專利名稱：粘膜炎莫拉氏菌的basb119多肽和多核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多核苷酸(此處稱作“BASB119多核苷酸”)，其編碼的多肽(此處稱作“BASB119”或者“BASB119多肽”)，重組材料及其制備方法。另一方面，本發(fā)明涉及使用這些多肽和多核苷酸的方法，包括針對(duì)細(xì)菌感染的疫苗。另一方面，本發(fā)明涉及檢測(cè)某些病原體感染的診斷分析。
背景技術(shù)：
粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)(也稱作粘膜炎布蘭漢球菌Branhamella catarrhalis)是革蘭氏陰性菌，常常從人體上呼吸道分離得到。它是造成幾種病變的原因，主要有幼兒和兒童中耳炎，和老年人肺炎。它也是造成竇炎和醫(yī)院感染的原因，并且不太經(jīng)常的造成入侵性疾病。
中耳炎在病例數(shù)目和其潛在后遺癥來(lái)說(shuō)，都是一種重要的兒童疾病。美國(guó)每年有超過(guò)350萬(wàn)病例報(bào)道，據(jù)估計(jì)80％的兒童在3歲之前都經(jīng)歷過(guò)至少一種耳炎癥狀(Klein，JO(1994)臨床感染疾病(Clin.Inf.Dis)19823)。除了未治療的或者變成慢性的之外，該疾病可以造成暫時(shí)的(對(duì)于內(nèi)耳液體積存的情況)或者永久的(如果聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)受損)聽(tīng)力損傷。對(duì)于幼兒，這樣的聽(tīng)力損傷可能造成遲緩說(shuō)話學(xué)習(xí)。
從有中耳炎的兒童中耳中，主要分離出3種細(xì)菌菌種肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)，無(wú)型流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)(NTHi)和粘膜炎莫拉氏菌。它們出現(xiàn)在60-90％的病例中。一篇近期研究的評(píng)論顯示，肺炎鏈球菌和NTHi都出現(xiàn)在大約30％的中耳炎病例中，粘膜炎莫拉氏菌出現(xiàn)在大約15％的中耳炎病例中(Murphy，TF(1996)微生物學(xué)綜述(Microbiolo.Rev.)60267)。也可以從中耳中分離出其他細(xì)菌(B型流感嗜血桿菌，化膿鏈球菌等)，但是頻率很低(2％或者更低的病例)。
流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，對(duì)于在中耳中發(fā)現(xiàn)的病原體來(lái)說(shuō)，在上呼吸道定居是發(fā)生耳炎的絕對(duì)前提；而其他條件對(duì)于引起疾病也是需要的(Dickinson，DP等(1998)傳染病學(xué)雜志(J.Infect.Dis.)158205，F(xiàn)aden，HL等(1991)Ann.Otorhinol.Laryngol.100612)。這對(duì)于引發(fā)細(xì)菌通過(guò)耳咽管移植到中耳是重要的，接著便開(kāi)始發(fā)炎過(guò)程。今天這些因素是已知的。假定，例如，免疫系統(tǒng)在病毒感染后的暫時(shí)性異常，可能造成不能控制呼吸道定居(Faden，HL等(1994)傳染病學(xué)雜志(J.Infect.Dis.)1691312)。另一種解釋是，暴露于環(huán)境因素使得有些兒童具有更重要的定居，因?yàn)橹卸≡w的持續(xù)存在，使得他們隨后變得易感染中耳炎的發(fā)生(Murphy，TF(1996)微生物學(xué)綜述(Microbiolo.Rev.)60267)。
粘膜炎莫拉氏菌免疫反應(yīng)的特征很少。依次從0-2歲嬰兒鼻咽分離的菌株的分析顯示，他們頻繁地得到和排除新菌株。這表明被定居的兒童，可以增加抗該細(xì)菌有效的免疫反應(yīng)(Faden，HL等.(1994)傳染病學(xué)雜志(J.Infect.Dis.)1691312)。
在大多數(shù)被試成年人中鑒定出細(xì)菌抗體(Chapman，AJ等(1985)傳染病學(xué)雜志(J.Infect.Dis.)151878)。粘膜炎莫拉氏菌菌株，在抵抗血清殺菌活性能力上有各種變化一般的，從患病個(gè)體分離的細(xì)菌，比從僅被定居的個(gè)體分離的細(xì)菌具有更強(qiáng)的抵抗性(Hol，C等(1993)論壇(Lancet)3411281，Jordan，KL等(1990)美國(guó)藥學(xué)雜志(Am.J.Med.)88(增刊5A)28S)。因此，血清抗性可以被看作細(xì)菌的一個(gè)毒性因素。在從中耳炎恢復(fù)的兒童的血清中觀測(cè)到調(diào)理活性。
除了OMP B1，84kDa蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的表達(dá)受鐵的調(diào)節(jié)，并且可以被肺炎患者的血清識(shí)別(Sethi，S，等(1995)感染免疫(Infect.Immun.)631516)，以及UspA1和UspA2(Chen D.等(1990)，感染·免疫(Infect.Immun.)671310)之外，被人體中這些不同免疫反應(yīng)作為目標(biāo)的抗原還沒(méi)有得到鑒定。
出現(xiàn)在粘膜炎莫拉氏菌表面的許多其他膜蛋白，可以通過(guò)生物化學(xué)方法表現(xiàn)其特征，或者對(duì)于它們?cè)谡T導(dǎo)保護(hù)性免疫方面的潛在本質(zhì)(綜述參見(jiàn)Murphy，TF(1996)微生物學(xué)綜述(Microbiol.Rev.)60267)進(jìn)行表征。在鼠的肺炎模型中，針對(duì)它們(UspA，CopB)增加的抗體的出現(xiàn)，促進(jìn)肺部感染更快的清除。另一種多肽(OMP CD)在粘膜炎莫拉氏菌菌株中高度保守，并且與銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa )的一種膜空蛋白具有同源性，證明它可以在動(dòng)物模型中有效地對(duì)抗該細(xì)菌。
在過(guò)去幾十年中，粘膜炎莫拉氏菌感染的頻率有驚人的增加。這歸因于多種抗生素抗性菌株的出現(xiàn)，以及具有弱化免疫系統(tǒng)人群的增加。分離出抵抗部分或者全部標(biāo)準(zhǔn)抗生素的粘膜炎莫拉氏菌菌株已經(jīng)不再罕見(jiàn)。這一現(xiàn)象造成未能滿足的醫(yī)療需要，以及對(duì)新的抗微生物藥劑、疫苗、藥物篩選方法和對(duì)該微生物診斷檢測(cè)的需求。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及BASB119，特別是涉及BASB119多肽和BASB119多核苷酸、重組材料及其制備方法的。另一方面，本發(fā)明涉及使用這些多肽和多核苷酸的方法，其中包括微生物疾病的預(yù)防和治療。另一方面，本發(fā)明涉及微生物感染相關(guān)疾病檢測(cè)的診斷分析和這種感染相關(guān)條件，例如檢測(cè)BASB119多核苷酸或者多肽表達(dá)或者活性的分析。
通過(guò)閱讀以下書面描述和閱讀本公開(kāi)內(nèi)容的其他部分，在本公布發(fā)明的精神和范疇內(nèi)的各種變化和更改，對(duì)于技術(shù)熟練者來(lái)說(shuō)是很明顯的。
發(fā)明描述本發(fā)明涉及BASB119多肽和多核苷酸，以下有更詳細(xì)的描述。本發(fā)明特別涉及粘膜炎莫拉氏菌的BASB119多肽和多核苷酸有關(guān)，其與任何已知的蛋白質(zhì)序列有氨基酸序列同源性。預(yù)測(cè)它是一種脂蛋白，因?yàn)樗哂兄鞍仔盘?hào)序列的特征。本發(fā)明尤其涉及這樣的BASB119，該BASB119具有分別在SEQ ID NO1或者3和SEQ ID NO2或者4中列出的核苷酸和氨基酸序列。在序列表(Sequence Listing)中“DNA”下引用的序列，被理解為代表本發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)例，因?yàn)槭煜こＲ?guī)技術(shù)者可以認(rèn)識(shí)到，這些序列一般可以有效地用于多核苷酸中，包括多核糖核酸。
多肽本發(fā)明的一個(gè)方面提供了粘膜炎莫拉氏菌的多肽，在此處被稱作“BASB119”和“BASB119多肽”，和其生物學(xué)上、診斷上、預(yù)防上、臨床上或者治療上有用變體，以及含有這些成分的組合物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供(a)分離的多肽，其氨基酸序列與SEQ ID NO2或者4的氨基酸序列有至少85％同一性，優(yōu)選的有至少90％同一性，更優(yōu)選的有至少95％同一性，最優(yōu)選的有至少97-99％同一性或者完全相同；(b)分離的多核苷酸編碼的多肽，該分離的多核苷酸的多核苷酸序列與SEQ ID NO1或者3分別在SEQ ID NO1或者3全長(zhǎng)上有至少85％同一性，優(yōu)選的有至少90％同一性，更優(yōu)選的有至少95％同一性，最優(yōu)選的有至少97-99％同一性或者完全相同；(c)分離的多核苷酸編碼的多肽，該分離的多核苷酸的多核苷酸序列編碼的多肽的氨基酸序列，與SEQ ID NO2或者4的氨基酸序列有至少85％同一性，優(yōu)選的有至少90％同一性，更優(yōu)選的有至少95％同一性，最優(yōu)選的有至少97-99％同一性或者完全相同。
SEQ ID NO2或者4提供的BASB119多肽，是粘膜炎莫拉氏菌MC2931(ATCC43617)菌株的BASB119多肽。
本發(fā)明也提供了BASB119多肽的免疫原性片段，即BASB119多肽的鄰接部分，該BASB119多肽具有與具有SEQ ID NO2或者4氨基酸序列的多肽相同的或者基本相同的免疫活性；也就是說(shuō)，該片段(如果需要可以與載體結(jié)合)能夠引起識(shí)別BASB119多肽的免疫反應(yīng)。這樣的免疫原性片段可以包括，例如缺少N-末端前導(dǎo)序列、和/或跨膜區(qū)域和/或C-末端錨定區(qū)域的BASB119多肽。在一個(gè)優(yōu)選的方面，根據(jù)本發(fā)明的BASB119的免疫原性片段包括這樣一種多肽的幾乎全部細(xì)胞外區(qū)域，該多肽與SEQ ID NO2或者4在SEQ ID NO2或者4全長(zhǎng)上，有至少85％同一性，優(yōu)選的有至少90％同一性，更優(yōu)選的有至少95％同一性，最優(yōu)選的有至少97-99％的同一性。
片段是含有氨基酸序列的多肽，它與本發(fā)明任何多肽氨基酸序列的一部分完全相同，而不是與全部氨基酸序列相同。至于BASB119多肽，片段可以是“游離狀況”，或者是包含在更大的多肽之中，它們形成更大的多肽的一部分或者一個(gè)區(qū)域，最優(yōu)選的是作為單個(gè)更大多肽的單獨(dú)連續(xù)區(qū)域。
優(yōu)選的片段包括，例如，具有SEQ ID NO2或者4氨基酸序列或者其變體的一部分的截短的多肽，例如包括氨基-和/或羧基-末端氨基酸序列的殘基連續(xù)系列。通過(guò)宿主細(xì)胞產(chǎn)生的或者宿主細(xì)胞內(nèi)的本發(fā)明多肽的降解形式，也是優(yōu)選的。更優(yōu)選的是具有結(jié)構(gòu)或者功能特征的片段，例如含有α-螺旋或者α-螺旋形成區(qū)域的片段、含有β-折疊和β-折疊形成區(qū)域的片段、含有轉(zhuǎn)角和轉(zhuǎn)角形成區(qū)域的片段、含有卷曲和卷曲形成區(qū)域的片段、含有親水區(qū)域的片段、含有疏水區(qū)域的片段、含有α兩親性區(qū)域的片段、含有β兩親性區(qū)域區(qū)域的片段、含有柔性區(qū)域的片段、含有表面形成區(qū)域的片段、含有底物結(jié)合區(qū)域的片段以及含有高抗原索引區(qū)域的片段。
更優(yōu)選的片段包括這樣的分離的多肽，該分離多肽的氨基酸序列含有SEQ ID NO2或者4氨基酸序列的至少15，20，30，40，50或者100個(gè)連續(xù)氨基酸，或者這樣的分離的多肽，該多肽的氨基酸序列含有從SEQ ID NO2或者4氨基酸序列剪切或者缺失的至少15，20，30，40，50或者100個(gè)連續(xù)氨基酸。
本發(fā)明多肽的片段可以用于通過(guò)肽合成制備相應(yīng)的全長(zhǎng)多肽；因此，這些片段可以用作制備本發(fā)明全長(zhǎng)多肽的中間體。
其中的幾個(gè)，5-10，1-5，1-3，1-2或者1個(gè)氨基酸以任意組合被替換、缺失或者添加的變體是特別優(yōu)選的。
本發(fā)明的多肽或者免疫原性片段，可以是“成熟”蛋白的形式，或者可以是像前體或者融合蛋白這樣更大蛋白的一部分。包含一段額外的氨基酸序列經(jīng)常是有利的，這包括分泌或者前導(dǎo)序列、前序列、像多聚組氨酸這樣有助于純化的序列，或者在重組制備中用于穩(wěn)定的額外序列。另外，也可以考慮添加提高最終分子免疫原性潛力的外源多肽或者脂質(zhì)尾部或者多核苷酸序列。
一方面，本發(fā)明涉及遺傳工程可溶性融合蛋白，該蛋白含有本發(fā)明的多肽或者其片段，以及免疫球蛋白各種亞類(IgG，IgM，IgA，IgE)重鏈或者輕鏈恒定區(qū)的各種部分。優(yōu)選的免疫球蛋白是，人體IgG，特別是IgG1重鏈的穩(wěn)定部分，融合發(fā)生在鉸鏈區(qū)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以通過(guò)與剪切序列結(jié)合而簡(jiǎn)單的除去Fc部分，該剪切序列可以被凝血因子X(jué)a剪切。
另外，本發(fā)明涉及通過(guò)遺傳工程制備這些融合蛋白的方法，并且與其藥物篩選、診斷和治療的用途有關(guān)。本發(fā)明的另一方面涉及編碼這種融合蛋白的多核苷酸有關(guān)。融合蛋白技術(shù)的實(shí)施例可以在國(guó)際專利申請(qǐng)WO94/29458和WO94/22914中找到。
蛋白質(zhì)可以化學(xué)結(jié)合，或者作為重組融合蛋白表達(dá)，這與非融合蛋白相比，可以允許提高表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的水平。融合配偶體可以有助于提供T輔助細(xì)胞抗原決定簇(免疫融合配偶體)，特別是人體識(shí)別的T輔助細(xì)胞抗原決定簇，或者有助于以比天然重組蛋白更高的產(chǎn)量表達(dá)蛋白質(zhì)(表達(dá)增強(qiáng)子)。優(yōu)選的融合配偶體既是免疫融合配體，又是表達(dá)增強(qiáng)配偶體。
融合配偶體包括來(lái)自流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)的蛋白D和來(lái)自流感病毒NS1(血凝素)的非結(jié)構(gòu)蛋白。另一種融合配偶體是稱為L(zhǎng)ytA的蛋白。優(yōu)選使用分子的C末端部分。Lyta來(lái)自肺炎鏈球菌(Streptococeus pneumoniae)，它合成N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶LytA(lytA基因編碼{Gene，43(1986)265-272頁(yè)})，一種特異性降解肽聚糖主鏈某些鍵的自溶素。LytA蛋白的C末端區(qū)域負(fù)責(zé)與膽堿或者某些膽堿類似物結(jié)合，例如DEAE。該性質(zhì)被用于開(kāi)發(fā)可用于表達(dá)融合蛋白的大腸桿菌C-LytA表達(dá)質(zhì)粒。對(duì)于在氨基末端含有C-LytA片段的雜交蛋白的純化，已有描述{生物技術(shù)(Biotechnology)10，(1992)795-798頁(yè)}?？梢允褂肔ytA分子的重復(fù)部分，該重復(fù)部分位于C末端起始于178殘基，例如殘基188-305。
本發(fā)明也包括前述多肽的變體，即通過(guò)保守氨基酸替換而與目標(biāo)對(duì)象不同的多肽，保守氨基酸替換是指用另一個(gè)具有相似性質(zhì)的殘基替換一個(gè)殘基。典型的這種替換發(fā)生在丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸之間；絲氨酸和蘇氨酸之間；酸性殘基天冬氨酸和谷氨酸之間；天冬酰胺和谷氨酰胺之間；堿性殘基賴氨酸和精氨酸殘基之間；或者芳香族殘基苯丙氨酸和酪氨酸之間。
本發(fā)明的多肽可以用任何合適的方法制備。這些多肽包括分離的天然發(fā)生的多肽、重組產(chǎn)生的多肽、合成產(chǎn)生的多肽，或者組合這些方法產(chǎn)生的多肽。制備這些多肽的方法，在技術(shù)上是熟知的。
本發(fā)明的多肽最優(yōu)選的是來(lái)自粘膜炎莫拉氏菌，然而，也可以優(yōu)選的從同一分類學(xué)屬的其他生物體獲得。例如，本發(fā)明多肽也可以從同一分類學(xué)科或者目的生物體獲得。
多核苷酸本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供編碼BASB119多肽的多核苷酸，特別是編碼此處稱作BASB119多肽的多核苷酸。
在本發(fā)明一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，該多核苷酸含有編碼具有SEQ ID NO1或者3中列出序列的BASB119多肽的區(qū)域，該區(qū)域包含全長(zhǎng)基因或者其變體。
SEQ ID NO1或者3提供的BASB119多核苷酸，是來(lái)自粘膜炎莫拉氏菌MC2931(ATCC 43617)菌株的BASB119多核苷酸。
本發(fā)明的另一方面提供了分離的編碼和/或表達(dá)BASB119多肽和多核苷酸的核酸分子，特別是粘膜炎莫拉氏菌BASB119多肽和多核苷酸，例如包括，未加工RNA、核酶RNA、mRNA、cDNA、基因組DNA、B-DNA和Z-DNA。本發(fā)明的其他實(shí)施方案包括生物學(xué)上、診斷上、預(yù)防上、臨床上或者治療上有用的多核苷酸和多肽，以及其變體，以及含有它們的組合物。
本發(fā)明的另一個(gè)方面與分離的多核苷酸、有緊密親緣關(guān)系的多核苷酸及其變體有關(guān)，該多核苷酸含有至少一條編碼BASB119多肽的全長(zhǎng)基因，該BASB119多肽具有SEQ ID NO2或者4推導(dǎo)出的氨基酸序列。
在本發(fā)明另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，來(lái)自粘膜炎莫拉氏菌的BASB119多肽含有或者由SEQ ID NO2或者4的氨基酸序列或者其變體組成。
使用此處提供的信息，例如SEQ ID NO1或者3列出的多核苷酸序列，使用標(biāo)準(zhǔn)克隆或者篩選方法，例如，那些使用粘膜炎莫拉氏菌Catlin細(xì)胞作為起始物質(zhì)，接著可以獲得全長(zhǎng)克隆的，克隆或者測(cè)序細(xì)菌染色體DNA片段的方法，可以獲得編碼BASB119多肽的本發(fā)明多核苷酸。例如，為了獲得本發(fā)明的多核苷酸序列，例如SEQ ID NO1或者3給出的多核苷酸序列，典型的是使用放射性標(biāo)記的來(lái)自部分序列的寡聚核苷酸，優(yōu)選的是17-mer或者更長(zhǎng)，探測(cè)粘膜炎莫拉氏菌Catlin在大腸桿菌或者其他合適宿主中的染色體DNA克隆文庫(kù)。然后，使用嚴(yán)格雜交條件，可以辨別出攜帶有與探針DNA一致的DNA的克隆。使用由原始多肽或者多核苷酸序列設(shè)計(jì)的測(cè)序引物，對(duì)雜交鑒定的個(gè)體克隆進(jìn)行測(cè)序，可以兩個(gè)方向擴(kuò)展多核苷酸序列，以確定全長(zhǎng)基因序列。例如，可以使用由質(zhì)粒克隆制備的變性雙鏈DNA，方便的進(jìn)行測(cè)序。合適的技術(shù)描述于Maniatis，T.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Sambrook等，分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(MOLECULAR CLONING，ALABORATORY MANUAL)，第二版，；冷泉港實(shí)驗(yàn)出版社，冷泉港，紐約(1989)(特別參見(jiàn)雜交篩選1.90和對(duì)變性的雙鏈DNA模板的測(cè)序13.70(Screening By Hybridization 1.90 and SequencingDenatured Double-Stranded DNA Templates 13.70))。也可以進(jìn)行基因組DNA直接測(cè)序得到全長(zhǎng)基因序列。本發(fā)明說(shuō)明，SEQ ID NO1或者3列出的多核苷酸發(fā)現(xiàn)于來(lái)自粘膜炎莫拉氏菌的DNA文庫(kù)。
另外，SEQ ID NO1或者3列出的每條DNA序列含有編碼蛋白質(zhì)的可讀框，該蛋白質(zhì)具有大約SEQ ID NO2或者4列出的氨基酸殘基數(shù)目，可以使用對(duì)于技術(shù)熟練者熟知的氨基酸殘基分子量計(jì)算該蛋白質(zhì)推導(dǎo)出的分子量。
SEQ ID NO1的多核苷酸，在SEQ ID NO1核苷酸編號(hào)1的起始密碼子和開(kāi)始于核苷酸編號(hào)514的終止密碼子之間，編碼SEQ ID NO2的多肽。
SEQ ID NO3的多核苷酸，在SEQ ID NO3核苷酸編號(hào)1的起始密碼子和開(kāi)始于核苷酸編號(hào)511的終止密碼子之間，編碼SEQ ID NO4的多肽。
另一方面，本發(fā)明提供含有或者由以下序列組成的分離的多核苷酸(a)多核苷酸序列，該序列與SEQ ID NO1或者3分別在SEQ ID NO1或者3全長(zhǎng)上有至少85％同一性，優(yōu)選的有至少90％同一性，更優(yōu)選的有至少95％同一性，甚至更優(yōu)選的有至少97-99％同一性或者完全相同；或者(b)編碼多肽的多核苷酸序列，該多肽與SEQ ID NO2或者4的氨基酸序列分別在SEQ ID NO2或者4全長(zhǎng)上，有至少85％同一性，優(yōu)選的有至少90％同一性，更優(yōu)選的有至少95％同一性，甚至更優(yōu)選的有至少97-99％同一性或者100％完全相同。
本發(fā)明編碼多肽的多核苷酸，包括來(lái)自粘膜炎莫拉氏菌以外其他菌種的同源物或者直向同源物，可以通過(guò)含有以下步驟的方法獲得在嚴(yán)格雜交條件下(例如，使用溫度范圍45-65℃，SDS濃度0.1-1％)，使用包含或者由SEQ ID NO1或者3序列或者其片段組成的標(biāo)記或者可探測(cè)探針，篩選合適的文庫(kù)；分離含有該多核苷酸序列的全長(zhǎng)基因和/或基因組克隆。
本發(fā)明提供在其全長(zhǎng)上與SEQ ID NO1或者3編碼序列(可讀框)一致的多核苷酸序列。本發(fā)明也提供了成熟多肽或者其片段編碼序列的本身，或者閱讀框架中成熟多肽或者其片段的編碼序列和另一段編碼序列，例如編碼前導(dǎo)或者分泌序列、前蛋白序列、或者原蛋白序列、或者前原蛋白序列的序列。本發(fā)明多核苷酸也含有至少一段非編碼序列，例如，包括但是不僅僅局限于，至少一段5’和3’非編碼序列，例如轉(zhuǎn)錄但是不翻譯的序列，終止信號(hào)(例如依賴rho的和不依賴rho的終止信號(hào))，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，Kozak序列、穩(wěn)定mRNA的序列、內(nèi)含子和多聚腺苷酸信號(hào)。多核苷酸序列也可以包含編碼附加氨基酸的額外編碼序列。例如，可以編碼有助于融合多肽純化的標(biāo)記序列。在本發(fā)明某些實(shí)施方案中，標(biāo)記序列是6組氨酸肽，如在pQE載體(Qiagen，Inc)中提供的，描述于Gentz等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)86821-824(1989)，或者HA肽標(biāo)記(Wilson等，細(xì)胞(Cell)37767(1984))，它們都可以用于純化與之融合的多肽序列。本發(fā)明的多核苷酸，也包括但是不僅僅局限于，含有結(jié)構(gòu)基因和其控制基因表達(dá)的天然相關(guān)序列的多核苷酸。
編碼SEQ ID NO2或者4的BASB119多肽的核苷酸序列，可以分別與包含在SEQ ID NO1的1至513核苷酸中的多肽編碼序列或者包含在SEQ ID NO3的1至513核苷酸中的多肽編碼序列一致。另外，它也可以是這樣的序列，該序列作為遺傳密碼冗余(簡(jiǎn)并)的結(jié)果，也編碼SEQ ID NO2或者4的多肽。
如此處所用的術(shù)語(yǔ)“編碼多肽的多核苷酸”包含這樣的多核苷酸，該多核苷酸包括編碼本發(fā)明多肽的序列，特別是細(xì)菌多肽，更特別是具有SEQ ID NO2或者4中列出氨基酸序列的粘膜炎莫拉氏菌BASB119多肽。該術(shù)語(yǔ)也包含這樣的多核苷酸，該多核苷酸包括編碼多肽(例如，被整合噬菌體、整合插入序列、整合載體序列、整合轉(zhuǎn)座子序列中斷的多核苷酸，或者由于RNA編輯或者DNA重組中斷的多核苷酸)的單獨(dú)連續(xù)區(qū)域或者不連續(xù)區(qū)域，以及額外區(qū)域，也含有編碼和/或非編碼序列。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及此處描述的多核苷酸的變體，這些多核苷酸變體編碼具有SEQ ID NO2或者4推導(dǎo)出的氨基酸序列多肽的變體。本發(fā)明多核苷酸的片段也可以用于，例如合成本發(fā)明全長(zhǎng)多核苷酸。
更加特別優(yōu)選的實(shí)施方案，是編碼BASB119變體的多核苷酸，該變體具有SEQ ID NO2或者4 BASB119多肽的氨基酸序列，其中若干、許多、5-10、1-5、1-3、2、1或者沒(méi)有氨基酸殘基以任何組合被替換、修飾、缺失和/或添加。特別優(yōu)選的是不改變BASB119多肽的性質(zhì)或者活性的沉默替換、添加和缺失。
本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是這樣的多核苷酸以及與這種多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸，該多核苷酸在其全長(zhǎng)上，與編碼具有SEQ ID NO2或者4列出氨基酸序列的BASB119多肽的多核苷酸有至少85％的同一性。另外，最優(yōu)選的是含有這樣區(qū)域的多核苷酸及其互補(bǔ)多核苷酸，該區(qū)域在其全長(zhǎng)上與編碼BASB119多肽的多核苷酸又至少90％的同一性。在這點(diǎn)上，在其全長(zhǎng)上與編碼BASB119多肽的多核苷酸有至少95％同一性的多核苷酸是特別優(yōu)選的。另外，在那些至少有95％同一性的多核苷酸中有至少97％同一性的那些多核苷酸是高度優(yōu)選的，其中那些至少有98％和至少有99％同一性的那些多核苷酸是特別高度優(yōu)選的，至少有99％同一性的是更加優(yōu)選的。
優(yōu)選的實(shí)施方案是編碼多肽的多核苷酸，該多肽具有與SEQ IDNO1或者3的DNA編碼的成熟多肽基本相同的生物功能和活性。
根據(jù)本發(fā)明某些優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了與BASB119多核苷酸序列雜交的多核苷酸，例如SEQ ID NO1或者3多核苷酸，特別是在嚴(yán)格雜交條件下。
本發(fā)明此外還涉及與此處提供的多核苷酸序列雜交的多核苷酸。在這點(diǎn)上，本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格雜交條件下，和此處提供的多核苷酸序列雜交的多核苷酸相關(guān)。如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”和“嚴(yán)格雜交條件”是指，只有當(dāng)兩條序列之間有至少95％同一性，優(yōu)選的有至少97％同一性時(shí)，發(fā)生的雜交。嚴(yán)格雜交條件的一個(gè)特定實(shí)例是，在含有以下組分的溶液中42℃孵育過(guò)夜，50％甲酰胺，5xSSC(150mMNaCl，15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH6.7)，5xDenhardt’s溶液，10％硫酸右旋糖苷，20mg/ml變性剪切鮭魚精子DNA，然后用0.1xSSC在大約65℃清洗雜交介質(zhì)。雜交和清洗條件是熟知的，在Sambrook，等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第二版，冷泉港，紐約(MolecularCloningA Laboratory Manual，Second Edition，Cold SpringHarbor，N.Y.)，(1989)中有舉例說(shuō)明，特別是在其第11章。用本發(fā)明提供的多核苷酸序列也可以使用溶液雜交。
本發(fā)明也提供多核苷酸，該多核苷酸含有或者由這樣的多核苷酸序列組成，該序列是在嚴(yán)格雜交條件下，使用探針，該探針具有所說(shuō)的列在SEQ ID NO1或者3中的多核苷酸序列或者其片段的序列，針對(duì)SEQ ID NO1或者3列出的多核苷酸序列，篩選含有全部基因的合適文庫(kù)而得到的；以及分離該多核苷酸序列。用于獲得該多核苷酸的片段包括，例如此處其他部分詳細(xì)描述的探針和引物。
正如此處其他部分關(guān)于本發(fā)明多核苷酸分析所討論的，例如，本發(fā)明的多核苷酸，可以用作RNA、cDNA和基因組DNA的雜交探針，以分離編碼BASB119的全長(zhǎng)cDNA和基因組克隆，分離與BASB119基因有高度同一性的，特別是高度序列同一性的其他基因的cDNA和基因組克隆。這些探針通常含有至少15個(gè)核苷酸殘基或者堿基對(duì)。優(yōu)選的，這些探針含有至少30個(gè)核苷酸殘基或者堿基對(duì)，并且可以含有至少50個(gè)核苷酸殘基或者堿基對(duì)。特別優(yōu)選的探針含有至少20個(gè)核苷酸殘基或者堿基對(duì)，并且具有少于30個(gè)核苷酸殘基或者堿基對(duì)。
用SEQ ID NO1或者3提供的DNA序列合成寡聚核苷酸探針，用該探針進(jìn)行篩選，可以分離得到BASB119基因的編碼區(qū)域。然后，使用具有與本發(fā)明基因序列互補(bǔ)序列的標(biāo)記寡聚核苷酸，篩選cDNA、基因組DNA或者mRNA文庫(kù)，以確定探針與文庫(kù)中的哪些成員雜交。
有幾種可以使用的，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，用于獲得全長(zhǎng)DNA，或者擴(kuò)展短DNA，例如那些基于cDNA末端快速擴(kuò)增方法(Rapid Amplification of cDNA ends)(RACE)(參見(jiàn)例如，F(xiàn)rohman，等，PANS USA 858998-9002，1988)的方法。新近的技術(shù)修改，例如以MarathonTM技術(shù)(Clontech Laboratories Inc.)為例，很大程度上簡(jiǎn)化了對(duì)長(zhǎng)cDNA的搜尋。在MarathonTM技術(shù)中，從由選定組織中提取的mRNA及與每個(gè)末端連接的“連接物”序列中，可以制備cDNA。然后使用基因特異的和連接物特異的寡聚核苷酸引物組合，進(jìn)行核酸擴(kuò)增(PCR)，以擴(kuò)增DNA“缺失的”5’端。接著，使用“嵌套”引物重復(fù)PCR反應(yīng)，嵌套引物是指為了擴(kuò)增產(chǎn)物間退火而設(shè)計(jì)的引物(典型的是連接物特異引物，它在連接物序列的3’以外退火，以及基因特異的引物，它在所選基因序列的5’以外退火)。隨后，可以通過(guò)DNA測(cè)序分析該反應(yīng)的產(chǎn)物，并且可以通過(guò)把產(chǎn)物直接與已存在的DNA連接產(chǎn)生完全序列，或者使用用于5’引物設(shè)計(jì)的新序列信息進(jìn)行單獨(dú)的全長(zhǎng)PCR，可以構(gòu)建全長(zhǎng)DNA。
正如此處關(guān)于多核苷酸分析所進(jìn)一步討論的，本發(fā)明的多核苷酸和多肽可以用作，例如疾病治療和診斷發(fā)現(xiàn)的研究試劑和材料，特別是人體疾病。
那些來(lái)自序列SEQ ID NO1或者3寡聚核苷酸的本發(fā)明多核苷酸，可以用于此處描述的方法中，以確定此處被鑒定的全部或者部分多核苷酸是在感染組織的細(xì)菌中轉(zhuǎn)錄的，優(yōu)選的方法是PCR。已知這些序列也可以用于診斷病原體達(dá)到的感染階段和感染類型。
本發(fā)明也提供編碼多肽的多核苷酸，該是成熟蛋白質(zhì)加額外的氨基或者羧基端氨基酸，或者產(chǎn)生多肽的內(nèi)部氨基酸(例如，當(dāng)成熟形式有多于一條多肽鏈時(shí))。這些序列可以在蛋白質(zhì)從前體到成熟形式的加工過(guò)程中發(fā)揮作用，可以使得蛋白質(zhì)運(yùn)輸發(fā)生，可以增長(zhǎng)或者縮短蛋白質(zhì)半壽期或者可以有利于蛋白質(zhì)分析或者制備的操作，以及其他作用。正如通常體內(nèi)的的情形，額外氨基酸可以被細(xì)胞酶類從成熟蛋白質(zhì)加工除去。
對(duì)于本發(fā)明的每一條和所有的多核苷酸，都提供了與其互補(bǔ)的多核苷酸。優(yōu)選的，這些互補(bǔ)多核苷酸與每一條與之互補(bǔ)的多核苷酸完全互補(bǔ)。
前體蛋白質(zhì)，具有與一條或者多條原序列融合的多肽成熟形式，可以是多肽的無(wú)活性形式。當(dāng)除去這些原序列時(shí)，這些無(wú)活性前體通常被激活。在激活之前，可以除去部分或者全部的原序列。通常這些前體被稱作原蛋白。
除了標(biāo)準(zhǔn)的核苷酸的A，G，C，T/U表示之外，術(shù)語(yǔ)“N”也可以用于描述本發(fā)明的某些多核苷酸。“N”是指在DNA或者RNA序列中，出現(xiàn)在指定位置的四個(gè)DNA或者RNA核苷酸的任意一個(gè)，除了優(yōu)選的，當(dāng)結(jié)合鄰近核苷酸位置，閱讀正確的閱讀框架時(shí)，N不是這樣的一個(gè)核酸，該核酸具有在這些閱讀框架中產(chǎn)生成熟前終止子的作用。
總之，本發(fā)明多核苷酸可以編碼成熟蛋白質(zhì)，成熟蛋白質(zhì)加前導(dǎo)序列(可以稱作前蛋白)，具有一條或者多條原序列的成熟蛋白質(zhì)前體，這些原序列不是前蛋白質(zhì)的前導(dǎo)序列，或者前原蛋白質(zhì)，它是原蛋白質(zhì)的前體，具有前導(dǎo)序列和一條或者多條原序列，這些序列通常在產(chǎn)生多肽活性和成熟形式的過(guò)程中被除去。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了本發(fā)明多核苷酸出于治療和預(yù)防目的的用途，特別是遺傳免疫。
本發(fā)明多核苷酸在遺傳免疫中的用途，優(yōu)選的使用合適的送遞方法，例如肌肉直接注射質(zhì)粒DNA(Wolff等，人類分子遺傳學(xué)(Hum MolGenet)(1992)1363，Manthorpe等，人類基因治療(Hum.GeneTher.)(1983)4419)，遞送與特殊蛋白質(zhì)載體結(jié)合的DNA(Wu等，生物化學(xué)雜志(J Biol Chem.)(1989)26416985)，DNA與磷酸鈣共沉淀(Benvenisty & Reshef，PNAS USA，(1986)839551)，把DNA包裝于各種形式的脂質(zhì)體中(Kaneda等，科學(xué)(Science)(1989)243375)，顆粒轟擊(Tang等，自然(Nature)(1992)356152，Eisenbraun等，DNA細(xì)胞生物學(xué)(DNA Cell Biol)(1993)12791)以及使用逆轉(zhuǎn)錄克隆載體的體內(nèi)感染(Seeger等，PNAS USA(1984)845849)。
載體，宿主細(xì)胞，表達(dá)系統(tǒng)本發(fā)明也涉及含有本發(fā)明一條或者多條多核苷酸的載體，經(jīng)遺傳工程操作具有本發(fā)明載體的宿主細(xì)胞，以及通過(guò)重組技術(shù)制備本發(fā)明多肽。使用來(lái)自本發(fā)明DNA構(gòu)建體的RNA，也可以使用無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)生產(chǎn)這些蛋白質(zhì)。
本發(fā)明重組多肽，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，從含有表達(dá)系統(tǒng)的遺傳工程宿主細(xì)胞制備。因此，另一方面，本發(fā)明有關(guān)于含有本發(fā)明一條或者多條多核苷酸的表達(dá)系統(tǒng)，經(jīng)遺傳工程操作具有這些表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞，以及通過(guò)重組技術(shù)制備本發(fā)明多肽。
對(duì)于本發(fā)明多肽的重組制備，宿主細(xì)胞可以經(jīng)遺傳操作而結(jié)合表達(dá)系統(tǒng)或者其部分或者本發(fā)明多核苷酸?？梢酝ㄟ^(guò)描述于很多標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)的方法，例如Davis，等，分子生物學(xué)基礎(chǔ)方法(BASIC METHODSIN MOLECULAR BIOLOGY)，(1986)和Sambrook，等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(MOLECULAR CLONINGA LABORATORY MANUAL)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)出版社，冷泉港N.Y.(1989)，例如磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-右旋糖苷介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)位、微注射、陽(yáng)離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電傳孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、刮擦裝載、彈道引入以及感染，有效地把多核苷酸引入宿主細(xì)胞。
合適宿主細(xì)胞的代表性實(shí)例包括，細(xì)菌細(xì)胞，例如鏈球菌、葡萄球菌、腸球菌、大腸桿菌、鏈霉菌、藍(lán)藻類細(xì)菌、枯草芽孢桿菌、腦膜炎奈球菌和粘膜炎莫拉氏菌細(xì)胞；真菌，例如酵母、克魯維酵母菌、釀酒酵母、擔(dān)子菌、白色念珠菌和曲霉菌細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞，例如Drosophila S2和Spodoptera Sf9細(xì)胞；動(dòng)物細(xì)胞，例如CHO、COS、Hela、C127、3T3、BHK、293、CV-1和Bowes黑色素瘤細(xì)胞；以及植物細(xì)胞，例如裸子植物和被子植物細(xì)胞。
各種各樣的表達(dá)系統(tǒng)可以用于生產(chǎn)本發(fā)明多肽。這些載體其中包括，染色體來(lái)源的、附加體來(lái)源的和病毒來(lái)源的載體，例如來(lái)自細(xì)菌質(zhì)粒的載體，來(lái)自噬菌體的載體，來(lái)自轉(zhuǎn)座子的載體，來(lái)自酵母附加體的載體，來(lái)自插入元件的載體，來(lái)自酵母染色體元件的載體，來(lái)自例如桿狀病毒、像SV40這樣的乳多空病毒、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒、細(xì)小核糖核酸病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和甲病毒這些病毒的載體，以及來(lái)自它們組合的載體，例如那些來(lái)自質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件的載體，像是粘粒和噬菌粒。表達(dá)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)可以含有調(diào)節(jié)并引起表達(dá)的控制區(qū)域。通常，在宿主細(xì)胞中適合維持、繁殖或者表達(dá)多核苷酸和/或表達(dá)多肽的任何系統(tǒng)或者載體，都可以在這點(diǎn)上用于表達(dá)?？梢酝ㄟ^(guò)各種熟知的和常規(guī)的技術(shù)，把合適的DNA序列插入表達(dá)系統(tǒng)，例如，像是列在Sambrook，等，分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(MOLECULARCLONING，A LABORATORY MANUAL)，(上文)中的那些。
在真核細(xì)胞重組表達(dá)系統(tǒng)中，為了把翻譯的蛋白質(zhì)分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔、周質(zhì)空間或者細(xì)胞外環(huán)境中，可以將合適的分泌信號(hào)結(jié)合到表達(dá)多肽上。這些信號(hào)對(duì)于多肽可以是內(nèi)源的，或者是異源信號(hào)。
使用熟知的方法，包括硫酸氨或者乙醇沉淀、酸萃取、陰離子或者陽(yáng)離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析和凝集素層析，可以從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化本發(fā)明多肽。最優(yōu)選的是使用金屬離子親和層析(IMAC)用于純化。當(dāng)多肽在細(xì)胞內(nèi)合成、分離和或者純化過(guò)程中變性時(shí)，可以使用熟知的關(guān)于蛋白質(zhì)再折疊的技術(shù)，再生其活性構(gòu)象。
表達(dá)系統(tǒng)也可以是重組的活微生物，例如病毒或者細(xì)菌。感興趣的基因可以被插入活的重組病毒或者細(xì)菌的基因組中。接種或者體內(nèi)感染這些活的載體，可以引起抗原的體內(nèi)表達(dá)，以及誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。用于這一目的的病毒和細(xì)菌舉例來(lái)說(shuō)有痘病毒(例如牛痘，禽痘，canarypox)，甲病毒(新培斯病毒，semliki Forest病毒，VenezuelianEquine Encephalitis病毒)，腺病毒，腺相關(guān)病毒，細(xì)小核糖核酸病毒(脊髓灰質(zhì)炎病毒，鼻病毒)，皰疹病毒(水痘-帶狀皰疹病毒等)，李斯特菌屬，沙門氏菌屬，志賀氏菌屬，BCG。這些病毒和細(xì)菌可以是毒性的，或者為了得到活的疫苗而以各種方式減毒的。這些活疫苗也組成了本發(fā)明的一部分。
診斷、預(yù)后、血清型和突變分析本發(fā)明也涉及用作診斷試劑的本發(fā)明BASB119多核苷酸和多肽的用途。真核細(xì)胞中，特別是哺乳動(dòng)物中，尤其是人體中，BASB119多核苷酸和/或多肽的檢測(cè)，為疾病診斷、疾病階段的診斷或者感染生物體對(duì)于藥物的反應(yīng)，提供了診斷方法。在核酸或者氨基酸水平上，使用各種熟知的方法以及此處提供的方法，可以檢測(cè)真核細(xì)胞，特別是哺乳動(dòng)物，尤其是人體，特別是感染了或者懷疑被感染了含有BASB119基因或者蛋白質(zhì)生物體的那些人體。
可以從推定被感染的和/或已經(jīng)被感染的個(gè)體機(jī)體物質(zhì)中，獲得用于預(yù)后、診斷或者其他分析的多肽和多核苷酸。這些來(lái)源的多核苷酸，特別是DNA或者RNA，可以直接用于檢測(cè)，或者可以通過(guò)使用PCR或者其他任何分析前擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行酶促擴(kuò)增。RNA，特別是mRNA，cDNA和基因組DNA，也可以以相同的方式使用。通過(guò)生物體所選多核苷酸的基因型分析，使用擴(kuò)增，可以表示個(gè)體感染的或者固有的微生物菌種或者菌株的特征。通過(guò)與選自親緣微生物對(duì)照序列基因型的比較得到的擴(kuò)增產(chǎn)物大小的變化，可以檢測(cè)缺失與插入，親緣微生物優(yōu)選的是同一屬中不同的種，或者同一種中不同菌株。通過(guò)擴(kuò)增DNA與標(biāo)記BASB119多核苷酸序列的雜交，可以鑒定點(diǎn)突變。通過(guò)分別對(duì)DNA或者RNA使用Dnase或者Rnase消化，或者通過(guò)測(cè)定融化溫度或者復(fù)性動(dòng)力學(xué)的不同，可以區(qū)分完全或者很大程度上匹配的序列與不完全或者很大程度上不匹配的雙螺旋。通過(guò)多核苷酸片段在凝膠中，與對(duì)照序列相比電泳遷移率的變化，也可以檢測(cè)多核苷酸序列的不同。這可以使用或者不使用變性劑進(jìn)行。通過(guò)直接DNA或者RNA測(cè)序，也可以檢測(cè)多核苷酸的不同，參見(jiàn)例如，Myers等，科學(xué)(Sciences)，2301242(1985)。通過(guò)核酸酶保護(hù)分析，例如Rnase、V1和S1保護(hù)分析，或者化學(xué)剪切方法，也可以顯示特殊位置的序列改變。參見(jiàn)例如，Cotton等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，854397-4401(1985)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以構(gòu)建含有BASB119核酸序列或者其片段的一批寡居核苷酸探針，進(jìn)行有效篩選，例如，遺傳突變、血清型、分類學(xué)分類或者鑒定的篩選。陣列技術(shù)方法是熟知的，具有全面的適用性，并且可以用于各種分子遺傳學(xué)問(wèn)題，包括基因表達(dá)、遺傳連鎖和遺傳多樣性(參見(jiàn)例如，Chee等，科學(xué)(Science)，274610(1996))。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及含有以下組分的診斷試劑盒(a)本發(fā)明的多核苷酸，優(yōu)選的是SEQ ID NO1或者3的核苷酸序列，或者其片段；(b)與(a)的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；(c)本發(fā)明的多肽，優(yōu)選的是SEQ ID NO2或者4的多肽，或者其片段；(d)本發(fā)明多肽的抗體，優(yōu)選的是SEQ ID NO2或者4多肽的抗體。
要明白在任何這種試劑盒中，(a)，(b)，(c)，(d)可以含有大量成分。其中，這種試劑盒在診斷疾病或者疾病易感性中是有用的。
本發(fā)明也涉及本發(fā)明多核苷酸作為診斷試劑的用途。本發(fā)明多核苷酸的突變形式，優(yōu)選的是SEQ ID NO1或者3的突變形式，與疾病或者致病性有關(guān)，其診斷提供了一種診斷工具，該工具可以增加或者確定疾病診斷、疾病過(guò)程預(yù)后、疾病階段確定、或者疾病易感性，這是由于多核苷酸的低表達(dá)、過(guò)量表達(dá)或者變化表達(dá)引起的。在多核苷酸水平上，通過(guò)各種技術(shù)，例如此處其他部分描述的那些技術(shù)，可以檢測(cè)攜帶有這些多核苷酸突變體的微生物，特別是有感染力的微生物。
在多核苷酸或者多肽水平上，通過(guò)各種技術(shù)，例如為血清分型技術(shù)，也可以檢測(cè)攜帶有本發(fā)明多核苷酸和/或多肽突變體或者多態(tài)性(等位基因變體)的微生物細(xì)胞。例如，可以使用RT-PCR檢測(cè)RNA突變。特別優(yōu)選的是結(jié)合自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)使用RT-PCR，例如像是GeneScan這樣的。RNA，cDNA或者基因組DNA也可以用于同樣的目的，PCR。作為一個(gè)實(shí)例，可以使用編碼BASB119多肽的多核苷酸互補(bǔ)的PCR引物，鑒定和分析突變體。
本發(fā)明進(jìn)一步提供從5’和/或3’端除去1，2，3或者4個(gè)核苷酸的引物。其中，這些引物可以用于擴(kuò)增分離的BASB119 DNA和/或RNA，這些分離的核酸來(lái)自個(gè)體樣品，例如機(jī)體物質(zhì)?？梢允褂靡飻U(kuò)增從感染個(gè)體分離的多核苷酸，從而多核苷酸可以用于各種闡明多核苷酸序列的技術(shù)。按這種方法，可以檢測(cè)多核苷酸序列的突變，并且可以使用這些突變?cè)\斷和/或預(yù)后感染或者其階段或者過(guò)程或者血清型，和/或把感染病因分類。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了診斷疾病的方法，優(yōu)選的是細(xì)菌感染，更優(yōu)選的是粘膜炎莫拉氏菌造成的感染，該方法包括，從來(lái)自個(gè)體的樣品，例如來(lái)自機(jī)體物質(zhì)的樣品，確定具有SEQ ID NO1或者3序列多核苷酸提高的表達(dá)水平?？梢允褂萌魏渭夹g(shù)上熟知的多核苷酸定量方法，例如，像是擴(kuò)增、PCR、RT-PCR、Rna se保護(hù)、Northern雜交、分光法和其他雜交方法，測(cè)量BASB119多核苷酸增高的或者減少的表達(dá)。
另外，依照本發(fā)明用于檢測(cè)BASB119多肽相對(duì)于正常對(duì)照組織樣品過(guò)量表達(dá)的診斷分析，可以用于檢測(cè)，例如感染的存在。用于確定來(lái)自宿主樣品，例如來(lái)自機(jī)體物質(zhì)樣品中的BASB119多肽水平的分析技術(shù)，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。這些分析方法包括放射免疫分析、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析、Western雜交分析、抗體夾心分析、抗體檢測(cè)和ELISA分析。
本發(fā)明多核苷酸可以用作多核苷酸分析的組分，優(yōu)選的是高密度陣列或者格柵(grid)。這些高密度陣列對(duì)于診斷和預(yù)后目的特別有用。例如，使用得自或者來(lái)自機(jī)體樣品的探針，各自含有不同基因的一系列點(diǎn)，并且進(jìn)一步含有本發(fā)明一條或者多條多核苷酸，可以用于探測(cè)，例如使用雜交或者核酸擴(kuò)增，以確定特殊多核苷酸序列或者相關(guān)序列在個(gè)體中的存在。這種存在可以指示病原體的存在，特別是粘膜炎莫拉氏菌，并且在疾病或者疾病過(guò)程的診斷和/或預(yù)后中也是有用的。含有許多SEQ ID NO1或者3序列多核苷酸變體的格柵是優(yōu)選的。含有許多編碼SEQ ID NO2或者4多肽序列的多核苷酸序列變體的格柵，也是優(yōu)選的。
抗體本發(fā)明的多肽和多核苷酸或者其變體，或者表達(dá)同樣物質(zhì)的細(xì)胞，都可以用作產(chǎn)生分別對(duì)這些多肽或者多核苷酸具有免疫特異性抗體的免疫原。術(shù)語(yǔ)“免疫特異性”是指，抗體與本發(fā)明多肽的親和力，比它與已知技術(shù)中的其他相關(guān)多肽的親和力強(qiáng)很多。
在本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了抗BASB119多肽或者多核苷酸的抗體。
通過(guò)操作本發(fā)明多肽和/或多核苷酸，或者其帶有抗原決定簇的片段，其類似物，或者表達(dá)它們的細(xì)胞，使用常規(guī)技術(shù)，在動(dòng)物中，優(yōu)選的是非人類的動(dòng)物，可以得到針對(duì)本發(fā)明多肽或者多核苷酸產(chǎn)生的抗體。為了制備單克隆抗體，可以使用任何提供通過(guò)連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)產(chǎn)生抗體的本領(lǐng)域已知的技術(shù)。實(shí)例包括各種各樣的技術(shù)，例如Kohler，G.和Milstein，C.，自然(Nature) 256495-497(1975)；Kozbor等，今日免疫學(xué)(Immunology Today)472(1983)；Cole等，pg.77-96，單克隆抗體和癌癥治療(MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCERTHERAPY)，Alan R.Liss，Inc.(1985)中的那些技術(shù)。
生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(美國(guó)專利No.4,946,778)適合生產(chǎn)本發(fā)明多肽或者多核苷酸的單鏈抗體。并且，轉(zhuǎn)基因小鼠，或者其他生物體或者動(dòng)物，例如其他哺乳動(dòng)物，可以用于表達(dá)對(duì)本發(fā)明多肽或者多核苷酸免疫特異的人源抗體。
另外，也可以使用噬菌體展示技術(shù)，從為含有抗-BASB119而篩選的PCR擴(kuò)增的人體淋巴細(xì)胞v-基因庫(kù)中，或者天然文庫(kù)中，選擇具有與本發(fā)明多肽結(jié)合活性的抗體基因(McCafferty，等，(1990)，自然(Nature)348，552-554；Marks，等，(1992)生物技術(shù)(Biotechnology)10，779-783)。通過(guò)例如鏈改組也能改善這些抗體的親和性(Clackson等，(1991)自然(Nature)352628)。
上述抗體可以用于分離或者鑒定表達(dá)本發(fā)明多肽或者多核苷酸的克隆，例如通過(guò)親和層析純化多肽或者多核苷酸。
因此，在其中，可以使用抗BASB119-多肽或者BASB119-多核苷酸的抗體治療感染，特別是細(xì)菌感染。
多肽變體包括，抗原等價(jià)物變體、抗原決定簇等價(jià)物變體或者免疫等價(jià)物變體，構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)特殊方面。
優(yōu)選的，修飾抗體或者其變體，使之在個(gè)體中免疫原性更小。例如，如果個(gè)體是人體，抗體可以最優(yōu)選的被“人源化”，其中互補(bǔ)決定區(qū)或者來(lái)自雜交瘤抗體的區(qū)域已經(jīng)被移植到人體單克隆抗體中，例如描述于Jones等(1986)，自然(Nature)321，522-525或者Tempest等，(1991)生物技術(shù)(Biotechnology)9，266-273中的。
拮抗劑和激動(dòng)劑-分析和分子本發(fā)明多肽和多核苷酸可以用于估定，在例如細(xì)胞、無(wú)細(xì)胞制備物、化學(xué)庫(kù)和天然產(chǎn)物混合物中，小分子底物與配體的結(jié)合。這些底物和配體可以是天然底物和配體，或者是結(jié)構(gòu)或者功能類似物。參見(jiàn)例如，Coligan等，當(dāng)代免疫學(xué)方法(Current Protocols inImmunology) 1(2)第5章(1991)。
依靠直接或者間接與候選化合物結(jié)合的標(biāo)記，篩選方法可以簡(jiǎn)單地測(cè)定候選化合物與多肽或者多核苷酸的結(jié)合，或者與帶有多肽或者多核苷酸的細(xì)胞或者膜結(jié)合，或者與多肽的融合蛋白結(jié)合。另外，篩選方法可以包括標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)物的競(jìng)爭(zhēng)。另外，使用適合于含有多肽或者多核苷酸細(xì)胞的檢測(cè)系統(tǒng)，這些篩選方法，可以檢驗(yàn)候選化合物是否會(huì)導(dǎo)致通過(guò)激活或者抑制多肽或者多核苷酸而產(chǎn)生信號(hào)。通常在已知激動(dòng)劑存在時(shí)分析活性抑制劑，并且通過(guò)已知激動(dòng)劑的存在，觀測(cè)激動(dòng)劑對(duì)于活性的作用。在激動(dòng)劑或者抑制劑不存在的情況下，通過(guò)檢驗(yàn)候選化合物是否導(dǎo)致多肽或者多核苷酸活性的抑制，視情況而定，組成型活性多肽和/或組成型表達(dá)多肽和多核苷酸，可以用于對(duì)相反激動(dòng)劑或者抑制劑的篩選方法。另外，篩選方法可以簡(jiǎn)單地包括這些步驟在含有多肽或者多核苷酸的溶液中混合候選化合物以形成混合物，測(cè)定混合物中BASB119多肽和/或多核苷酸的活性，以及相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)，比較混合物中BASB119多肽和/或多核苷酸的活性。如此處所描述的融合蛋白，例如由Fc部分和BASB119多肽制造的那些融合蛋白，也可以用于高產(chǎn)篩選分析，該高產(chǎn)篩選分析可以鑒定本發(fā)明多肽的拮抗劑，以及系統(tǒng)發(fā)生和/或功能相關(guān)多肽的拮抗劑(參見(jiàn)D.Bennett等，分子識(shí)別雜志(J Mol Recognition)，852-58(1995)；和K.Johanson等，生物化學(xué)雜志(J Biol Chem)，270(16)9459-9471(1995))。
與本發(fā)明多肽結(jié)合和/或相互作用的多核苷酸、多肽和抗體，也可以用于配置篩選方法，該篩選方法用于檢測(cè)添加的化合物對(duì)于細(xì)胞中mRNA和/或多肽產(chǎn)生的作用。例如，可以構(gòu)建ELISA分析，使用單克隆或者多克隆抗體，通過(guò)技術(shù)上已知的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)測(cè)量多肽的分泌或者細(xì)胞結(jié)合水平。這可以用于從適合操作的細(xì)胞或者組織中，發(fā)現(xiàn)抑制或者增強(qiáng)多肽生產(chǎn)的物質(zhì)(也分別稱作拮抗劑和激動(dòng)劑)。
本發(fā)明也提供了篩選化合物的方法，特別是那些抑菌的和/或殺菌的化合物，該方法可以鑒定那些增強(qiáng)(激動(dòng)劑)或者阻滯(拮抗劑)BASB119多肽或者多核苷酸功能的化合物。篩選技術(shù)可以包括高產(chǎn)量技術(shù)。例如，為了篩選激動(dòng)劑或者拮抗劑，在可能是BASB119激動(dòng)劑或者拮抗劑的候選分子存在或者不存在地情況下，孵育含有BASB119多肽和該多肽標(biāo)記底物或者配體的合成反應(yīng)混合物、像膜這樣的細(xì)胞區(qū)室、細(xì)胞包膜或者細(xì)胞壁、或者它們的制備物。候選分子激動(dòng)或者拮抗BASB119多肽的能力，反映在標(biāo)記配體結(jié)合的減少或者從該底物產(chǎn)生產(chǎn)物產(chǎn)量的減少。義務(wù)結(jié)合的分子，即不誘導(dǎo)BASB119多肽作用的分子，最有可能是好的拮抗劑。結(jié)合好的分子，并且視情況而定，可以增加從底物產(chǎn)生產(chǎn)物的效率、增加信號(hào)傳導(dǎo)、或者增加化學(xué)通道活性的分子，是激動(dòng)劑。效率的測(cè)定，或者視情況而定，從底物產(chǎn)生產(chǎn)物的效率、信號(hào)傳導(dǎo)、或者化學(xué)通道活性的測(cè)定，都可以使用報(bào)告系統(tǒng)得以增強(qiáng)。在這點(diǎn)上有用的報(bào)告系統(tǒng)，包括但是不僅僅局限于，比色分析、轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的標(biāo)記底物、負(fù)責(zé)改變BASB119多核苷酸或者多肽活性的報(bào)告基因、以及本領(lǐng)域已知的結(jié)合分析。
BASB119激動(dòng)劑分析的另一個(gè)實(shí)例是競(jìng)爭(zhēng)分析，該分析在合適條件下，為了競(jìng)爭(zhēng)抑制分析，結(jié)合BASB119和BASB119結(jié)合分子的潛在激動(dòng)劑，重組BASB119結(jié)合分子，天然底物或者配體，或者底物或者配體的模擬物。BASB119可以使用例如放射性或者比色混合物標(biāo)記，例如可以準(zhǔn)確確定與結(jié)合分子結(jié)合的BASB119分子或者轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的BASB119分子，從而估定潛在拮抗劑的效力。
潛在拮抗劑其中包括，與本發(fā)明多核苷酸和/或多肽結(jié)合，并從而抑制或者消除其活性或者表達(dá)的有機(jī)小分子、肽、多肽和抗體。潛在拮抗劑，也可以是像是與結(jié)合分子在相同位點(diǎn)結(jié)合的緊密相關(guān)蛋白質(zhì)或者抗體這樣的有機(jī)小分子、肽、多肽和抗體，例如這樣的結(jié)合分子，該分子不誘導(dǎo)BASB119誘導(dǎo)的活性，從而通過(guò)排除BASB119多肽和/或多核苷酸的結(jié)合，阻止BASB119多肽和/或多核苷酸的功能或者表達(dá)。
潛在拮抗劑包括這樣的小分子，該小分子結(jié)合并且占據(jù)多肽的結(jié)合位點(diǎn)，從而與細(xì)胞結(jié)合分子結(jié)合，以致阻止正常生物活性。小分子的實(shí)例包括但是不僅僅局限于，有機(jī)小分子、肽和肽相似分子。其他潛在拮抗劑包括反義分子(關(guān)于這些分子的描述，參見(jiàn)Okano，神經(jīng)化學(xué)雜志(J.Neurochem.)56560(1991)；寡脫氧核苷酸作為基因表達(dá)的反義抑制劑(OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORSOF GENE EXPRESSION)，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L(1998)。優(yōu)選的潛在拮抗劑包括與BASB119相關(guān)的化合物或者BASB119變體。
另一方面，本發(fā)明涉及遺傳工程可溶性融合蛋白，該融合蛋白包含本發(fā)明多肽或者其片段，以及免疫球蛋白各亞類(IgG，IgM，IgA，IgE)重鏈或者輕鏈恒定區(qū)各個(gè)部分。優(yōu)選的免疫球蛋白是，人體IgG，特別是IgG1重鏈的穩(wěn)定部分，融合發(fā)生在鉸鏈區(qū)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以通過(guò)與剪切序列結(jié)合而簡(jiǎn)單的除去Fc部分，該剪切序列可以被凝血因子X(jué)a剪切。另外，本發(fā)明涉及通過(guò)遺傳工程制備這些融合蛋白的方法，并且涉及其藥物篩選、診斷和治療的用途。本發(fā)明的另一方面涉及編碼這種融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白技術(shù)的實(shí)例可以在國(guó)際專利申請(qǐng)Nos.WO94/29458和WO94/22914中找到。
此處提供的每條多核苷酸序列，都可以用于發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)抗菌化合物。編碼的蛋白質(zhì)，一旦表達(dá)，便可以用作篩選抗菌藥物的目標(biāo)。另外，這樣的多核苷酸可以用于構(gòu)建控制感興趣編碼序列表達(dá)的反義序列，該多核苷酸編碼被編碼蛋白質(zhì)氨基末端區(qū)域，或者核糖體結(jié)合序列(Shine-Delgarno)，或者有助于各個(gè)mRNA翻譯的序列。
本發(fā)明也提供了，本發(fā)明的多肽、多核苷酸、激動(dòng)劑或者拮抗劑在干擾病原體與真核的對(duì)感染后遺癥有責(zé)任的宿主之間初始物理相互作用中的用途，優(yōu)選的是哺乳動(dòng)物的這種宿主。特別的，本發(fā)明分子可以用于阻止細(xì)菌粘著，特別是革蘭氏陽(yáng)性和/或革蘭氏陰性細(xì)菌與真核的，優(yōu)選的是哺乳動(dòng)物的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白內(nèi)藏裝置之間，或者與傷口處的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白之間的粘著；阻止真核的，優(yōu)選的是哺乳動(dòng)物的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白與介導(dǎo)組織損傷的細(xì)菌BASB119蛋白之間的細(xì)菌粘著，和/或；通過(guò)植入內(nèi)藏裝置或者通過(guò)其他手術(shù)技術(shù)，阻止初始感染的致病原因的正常發(fā)展。
同樣依照本發(fā)明的另一方面，提供了BASB119激動(dòng)劑和拮抗劑，優(yōu)選的是抑菌的或者殺菌的激動(dòng)劑和拮抗劑。
本發(fā)明的激動(dòng)劑和拮抗劑可以用于，例如阻止、抑制和/或治療疾病。
另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明多肽的mimotope。mimotope是一段肽序列，與天然肽(在序列上或者結(jié)構(gòu)上)有充分的相似性，它能夠被識(shí)別天然肽的抗體所識(shí)別；或者當(dāng)與合適的載體結(jié)合，能夠產(chǎn)生可識(shí)別天然肽的抗體。
可以為了特殊的目的，通過(guò)添加、缺失或者替換所選擇氨基酸，可以設(shè)計(jì)肽的mimotope。因此，為了使與蛋白質(zhì)載體的結(jié)合容易，可以對(duì)肽進(jìn)行修飾。例如，對(duì)某些化學(xué)結(jié)合方法來(lái)說(shuō)，包含末端半胱氨酸是值得做的。另外，對(duì)結(jié)合到蛋白質(zhì)載體上的肽來(lái)說(shuō)，在肽的結(jié)合末端包含疏水末端也是值得做的，這樣肽游離的未結(jié)合末端保持與載體蛋白質(zhì)表面的結(jié)合。因此，肽以這樣的構(gòu)像存在，該構(gòu)像與在全部天然分子中發(fā)現(xiàn)的肽的構(gòu)像最相似。例如，可以改變肽使之具有N-末端半胱氨酸和C-末端酰胺化疏水尾部。另外，可以對(duì)一個(gè)或者多個(gè)氨基酸的D-立體異構(gòu)體形式進(jìn)行添加或者取代，從而創(chuàng)造有益的衍生物，例如增加肽的穩(wěn)定性。
另外，可以使用抗體鑒定肽的mimotope，使用像是噬菌體展示技術(shù)(EP 0 552 267 B1)這樣的技術(shù)，這些抗體自身可以與本發(fā)明多肽結(jié)合。該技術(shù)產(chǎn)生大量與天然肽結(jié)構(gòu)相似的肽序列，并且因此能夠結(jié)合抗天然肽的抗體，但是它們自身沒(méi)有必要與天然多肽共有很大程度的序列同源性。
疫苗本發(fā)明另一方面涉及在個(gè)體中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，特別是在哺乳動(dòng)物中，優(yōu)選的是在人體中，該方法包括對(duì)個(gè)體接種BASB119多核苷酸和/或多肽或者其片段或者變體，足以產(chǎn)生保護(hù)該個(gè)體免于感染的抗體和/或T細(xì)胞免疫反應(yīng)，特別是細(xì)菌感染和最特別的是粘膜炎莫拉氏菌感染。也提供了這樣的方法，由此這種免疫反應(yīng)減慢細(xì)菌的復(fù)制。而本發(fā)明的另一方面，涉及在個(gè)體中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，為了在體內(nèi)表達(dá)BASB119多核苷酸和/或多肽或者其片段或者變體，為了保護(hù)該個(gè)體免除疾病，優(yōu)選的是人體，無(wú)論該疾病是否已經(jīng)在個(gè)體中建立，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，例如產(chǎn)生抗體和/或T細(xì)胞免疫反應(yīng)，包括例如產(chǎn)細(xì)胞因子T細(xì)胞或者細(xì)胞毒性T細(xì)胞，該方法包括給這些個(gè)體遞送核酸載體、序列或者核酶，以指導(dǎo)BASB119多核苷酸和/或多肽或者其片段或者變體表達(dá)。施用這些基因的一個(gè)實(shí)例是，將其作為顆粒的包被或者其他東西，加速其進(jìn)入所需細(xì)胞。這些核酸載體可以包括DNA、RNA、核酶、修飾核酸、DNA/RNA雜交體、DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體或者RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體。
本發(fā)明的另一方面涉及免疫組合物，當(dāng)被導(dǎo)入個(gè)體，特別是人體時(shí)，該組合物能夠在其中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，在該個(gè)體中，誘導(dǎo)針對(duì)BASB119多核苷酸和/或由此編碼多肽的免疫反應(yīng)，其中該組合物包括重組BASB119多核苷酸和/或由此編碼多肽，和/或包括編碼并表達(dá)該BASB119多核苷酸、由此編碼的多肽、或者本發(fā)明的其他多肽的抗原的DNA和/或RNA。免疫反應(yīng)可以用于治療或者疾病預(yù)防，并且可以采取抗體免疫和/或細(xì)胞免疫的形式，例如由CTL或者CD4+T細(xì)胞發(fā)生的細(xì)胞免疫。
BASB119多肽或者其片段，可以與輔蛋白或者化學(xué)部分融合，這些輔蛋白或者化學(xué)部分雖然自身可以或者不可以產(chǎn)生抗體，但是能夠穩(wěn)定第一蛋白，并且產(chǎn)生具有抗原性和/或免疫原性，以及優(yōu)選的保護(hù)特性的融合或者修飾蛋白。因此融合重組蛋白，優(yōu)選的進(jìn)一步包含抗原性輔蛋白，例如來(lái)自流感嗜血桿菌的脂蛋白D，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)或者β-半乳糖苷酶，或者可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)和有助于其生產(chǎn)與純化的其他任何相關(guān)的大的輔蛋白。另外，從對(duì)接受蛋白的生物體免疫系統(tǒng)提供全身性刺激來(lái)說(shuō)，輔蛋白可以作為佐劑。輔蛋白可以結(jié)合到第一蛋白的氨基端或者羧基端。
根據(jù)本發(fā)明的疫苗的組合物中，BASB119多肽和/或多核苷酸，或者其片段，或者其mimotope，或者其變體，都可以出現(xiàn)在載體中，例如像是活的細(xì)菌載體那樣的前述活的重組載體。
BASB119多肽的非活載體也是合適的，例如細(xì)菌外膜囊泡或者“泡(bleb)”。OM泡來(lái)自革蘭氏陰性菌雙層膜外膜，并且并且被記載于許多革蘭氏陰性細(xì)菌中(Zhou，L等1998.FEM微生物學(xué)快報(bào)(FEMSMicrobiol.Lett.)163223-228)，包括C.trachomatis和C.psittaci。被報(bào)道可以產(chǎn)生泡的細(xì)菌病原體的一份不詳盡清單也包括百日咳博德特氏桿菌，布氏疏螺旋體，馬爾他布魯氏菌，綿羊布魯氏菌，大腸埃希氏桿菌，流感嗜血桿菌，侵肺軍團(tuán)菌，粘膜炎莫拉氏菌，淋病奈瑟氏球菌，腦膜炎奈瑟氏球菌，銅綠假單胞菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌。
泡具有可以提供天然構(gòu)像外膜蛋白的優(yōu)勢(shì)，因此對(duì)于生產(chǎn)疫苗特別有用。通過(guò)工程改造細(xì)菌，從而改變一種或者多種外膜分子的表達(dá)，泡也可以經(jīng)改進(jìn)而用作疫苗用途。因此，可以引導(dǎo)或者上調(diào)(例如，通過(guò)改變啟動(dòng)子)，例如所需免疫原性蛋白在外膜的表達(dá)，例如BASB119多肽。另外，也可以下調(diào)不相關(guān)(例如，非保護(hù)性抗原，或者免疫顯性但是易變的蛋白質(zhì))或者有害的(例如，毒性分子，像是LPS，或者自身免疫反應(yīng)的潛在誘導(dǎo)物)外膜蛋白的表達(dá)。這些方法在下面有更詳細(xì)的討論。
BASB119基因兩側(cè)非編碼區(qū)域，含有對(duì)于基因表達(dá)重要的調(diào)節(jié)元件。這種調(diào)節(jié)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上。在基因可讀框的上游或者下游的這些區(qū)域的序列，可以通過(guò)DNA測(cè)序得到。這些序列信息允許確定潛在的調(diào)節(jié)基元，例如不同的啟動(dòng)子元件、終止子序列、誘導(dǎo)序列元件、阻抑物、負(fù)責(zé)相轉(zhuǎn)變的元件、核糖體結(jié)合序列、具有潛在二級(jí)結(jié)構(gòu)的參與調(diào)節(jié)的區(qū)域，以及其他類型的調(diào)節(jié)基元或者序列。該序列是本發(fā)明的另一個(gè)方面。
這些序列信息允許調(diào)節(jié)BASB119基因的天然表達(dá)。通過(guò)改變啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合序列、潛在的阻抑物或者操作元件、或者其他相關(guān)元件，可以實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的正調(diào)節(jié)。同樣的，通過(guò)相似類型的調(diào)節(jié)，可以實(shí)現(xiàn)表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)。另外，通過(guò)改變相改變序列，可以把基因的表達(dá)置于相改變的控制之下，或者將其與該調(diào)節(jié)分開(kāi)。在另一種方法中，基因表達(dá)可被置于一個(gè)或者多個(gè)調(diào)節(jié)表達(dá)的誘導(dǎo)元件的控制之下。這種調(diào)節(jié)的實(shí)例包括，但是不僅僅局限于，通過(guò)溫度變化調(diào)節(jié)，添加與所選糖類或者其衍生物相似的誘導(dǎo)底物，微量元素、維生素、輔因子、金屬離子，等等。
上述這些調(diào)節(jié)，可以通過(guò)幾種不同的方法引入。參與基因表達(dá)的序列調(diào)節(jié)，可以通過(guò)隨機(jī)突變，及隨后篩選所需的表型，而在體內(nèi)進(jìn)行。另一種方法包括，分離感興趣的區(qū)域，通過(guò)隨機(jī)修飾或者定點(diǎn)替換、插入或者缺失突變，對(duì)該區(qū)域進(jìn)行修飾。然后，通過(guò)同源重組可以把調(diào)節(jié)區(qū)域再次導(dǎo)入細(xì)菌基因組，并且可以估計(jì)它對(duì)基因表達(dá)的作用。在另一種方法中，可以使用感興趣區(qū)域的序列知識(shí)，替換或者缺失全部或者部分天然調(diào)節(jié)序列。在這種情況下，為了從其他基因，來(lái)自不同基因的調(diào)節(jié)元件組合，合成調(diào)節(jié)區(qū)域，或者任何其他調(diào)節(jié)區(qū)域，獲得調(diào)節(jié)元件，或者為了缺失野生型調(diào)節(jié)序列的所選部分，需要分離并修飾目標(biāo)調(diào)節(jié)區(qū)域。這些經(jīng)修飾的序列，通過(guò)同源重組可以被再次導(dǎo)入細(xì)菌基因組?？捎糜诨虮磉_(dá)正調(diào)節(jié)的優(yōu)選啟動(dòng)子的一份不詳盡清單包括，來(lái)自淋病奈瑟氏球菌(N.meningitidis)或者腦膜炎奈瑟氏球菌(N.gonorroheae)的啟動(dòng)子porA，porB，lbpB，tbpB，p110，lst，hpuAB；來(lái)自粘膜炎莫拉氏菌(M.Catarrhalis)的啟動(dòng)子ompCD，copB，lbpB，ompE，UspA1；UspA2；TbpB；來(lái)自流感嗜血桿菌的啟動(dòng)子p1，p2，p4，p5，p6，lpD，tbpB，D15，Hia，Hmw1，Hmw2。
在一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)將其啟動(dòng)子與一個(gè)更強(qiáng)的啟動(dòng)子進(jìn)行交換(通過(guò)分離基因的上游序列，對(duì)該序列進(jìn)行體外修飾，并通過(guò)同源重組將其再次導(dǎo)入基因組)，可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)。在細(xì)菌中，以及在從細(xì)菌脫落(或者制得)的外膜囊泡中，都可以獲得上調(diào)的表達(dá)。
在另一個(gè)實(shí)施例中，所述方法可以用于產(chǎn)生重組細(xì)菌菌株，該菌株可以增強(qiáng)疫苗應(yīng)用的特性。這些菌株可以是，但是不僅僅局限于，減毒菌株，增加表達(dá)所選抗原的菌株，敲除(或者減少表達(dá))干擾免疫反應(yīng)基因的菌株，可以調(diào)節(jié)免疫優(yōu)勢(shì)蛋白質(zhì)表達(dá)的菌株，可以調(diào)節(jié)外膜囊泡脫落的菌株。
因此，本發(fā)明也提供了BASB119基因的一段經(jīng)修飾上游區(qū)域，該經(jīng)修飾上游區(qū)域含有可以改變位于外膜的BASB119蛋白表達(dá)水平的異源調(diào)節(jié)元件。根據(jù)本發(fā)明的這一方面，上游區(qū)域包括BASB119基因的上游序列。上游區(qū)域起始于BASB119基因的上游，通常延續(xù)到基因ATG起始密碼子上游小于大約1000bp處。在基因位于多順?lè)醋有蛄?操縱子)中的情況下，上游區(qū)域可以直接起始于感興趣基因之前，或者操縱子中第一個(gè)基因之前。優(yōu)選的，根據(jù)本發(fā)明的這一方面，經(jīng)修飾的上游區(qū)域包含位于ATG上游500至700bp之間的異源啟動(dòng)子。
因此，本發(fā)明提供了在經(jīng)修飾細(xì)菌泡中的BASB119多肽。本發(fā)明進(jìn)一步提供了經(jīng)修飾的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞能夠產(chǎn)生基于非活性膜的泡載體。本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有BASB119基因的核酸載體，該BASB119基因具有含有異源調(diào)節(jié)元件的經(jīng)修飾上游區(qū)域。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了，根據(jù)本發(fā)明制備宿主細(xì)胞和細(xì)菌泡的方法。
本發(fā)明也提供了組合物，特別是疫苗組合物，以及包括本發(fā)明多肽和/或多核苷酸和免疫刺激DNA序列的方法，例如那些描述在Sato，Y等，科學(xué)(Science)273352(1996)中的方法。
本發(fā)明也提供了，在粘膜炎莫拉氏菌感染的動(dòng)物模型中，遺傳免疫試驗(yàn)所使用的多核苷酸構(gòu)建中，使用所述多核苷酸或者其特殊片段的方法，這些多核苷酸或者其特殊片段編碼細(xì)菌細(xì)胞表面蛋白的非變化區(qū)域。這些試驗(yàn)，用于鑒定能夠激發(fā)預(yù)后或者治療免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)抗原決定簇特別有效。為了開(kāi)發(fā)用于哺乳動(dòng)物，特別是人體中，細(xì)菌感染的預(yù)后試劑或者治療療法，特別是粘膜炎莫拉氏菌感染，該方法被認(rèn)為，為隨后有特殊價(jià)值的單克隆抗體作了準(zhǔn)備，該單克隆抗體來(lái)自成功抵抗或者清除感染的動(dòng)物的必需器官。
本發(fā)明也包括疫苗制劑，該制劑包含結(jié)合合適載體的本發(fā)明的免疫原性重組多肽和/或多核苷酸，合適載體例如藥學(xué)可接受載體。因?yàn)槎嚯暮投嗪塑账嵩谖钢锌梢越到?，所以它們?yōu)選的進(jìn)行非腸道用藥，包括例如，皮下、肌肉、靜脈或者皮內(nèi)用藥。適合非腸道用藥的制劑包括，消毒的含水或者不含水注射溶液，這些溶液可以含有抗氧化劑、緩沖液、抑菌化合物和溶質(zhì)，其中溶質(zhì)使制劑與個(gè)體的體液等滲，優(yōu)選的是血液；消毒的含水質(zhì)或者不含水的懸浮液，該懸浮液可以包括懸浮劑或者增稠劑。制劑可以是單劑量或者多劑量的包裝，例如，密封的安瓿和小瓶，并且可以在凍干的條件下儲(chǔ)存，只需在使用前加入消毒的液體載體。
本發(fā)明的疫苗制劑也包括用于增強(qiáng)制劑免疫原性的佐劑系統(tǒng)。優(yōu)選的佐劑系統(tǒng)優(yōu)先激發(fā)TH1型反應(yīng)。
免疫反應(yīng)可以概括的劃分為兩個(gè)極端種類，即體液或者細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(其傳統(tǒng)特征分別是保護(hù)機(jī)制的抗體效應(yīng)物和細(xì)胞效應(yīng)物)。應(yīng)答的這些種類分別稱作TH1-型應(yīng)答(細(xì)胞介導(dǎo)應(yīng)答)和TH2-型免疫應(yīng)答(體液應(yīng)答)。
極端TH1-型免疫應(yīng)答的特征是，產(chǎn)生抗原特異的單元型限制的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，以及天然殺傷細(xì)胞應(yīng)答。鼠的TH1-型應(yīng)答的特征通常是，產(chǎn)生IgG2a亞型抗體，相應(yīng)于人體中的IgG1型抗體。TH2-型免疫應(yīng)答的特征是，產(chǎn)生大范圍的免疫球蛋白同種型，包括鼠中的IgG1、IgA和IgM。
發(fā)展這兩種類型免疫應(yīng)答背后的驅(qū)動(dòng)力，可以認(rèn)為是細(xì)胞因子。高水平的TH1-型細(xì)胞因子，傾向于促成針對(duì)所給抗原的細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)，而高水平的TH1-型細(xì)胞因子，傾向于促成針對(duì)所給抗原的體液免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。
TH1和TH2-型免疫應(yīng)答的劃分不是絕對(duì)的。實(shí)際中，個(gè)體忍受的免疫應(yīng)答可以被描述為TH1占優(yōu)勢(shì)或者TH2占優(yōu)勢(shì)。然而，按照Mosmann和Coffman描述的鼠CD4+ev T細(xì)胞克隆(Mosmann，T.R.和Coffman，R.L.(1989)，TH1和TH2細(xì)胞導(dǎo)致不同功能性質(zhì)的細(xì)胞因子分泌的不同模式(TH1 and TH2 cellsdifferent patternsof lymphokine secretion lead to different functionalproperties.)，免疫學(xué)綜述年報(bào)(Annual Review of Immunology)，7，p145-173)考慮細(xì)胞因子家族，常常是很合適的。慣例的，TH1-型應(yīng)答是與T-淋巴細(xì)胞產(chǎn)生INF-γ和IL-2聯(lián)系在一起的。其他經(jīng)常與TH1-型免疫應(yīng)答誘導(dǎo)直接相關(guān)的細(xì)胞因子，不是T-細(xì)胞產(chǎn)生的，例如IL-12。相反的，TH2-型應(yīng)答與IL-4，IL-5，IL-6和IL-13的分泌是相關(guān)的。
已知某些疫苗佐劑特別適合于刺激TH1或者TH2-型細(xì)胞因子應(yīng)答。接種疫苗或者感染之后，免疫應(yīng)答TH1∶TH2平衡傳統(tǒng)的最好指標(biāo)包括，用抗原重復(fù)刺激之后，體外直接測(cè)定T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的TH1或者TH2細(xì)胞因子，和/或測(cè)定抗原特異的抗體應(yīng)答的IgG1∶IgG2a比率。
因此，TH1-型佐劑是這樣的佐劑，它在體外用抗原重復(fù)刺激時(shí)，優(yōu)先刺激分離的T-細(xì)胞群體產(chǎn)生高水平的TH1-型細(xì)胞因子，并且促進(jìn)CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的發(fā)育和與TH1-型同種型相關(guān)的抗原特異性免疫球蛋白應(yīng)答的發(fā)展。
能夠優(yōu)先刺激TH1細(xì)胞應(yīng)答的佐劑，描述于國(guó)際專利申請(qǐng)No.WO94/00153和WO 95/17209。
3去氧-酰化單磷酰脂A(3D-MPL)是一種這樣的佐劑。這是從GB2220211(Ribi)已知的?；瘜W(xué)上，它是具有4，5或者6酰化鏈的3去氧-?；瘑瘟柞Ｖ珹的混合物，Rib Immunochem.Mantana制造。3去氧-酰化單磷酰脂A的優(yōu)選形式公布于歐洲專利0 689 454 B1(SmithKline Beecham Biologicals SA)。
優(yōu)選的，3D-MPL顆粒是足夠小的，小到可以通過(guò)0.22微米膜除菌(歐洲專利0 689 454)。3D-MPL以每劑量10μg-100μg的范圍優(yōu)選25-50μg出現(xiàn)，其中抗原典型的是出現(xiàn)在每劑量2-50μg范圍。
另一種優(yōu)選的佐劑包含QS21，來(lái)自Quillaja Saponaria Molina樹(shù)皮的一種Hplc純化的無(wú)毒部分?？梢赃x擇將其與3去氧-酰化單磷酰脂A(3D-MPL)混合，也可以選擇連同載體一起使用。
生產(chǎn)QS21的方法公開(kāi)于美國(guó)專利No.5,057,540。
含有QS21的無(wú)反應(yīng)原性佐劑配方，在前面有描述(WO 96/33739)。含有QS21和膽固醇的該配方，當(dāng)與抗原一起配制時(shí)，表明是成功的TH1刺激佐劑。
優(yōu)先刺激TH1細(xì)胞應(yīng)答的其他佐劑，包括免疫調(diào)節(jié)寡聚核苷酸，例如在WO 96/02555中公開(kāi)的未甲基化CpG序列。
也涉及不同TH1刺激佐劑的組合，例如那些在上文提到的，提供TH1細(xì)胞應(yīng)答優(yōu)先刺激劑的佐劑。例如，QS21可以與3D-MPL一起配制。QS21∶3D-MPL的比率，典型的是在1∶10和10∶1之間，優(yōu)選的是在1∶5和5∶1之間，經(jīng)常基本上是1∶1。最佳增效作用的優(yōu)選范圍是3D-MPL∶QS21是2.5∶1至1∶1。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物中也存在載體。載體可以是水包油乳狀液，或者鋁鹽，例如磷酸鋁或者氫氧化鋁。
優(yōu)選的水包油乳狀液包含可以代謝的油，例如角鯊烯、α生育酚和Tween 80。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)特別優(yōu)選的方面，疫苗組成中的抗原，結(jié)合了在該乳狀液中的QS21和3D-MPL。另外，水包油乳狀液可以含有span 85和/或卵磷脂和/或辛酸甘油脂。
對(duì)于人體來(lái)說(shuō)，在疫苗中存在的QS21和3D-MPL典型地是，每劑量在1μg-200μg范圍內(nèi)，例如10-100μg，優(yōu)選的是在10μg-50μg。典型的水包油含有2-10％的角鯊烯，2-10％的α生育酚，以及0.3-3％的tween 80。優(yōu)選的角鯊烯α生育酚比率是等于或者小于1，這便提供了更穩(wěn)定的乳狀液。Span 85可以出現(xiàn)在1％的水平上。有些情況下，本發(fā)明疫苗進(jìn)一步含有穩(wěn)定劑是有利的。
無(wú)毒的水包油乳狀劑，優(yōu)選的在水質(zhì)載體中，含有無(wú)毒的油，例如角鯊?fù)榛蛘啧徬榛瘎?，例如Tween 80。水質(zhì)載體可以是，例如磷酸緩沖鹽水。
一種特別有效的佐劑配方，在水包油乳狀液中含有QS21、3D-MPL和生育酚，描述于WO 95/17210。
本發(fā)明也提供多價(jià)疫苗組合物，它含有本發(fā)明疫苗配方與其他抗原的組合，特別是用于治療癌癥、自身免疫疾病和相關(guān)疾病的抗原。這種多價(jià)疫苗組合物可以包括如在上文中描述的TH-1誘導(dǎo)佐劑。
本發(fā)明被描述為是關(guān)于某些BASB119多肽和多核苷酸的，可以理解為這覆蓋了天然存在的多肽和多核苷酸片段，以及經(jīng)過(guò)添加、缺失和替換，但是基本上沒(méi)有影響重組多肽或者多核苷酸免疫原性的相似多肽和多核苷酸。
組合物、試劑盒和用藥本發(fā)明的另一方面提供了，包含給單細(xì)胞或者多細(xì)胞生物體用藥的BASB119多核苷酸和/或BASB119多肽的組合物。
本發(fā)明也涉及含有此處討論的多核苷酸和/或多肽或者它們的激動(dòng)劑或者拮抗劑的組合物。本發(fā)明的多肽和多核苷酸可以與用于細(xì)胞、組織或者生物體的未消毒或者消毒的載體結(jié)合使用，例如適用于個(gè)體給藥的合適配藥載體。這些組成含有，例如，介質(zhì)添加劑或者有效治療劑量的本發(fā)明多肽和/或多核苷酸，以及藥物可接受載體或者賦形劑。這些載體包括，但是不僅僅局限于，鹽水、緩沖鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇以及它們的組合。制劑應(yīng)該適合用藥方式。本發(fā)明進(jìn)一步涉及診斷的和藥物的包和試劑盒，這種包和試劑盒，包含一個(gè)或者多個(gè)裝有一種或者多種本發(fā)明前述組合物中成分的容器。
本發(fā)明的多肽、多核苷酸和其他化合物，可以單獨(dú)使用或者與其他化合物結(jié)合使用，例如治療化合物。
可以以任何有效方便的方式對(duì)藥物組合物進(jìn)行用藥，這些方式在其中包括，例如，局部的、口服的、肛門的、陰道的、靜脈內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、肌肉的、皮下的、鼻內(nèi)的或者真皮下的給藥途徑。
在治療中或者作為預(yù)防藥，活性藥劑可以作為可注射組合物給個(gè)體用藥，例如作為消毒的水分散劑，優(yōu)選的是等滲的。
另一方面，本發(fā)明提供了這樣的藥物組合物，該藥物組合物包含治療有效劑量多肽和/或多核苷酸，例如本發(fā)明多肽和/或多核苷酸的可溶性形式，激動(dòng)劑或者拮抗劑肽或者小分子化合物，并且結(jié)合藥物可接受載體或者賦形劑。這些載體包括，但是不僅僅局限于，鹽水、緩沖鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇以及它們的組合。本發(fā)明進(jìn)一步涉及診斷的和藥物的包和試劑盒，這種包和試劑盒，包含一個(gè)或者多個(gè)裝有一種或者多種本發(fā)明前述組合物中成分的包裝。本發(fā)明的多肽、多核苷酸和其他化合物，可以單獨(dú)使用或者與其他化合物結(jié)合使用，例如治療化合物。
組合物要適合給藥途徑，例如全身或者口服途徑。全身給藥的優(yōu)選方式包括注射，典型的是靜脈注射。也可以使用其他注射途徑，例如皮下的、肌肉的或者腹膜內(nèi)的。全身用藥的其他方式，包括使用滲透劑的粘膜滲透和皮膚滲透用藥，滲透劑例如膽鹽或者梭鏈孢酸或者其他去垢劑。另外，如果本發(fā)明的多肽或者其他化合物可以用于腸道或者膠囊配方，那么口服用藥也是可以的。這些化合物的用藥也可以是局部的，以藥膏、軟膏、凝膠、溶液、粉末以及其他類似的形式。
給哺乳動(dòng)物，特別是人體用藥，活性藥劑的每日劑量水平預(yù)期是0.01mg/kg至10mg/kg，典型的大約是1mg/kg。無(wú)論如何，應(yīng)該由醫(yī)生來(lái)確定實(shí)際劑量，該劑量最適合于個(gè)體并且隨年齡、體重和特殊個(gè)體的反應(yīng)而變化。上述劑量是一般情況的實(shí)例。當(dāng)然，也存在適合更高或者更低劑量范圍的個(gè)體情況，這些也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
所需的劑量范圍依賴于多肽的選擇、用藥途徑、配方性質(zhì)、受治療者條件的性質(zhì)，以及主治醫(yī)師的判斷。然而，合適劑量在0.1-100μg/kg受治療者的范圍內(nèi)。
疫苗組合物常規(guī)是以可注射形式存在的。常規(guī)佐劑可以用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)。疫苗合適的劑量單位是0.5-5微克/kg抗原，該劑量?jī)?yōu)選的是服用1-3次，并間隔1-3周。在所指出的劑量范圍內(nèi)，不會(huì)觀測(cè)到本發(fā)明化合物有害的毒性作用，這些有害的毒性作用會(huì)妨礙對(duì)合適個(gè)體的用藥。
然而，由于所用到的各種化合物以及各種用藥途徑的不同效能，可以預(yù)期所需劑量可以有很大的變化。例如，可以預(yù)期口服用藥比靜脈注射用藥需要更高的劑量?？梢允褂米顑?yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)驗(yàn)程序，調(diào)節(jié)這些劑量水平的變化，這在技術(shù)上是可以理解的。
序列數(shù)據(jù)庫(kù)，有形介質(zhì)中的序列，以及運(yùn)算法則多核苷酸和多肽序列，可以構(gòu)成有價(jià)值的信息資源，用該資源可以確定它們的2-維和3-維結(jié)構(gòu)，并且可以進(jìn)一步鑒定類似同源物的序列。通過(guò)把這些序列儲(chǔ)存在計(jì)算機(jī)可讀的介質(zhì)中，然后在已知的大分子結(jié)構(gòu)程序中使用這些已儲(chǔ)存的數(shù)據(jù)，或者使用熟知的搜索工具搜索序列數(shù)據(jù)庫(kù)，例如GCG程序包，可以使這些方法更容易。
本發(fā)明也提供了序列或者鏈性質(zhì)分析的方法，特別是對(duì)遺傳序列或者編碼蛋白質(zhì)的序列。序列分析優(yōu)選的方法包括，例如，序列同源分析方法，像是鑒定分析和相似性分析，DNA、RNA和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，序列匯編，生物分類學(xué)分析，序列基元分析，可讀框確定，核酸堿基calling，密碼子使用分析，核酸堿基修整，以及測(cè)序色譜峰分析。
提供了一種基于計(jì)算機(jī)的方法進(jìn)行同源性鑒定。該方法包含以下步驟在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)中提供含有本發(fā)明多核苷酸序列的第一多核苷酸序列；將該第一多核苷酸序列，與至少一條用于鑒定同源性的第二多核苷酸或者多肽序列進(jìn)行比較。
也提供了一種基于計(jì)算機(jī)的方法進(jìn)行同源性鑒定，該方法包括以下步驟在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)中提供含有本發(fā)明多肽序列的第一多肽序列；將該第一多肽序列，與至少一條用于鑒定同源性的第二多核苷酸或者多肽序列進(jìn)行比較。
本書面描述中所引用的所有的出版物和參考文獻(xiàn)，包括但是不僅僅局限于專利和專利申請(qǐng)，在此處通過(guò)引用全部結(jié)合在一起，這如同每一種出版物或者參考文獻(xiàn)，在此處作為完全公開(kāi)，都明確并且單獨(dú)的被指出是通過(guò)引用而被結(jié)合的。任何本申請(qǐng)聲明對(duì)其有優(yōu)先權(quán)的專利申請(qǐng)，也用以上所述對(duì)出版物和參考文獻(xiàn)的方式，通過(guò)引用被完全地結(jié)合于此。
定義“同一性”，如本領(lǐng)域公知的，是指兩條或者多條多肽序列之間或者兩條或者多條多核苷酸序列之間的關(guān)系，視情況而定，可以通過(guò)序列比較測(cè)定。在技術(shù)上，“同一性”也指多肽或者多核苷酸序列之間序列相關(guān)性的程度，視情況而定，可以由這些序列鏈之間的匹配測(cè)定?！巴恍浴笨梢酝ㄟ^(guò)已知方法容易的計(jì)算，包括但是不僅僅局限于，描述于Computational MolecularBiology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；BiocomputingInformatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heine，G.，Academic Press，1987；and Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991；and Carillo，H.，and Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，481073(1988)中的那些方法。設(shè)計(jì)測(cè)定同一性的方法，以便給出被測(cè)試序列之間最大的匹配。另外，測(cè)定同一性的方法編碼于公開(kāi)提供的計(jì)算機(jī)程序中。測(cè)定兩條序列之間同一性的計(jì)算機(jī)程序方法，包括，但是不僅僅局限于，GCG程序包中的GAP程序(Devereux，J.，等，核酸研究(Nucleic Acids Reseach)12(1)387(1984))，BLASTP，BLASTN(Altschul，S.F.等，分子生物學(xué)雜志(J.Molec.Biol.)215403-410(1990))，以及FASTA(Pearson和Lipman，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85；2444-2448(1988))。BLAST程序家族，由NCBI和其他來(lái)源公開(kāi)提供(BLAST Manual，Altschul，S.，等，NCBI NLM NIH Bethesda，MD 20894；Altschul，S.，等，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)215403-410(1990))。熟知的Smith Waterman運(yùn)算法則也可以用于測(cè)定同一性。
多肽序列比較的參數(shù)包括以下這些運(yùn)算法則Needleman和Wunsch，分子生物學(xué)雜志(J.MolBiol.)48443-453(1970)比較介質(zhì)Henikoff和Henikoff的BLOSSUM62美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)8910915-10919(1992)空位處罰8空位長(zhǎng)度處罰2一個(gè)使用這些參數(shù)的有用程序，由Genetics Computer Group，Madison WI作為“gap”程序公開(kāi)提供。上述參數(shù)是肽序列比較的缺省參數(shù)(連同末端空位沒(méi)有處罰)。
多核苷酸序列比較的參數(shù)包括以下這些運(yùn)算法則Needleman和Wunsch，分子生物學(xué)雜志(J.MolBiol.)48443-453(1970)比較介質(zhì)匹配＝+10，不匹配＝0空位處罰50空位長(zhǎng)度處罰3提供來(lái)自Genetics Computer Group，Madison WI的“gap”程序。這些是核酸序列比較的缺省參數(shù)。
多核苷酸和多肽“同一性”的優(yōu)選含義，視情況而定，在以下(1)和(2)中提供。
(1)多核苷酸實(shí)施方案，進(jìn)一步包括包含這樣多核苷酸序列的分離的多核苷酸，該多核苷酸序列與SEQ ID NO1或者3對(duì)照序列有至少50，60，70，80，85，90，95，97或者100％的同一性，其中該多核苷酸序列可以與SEQ ID NO1或者3對(duì)照序列一致，或者與對(duì)照序列比較，包括某一特定整數(shù)數(shù)目的核苷酸改變，其中這種改變選自至少一個(gè)核苷酸缺失、替換，包括轉(zhuǎn)變和顛換，或者插入，而且其中這種改變可以發(fā)生在對(duì)照核苷酸序列的5’或者3’末端位置，或者末端位置間的任何位置，或者單獨(dú)散布在對(duì)照序列核苷酸之間，或者以一個(gè)或者多個(gè)連續(xù)基團(tuán)散布于對(duì)照序列中，并且這樣確定該核苷酸改變的數(shù)目，即用SEQ ID NO1或者3中總核苷酸數(shù)，乘以定義百分同一性的整數(shù)除以100，然后從SEQ ID NO1或者3總核苷酸數(shù)中減去該乘積，或者nn≤xn-(xn·y)其中nn是核苷酸改變的數(shù)目，xn是SEQ ID NO1或者3中總核苷酸數(shù)，y對(duì)于50％是0.50，對(duì)于60％是0.60，對(duì)于70％是0.70，對(duì)于80％是0.80，對(duì)于85％是0.85，對(duì)于90％是0.90，對(duì)于95％是0.95，對(duì)于97％是0.97，對(duì)于100％是1.00，·是乘法算子的符號(hào)，其中xn和y的任何非整數(shù)乘積，在將其從xn中減去之前，按去尾法變?yōu)檎麛?shù)。編碼SEQID NO2或者4多肽的多核苷酸序列的改變，可以產(chǎn)生該編碼序列中的無(wú)義、錯(cuò)義或者閱讀框架漂移突變，并從而改變已發(fā)生這些改變的多核苷酸編碼的多肽。
通過(guò)實(shí)施例的方式，本發(fā)明多核苷酸序列，可以與SEQ ID NO1或者3對(duì)照序列一致，即可以是100％的一致，或者與對(duì)照序列相比較，包括某一特定整數(shù)數(shù)目的核苷酸改變，從而百分比同一性小于100％同一性。這種改變選自至少一個(gè)核苷酸缺失、替換，包括轉(zhuǎn)變和顛換，或者插入，而且其中這種改變可以發(fā)生在對(duì)照多核苷酸序列的5’或者3’末端位置，或者末端位置間的任何位置，或者單獨(dú)散布在對(duì)照序列核酸之間，或者以一個(gè)或者多個(gè)連續(xù)基團(tuán)散布于對(duì)照序列中。給定百分同一性的核酸改變的數(shù)目，由下列方法確定，即用SEQ ID NO1或者3中總核苷酸數(shù)，乘以定義百分同一性的整數(shù)除以100，然后從SEQ IDNO1或者3總核苷酸數(shù)中減去該乘積，或者nn≤xn-(xn·y)其中nn是核苷酸改變的數(shù)目，xn是SEQ ID NO1或者3中總核苷酸數(shù)，y是，例如對(duì)于70％是0.70，對(duì)于80％是0.80，對(duì)于85％是0.85等等，是乘法算子的符號(hào)，其中xn和y的任何非整數(shù)乘積，在將其從xn中減去之前，按去尾法變?yōu)檎麛?shù)。
(2)多肽實(shí)施方案，進(jìn)一步包括包含這樣多肽的分離的多肽，該多肽序列與SEQ ID NO2或者4對(duì)照多肽序列有至少50，60，70，80，85，90，95，97或者100％的同一性，其中該多肽序列可以與SEQID NO2或者4對(duì)照序列一致，或者與對(duì)照序列比較，包括某一特定整數(shù)數(shù)目的氨基酸改變，其中這種改變選自至少一個(gè)氨基酸缺失、替換，包括保守和非保守替換，或者插入，而且其中這種改變可以發(fā)生在對(duì)照多肽序列的氨基-或者羧基-末端位置，或者末端位置間的任何位置，或者單獨(dú)散布在對(duì)照序列氨基酸之間，或者以一個(gè)或者多個(gè)連續(xù)基團(tuán)散布于對(duì)照序列中，并且這樣確定該氨基酸改變的數(shù)目，即用SEQ ID NO2或者4中總氨基酸數(shù)，乘以定義百分同一性的整數(shù)除以100，然后從SEQ ID NO2或者4總氨基酸數(shù)中減去該乘積，或者na≤xa-(xa·y)其中na是氨基酸改變的數(shù)目，xa是SEQ ID NO2或者4中總氨基酸數(shù)，y對(duì)于50％是0.50，對(duì)于60％是0.60，對(duì)于70％是0.70，對(duì)于80％是0.80，對(duì)于85％是0.85，對(duì)于90％是0.90，對(duì)于95％是0.95，對(duì)于97％是0.97，對(duì)于100％是1.00，·是乘法算子的符號(hào)，其中xa和y的任何非整數(shù)乘積，在將其從xa中減去之前，按去尾法變?yōu)檎麛?shù)。
通過(guò)實(shí)施例的方式，本發(fā)明多肽序列，可以與SEQ ID NO2或者4對(duì)照序列一致，即可以是100％的一致，或者與對(duì)照序列相比較，包括某一特定整數(shù)數(shù)目的氨基酸改變，從而百分比同一性小于100％同一性。這種改變選自至少一個(gè)氨基酸缺失、替換，包括保守和非保守替換，或者插入，而且其中這種改變可以發(fā)生在對(duì)照多肽序列的氨基-或者羧基-末端位置，或者末端位置間的任何位置，或者單獨(dú)散布在對(duì)照序列氨基酸之間，或者以一個(gè)或者多個(gè)連續(xù)基團(tuán)散布于對(duì)照序列中。給定％同一性的氨基酸改變的數(shù)目，由下列方法確定，即用SEQ ID NO2或者4中總氨基酸數(shù)，乘以定義百分同一性的整數(shù)除以100，然后從SEQ ID NO2或者4總氨基酸數(shù)中減去該乘積，或者na≤xa-(xa·y)其中na是氨基酸改變的數(shù)目，xa是SEQ ID NO2或者4中總氨基酸數(shù)，y是，例如對(duì)于70％是0.70，對(duì)于80％是0.80，對(duì)于85％是0.85等等，是乘法算子的符號(hào)，其中xa和y的任何非整數(shù)乘積，在將其從xa中減去之前，按去尾法變?yōu)檎麛?shù)。
“個(gè)體”，當(dāng)用在此處關(guān)于生物體時(shí)，是指多細(xì)胞真核生物，包括但是不僅僅局限于，后生動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、ovid、牛、猿、靈長(zhǎng)類和人。
“分離的”是指“經(jīng)過(guò)人手”使之從其天然狀態(tài)改變，即，如果它存在于自然狀態(tài)，將它從其原始環(huán)境中改變或者移動(dòng)，或者既改變也移動(dòng)。例如，如該術(shù)語(yǔ)此處所用的，天然存在于活的生物體中的多核苷酸或者多肽不是“分離的”，但是從其天然狀態(tài)共存物質(zhì)中分離出的同樣的多核苷酸或者多肽就是“分離的”。另外，通過(guò)轉(zhuǎn)化、遺傳操作或者其他任何重組方法，引入生物體的多核苷酸或者多肽是“分離的”，即便它仍然存在于該生物體中，該生物體可以是活的或者死的。
“多核苷酸”通常是指任何多核糖核苷酸或者多脫氧核糖核苷酸，可以是未修飾的RNA或者DNA，或者修飾的RNA或者DNA，包括單鏈和雙鏈區(qū)域。
“變體”是指不同于對(duì)照多核苷酸或者多肽，但是保留基本性質(zhì)的多核苷酸或者多肽。多核苷酸的典型變體，其核苷酸序列不同于別的對(duì)照多核苷酸。變體核苷酸序列的改變，可以或者可以不改變對(duì)照多核苷酸編碼多肽的氨基酸序列。如下所述，核苷酸改變，可以導(dǎo)致對(duì)照序列所編碼多肽的氨基酸替換、添加、缺失、融合和截短。多肽的典型變體，其氨基酸序列不同于別的對(duì)照多肽。通常，不同是有限的，從而使得對(duì)照多肽序列和變體，總的來(lái)說(shuō)非常類似，并且在許多區(qū)域是一致的。變體可以在氨基酸序列上，通過(guò)一個(gè)或者多個(gè)任意組合的替換、添加、缺失，而與對(duì)照多肽有所不同。替換或者插入的氨基酸殘基，可以是或者可以不是遺傳密碼子編碼的。多核苷酸或者多肽的變體可以是天然存在的，例如等位基因變體，或者它也可以是已知非天然存在的。多核苷酸和多肽的非天然存在變體，可以通過(guò)突變技術(shù)或者通過(guò)直接合成制得。
“疾病”是指由細(xì)菌感染造成的或者與細(xì)菌感染相關(guān)的任何疾病，包括，例如，嬰兒和兒童的中耳炎、老年人肺炎、竇炎、醫(yī)院感染和入侵性疾病、導(dǎo)致失聰?shù)穆灾卸?、中耳液體積存、聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)受損、語(yǔ)言學(xué)習(xí)遲延、上呼吸道感染和中耳發(fā)炎。
實(shí)施例以下實(shí)施例使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實(shí)現(xiàn)，除了另外詳細(xì)描述的以外，這些技術(shù)對(duì)于技術(shù)熟練者來(lái)說(shuō)是熟知的和常規(guī)的。實(shí)施例是說(shuō)明性的，但是并不限制本發(fā)明。實(shí)施例1粘膜炎莫拉氏菌ATCC 43617菌株BASB119基因的DNA測(cè)序A粘膜炎莫拉氏菌菌株中的BASB119SEQ ID NO1中的BASB119基因來(lái)自粘膜炎莫拉氏菌ATCC 43617菌株。BASB119多核苷酸序列的翻譯，顯示在SEQ ID NO2。
B粘膜炎莫拉氏菌ATCC 43617菌株中的BASB119BASB119基因序列證實(shí)存在于粘膜炎莫拉氏菌ATCC 43617菌株中。為了這一目的，質(zhì)粒DNA(參見(jiàn)實(shí)施例2A)被用作PCR模板，該質(zhì)粒DNA含有編碼來(lái)自粘膜炎莫拉氏菌ATCC 43617菌株成熟BASB119的基因區(qū)域。這些材料隨后被用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA擴(kuò)增，使用引物pTLZ F 5’TGA CAA TTA ATC ATC GGC TCG-3’[SEQ ID NO5]和反向引物pTLZ RV.2 5’GGC TGA AAA TCT TCT CTC ATC C-3’[SEQ IDNO6]。PCR擴(kuò)增接著用于DNA測(cè)序，使用Big Dyes試劑盒(Appliedbiosystems)，并在廠商描述的條件下用ABI 373/A DNA測(cè)序儀進(jìn)行分析。結(jié)果，便得到了多核苷酸序列和推導(dǎo)出的多肽序列，分別參考SEQ ID NO3和SEQ ID NO4。因?yàn)樾盘?hào)序列來(lái)自質(zhì)粒，所以這些序列不包含信號(hào)序列。
使用DNASTAR軟件包的MegAlign程序，對(duì)SEQ ID NO1和3多核苷酸序列進(jìn)行序列對(duì)比，顯示在

圖1中；同一性的成對(duì)比較顯示，在編碼成熟蛋白質(zhì)的區(qū)域，兩條BASB119多核苷酸基因序列是100％一致的。使用同一個(gè)MegAlign程序，對(duì)SEQ ID NO2和4多肽序列進(jìn)行序列對(duì)比，顯示在圖2中；同一性的成對(duì)比較顯示，在成熟蛋白質(zhì)區(qū)域，兩條BASB119蛋白質(zhì)序列是100％一致的。實(shí)施例2表達(dá)重組BASB119質(zhì)粒的構(gòu)建
ABASB119克隆用遺傳工程分別向MC-Lip10-Fn/t-RI(5’-AGG CAG AGG GAA TTCATG ATG AGA TTT TTA TTG GTT GG-3’)[SEQ ID NO7]正向擴(kuò)增引物和MC-Lip10RCh/t-Sal(5’-AGG CAG AGG GTC GAC TTA ATGGTG ATG GTG ATG GTG AAA CAG ACT TTC GTC AAT TAT GG-3’)[SEQID NO8]反向擴(kuò)增引物EcoRI和SalI限制性位點(diǎn)，允許把PCR產(chǎn)物定向克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pTLZ2中，從而使BASB119蛋白能夠作為在C-末端含有(His)6親和層析標(biāo)記的融合蛋白而表達(dá)。根據(jù)制造商的說(shuō)明書，可以通過(guò)使用基于硅膠的spin柱(QiaGen)的擴(kuò)增反應(yīng)，純化BASB119 PCR產(chǎn)物。為了產(chǎn)生克隆所需的EcoRI和SalI末端，如制造商所(Life Technologies)推薦的，應(yīng)隨后用EcoRI和SalI限制性酶完全消化PCR產(chǎn)物。在第一步限制性消化之后第二步酶消化之前，用上述spin柱除鹽并用無(wú)菌水洗脫，純化PCR產(chǎn)物。在與pTLZ2質(zhì)粒連接之前，再次使用基于硅膠的spin柱純化被消化的DNA片段。
B表達(dá)載體的產(chǎn)生為了制備用于連接的pTLZ2表達(dá)質(zhì)粒，類似的用EcoRI和SalI完全消化該質(zhì)粒，然后按照制造商的指導(dǎo)，用牛腸磷酸酶(CIP，～0.02單位/pmol 5’端，Life Technologies)進(jìn)行處理，以避免自身連接。使用超過(guò)準(zhǔn)備好的載體大約5倍摩爾的消化片段，設(shè)計(jì)連接反應(yīng)。使用本領(lǐng)域熟知的方法，用T4 DNA連接酶(～2.0單位/反應(yīng)，LifeTechnologies)催化標(biāo)準(zhǔn)的～20μl連接反應(yīng)(～16℃，～16小時(shí))。根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法，使用連接的一個(gè)等分試樣(～5μl)轉(zhuǎn)化電感受態(tài)JM109細(xì)胞。在～1ml LB肉湯培養(yǎng)基中37℃生長(zhǎng)～2-3小時(shí)，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在含有氨芐青霉素(100μg/ml)的LB瓊脂平板上?？股匕诤Y選中。平板在37℃培養(yǎng)～16小時(shí)過(guò)夜。使用消毒牙簽挑選單個(gè)的ApR克隆，用其“補(bǔ)丁”接種新鮮的LB ApR平板和～1.0ml LB ApR肉湯培養(yǎng)基。補(bǔ)丁平板和培養(yǎng)基在標(biāo)準(zhǔn)孵育箱(平板)或者水浴搖床37℃培養(yǎng)過(guò)夜。使用基于全細(xì)胞的PCR分析，檢驗(yàn)含有BASB119 DNA插入的轉(zhuǎn)化物。此處，把～1.0ml過(guò)夜的LB ApR肉湯培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到1.5ml的聚丙烯管中，Beckmann微型離心機(jī)(-3分鐘，室溫，～12,000Xg)離心收集細(xì)胞。細(xì)胞沉淀懸浮于～200μl無(wú)菌水中，使用～10μl等分試樣，進(jìn)行終體積為～50μl的含有BASB119正向和反向擴(kuò)增引物的PCR反應(yīng)。除了使用～5.0單位的Tag聚合酶以外，PCR反應(yīng)成分的終濃度，基本上與實(shí)施例2中所說(shuō)明成分的濃度相同。初始95℃的變性步驟增加到3分鐘，以確保細(xì)菌細(xì)胞的熱破碎和質(zhì)粒DNA的連接。使用ABI Model 9700熱循環(huán)控制器和32個(gè)循環(huán)的3步熱擴(kuò)增過(guò)程，即95℃，45秒，55-58℃，45秒，72℃，1分鐘，擴(kuò)增來(lái)自溶解轉(zhuǎn)化施樣品的BASB119片段。熱擴(kuò)增之后，用瓊脂糖凝膠電泳(Tris-乙酸-EDTA(TAE)緩沖液中含有0.8％瓊脂糖)分析反應(yīng)的～20μl等分試樣。凝膠電泳和溴乙啶染色之后，用紫外線照明觀測(cè)DNA片段。DNA分子大小標(biāo)準(zhǔn)(1Kb序列梯，Life Technologies)與被測(cè)樣品一起平行電泳，并用于估計(jì)PCR產(chǎn)物的大小。鑒定產(chǎn)生預(yù)期大小PCR產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化物為含有BASB119表達(dá)結(jié)構(gòu)的菌株。接下來(lái)分析含有表達(dá)質(zhì)粒的菌株，是否可以誘導(dǎo)表達(dá)重組BASB119。
CPCR-陽(yáng)性轉(zhuǎn)化物的表達(dá)分析對(duì)于上述鑒定的每一個(gè)PCR-陽(yáng)性轉(zhuǎn)化物，使用來(lái)自補(bǔ)丁平板的細(xì)胞，接種含有氨芐青霉素(100μg/ml)的～5.0ml LB肉湯培養(yǎng)基，并在37℃搖動(dòng)(～250rpm)培養(yǎng)過(guò)夜。在含有～25ml LB Ap肉湯培養(yǎng)基的125ml錐形燒瓶中，接種等分試樣的過(guò)夜種子培養(yǎng)基(～1.0ml)，并在37℃搖動(dòng)培養(yǎng)，直到培養(yǎng)物的濁度達(dá)到O.D.600～0.5，即中對(duì)數(shù)階段(通常是大約1.5-2.0小時(shí))。這時(shí)，把大約一半培養(yǎng)物(～12.5ml)轉(zhuǎn)移到第二個(gè)錐形燒瓶中，加入IPTG(無(wú)菌水制備的1.0M儲(chǔ)存液，Sigma)至終濃度1.0mM誘導(dǎo)重組BASB119蛋白的表達(dá)。繼續(xù)在37℃搖動(dòng)培養(yǎng)IPTG-誘導(dǎo)的和非IPTG-誘導(dǎo)的培養(yǎng)物～4小時(shí)。在誘導(dǎo)期過(guò)后，取出誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)培養(yǎng)物的樣品(～1.0ml)，用微型離心機(jī)室溫～3分鐘離心收集細(xì)胞。單個(gè)的細(xì)胞沉淀懸浮于～50ml無(wú)菌水中，然后與含有2-巰基乙醇的等體積2X Laemelli SDS-PAGE樣品緩沖液混合，置于沸水浴～3分鐘變性蛋白質(zhì)。把等體積(～15μl)粗IPTG-誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)的細(xì)胞溶解物，加樣到完全相同的兩塊12％Tris/甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠(1mm厚的Mini-凝膠，Novex)。在常規(guī)條件下，使用標(biāo)準(zhǔn)SDS/Tris/甘氨酸電泳緩沖液(BioRad)電泳誘導(dǎo)的和非誘導(dǎo)的細(xì)胞溶解樣品，同時(shí)電泳預(yù)染色的分子重量標(biāo)記(SeeBlue，Novex)。電泳之后，一塊膠用考馬斯亮藍(lán)R250(BioRad)染色，然后脫色至可以看見(jiàn)新的BASB119 IPTG-誘導(dǎo)蛋白。第二塊膠使用BioRad Mini-Protean II印跡儀器和Towbin’s甲醇(20％)轉(zhuǎn)移緩沖液，在4℃～2小時(shí)電印跡至PVDF膜(孔尺寸0.45微米，Novex)。根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行膜阻斷和抗體孵育。使用單克隆抗-PGS(His)3抗體，緊接著使用結(jié)合HRP(QiaGen)的兔抗鼠第二抗體，確定BASB119重組蛋白的表達(dá)和特性。使用ABT不溶底物或者使用Amersham ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)的Hyperfilm，可以看見(jiàn)抗-His抗體的反應(yīng)模式。實(shí)例3重組BASB119的生產(chǎn)細(xì)菌菌株含有編碼粘膜炎莫拉氏菌BASB119質(zhì)粒(pTLZ2)的大腸桿菌JM109重組表達(dá)菌株，被用于生產(chǎn)用于純化重組蛋白的細(xì)胞物質(zhì)。表達(dá)菌株被培養(yǎng)在含有100μg/ml氨芐青霉素(“Ap”)的LB瓊脂平板上，以確保維持pTLZ2。對(duì)于-80℃低溫儲(chǔ)藏，在含有相同濃度抗生素的LB肉湯培養(yǎng)基中繁殖菌株，然后與含有30％(w/v)甘油的相同體積的LB肉湯培養(yǎng)基混合。
培養(yǎng)基用于重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)的發(fā)酵培養(yǎng)基，由含有100μg/ml Ap的2XYT肉湯(Difco)。在發(fā)酵罐中，以0.25ml/L向培養(yǎng)基添加消泡劑(Antifoam 204，Sigma)。為了誘導(dǎo)表達(dá)重組BASB119蛋白，在發(fā)酵罐中加入IPTG(異丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷)(終濃度1mM)。
發(fā)酵含有50ml工作體積的500-ml種子錐形燒瓶，用0.3ml速融冷凍培養(yǎng)物，或者用選出的瓊脂平板培養(yǎng)物的幾個(gè)克隆進(jìn)行接種，在搖動(dòng)平臺(tái)上(Innova 2100，New Brunswick Scientific)，以150rpm，37±1℃培養(yǎng)大約12個(gè)小時(shí)。然后，該種子培養(yǎng)物被用于接種含有2X YT肉湯和Ap抗生素的5-L工作體積的發(fā)酵罐。發(fā)酵罐(Bioflo 3000，New Brunswick Scientific)在37±1℃，換氣量0.2-0.4VVM，Rushton葉輪250rpm的條件下進(jìn)行操作。在錐形燒瓶種子培養(yǎng)或者發(fā)酵罐中都不控制pH。發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵罐中的pH在6.5到7.3范圍內(nèi)。當(dāng)培養(yǎng)物到達(dá)中對(duì)數(shù)期時(shí)(～0.7O.D.600單位)，在發(fā)酵罐中添加IPTG(無(wú)菌水制備的1.0M儲(chǔ)存液)。誘導(dǎo)細(xì)胞2-4小時(shí)，然后使用28RS Heraeus(Sepatech)或者RC5C超速離心機(jī)(SorvallInstruments)進(jìn)行離心收集。細(xì)胞粘糊在處理之前儲(chǔ)存于-20℃。
化學(xué)物質(zhì)和材料咪唑和Triton X-100買自Merck。Aprotinin和Triton X-144來(lái)自Sigma Chemical Company。AEBSF來(lái)自ICN-Biochemicals。所有其他化學(xué)試劑都是試劑級(jí)或者更高級(jí)別的。
Ni-NTA Superflow樹(shù)脂和無(wú)牛血清白蛋白的五-His抗體來(lái)自QiaGen。MicroBCA分析來(lái)自Pierce；Amicon 3濾器來(lái)自Millipore。透析膜(MWCO 12-14000)來(lái)自MFPI，USA。分子量標(biāo)記(BenchMarkladder)來(lái)自Life-technologies。
實(shí)例4大腸桿菌重組BASB119的純化提取-純化把500ml IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)物(～4小時(shí)，OD620＝0.5)的細(xì)胞粘糊，重懸在40ml磷酸緩沖液中，pH7.5，該緩沖液中含有1mM AEBSF和1mM抑酶肽作為蛋白酶抑制劑。細(xì)胞在細(xì)胞破碎器中溶解。溶解物進(jìn)行去垢劑分相，4℃下1.5％Triton X-114進(jìn)行2小時(shí)，4℃下3,000g離心30分鐘。提取物升溫至37℃，保溫15分鐘，20℃下1,000g離心10分鐘。Triton相(下相)用含有0.3M NaCl，0.005％TritonX-100，10％甘油的磷酸緩沖液pH7.5(緩沖液A)稀釋至15ml，并以批量模式將其用于Ni-NTA superflow樹(shù)脂(保溫過(guò)夜)。用緩沖液A清洗樹(shù)脂。蛋白質(zhì)依次用含有50mM，100mM和200mM咪唑的緩沖液A洗脫下來(lái)。含有BASB119蛋白的部分收集在一起，在含有0.1％Triton X-100的PBS緩沖液pH7.4中透析。
純化的BASB119蛋白用Micro BCA分析試劑定量。得到了2mg純化蛋白，終濃度為130μg/ml。如圖3-A所示，純化的BASB119蛋白作為主帶顯示在SDS-PAGE分析中，遷移在大約21kDa(估計(jì)的相對(duì)分子量)。純度估計(jì)高于80％。BASB119蛋白對(duì)于針對(duì)6-組氨酸基元得到的小鼠單克隆抗體有反應(yīng)活性(圖3-B)。實(shí)例5重組BASB119抗血清的產(chǎn)生直接針對(duì)BASB119蛋白的多價(jià)抗血清，是通過(guò)用純化的重組BASB119蛋白免疫接種六只小鼠產(chǎn)生的。每只動(dòng)物總共進(jìn)行3次皮下免疫，每次注射大約10μg BASB119蛋白，間隔大約14天。在第一次免疫前(“前取血”)和最后一次免疫一周后對(duì)動(dòng)物取血。
使用重組BASB119蛋白(4μg/孔)ELISA測(cè)定抗-BASB119蛋白的效價(jià)。該效價(jià)被定義為，通過(guò)使用XL Fit軟件的4-參數(shù)邏輯模型計(jì)算出的效價(jià)的中點(diǎn)。小鼠血清免疫后的效價(jià)是1∶1300。
實(shí)例6免疫特性BASB119的表面暴露使用福爾馬林殺死的粘膜炎莫拉氏菌2926菌株完整細(xì)胞(20μg/孔)，通過(guò)ELISA測(cè)定抗-BASB119蛋白的效價(jià)。該效價(jià)被定義為，通過(guò)使用SoftMax Pro軟件的4-參數(shù)邏輯模型計(jì)算出的效價(jià)的中點(diǎn)。
觀測(cè)到的兔免疫血清效價(jià)(1∶100)表明，BASB119蛋白發(fā)現(xiàn)于粘膜炎莫拉氏菌細(xì)胞的表面。實(shí)例7免疫特性∶殺菌活性測(cè)定抗-BASB119抗體的補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性活性，以測(cè)定如上所述制備的BASB119抗血清的免疫效力。測(cè)定了免疫前血清和抗-BASB119抗血清，在介導(dǎo)補(bǔ)體殺死粘膜炎莫拉氏菌中的活性。在Mueller Hinton平板上，36℃下生長(zhǎng)粘膜炎莫拉氏菌菌株24小時(shí)。把幾個(gè)菌落接種到125ml錐形燒瓶的15ml BHI中。培養(yǎng)物在200rpm生長(zhǎng)4小時(shí)，直到A620＝0.4。經(jīng)過(guò)一次清洗之后，粘糊懸浮于HBSS，菌株稀釋至每毫升28500CFU。在96-孔板的第一個(gè)孔里加入五十(50)μl免疫前血清和抗-BASB119血清(56℃滅活30分鐘)，在同一行的其他空里加入HBSS的兩倍系列稀釋液。隨后加入二十五(25)μl稀釋的活粘膜炎莫拉氏菌，混合物室溫培養(yǎng)15分鐘。按照事先在毒性分析中確定的工作稀釋液，在每個(gè)孔中加入幼兔補(bǔ)體(Pel freez，clinical systems，Brown Deer，WI，UAS)。
蓋上微量平板，37℃下200rpm培養(yǎng)1小時(shí)。每個(gè)測(cè)試包括補(bǔ)體對(duì)照(沒(méi)有血清的孔，該血清含有活性的或者滅活的補(bǔ)體源)，陽(yáng)性對(duì)照(含有已知?dú)⒕贵w效價(jià)血清的孔)，培養(yǎng)物對(duì)照(沒(méi)有血清和補(bǔ)體的孔)和血清對(duì)照(沒(méi)有補(bǔ)體的孔)。
兔抗血清的殺菌效價(jià)(同源菌株50％致死)＜1∶25(免疫前)＞1∶100(免疫的)。實(shí)例8BASB119疫苗的功效在小鼠中增強(qiáng)肺部清除粘膜炎莫拉氏菌鼠的模型是基于接種鼠的標(biāo)準(zhǔn)鼻內(nèi)激發(fā)之后的粘膜炎莫拉氏菌肺部侵染分析。按照10μg劑量用100μl皮下免疫6只BALB/c鼠群體(雌性，6周齡)，2周后加強(qiáng)。加強(qiáng)一周后，在麻醉情況下(用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉劑的結(jié)合麻醉小鼠，0.24mg甲苯噻嗪(Rompun)和0.8mg氯胺酮(Imalgene)/100μl)，通過(guò)在左鼻孔滴注50μl細(xì)菌懸浮液(5×105CFU/50μl)，對(duì)小鼠進(jìn)行激發(fā)。激發(fā)之后4小時(shí)處死鼠，無(wú)菌條件下摘出肺臟，單個(gè)進(jìn)行勻漿。涂布20μl的5個(gè)系列勻漿物稀釋液之后，通過(guò)計(jì)數(shù)Mueller-Hinton瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落，確定CFU/肺臟的log10加權(quán)平均值。計(jì)算每一組的CFU/肺臟的log10加權(quán)平均值的算數(shù)平均值，以及標(biāo)準(zhǔn)偏差。
在假定方差等式(經(jīng)過(guò)Brown and Forsythe’s測(cè)試檢驗(yàn))和正規(guī)性等式(經(jīng)過(guò)Shapiro-Wilk測(cè)試檢驗(yàn))之后，通過(guò)使用1-途徑ANOVA，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用Dunnet測(cè)試、Tukey’s studentised范圍測(cè)試(HSD)和Student-Newman-Keuls測(cè)試，分析組之間的差異。
在該試驗(yàn)中，小鼠的分組用吸附在AlPO4上的BASB119(100μgAlPO4上的10μg BASB119)進(jìn)行免疫，或者用吸附在AlPO4上的粘膜炎莫拉氏菌ATCC 43617菌株的死的全細(xì)胞(kwc)制備物(100μgAlPO4上的5×108個(gè)細(xì)胞)進(jìn)行免疫，或者用沒(méi)有抗原的100μg AlPO4進(jìn)行免疫。用5×105CFU活的粘膜炎莫拉氏菌ATCC 43617細(xì)菌菌株，對(duì)小鼠進(jìn)行攻擊。
對(duì)每一組計(jì)算攻擊4小時(shí)后的CFU/肺臟的log10加權(quán)平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。攻擊4小時(shí)后假裝免疫小鼠的log10 CFU/肺臟是5.41(+/-0.2)。
與對(duì)照組比較，kwc制備物引起明顯的肺部清除(log差異1.58)。在肺部清除中，BASB119疫苗與對(duì)照組比較引起1.34的log差異，這與對(duì)照有相當(dāng)大的差異。
保藏材料含有粘膜炎莫拉氏菌Catlin菌株的保藏物，在1997年6月21日保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type CultureCollection)(此處的“ATCC”)，保藏號(hào)43617。該保藏物被稱作粘膜炎氏布蘭漢氏球菌(Branhamella catarrhalis)(Frosch andKolle)，是由粘膜炎莫拉氏菌分離株構(gòu)建的凍干的1.5-2.9kb插入文庫(kù)，該種群是從患有慢性支氣管炎的煤礦工人氣管吸出物中得到的。該保藏物在抗微生物物質(zhì)化學(xué)治療(Antimicrob.AgentsChemother.)21506-508(1982)中有描述。
粘膜炎莫拉氏菌菌株的保藏物，在此處稱作“保藏菌株”或者“保藏菌株的DNA”。
保藏菌株含有全長(zhǎng)的BASB119基因。
包括插入在pQE30中的粘膜炎莫拉氏菌DNA的pMC-D15載體保藏物，在1999年2月12日存放于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanType Culture Collection)(此處的“ATCC”)，保藏號(hào)207105。
當(dāng)與此處的任何序列描述有沖突時(shí)，保藏菌株/克隆中包含的多核苷酸序列，及其編碼的任何多肽的氨基酸序列是對(duì)照查對(duì)的。
保藏菌株的保藏物，符合國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約(Budapest Treaty on the International Recognition ofDeposit of Micro-organisms for Purpose of Patent Procedure)。保藏菌株在保護(hù)專利的前提下，不可取消地并且沒(méi)有限制和條件地準(zhǔn)許公眾公開(kāi)使用。保藏菌株只是為那些本領(lǐng)域技術(shù)人員提供方便，而不是例如35 U.S.C.§112要求的那些實(shí)施所需要的保藏物的許可。序列信息BASB119多肽和多核苷酸序列SEQ ID No1來(lái)自菌株ATCC43617的粘膜炎莫拉氏菌BASB119的多肽ATGATGAGATTTTTATTGGTTGGATGCTTGGCAACCTTATTTTTACTTGGGTGTGGTAATAATTCTAGTCAAGAATTAGAGACGAATACCATTGAACAATCAAGCCCAAGAATTACAATAAAAAATGAAATGATCGAAGCTCAACCGTTGCCAGAGACAGGGGCAACCAACAAACCTAATTTGTATGGCGATTCACCTTTACAAATAAAAACCAACTCAGGAAGTCATTATTGGGTAAAAATTGTCAATGCTTATGACGAGCGAGAAGAGCTGGTGAGTTATTTTATCCGTGGTGGAGAAACATTAGATGTTACTCTGCCCGTGGGAAGTTATGTCGTGAAATATGCTTATGGAGATACTTGGTATGGCGAAGAGTATTTATTTGGCGAAAATACAGGTTATTCCAAGGCGGATGAAGTGTTTGAATTTTATCACAATCAAGGCTATGTCATTGAGCTTATTCAACAATTAAATGGCAATTTACACACAACCATAATTGACGAAAGTCAGTTTTAGSEQ ID NO2由SEQ ID NO1的多核苷酸推導(dǎo)的粘膜莫拉氏菌BASB119的多肽序列MMRFLLVGCLATLFLLGCGNNSSQELETNTIEQSSPRITIKNEMIEAQPLPETGATNKPNLYGDSPLQIKTNSGSHYWVKIVNAYDEREELVSYFIRGGETLDVTLPVGSYVVKYAYGDTWYCEEYLFGENTGYSKADEVFEFYHNQGYVIELIQQLNGNLHTTIIDESQFSEQ ID NO3來(lái)自ATCC43617菌株的粘膜莫拉氏菌BASB119多核苷酸ATGATGAGATTTTTATTGGTTGGATGCTTGGCAACCTTATTTTTACTTGGGTGTGGTAATAATTCTAGTCAAGAATTAGAGACGAATACCATTGAACAATCAAGCCCAAGAATTACAATAAAAAATGAAATGATCGAAGCTCAACCGTTGCCAGAGACAGGGGCAACCAACAAACCTAATTTGTATGGCGATTCACCTTTACAAATAAAAACCAACTCAGGAAGTCATTATTGGGTAAAAATTGTCAATGCTTATGACGAGCGAGAAGAGCTGGTGAGTTATTTTATCCGTGGTGGAGAAACATTAGATGTTACTCTGCCCGTGGGAAGTTATGTCGTGAAATATGCTTATGGAGATACTTGGTATGGCGAAGAGTATTTATTTGGCGAAAATACAGGTTATTCCAAGGCGGATGAAGTGTTTGAATTTTATCACAATCAAGGCTATGTCATTGAGCTTATTCAACAATTAAATGGCAATTTACACACAACCATAATTGACGAAAGTCAGTTTSEQ ID NO4由SEQ ID NO3的多核苷酸推導(dǎo)出的粘膜莫拉氏菌BASB119多肽序列MMRFLLVGCLATLFLLGCGNNSSQELETNTIEQSSPRITIKNEMIEAQPLPETGATNKPNLYGDSPLQIKTNSGSHYWVKIVNAYDEREELVSYFIRGGETLDVTLPVGSYVVKYAYGDTWYGEEYLFGENTGYSKADEVFEFYHNQGYVIELIQQLNGNLHTTIIDESQFSEQ ID NO5TGA CAA TTA ATC ATC GGC TCGSEQ ID NO6GGC TGA AAA TCT TCT CTC ATC CSEQ ID NO7AGG CAG AGG GAA TTC ATG ATG AGA TTT TTA TTG GTT GGSEQ ID NO8AGG CAG AGG GTC GAC TTA ATG GTG ATG GTG ATG GTG AAA CTG ACTTTC GTC AAT TAT GG
序列表<110>SmithKline Beecham Biologicals SA<120>新化合物<130>BM45410<160>8<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>516<212>DNA<213>粘膜炎莫拉氏菌(MoraxeLLa catarrhalis)<400>1atgatgagat ttttattggt tggatgcttg gcaaccttat ttttacttgg gtgtggtaat 60aattctagtc aagaattaga gacgaatacc attgaacaat caagcccaag aattacaata 120aaaaatgaaa tgatcgaagc tcaaccgttg ccagagacag gggcaaccaa caaacctaat 180ttgtatggcg attcaccttt acaaataaaa accaactcag gaagtcatta ttgggtaaaa 240attgtcaatg cttatgacga gcgagaagag ctggtgagtt attttatccg tggtggagaa 300acattagatg ttactctgcc cgtgggaagt tatgtcgtga aatatgctta tggagatact 360tggtatggcg aagagtattt atttggcgaa aatacaggtt attccaaggc ggatgaagtg 420tttgaatttt atcacaatca aggctatgtc attgagctta ttcaacaatt aaatggcaat 480ttacacacaa ccataattga cgaaagtcag ttttag 516<210>2<211>171<212>pRT<213>粘膜炎莫拉氏菌(MoraxeLLa catarrhalis)<400>2Met Met Arg Phe Leu Leu Val Gly Cys Leu Ala Thr Leu Phe Leu Leu1 5 10 15Gly Cys Gly Asn Asn Ser Ser Gln Glu Leu Glu Thr Asn Thr Ile Glu20 25 30Gln Ser Ser Pro Arg Ile Thr Ile Lys Asn Glu Met Ile Glu Ala Gln35 40 45Pro Leu Pro Glu Thr Gly AIa Thr Asn Lys Pro Asn Leu Tyr Gly Asp50 55 60Ser Pro Leu Gln Ile Lys Thr Asn Ser Gly Ser His Tyr Trp Val Lys65 70 75 80Ile Val Asn Ala Tyr Asp Glu Arg Glu Glu Leu Val Ser Tyr Phe Ile85 90 95Arg Gly Gly Glu Thr Leu Asp Val Thr Leu Pro Val Gly Ser Tyr Val100 105 110Val Lys Tyr Ala Tyr Gly Asp Thr Trp Tyr Gly Glu Glu Tyr Leu Phe115 120 125Gly Glu Asn Thr Gly Tyr Ser Lys Ala Asp Glu Val Phe Glu Phe Tyr130 135 140His Asn Gln Gly Tyr Val Ile Glu Leu Ile Gln Gln Leu Asn Gly Asn145 150 155 160Leu His Thr Thr Ile Ile Asp Glu Ser Gln Phe165 170<210>3<211>513<212>DNA<213>粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)
<400>3atgatgagat ttttattggt tggatgcttg gcaaccttat ttttacttgg gtgtggtaat 60aattctagtc aagaattaga gacgaatacc attgaacaat caagcccaag aattacaata 120aaaaatgaaa tgatcgaagc tcaaccgttg ccagagacag gggcaaccaa caaacctaat 180ttgtatggcg attcaccttt acaaataaaa accaactcag gaagtcatta ttgggtaaaa 240attgtcaatg cttatgacga gcgagaagag ctggtgagtt attttatccg tggtggagaa 300acattagatg ttactctgcc cgtgggaagt tatgtcgtga aatatgctta tggagatact 360tggtatggcg aagagtattt atttggcgaa aatacaggtt attccaaggc ggatgaagtg 420tttgaatttt atcacaatca aggctatgtc attgagctta ttcaacaatt aaatggcaat 480ttacacacaa ccataattga cgaaagtcag ttt 513<210>4<211>171<212>pRT<213>粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)<400>4Met Met Arg Phe Leu Leu Val Gly Cys Leu Ala Thr Leu Phe Leu Leu1 5 10 15Gly Cys Gly Asn Asn Ser Ser Gln Glu Leu Glu Thr Asn Thr Ile Glu20 25 30Gln Ser Ser Pro Arg Ile Thr Ile Lys Asn Glu Met Ile Glu Ala Gln35 40 45Pro Leu Pro Glu Thr Gly Ala Thr Asn Lys Pro Asn Leu Tyr Gly Asp50 55 60Ser Pro Leu Gln Ile Lys Thr Asn Ser Gly Ser His Tyr Trp Val Lys65 70 75 80Ile Val Asn Ala Tyr Asp Glu Arg Glu Glu Leu Val Ser Tyr Phe Ile85 90 95Arg Gly Gly Glu Thr Leu Asp Val Thr Leu Pro Val Gly Ser Tyr Val100 105 110Val Lys Tyr Ala Tyr Gly Asp Thr Trp Tyr Gly Glu Glu Tyr Leu Phe115 120 125Gly Glu Asn Thr Gly Tyr Ser Lys Ala Asp Glu Val Phe Glu Phe Tyr130 135 140His Asn Gln Gly Tyr Val Ile Glu Leu Ile Gln Gln Leu Asn Gly Asn145 150 155 160Leu His Thr Thr Ile Ile Asp Glu Ser Gln Phe165 170<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列(Artificial sequence)<220>
<223>引物(primer)<400>5tgacaattaa tcatcggctc g 21<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列(Artificial sequence)<220>
<223>引物(Primer)<400>6ggctgaaaat cttctctcat cc22
<210>7<211>38<212>DNA<213>人工序列(Artificial sequence)<220>
<223>引物(primer)<400>7aggcagaggg aattcatgat gagattttta ttggttgg 38<210>8<211>59<212>DNA<213>人工序列(Artificial sequence)<220>
<223>引物(primer)<400>8aggcagaggg tcgacttaat ggtgatggtg atggtgaaac tgactttcgt caattatgg 59
權(quán)利要求
1.分離的多肽，該多肽包含的氨基酸序列與選自SEQ ID NO2和SEQ ID NO4的氨基酸序列分別在SEQ ID NO2或者SEQ ID NO4全長(zhǎng)上有至少85％的同一性。
2.如權(quán)利要求1中所述的分離的多肽，其氨基酸序列與選自SEQID NO2和SEQ ID NO4的氨基酸序列分別在SEQ ID NO2或者SEQ IDNO4全長(zhǎng)上有至少95％的同一性。
3.如權(quán)利要求1中所述的多肽，該多肽包含選自SEQ ID NO2和SEQ ID NO4的氨基酸序列。
4.SEQ ID NO2或者SEQ ID NO4的分離的多肽。
5.如權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述的多肽的免疫原性片段，其中該免疫原性片段的免疫原性基本上與SEQ ID NO2或者SEQ IDNO4多肽相同。
6.如權(quán)利要求1-5中任一權(quán)利要求所述的多肽，其中該多肽是更大的融合蛋白的一部分。
7.編碼如權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求所述多肽的分離的多核苷酸。
8.分離的包含編碼多肽的核苷酸序列的多核苷酸，該多肽與SEQ ID NO2或者4的氨基酸序列分別在SEQ ID NO2或者4全長(zhǎng)上有至少85％的同一性；或者與該分離的多核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列。
9.分離的多核苷酸，該多核苷酸與編碼SEQ ID NO2或者4多肽的核苷酸序列在全部編碼區(qū)域上有至少85％的同一性；或者與該分離的多核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列。
10.分離的多核苷酸，該多核苷酸包含的核苷酸序列與SEQ IDNO1或者3的核苷酸序列分別在SEQ ID NO1或者3全長(zhǎng)上有至少85％的同一性；或者與該分離的多核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列。
11.如權(quán)利要求7-10中任一權(quán)利要求所述的分離的多核苷酸，其與SEQ ID NO1或者3有至少9 5％的同一性。
12.分離的多核苷酸，該多核苷酸包含編碼SEQ ID NO2或者SEQ ID NO4多肽的核苷酸序列。
13.包含SEQ ID NO1或者SEQ ID NO3多核苷酸的分離的多核苷酸。
14.分離的多核苷酸，該多核苷酸包含編碼SEQ ID NO2，SEQ IDNO4多肽的核苷酸序列，它是通過(guò)在嚴(yán)格雜交條件下使用具有SEQ IDNO1或者SEQ ID NO3序列或者其片段的標(biāo)記探針篩選適當(dāng)?shù)奈膸?kù)得到的。
15.表達(dá)載體或者活的重組微生物，它們包含根據(jù)權(quán)利要求7-14中任一權(quán)利要求的分離的多核苷酸。
16.包含權(quán)利要求15表達(dá)載體、表達(dá)分離的多肽的宿主細(xì)胞，或者該宿主細(xì)胞的亞細(xì)胞部分或者膜，該分離的多肽包含的氨基酸序列與選自SEQ ID NO2和SEQ ID NO4的氨基酸序列有至少85％的同一性。
17.生產(chǎn)權(quán)利要求1-6多肽的方法，該方法包括在足夠生產(chǎn)該多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求16的宿主細(xì)胞，以及從培養(yǎng)基中回收所述多肽。
18.表達(dá)權(quán)利要求7-14中任一權(quán)利要求的多核苷酸的方法，該方法包括用含有至少一種所說(shuō)的多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，以及在足夠表達(dá)所說(shuō)的任一多核苷酸的條件下，培養(yǎng)該宿主細(xì)胞。
19.疫苗組合物，其含有有效量的權(quán)利要求1-6中任一 所述的多肽和藥學(xué)可接受載體。
20.疫苗組合物，其含有有效量的權(quán)利要求7-14中任一權(quán)利要求的多核苷酸和藥物有效載體。
21.根據(jù)權(quán)利要求19或者20中任一權(quán)利要求的疫苗組合物，其中所述組合物含有至少一種其他粘膜炎莫拉氏菌抗原。
22.對(duì)如權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求所述的多肽或者免疫片段有免疫特異性的抗體。
23.診斷粘膜炎莫拉氏菌感染的方法，包括鑒定如權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求所述的多肽，或者對(duì)所說(shuō)多肽有免疫特異性的抗體，這些多肽或者抗體出現(xiàn)在懷疑有這種感染的動(dòng)物體的生物樣品中。
24.含有免疫有效量的如權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求所述的多肽的組合物在制備用于在動(dòng)物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用。
25.含有免疫有效量的如權(quán)利要求7-14中任一權(quán)利要求所述的多核苷酸的組合物在制備用于在動(dòng)物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用。
26.在治療具有粘膜炎莫拉氏菌疾病的人體中有效的治療組合物，該組合物含有至少一種直接針對(duì)權(quán)利要求1-6多肽的抗體和合適的藥物載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了BASB119多肽和編碼BASB119多肽的多核苷酸,以及通過(guò)重組技術(shù)生產(chǎn)這些多肽的方法。并且提供了診斷的、預(yù)后的和治療的用途。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1377411SQ00813833
公開(kāi)日2002年10月30日 申請(qǐng)日期2000年7月31日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月3日
發(fā)明者J·通納德 申請(qǐng)人:史密絲克萊恩比徹姆生物有限公司