專利名稱：治療對治療有抗性的腫瘤的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及癌癥治療領域，更具體地說，涉及治療對治療有抗性的腫瘤的組合物和方法。
背景技術：
該公開文本自始至終，通過第一作者和日期，專利號或公開號引用參考各文獻。該說明書中可以看到各參考文獻的總文獻目錄。這些出版物的公開內容被引入本公開文本中作為參考以更詳細地描述本發(fā)明所涉及的本領域的狀況。
癌癥對化學治療的抗性是一個主要的健康護理問題。抗性機理可以分作兩種類型內源性的和獲得性的。對于癌癥，大多數(shù)抗藥性是酶介導的?；蛘呤前忻笇瘜W治療以太高的水平表達，從而不能阻斷其活性同時沒有對宿主的不可接受的毒性；或者酶被快速改變化學治療的染病細胞表達，從而破壞其治療活性。當染病細胞喪失腫瘤抑制劑基因功能(p53，RB，p16)時，癌癥發(fā)生對化學治療的內源性抗性。當該內源性抗性發(fā)生時，細胞周期自始至終組成性地表達酶，例如胸苷酸合成酶(TS)和二氫葉酸還原酶(DHFR)(Yeager和Reznikoff(1998)J.Urol.(159)(2)581-5；el-Deiry(1997)Curr.Opin.Oncol.9(1)79-87；Goker，Waltham，等(1995)血液(Blood)86(2)677-84；Banerjee，Ercikan-Abali等(1995)ActaBiochem Pol42(4)457-64；Fan和Bertino(1997)癌癥基因(Oncogene)14(10)1191-1200；Slansky和Farnham(1996)生物測試(Bioassay)18(1)55-62；Lenz，Danenberg等(1998)臨床癌癥研究(Clin.CancerRes.)4(5)1227-34；和Lee等(1997)表達細胞研究(Exp.CellRes.)234(2)270-6)。這導致對氟代嘧啶(通過提高TS的表達)或對甲氨蝶呤(通過提高水平的DHER的表達)的內源性抗性的增加。最新治療的發(fā)展大部分限制在開發(fā)更好的酶抑制劑，或者對要抑制的新的酶的研究(Hu等(1998)藥物科學雜志(J.Pharm.Sci.)87(7)886-90；Drake等(1996)生化藥理學(Biochem.Pharmacol)51(10)1349-55；Schultz等(1999)抗癌研究(Anticancer Res.)19(1A)437-43；Touroutoglou和Pazdur(1996)臨床癌癥研究(Clin.Cancer Res.)2(2)227-43；和Handfield和Levesque(1999)FEMS微生物研究(FEMSMicrobiol.Rev.)23(1)69-91)。申請人發(fā)現(xiàn)了很好地定向表征的酶的治療的新途徑。該項技術與先前的和歷史上的對癌癥治療的途徑不同，并且稱之為“ECTA”，即酶催化的治療性激活。
本發(fā)明的公開本發(fā)明提供選擇性抑制病理腫瘤細胞的方法，特征在于表達內源性的細胞內激活酶。該方法要求使細胞接觸有效量的底物化合物從而選擇性抑制細胞的增殖。該底物前體藥物化合物不滅活該酶。
本發(fā)明還提供抑制通過使至少兩種表達內源性的細胞內酶的試驗細胞接觸候選前體藥物而被內源性的細胞內酶在細胞內選擇性轉化為毒素的前體藥物的篩選方法和內源性的細胞內酶將前體藥物激活成毒素物質的測定方法。
附圖簡要描述

圖1圖示說明本發(fā)明的ECTA前體藥物的作用機理。
圖2是說明從溴乙基2’-脫氧尿苷一磷酸(“BVdUMP”)與重組人胸苷酸合成酶(“rHuTS”)培養(yǎng)得到的熒光產(chǎn)物的圖。BVdUMP與胸苷酸合成酶(“TS”)的溫育導致熒光產(chǎn)物的時間和酶依賴性產(chǎn)生。BVdUMP與指定量的rHuTS在標準反應混合物中在30℃下溫育(材料和方法)，但是從反應中省去了N5，N10-亞甲基四氫葉酸。與各數(shù)據(jù)曲線相鄰的數(shù)字參見TS酶單位。
圖3說明在rHuTS中BVdUMP與脫氧尿苷一磷酸(“dUMP”)競爭。在不存在(三角形)和存在(方形)20μMBVdUMP下，體外進行將dUMP轉化為dTMP的胸苷酸合成酶催化的反應。dUMP的濃度范圍是10-100μM，N5，N10-亞甲基四氫葉酸濃度是140μM，酶濃度是0.1μM。通過測量A340的增加測定酶活性。
圖4說明證明與BVdUMP的預先溫育不滅活rHuTS的實驗結果。人胸苷酸合成酶在反應混合物中與和不與125μM的BVdUMP預先溫育。20小時后，加入BVdUMP至125μM的濃度，dUMP至125μM的終濃度，加入N5，N10-亞甲基四氫葉酸至70μM的濃度。通過測量A340的增加測定胸苷酸合成酶活性。實心圓(預先溫育的反應)，虛心圓(沒有預先溫育的)。
圖5是體外反應產(chǎn)物的結構òrHuTS催化的BVdUMP的體外反應的產(chǎn)物的結構。結構I和II與沒有細胞的反應混合物中鑒定的質量離子相吻合。
圖6是提出的NB1011激活的機理。NB1011一定能夠進入細胞并且在與TS反應之前轉化為BVdUMP。推測TS轉化后產(chǎn)生的結構是外環(huán)嘧啶核苷一磷酸。這些化合物可以通過各種機理而對細胞有細胞毒性，包括干擾核苷和核酸代謝。
圖7說明對用NB1011處理過的H630R10細胞中BVdUMP的檢測。用100μM NB1011將H630R10細胞處理5天，然后進行材料與方法中描述的LC/MS分析。
圖8證明NB1011不會在體外不可逆滅活TS。完整細胞內NB1011對TS活性的作用完全是可逆的。根據(jù)材料與方法中所述，通過從5-[3H]脫氧尿苷釋放[3H]2O測定完整RKO細胞內TS活性。通過更換新鮮培養(yǎng)基，在37℃下培養(yǎng)60分鐘，然后重復該過程，從細胞中洗出NB1011。對對照和未處理過的細胞進行相同的洗滌程序。
圖9說明NB1011和抗-HER2要求的體外效力之間具有顯著的相似性。A).從表3，4和7采集的數(shù)據(jù)。B).來自Shepard等(1991)臨床免疫學雜志(J.Clin.Immun.)11(3)117-27的數(shù)據(jù)。縱向條塊表示利用Mann-WhitneyU測定計算的平均值的標準誤差。
圖10說明NB1011具有對托木迪斯(Tomudex)抗性癌癥的高活性。根據(jù)下面材料與方法所述，在alamar藍分析中測定對TDX8細胞系的細胞毒性。
圖11說明人正常和腫瘤結腸組織中胸苷酸合成酶的轉錄水平。據(jù)下面材料與方法所述進行RT-PCR分析。都校正為β-肌動蛋白的腫瘤與正常組織樣品中TSmRNA的比例(從左至右)是14.35，7.31，0.75，59.5，2.53，24.1和4.0。
圖12A說明NB1011抑制5-FU抗性結腸癌的生長。治療攜帶H630R10(5FU抗性)人結腸癌的裸鼠。在治療的第一天(第一天)開始測量腫瘤。
圖12B是對NB1011的長期反應。第25天對收集的數(shù)據(jù)進行分析。統(tǒng)計學分析在下面的材料與方法章節(jié)中描述。
圖13是說明多種人組織中TS的mRNA水平的示意圖。通過利用RT-PCR測定TSmRNA水平。定量測定相應于胸苷酸合成酶的DNA帶并且通過分子動力學反應(Molecular Dyuamics Storm)校正為β-肌動蛋白的情況。1-20欄表示人正常組織中TSmRNA水平。表達水平表示為相對于結腸(16欄)的值。第21和22欄表示7對結腸正常組織和癌癥組織中平均TS轉錄水平。表達值是相對于正常結腸組織(第21欄)的值。
圖14說明用抗胸苷酸合成酶抗體和tubilin進行的SDS PAGE蛋白質印跡估計的用Tomudex或NB1011篩選的細胞內TS表達水平。泳道1表示MCF7細胞，沒有用藥物選擇；泳道2表示用2μM tomudex選擇的MCF7細胞；泳道3如泳道2一樣表示MCF7細胞，但是之前使用NB1011作為選擇試劑進行后續(xù)篩選；泳道4如泳道2一樣表示MCF7細胞，之前在沒有Tomudex下通過。
實施本發(fā)明的方法除非另有說明，本發(fā)明的實施將應用本領域技術人員公知的分子生物學，藥物化學，有機化學，微生物學，細胞生物學和重組DNA的常規(guī)技術。參見，例如Sambrook等，分子克隆實驗手冊(MOLECULARCLONINGA LABORATORY MANUAL)第二版(1989)分子生物學現(xiàn)行方法(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)F.M.Ausubel等編著(1987))；酶學方法(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(AcademicPress.Inc.)PCR2實用方法(PCR2A PRACTICALAPPROACH)(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor編著(1995))和動物細胞培養(yǎng)(ANIMAL CELL CULTURE)(R.I.Freshney編著(1987))。
如在說明書和權利要求書中使用的，除非清楚指明外，單數(shù)形式的“一個”和“這個”包括多數(shù)形式。例如，術語“一個細胞”包括細胞的復數(shù)，包括其混合物。
術語“包括”意指組合物和方法包括指明的要素，但是不排除其它。當用來定義組合物和方法時，“基本上由…組成”意指排除任何對組合基本上顯著的其它要素。因此，如本文定義的基本上由一些要素組成的組合物不排除來自分離和純化方法和藥學可接受載體例如磷酸鹽緩沖液，防腐劑等的痕量雜質?！坝伞M成”應該指排除比其它成分的痕量要素多的要素和用于施用本發(fā)明的組合物的基本方法步驟。這些轉換術語各自定義的實施方案在本發(fā)明的范圍內。
“組合物”意指活性物質與惰性的(例如可檢測試劑或標記物或藥學可接受載體)或活性的(例如佐劑)其它化合物或成分的組合。
“藥物組合物”意指包括使組合物適合體外，體內或離體診斷或治療的活性物質與惰性或活性載體的組合。
如這里使用的，術語“藥學可接受載體”包括任何標準藥學載體，例如磷酸鹽緩沖液，水，和乳濁液，例如油/水或水/油乳濁液，各種類型的濕潤劑。該組合物還包括穩(wěn)定劑或防腐劑。載體，穩(wěn)定劑和佐劑的例子參見Martin，REMINGTON’S PHARM.SCI.第15版(MackPubl.Co.，Easton(1975))。
“有效量”是足以得到有利的或期望的結果的量?？梢砸淮位蚨啻谓o與，施用或給藥施用有效量。
“受試者”，“個體”或“患者”在這里互換使用，指脊椎動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人。哺乳動物包括但不限于鼠，猴，人，農(nóng)場動物，運動動物和寵物。
如這里使用的，術語“接觸”包括體外，離體和體內施用前體藥物。當體內給藥時，對受試者施用有效量前體藥物。如這里使用的，術語“受試者”意包括所有的合適的動物模型，例如小鼠，大鼠，兔，猴。也包括對人患者給藥。
“對照”是在實驗中使用的其他受試者或樣品，用于對比目的。對照可以是“陽性”或“陰性”對照。例如，實驗目的是測定基因的改變的表達水平與某種特定類型癌癥的關系時，一般優(yōu)選使用陽性對照(攜帶這種改變并且表現(xiàn)出該疾病特征的癥狀的受試者或來自受試者的樣品)，和陰性對照(沒有這種改變的表達和該疾病的臨床特征的受試者或來自受試者的樣品)。
如這里使用的，術語“病理細胞”，“靶細胞”，“試驗細胞”和“過度增殖細胞”包括特征在于細胞內酶的基因突變或內源性過度表達激活的細胞。在一些實施方案中，酶的過度表達與腫瘤抑制劑基因產(chǎn)物功能藥物抗性的喪失或與病理表型相關的的基因不穩(wěn)定性有關?？顾幮灾猩婕岸喾N細胞機理，例如改變的藥物代謝，對于活性化合物的細胞的不滲透性或加快藥物從細胞的消失，被抑制的酶的特異性改變，靶分子的產(chǎn)生增加，細胞毒性損傷的修復加快，或者改變的生物化學途徑抑制的反應的旁路。被激活或過度表達和與抗藥性相關的酶包括但不限于胸苷酸合成酶，二氫葉酸還原酶，酪氨酸激酶和多抗藥性酶；和ATP-依賴性多抗藥性相關的蛋白質，和，在某些疾病中，包括結腸癌和前列腺癌，拓撲異構酶I。或者，對一種藥物的抗藥性可以轉移給其它生物化學上不同的藥物。
對化學治療的抗性中涉及某些基因的擴增。二氫葉酸還原酶(DHFR)的擴增與對甲氨蝶呤的抗性相關而編碼胸苷酸合成酶的基因的擴增與對用5-嘧啶治療腫瘤的抗性相關。根據(jù)(Kashini-Sabet等(1988)癌癥研究(Cancer Res.)485775-5778)美國專利No.5085983所述，通過改進的聚合酶鏈反應(PCR)可以檢測和監(jiān)測與抗藥性相關的基因擴增。通過測定細胞遺傳異常，例如均與基因擴增有關的同源染色體染色區(qū)和雙微染色體，能夠監(jiān)測獲得性抗藥性。另外的測試包括直接或間接酶活性測定，這兩者均與基因擴增相關，和其它方法(例如聚合酶鏈反應或免疫組織化學)。
或者，病理細胞被表征為具有滅活的腫瘤抑制劑功能，例如已知增強活性酶例如TS的表達的成視網(wǎng)膜細胞瘤(RB)或p53的消除或失活。
治療方法一方面，本發(fā)明涉及通過使細胞接觸通過內源性細胞內活性酶在細胞內選擇性轉化為毒素的底物前體藥物而抑制病理細胞的增殖的方法。本發(fā)明的方法和組合物優(yōu)選用于抑制內源性表達胞內酶的細胞的生長或增殖，這發(fā)生在一些過度增殖的細胞或瘤細胞(例如胃癌細胞，結腸癌細胞和乳腺癌細胞)中。是本發(fā)明的選擇性靶物和前體藥物的激活酶的內源性胞內酶的例子包括但不限于胸苷酸合成酶(TS)和二氫葉酸還原酶(“DHFR”)。利用激活胸苷酸合成酶(TS)詳細說明本發(fā)明的概念。但是，使用TS只是說明性的，不認為權利要求書僅局限于針對TS的體系。胸苷酸合成酶是用于治療癌癥的充分表征的靶物，也已經(jīng)被用作傳染病靶物。胸苷酸合成酶是一種說明性靶物，激活酶，因為其結構和功能的高度表征(Carreras和Santi(1995)Anne.Rev.Biochem 64721-726)，其由單一基因而不是基因族(例如GST)表達的事實，最后，因為該酶的過度表達預示對化學治療的抗性和疾病的更加惡化(Johnston和Allegra(1995)癌癥研究(CancerRes.)55(7)1407-12)。
在一個實施方案中，前體藥物是具有這里更詳細描述中定義的結構的化合物。術語前體藥物指活性治療劑的母體。完美的前體藥物是在被期望的機理激活之前是藥理學惰性的前體藥物。前體藥物方案是指對病灶有潛在定向毒性的治療方法，從而避免全身毒性。針對這一目的已經(jīng)進行了很多探索。Mead等(1996)癌癥研究(CancerRes.)262374-2379以及Nichol和Hakala(1966)生化藥理學(Biochem.Pharmacol.)151621-1623報道了用于癌癥治療的前體藥物的第一次嘗試。該嘗試的指導性原理是在甲氨蝶呤-抗性白血病中靶向過度表達二氫葉酸還原酶。因為在甲氨蝶呤-抗性腫瘤細胞中二氫葉酸還原酶的升高可能會將高葉酸轉化為對胸苷酸合成酶的代謝毒物，期望有腫瘤細胞的自身毒性。后來發(fā)現(xiàn)高葉酸的合理的抗腫瘤效果不是由于代謝激活，而更可能是由于對葉酸轉運到細胞內的抑制作用(Livingston等(1968)生物化學(Biochem.)7(8)2814-2818)。下面的表1中匯總了用于進行治療的裂解腫瘤的選擇性靶物的前體藥物-樣嘗試。
表1.前體藥物方案比較

下面結果的一項或幾項混淆了這些探討a)適當定位激活酶和/或缺少靶向酶的腫瘤選擇性；b)激活的前體藥物的系統(tǒng)分布和得到的毒性；和c)實現(xiàn)需要的防止被除靶向的酶之外的酶激活的底物酶特異性。例如，Morgan等(1998)癌癥研究(Cancer Res.)582568-2575描述的谷胱甘肽-s-轉移酶(GST)前體藥物，在對GST有特異性的同時，不只是對腫瘤過度表達的GST-P1-I有特異性，而且也能被GST-A1-1激活。這導致不適當?shù)乃幬锛せ钭饔煤蜐撛诘亩拘浴Ｔ谏衔谋?中提供的引用參考文獻中更詳細討論了很多這樣的論述。通過提供靶向酶的前體藥物(所述酶由于轉錄激活和/或腫瘤抑制劑基因喪失后發(fā)生的基因擴增而在腫瘤細胞中選擇性過度表達)，本發(fā)明的方法和組合物避免了現(xiàn)有技術前體藥物的缺點。
在本發(fā)明的另一個方面中，激活酶被表征為在大多數(shù)癌癥中，并且特別是在已經(jīng)接受氟代嘧啶治療(5-FU，5-FudR，Xeloda)或者其它TS抑制劑(例如Tomudex)的癌癥中，過度表達(喪失所有的p53，RB或p16腫瘤抑制劑功能的那些)。本發(fā)明的前體藥物進一步表征為對正常細胞基本上沒有毒性。該方面進一步增強前體藥物的選擇性，因為只有異?；虿B(tài)細胞提供有效量的前體藥物的有毒代謝產(chǎn)物來抑制細胞增殖，并且更優(yōu)選地，選擇性殺死細胞。事實上，申請人第一次注意到通過本發(fā)明的方法和前體藥物選擇性殺死表達比正常量多的激活酶的細胞而不關酶的活性，例如TS活性，正如Roberts(1966)生物化學(Biochem.)5(11)3546-3548測定的。因此，術語“過度表達”指TS蛋白質的總量，而不是根據(jù)氚釋放(Roberts(1966)上文)測定的TS酶活性。在下面的實驗章節(jié)中證明這一點。
開發(fā)藥物的焦點在于抑制劑。抑制劑的基本原理是與大多數(shù)正常細胞相比，大多數(shù)腫瘤細胞在體內更頻繁地分裂。結果，腫瘤細胞中TS的平均量比它們的正常細胞中TS的平均量高。用這些化合物發(fā)現(xiàn)有限藥效，伴隨明顯的劑量-限制性毒性。二十世紀中葉發(fā)展到廣泛應用這些化合物，氟代嘧啶類，并且發(fā)現(xiàn)其在治療晚期胃腸癌的用途(Heidelberger等(1983)酶學相關領域分子生物學進展(Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.)5458-119)。5-氟代尿嘧啶的最初發(fā)展具有另外的支持和Heidelberger發(fā)現(xiàn)的基本原理，即在細胞培養(yǎng)中，與正常細胞相比，腫瘤細胞更快代謝尿嘧啶(Heidelberger等(1957)氟代嘧啶及其核苷，“實驗藥物學手冊”(Handbook ofExperimental Pharmacology)pp.193-231)。治療反應速度一直在大約25-30％左右。沒有治療的患者通常存活大約6個月，用氟代嘧啶治療，存活至多一年(Midgley和Kerr(1999)Lancet 353(9150)391-9和van Laar，Rustum等(1998)歐洲癌癥雜志(Eur.J.Cancer)34(3)296-306)。
持續(xù)開發(fā)可替代的藥劑的方案或新的抑制TS活性的方法很少能使或不會使存活率提高。例如，開發(fā)更完美的TS抑制劑，例如Tomudex，沒有導致存活率的顯著提高，但是Tomudex的毒性曲線與氟代嘧啶不同(Blackledge(1998)英國癌癥雜志(Br.J.Cancer)77(增刊.2)29-37)。最后，因為氟代嘧啶治療和Tomudex治療都導致TS水平升高，發(fā)現(xiàn)明顯的交叉-抗性。用氟代嘧啶無效用Tomudex也難治(Farrugia(1998)歐洲癌癥雜志(Eur.J.Cancer)34(7)987-91)。當前的狀況是開發(fā)通過新的機理進攻5FU/Tomudex抗性腫瘤細胞的化學療法。
本發(fā)明的另一方面是通過對受試者施用治療有效量的前體藥物治療受試者病理細胞的方法，所述前體藥物通過如上定義的內源性胞內酶在細胞內轉化為毒素。該酶是“過度表達”的并且接受治療的細胞是腫瘤細胞或癌細胞。
當對受試者例如小鼠，大鼠或人施用前體藥物時，可以將前體藥物加到藥學可接受載體中并且全身給藥或局部給藥。
為了確定可以有利地接受治療的患者，要從患者取出腫瘤樣品并且對細胞測定靶酶的表達水平。如果表達高于在正常細胞中的表達使得毒性量的前體藥物會引起給藥并且沒有不期望的副作用，則測得該腫瘤或細胞有利地可接受治療，因此，該患者適合本發(fā)明的治療。例如，與正常細胞相比，靶酶表達至少高大約2倍并且優(yōu)選至少大約3倍更優(yōu)選高于4倍，則該患者是適合接受本發(fā)明治療方法的患者。可以根據(jù)經(jīng)驗確定治療量，并且治療量隨著治療的病理狀態(tài)，被治療的患者和轉化的前體藥物或細胞毒素而不同。
當送遞給動物時，該方法用于進一步證明前體藥物的藥效。作為動物模型的一個例子，分別用大約105至大約109個如上定義的過度增殖的癌細胞或靶細胞皮下接種裸鼠組(Balb/cNCR nu/nu雌性Simonsen，Gilroy，CA)。當有了腫瘤時，施用前體藥物，例如，通過在腫瘤周圍皮下注射。一周兩次用venier卡尺兩維測量腫瘤以確定腫瘤體積的減小。如果合適也可以使用其它動物模型。在下文的材料與方法章節(jié)中舉例說明了該方法。
以一次劑量，或者在整個治療過程中連續(xù)式或間歇式進行體內給藥。測定最有效方式和施用劑量的方法對于本領域技術人員是公知的并且隨著用于治療的組合物，治療的目的，和治療的靶細胞而不同。通過治療醫(yī)生選擇的劑量水平和方式進行一次或多次給藥。下面可以看到施用前體藥物的合適的劑量形式和方法。
本發(fā)明的前體藥物和組合物可以用于制備藥物和通過根據(jù)常規(guī)方法例如在藥物組合物中的活性成分給藥用于治療人和其它動物。
藥物組合物可以口服，鼻內，腸胃外或通過吸入療法給藥，并且可以是片劑，錠劑，顆粒劑，膠囊，丸劑，安瓿，栓劑或氣霧劑形式。它們也可以是活性成分在含水或不含水稀釋劑中的懸浮液，溶液和乳濁液形式，糖漿，顆粒劑或粉末劑形式。除了本發(fā)明的化合物之外，所述藥物組合物還可以含有其它藥物活性化合物或多種本發(fā)明的化合物。
更具體地說，本發(fā)明的結構式的化合物也在這里指作活性成分，可以通過任何合適的途徑施用用于治療，包括口服，直腸，鼻，局部(包括經(jīng)皮，氣霧劑，含劑和舌下)，陰道，腸胃外(包括皮下，肌內，靜脈內和皮內)和肺內。還要理解優(yōu)選途徑將隨著接受者的狀況和年齡以及治療的疾病而不同。
一般情況下，對于各上述化合物的合適的劑量是每天每公斤接受者體重大約1至大約100毫克范圍內，優(yōu)選每天每公斤接受者體重大約1至大約50毫克范圍內，最優(yōu)選每天每公斤接受者體重大約1至大約25毫克范圍內。除非另有說明，所有的活性化合物重量對于鹽或者其酯以本發(fā)明的母體化合物來計算，重量將按比例增加。一天內以合適的時間間隔施用兩次，三次，四次，五次，六次或更多次亞劑量。可以以單位劑量形式施用這些亞劑量，例如每單位劑量形式含有大約1至大約100毫克，優(yōu)選大約1至高于大約25毫克，最優(yōu)選大約5至高于大約25毫克的活性成分。要理解本發(fā)明的化合物和組合物的劑量可以依賴于疾病類型和嚴重程度和階段，并且可以隨著患者與患者的變化而不同。確定最佳劑量一般涉及本發(fā)明的治療有益水平與任何風險或不利的副作用的平衡。
理想情況是，施用前體藥物實現(xiàn)在病灶處活性化合物的最高濃度。例如，通過靜脈內注射，任選地，在鹽水中，或者口服，例如，作為含有活性成分的片劑，膠囊或糖漿來實現(xiàn)。通過連續(xù)輸液到疾病組織中以提供治療量的活性成分可以保持期望的前體藥物的血液水平。操作組合的應用涉及提供比單獨使用各治療化合物或方法可能需要較低劑量的前體藥物從而降低副作用的治療組合。
對于癌癥治療的性質和基礎討論在不斷地變化。這種變化是對疾病的分子基礎的更好理解的結果。在這些新領域的研究導致對非惡性疾病的實驗性的，或者在某些情況下是日常性的應用。用于細胞毒性抗腫瘤治療的相同藥物成為于下面治療方案的的重要組成部分類風濕性關節(jié)炎(甲氨蝶呤和環(huán)磷酰胺)，器官移植(甲氨蝶呤和硫唑嘌呤)，鐮狀細胞性貧血(羥基脲)，抗-感染性化學治療(trimetrexate和亞葉酸)，和牛皮癬(甲氨蝶呤)。因此，許多內科、外科和兒科專家使用這些藥物用于腫瘤和非腫瘤疾病。對這些疾病機理的理解也可以幫助確定對治療疾病(包括癌癥)的藥物組合的更好方法。例如，現(xiàn)在已知通過不同機理起作用的不同化學治療，并且合適的組合能導致協(xié)同效果。NB1011通過被胸苷酸合成酶激活而起作用，并且推測得到的異常核苷酸干擾核苷酸代謝中的多個步驟(圖6)。與通過不同的機理起作用的化學治療或生物療法結合應該給出增強的或協(xié)同的活性。這樣的化合物的例子包括1)阿霉素，其通過多個機理起作用，包括DNA插入和自由基形成；2)拓撲異構酶抑制劑(象topotecan)，其誘導DNA在復制期間單鏈斷裂；3)抗激素，包括抗雌激素(例如三苯氧胺)或抗雄激素(例如氟硝丁酰胺)，或生物制品，象干擾素(例如內含子A)。在后面這些情況下中，通過關連激素；誘導多條途徑(包括誘導胞內核酸酶和抑制癌基因表達)的干擾素，抗激素抑制生長刺激。通過利用烷基化試劑，象氮芥子氣，其修飾和滅活很多細胞成分，但是最重要的是修飾DNA配對和編程性細胞死亡，也可以看到與NB1011的協(xié)同作用。
將這里描述的前體藥物與上述另外的治療結合是本發(fā)明的另一方面。例如，這里描述的前體藥物優(yōu)選與通過不是通過本發(fā)明前體藥所經(jīng)途徑發(fā)揮它們的毒性作用的藥物結合。所述另外的治療化合物包括但不限于制管張素，抗雌激素和拓撲異構酶抑制劑。另外，本發(fā)明的前體藥物和方法可以與完全根治腫瘤的手術或放療結合。
可以有多種方法確定治療方法是否達到了目的。這包括但不限于RT-PCR分析，生長抑制研究(alamar藍測試)和噬菌斑測定。這些方法是本領域公知的并且在本文中有所描述。
申請人也發(fā)現(xiàn)用底物前體藥物處理過的細胞可以轉化為適當?shù)赝ㄟ^常規(guī)療法處理的先前的表型。用TS作為例子，申請人證明用5-FU處理過的癌細胞變得對藥物有抗性。此時，用NB1011處理細胞。亞群成活并且變得對NB1011有抗性但是再次獲得對5-FU的敏感性(參見表9和圖14)。因此，本發(fā)明提供了上述方法，其中有效量的另一種活性劑與本發(fā)明的底物前體藥物一起施用。一方面，第二種或第三種活性劑是細胞對其預先產(chǎn)生抗藥性的藥物。所述另外的活性劑可以在施用底物前體藥物的同時或隨后給藥。
本發(fā)明進一步提供了與對應的正常細胞相比病理細胞過量產(chǎn)生或過度表達的激活酶選擇性轉化的前體藥物；例如動物細胞，哺乳動物細胞，或人細胞。申請人發(fā)現(xiàn)幾種實施本發(fā)明的優(yōu)選前體藥物。這些化合物的結構和合成方法在下面的材料與方法中描述。
本發(fā)明的另一方面是通過對受試者施用有效量前體藥物治療受試者的方法，所述前體藥物被這里定義的激活酶細胞內轉化為毒素。另一方面，在施用底物前體藥物的同時或隨后共同施用有效量的至少一種另外的治療活性劑。
篩選測試本發(fā)明進一步提供篩選前體藥物的方法，通過提供至少兩種表達激活酶的試驗細胞并且使該細胞接觸候選前體藥物，在病理細胞中所述前體藥物被選擇性轉化為毒素。測試所述酶將該前體藥物激活為毒物的反應。在一個實施方案中，第一種試驗細胞是如上定義的病理細胞，另一種試驗細胞是表達正常水平酶的對應的正常細胞。另一方面，可檢測標記的候選前體藥物。在一個實施方案中，可檢測標記是熒光標記。在另一個實施方案中，可檢測標記是相同原子例如溴原子的至少兩個或多個不同的同位素。在該實施方案中，人們通過反應產(chǎn)物的質譜能檢測前體藥物修飾為毒性副產(chǎn)物。通過純化毒性產(chǎn)物并且接著分別測定其選擇性抑制病理細胞的增殖并且對正常細胞不產(chǎn)生可分辨的毒性的能力證實產(chǎn)生了毒性代謝產(chǎn)物的候選活性劑的治療療效。通過對上述合適的動物模型施用前體藥物和毒性代謝產(chǎn)物能夠實現(xiàn)進一步證明。
如這里使用的，試驗細胞可以是表達所述酶或者被轉化表達所述胞內酶的原核細胞或真核細胞。例如，不內源性表達胞內酶TS的原核生物大腸埃希氏桿菌是合適的宿主細胞或靶細胞。類似于上文對真核細胞所述進行大腸埃希氏桿菌的轉染?；蛘撸瑴y試細胞可以是從受試者分離的病理細胞，或者表達所述酶的培養(yǎng)細胞。細胞可以有對照對應物(缺少靶酶)，或者在另一個實施方案中，是經(jīng)基因修飾差異表達靶酶或酶(表達不同水平靶酶)的對應物。可以使用一種以上的酶來分別轉導各宿主細胞，使得候選藥物對靶酶的作用同時與其對另一種酶或者來自另一物種的相應的酶的作用相比較。
在另一個實施方案中，將第三靶細胞用作陽性對照，因為其接受有效量的化合物，例如下面給出的化合物，它們是有效的前體藥物。
Ras-轉化的NIH3T3細胞(ATCC，10801 UniversityBLVD.，Manassas，VA 20110-2209，美國)是合適的真核細胞。對細胞進行基因工程處理使從編碼所述酶的克隆cDNA可變量和漸增量表達感興趣的靶酶。轉染是使用本領域公知的方法和上文Sambrook等描述的方法的瞬時轉染或永久轉染。插入所述cDNA的合適的載體是從Stratagene，La Jolla，CA和其它供應商處購得。使用預先產(chǎn)生的抗所述酶的單克隆或多克隆抗體用于免疫檢測，通過細胞溶胞產(chǎn)物中的免疫印跡和免疫測試，可以監(jiān)測各轉染的細胞系中酶的表達水平。通過導入到細胞中的表達盒的拷貝數(shù)或者通過利用不同的啟動子可以調節(jié)表達量。也可以根據(jù)Carreras和Santi(1995)(上文)或下文描述的方法來進行檢測表達的酶的量的酶測定。
試驗細胞在小的多孔板上培養(yǎng)并且被用來測定試驗前體藥物的生物活性。為了本發(fā)明目的，成功的候選藥物將抑制病理細胞的生長或者殺死它但是不傷害對照細胞型。
可以將候選前體藥物直接加入細胞培養(yǎng)基中或者預先偶聯(lián)一種對細胞表面受體特異性的配體然后加入培養(yǎng)基。細胞特異性送遞的偶聯(lián)方法是本領域公知的，參見例如美國專利No.5459127；5264618；和公開的專利說明書WO91/17424(1991年11月14日公開)。候選前體藥物的離去基團可以用例如氚可檢測性標記。然后對靶細胞或培養(yǎng)基測定從候選前體藥物釋放的標記的量?；蛘撸ㄟ^使用本領域公知的方法將前體藥物包裝到脂質體中或者與細胞轉染劑組合(這也是本領域公知的)可以增強細胞攝入。
應該明白，盡管不總是明確地陳述，但是通過提供不同的靶細胞作為對照通過接受有效量的化合物(例如下面給出的化合物(已經(jīng)證明其是潛在的前體藥物))可以進一步改動各實施方案。
這里還提供了本方法鑒定的活性劑。
利用上述篩選，人們也可以從獲自受試者(例如人患者)的樣品預篩選幾種前體藥物。人們可以利用該項篩選來測定最有效的底物前體藥物和針對各靶酶和受試者的治療。該方法在上文中作了更詳細的描述。
本發(fā)明的前體藥物I.材料與方法A.合成方法通過Dyer等的方法(Dyer等(1991)核酸化學改進的和新的合成方法，方法和技術，Townsend等(編著)John Wiley&Sons，Inc.，紐約，pp.79-83)制備(E)-5-(2-溴乙烯基)-2’-脫氧尿苷(BVdU)。在真空下在75℃下分別干燥該化合物和購得的(Fisher/Acros)5-氟-2’-脫氧尿苷(5FdU)，在使用之前用P2O5干燥。在Chromatotron儀器(HarrisonResearch，Palo Alto，CA)上進行徑向層析，使用帶有熒光指示劑的Merck硅膠-60作為吸附劑。通過BVdU的標準化學磷酸化作用制備(E)-5-(2-溴乙烯基)-2’-脫氧尿苷5’-一磷酸(“BVdUMP”)。
在Varian Associates Gemini分光計上在300MHz處記錄NMR 1HNMR譜，使用六氘化-二甲亞砜(C2H3)2SO溶液。以d＝0.0ppm內標四甲基甲硅烷參照物相對表示化學位移。在75MHz處記錄13CNMR譜，以d＝39.5ppm內標五氘化-二甲亞砜相對表示化學位移。在Bruker光度計上在202MHz處記錄31P NMR譜，以d＝0.0ppm外標85％H2O/15％H3PO4，體積/體積比，相對表示化學位移。
如下制備NB1011(E)-5-(2-溴乙烯基)-2’-脫氧-5’-尿苷基苯基L-丙氨?；被姿狨?BVdU-PA，“NB1011”)。氬氣下滴加苯基L-甲氧基丙氨?；剂茁然?McGuigan等(1996)，藥物化學雜志(J.Med.Chem.)391748-1753)(15滴，350毫克，1.26毫摩爾)處理2毫升無水DMF中BVdU(420毫克，1.26毫摩爾)和咪唑(103毫克，1.51毫摩爾)的溶液，并且將反應混合物在23℃下氬氣下攪拌24小時。通過在硅膠上用10％MeOH/90％CH2Cl2，體積/體積，作為洗脫劑進行TLC，從起始物(Rf＝0.53)產(chǎn)生轉化產(chǎn)物(Rf＝0.70)，但是只是一定程度(大約15％)，因此加入另外的咪唑(52毫克，0.75毫摩爾)和偶磷氯化物試劑(8滴，175毫克，0.63毫摩爾)，并且將該混合物在23℃下氬氣下再攪拌24小時。通過TLC監(jiān)測，轉化率提高到大約30％的程度。下面用另外的偶磷氯化物和咪唑處理一點也不促進反應的進展。通過在不等于40℃下真空下旋轉蒸發(fā)將溶液減少至0.75毫升體積，然后加入等體積的二氯甲烷，將溶液直接施加給干燥4毫米硅膠板。此時，如果通過將該板放入真空干燥器中30分鐘去除大部分殘留的DMF則有利于下面的處理。使用250毫升二氯甲烷(來洗脫殘留試劑和DMF)，接著用10％甲醇/90％二氯甲烷，體積/體積(來洗脫產(chǎn)物之后洗脫起始物)，進行徑向色譜，得到144毫克(20％)中間體(3)和294毫克起始物，以沒有回收的起始物為基礎，得到67％產(chǎn)率的轉化產(chǎn)物。通過1HNMR檢測是否存在雜質咪唑(d＝7.65和7.01)或DMF(d＝7.95，2.89和2.73)，進行另外的徑向色譜純化。以這種方法，獲得轉化產(chǎn)物，TLC和1HNMR檢測純度是98％，為磷原子中心基非對映體接近等摩爾混合物，是油/膠或泡沫-粉末形式1H NMR((C2H3)2SO)d＝11.4(bs可與2H2O交換，1，N3H)，8.28(假-t，1，H6)，7.35(假-t，2，o-Ph)，7.31(d，1，乙烯基1H)，7.20(假-t，3，m-和p-Ph)，6.89(d，1，乙烯基2H)，6.19(t，1，H1′)，6.08(t，可與2H2O交換，1，丙氨?；鵑H)，5.45(bs，可與2H2O交換，1，O31H)，4.32(m，1，H3′)，4.22(m，2，5′CH2)，3.97(m，1，H4′)，3.86(t，1，丙氨酰基CH)，6.58(兩個s，3，CO2Me)，2.15(m，2，2′CH2)，1.23(假-t，3，丙氨?；鵆H3)，J乙烯基CH-丙氨?；鵑H～6Hz.用1H/1H COSY 2D NMR分析確定光譜轉移。13C NMR((2H3O)2SO))d＝173.7和173.6(丙氨?；鵆O2)，162.1和161.6(C2)，150.61，150.5(ipso-Ph)，149.2(C4)，139.4和139.2(C6)，129.8和129.6(M-Ph)，124.7(P-Ph)，120.3，120.2(o-Ph)，107.1(乙烯基C1)，87.5(乙烯基C2)，84.8(C4′)，83.8(C1′)，70.1(C3′)，66.1(C5′)，51.9(丙氨酰基OMe)，49.7(丙氨?；?H)，29.5(C2′)，19.6(丙氨?；?Me)，3JP-C4′＝7.8，2JP-C5′＝4.4，2JP-ipso-Ph＝6.5Hz.31P NMRd＝3.99，3.69低分辨率DCI(NH3)，質譜593/591(MNH4+)，576/574(MH+)。
只是為了方便，將本發(fā)明方法中使用的前體藥物的結構分為I組和II組。
I組化合物的一般合成I組化合物的L和D異構體具有下面的結構 在上面的結構式中，(5-位)R1是或者包含離去基團，其是具有與從嘧啶環(huán)的分離相適應的分子大小和親電性的化學個體并且其從嘧啶環(huán)釋放時具有抑制細胞增殖或殺死細胞的能力。
在上面的結構式中，Q是糖，是碳環(huán)或非環(huán)化合物，或者是其掩蔽的磷酸酯或氨基磷酸酯衍生物。選自糖基，硫代糖基的化學個體，Q是或包含碳環(huán)基團和其衍生物。糖基的例子包括但不限于單糖環(huán)狀糖基，例如從氧雜環(huán)丁烷(4-元環(huán)糖)，呋喃糖(5-元環(huán)糖)，和吡喃糖(6-元環(huán)糖)衍生的那些基團。呋喃糖的例子包括呋喃蘇-糖基(來自蘇糖，一種4碳糖)；呋喃赤蘚糖基(來自赤蘚糖，一種4碳糖)；呋喃核糖基(來自核糖，一種5碳糖)；呋喃阿拉伯糖基(也稱之為阿拉伯呋喃糖基；來自阿拉伯糖，一種5碳糖)；呋喃木糖基(來自木糖，一種5碳糖)和呋喃來蘇糖基(來自來蘇糖，一種5碳糖)。糖基衍生物的例子包括“脫氧”，“酮”和“脫氫”衍生物以及取代衍生物。硫代糖基的例子包括上述糖基的硫類似物，其中成環(huán)氧原子被硫原子置換。碳環(huán)基團的例子包括可以進一步具有一個或多個取代基(例如-OH基團)的C4碳環(huán)，C5碳環(huán)，和C6碳環(huán)。
在一個實施方案中，Q是下式的β-D-呋喃核糖基
其中R7選自H，掩蔽的磷酸酯或氨基磷酸酯及其衍生物，并且其中R2和R3是相同或不同的并且獨立地是-H或-OH。
在上式的一些實施方案中，R1是鏈烯基，即(-CH＝CH)n-R4，其中n是0或1-10的整數(shù)，R4是鹵原子(例如I，Br，Cl)，或CN或汞。R2是H而R3是-OH或者R2是OH而R3是H或者R2和R3是H或者其中R2和R3是OH。
另一方面，R4是或包含選自H，烷基，鏈烯基，炔基，羥基，-O-烷基，-O-芳基，-O-雜芳基，-S-烷基，-S-芳基，氰化物，氰酸酯，和硫代氰酸酯鹵代乙烯基，鹵代汞基，-S-雜芳基，-NH2，-NH-烷基，-N(烷基)2，-NHCHO，-NHOH，-NHO-烷基，NH2CONHO-，和NHNH2的基團。在這些實施方案中，其它方面包括其中R2和R3是H；其中R2是OH和R3是H；其中R2是H而R3是OH；或者其中R2和R3是OH。
R1位取代基優(yōu)選實施方案是可以有烯丙基互換的基團。
在另一方面，所述候選治療劑是下式的化合物 其中n是0-10的整數(shù)；其中A是磷衍生物，或者是下式的化合物 其中Q選自H，如上定義的未取代的或取代的糖和如上定義的取代的或未取代的碳環(huán)。

其中R＝2’-脫氧-5-尿苷基，m是0或1，而n是0-10的整數(shù)。
在適當情況下，化合物可以是它們的對映異構體，非對映異構體或立體異構體形式，包括，例如D-或L-構型，并且可以是任何立體化學構象，包括，例如α-或β-端基差向異構體形式。
通過本領域公知的方法能實現(xiàn)上述5-取代的嘧啶核苷和5-取代的嘧啶核苷一磷酸的合成。例如，在Li2PdCl4存在下用鹵代烷基化合物，鹵代乙酸酯或鹵代鏈烯烴處理5-氯代汞基-2’-脫氧尿苷，導致通過有機鈀中間體分別形成5-烷基，5-?；?-酮鏈烯基衍生物。嘧啶核苷和核苷酸的C5-修飾的另一個例子是通過用乙酸汞處理接著在Li2PdCl4存在下加入苯乙烯或環(huán)-取代的苯乙烯形成C5-反-苯乙烯基衍生物。Bigge等(1980)美國化學學會會刊(J.Am.Chem.Soc.)102(6)2033-2038。通過在50℃下用乙酸鹽緩沖液中的乙酸汞處理3小時使嘧啶脫氧核糖核苷三磷酸用汞在嘧啶環(huán)的5位衍生化。Dale等(1973)PNAS 70(8)238-2242。預計這樣的處理對修飾一磷酸酯也是有效的；或者，被修飾的三磷酸酯可以酶促轉化為修飾的一磷酸酯，例如，通過用堿磷酸酶控制處理接著純化一磷酸酯。分子性能類似于汞但是具有優(yōu)選的藥學性能的有機或無機的其它部分可以被取代。關于合成取代的嘧啶的一般方法參見例如美國專利No.4247544；4267171；和4948882；和Bergstrom等(1981)有機化學雜志(J.Org.Chem.)46(7)1432-1441。上述方法也可以應用于包含除了核糖或2’-脫氧核糖(例如2’-3’-二脫氧核糖，阿拉伯糖，呋喃糖，來蘇糖，五糖，六糖，七糖和吡喃糖)之外的糖的5-取代的嘧啶核苷和核苷酸的衍生物的合成。5-位取代基的一個例子是鹵代乙烯基，例如E-5-(2-溴乙烯基)-2’脫氧尿苷酸，Barr等(1983)，上文。為了本發(fā)明的目的，如下所述合成上面結構式的兩個實施方案的合成。
或者，從Glen Research，Sterling，VA(USA)，Sigma-AldrichCorporation，St.Louis，MO(USA)，Moravek Biochemicals，Inc.，Brea，CA(USA)，ICN，Cost a Mesa，CA(USA)和New England Nuclear，Boston，MA(USA)購得5-溴脫氧尿苷，5-碘脫氧尿苷及其一磷酸衍生物。使用從Glen Research，Sterling，VA(USA)和ICN，Costa Mesa，CA(USA)購得的試劑通過激酶作用，用化學方法或酶學方法可以將購得的5-溴脫氧尿苷和5-碘脫氧尿苷轉化為它們的一磷酸酯。這些鹵原子衍生物可以與其它取代基組合產(chǎn)生新的而且更有效的抗代謝物。
II組化合物的一般合成II組的化合物包括四類化合物。每一類由尿嘧啶堿基或修飾的尿嘧啶堿基的結構定義。它們是ECTA化合物，其中I)堿基是尿嘧啶的呋喃基-嘧啶酮衍生物；II)堿基是6-氟尿嘧啶；和III)堿基是4-腙取代的尿嘧啶衍生物和IV)堿基是尿嘧啶。使用尿嘧啶或修飾的尿嘧啶衍生物合成5位被毒性離去基團取代的化合物，通過在5-位電子軌道的鏈連接，并且包括電子軌道和毒性離去基團之間的間隔基團部分。ECTA化合物包含“Q”，其可以是沒有被磷?；?，5’一磷酸酯，5’-磷酸二酯，或5’-保護的(“掩蔽的”)脫氧尿苷或者R7位可替換的碳水化合物部分的可比較的衍生物并且如下所述。保護的5-取代的脫氧尿苷一磷酸衍生物是其中通過連接合適的化學保護基而封閉磷酸部分的那些。5-取代的脫氧尿苷一磷酸衍生物的保護能夠改進溶解性，有利于細胞滲透，有利于通過血腦屏障，并且防止細胞或胞外磷酸酶的作用，其可能另外導致磷酸根基團的失去。在另一個實施方案中，對具有核苷激酶活性的細胞施用5-取代的尿嘧啶或尿苷衍生物，其中5-取代的尿嘧啶/尿苷衍生物被轉化為5-取代的尿苷一磷酸衍生物。也可以修飾尿苷衍生物以提高它們的溶解性，細胞穿透性和/或越過血腦屏障的能力。
胸苷酸合成酶對5-取代的尿苷一磷酸衍生物的作用可以釋放與嘧啶環(huán)的5-位連接的取代基(“離去基團”)。釋放的取代基然后能內在地或與另一種細胞成分進行反應后，作為毒素或細胞增殖的抑制劑起作用。
本發(fā)明的化合物的L和D異構體選自具有下面結構式的化合物 在上述結構式中，R1是下式部分 在上述結構式中，R2是或包含二價電子軌道基團。在一個實施方案中，R2是或包含一不飽和或多不飽和電子軌道，作用是使電子從嘧啶環(huán)傳導并且傳向離去基團R1，前提是在I組化合物中，n可以是零。在一個實施方案中，R2是選自不飽和的烴基；包括一個或多個不飽和烴基的芳香族烴基；和包括一個或多個不飽和烴基的雜芳基。
在一個實施方案中，MISO和R2是具有選自下面的結構式的不飽和烴基 在一個實施方案中，R2和R3一起形成選自下面的結構 在一個實施方案中，R2是具有選自下面結構的芳香族烴基 在一個實施方案中，R2是具有選自下面結構的雜芳基 其中J是雜原子，例如-O-，-S-，或-Se-，或雜原子，例如-NH-或-NRALK，其中RALK是具有1-10個碳原子的直鏈或支鏈烷基或具有3-10個碳原子的環(huán)烷基。
在上面的結構式中，R3是二價間隔基團部分，也稱之為間隔基單元。在一個實施方案中，R3是具有選自下面結構的二價間隔基團部分
其中R5是相同或不同的，并且獨立地是具有1-10個碳原子的直鏈或支鏈烷基或具有3-10個碳原子的環(huán)烷基或R5是鹵原子(F，Cl，Br，I)。
在一個實施方案中，R3是具有選自下面結構的二價間隔團部分 在一個實施方案中，R3是具有選自下面結構的二價間隔團部分 在上面的結構式中，n是0或1-10的整數(shù)，m是0或1。在一個實施方案中，n是0或1-10的整數(shù)，m是1。在一個實施方案中，n是0且m是0。在一個實施方案中，當R7是-H時，則n不是0。在一個實施方案中，當R7是-H時，則m不是0。在一個實施方案中，當R7是-H時，則n不是0且m不是0。在一個實施方案中，當R7是-H時，R4不是鹵原子(即-F，-Cl，-Br，-I)。在一個實施方案中，當R7是-H且m是0時，則R4不是鹵原子(即-F，-Cl，-Br，-I)。在一個實施方案中，當R7是-H且m是0且n是0時，則R4不是鹵原子(即-F，-Cl，-Br，-I)。
在上面的結構式中，R4是發(fā)毒基團。如這里使用的，術語“發(fā)毒基團”指是或包含是化學個體的離去基團的部分，所述化學個體具有與通過激活酶從嘧啶環(huán)提出的部分一致的分子大小和親電性，并且其從嘧啶環(huán)酶促釋放時具有抑制細胞增殖或殺死細胞的能力。
在一個實施方案中，發(fā)毒基團是或包含在細胞內過度表達的胞內酶激活或釋放的離去基團。在一個實施方案中，R4是或包含具有選自下面結構的基團
其中，X在各位置是相同或不同的，并且是-Cl，-Br，-I或其它潛在的離去基團(包括但不限于-CN，-OCN，和-SCN)；Y在各位置是相同或不同的，并且獨立地是-H或-F；Z是相同或不同的，并且獨立地是-O-或-S-，R8和R9是低級烷基，R10是H或CH3。
在一個實施方案中，R4是或包含選自下面的化學個體-Br，-I，-O-烷基，-O-芳基，-O-雜芳基，-S-烷基，-S-芳基，-S-雜芳基，-CN，-OCN，-SCN，-NH2，-NH-烷基，-N(烷基)2，-NHCHO，-NHOH，-NHO-烷基，NH2CONHO-，NHNH2，-N3和順鉑衍生物，例如 在上面的結構式中，Q如對于I組的化合物的描述，因此是或包含支持前體藥物與酶(例TS或TK)的功能性結合的部分。在一個實施方案中，Q是選自下面的結構
其中在各位置的R6是相同或不同的并且獨立地是-H，F(xiàn)，-OH，-OC(＝O)CH3，或其它保護的羥基(包括但不限于苯甲酰基，-COC6H5，和甲苯?；?COC6H4CH2)；R7在5’位與Q連接并且是氫原子，磷酸根，磷酸二酯基團，氨基磷酸酯，或者其它含磷基團。
在一個實施方案中，Q是 在一個實施方案中，R7是氫原子。在另一個實施方案中，R7是磷酸酯基團，保護的磷酸酯基團，磷酸二酯基團，或者氨基磷酸酯基團。在優(yōu)選的實施方案中，R7是氨基磷酸酯基團。
在一個實施方案中，R7是從氨基酸(包括例如二十種天然存在的氨基酸)衍生的氨基磷酸酯基團。在一個實施方案中，R7是從丙氨酸衍生的氨基磷酸酯基團。在一個實施方案中，R7是或包含具有下面結構的基團 上述基團以及其制備方法描述于McGuigan等(1993)藥物化學雜志(J.Med.Chem.)361048-1052，和McGuigan等(1996)藥物化學雜志(J.Med.Chem.)391748-1753。
在一個實施方案中，R7是從色氨酸衍生的氨基磷酸酯基團。在一個實施方案中，R7是或包含具有下面結構的基團 上述基團及其制備方法描述于Abraham等(1996)藥物化學雜志(J.Med.Chem.)394569-4575。
在一個實施方案中，R7是磷酸酯基團。在一個實施方案中，R7是或包含具有選自下面結構的基團 上面兩個基團的第一個及其制備方法描述于Freed等(1989)生物化學藥物(Biochem.Pharmacol.)383193-3198；Sastry等(1992)分子藥物學(Mol.Pharmacol.)414411-445；Arquhar等(1994)藥物化學雜志(J.Med.Chem.)373902-3909和Farquhar等(1995)藥物化學雜志(J.Med.Chem.)38448-495。上面兩個基團的第二個及其制備方法描述于Valette等(1996)藥物化學雜志(J.Med.Chem.)391981和Benzaria等(1996)藥物化學雜志(J.Med.Chem.)39，p.4958。
在一個實施方案中，R7是或包含具有選自下面結構的基團(其中R是芳香取代基) 上面兩個基團的第一個及其制備方法描述于Meier等(1997)生物有機藥物化學快報(Bioorg.Med.Chem.Lett.)71577；Meier等(1997)生物有機藥物化學快報(Bioorg.Med.Chem.Lett.)799；和Meier等(1997)國際抗病毒新聞(International Antiviral News)5183。上面兩個基團的第二個及其制備方法描述于Hostetler等(1997)生物化學藥物(Biochem.Pharmacol.)531815；和Hostetler等，公開的國際專利申請No.WO96/40088(1996)。
在一個實施方案中，R7與Q形成環(huán)基。下面描述這樣的實施方案及其制備方法(其中DMTr是4，4’-二甲氧基三苯甲基，Boc是叔丁氧羰基，DCC是1，3-二環(huán)己基碳化二亞胺，4-DMAP是4-二甲基氨基吡啶) 在一個實施方案中，化合物可以是任何對映異構體，非對映異構體或立體異構體形式，包括，D-構型或L-構型，和α-端基差向異構體或β-端基差向異構體形式。
在一個實施方案中，化合物可以是鹽形式，或者是保護的或前體藥物形式，或者其組合，例如作為鹽，醚或酯。
在另一個實施方案中，利用下面描述的方法上述結構被進一步修飾使具有硫代磷酸二氮丙啶代替磷酸二氮丙啶基團。
5-位處的結構被稱之為鏈，因為它們連接假定的離去基團(發(fā)毒基團)和雜環(huán)。在例如人TS的激活位點通過與Cys殘基反應激活雜環(huán)時，一個負電荷從尿嘧啶的6-位傳導給鏈。關于(BVDU)的5’-一磷酸化化合物，Barr等(1983)生物化學(Biochenistry)221696-1703描述了其機理，關于(E)-5-(3，3，3-三氟-1-丙烯基)-2’-脫氧尿苷(TFPe-dUrd)，Wataya等(1979)藥物化學雜志(J.Med.Chem.)22339-340；Santi(1980)藥物化學雜志(J.Med.Chem.)23103-111；和Bergstrom等(1984)藥物化學雜志(J.Med.Chem.)27279-284描述了其機理。
毒素和dNMP之間的鏈“間隔基”必須是不飽和的，這樣其能夠傳導TS-Cys巰基連接供給的毒素-不穩(wěn)定負電荷。為了該目的可獲得的很多不飽和有機官能團中，乙烯基，烯丙基和炔丙基是簡單的，小的并且容易合成的。乙烯基和烯丙基單元的優(yōu)點在于它們可以制備成兩種不能相互轉化的幾何異構體形式之一。因此，它們可以用作通過TS激活位點調節(jié)前體藥物的“探針”。一方面，炔丙基單元具有圓柱型對稱的優(yōu)點，這樣TS-催化的毒素從該類型的鏈釋放不取決于關于dUMP尿嘧啶環(huán)的取向，乙烯基和烯丙基分子的情況一樣。
采用兩種不同的方法設計本發(fā)明的核苷酸-基前體藥物。一種以BVDU一磷酸的結構為基礎，并且特征在于離去基團/毒素直接連接dUMP的C5處(多)乙烯基取代基的末端。這是乙烯基鏈方法。另一種以TFPe-dUMP的結構為基礎，并且類似于第一種，但是有亞甲基單元分開離去基團/毒素和不飽和單元，因此包含烯丙基或炔丙基單元。這是烯丙基鏈方法。
烯丙基鏈方法的炔丙基形式的激活的機理在5-乙炔基-2’-脫氧尿苷5’-一磷酸(EdUMP)和5-(3-羥基-1-丙炔基)-2’脫氧尿苷5’-一磷酸(HOPdUMP)與TS的相互作用中有先例(Barr等(1981)藥物化學雜志(J.Med.Chem.)241385-1388和Barr等(1983)上文)。EdUMP是TS的潛在抑制劑(Ki＝0.1TM)，并且可能在活性位點形成基于丙二烯的物質。HOPdUMP(Ki＝3.0TM)表現(xiàn)出不一般的抑制動力學。這可能由于在活性位點形成基于累積多烯的物質。
最近合成出了結構類似于對乙烯基和烯丙基鏈方法機理常見的中間體的5-烷烯化的5，6-二氫尿嘧啶(Anglada等(1996)雜環(huán)化學(J.Hetercyclic Chem.)33(4)1259)。這些表現(xiàn)出高親電性。它們與乙醇反應生成5-(乙氧基甲基)尿嘧啶是加水催化再生合適的TS的慣例。最近，追蹤研究證明存在通過TS產(chǎn)生的C5亞甲基中間體(Barett等(1998)美國化學學會會刊(J.Am.Chem.Soc.)120449-450)。
帶有炔丙基鏈的ECTA化合物的合成目的在于合成有炔丙基和烯丙基的攜帶醇的2’脫氧尿苷。文獻中報道了很多這些化合物及其密切的衍生物，一些甚至與TS關聯(lián)進行了研究。例如，5-炔基-dUMP，包括5-(3-甲氧基-1-丙炔基)和5-(3-羥基-1-丙炔基)已經(jīng)被驗證為TS抑制劑(Bart等(1981)藥物化學雜志(J.Med.Chem.)241385-1388)，并且其中的一些已經(jīng)被證明導入TS-缺乏癌細胞的DNA中(Balzarini等(1985)FEB Slett 373(1)41-4)。
在鈀催化劑存在下，5-汞(Ruth等(1978)有機化學雜志(J.Org.Chem.)432870-2876)和5-碘尿苷(Robins等(1981)四面體快報(Tetrahedron Lett)22421-424)容易與烯和炔縮合產(chǎn)生有C5鏈的尿苷。后一途徑更經(jīng)常使用(Robins等(1982)加拿大化學雜志(Can.J.Chem.)60554-557；Asakura(1988)四面體快報(TetrahedronLett)292855-2858；和Asakura(1990)有機化學雜志(J.Org.Chem.)554928-4933)。已經(jīng)實現(xiàn)了保護的5-碘-2’-脫氧尿苷與叔丁基二甲基甲硅烷基炔丙基醚(Graham等(1998)J.Med.Soc.Perk.Trans.11131-1138和DeClercq等(1983)藥物化學雜志(J.Med.Chem.)26661-666)，與甲基炔丙基醚(Tolstikov等(1997)核苷核苷酸(Nucleoside Nucleotides)16215-225)，甚至和炔丙基醇本身(Chaudhuri等(1995)美國化學學會會刊(J.Am.Chem.Soc.)11710434-10442和Goodwin等(1993)四面體快報(Tetrahedron Lett)345549-5552)的高產(chǎn)率縮合。通過甲基丙烯酸基的DIBAL-H還原也可以增加通過后一反應導入的3-羥基-1-丙炔基取代基(Cho等(1994)四面體快報(Tetrahedron Lett)251149-1152)，其本身從在BVDU的合成中使用的相同Heck反應產(chǎn)生。這些鈀催化的反應是如此多面性使得它們能被用來縮合非常長而且功能復雜的基于炔丙基的鏈和5-碘-2’-脫氧尿苷(Livak等(1992)核酸研究(NucleicAcids Res.)204831-4837和Hobbs(1989)有機化學雜志(J.Org.Chem.)543420-3422)。通過用Undiar催化劑部分氫化炔丙基母體產(chǎn)生基于(Z)-烯丙基的鏈(Robins(1983)有機化學雜志(J.Org.Chem.)5(11)3546-3548)和(Barr(1983)生物化學雜志(J.Biol.Chem.)258(22)13627-13631和生物化學(Biochem.)221696-1703)，而通過(E)-三丁基甲錫烷基化乙烯的Heck偶聯(lián)制備基于(E)-烯丙基的化合物最好(Crisp(1989)合成通訊(Synth.Commun.)192117-2123)。
嚴格根據(jù)文獻方法，制備帶有叔丁基二甲基甲硅烷基炔丙基醚的3’，5’-二-O-保護的2’-脫氧尿苷(Graham等(1998)上文；DeClercq等(1983)藥物化學雜志(J.Med.Chem.)26661-666)，并且還原其轉化為相應的(Z)-烯丙基醚的那部分(Barr等(1983)上文)。因為TBDMS基團的TBAF-介導的去除產(chǎn)生氧陰離子，其可以原位功能化，這些TBDMS-保護的炔丙基-和(Z)-烯丙基鏈化核苷將作為某些有發(fā)毒基團的靶物的方便的母體。關于帶(E)-烯丙基醇的核苷，通過(E)-三丁基甲錫烷基化乙烯的文獻Heck偶聯(lián)制備已知的O-四氫吡喃基醚衍生物(Crisp(1989)上文)。 利用兩步文獻方法(Phelps等(1980)藥物化學雜志(J.Med.Chem.)231229-1232和Hsiao和Bardos(1981)藥物化學雜志(J.Med.Chem.)24887-889)，炔丙基和(E)和(Z)-烯丙基醇轉化為它們相應的雙氮丙啶氨基磷酸酯或硫代氨基磷酸酯，這樣5’-單核苷酸的TS處理分別釋放抑制細胞藥物TEPA或硫代TEPA的活性代謝產(chǎn)物(Dirven等(1995)癌癥研究(Cancer Res.)551701-1706)。 合成二-氮丙啶-1-基-次膦酸3-[2-脫氧尿苷-5-基]-丙-2-炔酯(“TEPA”)并且通過1HNMR分析得到下面的結果1H NMR((CD3)2SO)由于噪音而復雜。顯著特征δ8.28(D，1，H6)，6.10(假-t，1，H1′)，5.26(m，可與D2O交換，1，3′-OH)，5.13(m，可與D2O交換，1，5′-OH)，4.81(q or dd，2，炔丙基-CH2)，4.24(m，1，H3′)，3.57(m，2，5′-CH2)，2.15-2.0(m，8，氮丙啶-CH2).
合成二-氮丙啶-1-基-硫代次膦酸3-[2-脫氧尿苷-5-基]-丙-2-炔酯(“硫代TEPA”)并且通過1HNMR分析得到下面的結果1H NMR((CD3)2SO)由于噪音而復雜。顯著特征δ8.29(D，1，H6)，6.10(假-t，1，H1′)，5.22(m，可與D2O交換，1，3′-OH)，5.10(m，可與D2O交換，1，5′-OH)，4.88(q or dd，2，炔丙基-CH2)，4.31(m，1，H3′)，3.52(m，2，5′-CH2)，2.15-2.0(m，8，氮丙啶-CH2).
呋喃并嘧啶酮的合成從合成有C5炔丙基-醇的2’-脫氧尿苷開始合成呋喃并嘧啶酮。然后從上述O-四氫吡喃基醚衍生物形成呋喃并嘧啶酮化合物。通過炔丙基的第二個碳與嘧啶環(huán)的C4位連接的氧鍵合的反應進行合成，得到熒光呋喃并嘧啶酮，其容易從反應混合物中分離。這樣的化合物提供了另外的通過具體電子軌道，間隔基和毒性離去基團的各種組合合成ECTA化合物的基礎。 在已知促進這些熒光化合物生成的條件下(Barr等(1983)上文)，通過縮合2’，3’-二-O-對-甲苯?；?’，3’-二-O-乙?；?5-碘-2’-脫氧尿苷與1-(四氫吡喃基氧基)-2-丙炔(Jones和Mann(1953)美國化學學會會刊(J.Am.Chem.Soc.)754048-4052)，制備呋喃并[2，3-d]嘧啶酮核苷。堿-催化去除糖保護基團得到6-(四氫吡喃-2-基氧基甲基)-取代的雙環(huán)核苷，其或者進行標準酸性THP基水解(二氯甲烷中的TFA)或者通過制備BvdU-PA和5FUdR-PA使用的相同方法區(qū)域選擇性地5’-氨基磷酸酯化。氨基磷酸酯化作用之后，通過酸解能去除THP基團。 3-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-6-(四氫吡喃-2-基氧基甲基)呋喃并[2，3-d]嘧啶-2(3H)-酮1H NMR((CD3)2SO)δ 8.28(s，1，H4)，6.74(s，1，H5)，6.16(假-t，1，H1′)，5.27(d，可與D2O交換，1，3′-OH)，5.12(m，可與D2O交換，1，5′-OH)，4.72(m，1，THP-H2)，4.56(q，2，CH2OTHP)，3.92(m，1，H4′)，3.64(m，2，5′-CH2)，2.40(m，1，H2′a)，2.03(m，1，H2′b)，1.68和1.50(m，8，THP).低分辨率質譜(DCI-NH3)on bis-TMS derivative，m/z323(B+TMS+H+)，511(MH+)，583(M+TMS+).
3-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-6-(羥甲基)呋喃并[2，3-d]嘧啶-2(3H)-酮1H NMR((CD3)2SO)δ12.0(bs，1，OH)，8.24(s，1，H4)，6.53(s，1，H5)，5.51(假-t，1，H1′)，4.42(m，2，CH2OH)低分辨率質譜(DCI-NH3)，m/z167(B+2H+)，184(B+NH4+).
1-[6-(四氫吡喃-2-基氧基甲基)呋喃并[2，3-d]嘧啶-2(3H)-酮-3-基]-2-脫氧-β-D-呋喃核糖-5-基苯基甲氧基-L-丙氨酰氨基磷酸酯。1H NMR((CD3)2SO)由于存在非對映異構體而復雜。顯著特征δ8.62和8.59(each s，each 1，H4)，7.4-7.1(m，5，PhO)，6.61和6.60(each s，each 1，H5)，6.25(m，1，H1′)，4.56(q，2，炔丙基CH2)，3.56和3.54(each s，each 3，CO2Me)，2.0(m，1，H2′b)，1.22(m，3，丙氨?；?α-Me)，低分辨率質譜(DCI-NH3)，m/z167(B+2H+)，184(B+H++NH4+-THP).
1-[6-(羥甲基)呋喃并[2，3-d]嘧啶-2(3H)-酮-3-基]-2-脫氧-β-D-呋喃核糖-5-基苯基甲氧基-L-丙氨酰氨基磷酸酯。1HNMR(CDCl3)2SO由于存在非對映異構體而復雜。顯著特征δ8.5(s，1，H4)，7.4-7.1(m，5，PhO)，6.36和6.30(each s，each1，H5)，6.23(m，1，H1′)，3.67和3.65(each s，each 3，CO2Me)，2.69(m，1，H2′a)，2.1(m，1，H2′b)，1.35(m，3，丙氨酰基-α-Me)，低分辨率質譜(DCI-NH3)，m/z 525(MH+)，595(MNH4+).
根據(jù)如下所示標準醚合成方法制備5-(3-羥基-1-丙炔基)-2’-脫氧尿苷的4-硝基苯基醚衍生物。

5-[3-(4-硝基苯氧基)-1-丙炔基]-2’-脫氧尿苷。氬氣下，用4-硝基苯酚(696毫克，5毫摩爾)，三苯基膦(787毫克，3毫摩爾)和二異丙基偶氮二羧酸(590升，3毫摩爾)處理40毫升無水THF中預先干燥過的5-(3-羥基-1-丙炔基)-2’-脫氧尿苷(“核酸化合物39，5-碘至5-炔的有效轉化和衍生的5-取代的尿嘧啶堿基和核苷’Robins和Barr(1983)上文)(565毫克，2毫摩爾)，并且將反應混合物在60℃下加熱直到溶液澄清，然后再加熱1小時。使該混合物冷卻到23℃，然后使其蒸發(fā)到SiO2上并且通過使用甲醇/二氯甲烷進行色譜純化，得到107毫克(13％)的期望的醚產(chǎn)物Mp 112-118℃.1H NMR((CD3)2SO)δ11.65(s，可與D2O交換，1，-NH)，8.29(s，1，H6)，2.24(d，j＝9.3Hz，2，m-ArH)，7.23(d，j＝9.2Hz，2，o-ArH)，6.09(假-t，1，H1′)，5.17(s，2，炔丙基-CH2)，4.22(m，1，H3′)，3.80(m，1，H4′)，3.59(m，2，5′-CH2)，2.13(假-t，2，2′-CH2).在per-三甲基甲硅烷基化材料上的低分辨率質譜(DCI-NH3)，m/z547[M(TMS)2H+]，565[M(TMS)2NH4+]，620[M(TMS)3H+]以呋喃并-嘧啶酮為基礎的TS ECTA化合物。如同對上述合成TEPA和硫代TEPA衍生物解釋的，用使毒性離去基團與C5丙炔基尿苷化合物上的羥基連接所使用的類似方法使毒性R4離去基團連接呋喃-2甲基醇。對于本領域技術人員是顯而易見的是各種不同的毒性離去基團是本發(fā)明的主題。另外，也要求了對R2電子軌道成分的長度和組成以及對R3間隔基元件的組成的修飾。
以呋喃并-嘧啶酮為基礎的TS ECTA化合物也可以由不同修飾的“Q”部分組成。很多5-取代的2’-脫氧尿苷不是人TK的底物，但是令人感興趣的是發(fā)現(xiàn)5-(4-羥基-1-丁炔基)-2’-脫氧尿苷是一個例外(Barr等(1981)上文)。因此，預期一些帶發(fā)毒基團的核苷也具有合適的TK底物活性。因此，ECTA化合物可以具有與不同的糖基連接的自由5’-羥基，5’-一磷酸酯，或5’-氨基磷酸酯基團。通過在HCl清除劑存在下使2-脫氧-3’-羥基，5’-羥基沒有保護的核苷酸與氯代磷酸酯反應實現(xiàn)了這樣的氨基磷酸酯化合物合成的新方法。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述氯代磷酸酯包括磷取代基，其從氨基酸例如丙氨酸衍生。例如，所述氯代磷酸酯可以是苯基-L-甲氧基丙氨酸氯代磷酸酯。
基于C6氟尿苷和C4腙基的化合物。在與dUMP的正常TS反應中，對嘧啶C5-C6雙鍵加中性硫醇進行放熱反應(每摩爾3-9千卡；參見綜述Les等(1998)生物分子結構和動力學(Biomolecular Structure andDynamics)15(4)703-715)。通過活性人TS半胱氨酸(與L.casci的cys-198同源)，用酶有利于形成巰基鍵的6位TS活潑氫的不同取代基，包括氟原子。在嘧啶環(huán)中的其它位置的這樣的取代基也能有利于底物與TS之間的反應。例如，尿嘧啶上的4-腙取代(Les和Rhode(1998)生物分子結構和動力學(Biomolecular Structure andDynamics)15(4)703-715所述)有利于硫醇(TS)與TS的反應。得到的核苷酸-硫醇(TS)中間體以這樣一種方式重排使得可以通過水解被動完成改變的核苷酸的釋放這一點是重要的。 以前沒有報道過在C6位引入氟原子，但是可以根據(jù)Krajewskas和Shugar(1982)生物化學藥物(Biochem.Pharmacol.)31(6)1097-102對合成的描述來合成，上述文獻描述了幾種6取代的尿嘧啶和尿苷類似物的合成。
嘧啶堿基的C4位的有利于化學反應的取代是本領域技術人員公知的。文獻說明的例子包括Wallis等(1999)Farmaco54(1-2)83-89；Negishi等(1996)核酸研討會35(第23屆核酸化學研討會)137-138；Barbato等(1991)核苷核苷酸(NucleosideNucleotides)10(4)853-66；Barbato等(1989)核苷核苷酸(NucleosideNucleotides)8(4)515-528；和Holy等(1999)藥物化學雜志(J.Med.Chem.)42(12)2064-2086。這些合成技術也能將取代作用組合，例如在嘧啶環(huán)的C4和C5位(Pluta等(1999)Boll.Chim.Farm.138(1)30-33)或在嘧啶環(huán)的C2和C4位(Zeid等(1999)核苷核苷酸(Nucleoside Nucleotides)18(1)95-111)。 在本發(fā)明的一個實施方案中，通過對C6氟-尿苷堿基或C4腙修飾的嘧啶加上不同的電子軌道，間隔基部分和毒性離去基團合成ECTA化合物。上文對于2-脫氧尿苷堿基ECTA化合物的合成描述的方法也適用于這樣的分子的合成。
B.I組和II組的化合物的衍生物這里公開的上述化合物的鹽，酯和醚也在本發(fā)明的范圍內。本發(fā)明的前體藥物的鹽可以從無機或有機酸和堿衍生。酸的例子包括鹽酸，氫溴酸，硫酸，硝酸，高氯酸，富馬酸，馬來酸，磷酸，乙醇酸，乳酸，水楊酸，琥珀酸，對甲苯磺酸，酒石酸，乙酸，檸檬酸，甲磺酸，乙磺酸，甲酸，苯甲酸，丙二酸，萘-2-磺酸和苯磺酸。其它酸，例如草酸，盡管其本身是藥學不可接受的，但是可以在用作獲得本發(fā)明的化合物及其藥學可接受酸加成鹽的中間體的鹽的制備中使用。堿的例子包括堿金屬(例如鈉)氫氧化物，堿土金屬(例如鎂)氫氧化物，氨，和式NW4+的化合物，其中W是C1-4烷基。
鹽的例子包括乙酸鹽，己二酸鹽，藻酸鹽，天冬氨酸鹽，苯甲酸鹽，苯磺酸鹽，硫酸氫鹽，丁酸鹽，檸檬酸鹽，樟腦酸鹽，樟腦磺酸鹽，環(huán)戊烷丙酸鹽，二葡糖酸鹽，十二烷基硫酸鹽，乙磺酸鹽，富馬酸鹽，fluco庚酸鹽，甘油磷酸鹽，半硫酸鹽，庚酸鹽，己酸鹽，鹽酸鹽，氫溴酸鹽，氫碘酸鹽，2-羥基乙磺酸鹽，乳酸鹽，馬來酸鹽，甲磺酸鹽，2-萘磺酸鹽，煙酸鹽，草酸鹽，棕櫚酸鹽，果膠酸鹽，過二硫酸鹽，苯基丙酸鹽，苦味酸鹽，戊二酸鹽，丙酸鹽，琥珀酸鹽，酒石酸鹽，硫代氰酸鹽，甲苯磺酸鹽和十一烷酸鹽。鹽的其它例子包括與合適的陽離子例如Na+，NH4+，和NW4+(其中W是C1-4烷基)化合的本發(fā)明的化合物的陰離子。
對于治療用途，本發(fā)明的化合物的鹽是藥學可接受的。但是，在藥學可接受化合物的制備和純化中也可以發(fā)現(xiàn)非藥學可接受酸和堿的鹽的用途。通過本發(fā)明的方法鑒定的前體藥物或化合物的酯包括通過酯化2’-，3’-和/或5’-羥基獲得的羧酸酯(即-O-C(＝OR))，其中R選自(1)直鏈或支鏈烷基(例如正丙基，叔丁基或正丁基)，烷氧基烷基(例如甲氧基甲基)，芳烷基(例如芐基)，芳基氧基烷基(例如苯氧基甲基)，芳基(例如任選地被例如鹵原子，C1-4烷基或C1-4烷氧基或氨基取代的苯基)；(2)磺酸酯，例如烷基磺?；?例如甲磺?；?或芳烷基磺?；?；(3)氨基酸酯(例如L-纈氨酰或L-異亮氨酰)；(4)磷酸酯和(5)一-，二-或三磷酸酯。通過例如C1-20醇或者其反應衍生物，或者通過2，3-二(C6-24)酰基甘油可以進一步酯化磷酸酯。在這些酯中，除非另有說明，存在的烷基部分有利地含有1-18個碳原子，特別是1-6個碳原子，更特別地1-4個碳原子。這樣的酯中存在的任何環(huán)烷基部分有利地含有3-6個碳原子。這樣的酯中存在的任何芳基部分有利地包括苯基。本發(fā)明的呋喃來蘇糖前體藥物衍生物的例子包括例如有化學保護羥基(例如有O-乙?；?的那些，例如2’-O-乙?；?呋喃來蘇糖基；3’-O-乙?；?呋喃來蘇糖基；5’-O-乙?；?呋喃來蘇糖基；2’，3’-二-O-乙?；?呋喃來蘇糖基和2’，3’，5’-三-O-乙酰基-呋喃來蘇糖基。
本發(fā)明的化合物的酯包括甲酯，乙酯，丙酯，丁酯，異丁酯和仲丁酯。
在另一個實施方案中，底物可能與嘧啶或葉酸不是化學相關的，但是確實是在合理藥物設計的已知參數(shù)的基礎上合成的(參見Dunn等(1996)藥物化學雜志(J.Med.Chem.)394825)。
按照下面提供的實施例或者(Barr等(1983)上文)描述的方法測定產(chǎn)物(例如其中反應產(chǎn)物是dUMP的溴乙烯基衍生物的抗代謝產(chǎn)物)。
C.制劑制劑包括適合口服，直腸，鼻，局部(包括經(jīng)皮，含劑和舌下)，陰道，腸胃外(包括皮下，肌內，靜脈內和皮內)和肺內給藥的那些。制劑可以方便地以單位劑量形式存在并且可以用制藥領域公知的任何方法制備。這樣的方法包括將活性成分與構成一種或多種輔助成分的載體混合。一般情況下，通過均勻地并且密切地混合活性成分和液體載體或研細的固體載體或兩者，然后，如果需要，將產(chǎn)品成型。
適合口服的本發(fā)明制劑可以以離散的單位存在，例如膠囊，扁囊劑或片劑，各自含有預定量的活性成分；作為粉末劑或顆粒劑；作為在含水或不含水液體中的溶液或懸浮液；或者作為水包油液體乳濁液或油包水液體乳濁液?；钚猿煞忠部梢砸源笸鑴?，藥糖劑或糊劑存在。
通過任選地與一種或多種輔助成分一起壓制或模制可以制備片劑。通過在合適的機器中壓制活性成分可以制備壓片，其中活性成分呈自由流動形式，例如是粉末劑或顆粒劑，任選地與粘合劑(例如聚乙烯吡咯烷酮，明膠，羥丙基甲基纖維素)，潤滑劑，惰性稀釋劑，防腐劑，崩解劑(例如淀粉乙醇酸鈉，交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮，交聯(lián)羧甲基纖維素鈉)，表面活性劑或分散劑混合。通過在合適的機器中模壓用惰性液體稀釋劑濕潤的粉末化合物的混合物來制備模壓片劑。片劑可以任選地包衣或刻痕并且可以配制成能夠緩慢或受控釋放其中的活性成分的劑型，例如，使用不同比例的羥丙基甲基纖維素來提供期望的釋放曲線。片劑可以任選地進行腸包衣，來提供在腸的部分而不是在胃中釋放。
適合在口中局部給藥的制劑包括錠劑，其在矯味基質中含有活性成分，通常是蔗糖和阿拉伯膠或黃蓍膠；軟錠劑，其在惰性基質例如明膠和甘油，或蔗糖和阿拉伯膠中含有活性成分；和漱口液，其在合適的液體載體中含有活性成分。
根據(jù)本發(fā)明的局部給藥的藥物組合物可以配制成軟膏劑，乳膏劑，懸浮液，洗劑，粉末劑，溶液，糊劑，凝膠，噴霧劑，氣溶膠或油狀物?；蛘?，制劑可以包括透皮貼或敷料，例如浸有活性成分和任選的一種或多種賦形劑或稀釋劑的繃帶或粘石膏。
對于眼部或者其它外部組織例如口和皮膚，優(yōu)選以含有活性成分的局部用軟膏或乳膏，以活性成分的量是，例如，大約0.075至大約20％w/w，優(yōu)選大約0.2至大約25％w/w，最優(yōu)選大約0.5至大約10％w/w的量施用制劑。當配制成軟膏時，前體藥物可以與石蠟或水不相混溶的基質一起使用?；蛘?，可以在乳膏中使用水包油乳膏基質配制前體藥物成分。
如果需要，乳膏基質的水相可以包括，例如，至少大約30％w/w的多羥基醇，即具有兩個或多個羥基的醇，例如丙二醇，丁烷-1，3-二醇，甘露糖醇，山梨糖醇，甘油和聚乙二醇及其混合物。局部用制劑最好包括增強前體藥物成分通過皮膚或其它受影響區(qū)域的吸收或穿透的化合物。這樣的表皮滲透增強劑的例子包括二甲亞砜和相關類似物。
本發(fā)明乳濁液的油相可以用已知方法用已知成分構成。該相可以只含有乳化劑(也被稱作乳化劑emulgent)，最好含有至少一種乳化劑與脂肪或油或者是脂肪和油的混合物。優(yōu)選地，含有親水性乳化劑和親脂性乳化劑，后者作為穩(wěn)定劑。也優(yōu)選含有油和脂肪。乳化劑在有或沒有穩(wěn)定劑的情況下構成稱之為乳化蠟狀物的物質，該蠟狀物與油和/或脂肪一起制成稱之為乳化軟膏基質的物質，其形成乳膏制劑的油分散相。
適合在本發(fā)明的制劑中使用的乳化劑和乳化穩(wěn)定劑包括Tween60，Span 80，十六醇十八醇混合物，十四醇，一硬脂酸甘油酯和月桂基硫酸鈉。
用于制劑的合適的油或脂肪的選擇以實現(xiàn)期望的化妝性質為基礎，因為活性化合物在大多數(shù)可能能在藥物乳化制劑中使用的油中的溶解度非常低。因此軟膏應該優(yōu)選是沒有油脂的沒有顏色的和可洗去的產(chǎn)品，其有適當?shù)某志眯?，避免從試管或其它容器泄漏?？梢允褂弥辨溁蛑ф湹囊?或二烷基酯，例如二異己二酸酯，硬脂酸異十六烷基酯，椰子油脂肪酸丙二醇二酯，十四烷酸異丙酯，油酸癸酯，棕櫚酸異丙酯，硬脂酸丁酯，棕櫚酸2-乙基己酯或稱作CrodamolCAP支鏈酯的混合物，后三種是優(yōu)選的酯。這些可以單獨使用或者根據(jù)要求的性質組合使用?；蛘?，可以使用高熔點脂類，例如白軟石蠟和/或液體石蠟或者其它礦物油。
適合對眼局部給藥的制劑還包括滴眼藥，其中活性成分溶解于或懸浮于合適的載體中，特別是用于前體藥物成分的含水溶劑。所述前體藥物成分優(yōu)選以這樣的制劑存在，其中濃度是大約0.5至大約20％，有利地是大約0.5至大約10％，特別是大約1.5％w/w。
用于直腸給藥的制劑可以作為栓劑存在，有合適的基質，包括例如可可脂或水楊酸酯。
適合陰道給藥的制劑可以以栓劑，棉塞，乳膏，凝膠，糊劑，泡沫劑或噴霧劑存在，除了前體藥物成分之外含有本領域公知的合適的載體。
其中載體是固體適合鼻給藥的制劑包括具有例如大約20至大約500微米范圍顆粒度的粗粉，其以使勁吸入的方式給藥，即通過從緊貼鼻子的盛粉末的容器中通過鼻道快速吸入。其中載體是用于給藥的液體的合適的制劑，例如鼻噴霧劑，滴鼻劑或者通過噴霧器氣霧劑給藥的制劑包括前體藥物成分的水溶液或油溶液。
適合腸胃外給藥的制劑包括含水和不含水的等滲滅菌注射液，其可以含有抗氧化劑，緩沖液，抑菌劑和使制劑與要給藥的接受者的血液等滲的溶質；含水和不含水的滅菌懸浮液(其可以含有懸浮劑和增稠劑)，以及被設計成使所述化合物靶向血液成分或一個或多個器官的脂質體或其它微?；w系。制劑可以分裝在單位劑量密封的容器，例如安瓿和小管瓶，并且可以保存在冷凍干燥(凍干)條件下，在使用之前要求只加入滅菌液體載體，例如注射用水?？梢詮南惹懊枋鲱愋偷臏缇勰﹦?，顆粒劑和片劑制備即用的注射液和懸浮液。
優(yōu)選的單位劑量制劑是前體藥物成分的上述含有日劑量或單位，日亞劑量的那些，或者其合適的等份。
應該理解除了上面特別提到的成分之外，本發(fā)明的制劑根據(jù)要求的劑型可以含有其它本領域常規(guī)物質，例如適合口服給藥的制劑可以含有象甜味劑，增稠劑和矯味劑這樣的其它試劑。
本發(fā)明結構式的前體藥物和組合物也可以以獸藥制劑形式存在，其可以例如通過本領域常規(guī)方法制備。
D.人正常組織中胸苷酸合成酶的表達為了估算胸苷酸合成酶激活的前體藥物的全身毒性，檢測正常人組織中TS表達水平。通過使用RT-PCR測定腦，心臟，腎，脾，肝，結腸，肺，小腸，胃肌，睪丸，卵巢，子宮，前列腺，甲狀腺，唾液腺，腎上腺，皮膚，PBL和骨髓組織中相對TS mRNA水平。發(fā)現(xiàn)這些組織的大多數(shù)中TSmRNA水平等于或小于在結腸組織中的水平，但在骨髓中的(1.25倍)，在卵巢中的(1.38倍)和睪丸中的(2.13倍)除外(圖13)。但是，結腸癌樣品中平均TS mRNA水平是它們相應的正常結腸組織樣品中的4.6倍(圖13)。該結果提示結腸癌中TS過度表達激活的化合物對人正常組織可能沒有或幾乎沒有毒性。
通過PCR擴增研究多種正常組織中人胸苷酸合成酶的轉錄水平。從OriGene Technologics，Inc.(Rockville，MD)獲得一系列人組織的cDNA。在25微升的體積中進行PCR反應，該體積含有cDNA(100X)，3mMMgCl2，50mM KCl，20mM Tris-Cl，pH8.4，0.2mM的各種dNTP，0.2μM胸苷酸合成酶有義和反義引物和1.25單位Taq DNA聚合酶(獲自Promega，Madison，WI)。該反應混合物在94℃下溫育2分鐘，接著下面12次循環(huán)94℃溫育40秒，58℃溫育1分鐘，然后72℃溫育1分鐘。加入25微升反應緩沖液，其中含有0.2μMβ-肌動蛋白引物，0.2μM胸苷酸合成酶引物，3mM MgCl2，50mM KCl，20mM Tris-Cl，pH8.4，0.2mM的各種dNTP，和1.25單位Taq DNA聚合酶，達到0.2μM胸苷酸合成酶引物和0.1μMβ-肌動蛋白引物的終濃度，使反應體積達到50微升。PCR反應總共進行36次循環(huán)，接著在72℃溫育7分鐘。
通過在2％瓊脂糖凝膠上電泳接著用SYBR Gold核酸凝膠染料(獲自Molecular probes，Eugene，OR)染色分離10微升PCR產(chǎn)物。定量測定相應于胸苷酸合成酶的DNA泳帶并且通過分子動力學Storm相對β-肌動蛋白的值校正。定量表達水平表示為相對于結腸的表達水平的值。
E.匹配的正常組織和腫瘤組織的RT-PCR分析通過利用逆RT-PCR擴增定量測定結腸癌組織和匹配的正常結腸組織中人胸苷酸合成酶的轉錄物水平。如下設計用于擴增人胸苷酸合成酶和β-肌動蛋白的寡核苷酸引物胸苷酸合成酶有義引物5’-GGGCAGATCCAACACATCC-3’(相應于胸苷酸合成酶cDNA序列的堿基208-226，Genbank登記號No.X02308)，反義引物5’-GGTCAACTCCCTGTCCTGAA-3’(相應于堿基564-583)，β-肌動蛋白有義引物5’-GCCAACACAGTGCTGTCTG-3’(相應于β-肌動蛋白基因序列的堿基2643-2661，Genbank登記號No.M10277)，和反義引物5’CTCCTGCTTGCTGATCCAC-3’(相應于堿基2937-2955)。
從Cooperative Human Tissue Network(CHTN，Western Division，Cleveland，OH)獲得人結腸癌組織和匹配的正常組織。根據(jù)供應商說明，使用Tri純分離試劑(獲自Boehringer MannheinCorp.，Indianapolis，IN)分離總RNA。為了檢測可能的DNA污染，設計用于擴增β-肌動蛋白的引物跨越外顯子4/內含子5/外顯子5連接?；蚪MDNA模板產(chǎn)生313bpβ-肌動蛋白片段，cDNA模板產(chǎn)生210bp產(chǎn)物。
使用SuperScript預擴增系統(tǒng)(Gibco/BRL，Gaithersburg，MD)進行逆轉錄。根據(jù)供應商說明，用3微克總RNA在20微升體積的緩沖液中進行逆轉錄反應。
在96微升的體積中進行PCR反應，該體積含有5微升來自逆轉錄反應的cDNA混合物，3mM MgCl2，50mM KCl，20mM Tris-Cl，pH8.4，0.2mM的各種dNTP，0.3μM胸苷酸合成酶有義和反義引物和5單位Taq DNA聚合酶(獲自Promega，Madison，WI)。該反應混合物在94℃下溫育3分鐘，接著進行下面9次循環(huán)94℃溫育1分鐘，58℃溫育1分鐘，然后72℃溫育1分鐘。9次循環(huán)之后，加入4微升人β-肌動蛋白引物，達到0.2μM的終濃度，使最終反應體積達到100微升。繼續(xù)進行PCR反應總共進行30次，32次或34次循環(huán)，接著在72℃溫育7分鐘。
通過在2％瓊脂糖凝膠上電泳接著用SYBR Gold核酸凝膠染料(獲自Molecular probes，Eugene，OR)染色分離10微升PCR產(chǎn)物。定量測定結果表明胸苷酸合成酶和B-肌動蛋白的擴增在30和34次循環(huán)之間是線性的。定量測定相應于胸苷酸合成酶的DNA泳帶并且通過分子動力學Storm校正為相對β-肌動蛋白的值。定量表達水平表示為TS和β-肌動蛋白之間的比值。
F.細胞系和轉染在補充有10％胎牛血清的PRMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)HT1080細胞，并且用GFP-TS表達載體轉染。48小時之后，將轉染的細胞用胰蛋白酶處理(tripsinized)并且在含有750微克/毫升G418的培養(yǎng)基中再次培養(yǎng)。用G418篩選2周之后，以熒光表達為基礎將成活細胞分類。選擇較高熒光表達的一個克隆(命名為TSH/HT1080)和較低熒光表達的一個克隆(命名為TSL/HT1080)，并且擴增到細胞系中。用pEGFP-C3轉染的穩(wěn)定HT1080細胞作為對照。
G.GFP-TS表達載體的構建使用下面的引物通過PCR擴增獲得編碼人胸苷酸合成酶的保守區(qū)(氨基酸23-313)的cDNA片段有義引物，5’-CGGAAGCTTGAGCCGCGTCCGCCGCA-3’和反義引物，5’-GAAGGTACCCTAAACAGCCATTTCCA-3’。用GFP序列符合讀框將cDNA克隆到哺乳動物表達載體pEGFP-C3(Clontech Laboratories.Inc.，Palo Alto，CA)的HindIII和Kpn I位點。通過DNA測序證實cDNA插入。
H.蛋白質印跡分析在補充有10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)人正常細胞和癌細胞。細胞在100毫米培養(yǎng)皿中生長至融合并且在0.5毫升RIPA緩沖液(50mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl，0.5％TritonX-100，0.1％SDS，0.5％脫氧膽酸，鈉鹽和蛋白酶抑制劑)中溶解。通過使用BCA-200蛋白質測定試劑盒(獲自Pierce，Rockford，IL)測定蛋白質濃度。通過12％SDS-PAGE從各細胞株/系分離15微克總蛋白質。分離的蛋白質轉移到PVDF膜上，接著用人胸苷酸合成酶單克隆一抗(NeoMarkers，F(xiàn)remont，CA制備)和辣根過氧化物酶連接的綿羊抗-小鼠Ig二抗(獲自Amersham，英國)進行免疫印跡。使用ECLplus試劑盒(Amersham)測定免疫反應性。定量測定相應于胸苷酸合成酶的泳帶并且通過分子動力學storm相對微管蛋白校正。定量表達水平表示為相對于細胞株CCDl8co的值。
I.通過從dUMP-3H的氚釋放測定TS活性細胞在24孔平板上鋪平板至30000細胞/板的密度并且溫育16小時使粘附平板的塑料表面。
在胸苷酸合成酶測定之前，用RPMI+10％透析的胎牛血清替換培養(yǎng)基。向各孔加入0.5μC i5-[3H]脫氧尿苷，不加CO2下平板在37℃下溫育60分鐘。通過室溫下活性炭(10％，于1×PBS)吸附5-[3H]脫氧尿苷5分鐘來測定[3H]釋放。以13000RPM離心5分鐘之后通過液體閃爍計數(shù)測定上清液中的[3H]量。
J.生長抑制研究指數(shù)生長細胞被轉移到384-孔平底組織培養(yǎng)板中。將所有的細胞類型鋪平板，在25微升完全培養(yǎng)基(RPMll640+10％胎牛血清+抗生素/抗霉劑)中，密度為每孔500個細胞。24小時之后(第0天)，一式三份加入含有劑量范圍是 至 M的實驗化合物的完全培養(yǎng)基25微升。接觸藥物時間是120小時(第5天)，然后測定生長抑制作用。向各孔中加入5微升氧化還原指示劑alamarBlue(10％v/v)。在37℃溫育4小時之后，在535nm激發(fā)和595nm發(fā)射下監(jiān)測熒光。
濃度對相對熒光單位(RFU)作圖，使用Hill等式，S形曲線吻合。曲線的回折點指示的IC50是生長被抑制50％時的濃度。
K.NB1011細胞毒性的Tomudex抑制將MCF7-TDX轉移到384孔測試板，每孔25微升完全培養(yǎng)基中500個細胞。24小時之后(第0天)，雙份加入含有由1mM系列二倍稀釋的NB1011和不連續(xù)濃度(0，1，10，100，1000nM)的Tomudex的混合物的25微升完全培養(yǎng)基。接觸藥物時間是120小時(第5天)，然后如在上文生長抑制研究中描述的用alamarBlue測定生長抑制作用。
L.酶制備為了加上氨基末端His標記，使用NdeI SacI插入位點，將克隆的人胸苷酸合成酶質粒pBCHTS亞克隆到大腸埃希氏桿菌BL21(DE3)/pET-28a(+)(Novagen)。通過用IPTG誘導在大腸埃希氏桿菌中表達酶，并且通過在Ni2+His Bind金屬螯合樹脂(Novagen)上的親和層析純化。柱Ni2+His Bind金屬螯合樹脂柱用20Mm Tris pH7.9，5mM咪唑，0.5mM NaCl洗滌用20mM Tris pH7.9，60mM咪唑，0.5mM NaCl洗脫胸苷酸合成酶活性。
M.酶測試和動力學測定在由40mM Tris pH7.5，25mM MgCl2，1mm EDTA，25mM巰基乙醇，125MdUMP，和65μM指明的N5，N10-亞甲基四氫葉酸構成的200微升反應體積中在96孔Costar UV透明板中進行胸苷酸合成酶測定。通過將四氫葉酸(Sigma)直接溶解于0.2MT ris pH7.5，0.5M-巰基乙醇制備四氫葉酸貯備溶液；在-80℃下貯存貯備溶液。通過向1毫升0.65mM四氫葉酸溶液加入12微升3.8％甲醛并且在37℃下溫育5分鐘來制備N5，N10-亞甲基四氫葉酸。N5，N10-亞甲基四氫葉酸保存在冰上并且在制備之后2小時內使用。
用340nm激發(fā)波長和595nm發(fā)射波長在96孔Dynex MicrofluorBlack“U”型底微量滴定板中在200mul含有125M BV dUMP的胸苷酸合成酶反應中測定通過胸苷酸合成酶將BV dUMP轉化為熒光產(chǎn)物的轉化。用Tecan Spectrafluor Plus熒光計測定熒光。
使用上述酶測定條件對人胸苷酸合成酶底物dUMP和BV dUMP測定酶動力學常數(shù)(Km和Vmax)。通過測定對與dUMP反應的A340增加和對與BV dUMP反應的A294降低來測定酶反應初始速率。從動力學常數(shù)Km和Vmax計算酶催化效率(Kcat/Km)。
N.液相色譜/質譜室溫下用PBS將細胞洗滌三次，然后在5毫升PBS中冷凍/解凍溶解。以10KRPM將細胞提取液離心10分鐘，然后吸附于Sep PakC18并且用10毫升PBS洗滌。用1毫升蒸餾水洗脫BVdUMP。通過使用0.1％甲酸-0.1％甲酸/95％乙腈的線性梯度在C18柱上通過反相色譜分析LC/MS樣品。用Micromass Quattro II三級四極分光計進行質譜分析。
O.抗性的恢復先前描述過人乳腺癌MCF7 TDX細胞系的來源和特征(Drake等(1996)生物化學藥物(Biochem.Pharmacol.)51(10)1349-1355)。簡要地說，通過連續(xù)暴露給至多2.0μM的濃度逐步遞增的TDX，對MCF-7乳腺癌細胞體外篩選對Tomudex的抗藥性。通過連續(xù)將親本MCF7 TDX細胞系暴露給沒有TDX但是有50μM NB1011的培養(yǎng)基，對抗藥性亞系篩選對NB1011的抗藥性，其中NB1011濃度大約比親本MCF 7TDX細胞系中對NB1011的IC50高大約16倍。顯著的初始細胞殺死效果之后，出現(xiàn)抗藥性菌落，形成茁壯生長的單層。根據(jù)“材料與方法”中的描述分別通過蛋白質印跡和alamarBlue細胞毒性測定，對得到的MCF7TDX/1011細胞系測定5-FU，TDX，和NB1011的TS蛋白質水平和IC50。
II.實驗A.體內分析NB1011的TS-表達，5-FU抗藥性，H630-10結腸癌異種移植。
體外篩選的對5-FU抗藥性的H630-10結腸癌細胞表達高水平的胸苷酸合成酶，并且在無胸腺小鼠中形成異種移植。細胞離體擴增之后，在4-6周齡雌性CD-1(nu/nu)無胸腺小鼠(Charles RiverLaboratories，Wilmington，MA)的背部中部以1.5×107細胞/腫瘤皮下注射(S.Q.)H630-10。一個人進行一系列微米測定每周兩次監(jiān)測根據(jù)長乘寬乘高計算的腫瘤體積。六只動物隨機分為各處理組并且進行統(tǒng)計學試驗(單因數(shù)ANOVA)來保證在實驗開始時處理組和對照組之間起始腫瘤體積的一致性。通過腹膜內(I.P.)或腫瘤內注射(I.T.)施用NB1011。試驗試劑的實驗劑量如下第1組DMSO賦形劑對照溶液(IP)，第2組5-FU(15毫克/千克×5天IP＝以該方式對5-FU的MTD)，第3組NB1011＝1.25毫克×5天(IP)，第4組NB1011＝2.5毫克×5天(IP)，第5組NB1011＝3.5毫克×5天(IP)，第6組DMSO對照(IT)，第7組NB1011＝1.25毫克×5天(IT)，和第8組NB1011＝2.5毫克×5天(IT)。這些劑量以在實驗室進行的獨立的發(fā)現(xiàn)劑量實驗為基礎并且接近該具體年齡和品種的雌性無胸腺小鼠的NB1011最大耐受劑量。為了保證精確劑量給藥，在每次注射之前確定的動物體重的基礎上分別給出藥物劑量。在異種移植接種之后測得異種移植物體積為45-68mm3時開始用對照溶液或NB1011治療10天。通過對數(shù)轉化腫瘤體積數(shù)據(jù)的單因數(shù)ANOVA分析各組之間的第25天異種移植物體積的差異。在UCLAAnimal Care Facility的專用房間里在無菌條件下保持實驗無胸腺小鼠。洛山磯加里弗尼亞大學有Animal Welfare Assurance文檔，Officeof Protection from Research Risks，Laboratory Animal SafetyAssuranceNo.A-3196-01。所有的實驗由UCLA獸醫(yī)嚴格指導。Panel oftheAmerican Veterinary MedicalAssociation支持UCLA使用的安死術。American Association for the Accreditation of LaboratoryAnimal Care委托洛山磯加里弗尼亞大學實驗動物計劃和設備。該方案中描述的個人進行的動物程序和操作在那些程序中在技術上是合格的，并且根據(jù)Animal Welfare Actof 1985的要求接受對研究中動物的使用訓練。
B.BVdUMP與人胸苷酸合成酶的體外反應1.用rHuTS對BVdUMP進行無細胞處理產(chǎn)生熒光產(chǎn)物。
干酪乳桿菌(L.casei)TS對BVdUMP的無細胞處理證明產(chǎn)生了潛在的活性中間體(Barr等(1983)上文)。因為這個原因，想到TS對BVdUMP的處理導致人TS不可逆的滅活(Balzarini(1987)分子藥物(Mol.Pharmacol.)32(3)410-6)。DeClercq，Balzarini及其同事(Balzarini(1987)上文；Balzarini(1993)生物化學雜志(J.Biol.Chem.)268(a)6332-7；Balzarini(1995)FEBS Lett373(1)41-4)進行的分子基礎實驗支持這樣的概念，即一旦BVDU在細胞內轉化為一磷酸酯(通過皰疹病毒腺苷激酶)，則其在該過程中結合并滅活Hu TS。但是，從來沒有充分表征過人TS與BVdUMP的實際反應。Santi和同事(Barr(1983)上文)對于他們的工作使用了細菌TS來證明從BVdUMP+TS反應產(chǎn)生產(chǎn)物，DeClercq及其同事使用了細胞和細胞溶胞產(chǎn)物，沒有純化的人TS(Balzarini(1987)上文；Balzarini(1993)上文；Balzarini(1995)上文)。
由于申請人對可以特異性被TS激活的治療底物的產(chǎn)生感興趣，反復研究了BVdUMP與純化的重組人TS(rHuTS)的相互作用。當BVdUMP與rHuTS在標準反應混合物中溫育時，反應導致熒光產(chǎn)物的生成(圖2)。熒光時間依賴性增加伴隨初始BVdUMP濃度的降低。部分表征了得到的產(chǎn)物，表現(xiàn)出是外向環(huán)嘧啶核苷酸衍生物(見下文)。
該結果是令人驚奇的，引起先前的結果支持這樣的概念，即TS與BVdUMP反應應該滅活人TS酶(Balzarini等(1987)，(1993)，(1995)，上文)。因為上述反應在具有純化的成分的無細胞系統(tǒng)中進行，可能胞內介質提供的成分導致在NB1011轉化為細胞內自由核苷酸一磷酸之后TS失活。下面進行詳細描述2.dUMP和BVdUMP與rHuTS的反應動力學比較先前Barr等(1983)報道的工作使用于酪乳桿菌TS(Balzarini(1995)上文；Balzarini(1987)上文；Balzarini(1993)上文)，使用細胞和細胞溶胞產(chǎn)物，不清楚BVdUMP與人TS的反應是否導致該酶的不可逆失活。為了明確該問題，在存在或不存在dUMP下測定了BVdUMP與rHuTS的反應動力學。
競爭抑制作用與其中BVdUMP不滅活TS酶的反應最吻合。為了幫助進一步澄清該情況，為了測定比其中進行動力學更長時間可能發(fā)生的任何滅活作用進行想要的rHuTS與BVdUMP的溫育(圖4)。
這些數(shù)據(jù)表明即使在溫育rHuTS與BVdUMP之后20小時，根據(jù)作為底物的THF DHP dUMP的轉化速率測定的，沒有或幾乎沒有酶失活情況出現(xiàn)。該結果與對在細胞內，優(yōu)選在過度表達TS的細胞內，過度表達的TS將BVdUMP轉化為細胞毒性代謝產(chǎn)物的預期能力相吻合，最后沒有使該酶失活。
3.BVdUMP與TS反應的表征輔因子和抑制劑TS的最完全表征的反應是dUMP向dTMP的轉化。該反應包括將N5，N10-亞甲基四氫葉酸(THF)的亞甲基轉化為dUMP的C-5位(Carreras CW(1995)上文)。該反應取決于輔因子(THF)，并且被尿苷酸模擬物、5F-dUMP抑制，5F-dUMP在與酶反應時，導致穩(wěn)定復合物的產(chǎn)生并且喪失了酶活性。TS活性的第二種被完全表征的抑制劑是Tomudex，Tomudex占據(jù)了TS同型二聚體的葉酸結合位點，防止THF的結合，并且阻斷TS在細胞內的活性(Drake(1996)生物化學藥物(Biochem.Pharmacol.)51(10)1349-1355和Touroutoglou和Pazdur(1996)臨床癌癥研究(Clin.Cancer Res.)2(2)227-243)。作為表征rHuTS與BVdUMP反應初步努力的一部分，對酶與dUMP和BVdUMP的反應比較了5F-dUMP，Tomudex和輔因子的效果。這些實驗證明(表4)，與dUMP的情況類似，5F-dUMP能夠防止BVdUMP向熒光產(chǎn)物的轉化。另外，Tomudex也能防止從dUMP和BVdUMP兩者形成產(chǎn)物。但是，與干酪乳桿菌較早的報道(Barr等(1983)上文)相吻合，BVdUMP向熒光產(chǎn)物的轉化不需要THF。另外，表4中的數(shù)據(jù)也證明在BVdUMP與rHuTS的反應中THF刺激熒光產(chǎn)物的產(chǎn)生。從早期報道THF對該反應沒有影響的數(shù)據(jù)(Barr等(1983)上文)不能預期該結果，并且說明潛在的重要可能性，即輔因子，或輔因子拮抗劑，象甲酰四氫葉酸，不能調節(jié)BVdUMP與人TS的反應。
對該反應的Michaelis-Menton動力學分析證明dUMP對BVdUMP的抑制作用符合預期形式的競爭抑制作用，與作為rHuTS的底物的行為的核苷酸吻合。
先前用干酪乳桿菌TS報道的數(shù)據(jù)表明BVdUMP是比dUMP效果小385倍的底物(Barr等(1983)上文；SantiD.V.(1980)上文)。這里報道的實驗證明這種情況在用人酶時完全不同。對于rHuTS，dUMP的相對催化效率與BVdUMP相比是60倍。這代表與內源底物相比催化效率的提高大于6.4倍。先前用干酪乳桿菌TS的結果導致預計細胞內酶反應的效率對于NB1011太低不是有效的治療底物，因為它不得不與大量的內源dUMP競爭。這里報道的發(fā)現(xiàn)，即人酶具有大于6.4倍的提高的BVdUMP轉化效率，是使用NB1011的一個重要的因素。人酶與干酪乳桿菌酶相比對BVdUMP應用的提高的效率也確定物種特異性底物是可能的并且能夠設計。最近報道了與人TS相比的通過結合干酪乳桿菌的表面上物種特異性區(qū)特異性抑制異源酶的能力(Stout(1999)生物化學(Biochemistry)38(5)1607-17和Costi等(1999)藥物化學雜志(J.Med.Chem.)42(12)2112-2124)。與由蛋白質的最高度保守區(qū)組成的TS的活性位點相關的特異性差異(Carreras(1995)上文)是令人驚奇的并且先前沒有報道過。
通過質譜分析rHuTS與BVdUMP的無細胞酶促反應的產(chǎn)物。圖5給出的分子結構I和II具有與BVdUMP與純化的rHuTS溫育之后TS反應混合物中分子離子的質量相吻合的質量。對該反應產(chǎn)物的知識可以用來理解NB1011的作用的最終機理。另外，該信息可以用來設計新的化學治療劑，因為TS-BVdUMP反應產(chǎn)物本身有用作化學治療劑的潛在可能性。
4.NB1011在腫瘤細胞中轉化為一磷酸酯根據(jù)與TS結合的預先要求，在細胞中NB1011從氨基磷酸酯轉化為一磷酸酯形式。圖6說明對于NB1011的沒有掩蔽的磷酸酯的推定的途徑，其與TS的結合和向毒性代謝產(chǎn)物的轉化。
為了確定轉化中是否有利地發(fā)生該關鍵步驟，利用了溴原子的不常見的性質，即其在自然界中以兩種相等豐度的同位素形式存在。這種情況要通過集中對BVdUMP預計質量離子(411和413道爾頓)的質譜分析來測定包含溴的一磷酸酯。將H630 R10腫瘤細胞(其表達高水平的TS)與100μM NB1011溫育。根據(jù)方法中所述制備處理過的細胞溶胞產(chǎn)物的提取物。使用質譜檢測，接著根據(jù)BVdUMP的沒有保護的核苷酸質量離子(其在反相色譜上有相同的滯留時間)的形成用液相色譜進行初始純化。
這些結果(圖7)與激活途徑中第一步驟之后的NB1011相吻合。
C.NB1011的細胞毒活性的表征1.腫瘤/正常細胞的篩選作為表征NB1011的生物活性的開始步驟，在alarmar blue測試中對大量系列正常和腫瘤細胞類型測試對NB1011和5-氟尿嘧啶兩者的靈敏性。
根據(jù)上文方法中的描述進行測定。以對正常細胞的平均IC50與對腫瘤細胞的平均IC50的比值計算治療指數(shù)。所有的測定至少進行三次。
這些數(shù)據(jù)證明NB1011符合對TS ECTA化合物的基本設計目的，即與正常細胞類型相比對腫瘤細胞的效力更高?？傊c對正常細胞相比，對腫瘤細胞的細胞毒性高大約2倍，而5FU對正常細胞的毒性比其對腫瘤細胞的毒性大3倍。因此，與5FU相比，NB1011的總的有利點在于NB1011治療指數(shù)提高(2)×(3)＝6倍。篩選具有正治療指數(shù)的化學治療劑的嚴格方法是篩選對正常細胞和腫瘤細胞類型的活性。在發(fā)現(xiàn)新的癌癥治療藥物的領域沒有一直使用該方法。例如，篩選對正常細胞類型的新的候選化合物是國家癌癥研究所(National Cancer Institute)的篩選方法(Curt(1996)Oncologistl(3)II-III)的一部分。
2.體內NB1011不使TS失活上述結果指明細胞內從NB1011產(chǎn)生的BVdUMP在其轉化為產(chǎn)物期間不可能滅活TS。但是，無細胞系統(tǒng)與胞內介質不同。為了進一步解釋該問題，進行對TS活性的基于細胞的測定。在這些實驗中向細胞培養(yǎng)基加入外源5-(3H)脫氧尿苷并且監(jiān)測氚化水的釋放(Carreras和Santi(1995)上文；Roberts(1966)生物化學(Biochem.)5(11)3546-3548)。圖8說明細胞培養(yǎng)基中NB1011的存在降低了[3H]2O從5-(3H)dUMP的釋放速度。為了確定這是不是TS不可逆抑制作用的結果，在新鮮培養(yǎng)基中回收NB1011-處理過的細胞，然后測定TS活性。在沒有NB1011的培養(yǎng)基中回收的細胞具有與未處理細胞相同水平的TS活性。該結果支持這樣一個假設，即NB1011在經(jīng)歷胞內過程后不會不可逆滅活TS酶。
采用另外的途徑來理解NB1011主要通過滅活TS是否可能干擾細胞生長。該項研究以TS-封閉的細胞的腺苷拯救為基礎。Tomudex或5FdUMP(接著用5FdUrd處理)阻斷的細胞不能通過從頭合成來制備dTMP。因為這個原因，它們只有通過清除劑機理才能存活。重要的清除劑機理之一是利益胞外腺苷。通過靶細胞摻入的腺苷通常通過胸苷激酶可以轉化為dTMP，并且這樣持續(xù)進行DNA合成。也描述過使用外源腺苷的其它途徑。如果NB1011活性的重要機理是通過內源TS的抑制，則當對細胞培養(yǎng)基加入腺苷時應該減輕細胞毒性。對于該項實驗，對多種細胞系篩選它們對Tomudex和5FdUrd的敏感性，和通過腺苷補充從這些試劑恢復的能力。使用正常的結腸內皮細胞，CCD18co，因為它們對NB1011，5FUdR和Tomudex有可測定的敏感性。根據(jù)(Patterson等(1998)癌癥研究(Cancer Res.)582737-2740)所述，有或沒有10μM腺苷下，進行實驗，但是使用alamar blue測定(參見材料與方法)來測定細胞毒性。結果表明從Tomudex拯救15倍(IC50從6.5nM變?yōu)?5nM)，從5FudR拯救大于590倍(IC50從小于0.01μM變?yōu)榇笥?.9μM)，不存在腺苷下稍微降低變?yōu)榇嬖?0μM腺苷下的223μM。
3.對腫瘤細胞系的TS水平和NB1011介導的細胞毒性之間的相關性利用幾種方法確立TS參與NB1011-介導的細胞毒性1)檢查NB1011對正常結腸細胞與高TS表達，5FU-抗性，腫瘤細胞相比的活性；2)TS轉染到腫瘤細胞背景中，產(chǎn)生克隆衍生物，其基本上與TS表達不同但是非常相似；和3)使用TS的特異性抑制劑，Tomudex，來降低細胞內TS活性。
在開始對NB1011和5FUdR-介導的細胞毒性分析時，對CCD18co正常結腸內皮細胞類型和H630R10，5FU抗藥性結腸腫瘤細胞系進行比較(Copur等(1995)生物化學藥物(Biochem.Pharm)49(10)1419-1426)。這測得了對正常細胞(CCD18co)的細胞毒性，以及測得對過度表達TS的抗藥性腫瘤細胞(H630R10)的細胞毒性。這是重要的，因為明顯限制當前化學治療物的是它們對正常組織的細胞毒性。表4給出了結果。
該實驗證明與5FU-抗性H630R10腫瘤細胞相比5FUdR對正常結腸細胞(CCD18co)的毒性高大約18倍。該負治療指數(shù)是當前化學治療的主要局限性，即其對正常組織的毒性。對于阿霉素也報道過這樣的負治療指數(shù)(Smith等(1985)J.Natl.Cancer Inst.74(2)341-7和Smith等(1990)癌癥研究(Cancer Res.)50(10)2943-2948)。但是與5FUdR相反，與正常結腸內皮細胞相比(IC50大于2500μM)，對抗藥性H630R10細胞(IC50＝216.7μM)，NB1011具有提高11倍以上的活性。該結果提示1)NB1011的活性對高TS表達腫瘤細胞更顯著；和2)與5FUdR相比，使用TS ECTA化合物可實現(xiàn)治療指數(shù)共提高(18)×(11)＝198倍。
4.HT1080腫瘤細胞中TS的過度表達提高它們對NB1011的敏感性。
NB1011的激活需要幾個步驟。這些包括細胞穿透轉化為核苷酸一磷酸，結合TS，和接著的毒性代謝。細胞穿透和轉化的精確機理還沒有完全確定。細胞進入可能部分取決于核苷傳輸機理(Cass等(1998)生物化學與細胞生物學(Biochem.Cell Biol.)76(5)761-70)。類似地，氨基磷酸酯轉化為一磷酸酯的過程應用了定義不太確切的機理(Abraham等(1996)藥物化學雜志(J.Med.Chem.)839(23)4589-4575)。
這些結果是特別明顯的，因為它們證明，在十分均勻的遺傳背景下，提高的TS水平指示對NB1011的增強的敏感性。另外，數(shù)據(jù)也證明提高的TS水平指示對氟代嘧啶的抗性，結果與文獻報道(Copur等(1995)上文；Banerjee等(1998)癌癥研究(CancerRes.)584292-4296)相吻合。
5.NB1011-介導的細胞毒性的抑制劑
Tomudex是主要通過對TS的抑制作用起作用的化學治療劑。如果NB1011通過TS酶表現(xiàn)出細胞毒性，則用Tomudex對TS的抑制應該降低NB1011-介導的細胞毒性。為了直接測試該假設，與親本MCF7細胞系相比過度表達TS11倍的Tomudex-抗性MCF7細胞在漸增濃度的TDX存在下接觸NB1011。
將細胞鋪平板并且根據(jù)上面材料與方法章節(jié)中描述接觸指定濃度的化合物。
數(shù)據(jù)表明，使用特異性抑制劑Tomudex對TS的阻斷導致對NB1011-介導的細胞毒性的高達大約25倍的抑制。這些結果支持這樣的概念，即通過TS從其代謝產(chǎn)物產(chǎn)生NB1011活性。
為了進一步表征NB1011的胞內代謝，用甲酰四氫葉酸(LV；5-甲?；臍淙~酸)進行組合實驗。該項實驗是首創(chuàng)的，因為我們發(fā)現(xiàn)THF刺激BVdUMP和rHuTS的無細胞反應中熒光產(chǎn)物的產(chǎn)生。假設如果熒光產(chǎn)物與NB1011的細胞毒性作用相關，則通過在培養(yǎng)基中提供LV提高的THF胞內水平也增強NB1011-介導的細胞毒性作用。令人驚奇地，根據(jù)在alarmar blue測試中測定的，與單獨的NB1011相比，在3μM LV存在下，NB1011對H630R10細胞系的活性減小90％以上。補充胞內減少的葉酸總量的LV破壞NB1011活性的事實提示NB1011可能部分通過減少這些集合而起作用?；蛘?，LV(或代謝產(chǎn)物)可能部分由于通過與TS相互干擾而直接沖擊BVdUMP的代謝。
為了揭示LV是否直接沖擊BVdUMP與TS的反應，進行反應，+/-THF與BVdUMP，或者用THF+dUMP，和+/-氨甲喋呤(MTX)，LV或Tomudex(TDX)。
這些結果(表6)在兩方面是令人驚奇的1)盡管在THF的存在下從BVdUMP產(chǎn)生的熒光產(chǎn)物增加，但是在該輔因子的存在下發(fā)生了使用的底物消耗(BVdUMP)的速率降低；和2)在輔因子存在下，所有三種實驗化合物(MTX，TDX和LV)大大抑制rHuTS+BVdUMP反應。在各種情況下，該抑制作用比在dUMP+rHuTS反應中或者在沒有THF存在下與BVdUMP的反應中見到的更顯著。
上述結果證明LV，MTX和TDX對BVdUMP+TS反應的抑制作用，和另外的，該作用在輔因子(THF)存在下更顯著，上述結果提示其它化學治療劑可以調節(jié)NB1011活性。重要的是，通過提供LV容易拯救NB1011-處理過的細胞，類似于從MTX的LV拯救。在MTX情況下，LV拯救通過補充胞內葉酸總量而發(fā)生，胞內葉酸總量通過二氫葉酸還原酶和TS的MTX抑制作用而減少。如果在BVdUMP與TS反應期間被還原的葉酸在細胞內減少，則通過不同機理減少胞內胸苷或嘌呤核苷酸總量的其它化合物當與NB1011一起使用時可以給出加和或協(xié)同抗細胞效果。這樣的化合物的例子(Dorr和VonHoff(1994)上文)，包括6-巰基嘌呤，硫代鳥嘌呤和2’-脫氧助間型霉素，所有這些都干擾嘌呤代謝。氮胞苷-介導的乳清苷脫羧酶的抑制作用阻斷嘧啶生物合成，這樣通過與NB1011不同的機理降低細胞內胞內胸苷水平。
D.TS ECTA的藥物基因組學1.TS和HER2的比較當前發(fā)現(xiàn)和開發(fā)新的治療方法的一個重要的方面是鑒定最可能對治療產(chǎn)生反應的(陽性藥物基因組選擇)的患者。該領域占先鋒位置的藥物之一是Herceptin，現(xiàn)在用來治療過度表達HER2原癌基因的乳腺癌。使用抗-HER2抗體的早期數(shù)據(jù)表明對隨機選擇的腫瘤細胞和正常細胞的活性是小的。但是，如果選擇HER2表達提高至少4倍的腫瘤細胞系，則可以證明與正常細胞或表達較低量的HER2基因產(chǎn)物的腫瘤細胞相比明顯的活性和抗-HER2抗體(Shepard等(1991)上文)；(Lewis(1993)Cancer Immural Immunother37(4)255-63)。圖9給出的數(shù)據(jù)證明與用Herceptin的情況類似。
圖2給出的細胞系結果可以提示TS和HER2/NEU體系之間的另外的相似性。該相似性是每一個具有類似的過度表達要求(大約4倍)，其指示TS和HER2/NEU過度表達患者疾病更嚴重(Johnston等(1994)J.Clin.Oncol.122640-2647)。
2.NB1011抗5FU和Tomudex-抗性結腸和乳腺癌細胞系是有活性的。
因為NB1011具有預見的抗癌活性，將其就安全性與其它化學治療劑相比較是重要的。當將其與Tomudex相比較時，進一步強調在癌癥的治療中使用NB1011，Tomudex是一種化學治療劑，象5FU一樣，其經(jīng)常被用來治療結腸癌和乳腺癌以及惡性腫瘤。
結果(圖10)表明對正常細胞(CCD18co)，NB1011比TDX毒性小10倍以上，對MCF7-TDX抗性腫瘤細胞，其比TDX更有效達30倍以上。對于其它TDX-抗性腫瘤細胞系獲得了類似結果。對正常細胞的低水平毒性和對TDXR腫瘤細胞的高毒性支持對過度表達TS的抗藥性癌癥施用NB1011。
3.根據(jù)從dUMP-3H氚釋放的測定，NBl011比TS活性更依賴TS蛋白質水平。
使用四種類型的測試來表征細胞和組織內TS水平。最常用的是以抗體為基礎的技術(Johnston(1994)上文；Johnston(1995)上文)，但是在各種研究中也測定了RT-PCR，5FdUMP-結合和氚釋放(van Laar(1996)臨床癌癥研究(Clin.Cancer Res)2(8)1327-33；vanTriest(1999)Clin.Cancer.Res.5(3)643-54；Jackman(1995)耳鼻咽喉科學紀事(Ann.Oncol.)6(9)871-81；Larsson(1996)Acta.Oncol.35(4)469-72；Komaki(1995)乳腺癌研究治療(Breast CancerRes.Treat.)35(2)157-62；Mulder(1994)抗癌研究(AnticancerRes.)14(6B)2677-80)為了表征細胞系，我們集中進行蛋白質印跡和從3H-dUMP的氚釋放。選擇這些測試，因為抗體-檢測常用于臨床樣品，而來自標記的脫氧尿苷的氚釋放直接測定細胞內TS的催化活性。
根據(jù)方法中所述培養(yǎng)細胞并表征。TS表達水平是相對于CCD18co，正常結腸內皮細胞系的。根據(jù)方法中所述，氚釋放是減去背景值的。ND＝未能檢測到高于背景的值。
表7中給出的數(shù)據(jù)分析表明TS蛋白質水平和對NB1011的敏感性之間的關系比TS活性(從3H-dUMP的氚釋放)和NB1011敏感性之間的關系更密切。在各套匹配的親本細胞系和抗藥性腫瘤細胞系中，抗藥性衍生物，各有比親本更多的TS蛋白質，也具有提高的對NB1011的敏感性。但是，當關于TS活性進行相同的比較時，親本細胞系常常具有可比的，或者更大的TS活性，并且對NB1011-介導的細胞毒性更不敏感。
這些結果通過很多不同機理或機理的組合而發(fā)生，可能是3H-dUMP向dUMP的轉化(和伴隨氚釋放)可能受到某些成分的限制，可能是輔因子可獲得性。但是，因為BVdUMP的轉化不依賴于輔因子，所以其與TS的反應即使在其中輔因子是有限的這樣的細胞培養(yǎng)基中也是連續(xù)的。該發(fā)現(xiàn)是重要的，因為作為治療劑的TS底物沒有試圖以對TS活性的典型氚釋放測試的結果為基礎，在所述測試中，發(fā)現(xiàn)最惡化的抗藥性腫瘤細胞比它們的親本具有更低的TS活性。這些結果另外支持這樣的提示，即通過抗體染色檢測TS水平的基礎上簡單地選擇進行TS ECTA治療的患者。
4.腫瘤樣品中TS水平經(jīng)常超過正常組織的4倍。
上面給出的結果提示，TS ECTA治療，至少用NB1011，當對過度表達TS至少4倍的癌癥患者使用時最有效。
文獻(Johnston(1994)上文；Bathe(1999)美國癌癥科學研究(CancerJ.Sci.Am)5(1)34-40；Leichman(1998)Oncol.(Huntingt.)12(8增刊6)43-7；和Lenz(1995)PCR方法應用(PCR MethodsAppl.)4305-308)提出大約50％的癌癥患者過度表達在4倍范圍內，并且，此外，過度表達的該水平預示更惡化的疾病。為了證實人結腸癌中TS至少4倍過度表達的概率，從Cooperative Human Tissue Network獲得匹配的正常樣品和腫瘤樣品。通過RT-PCR對這些樣品分析TSmRNA水平，將得到的結果與免疫組織化學的結果相比較(Johnston等(1995)上文)。圖11給出了對樣品RT-PCR評價的結果。
根據(jù)RT-PCR測試確定的，上面分析的7份樣品中的5份過度表達TS至少4倍水平。這些患者中沒有一名事先用化學治療治療，這提示該概率和過度表達水平與發(fā)病有關，而不是由于化學治療的選擇。預計為了提高表達可以篩選接觸了TS抑制劑例如Tomudex或5FU或5-FdUrd，5-FdUMP的合成代謝衍生物的癌細胞(Lonn等(1996)癌癥(Cancer)77(1)107-12)。根據(jù)對所有7份樣品的RT-PCR測定的，過度表達的程度是大約4.7倍。這些數(shù)據(jù)提示腫瘤病灶中TS過量4倍以上表達是常見的。
5. 5FU-抗性人結腸癌的實驗性治療。
定向TS的新化合物治療的最重要的疾病是胃腸癌。為了在體內模型中研究NB1011的活性，H630R10，5FU-抗性人結腸癌細胞在裸鼠體內皮下生長至平均腫瘤大小為50mm3。然后用賦形劑(DMSO，5FU或NB1011)處理小鼠。
腫瘤內或腹膜內對有腫瘤的小鼠每天給藥3.5毫克，2.5毫克和1.25毫克劑量的NB1011，給藥5天。圖12A說明與賦形劑或5FU處理動物相比，用NB1011治療5天誘導了腫瘤生長的最初的阻斷。盡管在NB1011組中沒有證明統(tǒng)計學意義的劑量反應相關性，但是從第6天開始NB1011組相對5FU或賦形劑對照組之間出現(xiàn)明顯不同。在第25天殺死對照動物之前這種差異都一直保持(圖12B)，即使在第5天之后治療就不持續(xù)了。
盡管參照具體實施方案詳細描述了本發(fā)明，但是對本領域技術人員顯而易見的是不超出本發(fā)明的精神和范圍可以進行各種變化和修飾。
表2 細菌和rHuTS動力學參數(shù)的比較

根據(jù)方法中所述進行酶動力學實驗。關于干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)的數(shù)據(jù)得自Barr等(1983)上文。根據(jù)上文材料與方法中所述制備rHuTS。
表3 Tomudex和5-FdUMP對rHuTS反應的抑制作用

Tomudex和5-FdUMP對rHuTS反應的抑制作用。根據(jù)材料與方法中所述將含有酶抑制劑或輔因子的胸苷酸合成酶反應在30℃下溫育，對于BVdUMP反應，通過測定340nm激發(fā)和595nm發(fā)射下相對熒光單位的增加，或者，對于dUMP反應，測定A340的增加，測定酶反應的初始速率。表4 對正常和腫瘤細胞株的相對5FU的NB1011的細胞毒性

表4，續(xù)

在alamar blue測試(方法)中對細胞分析對NB1011或5FU的反應。所有的測試至少進行三次。標準偏差小于0％。以IC50(所有細胞類型的平均值)與IC50(所有腫瘤細胞系的平均值)之比計算治療指數(shù)。
表5 對基因工程處理以表達HuTS的細胞系的NB1011細胞毒性

用GFP符合讀框將編碼rHuTS的cDNA亞克隆到載體pEGFP-C3中。將該構建體轉染到HT1080細胞中并且為了獲得穩(wěn)定表達融合rHuTS的克隆用G418(750μg/毫升)篩選。根據(jù)方法中所述以高熒光表達或低熒光表達為基礎克隆各細胞。通過使用蛋白質印跡分析測定*TS水平，以相對于細胞株CCD18co的值表示定量測定的表達水平。
表6 Tomudex抑制NB1011介導的細胞毒性

根據(jù)方法中所述，用TDX-抗性MCF7乳腺癌細胞進行Tomudex拯救測試(alamar blue)。以有或沒有加TDX的IC50的比例計算“保護倍數(shù)”。表7 葉酸抑制劑的影響

根據(jù)方法中所述，使用rHuTS進行無細胞測試，合并合適的底物和其它成分。加入MTX(140μM)，LV(140μM)或TDX(5μM)來估算它們的抑制活性。底物的應用(或者BVdUMP或者THF)被用作反應速率的量度。數(shù)字表示殘留的活性。
表8 與氚釋放相比，NB1011活性與TS蛋白質更相關

表9選擇的MDF7TDX細胞對NB1011的抗性比對5-氟尿嘧啶和Tomudex更敏感IC50(微摩爾)*相對TS5-FU TomudexNB1011蛋白質水平MCF7 10- .026- 291- 1X-MCF7 TDX 32 ＞10 2 11XMCF7 TDX/10112.041 240 4X*＝根據(jù)通過材料與方法中描述的alamar blue測試測定的結果。TDX＝Tomudex；1011＝NB1011。
權利要求
1.一種選擇性抑制病理細胞的方法，其中所述細胞特征在于過度表達內源胞內激活酶，并且其中所述酶不被底物前體藥物化合物滅活，該方法包括使細胞接觸有效量的具有通過激活酶在細胞內選擇性轉化為毒素從而選擇性抑制病理細胞增殖的結構的底物化合物。
2.下面的化合物 其中R1是或者包含離去基團，所述離去基團是具有與通過激活酶從嘧啶環(huán)的分離相適應的分子大小和親電性的化學個體，并且其從嘧啶環(huán)激活酶釋放時具有抑制細胞增殖或殺死細胞的能力；其中Q選自糖，碳環(huán)化合物，非環(huán)化合物，和掩蔽的磷酸酯或氨基磷酸酯衍生物。
3.權利要求1或2的方法，其中所述化合物具有下面的結構 其中R1是下式基團 前提是化合物I中，n可以是0，R2是選自下面的二價電子軌道基團不飽和的烴基；包括一個或多個不飽和烴基的芳香族烴基；包括一個或多個不飽和烴基的雜芳基；R3是選自下面的二價間隔基部分 R5可以是相同或不同的，并且獨立地是具有1-10個碳原子的直鏈或支鏈烷基，或具有3-10個碳原子的環(huán)烷基，或R5是鹵原子(F，Cl，Br，I)；n是0-10的整數(shù)；m是0或1；R4是選自下面的發(fā)毒基團 R8和R9是低級烷基且R10是H或CH3；X是-Cl，-Br，-I，或者其它可能的離去基團，前提是當R7是-H且m是0時，則R4不是鹵原子，或者當m是0且n是0時，則R4不是鹵原子；Y獨立地是-H或-F；Z獨立地是-O-或-S-；Q是選自下面的基團 R6獨立地是-H，-OH，-OC(＝O)CH3，F(xiàn)或者其它保護的羥基；而R7是氫，磷酸酯基團，磷酸二酯基團或氨基磷酸酯基團；其中所述化合物可以是任何對映異構體，非對映異構體，或立體異構體形式，包括，D-構型，L-構型，α-端基差向異構體，和β-端基差向異構體形式。
4.權利要求1的方法，其中所述病理細胞由于喪失腫瘤抑制劑功能過度表達激活酶。
5.權利要求1的方法，其中所述激活酶由于前化學治療被過度表達。
6.權利要求5的方法，其中所述化學治療是氟代嘧啶或托木迪斯。
7.權利要求1的方法，其中所述細胞是過渡增殖細胞或腫瘤細胞。
8.權利要求7的方法，其中所述腫瘤細胞是選自胃癌細胞，乳腺癌細胞和結腸癌細胞的細胞。
9.權利要求1的方法，其中所述激活酶是胸苷酸合成酶。
10.權利要求1的方法，其中所述激活酶選自胸苷酸合成酶，酪氨酸激酶或二氫葉酸還原酶。
11.權利要求1的方法，其中所述細胞和激活酶是相同物種的。
12.權利要求1的方法，進一步包括使細胞接觸第二種治療劑。
13.權利要求1的方法，其中所述第二種治療劑是氟代嘧啶或托木迪斯。
14.權利要求1的方法，其中所述接觸是在體外，離體和體內。
15.權利要求1的方法，其中所述接觸是在體內。
16.權利要求1的方法，其中所述激活酶過度表達至少4倍。
17.權利要求1的方法，進一步包括使細胞接觸有效量的減少胞內胸苷或嘌呤的化合物。
18.權利要求1的方法，進一步包括使細胞接觸有效量的6-巰基嘌呤，硫代鳥嘌呤或2’-脫氧助間型霉素。
19.權利要求1-18任一項的方法，其中所述化合物是(e)-5-(2-溴乙烯基)-2’-脫氧-5’-尿苷基苯基L-丙氨酰基氨基磷酸酯。
20.篩選通過不被前體藥物抑制也不被滅活的內源胞內酶選擇性胞內轉化為毒素的前體藥物的方法，包括使候選前體藥物與至少兩種試驗細胞接觸，所述試驗細胞表達來自相同或不同物種的內源胞內酶，并且測定通過內源胞內酶將前體藥物激活為毒性物質的激活作用。
21.權利要求20的方法，其中一種試驗細胞是正常細胞，另一種試驗細胞是病理細胞。
22.權利要求21的方法，其中所述測試包括通過質譜分析胞內代謝產(chǎn)物。
23.權利要求20的方法，其中所述候選物質包括可檢測試劑。
24.權利要求23的方法，其中所述可檢測試劑是熒光標記。
25.權利要求20的方法，其中至少一種試驗細胞是過渡增殖細胞或腫瘤細胞。
全文摘要
本發(fā)明提供一種選擇性抑制病理細胞的方法，其中所述細胞特征在于表達一種內源胞內激活酶，并且其中所述酶不被底物前體藥物化合物滅活。該方法要求使細胞接觸有效量的底物化合物從而選擇性抑制病理細胞的增殖。本發(fā)明還提供了篩選通過酶在細胞內選擇性將前體藥物轉化為毒素的前體藥物的方法，該方法包括使至少兩種表達內源胞內酶的試驗細胞與來自相同或不同物種的候選前體藥物接觸并且測定通過內源胞內酶將前體藥物激活為毒素物質的激活作用。
文檔編號A61K31/7042GK1391486SQ00812868
公開日2003年1月15日 申請日期2000年7月21日 優(yōu)先權日1999年7月22日
發(fā)明者H·M·施帕德 申請人:新生物公司