生物III-8。乙酯在這些條件下轉(zhuǎn)化為甲酯，芐基的除去用乙硫醇和BF3.OEt2進(jìn)行，得到酚III-9，它根據(jù)方案I中描述的方法轉(zhuǎn)化為III-10。
方案IV (a)BnCl，K2CO3，丙酮；(b)5-甲基噻唑，n-BuLi，THF；(c)(EtO)2P(＝O)CH2CO2Et，NaH，THF；(d)Mg，MeOH；(e)BF3·OEt2，EtSH；(f)6-(甲基氨基)-2-吡啶基乙醇，DIAD，(Ph)3P，THF；(g)LiOH，THF，H2O，隨后酸化。
商業(yè)上獲得的4-羥基苯基乙酸甲酯(V-1)的酚基用合適的保護(hù)基團(tuán)，例如甲基醚、芐基醚或三異丙基甲硅烷基醚保護(hù)。酚的保護(hù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的，代表性的保護(hù)基團(tuán)在標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)，例如Greene，“有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)”(Wiley-Interscience出版)中描述。得到的化合物(IV-2)與合適的格利雅或有機(jī)鋰試劑反應(yīng)得到酮。例如由5-甲基噻唑和正丁基鋰制備的2-鋰代-5-甲基噻唑與IV-2在醚溶劑，例如THF或DME中反應(yīng)得到酮衍生物IV-3。該酮隨后根據(jù)方案III中描述的方法轉(zhuǎn)化為IV-6。
方案V (a)TBDMSCl KCN，ZnI2，CH3CN；(b)LDA，THF然后4-芐氧基芐基氯；(c)TBAF，THF；(d)(EtO)2P(＝O)CH2CO2Et，NaH，THF；(e)H2，Pd/C，EtOH；(f)6-(甲基氨基)-2-吡啶基乙醇，DIAD，(Ph)3P，THF；(g)LiOH，THF，H2O，隨后酸化。
選擇的芳香醛，例如3-吡啶甲醛(V-1)，通過(guò)與氰化物離子在合適甲硅烷基鹵，例如三甲基甲硅烷基氯(TMSCl)、三異丙基甲硅烷基氯(TIPSCl)或叔丁基二甲基甲硅烷基氯(TBDMSCl或TBSCl)存在下反應(yīng)轉(zhuǎn)化為甲硅烷基保護(hù)的氰醇，例如V-2。氰化物離子的典型來(lái)源包括氰化鉀(KCN)、氰化鈉(NaCN)和氰化四丁基銨(Bu4NCN)，反應(yīng)通常在催化量的路易斯酸，通常ZnI2存在下進(jìn)行，優(yōu)選極性非質(zhì)子傳遞溶劑，例如乙腈(CH3CN)?？墒褂闷渌Ｗo(hù)的氰醇，例如乙氧基乙基-保護(hù)的氰醇，只要保護(hù)基團(tuán)與隨后的化學(xué)相容，可在需要時(shí)選擇性地除去。保護(hù)基團(tuán)的討論可在標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)，例如Greene，“有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)”(Wiley-Interscience出版)中找到?；衔颲-2用合適的芐基鹵，例如4-芐氧基芐基氯C-烷基化得到V-3。反應(yīng)包括最初的脫質(zhì)子以得到中間體陰離子，它不用分離，而是就地與烷基化劑反應(yīng)。用于這類反應(yīng)的典型堿包括二異丙基氨基鋰(LDA)和六甲基二硅氮化鋰(LiN(TMS)2)，優(yōu)選極性，非質(zhì)子傳遞溶劑，例如THF或DME。V-3的TBS氰醇通過(guò)與氟化四丁基銨(TBAF)方便地轉(zhuǎn)化為酮V-4。兩步方法也可用于進(jìn)行該轉(zhuǎn)化過(guò)程。例如，V-3的甲硅烷基保護(hù)基團(tuán)可在酸性條件，例如通過(guò)與HF反應(yīng)除去以得到氰醇，它可通過(guò)與合適的堿反應(yīng)轉(zhuǎn)化為酮V-4。化合物V-4通過(guò)熟知的Wittig反應(yīng)轉(zhuǎn)化為α，β-不飽和酯V-5。反應(yīng)通常使用膦?；宜崛阴ピ诤线m堿，通常是氫化鈉(NaH)或LiN(TMS)2存在下，在非質(zhì)子傳遞溶劑，例如甲苯、THF或它們的混合物中進(jìn)行。V-5的烯基的還原選擇性地通過(guò)在鈀催化劑，例如在活性炭上的鈀存在下，在合適溶劑，例如乙酸乙酯、甲醇、乙醇、異丙醇或它們的混合物中氫化來(lái)進(jìn)行。在這些條件下還可除去酚上的芐基保護(hù)基團(tuán)。得到的酚V-5與6-(甲基氨基)-2-吡啶基乙醇按照Mitsunobu型偶合反應(yīng)(有機(jī)反應(yīng)1992，42，335-656；合成1981，1-28)進(jìn)行反應(yīng)得到V-7。反應(yīng)通過(guò)在偶氮二羧酸二酯，例如偶氮二羧酸二乙酯或偶氮二羧酸二異丙基酯和三苯基膦之間形成配合物作為媒介，通常在非質(zhì)子傳遞溶劑，例如THF、二氯甲烷或DMF中進(jìn)行。V-7的乙基酯使用含水堿，例如在含水THF或NaOH在含水二烷、THF、甲醇或乙醇中的LiOH或NaOH水解，中間體羧酸鹽用合適的酸，例如TFA或HCl酸化以得到羧酸V-8。如果需要，可分離中間體羧酸鹽，此外，羧酸的合適鹽或胺可通過(guò)本領(lǐng)域中技術(shù)人員熟知的方法制備。
方案VI (a)丙烯酰氯，(i-Pr)2NEt，Cucl，CH2Cl2；(b)3-溴吡啶，Pd(OAc)2，P(tcol)3，(i-Pr)2NEt，DMF；(c)4-甲氧基芐基氯化鎂，ZnI2，CuBr·DMF，THF，甲苯；(d)NaOEt，THF；(e)AlCl3，EtSH，CH2Cl2；(f)6-(甲基氨基)-2-吡啶基乙醇，DIAD，(Ph)3P，THF，(g)NaOH，二烷，H2O，然后酸化。
商業(yè)得到的(4S，5R)-1，5-二甲基-4-苯基-2-咪唑烷酮(VI-1)與合適的α，β-不飽和酰氯，例如丙烯酰氯反應(yīng)得到酰亞胺VI-2。反應(yīng)通過(guò)合適的堿，通常三乙胺(Et3N)或二異丙基乙胺((i-Pr)2NEt)作為媒介，在催化量的鹵化銅，例如氯化銅(I)存在下進(jìn)行。優(yōu)選中性溶劑，例如二氯甲烷?；衔颲I-2與合適的芳基鹵，例如3-溴吡啶以Heck型反應(yīng)(參見(jiàn)Heck，Org.Reations，1982，27，345)進(jìn)行反應(yīng)得到VI-3。反應(yīng)用鈀(0)物質(zhì)作為媒介，通常在惰性溶劑，例如乙腈、丙腈、甲苯或DMF中，在合適酸清除劑，例如三乙胺(Et3N)或二異丙基乙胺((i-Pr)2NEt)存在下進(jìn)行。鈀(0)物質(zhì)的通常來(lái)源包括乙酸鈀(II)(Pd(OAc)2)和氯化鈀(PdCl2)，有時(shí)包括 膦配位體，例如三苯基膦((Ph)3P)或三鄰甲苯基膦(P(tol)3)。化合物VI-3與有機(jī)銅物質(zhì)以1，4-加成反應(yīng)進(jìn)行反應(yīng)得到共軛加成產(chǎn)物VI-4(參見(jiàn)Melnyk，O.；Stephan，E.；Pourcelot，G.；Gresson，P.Tetrahedron 1992，48，841-850；Bongini，A.；Cardillo，G.；Mingardi，A.，Tomasini，C.Tetrahedron Asymmetry 1996，7，1457-1466；van Heerden，P.S.；Bezuidenhoudt，B.C.B.；Ferreira，D.Tetrahedron Lett.1997，38，1821-1824。關(guān)于有機(jī)銅反應(yīng)，參見(jiàn)Posner，G.Organic Reactions 1972，19，1-113；Lipshutz，B.Organic Reactions 1992，41，135-631)。有機(jī)銅物質(zhì)的產(chǎn)生可通過(guò)將有機(jī)鋰或有機(jī)鎂試劑，例如4-甲氧基芐基氯化鎂加入銅(I)源，例如CuCl，CuBr.DMS或CuI在惰性溶劑，例如Et2O、THF、DME、甲苯或它們的混合物中進(jìn)行。反應(yīng)的非對(duì)映選擇性通過(guò)某些路易斯酸，例如MgBr2，Bu2BOTf或ZnI2提高。VI-4的手性輔助物通過(guò)在堿條件下乙醇分解方便地除去。例如VI-4在THF中用乙醇鈉處理得到VI-5。VI-5的甲基醚可用三溴化硼(BBr3)，在惰性溶劑，優(yōu)選二氯甲烷中或用乙硫醇(EtSH)和三氯化鋁(AlCl3)在惰性溶劑，例如二氯甲烷中斷裂，得到酚V1-6。用于除去甲基醚保護(hù)基團(tuán)的其它有用方法在標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)(參見(jiàn)方案V)中描述。酚VI-6如方案V中所述方法轉(zhuǎn)化為VI-8。
用于本文的酰胺偶合試劑是指可用于形成肽鍵的試劑。典型偶合方法使用碳化二亞胺、活性酐和酯和酰鹵。試劑，例如EDC、DCC、DPPA、BOP試劑、HOBt、N-羥基琥珀酰亞胺和草酰氯是常見(jiàn)的。
形成肽鍵的偶合方法通常是本領(lǐng)域中已知的。肽合成方法由Bodansky等，THE PRACTICE OF PEPTIDE SYNTHESIS，Springer-Verlag，Berlin，1984中一般說(shuō)明，Ali等，J.med.Chem.29，984(1986)和J.Med.Chem.，30，2291(1987)是技術(shù)的舉例說(shuō)明，列為本文參考文獻(xiàn)。
通常胺或苯胺經(jīng)其自由氨基與合適的羧酸物質(zhì)使用合適的碳化二亞胺偶合試劑，例如N，N’-二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)，選擇性地在催化劑，例如1-羥基苯并三唑(HOBt)和二甲基氨基吡啶(DMAP)存在下偶合。其它方法也是合適的，例如形成合適保護(hù)的酸物質(zhì)的自由羧基的活性酯、酐或酰鹵，隨后與合適保護(hù)的胺的自由胺，選擇性地在堿存在下反應(yīng)。例如，保護(hù)的Boc-氨基酸或Cbz-脒基苯甲酸在無(wú)水溶劑，例如二氯甲烷或四氫呋喃(THF)中在堿，例如N-甲基嗎啉，DMAP或三烷基胺存在下，用氯甲酸異丁基酯處理以形成“活性酐”，它隨后與第二種保護(hù)的氨基酸或苯胺的自由胺反應(yīng)。
用于其中R2是苯并咪唑的式(I)化合物的有用中間體在Nestor等的J.Med.Chem.1984，27，320中公開(kāi)，用于制備用作本發(fā)明中間體的苯并咪唑化合物的典型方法是本領(lǐng)域中已知的，可以在例如EP-A0381033中找到。
本發(fā)明化合物的酸加成鹽以標(biāo)準(zhǔn)方法在合適溶劑中由母體化合物和過(guò)量酸，例如鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、硫酸、磷酸、乙酸、三氟乙酸、馬來(lái)酸、琥珀酸或甲磺酸制備。某些化合物形成內(nèi)鹽或兩性離子，它們是可接受的。陽(yáng)離子鹽通過(guò)用過(guò)量的含有合適陽(yáng)離子的堿性試劑，例如氫氧化物、碳酸鹽或醇鹽，或用合適有機(jī)胺處理母體化合物制備。陽(yáng)離子，例如Li+、Na+、K+、Ca++、Mg++、NH4+是在可藥用的鹽中存在的陽(yáng)離子的具體實(shí)例。
本發(fā)明還提供藥物組合物，它含有式(I)化合物和可藥用的載體。因此，式(I)化合物可用于生產(chǎn)藥物。如上所述制備的式(I)化合物的藥物組合物可配制成用于腸胃外給藥的溶液或凍干粉末。粉末在使用前通過(guò)加入合適稀釋劑或其它可藥用的載體重新組成。液體制劑可以是緩沖的、等滲的含水溶液。合適的稀釋劑的實(shí)例是標(biāo)準(zhǔn)等滲鹽水溶液、在水或緩沖的乙酸鈉或乙酸銨溶液中的標(biāo)準(zhǔn)5％葡萄糖。該制劑尤其適用于腸胃外給藥，但還可用于口服給藥或包括在用于吹入法的計(jì)量吸收器或噴霧器中。合乎需要的是加入賦形劑，例如聚乙烯基吡咯烷酮、明膠、羥基纖維素、阿拉伯膠、聚乙二醇、甘露糖醇、氯化鈉或檸檬酸鈉。
此外，這些化合物可被制成用于口服的膠囊、片劑或制成乳劑或糖漿?？伤幱玫墓腆w或液體載體可加入以提高或穩(wěn)定組合物或有利于組合物的制備。固體載體包括淀粉、乳糖、磷酸鈣二水合物、白土、硬脂酸鎂或硬脂酸、滑石、果膠、阿拉伯膠、瓊脂或明膠。液體載體包括糖漿、花生油、橄欄油、鹽水和水。載體還可包括延遲釋放的物質(zhì)，例如單獨(dú)的甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯或與蠟的混合物。固體載體的數(shù)量可以變化，但優(yōu)選為每劑量單位約20mg-約1g。藥物制劑根據(jù)制藥業(yè)的常規(guī)技術(shù)制備，包括用于片劑形式的研磨、混合、造粒，和根據(jù)需要的壓制；或用于硬明膠膠囊的研磨、混合和填充。當(dāng)液體載體使用時(shí)，制劑將是糖漿、酏劑、乳劑或含水或非水懸浮液形式。該液體制劑可直接地經(jīng)口給藥或填充在軟膠膠膠囊中。
為用于直腸給藥，本發(fā)明的化合物還可與賦形劑，例如可可脂、甘油、明膠或聚乙二醇混合，模制成栓劑。
本文描述的化合物是玻璃體結(jié)合蛋白受體的拮抗劑，用于治療其中基礎(chǔ)病理取決于與玻璃體結(jié)合蛋白受體反應(yīng)的配體或細(xì)胞的疾病。例如這些化合物用于治療其中骨基質(zhì)的損失產(chǎn)生病狀的疾病。因此，本發(fā)明的化合物用于治療骨質(zhì)疏松、甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)、佩吉特氏病、惡性高鈣血、骨轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的溶骨損害、由于免疫或性激素缺乏引起的骨損失。本發(fā)明的組合物還被認(rèn)為具有作為抗腫瘤、抗生成血管、消炎和抗轉(zhuǎn)移藥物的作用，用于治療動(dòng)脈粥樣硬化和再狹窄。
化合物口服或腸胃外地以足以抑制骨吸收或其它該適應(yīng)征的藥物濃度的方式向患者給藥。含有本發(fā)明化合物的藥物組合物以與患者病癥一致的方式以約0.1-約50mg/kg的口服劑量給藥。優(yōu)選口服劑量將是約0.5-約20mg/kg。對(duì)于急性治療，優(yōu)選腸胃外給藥。在水或標(biāo)準(zhǔn)鹽水中的5％葡萄糖中的肽的靜脈內(nèi)輸注或用合適賦形劑的類似制劑是最有效的，雖然肌內(nèi)bolus注射也是有用的。通常，腸胃外劑量將是約0.01-約100mg/kg；優(yōu)選0.1-20mg/kg?；衔锩刻煲砸欢拷o藥1-4次以達(dá)到約0.4-約400mg/kg/天的總?cè)談┝??；衔锝o藥的精確數(shù)量和方法由本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過(guò)比較藥物的血液含量與具有治療效果所需的濃度容易地確定。
本發(fā)明還提供治療骨質(zhì)疏松或抑制骨損失的方法，其包括以逐步或物理結(jié)合形式給藥式(I)化合物和骨吸收的其它抑制劑，例如二膦酸鹽(即allendronate)、激素置換治療劑、抗雌激素或降鈣素。此外，本發(fā)明提供使用本發(fā)明的化合物和組成代謝藥物，例如骨形態(tài)形成蛋白質(zhì)、異丙氧黃酮的治療方法，用于預(yù)防骨損失和/或增加骨質(zhì)量。
此外，本發(fā)明提供抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法，其包括以逐步或物理結(jié)合形式給藥式(I)化合物和抗腫瘤藥。喜樹(shù)堿類化合物，例如托泊替堪、irinotecan和9-氨基喜樹(shù)堿，和鉑配位配合物，例如順鉑、ormaplatin、和tetraplatin是熟知的抗腫瘤藥。喜樹(shù)堿類化合物在US5004758、4604463、4473692、4545880、4342776、4513138、4399276、EP0418099和0088642，Wani等的J.Med.Chem.，1986，29，2358，Wani等的J.Med.Chem.，1980，23，554，Wani等的J.Med.Chem.，1987，30，1774和Nitta等，Proc.14th International Congr.Chemotherapy.，1985，Anticancer Section 1，28，每篇的全部?jī)?nèi)容列為本文參考文獻(xiàn)。鉑配位配合物，順鉑以名稱Platinol由Bristol Myers-SquibbCorporation得到。用于順鉑的有用制劑在US5562925和4310515中描述，其全文列為本文參考文獻(xiàn)。
在包括以逐步或物理結(jié)合形式給藥式(I)化合物和抗腫瘤藥的抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法中，鉑配位化合物，例如順鉑采用緩慢靜脈內(nèi)輸注給藥。優(yōu)選的載體是含有甘露糖醇的葡萄糖/鹽水溶液。鉑配位化合物的劑量時(shí)間表可以每治療過(guò)程約1-約500mg/平方米(mg/m2)身體表面。鉑配位化合物的輸入可每周1-2次，每周治療可重復(fù)若干次。在腸胃外給藥中使用喜樹(shù)堿類化合物，通常采用的治療過(guò)程是約0.1-約300.0mg/m2身體表面積/天，約連續(xù)5日。更優(yōu)選托泊替堪采用的治療過(guò)程是約1.0-約2.0mg/m2身體表面積/天，約連續(xù)5日。治療過(guò)程優(yōu)選以約7天-約28天間隔重復(fù)至少1次。
藥物組合物可在相同容器中用式(I)化合物和抗腫瘤藥配制，但是優(yōu)選在不同容器中配制。兩種藥物以溶液形式提供時(shí)，它們可包含在用于同時(shí)給藥或以一前一后排列方式包含在輸注/注射系統(tǒng)中。
為方便在相同或不同時(shí)間給藥式(I)化合物和抗腫瘤藥，制備試劑盒，包括在單一容器，例如盒、卡紙盒或其它容器、單個(gè)瓶、袋、小瓶或其它容器中的每個(gè)含有有效量的如上所述用于腸胃外給藥的式(I)化合物和如上所述的用于腸胃外給藥的有效量的抗腫瘤藥。該試劑盒可包括，例如在單獨(dú)容器或相同容器中的藥物，選擇性地作為凍干填料，和用于重新組成的溶液的容器。該變化包括用于重新組成的溶液和在使用前導(dǎo)致可以混合的單一容器中的兩個(gè)室中的凍干填料。用該排列方式，抗腫瘤藥和本發(fā)明的化合物可在兩個(gè)容器中單獨(dú)包裝或作為粉末凍干，裝在單一容器中。
當(dāng)兩種藥物以溶液形式提供時(shí)，它們可包含在用于同時(shí)給藥或以一前一后排列方式的輸注/注射系統(tǒng)中。例如式(I)化合物可以是靜脈注射形式，或輸注袋，它經(jīng)管子串聯(lián)于第二輸注袋中的抗腫瘤藥。使用該系統(tǒng)，患者可接受最初bolus類型的式(I)化合物的注射或輸注，隨后是抗腫瘤藥的輸注。
本發(fā)明化合物可以若干生物試驗(yàn)之一試驗(yàn)以確定具有給定藥物效果所需的化合物的濃度。玻璃體結(jié)合蛋白結(jié)合的抑制固相[3H]-SK&F-107260結(jié)合于αvβ3在緩沖液T(含有2mM CaCl2和1％辛基糖苷)中的人體胎盤(pán)或人體血小板αvβ3(0.1-0.3mg/ml)用含有2mMCaCl2、1mMMnCl2、1mMMgCl2(緩沖液A)和0.05％NaN3的緩沖液T稀釋，隨后立即以每孔0.1ml加入96孔ELISA板(Corning，New York，NY)中，每個(gè)孔中加入0.1-0.2μgαvβ3。板在4℃下培養(yǎng)過(guò)夜，在實(shí)驗(yàn)時(shí)，孔用緩沖液A洗滌1次，用0.1ml的在相同緩沖液中的3.5％牛血清蛋白在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)。在培養(yǎng)后，孔完全抽吸，用0.2ml緩沖液A洗滌2次。
將化合物溶解在100％DMSO中得到2mM儲(chǔ)備溶液，它用結(jié)合緩沖液(15mM Tris-HCl(pH7.4)，100mMNaCl，1mM CaCl2，1mMMnCl2，1mMMgCl2)稀釋至100μM的最終化合物濃度。將該溶液稀釋至所需的最終化合物濃度。重復(fù)三次地向孔中加入各種濃度的未標(biāo)記拮抗劑(0.001-100μM)，隨后加入5.0nM[3H]-SK&F-107260(65-86Ci/mmol)。
所述板在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)，在培養(yǎng)后，完全抽吸孔，以逐孔的方式用0.2ml冰冷卻的緩沖液A洗滌1次。受體溶解在0.1ml的1％SDS中，在40％效率的Beckman LS Liquid Scintillation Counter中，結(jié)合的[3H]-SK&F-107260通過(guò)加入3ml Ready Safe用液體閃爍計(jì)數(shù)測(cè)定。[3H]-SK&F-107260的非特異結(jié)合在2μM SK&F-107260存在下測(cè)定始終低于總放射性輸入的1％。IC50(抑制50％[3H]-SK&F-107260結(jié)合的拮抗劑的濃度)用由LUNDON-2程序改進(jìn)的非線性最小二乘方曲線擬合常規(guī)測(cè)定。Ki(拮抗劑的離解常數(shù))根據(jù)公式Ki＝IC50/(1+L/Kd)計(jì)算，其中L和Kd分別是[3H]-SK&F-107260的濃度和離解常數(shù)。
本發(fā)明的化合物以約0.060-約0.0005μmol的濃度范圍抑制玻璃體結(jié)合蛋白結(jié)合于[3H]-SK&F-107260。
本發(fā)明的化合物在本領(lǐng)域中標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)中測(cè)試體外和體內(nèi)骨吸收，用于評(píng)價(jià)骨形成的抑制，例如在EP528587中公開(kāi)的窩形成試驗(yàn)，如Wronski等的Cells and Materials 1991，Sup.1，69-74所述，它還使用人體破骨細(xì)胞代替大鼠破骨細(xì)胞和使用切除卵巢的(ovarectomized)大鼠模型進(jìn)行。血管平滑肌細(xì)胞移動(dòng)試驗(yàn)使用大鼠或人體主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，細(xì)胞移動(dòng)在Transwell細(xì)胞培養(yǎng)室中通過(guò)使用8um孔的聚碳酸酯膜(Costar)監(jiān)測(cè)。過(guò)濾器的下部表面涂有玻璃體結(jié)合蛋白。細(xì)胞以2.5-5.0×106細(xì)胞/ml的濃度懸浮在補(bǔ)加0.2％牛血清白蛋白的DMEM中，用不同濃度的試驗(yàn)化合物在20℃下預(yù)處理20分鐘，單獨(dú)的溶劑用作對(duì)照物。將0.2ml的細(xì)胞懸浮液放置在室的上分隔間中，下分隔間含有0.6ml補(bǔ)加0.2％牛血清白蛋白的DMEM。培養(yǎng)過(guò)程在37℃在95％空氣/95％CO2的氣氛中進(jìn)行24小時(shí)。在培養(yǎng)后，緩慢刮去在過(guò)濾器上表面上的非移動(dòng)細(xì)胞。過(guò)濾器隨后固定在甲醇中，用10％Giemsa著色劑著色。通過(guò)a)計(jì)數(shù)移動(dòng)到過(guò)濾器下表面的細(xì)胞數(shù)或b)用10％乙酸提取染色的細(xì)胞，隨后測(cè)定在600nM吸光率測(cè)定移動(dòng)。甲狀腺甲狀旁腺切除術(shù)大鼠模型每個(gè)實(shí)驗(yàn)組由5-6只成年雄性Sprague-Dawley大鼠(250-400g體重)組成。大鼠在使用前7天被切除甲狀腺甲狀旁腺(由vendor，Taconic Farms)。所有大鼠每3天接受置換劑量的甲狀腺素。在由尾靜脈穿刺術(shù)抽入肝素化試管后立即測(cè)定全血中的循環(huán)離子化鈣含量。關(guān)住離子化鈣含量(用Ciba-Corning634型鈣pH分析器測(cè)量)＜1.2mM/l的大鼠。使每只大鼠的內(nèi)在靜脈和動(dòng)脈導(dǎo)管適合于分別提供試驗(yàn)物質(zhì)和血樣。大鼠隨后喂給無(wú)鈣食物和在離子水。測(cè)定基線鈣含量，每只大鼠經(jīng)靜脈導(dǎo)管使用外部注射器泵通過(guò)連續(xù)靜脈內(nèi)輸注給藥對(duì)照載體或人體甲狀旁腺激素1-34肽(hPTH-34，劑量鹽水中的1.25ug/kg/h/0.1％牛血清白蛋白，Bachem.Ca)或hPTH1-34和試驗(yàn)物質(zhì)的混合物。在6-8小時(shí)的輸注過(guò)程中以2小時(shí)間隔測(cè)量每只大鼠的血鈣響應(yīng)。人體破骨細(xì)胞再吸收和粘著試驗(yàn)已開(kāi)發(fā)窩再吸收和粘著試驗(yàn)，用由破骨細(xì)胞瘤組織獲得的正常人體破骨細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)化。開(kāi)發(fā)試驗(yàn)1通過(guò)激光同焦顯微鏡用于測(cè)量破骨細(xì)胞窩體積，開(kāi)發(fā)試驗(yàn)2用于較高能力的篩選，其中膠原碎片(在再吸收過(guò)程中釋放)用競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)量。試驗(yàn)1(使用激光同焦顯微鏡)·人體破骨細(xì)胞瘤得到的細(xì)胞懸浮液的等分試樣由液氮貯存中取出，在37℃快速溫?zé)?，通過(guò)離心(1000rpm，5分鐘，4℃)用RPMI-1640介質(zhì)洗滌1次。
·抽吸介質(zhì)，用鼠抗HLA-DR抗體代替，隨后在PRMI-1640培養(yǎng)基中1∶3稀釋，懸浮液在冰中培養(yǎng)30分鐘，頻繁混合。
·細(xì)胞用冷PRMI-1640洗滌2次，隨后離心(1000rpm，5分鐘，4℃)，細(xì)胞轉(zhuǎn)移到無(wú)菌15ml離心管中，單核細(xì)胞的數(shù)量在改進(jìn)Neubauer計(jì)數(shù)室中計(jì)數(shù)。
·由貯存瓶中取出涂有山羊抗小鼠Ig G(Dynal，Great Neck，NY)的足夠磁珠(5/單核細(xì)胞)，放置在5ml新鮮培養(yǎng)基中(洗去毒性疊氮化物防腐劑)，通過(guò)將珠固定在磁鐵上除去培養(yǎng)基，用新鮮培養(yǎng)基代替。
·將珠與細(xì)胞混合，懸浮液在冰上培養(yǎng)30分鐘，頻繁混合懸浮液。
·涂細(xì)胞的珠被固定在磁鐵上，其余細(xì)胞(破骨細(xì)胞富集部分)傾入無(wú)菌50ml離心管中。
·向涂細(xì)胞的珠中加入新鮮培養(yǎng)基以去除任何俘獲的破骨細(xì)胞，該洗滌過(guò)程重復(fù)10次，丟棄涂細(xì)胞的珠。
·使用熒光素二乙酸鹽標(biāo)記存活細(xì)胞，在計(jì)數(shù)室中計(jì)數(shù)存活破骨細(xì)胞。使用大孔的一次性塑料巴斯德氏移液管將樣品加入室中。
·通過(guò)離心使破骨細(xì)胞成顆粒沉淀，在補(bǔ)加10％胎牛血清和1.7g/l碳酸氫鈉的EMEM培養(yǎng)基將密度調(diào)節(jié)至合適數(shù)值(在腫瘤之間破骨細(xì)胞的數(shù)目是可變的)。
·將3ml的細(xì)胞懸浮液的等分試樣(均為化合物處理物)加入15ml離心管中，通過(guò)離心使細(xì)胞成顆粒沉淀。
·向每個(gè)管中加入3ml合適的化合物處理物(在EMEM培養(yǎng)基中稀釋到50uM/ml)。還包括合適的賦形劑對(duì)照組，正對(duì)照組(抗玻璃體結(jié)合蛋白受體鼠單克隆抗體[87MEM1]稀釋到100ug/ml)和同種型對(duì)照組(IgG2a稀釋到100ug/ml)。樣品在37℃培養(yǎng)30分鐘。
·將0.5ml的細(xì)胞等分試樣在48孔板上的無(wú)菌牙質(zhì)切片上接種，每種處理物重復(fù)四次地篩選。
·切片在6次變化的溫PBS(10ml/6孔板中的孔)中洗滌，隨后放置到含有化合物處理物或?qū)φ赵嚇拥男迈r培養(yǎng)基中，樣品在37℃培養(yǎng)48小時(shí)。耐酒石酸鹽酸性磷酸酯酶(TRAP)方法(用于破骨細(xì)胞譜系細(xì)胞的選擇性菌株)·含有并聯(lián)破骨細(xì)胞的骨切片用磷酸鹽緩沖的鹽水洗滌，在2％戊二醛(gluteraldehyde)(在0.2M二甲胂酸鈉中)中固定5分鐘。
·它們隨后用水洗滌，在37℃下在TRAP緩沖液(溶解于N，N-二甲基甲酰胺中的0.5mg/ml萘酚AB-BI磷酸鹽，與0.25M含有10mM酒石酸鈉的檸檬酸鹽緩沖液(pH4.5)混合)中培養(yǎng)4分鐘。
·用冷水洗滌后，切片浸在含有1mg/ml堅(jiān)牢紅紫醬紅的冷乙酸鹽緩沖液(0.1M，pH6.2)，在4℃培養(yǎng)4分鐘。
·抽吸過(guò)量緩沖液，切片在空氣中干燥，隨后用水洗滌。
·TRAP正破骨細(xì)胞(磚紅色/紫色沉淀)用亮視野顯微鏡檢查計(jì)數(shù)，隨后通過(guò)聲波由牙質(zhì)表面除去。
·窩體積使用Nikon/Lasertec ILM21 W同焦顯微鏡測(cè)定。試驗(yàn)2(使用ELISA讀出)如試驗(yàn)1的最初9個(gè)步驟描述的那樣富集和制備人體破骨細(xì)胞用于化合物篩選，為清楚起見(jiàn)，如下重復(fù)這些步驟。
·人體破骨細(xì)胞瘤得到的細(xì)胞懸浮液的等分試樣由液氮貯存中取出，在37℃快速溫?zé)?，通過(guò)離心(1000rpm，5分鐘，4℃)用RPMI-1640介質(zhì)洗滌1次。
·抽吸介質(zhì)，用鼠抗HLA-DR抗體代替，隨后用PRMI-1640介質(zhì)1∶3稀釋，懸浮液在冰中培養(yǎng)30分鐘，頻繁混合。
·細(xì)胞用冷PRMI-1640洗滌2次，隨后離心(1000rpm，5分鐘，4℃)，細(xì)胞轉(zhuǎn)移到無(wú)菌15ml離心管中，單核細(xì)胞的數(shù)量在改進(jìn)的Neubauer計(jì)數(shù)室中計(jì)數(shù)。
·由貯存瓶中取出涂有山羊抗小鼠Ig G(Dynal，Great Neck，NY)的足夠磁珠(5/單核細(xì)胞)，放置在5ml新鮮培養(yǎng)基中(洗去毒性疊氮化物防腐劑)，通過(guò)將珠固定在磁鐵上除去培養(yǎng)基，用新鮮培養(yǎng)基代替。
·將珠與細(xì)胞混合，懸浮液在冰上培養(yǎng)30分鐘，頻繁混合懸浮液。
·涂細(xì)胞的珠被固定在磁鐵上，其余細(xì)胞(破骨細(xì)胞富集部分)傾入無(wú)菌50ml離心管中。
·向涂細(xì)胞的珠中加入新鮮培養(yǎng)基以去除任何俘獲的破骨細(xì)胞，該洗滌過(guò)程重復(fù)10次，丟棄涂細(xì)胞的珠。
·使用熒光素二乙酸鹽標(biāo)記存活細(xì)胞，在計(jì)數(shù)室中計(jì)數(shù)存活破骨細(xì)胞。使用大孔的一次性塑料巴斯德氏移液管將樣品加入室中。
·通過(guò)離心使破骨細(xì)胞成顆粒沉淀，在補(bǔ)加10％胎牛血清和1.7g/l碳酸氫鈉的EMEM培養(yǎng)基將密度調(diào)節(jié)至合適數(shù)值(在腫瘤之間破骨細(xì)胞的數(shù)目是可變的)。
與試驗(yàn)1中描述的方法相反，如下所述以4劑量篩選化合物以得到IC50·破骨細(xì)胞制劑在37℃用試驗(yàn)化合物(4劑量)或?qū)φ瘴镱A(yù)培養(yǎng)30分鐘。
·它們隨后在48孔組織培養(yǎng)板的孔中接種到牛骨密質(zhì)切片上，在37℃再培養(yǎng)2小時(shí)。
·骨切片在六次變化的溫?zé)崃姿猁}緩沖的鹽水(PBS)中洗滌，以除去非粘附細(xì)胞，隨后重新加入含有新鮮化合物或?qū)φ瘴锏?8孔板的孔中。
·組織培養(yǎng)板在37℃下培養(yǎng)48小時(shí)。
·由每個(gè)孔中抽吸上清液加入單獨(dú)的試管中，在檢測(cè)在吸收過(guò)程中釋放的I型膠原的c-端肽的競(jìng)爭(zhēng)ELISA中篩選。它是一種商業(yè)上可獲得的ELISA(Osteometer，Denmark)，它含有特異地與存在于I型膠原的al鏈的羧基末端端肽的8-氨基酸序列(Glu-Lys-Ala-His-Asp-Gly-Gly-Arg)反應(yīng)的兔抗體。該結(jié)果表示為與載體對(duì)照物相比的吸收抑制％。人體破骨細(xì)胞粘著試驗(yàn)如試驗(yàn)1的最初9個(gè)步驟那樣富集和制備人體破骨細(xì)胞用于化合物篩選，為清楚起見(jiàn)，如下重復(fù)這些步驟。
·人體破骨細(xì)胞瘤得到的細(xì)胞懸浮液的等分試樣由液氮貯存中取出，在37℃快速溫?zé)?，通過(guò)離心(1000rpm，5分鐘，4℃)用RPMI-1640介質(zhì)洗滌1次。
·介質(zhì)培養(yǎng)基，用鼠抗HLA-DR抗體代替，隨后用PRMI-1640培養(yǎng)基1∶3稀釋，懸浮液在冰中培養(yǎng)30分鐘，頻繁混合。
·細(xì)胞用冷PRMI-1640洗滌2次，隨后離心(1000rpm，5分鐘，4℃)，細(xì)胞轉(zhuǎn)移到無(wú)菌15ml離心管中，單核細(xì)胞的數(shù)量在改進(jìn)Neubauer計(jì)數(shù)室中計(jì)數(shù)。
·由貯存瓶中取出涂有山羊抗小鼠Ig G(Dynal，Great Neck，NY)的足夠磁珠(5/單核細(xì)胞)，放置在5ml新鮮培養(yǎng)基中(洗去毒性疊氮化物防腐劑)，通過(guò)將珠固定在磁鐵上除去培養(yǎng)基，用新鮮培養(yǎng)基代替。
·將珠與細(xì)胞混合，懸浮液在冰上培養(yǎng)30分鐘，頻繁混合懸浮液。
·涂細(xì)胞的珠被固定在磁鐵上，其余細(xì)胞(破骨細(xì)胞富集部分)傾入無(wú)菌50ml離心管中。
·向涂細(xì)胞的珠中加入新鮮培養(yǎng)基以去除任何俘獲的破骨細(xì)胞，該洗滌過(guò)程重復(fù)10次，丟棄涂細(xì)胞的珠。
·使用熒光素二乙酸鹽標(biāo)記存活細(xì)胞，在計(jì)數(shù)室中計(jì)數(shù)存活破骨細(xì)胞。使用大孔的一次性塑料巴斯德氏液移管將樣品加入室中。
·通過(guò)離心使破骨細(xì)胞成顆粒沉淀，在補(bǔ)加10％胎牛血清和1.7g/l碳酸氫鈉的EMEM培養(yǎng)基將密度調(diào)節(jié)至合適數(shù)值(腫瘤之間破骨細(xì)胞數(shù)目是可變的)。
·破骨細(xì)胞瘤得到的破骨細(xì)胞在37℃用試驗(yàn)化合物(4劑量)或?qū)φ瘴镱A(yù)培養(yǎng)30分鐘。
·所述細(xì)胞隨后接種到骨橋蛋白涂覆的切片上(人體或大鼠骨橋蛋白，2.5ug/ml)，在37℃培養(yǎng)2小時(shí)。
·切片在磷酸鹽緩沖的鹽水中劇烈洗滌，以除去非粘附細(xì)胞，殘余在切片上的細(xì)胞固定在丙酮中。
·破骨細(xì)胞染色用于耐酒石酸鹽酸性磷酸酯酶(TRAP)，選擇性標(biāo)記用于該酚型細(xì)胞(參見(jiàn)步驟15-17)，用光顯微鏡計(jì)數(shù)。結(jié)果表示為與載體對(duì)照物相比的吸收抑制％。細(xì)胞粘著試驗(yàn)細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)物人胚胎中腎細(xì)胞(HEK293細(xì)胞)由ATCC得到(目錄編號(hào)CRL1573)。細(xì)胞在含有Earl鹽、10％胎牛血清、1％谷氨酰胺和1％青霉素-鏈霉素的Earl基本必需培養(yǎng)基(EMEM)中生長(zhǎng)。構(gòu)成和轉(zhuǎn)染將αv亞基的3.2kb EcoRI-KpnI片段和β3亞基的2.4kb XbaI-XhoI片段通過(guò)平端連接插入含有CMV啟動(dòng)子和G418選擇標(biāo)記的pCDN載體(Aiyar等，1994)的EcoRi-EcoRV克隆位。為穩(wěn)定表達(dá)，80×106HEK 293細(xì)胞使用Gene Pulser(Hensley等，1994)用αv+β3結(jié)構(gòu)(每個(gè)亞基20μgDNA)電轉(zhuǎn)化，在100mm板中平板培養(yǎng)(5×105細(xì)胞/板)。48小時(shí)后，生長(zhǎng)培養(yǎng)基補(bǔ)加450μl/mlGeneticin(G418硫酸鹽，GIBCO-BRL，Bethesda，MD)。細(xì)胞保持在選擇培養(yǎng)基中至克隆大至足以進(jìn)行試驗(yàn)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)分析為測(cè)定HEK293轉(zhuǎn)染物是否表達(dá)玻璃體結(jié)合蛋白受體，細(xì)胞通過(guò)離心固定在玻璃顯微鏡片上，在室溫下在丙酮中固定2分鐘，空氣干燥。使用標(biāo)準(zhǔn)間接免疫熒光方法說(shuō)明23C6的特異反應(yīng)性，特殊用于αvβ3配合物的單克隆抗體。細(xì)胞粘著研究Corning96孔ELISA板在4℃用0.1ml人體玻璃體結(jié)合蛋白(在RPMI培養(yǎng)基中，0.2μg/ml)預(yù)涂覆過(guò)夜。在實(shí)驗(yàn)時(shí)，板用RPMI培養(yǎng)基洗滌1次，在室溫下用在RPMI培養(yǎng)基中的3.5％BSA阻斷1小時(shí)。轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞以0.5×106細(xì)胞/ml的密度重新懸浮在補(bǔ)加20mM hepes，pH7.4和0.1％BSA的RPMI培養(yǎng)基中。向每個(gè)孔中加入0.1ml細(xì)胞懸浮液，在存在或不存在各種αvβ3拮抗劑下在37℃培養(yǎng)1小時(shí)。在培養(yǎng)后，加入0.025ml pH7.4的10％甲醛溶液，細(xì)胞在室溫下固定10分鐘。板用0.2mlRPMI培養(yǎng)基洗滌3次，粘附細(xì)胞用0.1ml的0.5％甲苯胺藍(lán)在室溫下染色20分鐘。通過(guò)用去離子水充分洗滌除去過(guò)量染色。加入細(xì)胞的甲苯胺藍(lán)通過(guò)加入0.1ml的含有50mM鹽酸的50％乙醇洗脫。細(xì)胞粘著在600nm光密度下用微滴板閱讀器(Titertek Multiskan MC，Sterling，VA)定量。固相αvβ3結(jié)合試驗(yàn)由人體胎盤(pán)純化玻璃體結(jié)合蛋白受體αvβ5。受體制劑用50mM Tris-HCl，pH7.5，100mMNaCl，1mM CaCl2、1mMMnCl2、1mMMgCl2(緩沖液A)稀釋，隨后立即以每孔0.1ml加入96孔ELISA板中，每個(gè)孔中加入0.1-0.2μgαvβ3。板在4℃下培養(yǎng)過(guò)夜，在實(shí)驗(yàn)時(shí)，孔用緩沖液A洗滌1次，用0.1ml的在相同緩沖液中的3.5％牛血清白蛋白在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)。在培養(yǎng)后，孔完全抽吸，用0.2ml緩沖液A洗滌2次。
在[3H]-SK&F-107260競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)中，將各種濃度的未標(biāo)記拮抗劑(0.001-100μM)加入孔中，隨后加入5.0nM[3H]-SK&F-107260。板在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)，在培養(yǎng)后，完全抽吸孔，以逐孔的方式用0.2ml冰冷卻的緩沖液A洗滌1次。受體溶解在0.1ml的1％SDS中，在40％效率的Beckman LS LiquidScintillation Counter中，結(jié)合的[3H]-SK&F-107260通過(guò)加入3ml Ready Safe用液體閃爍計(jì)數(shù)測(cè)定。[3H]-SK&F-107260的非特異結(jié)合在2μM SK&F-107260存在下測(cè)定，始終低于總放射性輸入的1％。IC50(抑制50％[3H]-SK&F-107260結(jié)合的拮抗劑的濃度)用由LUNDON-2程序改進(jìn)的非線性最小二乘方曲線擬合常規(guī)測(cè)定。Ki(拮抗劑的離解常數(shù))根據(jù)cheng和Prusoff公式Ki＝IC50/(1+L/Kd)計(jì)算，其中L和Kd分別是[3H]-SK&F-107260的濃度和離解常數(shù)。
RGD-介導(dǎo)的GPIIb-IIIa結(jié)合的抑制GPIIb-IIIa純化10單位的過(guò)時(shí)的、洗滌的人體血小板(由Red Cross得到)通過(guò)在3％辛基糖苷、20mM Tris-HCl，pH7.4，140mMNaCl，2mM CaCl2中在4℃緩慢攪拌2小時(shí)溶解。溶胞產(chǎn)物以100000g離心1小時(shí)，得到的上清液提供給用20mMTris-HCl，pH7.4，100mMNaCl，2mM CaCl2、1％辛基糖苷(緩沖液A)預(yù)平衡的5ml兵豆植物凝血素瓊脂糖4B柱。在2小時(shí)培養(yǎng)后，柱用50ml冷緩沖液A洗滌。殘留植物凝血素的GPIIb-IIIa用含有10％葡萄糖的緩沖液A洗脫。所有過(guò)程在4℃下進(jìn)行。得到的GPIIb-IIIa用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示為＞95％純度。
本發(fā)明的優(yōu)選化合物具有相對(duì)于纖維蛋白原受體大于10∶1的玻璃體結(jié)合蛋白受體親和力，更優(yōu)選化合物具有大于100∶1的活性比率。
單獨(dú)的式(I)化合物或與抗腫瘤藥的結(jié)合的功效可使用若干可移植的小鼠腫瘤模型測(cè)定，參見(jiàn)US5004758和5633016有關(guān)該模型的詳細(xì)說(shuō)明。
如下實(shí)施例無(wú)論如何也不限制本發(fā)明的范圍，但提供用于舉例說(shuō)明如何制備和使用本發(fā)明的化合物。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，許多其它實(shí)施方案將是明顯的。
常規(guī)質(zhì)子核磁共振(1H NMR)譜以250、300或400MHz記錄?；瘜W(xué)位移由內(nèi)標(biāo)四甲基甲硅烷(TMS)以每百萬(wàn)份的份數(shù)(δ)低磁場(chǎng)記錄。用于NMR數(shù)據(jù)的縮寫(xiě)如下s＝單峰，d＝雙重峰，t＝三重峰，q＝四重峰，m＝多重峰，dd＝雙重雙重峰，dt＝雙重三重峰，app＝清晰可見(jiàn)，br＝寬峰。J表示NMR偶合常數(shù)在Hertz中測(cè)定。CDCl3是氘氯仿。DMSO-d6是六氘代二甲基亞砜和CD3OD是四氘代甲醇。紅外(IR)光譜以傳輸方式記錄，譜帶位置以反波數(shù)記錄(cm-1)。質(zhì)譜使用電噴霧(ES)或FAB離子化技術(shù)得到。元素分析由內(nèi)部或由Quantitative Technologies Inc.Whitehouse，NJ進(jìn)行。熔點(diǎn)用Thomas-Hoover熔點(diǎn)裝置取得，未校準(zhǔn)。所有溫度用攝氏度表示。Analtech Silica Gel GF和E.Merck Silica Gel 60F-254薄層板用于薄層色譜法?？焖俸椭亓ιV法在E.Merck Kieselgel 60(230-400目)硅膠柱上進(jìn)行。分析和制備HPLC用Rainin或Beckman色譜法進(jìn)行。ODS是指十八烷基甲硅烷基衍生的硅膠色譜載體。5μApex-ODS表示十八烷基甲硅烷基衍生的硅膠柱色譜載體，具有5μ的正常粒度，由Jones Chromatography，Littleton，Colorado制造。YMC ODS-AQ是ODS色譜載體，是YMC Co.Ltd.，Kyoto，Japan的注冊(cè)商標(biāo)。PRP-1是聚(苯乙烯-二乙烯基苯)色譜載體，是Hamiton Co.，Reno，Nevada的注冊(cè)商標(biāo)。Celite是由酸洗滌的硅藻土硅膠組成的過(guò)濾助劑，是Manville Corp.，Denver，Colorado的注冊(cè)商標(biāo)。
制備例16-(甲基氨基)-2-吡啶乙醇的制備a)2-(叔丁氧基羰基氨基)-6-甲基吡啶將2-氨基-6-甲基吡啶(21.63g.200mmole)和焦碳酸二叔丁基酯(di-tert-butyl dicarbonate)(52.38g，240mmole)在CH2Cl2(200mL)中的溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(rotavap)中在50℃下濃縮，得到的殘余物在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上在50℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。在21.5小時(shí)后，反應(yīng)混合物用己烷(400ml)稀釋，通過(guò)硅膠(己烷，隨后20％乙酸乙酯/己烷)過(guò)濾。濃縮得到標(biāo)題化合物(41.84g，定量)，為淺黃色油狀物，它在靜置時(shí)逐慚固化1H NMR(250MHz，CDCl3)δ7.71(dJ＝8.3Hz，1H)，7.40-7.65(m，2H)，6.80(d，J＝7.5Hz，1H)，2.43(s，3H)，1.50(s，9H)；MS(ES)m/e 153(M+H-C4H8)+。b)2-[(叔丁氧基羰基)甲基氨基]-6-甲基吡啶在15℃(冷水浴)下，將NaH(在礦物油中60％，3.60g，90mmole)在幾分鐘內(nèi)分批加入2-(叔丁氧基羰基氨基)-6-甲基吡啶(15.62g，75mmole)和碘甲烷(9.3ml，150mmole)在無(wú)水DMSO(75ml)中的溶液中。內(nèi)部溫度上升到35℃，當(dāng)氣體逸出停止時(shí)，移去冷水浴，使反應(yīng)混合物在室溫下攪拌。在0.5小時(shí)后，將暗黃色混合物傾入冰/水(300ml)中用Et2O(3×300ml)提取。合并的有機(jī)層依次用水(2×75ml)和鹽水(75ml)洗滌。干燥(硫酸鎂)和濃縮得到黃色油狀物，經(jīng)硅膠(70％乙酸乙酯/己烷)色譜純化。得到標(biāo)題化合物(13.01g，78％)，為微黃色油狀物1H NMR(250MHz，CDCl3)δ7.51(app t，1H)，7.37(d，J＝8.2Hz，1H)，6.86(d，J＝7.2Hz，1H)，3.38(s，3H)，2.49(s，3H)，1.50(s，9H)；MS(ES)m/e 223(M+H)+。c)6-[(叔丁氧基羰基)甲基氨基]-2-吡啶基乙酸乙基酯在0℃和氬氣氣氛中由在無(wú)水THF(350ml)中的二異丙基胺(19.5ml，139.14mmole)和2.5M在己烷中的正丁基鋰(46.4ml，115.95mmole)制備LDA。將溶液冷卻到-78℃，在10分鐘內(nèi)滴加2-[(叔丁氧基羰基)甲基氨基]-6-甲基吡啶(10.31g，46.38mmole)在無(wú)水THF(46ml)中的溶液。另外的無(wú)水THF(2ml)用于轉(zhuǎn)移。橙色溶液在-78℃攪拌15分鐘，然后迅速加入碳酸二乙酯(6.2ml，51.02mmole)。紅色溶液在-78℃下攪拌15分鐘，隨后用半飽和的NH4Cl(175ml)抑制。將混合物溫?zé)岬?5℃，用EtOAc(175ml)，隨后用CH2Cl2(2×100ml)提取。合并的有機(jī)物用鹽水(100ml)洗滌，干燥(硫酸鎂)和濃縮?；鞚岬狞S色油狀物用硅膠色譜分離(15％EtOAc/己烷)得到標(biāo)題化合物(10.72g，79％)，為淺黃色油狀物1H NMR(250MHz，CDCl3)δ7.51-7.63(m，2H)，6.91-7.03(m，1H)，4.19(q，J＝7.1Hz，2H)，3.77(s，2H)，3.38(s，3H)，1.27(t，J＝7.1Hz，3H)，1.51(s，9H)；MS(ES)m/e 295(M+H)+。d)6-[(叔丁氧基羰基)甲基氨基]-2-吡啶基乙醇在氬氣中，將THF中的2N LiBH4(7ml，14mmole)溶液用注射器加入攪拌的6-[(叔丁氧基羰基)甲基氨基]-2-吡啶基乙酸乙酯(6.97g1 23.7mmole)在無(wú)水THF(30ml)中的溶液中。使反應(yīng)混合物緩慢加熱至回流(最初放熱)。在回流16小時(shí)后，將反應(yīng)混合物冷卻到0℃，用水(50ml)仔細(xì)抑制。混合物用EtOAc(150ml)提取，有機(jī)層用鹽水洗滌，干燥(硫酸鈉)和濃縮。用硅膠快速色譜法(35％乙酸乙酯/己烷)純化得到標(biāo)題化合物(5.26g，88％)透明油狀物1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.57(m，2H)，6.88(d，J＝7.2Hz，1H)，4.01(t，2H)，3.39(s，3H)，3.00(t，2H)，1.53(s，9H)；MS(ES)m/e 253.2(M+H)+。e)6-(甲基氨基)-2-吡啶基乙醇向6-[(叔丁氧基羰基)甲基氨基]-2-吡啶基乙醇(17.9g，71mmole)中加入在二烷(200ml)中的4NHCl。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1小時(shí)(慢慢觀察到氣體逸出)，隨后濃縮至干。作為鹽酸鹽的產(chǎn)物在真空下固化。將固體溶解在NaCl飽和的1.0N NaOH溶液(75ml)中，溶液用Et2O(2×200ml)提取。合并的有機(jī)層用鹽水洗滌，干燥(硫酸鈉)和濃縮得到標(biāo)題化合物(9.12g，85％)蠟狀固體1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.37(t，1H)，6.42(d，J＝7.3Hz，1H)，6.27(d，J＝8.3Hz，1H)，4.62(br s，1H)，3.96(t，2H)，2.90(d，J＝5.2Hz，3H)，2.84(t，2H)；MS(ES)m/e 153(M+H)+。
制備例22-(5.6.7.8-四氫-1，8-萘啶-2-基)-1-乙醇的制備a)2-(新戊酰氨基)吡啶在0℃向2-氨基吡啶(94.12g，1mole)和Et3N(167.3ml，1.2mole)在CH2Cl2(1L)中的溶液中滴加新戊酰氯(135.5ml，1.1mole)，混合物用溫?zé)岬脑責(zé)岬绞覝亍?8小時(shí)后，過(guò)濾混合物。濾液依次用水(1.5L)和飽和NaHCO3(2×1.5L)洗滌，干燥(MgSO4)和減壓濃縮得到標(biāo)題化合物(183g，103％)灰白色固體1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.28(m，2H)，8.00(br s，1H)，7.70(m，1H)，7.03(m，1H)，1.31(s，9H)；MS(ES)m/e 179(M+H)+。
注1H NMR顯示存在少量含有叔丁基的雜質(zhì)，但該物質(zhì)用于下一步驟是足夠純的。b)2-(新戊酰氨基)-3-吡啶基甲醛在-20℃下向2-(新戊酰基氨基)吡啶(17.8g，100mmole)在無(wú)水THF(250ml)中的溶液中在30分鐘內(nèi)滴加正丁基鋰(己烷中的2.5M溶液，100ml，250mmoles)。2小時(shí)后，在30分鐘內(nèi)滴加DMF(21ml，275mmoles)?；旌衔镉脺?zé)岬脑責(zé)岬绞覝亍?8小時(shí)后，混合物用飽和NH4Cl(300ml)抑制，得到的混合物用EtOAc(3×400ml)提取。干燥(MgSO4)合并的有機(jī)層，濃縮得到標(biāo)題化合物，是與2-(新戊?；被?吡啶的2∶1混合物(22g)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ10.95(br S，1H)，9.95(s，1H)，8.69(m，1H)，8.02(m，2H)，7.20(m，1H)，1.38(s，9H)；MS(ES)m/e 207(M+H)+。
注用1-甲?；哙?0.5ml，275mmoles)代替DMF重復(fù)上述過(guò)程得到標(biāo)題化合物，是與2-(新戊酰基氨基)吡啶的4∶1混合物(21g)。c)2-氨基-3-吡啶甲醛將粗2-(新戊?；被?-3-吡啶甲醛(來(lái)自步驟b，43g)溶解在3MHCl(500ml)中，將溶液回流加熱。18小時(shí)后，混合物冷卻到室溫，用固體K2CO3仔細(xì)調(diào)節(jié)pH至7，水溶液用EtOAc(3×500ml)提取。干燥(硫酸鎂)合并的有機(jī)層，濃縮得到標(biāo)題化合物(24.57g，101％)，為紅棕色固體1H NMR(300MHz，CDCl3)δ9.85(s，1H)，8.24(m，1H)，7.80(m，1H)，6.90(br s，2H)，6.74(m，2H)；MS(ES)m/e 123(M+H)+。d)2-甲基-1，8-萘啶向2-氨基-3-吡啶甲醛(來(lái)自步驟c，24.57g)在丙酮(750ml)中的溶液中加入甲基吡啶(2.3g，20mmole)，隨后混合物回流加熱。48小時(shí)后，混合物冷卻到室溫，過(guò)濾和濃縮。進(jìn)行快速硅膠柱色譜(35％丙酮/己烷)得到標(biāo)題化合物(18.5g，64％，上面3個(gè)步驟)橙黃色固體1H NMR(300MHz，CDCl3)δ9.07(m，1H)，8.10(m，2H)，7.40(m，2H)，2.80(s，3H)；MS(ES)m/e145(M+H)+。e)2-甲基-5，6，7，8-四氫-1，8-萘啶2-甲基-1，8-萘啶(18.5g，128mmole)、10％Pd/C(5g)和無(wú)水EtOH(150ml)的混合物在氫氣中(15psi)在Parr裝置中振蕩。24小時(shí)后，通過(guò)celite過(guò)濾混合物，過(guò)濾填料依次用無(wú)水乙醇和乙酸乙酯洗滌。濾液濃縮至干得到標(biāo)題化合物(18.85g，99％)灰白色固體1H NMR(300MHz，CDCl3)δ 7.02(d，J＝7.5Hz，1H)，6.34(d，J＝7.5Hz，1H)，4.80(br s，1H)，3.38(m，2H)，2.74(m，2H)，2.30(s，3H)，1.88(m，2H)；MS(ES)m/e 149(M+H)+。f)2-甲基-8-(叔丁氧基羰基)-5，6，7，8-四氫-1，8-萘啶向2-甲基-5，6，7，8-四氫-1，8-萘啶(23.32g，157mmole)和焦碳酸二叔丁基酯(44.74g，205mmole)在無(wú)水THF(750ml)中的溶液中在0℃滴加LiHMDS(THF中的1.0M溶液，205ml，205mmole)。加完后30分鐘，混合物用飽和NH4Cl(500ml)抑制，用EtOAc(3×500ml)提取。干燥(硫酸鎂)合并的有機(jī)層，減壓濃縮。進(jìn)行快速硅膠柱色譜(40％EtOAc/己烷)得到標(biāo)題化合物(32.3g，83％)淺黃色油狀物1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.27(d，J＝7.6Hz，1H)，6.81(d，J＝7.6Hz，1H)，3.69-3.79(m，2H)，2.65-2.75(m，2H)，2.48(s，3H)，1.83-1.98(m，2H)，1.52(s，9H)；MS(ES)m/e 249(M+H)+。g)[8-(叔丁氧基羰基)-5，6，7，8-四氫-1，8-萘啶-2-基]乙酸乙酯在0℃向二異丙基胺(47.7ml，364mmol)在無(wú)水THF(250ml)中的溶液中滴加正丁基鋰(己烷中的2.5M溶液，145.6ml，364mmole)。15分鐘后，將該溶液在-78℃下滴加到2-甲基-8-(叔丁氧基羰基)-5，6，7，8-四氫-1，8-萘啶(32.3g，130mmole)和碳酸二乙酯(56.8ml，481mmole)在無(wú)水THF(400ml)中的溶液中。30分鐘后，混合物用飽和NH4Cl(500ml)抑制，溫?zé)岬绞覝兀肊tOAc(3×500ml)提取。干燥(硫酸鎂)合并的有機(jī)提取物，過(guò)濾和減壓濃縮。在高真空下干燥過(guò)夜得到標(biāo)題化合物(42.52g，102％)淺黃色油狀物1H NMR(300MHz，CDCl3)δ 7.35(d，J＝7.5Hz，1H)，6.96(d，J＝7.5Hz，1H)，4.18(t，2H)，3.75(m，4H)，2.72(t，2H)，1.91(m，2H)，1.52(s，9H)，1.24(m，3H)MS(ES)m/e 321(M+H)+。
注1H-NMR顯示在產(chǎn)物中存在少量碳酸二乙酯，但該物質(zhì)用于下一步驟是足夠純的。h)2-(5，6，7，8-四氫-1，8-萘啶-2-基)-1-乙醇在室溫下向[8-(叔丁氧基羰基)-5，6，7，8-四氫-1，8-萘啶-2-基]乙酸乙酯(42.52g，130mmole)在無(wú)水THF(650ml)中的溶液中加入LiBH4(THF中2.0M，65ml，130mmole)，得到的混合物加熱回流。18小時(shí)后，將混合物冷卻到0℃，用水(300ml)仔細(xì)抑制。10分鐘后，混合物用EtOAc(3×500ml)提取，干燥(硫酸鎂)合并的有機(jī)提取物，過(guò)濾和減壓濃縮。
將上述殘余物溶解在CH2Cl2(300ml)中，在室溫下向溶液中緩慢加入在二烷中的4NHCl(300ml)。4小時(shí)后，減壓濃縮混合物，殘余物溶解在1.0N NaOH和飽和氯化鈉(300ml)的1∶1混合物中，用CH2Cl2(3×300ml)提取。干燥(硫酸鎂)合并的有機(jī)提取物，過(guò)濾和減壓濃縮。殘余物溶解在Et2O(250ml)中，滴加96％甲酸(130mmoles)。過(guò)濾收集得到的固體，用Et2O(2×50ml)洗滌。將固體溶解在1.0N NaOH和飽和NaCl的1∶1混合物(300ml)中，溶液用CH2Cl2(3×300ml)提取。干燥(硫酸鎂)合并的有機(jī)提取物，過(guò)濾和減壓濃縮得到標(biāo)題化合物(11.1g，48％上述4步驟)黃色固體。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.05(d，J＝7.6Hz，1H)，6.33(d，J＝7.6Hz，1H)，3.90(t，2H)，3.39(m，2H)，2.75(t，2H)，2.70(t，2H)，1.90(m，2H)；MS(ES)m/e 179(M+H)+。
制備例3(±)-4-(4-羥基苯基)-3-[4-(三氟甲基)苯基]丁酸乙酯的制備a)N-甲氧基-N-甲基-2-(4-甲氧基苯基)乙酰胺向4-甲氧基苯基乙酸(3.3g，20mmole)在無(wú)水DMF(75ml)中的溶液中加入N-甲氧基-N-甲基胺鹽酸鹽(1.95g，20mmole)，Et3N(3.ml，22mmole)，HOBt·H2O(1.95g 22mmole)和EDC(2.7g，22mmole)。溶液在室溫下攪拌過(guò)夜，隨后真空濃縮。殘余物溶解在5％碳酸鈉(10ml)溶液中，用CH2Cl2(3×20ml)提取。干燥(硫酸鎂)合并的有機(jī)層，過(guò)濾和濃縮。殘余物在硅膠上進(jìn)行色譜分離(3％MeOH/CH2Cl2)得到標(biāo)題化合物(1.54g，37％)白色固體MS(ES)m/e210(M+H)+。
b)2-(4-甲氧基苯基)-1-[4-(三氟甲基)苯基]乙酮向仲丁基鋰(在THF中的1.3M，22.6ml，29.5mmole)在無(wú)水THF(50ml)中的溶液中滴加4-溴三氟甲苯(3.3g，14.7mmole)在無(wú)水THF(20ml)中的溶液。20分鐘后，滴加在無(wú)水THF(20ml)中的N-甲氧基-N-甲基-2-(4-甲氧基苯基)乙酰胺(1.5g，7.4mmole)。1小時(shí)后，混合物用飽和NH4Cl(10ml)抑制，溫?zé)岬绞覝?，用Et2O(3×20ml)提取。用硫酸鎂干燥合并的有機(jī)層，過(guò)濾和濃縮。殘余物在硅膠上進(jìn)行色譜分離(15％EtOAc/己烷)得到標(biāo)題化合物(2.2g，100％)微黃色固體TLC(1.5％EtOAc/己烷)Rf 0.81；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.10(d，J＝8.2Hz12H)，7.72(d，J＝8.2Hz，2H)，7.18(d，3＝8.7Hz，2H)，6.88(d，J＝8.7Hz，2H)，4.25(s，2H)，3.79(s，3H)。c)(±)-4-(4-甲氧基苯基)-3-[4-(三氟甲基)苯基]丁烯酸乙酯向60％NaH(350mg，8.84mmole)在無(wú)水甲苯(30ml)中的懸浮液中在室溫下滴加在無(wú)水THF(20ml)中的膦酰基乙酸三乙酯(2.0g，8.84mmole)。在15分鐘后，滴加2-(4-甲氧基苯基)-1-[4-(三氟甲基)苯基]乙酮(1.3g，4.42mmole)在無(wú)水甲苯(15ml)中的溶液，溶液加熱回流。16小時(shí)后，反應(yīng)用飽和NH4Cl(10ml)抑制，混合物用EtOAc(3×20ml)提取。用硫酸鎂干燥合并的有機(jī)層，過(guò)濾和濃縮。得到標(biāo)題化合物(2.2g，56％，兩種組分的混合物)，淺黃色油狀物TLC(5％EtOAc/己烷)Rf0.42，0.44。使用該物質(zhì)無(wú)需進(jìn)一步純化。d)(±)-4-(4-甲氧基苯基)-3-[4-(三氟甲基)苯基]丁酸乙酯向10％Pd/C(600mg)在無(wú)水乙醇(50ml)中的懸浮液中加入(±)-4-(4-甲氧基苯基)-3-[4-(三氟甲基)苯基]丁烯酸乙酯(2.2g，6mmole)?；旌衔镌赑arr裝置中在室溫下在H2(50psi)中振蕩。4小時(shí)后，混合物通過(guò)celite填料過(guò)濾，濃縮濾液。重復(fù)反應(yīng)過(guò)程三次。殘余物在硅膠上進(jìn)行色譜分離(35％EtOAc/己烷)得到標(biāo)題化合物(900mg，56％)油狀物TLC(5％EtOAc/己烷)Rf 0.46；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.51(d，3＝8.2Hz，2H)，7.24(d，J＝8.2Hz，2H)，6.94(d，3＝8.7Hz，2H)，6.76(d，3＝8.7Hz，2H)，3.99(q，3＝7.1Hz，2H)，3.76(s，3H)，3.35-3.50(m，1H)，2.75-2.93(m，2H)，2.69(dd 3＝15.6，6.4Hz，1H)，2.60(dd，J＝15.6，8.9Hz，1H)，1.11(t，J＝7.1Hz，3H)。e)(±)-4-(4-羥基苯基)-3-[4-(三氟甲基)苯基]丁酸乙酯向(±)-4-(4-甲氧基苯基)-3-[4-(三氟甲基)苯基]丁酸乙酯(450mg，1.23mmole)在CH2Cl2(5ml)中的溶液中在-10℃下加入BBr3(1.5ml，1.48mmole)。3小時(shí)后，混合物仔細(xì)用EtOH(10ml)驟冷，使溶液溫?zé)岬绞覝亍饪s混合物，殘余物在硅膠上進(jìn)行色譜分離(20％EtOAc/己烷)得到標(biāo)題化合物(270mg，63％)黃色油狀物TLC(20％EtOAc/己烷)Rf0.22。
制備例4(±)-3-[4-羧基-1，3-唑-2-基]-4-[4-[(叔丁氧基羰基)氧基]苯基]丁酸甲酯的制備a)4-溴-1-(三異丙基甲硅烷氧基)苯在室溫下向4-溴苯酚(17.3g，100mmole)在無(wú)水DMF(100ml)中的溶液中加入咪唑(13.62g，200mmole)，隨后加入三異丙基甲硅烷基氯(22.5ml，105mmole)。4小時(shí)后，混合物用水(50ml)稀釋，用己烷(3×75ml)提取。用硫酸鎂干燥合并的有機(jī)層，過(guò)濾和濃縮得到標(biāo)題化合物(32.23g，100％)透明油狀物，它無(wú)需進(jìn)一步純化而使用1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.29(d，J＝6Hz，2H)，6.71(d，J＝6Hz，2H)，1.22(m，3H)，1.09(m，18H)。b)3-(芐氧基羰基)-3-丁烯酸甲酯在0℃將偶氮二羧酸二異丙基酯(32.8ml，166mmole)加入3-羧基-3-丁烯酸甲酯(20g，139mmole)、芐醇(17.2mg，166mmole)和三苯基膦(43.7g，166mmole)在無(wú)水THF(500ml)中的溶液。用溫?zé)岬脑∈够旌衔餃責(zé)岬绞覝亍?小時(shí)后，濃縮混合物，殘余物在硅膠上進(jìn)行色譜分離(10％EtOAc/己烷)。得到標(biāo)題化合物無(wú)色油狀物(29.46g，91％)1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.35(m，5H)，6.48(s，1H)，5.71(s，1H)，5.20(s，2H)，3.63(s，3H)，3.37(s，2H)。c)(±)-4-(4-三異丙基甲硅烷氧基苯基)-3-羧基丁酸甲酯將4-溴-1-(三異丙基甲硅烷氧基)苯(33.23g，100mmole)、3-(芐氧基羰基)-3-丁烯酸甲酯(28.11g，120mmole)、Pd(OAc)2(2.24g，10mmole)、P(o-甲苯基)3(6.09g，20mmole)和(異丙基)2NEt(34.8ml，200mmole)在丙腈(350ml)中的溶液脫氧(3x排空/N2凈化周期)，隨后加熱回流。18小時(shí)后，濃縮混合物，殘余物在硅膠上進(jìn)行色譜分離(10％EtOAc/己烷)得到黃色油狀物。將油狀物溶解在5％EtOAc/己烷(100ml)中，溶液在室溫下靜置。72小時(shí)后，過(guò)濾混合物，濾液濃縮得到粗(±)-4-(4-三異丙基甲硅烷氧基苯基)-3-(芐氧基羰基)-3-丁酸甲酯，是烯烴異構(gòu)體的混合物，它立即用于下一步驟。
將上述烯烴混合物分成兩部分。每個(gè)部分以如下方式反應(yīng)然后過(guò)濾后混合向10％Pd/C(7.4g)在EtOAc(100ml)中的懸浮液中加入上述烯烴混合物?；旌衔锩撗?3x排空/N2凈化周期)，然后通入H2(50psi)。4小時(shí)后，除去氫氣，混合物通過(guò)celite.填料過(guò)濾。濾液濃縮得到標(biāo)題化合物(24.64g，由4-溴-1-(三異丙基甲硅烷氧基)苯計(jì)算為89％)透明油狀物1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.01(d，J＝6Hz，2H)，6.80(d，J＝6Hz，2H)，3.62(s，3H)，3.05(m，2H)，2.65(m，1H)，2.40(m，2H)，1.21(m，3H)，1.09(m，18H)。d)(±)-N-[2-[4-(三異丙基甲硅烷氧基)芐基]-3-(甲氧羰基)丙酰基]絲氨酸芐酯在室溫下向(±)-3-羧基-4-[4-(三異丙基甲硅烷氧基)苯基]丁酸甲酯(5.00g，12.67mmole)在無(wú)水DMF(60ml)中的溶液中加入絲氨酸芐酯鹽酸鹽(3.52g，15.21mmole)，HOBt(2.06g，15.21mmole)，Et3N(5.3ml，38.01mmole)和EDC(2.92g，15.21mmole)。18小時(shí)后，濃縮混合物，殘余物在硅膠上進(jìn)行色譜分離(80％EtOAc/己烷)得到標(biāo)題化合物(5.76mg，79％)淺黃色油狀物MS(ES)m/e 572(M+H)+。e)(±)-3-[4-(芐氧基羰基)-1，3-唑啉-2-基]-4-[4-(三異丙基甲硅烷氧基)苯基]丁酸甲酯向(±)-N-[2-[4-(三異丙基甲硅烷氧基)芐基]-3-(甲氧羰基)丙酰基]絲氨酸芐酯(5.76g，10.07mmole)在無(wú)水THF(50ml)中的溶液中加入Burgess試劑(2.88g，12.08mmole)，混合物加熱回流。2小時(shí)后，將混合物冷卻到室溫并濃縮。殘余物在硅膠上進(jìn)行色譜分離(35％EtOAc/己烷)得到標(biāo)題化合物(4.45g，80％)透明油狀物MS(ES)m/e 554(M+H)+。f)(±)-3-[4-(芐氧基羰基)-1，3-唑-2-基]-4-[4-(三異丙基甲硅烷氧基)苯基]丁酸甲酯向0℃的(±)-3-[4-(芐氧基羰基)-1，3-唑啉-2-基]-4-[4-(三異丙基甲硅烷氧基)苯基]丁酸甲酯(4.45g，8.03mmole)在CH2Cl2(40ml)中的溶液中加入DBU(1.4ml，9.64mmole)，隨后加入溴三氯甲烷(0.95ml，9.64mmole)?；旌衔镉脺?zé)岬脑責(zé)岬绞覝亍?8小時(shí)后，濃縮混合物。殘余物在硅膠上進(jìn)行色譜分離(20％EtOAc/己烷)得到標(biāo)題化合物(2.23g，50％)透明油狀物MS(ES)m/e 552(M+H)+。g)(±)-3-[4-(芐氧基羰基)-1，3-唑-2-基]-4-(4-羥基苯基)丁酸甲酯向(±)-3-[4-(芐氧基羰基)-1，3-唑-2-基]-4-[4-(三異丙基甲硅烷氧基)苯基]丁酸甲酯(2.23g，4.04mmole)在無(wú)水THF(20ml)中的溶液中在0℃加入TBAF在THF中的溶液(1.0M，6.0ml，6.06mmole)。2小時(shí)后，混合物用飽和NH4Cl(10ml)稀釋，用CH2Cl2(3×15ml)提取。用硫酸鎂干燥合并的有機(jī)層，過(guò)濾并濃縮。殘余物在硅膠上進(jìn)行色譜分離(40％EtOAc/己烷)得到標(biāo)題化合物(1.4g，88％)灰白色泡沫MS(ES)m/e 396(M+H)+。h)(±)-3-[4-(芐氧基羰基)-1，3-唑-2-基]-4-[4-[(叔丁氧基羰基)氧基]苯基]丁酸甲酯向(±)-3-[4-(芐氧基羰基)-1，3-唑-2-基]-4-(4-羥基苯基)丁酸甲酯(700mg，1.77mmole)和碳酸二叔丁基酯(463mg，2.12mmole)在無(wú)水THF(10ml)中的溶液中在室溫下加入吡啶(0.17ml，2.12mmole)。18小時(shí)后，濃縮混合物。殘余物用己烷研制，過(guò)濾和真空干燥得到標(biāo)題化合物(765mg，87％)白色固體MS(ES)m/e 496(M+H)+。i)(±)-3-[4-羧基-1，3-唑-2-基]-4-[4-[(叔丁氧基羰基)氧基]苯基]丁酸甲酯將(±)-3-[4-(芐氧基羰基)-1，3-唑-2-基]-4-[4-[(叔丁氧基羰基)氧基]苯基]丁酸甲酯(765mg，1.54mmole)和10％Pd/C(164mg)在乙醇(20ml)中的混合物脫氧(3x排空/N2凈化周期)，隨后加入H2(50psi)。4小時(shí)后，除去氫氣，混合物通過(guò)celite.填料過(guò)濾。濃縮濾液得到標(biāo)題化合物659mg，100％)白色固體MS(ES)m/e 811(2M+H)+。
制備例5(±)-3-[4-(三氟甲基)噻唑-2-基]-4-(4-羥基苯基)丁酸甲酯的制備a)2-氰基甲基-4-(三氟甲基)噻唑?qū)?-氰基硫代乙酰胺(1.00g，9.99mmole)和3-溴-1-三氟丙-2-酮(1.04ml，9.99mmole)在無(wú)水EtOH(50ml)中混合，加熱回流。18小時(shí)后，冷卻混合物到室溫并濃縮。殘余物在硅膠上進(jìn)行色譜純化(15％EtOAc/己烷)得到標(biāo)題化合物(1.24g)，為與2-氰基乙酸乙酯的2∶1混合物MS(ES)m/e 385(2M+H)+。b)3-(4-芐氧基苯基)-2-[(4-三氟甲基)噻唑-2-基]丙烯腈將NaH(516mg，在礦物油中的60％分散液，12.9mmole)與無(wú)水EtOH(10ml)在0℃反應(yīng)。在氣體逸出停止后，混合物溫?zé)岬绞覝?。作為固體一次加入4-芐氧基苯甲醛(2.05g，9.68mmole)。向該混合物滴加2-氰基甲基-4-(三氟甲基)噻唑(1.24g)在無(wú)水EtOH(20ml)中的溶液。反應(yīng)混合物攪拌4小時(shí)，隨后通過(guò)過(guò)濾收集固體，用己烷洗滌得到標(biāo)題化合物(1.64g，42％上述兩個(gè)步驟)，為黃色固體1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.25(s，1H)，8.00(d，J＝6Hz，2H)，7.79(s，1H)，7.40(m，5H)，7.10(d，J＝6Hz，2H)，5.18(s，2H)。c)3-(4-芐氧基苯基)-2-氰基-2-[(4-三氟甲基)噻唑-2-基]環(huán)氧乙烷向3-(4-芐氧基苯基)-2-[(4-三氟甲基)噻唑-2-基]丙烯腈(500mg，1.29mmole)在CH3CN(5ml)中的溶液中加入中性氧化鋁(1.3g)。在室溫下滴加Clorox漂白劑(5ml)，1小時(shí)后，過(guò)濾混合物。濾液用水(20ml)稀釋并用CH2Cl2(3×20ml)提取。用硫酸鎂干燥合并的有機(jī)層，過(guò)濾和濃縮得到標(biāo)題化合物(425mg，82％)黃色油狀物，用于下一步驟是足夠純的。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.90(s，1H)，7.40(m，7H)，7.06(d，J＝6Hz，2H)，5.10(s，2H)，4.59(s，1H)。d)2-(4-芐氧基苯基)-1-[4-(三氟甲基)噻唑-2-基]乙酮在0℃向3-(4-芐氧基苯基)-2-氰基-2-[(4-三氟甲基)噻唑-2-基]環(huán)氧乙烷(425ml，1.06mmole)在CH2Cl2(7ml)中的溶液中滴加Et3SiH(0.85ml，5.3mmole)，隨后滴加BF3.OEt2(0.39ml，3.17mmole)。2小時(shí)后，將混合物傾入水(20ml)中，用CH2Cl2(3×20ml)提取。用硫酸鎂干燥合并的有機(jī)層，過(guò)濾和濃縮。
向在無(wú)水THF(7ml)中的上述殘余物在0℃下加入TBAF在THF中的溶液(1.0M，1.6ml，1.6mmole)。1小時(shí)后，將混合物傾入飽和NH4Cl(20ml)中，用EtOAc (3×20ml)提取。用硫酸鎂干燥合并的有機(jī)層，過(guò)濾和濃縮。殘余物在硅膠上色譜純化(5％EtOAc/己烷)得到標(biāo)題化合物(167mg，40％)白色固體1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.05(s，1H)，7.35(m，7H)，6.92(d，J＝6Hz，2H)，5.05(s，2H)，4.40(s，1H)。e)(±)-3-[4-(三氟甲基)噻唑-2-基]-4-(4-羥基苯基)丁酸甲酯在室溫下向NaH(35mg，0.88～mmole)在無(wú)水THF(2ml)中的懸浮液中滴加膦?；宜崛阴?0.17ml，0.88mmole)。15分鐘后，滴加2-(4-芐氧基苯基)-1-[4-(三氟甲基)噻唑-2-基]乙酮(167mg，0.44mmole)在無(wú)水THF(2ml)中的溶液，混合物加熱回流。18小時(shí)后，混合物冷卻到室溫，用飽和NH4Cl(10ml)驟冷，用EtOAc(3×20ml)提取。用硫酸鎂干燥合并的有機(jī)層，過(guò)濾和濃縮得到粗(±)-3-[4-(三氟甲基)噻唑-2-基]-4-(4-芐氧基苯基)丁烯酸乙酯油狀物。它無(wú)需純化用于下一步驟。
將(±)-3-[4-(三氟甲基)噻唑-2-基]-4-(4-芐氧基苯基)丁烯酸乙酯(0.44mmole，粗的)溶解于MeOH(4ml)中，在室溫下加入鎂屑(53mg，2.20mmole)。72小時(shí)后，將混合物傾入10％HCl(75ml)中，用CH2Cl2(3×50ml)提取。用硫酸鎂干燥合并的有機(jī)層，過(guò)濾和濃縮得到粗(±)-3-[4-(三氟甲基)噻唑-2-基]-4-(4-芐氧基苯基)丁酸甲酯。它無(wú)需純化用于下一步驟。
在室溫下向(±)-3-[4-(三氟甲基)噻唑-2-基]-4-(4-芐氧基苯基)丁酸甲酯(0.44mmole，粗的)在EtSH(5ml)中的溶液中加入BF3OEt2(0.3ml)。18小時(shí)后，加入另外的BF3OEt2(0.3ml)。另外18小時(shí)后，將混合物冷卻到0℃，用飽和NaHCO3仔細(xì)驟冷。得到的混合物用CH2Cl2(3×25ml)提取，用硫酸鎂干燥合并的有機(jī)層，過(guò)濾和濃縮。殘余物用硅膠進(jìn)行色譜純化(30％EtOAc/己烷)得到標(biāo)題化合物(123mg，81％上述3步)黃色油狀物MS(ES)m/e 346(M+H)+。
制備例6(±)-3-(5-甲基噻唑-2-基)-4-(4-羥基苯基)丁酸甲酯的制備a)4-(芐氧基)苯基乙酸甲酯向K2C03(20.7g，150mmole)在丙酮(50ml)中的懸浮液中加入4-羥基苯基乙酸甲酯(5.0g，30mmole)和芐基氯(10.4ml，90mmole)，混合物加熱回流。24小時(shí)后，混合物冷卻到室溫，過(guò)濾和濃縮。殘余物用硅膠進(jìn)行色譜純化(10％EtOAc/己烷)得到標(biāo)題化合物(7.7g，100％)白色固體1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.40(m，5H)，7.21(d，J＝6.6Hz，2H)，6.95(d，J＝6.6Hz，2H)，5.05(s，2H)，3.70(s，3H)，3.59(s，2H)。b)2-(4-芐氧基苯基)-1-(5-甲基噻唑-2-基)乙酮在-78℃下向5-甲基噻唑(0.21ml，2.34mmole)在無(wú)水THF(10ml)中的溶液中滴加正丁基鋰(0.94ml，2.5M，己烷溶液，2.34mmole)。15分鐘后，滴加在無(wú)水THF(5ml)中的4-芐氧基苯基乙酸甲酯(0.5g，1.95mmole)。30分鐘后，混合物用飽和NH4Cl(10ml)驟冷，溫?zé)岬绞覝?，用EtOAc(3×20ml)提取。用硫酸鎂干燥合并的有機(jī)層，過(guò)濾和濃縮。殘余物用硅膠色譜純化(15％EtOAc/己烷)得到標(biāo)題化合物白色固體(532mg，51％)MS(ES)m/e324(M+H)+。c)(±)-4-(4-芐氧基苯基)-3-(5-甲基噻唑-2-基)丁烯酸乙酯在室溫下向NaH(79mg，1.98mmole)在無(wú)水THF(2ml)中的懸浮液中滴加膦?；宜崛阴?0.39ml，1.98mmole)。15分鐘后，滴加2-(4-芐氧基苯基)-1-(5-甲基噻唑-2-基)乙酮(320mg，0.99mmole)在無(wú)水THF(3ml)中的溶液，混合物加熱回流。18小時(shí)后，混合物冷卻到室溫，用飽和NH4Cl(10ml)驟冷，用EtOAc(3×20ml)提取。用硫酸鎂干燥合并的有機(jī)層，過(guò)濾和濃縮，得到的油狀物無(wú)需純化用于下一步驟MS(ES)m/e 394(M+H)+。d)(±)-3-(5-甲基噻唑-2-基)4-(4-芐氧基苯基)丁酸甲酯將(±)-3-(5-甲基噻唑-2-基)-4-(4-芐氧基苯基)-丁烯酸乙酯(0.99mmole，粗的)溶解于MeOH(5ml)中，在室溫下加入鎂屑(120mg，4.95mmole)。72小時(shí)后，將混合物傾入10％HCl(75ml)中，用CH2Cl2(3×50ml)提取。用硫酸鎂干燥合并的有機(jī)層，過(guò)濾和濃縮得到粗標(biāo)題化合物，它無(wú)需純化用于下一步驟MS(ES)m/e 382(M+H)+。e)(±)-3-(5-甲基噻唑-2-基)-4-(4-羥基苯基)丁酸甲酯在室溫下向(±)-3-(5-甲基噻唑-2-基)-4-(4-芐氧基苯基)丁酸甲酯(0.99mmole，粗的)在EtSH(5ml)中的溶液中加入BF3OEt2(0.6ml)。18小時(shí)后，加入另外的BF3OEt2(0.6ml)。另外18小時(shí)后，將混合物冷卻到0℃，用飽和NaHCO3仔細(xì)驟冷。得到的混合物用CH2Cl2(3×25ml)提取，用硫酸鎂干燥合并的有機(jī)層，過(guò)濾和濃縮。殘余物用硅膠進(jìn)行色譜純化(50％EtOAc/己烷)得到標(biāo)題化合物(249mg，86％上述3步)黃色固體MS(ES)m/e292(M+H)+。
制備例7(4R，5S)-1-丙烯?；?3.4-二甲基-5-苯基咪唑烷-2-酮的制備向(4R，5S)-1，5-二甲基-4-苯基-2-咪唑烷酮(45.0g，237mmole)和(i-Pr)2NEt(62ml，355mmole)在CH2Cl2(1200ml)中的溶液中加入CuCl(50mg，0.51mmole)，隨后加入丙烯酰氯(29ml，355mmole)，混合物加熱回流。2小時(shí)后，混合物冷卻到室溫，用水(3×400ml)洗滌，用硫酸鎂干燥并濃縮。得到的固體用Et2O(300ml)研制，過(guò)濾收集得到標(biāo)題化合物(45.15g，78％)1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.72(dd，J＝17.0，10.5Hz，1H)，7.20-7.38(m，3H)，7.10-7.20(m，2H)，6.40(dd，J＝17.0，2.1Hz，1H)，5.77(dd，J＝10.4，2.0Hz，1H)，5.36(d，J＝8.5Hz，1H)，3.85-4.00(m，1H)，2.85(s，3H)，0.82(d，J＝6.6Hz，3H)；MS(ES)m/e 245(M+H)+。
制備例84-甲氧基苯基溴化鎂的制備在室溫下將4-甲氧基芐基氯(120g，766mmole)在無(wú)水THF(1.0L)中的溶液中在1.5小時(shí)內(nèi)滴加到鎂屑(74g，3.04mole)和I2(50mg，0.20mmole)在無(wú)水THF(0.5L)中的混合物中。在加入的最初10分鐘內(nèi)，棕色消失，反應(yīng)混合物變熱。在加完后1小時(shí)，反應(yīng)混合物恢復(fù)到室溫。用1，10-菲咯啉滴定顯示溶液是在THF中的0.36M格利亞試劑。
制備例9(S)-3-(3-氟苯基)-4-(4-羥基苯基)丁酸乙酯的制備(a)(4R，5S)-3，4-二甲基-1-[(E)-3-(3-氟苯基)丙-2-烯?；鵠-5-苯基咪唑烷-2-酮將1-溴-3-氟苯(525mg，3mmole)、(4R，5S)-1-丙烯?；?3，4-二甲基-5-苯基咪唑烷-2-酮(500mg，2mmole)，Pd(OAc)2(22mg，0.10mmole)、P(o-甲苯基)3(61mg，0.20mmole)和(iPr)2NEt(0.73ml，4.2mmole)在無(wú)水DMF(10ml)中的溶液脫氣(3x真空/N2清掃)，隨后加熱到110℃。2小時(shí)后，冷卻混合物，傾入EtOAc中。得到的混合物用水(3X)洗滌，合并的水層用乙酸乙酯反萃取。用硫酸鎂干燥合并的有機(jī)層，通過(guò)硅膠填料過(guò)濾和濃縮。殘余物溶解在1∶1的Et2O/己烷(10ml)中在-20℃下冷卻過(guò)夜。收集固體，真空干燥得到標(biāo)題化合物(514mg，76％)1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.18(d，J＝15.9Hz，1H)，7.64(d，J＝15.9Hz，1H)，7.15-7.45(m，8H)，6.98-7.10(m，1H)，5.42(d，J＝8.5Hz，1H)，3.88-4.03(m，1H)，2.88(s，3H)，0.85.(d，J＝6.6Hz，3H)；MS(ES)m/e 339(M+H)+。(b)(4R，5S)-3，4-二甲基-1-[(S)-3-(3-氟苯基)-4-(4-甲氧基苯基)丁酰基]-5-苯基咪唑烷-2-酮在-15℃將4-甲氧基苯基溴化鎂在THF中的溶液(0.31M，14.7ml，4.56mmole)滴加到攪拌的(4R，5S)-3，4-二甲基-1-[(E)-3-(3-氟苯基)丙-2-烯?；鵠-5-苯基咪唑烷-2-酮(514mg，1.52mmole)，CuBr·DMS配合物(229mg，1.06mmole)和ZnI2(582mg，1.82mmole)在THF/甲苯(10ml)中的懸浮液中。在1.5小時(shí)后，用飽和NH4Cl驟冷反應(yīng)，用EtOAc(3x)提取。用硫酸鎂干燥合并的有機(jī)層，濃縮至干。殘余物溶解在1∶1的Et2O/己烷中，在-20℃冷卻18小時(shí)。收集固體，用1∶1 Et2O/己烷洗滌，真空干燥得到第一批標(biāo)題化合物。濃縮濾液，殘余物用硅膠快速色譜純化(30％EtOAc/己烷)得到附加的標(biāo)題化合物黃色油狀物，它在真空中固化。標(biāo)題化合物的總產(chǎn)量是0.62g(91％)1H NMR(300MHz，CDCl3)δ6.75-7.37(m，13H)，5.10(d，J＝8.5Hz，1H)，3.80(s，3H)，3.65-3.85(m，1H)，3.63(dd，J＝16.7，9.6Hz，1H)，3.36-3.41(m，1H)，3.14(dd，J＝16.7，4.9Hz，1H)，2.72-2.88(m，2H)，2.79(s，3H)，0.74(d，J＝6.6Hz，3H).(c)(S)-3-(3-氟苯基)-4-(4-甲氧基苯基)丁酸乙酯將21％NaOEt在EtOH(0.6ml，1.8mmole)中的溶液加入(4R，5S)-3，4-二甲基-1-[(S)-3-(3-氟苯基)-4-(4-甲氧基苯基)丁?；鵠-5-苯基咪唑烷-2-酮(620mg，1.382mole)在THF(10ml)中的溶液中。攪拌反應(yīng)混合物1小時(shí)，隨后用飽和NH4Cl驟冷，EtOAc提取，干燥(MgS04)和濃縮得到殘余物，它通過(guò)硅膠填料(15％EtOAc/己烷)過(guò)濾。濃縮濾液得到標(biāo)題化合物(263mg，60％)透明油狀物1H NMR(300MHz，CDCl3)δ 7.13-7.35(m，1H)，6.80-7.00(m，5H)，6.70-6.80(m，2H)，4.00(q，J＝7.1Hz，2H)，3.81(s，3H)，3.28-3.45(m，1H)，2.83(d，J＝7.5Hz，2H)，2.65(dd，J＝15.4，6AHz，1H)，2.56(dd，J＝15.4，8.7Hz，1H)，1.12(t，J＝7.1Hz，3H)。(d)(S)-3-(3-氟苯基)-4-(4-羥基苯基)丁酸乙酯在-15℃下向(S)-3-(3-氟苯基)-4-(4-甲氧基苯基)丁酸乙酯(263mg，0.83mmole)在CH2Cl2(5ml)的溶液中滴加乙硫醇(0.30ml，4.16mmole)，隨后加入AlC3(555mg，4.16mmole)。30分鐘后，混合物溫?zé)岬绞覝?，再攪?0分鐘，隨后傾在冰上。使冰熔化，混合物用CH2Cl2(3x)提取。干燥(硫酸鎂)和濃縮得到殘余物，它通過(guò)硅膠填料(30％EtOAc/己烷)過(guò)濾。濃縮濾液得到標(biāo)題化合物(250mg，定量)1H NMR(300MHz，CDCl3)δ 7.10-7.35(m，1H)，6.78-7.00(m，5H)，6.58-6.78(m，2H)，5.00(s，1H)，4.00(q，2H)，3.28-3.45(m，1H)，2.83(d，2H)，2.50-2.75(m，2)，1.17(t，3H)。
制備例10(±)-4-(4-羥基苯基)-3-(吡啶-3-基)丁酸乙酯的制備(a)2-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-2-(吡啶-3-基)乙腈向3-吡啶甲醛(1.0g，9.34mmole)在CH3CN(45ml)中的溶液中加入KCN(6.0g，93mmole)，′IBDMSCl(1.7g，11.21mmole)和ZnI2(50mg，0.16mmole)。在室溫下4小時(shí)后，混合物通過(guò)celite過(guò)濾，濃縮濾液。快速硅膠色譜純化(25％EtOAC/己烷)得到標(biāo)題化合物(2.17g，94％)透明油狀物1H NMR(300MHz，CDCl3)δ 8.63-8.73(m，2H)，7.80-7.87(m，1H)，7.33-7.41(m，1H)，5.57(s，1H)，0.97(s，9H)，0.27(s，3H)，0.19(s，3H)。(b)(±)-3-(4-芐氧基苯基)-2-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-2-(吡啶-3-基)丙腈通過(guò)在0℃將正丁基鋰(2.5M己烷溶液，1.93ml，4.83mmole)加入二異丙基胺(0.63ml，4.83mmole)在無(wú)水THF(5ml)中的溶液中制備LDA。LDA溶液在-78℃下滴加到2-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-2-(吡啶-3-基)乙腈(1.0g，4.03mmole)在無(wú)水THF(15ml)中的溶液中。溶液攪拌15分鐘，隨后作為固體一次加入4-芐氧基芐基氯(1.41g，6.05mmole)。反應(yīng)在-78℃保持1 5分鐘，隨后溫?zé)岬绞覝亍Ｔ谑覝叵?0分鐘后，反應(yīng)用飽和含水NH4Cl驟冷，攪拌20分鐘。EtOAc提取(3X)，干燥(硫酸鎂)、濃縮和快速硅膠色譜純化(20％EtOAc/己烷)得到標(biāo)題化合物(769mg，43％)黃色油狀物1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ 8.80(窄m，1H)，8.67-8.70(m，1H)，7.75-7.80(m，1H)，7.33-7.53(m，6H)，7.08(d，2H)，6.93(d，2H)，5.10(s，2H)，3.30(1/2 Abq，1H)，3.18(1/2 Abq，1H)，0.99(s，9H)，0.12(s，3H)，0.08(s，3H)。(c)2-(4-芐氧基苯基)-1-(吡啶-3-基)乙酮在-15℃下將TBAF在THF中的溶液(1.0M，2.2ml，2.2mmole)滴加到(±)-3-(4-芐氧基苯基)-2-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-2-(吡啶-3-基)丙腈(769mg，1.73mmole)在無(wú)水THF(10ml.)中的溶液中。30分鐘后，反應(yīng)混合物在乙酸乙酯和水之間分配，分層，有機(jī)層用水洗滌，干燥(硫酸鎂)，通過(guò)硅膠填料過(guò)濾和濃縮得到不純的標(biāo)題化合物(492mg，94％)黃色固體MS(ES)m/e 304(M+H)+。使用該物質(zhì)無(wú)需進(jìn)一步純化。(d)4-(4-芐氧基苯基)-3-(吡啶-3-基)丁-2-烯酸乙酯在室溫下將膦?；宜崛阴?0.70ml，3.46mmole)滴加到NaH(60％礦物油分散液，138mg，3.46mmole)在無(wú)水THF(5ml)中的懸浮液中。當(dāng)氣體逸出停止時(shí)，加入2-(4-芐氧基苯基)-1-(吡啶-3-基)乙酮(約1.73mmole，制備例10(c)的不純物質(zhì))在無(wú)水THF(5ml)中溶液，將混合物加熱回流。18小時(shí)后，將混合物冷卻到室溫，用飽和含水NH4Cl驟冷，用EtOAc(3x)提取。干燥(硫酸鎂)合并的有機(jī)物，濃縮得到粗標(biāo)題化合物MS(ES)m/e 374(M+H)+。使用該物質(zhì)無(wú)需進(jìn)一步純化。(e)(±)-4-(4-羥基苯基)-3-(吡啶-3-基)丁酸乙酯4-(4-芐氧基苯基)-3-(吡啶-3-基)丁-2-烯酸乙酯(1.73mmole)和10％Pd/C(200mg)在EtOH(10ml)中的混合物在H2(50psi)下在Parr裝置中振蕩，4小時(shí)后，混合物通過(guò)celite過(guò)濾，濾液濃縮。用快速硅膠色譜純化(50％EtOAc/己烷)得到不純的標(biāo)題化合物(327mg，66％上述3步)黃色油狀物MS(ES)m/e 286(M+H)+。使用該物質(zhì)無(wú)需進(jìn)一步純化。
制備例11(S)-4-(4-羥基苯基)-3-(吡啶-3-基)丁酸乙酯的制備(a)(4R，5S)-3，4-二甲基-1-[(E)-3-(吡啶-3-基)丙-2-烯酰基]-5-苯基咪唑烷-2-酮將3-溴吡啶(8.6ml.，88.5mmole)、(4R，5S)-1-丙烯?；?3，4-二甲基-5-苯基咪唑烷-2-酮(14.4g，59mmole)，Pd(OAc)2(662mg，2.95mmole)、P(o-甲苯基)3(1.80g，5.9mmole)和(i-Pr)2NEt(22ml.，124mmole)在無(wú)水DMF(300ml)中的溶液脫氣(3x真空/N2清掃)，隨后加熱到110℃。2小時(shí)后，冷卻混合物，傾入EtOAc中。得到的混合物用水(3X)洗滌，合并的水層用乙酸乙酯(2X)反萃取。用硫酸鎂干燥合并的有機(jī)層，通過(guò)硅膠填料過(guò)濾和濃縮。殘余物溶解在1∶1的Et2O/己烷中，收集固體，用1∶1的Et2O/己烷洗滌，真空干燥得到第一批標(biāo)題化合物。濾液濃縮，重復(fù)結(jié)晶過(guò)程得到第二批產(chǎn)物。標(biāo)題化合物的總產(chǎn)量是17.53g(92％)1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.48-8.85(m，2H)，8.25(d，J＝15.9Hz，1H)，7.89-7.97(m，1H)，7.68(d，J＝15.9Hz，1H)，7.15-7.38(m，6H)，5.43(d，J＝8.5Hz，1H)，3.90-4.02(m，1H)，2.88(s，3H)，0.85(d，J＝6.6Hz，3H)；MS(ES)m/e 322(M+H)+。(b)(4R，5S)-3，4-二甲基-1-[(S)-4-(4-甲氧基苯基)-3-(吡啶-3-基)丁?；鵠-5-苯基咪唑烷-2-酮在-15℃將4-甲氧基苯基溴化鎂在THF中的溶液(0.33M，495ml，163.5mmole)滴加到攪拌的(4R，5S)-3，4-二甲基-1-[(E)-3-(吡啶-3-基)丙-2-烯?；鵠-5-苯基咪唑烷-2-酮(17.53g，54.5mmole)，CuBr·DMS配合物(14.1g，65.4mmole)和ZnI2(20.9g，65.4mmole)在THF/甲苯(270ml)中的懸浮液中。在1小時(shí)后，用9∶1的飽和NH4Cl/濃NH4OH驟冷反應(yīng)?；旌衔镌诔ㄩ_(kāi)下攪拌30分鐘。混合物用水稀釋，用EtOAc(3x)提取。用硫酸鎂干燥合并的有機(jī)層，濃縮。殘余物溶解在甲基叔丁基醚(MTBE，200ml)中，在-20℃貯存過(guò)夜。收集固體，用MTBE洗滌，真空干燥。該物質(zhì)由3∶1己烷/EtOAc重結(jié)晶得到標(biāo)題化合物(19.408g，80％)1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.72(br s，2H)，7.50(窄m，1H)，7.12-7.35(m，4H)，6.97-7.03～(m，2H)，6.94(d，J＝8.6Hz，2H)，6.72(d，J＝8.6Hz，2H)，5.11(d，J＝8.4Hz，1H)，3.70-3.90(m，2H)，3.70(s，3H)，3.43-3.58(m，1H)，3.03-3.18(m，1H)，2.75-2.95(m，2H)，2.71(s，3H)，0.66(d，J＝6.5Hz，3H)；MS(ES)m/e444(M+H)+。(c)(S)-4-(4-甲氧基苯基)-3-(吡啶-3-基)丁酸乙酯將21％NaOEt在EtOH(18.4ml.，56.88mmole)中的溶液中加入(4R，5S)-3，4-二甲基-1-[(S)-4-(4-甲氧基苯基)-3-(吡啶-3-基)丁?；鵠-5-苯基咪唑烷-2-酮(19.408g，43.8mmole)在THF(200ml)中的溶液中。攪拌反應(yīng)混合物1小時(shí)，隨后用飽和NH4Cl驟冷，EtOAc(3X)提取，干燥(MgSO4)合并的有機(jī)層并濃縮。殘余物溶解在1∶1乙酸乙酯/己烷中，過(guò)濾，濾液通過(guò)硅膠填料過(guò)濾(1∶1EtOAc/己烷)。濃縮濾液得到標(biāo)題化合物(9.25g，71％)橙色油狀物1H NMR(400MHz，CDCl3)δ 8.57(br s，2H)，7.44(窄m，1H)，7.17-7.25(m，1H)，6.95(d，J＝8.6Hz，2H)，6.76(d，J＝8.6Hz，2H)，4.01(q，3＝7.1Hz，2H)，3.75(s，3H)，3.33-3.48(m，1H)，2.91(dd，J＝13.7，7.3Hz，1H)，2.85(dd，J＝13.7，7.8Hz，1H)，2.71(dd，J＝15.6，6.5Hz，1H)，2.61(dd，J＝15.6，8.7Hz，1H)，1.13(t，J＝7.1Hz，3H)；MS(ES)m/e 300(M+H)+。(d)(S)-4-(4-羥基苯基)-3-(吡啶-3-基)丁酸乙酯將(S)-4-(4-甲氧基苯基)-3-(吡啶-3-基)丁酸乙酯(9.25g，31mmole)在CH2Cl2(150ml)中的溶液冷卻到0℃，加入乙硫醇(11.5ml，155mmole)，隨后分批加入AlC3(20.7g，155mmole)。2小時(shí)后，混合物傾入冰中，溫?zé)岬绞覝?，用碳酸氫鈉中和。得到的懸浮液通過(guò)celite過(guò)濾，過(guò)濾填料用CH2Cl2洗滌。分層，水層用CH2Cl2提取。干燥(硫酸鎂)合并的有機(jī)層和濃縮。在硅膠上快速色譜純化(1∶1 EtOAc/己烷)得到標(biāo)題化合物(6.435g，73％)1H NMR(400MHz，CDCl3)δ 8.72，8.41(dd，J＝4.9，1.5Hz，1H)，8.24(窄m，1H)，7.26(dd，J＝7.8，4.9Hz，1H)，6.78(d，J＝8.5Hz，2H)，6.64(d，J＝8.5Hz，2H)，4.03(q，J＝7.1Hz，2H)，3.34-3.48(m，1H)，2.92(dd，J＝13.7，6.1Hz，1H)，2.69-2.81(m，2H)，2.64(dd，J＝15.6，8.7Hz，1H)，1.13(t，J＝7.1Hz，3H)；MS(ES)m/e286(M+H)+。
實(shí)施例1(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]-1-乙氧基]苯基]-3-[4-(三氟甲基)苯基]丁酸的制備a)(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]-1-乙氧基]苯基]-3-[4-(三氟甲基)苯基]丁酸乙酯在0℃和N2下，將偶氮二羧酸二異丙基酯(0.15ml，0.767mmole)在2分鐘內(nèi)加入(±)-4-(4-羥基苯基)-3-[4-(三氟甲基)苯基]丁酸乙酯(270mg，0.767mmole)、6-(甲基氨基)-2-吡啶基乙醇(130mg，0.92mmole)和三苯基膦200mg，0.767mmole)在無(wú)水THF(5ml)中的溶液中。將黃色溶液保持在0℃10分鐘，隨后溫?zé)岬绞覝?。?4小時(shí)后，濃縮反應(yīng)混合物，殘余物用硅膠色譜純化(20％EtOAc/己烷)，得到標(biāo)題化合物(200mg，54％)無(wú)色油狀物MS(ES)m/e 487(M+H)+。b)(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]-1-乙氧基]苯基]-3-[4-(三氟甲基)苯基]丁酸將1.0N NaOH(8.2ml，0.823mmole)滴加到冷卻(15℃)的(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]-1-乙氧基]苯基]-3-[4-(三氟甲基)苯基]丁酸乙酯(200mg，0.41mmole)在MeOH(3ml)中的溶液中，混合物在室溫?cái)嚢?4小時(shí)。真空濃縮得到的溶液，殘余物溶解在水(5ml)中。用1.0NHCl調(diào)節(jié)pH至5，收集沉淀，用少量水洗滌，在60℃真空干燥。得到標(biāo)題化合物(120mg，64％)白色泡沫固體MS(ES)m/e 459(M+H)+。C25H25FN2O30.85H2O計(jì)算值C，63.38；H，5.68；N，5.91。實(shí)驗(yàn)值C，63.23；H，5.41；N，5.73。
實(shí)施例2(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]-1-乙氧基]苯基]-3-[4-[(N-甲基-N-苯基氨基)羰基]-1，3-唑-2-基]-丁酸的制備a)(±)-3-[4-[(N-甲基-N-苯基氨基)羰基]-1，3-唑-2-基]-4-(4-羥基苯基)丁酸甲酯向(±)-3-[4-羧基-1，3-唑-2-基]-4-[4-[(叔丁氧基羰基)氧基]苯基]丁酸甲酯(150mg，0.37mmole)、(i-Pr)2NEt(0.1ml，0.56mmole)、吡啶(0.09ml.，1.11mmole)和N-甲基苯胺(0.06ml.，0.56mmole)在無(wú)水DMF(2ml.)中的溶液中在室溫下加入BPFFH(382mg，1.11mmole)。18小時(shí)后，濃縮混合物，殘余物溶解在10％HCl(20ml)中，用CH2Cl2(3×20ml)提取。合并的有機(jī)層用硫酸鎂干燥，過(guò)濾和濃縮。
上述殘余物在室溫下溶解在二烷中的4 NHCl(10ml)中，18小時(shí)后，濃縮混合物。殘余物用硅膠進(jìn)行色譜純化(75％EtOAc/己烷)得到標(biāo)題化合物(146mg)橙色泡沫，被二(五亞甲基)脲污染MS(ES)m/e 417(M+H)+。b)(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]-1-乙氧基]苯基]-3-[4-[(N-甲基-N-苯基氨基)羰基]-1，3-唑-2-基]丁酸甲酯在0℃，將偶氮二羧酸二異丙基酯(0.15ml，0.74mmole)加入(±)-3-[4-[(N-甲基-N-苯基氨基)羰基]-1，3-唑-2-基]-4-(4-羥基苯基)丁酸甲酯(146mg，0.37mmole)、6-(甲基氨基)-2-吡啶基乙醇(113mg，0.74mmole)和三苯基膦(194mg，0.74mmole)在CH2Cl2(2ml.)中的溶液中。將混合物用溫?zé)嵩責(zé)岬绞覝亍?8小時(shí)后，濃縮混合物，殘余物用硅膠色譜純化(50％THF/己烷)，濃縮含有產(chǎn)物的餾分得到標(biāo)題化合物(322mg)，被三苯基氧化膦污染MS(ES)m/e 529(M+H)+。c)(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]-1-乙氧基]苯基]-3-[4-[(N-苯基-N-甲基氨基)羰基]-1，3-唑-2-基]-丁酸向(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]-1-乙氧基]苯基]-3-[4-[(N-甲基-N-苯基氨基)羰基]-1，3-唑-2-基]丁酸甲酯(322mg)在1∶1THF/H2O(2ml)中的溶液中在室溫下加入1.0N LiOH(0.35ml，0.35mmole)。18小時(shí)后，混合物用10％HCl調(diào)節(jié)pH到6，隨后濃縮至干。殘余物用逆相HPLC(梯度10-80％CH3CN/H2O，含有0.1％TFA)純化，合并含有產(chǎn)物的餾分，濃縮以除去乙腈。將得到的水溶液凍干得到標(biāo)題化合物(33mg，29％上述3步)白色固體MS(ES)m/e 515(M+H)+。C29H3～N4O51.85 TFA計(jì)算值C，54.13；H，4.42；N，7.72。實(shí)驗(yàn)值C，54.17；H，4.50；N，7.52。
實(shí)施例3(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]-1-乙氧基]苯基]-3-[4-(嗎啉-4-基)羰基]-1，3-唑-2-基]-丁酸的制備a)(±)-3-[4-(嗎啉-4-基)羰基]-1，3-唑-2-基]-4-(4-羥基苯基)丁酸甲酯向(±)-3-[4-羧基-1，3-唑-2-基]-4-[4-[(叔丁氧基羰基)氧基]苯基]丁酸甲酯(150mg，0.37mmole)、(i-Pr)2NEt(0.1ml，0.56mmole)、吡啶(0.09ml.，1.11mmole)和嗎啉(0.05ml.，0.56mmole)在無(wú)水DMF(2ml.)中的溶液中在室溫下加入BPFFH(382mg，1.11mmole)。18小時(shí)后，濃縮混合物，殘余物溶解在10％HCl(20ml)中，用CH2Cl2(3×20ml)提取。合并的有機(jī)層用硫酸鎂干燥，過(guò)濾和濃縮。
上述殘余物在室溫下溶解在二烷中的4N HCl(10ml)中，18小時(shí)后，濃縮混合物。殘余物用硅膠進(jìn)行色譜純化(100％EtOAc)得到標(biāo)題化合物(122mg，88％)透明油狀物1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.05(s，1H)，7.88(d，J＝6.6Hz，2H)，6.70(d，J＝6.6Hz，2H)，5.9(s，1H)，3.73(bs，8H)，3.62(s，3H)，2.85(m，5H)。b)(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基吡啶-2-基]-1-乙氧基]苯基]-3-[4-(嗎啉-4-基)羰基]-1，3-唑-2-基]丁酸甲酯在0℃，將偶氮二羧酸二異丙基酯(0.13ml，0.66mmole)加入(±)-3-[4-(嗎啉-4-基)羰基]-1，3-唑-2-基]-4-(4-羥基苯基)丁酸甲酯(122mg，0.37mmole)、6-(甲基氨基)-2-吡啶基乙醇(100mg，0.66mmole)和三苯基膦(173mg，0.66mmole)在CH2Cl2(2ml)中的溶液中。將混合物用溫?zé)嵩責(zé)岬绞覝亍?8小時(shí)后，濃縮混合物，殘余物用硅膠色譜純化(100％乙酸乙酯)，濃縮含有產(chǎn)物的餾分得到標(biāo)題化合物(94mg)，被三苯基氧化膦污染MS(ES)m/e 509(M+H)+。c)(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]-1-乙氧基]苯基]-3-[4-(嗎啉-4-基)羰基]-1，3-唑-2-基]-丁酸向(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]-1-乙氧基]苯基]-3-[4-(嗎啉-4-基)羰基]-1，3-唑-2-基]丁酸甲酯(94mg，0.18mmole)在1∶1 THF/H2O(2ml)中的溶液中在室溫下加入1.0N LiOH(0.25ml，0.25mmole)。18小時(shí)后，混合物用10％HCl調(diào)節(jié)pH到6，隨后濃縮至干。殘余物用逆相HPLC(梯度15-35％CH3CN/H2O，含有0.1％TFA)純化。合并含有產(chǎn)物的餾分，濃縮以除去乙腈。將得到的水溶液凍干得到標(biāo)題化合物(23mg，26％上述2步)白色固體MS(ES)m/e 495(M+H)+。C26H30N4O61.75 TFA計(jì)算值C，49.76；H，4.78；N，7.87。實(shí)驗(yàn)值C，49.93；H，4.97；N，7.84。
實(shí)施例4(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]-1-乙氧基]苯基]-3-[4-[[N-甲基-N-(2，2，2-三氟乙基)氨基]羰基]-1，3-唑-2-基]-丁酸的制備a)(±)-3-[4-[[N-甲基-N-(2，2，2-三氟乙基)氨基]羰基]-1，3-唑-2-基]-4-(4-羥基苯基)丁酸甲酯向(±)-3-[4-羧基-1，3-唑-2-基]-4-[4-[(叔丁氧基羰基)氧基]苯基]丁酸甲酯(150mg，0.37mmole)、(i-Pr)2NEt(0.1ml，0.56mmole)、吡啶(0.09ml.，1.11mmole)和N-甲基-N-(2，2，2-三氟乙基)胺鹽酸鹽(84mg，0.56mmole)在無(wú)水DMF(2ml.)中的溶液中在室溫下加入BPFFH(382mg，1.11mmole)。18小時(shí)后，濃縮混合物。殘余物溶解在10％HCl(20ml)中，用CH2Cl2(3×20ml)提取。合并的有機(jī)層用硫酸鎂干燥，過(guò)濾和濃縮。
上述殘余物在室溫下溶解在二烷中的4NHCl(10ml)中，18小時(shí)后，濃縮混合物。殘余物用硅膠進(jìn)行色譜純化(60％EtOAc/己烷)得到標(biāo)題化合物(298mg)透明油狀物，被二(五亞甲基)脲污染。油狀物無(wú)需進(jìn)一步提純用于下一步驟。b)(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基吡啶-2-基]-1-乙氧基]苯基]-3-[4-[[N-甲基-N-(2，2，2-三氟乙基)氨基]羰基]-1，3-唑-2-基]丁酸甲酯在0℃，將偶氮二羧酸二異丙基酯(0.15ml，0.74mmole)加入(±)-3-[4-[[N-甲基-N-(2，2，2-三氟乙基)氨基]羰基]-1，3-唑-2-基]-4-(4-羥基苯基)丁酸甲酯(298mg，0.37mmole)、6-(甲基氨基)-2-吡啶基乙醇(113mg，0.74mmole)和三苯基膦(194mg，0.74mmole)在CH2Cl2(2ml)中的溶液中。將混合物用溫?zé)嵩責(zé)岬绞覝亍?8小時(shí)后，濃縮混合物，殘余物用硅膠色譜純化(40％乙酸乙酯/己烷)，濃縮含有產(chǎn)物的餾分得到標(biāo)題化合物(115mg)，被三苯基氧化膦污染MS(ES)m/e 535(M+H)+。c)(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]-1-乙氧基]苯基]-3-[4-[[N-甲基-N-(2，2，2-三氟乙基)氨基]羰基]-1，3-唑-2-基]-丁酸向(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]-1-乙氧基]苯基]-3-[4-[[N-甲基-N-(2，2，2-三氟乙基)氨基]羰基]-1，3-唑-2-基]丁酸甲酯(155mg，0.22mmol)在1∶1THF/H2O(2ml)中的溶液中在室溫下加入1.0N LiOH(0.32ml，0.32mmole)。18小時(shí)后，混合物用10％HCl調(diào)節(jié)pH到6，隨后濃縮至干。殘余物用逆相HPLC(梯度10-80％CH3CN/H2O，含有0.1％TFA)純化，合并含有產(chǎn)物的餾分，濃縮以除去乙腈。將得到的水溶液凍干得到標(biāo)題化合物(42mg，37％上述3步)白色固體MS(ES)m/e 522(M+H)+。C25H27F3N4O5·1.4TFA計(jì)算值C，49.09；H，4.21；N，8.24。實(shí)驗(yàn)值C，49.18；H，4.18；N，8.22。
實(shí)施例5(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]-1-乙氧基]苯基]-3-[4-(三氟甲基)噻唑-2-基]丁酸的制備a)(±)-4-[4-[2-(6-甲基氨基吡啶-2-基)-1-乙氧基]苯基]-3-[4-(三氟甲基)噻唑-2-基]丁酸乙酯在0℃，將偶氮二羧酸二異丙基酯(0.14ml，0.71mmole)加入(±)-3-[4-(三氟甲基)噻唑-2-]-4-羥基苯基丁酸甲酯(123mg，0.37mmole)、6-(甲基氨基)-2-吡啶基乙醇(108mg，0.71mmole)和三苯基膦(186mg，0.71mmole)在CH2Cl2(2ml)中的溶液中。將混合物用溫?zé)岬脑責(zé)岬绞覝亍?8小時(shí)后，濃縮反應(yīng)混合物，殘余物用硅膠色譜純化(在1∶1甲苯/己烷中的40％EtOAc)，濃縮含有產(chǎn)物的餾分得到標(biāo)題化合物(114mg，被還原的DIAD污染)MS(ES)m/e 480(M+H)+。b)(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]-1-乙氧基]苯基]-3-[4-(三氟甲基)噻唑-2-基]丁酸向(±)-4-[4-[2-(6-甲基氨基吡啶-2-基)-1-乙氧基]苯基]-3-[4-(三氟甲基)噻唑-2-基]丁酸甲酯(114mg，0.24mmole)在1∶1 THF/H2O(2ml)中的溶液中在室溫下加入1.0N LiOH(0.36ml，0.36mmole)。18小時(shí)后，混合物用10％HCl調(diào)節(jié)pH到6，通過(guò)過(guò)濾收集得到的固體，在50℃真空干燥得到標(biāo)題化合物(43rng，42％)白色固體MS(ES)m/e 466(M+H)+。C22H22F3N3O3S 0.2H2O計(jì)算值C，56.33；H，4.81；N，8.96。實(shí)驗(yàn)值C，56.34；H，4.69；N，8.88。
實(shí)施例6(±)-4-[4-[2-(6-甲基氨基吡啶-2-基)-1-乙氧基]苯基]-3-(5-甲基噻唑-2-基)丁酸的制備a)(±)-4-[4-[2-(6-甲基氨基吡啶-2-基)-1-乙氧基]苯基]-3-(5-甲基噻唑-2-基)丁酸甲酯在0℃，將偶氮二羧酸二異丙基酯(0.25ml，1.28mmole)加入(±)-4-(4-羥基苯基)-3-(5-甲基噻唑-2-基)丁酸甲酯(249mg，0.85mmole)、6-(甲基氨基)-2-吡啶基乙醇(194mg，1.28mmole)和三苯基膦(336mg，1.28mmole)在TBME(5ml)中的溶液中。將混合物用溫?zé)岬脑責(zé)岬绞覝亍?2小時(shí)后，濃縮反應(yīng)混合物，殘余物用硅膠色譜純化(30％EtOAc/CHCl3)，濃縮含有產(chǎn)物的餾分得到標(biāo)題化合物(385mg，被三苯基氧化磷污染)MS(ES)m/e 426(M+H)+。b)(±)-4-[4-[2-(6-甲基氨基吡啶-2-基)-1-乙氧基]苯基]-3-(5-甲基噻唑-2-基)丁酸向(±)-4-[4-[2-(6-甲基氨基吡啶-2-基)-1-乙氧基]苯基]-3-(5-甲基噻唑-2-基)丁酸甲酯(0.85mmole)在1∶1 THF/H2O(5ml)中的溶液中加入1.0N NaOH(1.28ml，1.28mmole)。18小時(shí)后，混合物用10％HCl調(diào)節(jié)pH到6，濃縮至干。殘余物用硅膠進(jìn)行色譜純化(乙醇)得到標(biāo)題化合物黃色固體(217mg，62％，上述2步)。MS(ES)m/e 412(M+H)+。C22H25N3O3S 1.2H2O計(jì)算值C，61.01；H，6.38；N，9.70。實(shí)驗(yàn)值C，61.25；H，6.06；N，9.32。
實(shí)施例7(S)-3-(3-氟苯基)-4-[4-[2-(5，6，7，8-四氫-1，8-萘啶-2-基)乙氧基]苯基]丁酸的制備(a)(S)-3-(3-氟苯基)-4-[4-[2-(5，6，7，8-四氫-1，8-萘啶-2-基)乙氧基]苯基]丁酸乙酯在室溫下將偶氮二羧酸二異丙基酯(0.20ml，1.0mmole)滴加到(S)-3-(3-氟苯基)-4-(4-羥基苯基)丁酸乙酯(250mg，0.83mmole)、2-(5，6，7，8-四氫-1，8-萘啶-2-基)-1-乙醇(178mg，1.0mmole)和三苯基膦(262mg，1.0mmole)在無(wú)水THF(5ml)中的溶液中。18小時(shí)后，濃縮反應(yīng)混合物，殘余物用硅膠快速色譜純化(5∶1Et2O/己烷)得到不純的標(biāo)題化合物(236mg，61％)MS(ES)m/e 436(M+H)+。它無(wú)需進(jìn)一步純化即可使用。b)(S)-3-(3-氟苯基)-4-[4-[2-(5，6，7，8-四氫-1，8-萘啶-2-基)乙氧基]苯基]丁酸將1.0N LiOH(0.76ml，0.76mmole)加入(S)-3-(3-氟苯基)-4-[4-[2-(5，6，7，8-四氫-1，8-萘啶-2-基)乙氧基]苯基]丁酸乙酯(236mg，0.51mmole)在THF/H2O(3ml)中的溶液中，混合物在50℃加熱。18小時(shí)后，混合物冷卻到室溫，用10％含水HCl調(diào)節(jié)pH到6。加入EtOAc(5ml)，劇烈攪拌混合物。吸濾收集固體，用水(2X)和乙醚(2X)洗滌，在50℃真空干燥得到標(biāo)題化合物MS(ES)m/e 435(M+H)+。C26H27FN2O32.25HCl計(jì)算值C，60.46；H，5.71；N，5.42。實(shí)驗(yàn)值C，60.44；H，5.34；N，5.45。
實(shí)施例8(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]乙氧基]苯基]-3-(吡啶-3-基)丁酸的制備a)(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]乙氧基]苯基]-3-(吡啶-3-基)丁酸乙酯根據(jù)實(shí)施例7(a)的方法，只是用4-(4-羥基苯基)-3-(吡啶-3-基)丁酸乙酯(327mg，不純，1.15mmole)代替(S)-3-(3-氟苯基)-4-(4-羥基苯基)丁酸乙酯，用6-(甲基氨基)-2-吡啶基乙醇(210mg，1.38mmole)代替2-(5，6，7，8-四氫-1，8-萘啶-2-基)-1-乙醇，制備標(biāo)題化合物，為不純物質(zhì)，淺橙色固體，隨后用快速硅膠色譜純化(100％乙酸乙酯)MS(ES)m/e420(M+H)+。該物質(zhì)無(wú)需進(jìn)一步提純而使用。b)(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]乙氧基]苯基]-3-(吡啶-3-基)丁酸將1.0N LiOH(3.45ml，3.45mmole)加入(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]乙氧基]苯基]-3-(吡啶-3-基)丁酸乙酯(1.15mmole)在THF/H2O(5ml)中的溶液中，混合物在50℃加熱。18小時(shí)后，反應(yīng)混合物冷卻到室溫，用10％含水HCl調(diào)節(jié)pH到6?；旌衔镉寐确?3X)提取，合并的有機(jī)層用硫酸鎂干燥并濃縮。殘余物用C-18 Bond-Elute柱色譜純化(20％CH3CN/H2O)。合并含有產(chǎn)物的餾分，用CHCl3(3x)提取，合并的有機(jī)層用硫酸鎂干燥并濃縮。將得到的固體溶解在2M NaOH中，用EtOAc(2x)洗滌。放棄EtOAc提取物，水層酸化到pH6，用CHCl3(3x)提取。合并的有機(jī)層用硫酸鎂干燥并濃縮得到標(biāo)題化合物(51mg，11％)白色固體1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.32(m，2H)，7.54(dd，J＝8.7，7.2～Hz，1H)，7.38-7.46(m，1H)，7.12(dd，J＝7.8，4.9Hz，1H)，6.86(d，J＝8.6Hz，2H)，6.68(d，J＝8.6Hz，2H)，6.52(d，J＝7.2Hz，1H)，6.37(d，J＝8.7Hz，1H)，4.15-4.30(m，2H)，3.39-3.52(m，1H)，2.98-3.20(m，3H)，2.85(s，3H)，2.80(dd，J＝13.7，8.9Hz，1H)，2.68(dd，J＝15.1，8.3Hz，1H)，2.59(dd，J＝15.1，6.7Hz，1H)；MS(ES)m/e 392(M+H)+。C23H25N3O3.1.3HCl計(jì)算值C，62.95；H，6.04；N，9.57；實(shí)驗(yàn)值C，35 62.84；H，5.87；N，9.20。
實(shí)施例9(S)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]乙氧基]苯基]-3-(吡啶-3-基)丁酸的制備a)(S)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]乙氧基]苯基]-3-(吡啶-3-基)丁酸乙酯在0℃將偶氮二羧酸二異丙基酯(7.8ml，39.8mmole)滴加到(S)-4-(4-羥基苯基)-3-(吡啶-3-基基)丁酸乙酯(9.455g，33.1mmole)、6-(甲基氨基)-2-吡啶基乙醇(6.06g.39.8mmole)和三苯基膦(10.44g，39.8mmole)在無(wú)水THF(150ml)中的溶液中?；旌衔镉脺?zé)岬脑責(zé)岬绞覝兀?8小時(shí)后，濃縮反應(yīng)混合物，殘余物用硅膠快速色譜純化(在1∶1EtOAc/CHCl3中的3％MeOH)得到標(biāo)題化合物(9.2g，66％)粘性黃色油狀物1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.43(dd，J 15＝4.8，1.6Hz，1H)，8.39(d，J＝1.9Hz，1H)，7.31-7.45(m，2H)，7.13-7.21(m，1H)，6.91(d，J＝8.6Hz，2H)，6.77(d，J＝8.6Hz，2H)，6.53(d，J＝7.3Hz，1H)，6.24(d，J＝8.2Hz，1H)，4.43-4.58(m，1H)，4.26(t，J＝7.0Hz，2H).3.92-4.05(m，2H)，3.32-3A5(m，1H)，3.04(t，J＝7.0Hz，2H)，2.89(d，J＝5.3Hz，3H)，2.88(dd，J＝13.7，7.2Hz，1H)，2.82(dd，J＝13.7，7.8Hz，1H)，2.70(dd，J＝15.6，6.3Hz，1H)，2.59(dd，J＝15.6，9.0Hz，1H)，1.11(t，J＝7.1Hz，3H)；MS(ES)m/e 420(M+H)+。b)(S)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]乙氧基]苯基]-3-(吡啶-3-基)丁酸將2.0M NaOH(15ml，30mmole)加入(S)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]乙氧基]苯基]-3-(吡啶-3-基)丁酸乙酯(9.2g，22mmole)在二烷/H2O(100ml)中的溶液中，混合物在50℃加熱。18小時(shí)后，混合物冷卻到室溫，用10％HCl(25ml)酸化，濃縮到1/3體積以沉淀膠狀物。傾去上清液，膠狀物在水和氯仿之間分配。分層，水層用氯仿(3X)提取。合并的有機(jī)層用硫酸鎂干燥并濃縮。殘余物溶解在水和2MNaOH中。溶液用Et2O(2x)洗滌。放棄Et2O提取物。水層用10％HCl(50ml)酸化，濃縮到1/3體積，用CHCl3(3x)提取。合并有機(jī)層，用硫酸鎂干燥并濃縮得到泡沫。該泡沫溶解在CH2Cl2中，溶液用己烷稀釋和濃縮。該過(guò)程重復(fù)三次。得到的固體在65℃下真空干燥得到標(biāo)題化合物(7.96g.92％)1H NMR(400MHz，MeOH-d4)δ8.28(窄m，1H)，8.21(d，J＝1.7Hz，1H)，7.68(窄m，1H)，7.48(dd，J＝8.5，7.3Hz，1H)，7.30(dd，J＝7.9，4.9Hz，1H)，6.91(d，J 8.6Hz，2H)，6.72(d，J 8.6Hz，2H)，6.56(d，J＝7.3Hz，1H)，6.44(d，J＝8.5Hz，1H)，4.20(t，J＝6.6Hz，2H)，3.31-3.42(m，1H)，3.02(t，J＝6.6Hz，2H)，2.97(dd，J＝13.6，6.5Hz，1H)，2.87(s，3H)，2.77(dd，J＝13.6，8.9Hz，1H)，2.71(dd，J＝15.6，6.4Hz，1H)，2.62(dd，J＝15.6，8.9Hz，1H)；MS(ES)m/e 392(M+H)+。C23H25N3O30.1H2O計(jì)算值C，70.25；H，6.46；N，10.68。實(shí)驗(yàn)值C，70.32；H，6.50；N，10.32。
實(shí)施例10(S)-3-(吡啶-3-基)-4-[4-[2-(5，6，7，8-四氫-1，8-萘啶-2-基)乙氧基]苯基]丁酸的制備(a)(S)-3-(吡啶-3-基)-4-[4-[2-(5，6，7，8-四氫-1，8-萘啶-2-基)乙氧基]苯基]丁酸乙酯在室溫下將偶氮二羧酸二異丙基酯(0.41ml，2.1mmole)滴加到(S)-4-(4-羥基苯基)-3-(吡啶-3-基)丁酸乙酯(500mg，1.75mmole)、2-(5，6，7，8-四氫-1，8-萘啶-2-基)-1-乙醇(374mg，2.1mmole)和三苯基膦(551mg，2.1mmole)在無(wú)水THF(8ml)中的溶液中。18小時(shí)后，濃縮反應(yīng)混合物，殘余物用硅膠快速色譜純化(90％EtOAc/己烷然后5％EtOH/EtOAc)得到標(biāo)題化合物(572mg，73％)油狀物1HNMR(400MHz，CDCl3)δ8.43(dd，J＝4.8，1.6Hz，1H)，8.39(d，J＝1.9Hz，1H)，7.17(窄m，1H)，7.17(dd，J＝7.8，4.8Hz，1H)，7.07(d，J＝7.3Hz，1H)，6.90(d，J＝8.6Hz，2H)，6.76(d，J＝8.6Hz，2H)，6.44(d，J＝7.3Hz，1H)，4.75(brs，1H)，4.21(t，J＝7.0Hz，2H)，3.93-4.08(m，2H)，3.31-3A5(m，3H)，2.99(t，J＝7.0Hz，2H)，2.88(dd，J＝13.7，7.2Hz，1H)，2.82(dd，J＝13.7，7.8Hz，1H)，2.65-2.75(m，3H)，2.59(dd，J＝15.6，9.0Hz，1H)，1.85-1.95(m，2H)，1.12(t，J＝7.1Hz，3H)；MS(ES)m/e 446(M+H)+。b)(S)-3-(吡啶-3-基)-4-[4-[2-(5，6，7，8-四氫-1，8-萘啶-2-基)乙氧基]苯基]丁酸將1.0M LiOH(2.6ml，2.6mmole)加入(S)-3-(吡啶-3-基)-4-[4-[2-(5，6，7，8-四氫-1，8-萘啶-2-基)乙氧基]苯基]丁酸乙酯(572mg，1.28mmole)在THF/H2O(8ml)中的溶液中，混合物在50℃加熱。18小時(shí)后，反應(yīng)混合物冷卻到室溫，用10％含水HCl酸化到pH6.0。吸濾收集沉淀的固體，用水洗滌，真空干燥得到標(biāo)題化合物(414mg，77％)1H NMR(400MHz，MeOH-d4)δ8.28(dd，J＝4.9，1.4Hz，1H)，8.21(d，J＝1.8Hz，1H)，7.68(d，J＝8.0Hz，1H)，7.257.27(m，2H)，6.91(d，J＝8.6Hz，2H)，6.71(d，J＝8.6Hz，2H)，6.53(d，J＝7.3Hz，1H)，4.08-4.22(m，2H)，3.30-3.45(m，3H)，2.90-3.05(m，3H)，2.70-2.85(m，3H)，2.68(dd，J＝15.2，6.7Hz，1H)，2.58(dd，J＝15.2，8.5Hz，1H)，1.80-1.97(m，2H)；MS(ES)m/e 418(M+H)+。C23H25N3O30.25H2OC，71.15；H，6.57；N，9.96。實(shí)驗(yàn)值C，71.11；H，6.66；N，9.82。
實(shí)施例11腸胃外的劑量單位組合物如下制備含有20mg實(shí)施例1化合物的無(wú)菌干粉末的制劑將20mg所述化合物溶解在15ml蒸餾水中，溶液在無(wú)菌條件下過(guò)濾裝入25ml多劑量安瓿中并凍干。粉末通過(guò)加入20ml的5％葡萄糖水溶液(D5W)重新構(gòu)成用于靜脈內(nèi)和肌內(nèi)注射。因而劑量通過(guò)注射體積確定。隨后可通過(guò)將計(jì)量體積的該劑量單位加入其它用于注射的D5W體積中稀釋或計(jì)量的單位可加入用于分散藥物的機(jī)構(gòu)，例如用于IV滴注輸入或其它注射輸入系統(tǒng)的瓶或袋中。
實(shí)施例12口服劑量單位組合物用于口服給藥的膠囊通常將50mg的實(shí)施例1的化合物與75mg的乳糖和5mg的硬脂酸鎂混合和研磨制備。將得到的粉末過(guò)篩，填充入硬明膠膠囊中。
實(shí)施例13口服劑量單位組合物用于口服給藥的片劑通過(guò)將20mg蔗糖、150mg硫酸鈣二水合物和50mg實(shí)施例1的化合物和10％明膠溶液混合和造粒。將濕顆粒過(guò)篩，干燥與10mg淀粉、5mg滑石和3mg硬脂酸混合，壓制成片。
如上描述完全公開(kāi)了如何進(jìn)行和使用本發(fā)明的化合物。然而，本發(fā)明并不限制于本文描述的具體實(shí)施方案，它包括所有在如下權(quán)利要求范圍內(nèi)的所有改變。本文引用的各種雜志、專利和其它出版物包括了現(xiàn)有技術(shù)的狀態(tài)，全部描述的內(nèi)容列為本文參考文獻(xiàn)。
權(quán)利要求
1.式(I)化合物 其中R1是Het-或Ar；R2是 或其可藥用的鹽。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中R1是 其中R’是C1-4烷基和R”是苯基、芐基或-CH2CF3；或R’和R”連接形成嗎啉環(huán)。
3.權(quán)利要求1的化合物，其中R2是
4.權(quán)利要求1的化合物，其中R2是
5.化合物，它是(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]-1-乙氧基]苯基]-3-[4-(三氟甲基)苯基]丁酸；(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]-1-乙氧基]苯基]-3-[4-(N-甲基-N-苯基氨基)羰基]-1，3-噁唑-2-基]丁酸；(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]-1-乙氧基]苯基]-3-[4-[(嗎啉-4-基)羰基]-1，3-噁唑-2-基]丁酸；(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]-1-乙氧基]苯基]-3-[4-[[N-甲基-N-(2，2，2-三氟乙基)氨基]羰基]-1，3-噁唑-2-基]丁酸；(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]-1-乙氧基]苯基]-3-[4-(三氟甲基)噻唑-2-基]丁酸；(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]-1-乙氧基]苯基]-3-(3-甲基噻唑-2-基)丁酸；(S)-3-(3-氟苯基)-4-[4-[2-(5，6，7，8-四氫-1，8-萘啶-2-基)乙氧基]苯基]丁酸；(±)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]乙氧基]苯基]-3-(吡啶-3-基)丁酸；(S)-4-[4-[2-[6-(甲基氨基)吡啶-2-基]乙氧基]苯基]-3-(吡啶-3-基)丁酸；和(S)-3-(吡啶-3-基)-4-[4-[2-(5，6，7，8-四氫-1，8-2-基)乙氧基]苯基]丁酸；或其可藥用的鹽。
6.藥物組合物，其含有權(quán)利要求1-5的任一的化合物和可藥用的載體。
7.藥物組合物，其含有權(quán)利要求1的化合物、抗腫瘤藥和可藥用的載體。
8.權(quán)利要求6的藥物組合物，其中抗腫瘤藥是托泊替堪和順鉑。
9.藥物組合物，其含有權(quán)利要求1的化合物、骨吸收抑制劑和可藥用的載體。
10.治療其中顯示αvβ3受體的拮抗作用的疾病癥狀的方法，包括向需要的患者給藥權(quán)利要求1的化合物。
11.治療其中顯示αvβ5受體的拮抗作用的疾病癥狀的方法，包括向需要的患者給藥權(quán)利要求1的化合物。
12.治療骨質(zhì)疏松的方法，包括向需要的患者給藥權(quán)利要求1的化合物。
13.抑制血管生成、腫瘤生長(zhǎng)或腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，包括向需要的患者給藥權(quán)利要求1的化合物。
14.治療動(dòng)脈粥樣硬化、再狹窄或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，包括向需要的患者給藥權(quán)利要求1的化合物。
15.抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法，包括以逐步或以物理結(jié)合形式給藥 1的化合物和抗腫瘤藥。
16.權(quán)利要求15的方法，其中抗腫瘤藥是托泊替堪和順鉑。
17.治療骨質(zhì)疏松或抑制骨損失的方法，包括以逐步或以物理結(jié)合形式給藥權(quán)利要求1的化合物和骨吸收抑制劑。
18.用作藥物的權(quán)利要求1-5的任一的化合物。
19.權(quán)利要求1定義的式(I)化合物在生產(chǎn)治療其中顯示αvβ3受體的拮抗作用的疾病的藥物中的用途。
20.權(quán)利要求1定義的式(I)化合物在生產(chǎn)治療其中顯示αvβ5受體的拮抗作用的疾病的藥物中的用途。
21.權(quán)利要求1定義的式(I)化合物在生產(chǎn)用于治療骨質(zhì)疏松的藥物中的用途。
22.權(quán)利要求1定義的式(I)化合物在生產(chǎn)用于抑制血管生成、腫瘤生長(zhǎng)或腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物中的用途。
23.權(quán)利要求1定義的式(I)化合物在生產(chǎn)用于治療動(dòng)脈粥樣硬化、再狹窄或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物中的用途。
24.權(quán)利要求1定義的式(I)化合物和抗腫瘤藥在生產(chǎn)以物理結(jié)合或逐步給藥形式用于抑制腫瘤生長(zhǎng)的藥物中的用途。
25.權(quán)利要求24的用途，其中抗腫瘤藥是托泊替堪和順鉑。
26.權(quán)利要求1定義的式(I)化合物和骨吸收抑制劑在生產(chǎn)以物理結(jié)合或逐步給藥形式用于治療骨質(zhì)疏松的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了式(I)化合物或其可藥用的鹽,它們是玻璃體結(jié)合蛋白受體拮抗劑,用于治療骨質(zhì)疏松,其中R
文檔編號(hào)A61K31/5377GK1377269SQ00812613
公開(kāi)日2002年10月30日 申請(qǐng)日期2000年9月7日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月7日
發(fā)明者彼得·J·曼利, 威廉·H·米勒, 艾琳·N·烏津斯卡斯 申請(qǐng)人:史密絲克萊恩比徹姆公司