專利名稱：皮膚免疫功能調節(jié)劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及化妝品和皮膚科學的技術領域。具體而言，本發(fā)明涉及保護皮膚免受外界影響的調制劑和方法。
對香料的精神效果進行臨床試驗的結果表明(Komori et al，Neuroimmunomodulation 2174-180)，嗅覺的刺激以減少抗綿羊(anti-sheep)的紅細胞中的血小板形成細胞(Shibata et al，InternJ Neurosience 51245-247，1990)以及增加唾液的sIgA(Komori etal，同前)為首，可調節(jié)全身的免疫系統(tǒng)。
如上所述，香料對全身免疫系統(tǒng)的作用已逐漸明確，但關于香料對皮膚的作用，只是解析了皮膚表層的電位變化(Miltner et al.，Psychophysiology 31107-110，1994；Alaoui-Iamaili et al，PhysiolBehavior 62(4)713-720，1997)。皮膚免疫具有防御外敵入侵的防御功能的同時，也是引起變應性反應的原因。所謂郎罕氏細胞的皮膚免疫功能細胞是位于表皮淺部的樹突狀細胞，這些細胞通過將遇到的抗原呈遞給T細胞而誘導免疫。
另一方面，對特定香料的作用進行概況的話，有報道稱檸檬腈(即，3，7-二甲基-2，6-辛二烯腈)能使蛙和大鼠嗅覺細胞中的腺苷酸環(huán)化酶活化(分別參見Sklar et al，J.Biol.Chem.26115538-15543，1986和Boekhoff et al，EMBO J.92453-2458，1990)。也有報道稱lyral(4-(4-羥基-4-甲基戊基)-3-環(huán)己烷-1-羧基醛)和鈴蘭醛(lilial4-(1，1-二甲基乙基)-α-甲基苯丙醇)的混合物在嗅覺受體表達細胞中誘導肌醇磷酸的代謝運轉(Raminget al，Nature 361353-356，1993)。
另外，發(fā)現(xiàn)刺激嗅覺受體的揮發(fā)性物質從某種角度出發(fā)，可分為能明顯改變巴比土酸誘發(fā)睡眠測定方法中受試者的睡眠時間的物質和/或能明顯改變誘發(fā)陰性變動(Contingent Negative Variation)(以下，略作CNV)測定方法中受試者的CNV振幅面積的物質。
因此，本發(fā)明提供以可刺激嗅覺受體的揮發(fā)性物質為有效成分的皮膚免疫功能調節(jié)劑，更具體而言，提供以能明顯改變巴比土酸誘發(fā)睡眠測定方法中受試者的睡眠時間的物質和/或能明顯改變CNV測定方法中受試者的CNV振幅面積的物質為有效成分的皮膚免疫功能調節(jié)劑。
作為本發(fā)明的其他形式，本發(fā)明提供該揮發(fā)性物質作為制備皮膚免疫功能調節(jié)劑的有效成分的應用。
作為本發(fā)明的另一形式，本發(fā)明提供受試者皮膚免疫功能的調節(jié)方法，該方法包括將可調節(jié)該免疫功能的足夠量的揮發(fā)性物質經呼吸道施用于希望或有必要調節(jié)皮膚免疫功能的受試者的過程。
根據本發(fā)明，可根據需要隨意調節(jié)皮膚免疫功能，所以有用于預防或治療皮膚免疫功能的異常，例如預防或治療接觸性過敏癥，或有用于維持或恢復皮膚屏障功能。
圖2表示檸檬腈與lyral/鈴蘭醛的皮膚免疫抑制效果的比較。
圖3表示局部施用香料時的皮膚免疫抑制效果。
圖4表示對防止限制性應激造成的皮膚免疫能力降低的香料DMMB的效果。
圖5表示應激負荷對郎罕氏細胞的影響以及香料DMMB引起的應激負荷影響的緩和或抑制作用。
作為這種揮發(fā)性物質，例如可明顯改變由一般性的香料分類中使用的巴比土酸誘發(fā)睡眠測定方法(例如參照T.Tsuchiya et al.，BrainResearch Bulletin 26397-401，1991)測定的睡眠時間的物質，以及可明顯改變由誘發(fā)陰性變動(Contingent Negative Variation)(以下，略作CNV)測定方法(例如參照W.G.Walter et al.，Nature 203380-384，1964；S.Torri，Cosmetics and Toiletaries 102，1987)確定的CNV振幅面積的物質。
上述“能明顯改變睡眠時間”可由下述標準進行確認，即，與不施用揮發(fā)性物質或不接觸該物質時所測定的受試者睡眠時間(對照)相比，施用揮發(fā)性物質或接觸該物質時所測定的受試者睡眠時間至少延長或縮短15％。
對上述具有延長作用的揮發(fā)性物質沒有限定，例如乙酸萜品酯、苯乙醇、沉香醇(linalool)和茴香(來源于種子的精油)等。它們通常能使低下的皮膚免疫功能亢進，或可防止皮膚免疫功能的異常降低。對相反具有縮短作用的揮發(fā)性物質也沒有限定，例如檸檬腈、檸檬油(來源于檸檬果皮的精油)、茉莉(來源于花的凈油)、乙酸異冰片酯(iso-bornyl acetate)和葉綠醇等。這些物質一般能抑制過度或過敏的皮膚免疫應答。
另一方面，上述“能明顯改變CNV振幅面積”可由下述標準進行確認，即，與不施用揮發(fā)性物質或不接觸該物質時用CNV測定方法進行測定的受試者CNV振幅面積(對照)相比，施用揮發(fā)性物質或接觸該物質時所測定的受試者CNV振幅面積減少或增加10％。
對于可減少振幅面積的揮發(fā)性物質沒有限定，例如香菜、1，3-二甲氧基-5-甲基苯(DMMB)、白檀木(來源于木材的精油)、薔薇(來源于花的精油或凈油)、迷迭香(來自整草的精油)、香檸檬(來自果皮的精油)、薰衣香(來自花穗的精油)、橙子(來自果皮的精油)和甘菊(來自干燥的花的精油)等。
這些揮發(fā)性物質一般可使上述皮膚免疫功能亢進。對相反具有增加振幅面積的揮發(fā)性物質也沒有限定，例如檸檬油(來自果皮的精油)、茉莉(來源于花的凈油)、薄荷(來自整草的精油)、羅勒(來自整草的精油)、丁香(來自花蕾的精油)和八角茴香(來自果實的精油)等。這些揮發(fā)性物質一般能抑制上述皮膚免疫功能(抑制過度的皮膚免疫應答)。以上測定方法中所講的受試者通常指健康的成年人或人以外的哺乳動物，例如小鼠、大鼠等。
本發(fā)明的皮膚免疫功能調節(jié)劑可以上述揮發(fā)性物質的1種或2種以上的混合物作為有效成分來使用。如上所述，本發(fā)明中所講的“皮膚免疫功能調節(jié)劑”是指，在皮膚免疫處于過度的亢進狀態(tài)時能平息免疫，而當皮膚免疫處于減弱的狀態(tài)時能增進或激活免疫。再者，該免疫功能調節(jié)還包括預防應該正常的免疫功能過度亢進或減弱。
要確實保證本發(fā)明的效果，就有必要使有效成分揮發(fā)性物質處于刺激嗅覺受體的狀態(tài)，或經氣道將有效量的揮發(fā)性物質吸入體內?！坝行Я俊笔侵福缬煤笫龅脑囼灧椒ㄟM行評價時，與對照(未處理)相比可明顯減少或增加郎罕氏細胞數(shù)的量。對于上述縮短睡眠時間和/或增大CNV振幅面積的揮發(fā)性物質來說，則是明顯減少郎罕氏細胞數(shù)的量；對于另一方的揮發(fā)性物質來說，則是可發(fā)揮與前面作用相反作用的量。
因可根據受試者的年齡、免疫狀態(tài)、香料的施用量、施用時期、施用方法等改變最適量，所以不能對該有效量進行限定，一般來講，可參照后述的實驗方法和結果由專家進行確定，并且優(yōu)選由專家進行確定。再者，用于預防或治療接觸性過敏反應時，上述縮短睡眠時間和/或增大CNV振幅面積的揮發(fā)性物質有效量的確定也可參照后述應用動物模型的接觸性過敏反應的評價方法及其結果。
本發(fā)明的調節(jié)劑可配合使用香料制劑中通常應用的載體、稀釋劑或其它活性成分來制劑化(或制品化)。其形式除為香水、古龍香水、室內芳香劑等芳香制品之外，在可經氣道吸收或施用的范圍內，可為洗劑、面霜、肥皂、牙膏、氣溶膠制品等化妝品、其它香料通常應用的任一形式。此外，也可采用吸入藥等特定的醫(yī)藥品形式。例如，用于預防和治療皮膚接觸性過敏反應的制劑中特定揮發(fā)性物質的配合量，只要是吸入后能充分獲得抑制接觸性過敏反應的效果的量即可。配合量根據使用形式以及藥劑(香料)等有所差異，但通常為0.01重量％以上。
以上，主要說明了考慮給人使用時的劑型等，但本發(fā)明的調節(jié)劑和調節(jié)方法還適用于人以外的哺乳動物，例如牛、豬、綿羊、兔子、鼠等，施用于動物時，根據需要可對上述劑型進行一些必要調整。
以下通過具體例對本發(fā)明進行更為具體的說明，同時顯示發(fā)揮本發(fā)明作用效果的指標，但本發(fā)明并不限定于這些例子。試驗例1香料對接觸性過敏反應等的影響(實驗動物)使用雌性C57BL/6小鼠(7～9周齡)。動物在維持21～25℃的溫度、相對濕度40％～70％的室內進行飼養(yǎng)，每個籠子(225×338×140mm)內各5只。將吸收了香料的濾紙置于陪替氏(Petri)培養(yǎng)皿中并在其上用直徑10cm的金屬網覆蓋，將培養(yǎng)皿放置到鼠籠內，這樣讓動物吸收香料(對照使用未吸收香料的濾紙)。該動物實驗是按照日本學術審議會實驗動物操作標準(National Research Council GuideLines)進行的。1-1.接觸性過敏反應第1大，將抗原2，4，6-三硝基氯苯(TNCB)(3％丙酮溶液50μl)涂到小鼠去毛的背部，使小鼠致敏。5天后(實驗第6天)將5μl上述抗原的1％丙酮溶液分別涂到動物右耳的兩側，激發(fā)接觸性過敏反應。第7天用千分尺測定左耳和右耳腫脹的厚度，通過二者測定值的差評價接觸性過敏(以下略作CH)反應。
觀察致敏階段的香料吸入的效果時，于第0～2天在籠內設置放置了上述吸收了香料的濾紙的陪替氏培養(yǎng)皿。觀察激發(fā)免疫階段的香料吸入的效果時，于第5～7天在籠內設置上述陪替氏培養(yǎng)皿。觀察香料直接涂到皮膚上的效果時，將0.1％檸檬腈(citralva)或lyral/鈴蘭醛或稀釋劑(丙酮中50％玉米油)各50μl，在致敏6小時前，涂到涂布上述抗原的部位。觀察長期效果時，在第0～2天每天適用1％香料或稀釋劑50μl來進行試驗。結果(1)由TNCB誘導或激發(fā)CH反應時，將小鼠暴露于檸檬腈2天的結果如

圖1所示。由圖1可知，CH反應的激發(fā)可因吸入檸檬腈而抑制到對照的約50％(A)，而對CH反應的誘導也可明顯抑制20％左右(B)。該結果提示，嗅覺刺激可調節(jié)皮膚的免疫反應。(2)香料對CH反應激發(fā)的效果如圖2所示。該圖中比較了檸檬腈(縮短上述睡眠時間的香料)與其它香料(lyral/鈴蘭醛)的效果。由結果可知，任一種香料均抑制CH反應，但檸檬腈更明顯地強烈抑制。另外，CH反應的抑制受香料種類影響。
以上實驗結果是將每組5只小鼠的測定結果用t檢驗進行統(tǒng)計學處理的結果。(3)局部涂布香料的結果如圖3所示。從該圖可知，檸檬腈和lyral/鈴蘭醛對CH反應均沒有影響。1-2.郎罕氏細胞的染色表皮郎罕氏細胞的染色按已知的方法進行。染色的大致過程為，通過在3.8％異硫氰酸銨水溶液中37℃孵育20分鐘，從小鼠耳的真皮中分離出表皮。用丙酮固定表皮層，在小鼠雜交瘤M5/114.15.2(American Tissue Type Collection Rockville，MD，USA)的培養(yǎng)上清中進行培養(yǎng)，使之分泌抗I-AIgG，然后與熒光異硫氰酸酯(FITC)(Sigma，USA)標記的抗小鼠IgG抗體結合。用共聚焦激光掃描顯微鏡(MRC600，BioRad，USA)觀察、分析I-A抗原陽性的細胞。樣品是從每組5只小鼠中收集的。3個區(qū)域的各樣品通過空白校驗進行分析。結果提取暴露于檸檬腈后的各樣品，對I-A抗原進行染色，用共聚焦激光掃描顯微鏡進行觀察、分析，結果如表I所示(表中，括號內的數(shù)值是標準偏差(SD))。表I 1)1mm2中的郎罕氏細胞數(shù)2)μm2*p＜0.05于檸檬腈或lyral/鈴蘭醛存在下飼養(yǎng)動物后提取表皮層，對I-A抗原進行染色后，用共聚焦激光掃描顯微鏡進行分析的結果如表II所示(表中，括號內的數(shù)值是標準差(SD))。表II 1)1mm2中的郎罕氏細胞數(shù)2)μm2*p＜0.05由上表可知，暴露于檸檬腈后明顯減少了LC數(shù)(表I)。
各I-A陽性細胞的面積也因暴露于檸檬腈后明顯降低。比較香料的效果時可知，檸檬腈比lyral/鈴蘭醛的效果更強(表II)。
這些結果意味著嗅覺刺激可影響表皮郎罕氏細胞。試驗例2香料對應激負荷造成的皮膚免疫反應抑制的效果(實驗動物)使用雌性C57BL/6小鼠(7～9周齡)[購自Charles River Japan]。動物。在維持21～25℃的溫度、相對濕度40％～70％的室內進行飼養(yǎng)，每個籠子(225×338×140mm)內各5只。將吸收了香料的濾紙置于陪替氏(Petri)培養(yǎng)皿中并在其上用直徑10cm的金屬網覆蓋，將培養(yǎng)皿放置到鼠籠內，這樣讓動物吸收香料(對照使用未吸收香料的濾紙)。讓這些動物趴下后，用柔軟的細孔金屬網包裹6小時。該動物實驗是按照日本學術審議會實驗動物操作標準(National ResearchCouncil Guide Lines)得到了社內動物實驗委員會承認的。2-1.接觸性過敏反應將2，4，6-三硝基氯苯(TNCB)(3％丙酮溶液10μl)涂到小鼠左耳的內外表面，使小鼠致敏。5天后，將TNCB(1％丙酮溶液5μl)涂到小鼠右耳的內外兩表面，激發(fā)接觸性過敏反應。于第24小時、用千分尺(三豐公司制)測定左耳和右耳的厚度，通過二者測定值的差評價腫脹程度。動物暴露給香料從激發(fā)前24小時持續(xù)到測定腫脹時。限制性應激在激發(fā)24小時前負荷，激發(fā)開始后再度負荷。實驗中每組使用5只動物，使用1，3-二甲氧基-5甲基苯(DMMB購自TakasagoInternational Inc.)作香料。結果如下面的表III和圖4所示。
表III(1)測定值

(2)分散分析一元配置

表III(1)中測定值的數(shù)值是所測定的各受試動物右耳厚度與左耳厚度的差值；(2)是對上述數(shù)值進行分散分析的結果。
由以上的表III和圖4可知，無香料時，由應激負荷可抑制皮膚免疫反應，但在吸入DMMB的動物組中，沒有見到因應激引起的皮膚免疫抑制。這意味著特定的香料可防止因應激引起的皮膚免疫功能降低。2-2.郎罕氏細胞的染色用實施例1的“1-2.郎罕氏細胞的染色”中描述的同樣方法進行染色，并進行同樣地分析，結果如圖5所示。
由該圖可知，表皮中郎罕氏細胞數(shù)因應激負荷減少約30％。受試動物在應激負荷時吸收DMMB的話，其郎罕氏細胞數(shù)比應激負荷時明顯增加，其細胞數(shù)與未應激負荷的動物組程度相同。
產業(yè)上的實用性本發(fā)明提供應用某一特定揮發(fā)性物質來調節(jié)皮膚免疫功能的制劑和方法。由于這些制劑和方法可在多種多樣的化妝品和美容方法中實現(xiàn)，所以可在化妝品或化妝用具制品的制造業(yè)和美容業(yè)中利用。
說明書附圖 圖1
圖2
圖3
圖4
圖權利要求
1.一種皮膚免疫功能調節(jié)劑，它以可刺激嗅覺受體的揮發(fā)性物質為有效成分。
2.權利要求1所述的調節(jié)劑，其中，揮發(fā)性物質為可明顯改變巴比土酸誘發(fā)睡眠測定方法中受試者的睡眠時間的物質。
3.權利要求2所述的調節(jié)劑，其中，揮發(fā)性物質為可使受試者的睡眠時間與對照相比至少延長15％的物質。
4.權利要求2所述的調節(jié)劑，其中，揮發(fā)性物質可使受試者的睡眠時間與對照相比至少延長15％，且選自乙酸萜品酯、苯乙醇、沉香醇(linalool)和茴香。
5.權利要求2所述的調節(jié)劑，其中，揮發(fā)性物質為可使受試者的睡眠時間與對照相比至少縮短15％的物質。
6.權利要求2所述的調節(jié)劑，其中，揮發(fā)性物質可使受試者的睡眠時間與對照相比至少縮短15％，且選自檸檬腈、檸檬油、茉莉油、乙酸異冰片酯(iso-bornyl acetate)和葉綠醇等。
7.權利要求1所述的調節(jié)劑，其中，揮發(fā)性物質為可明顯改變誘發(fā)陰性變動(Contingent Negative Variation)(CNV)測定方法中受試者的CNV振幅面積。
8.權利要求7所述的調節(jié)劑，其中，揮發(fā)性物質為可使受試者的CNV振幅面積與對照相比至少減少10％的物質。
9.權利要求7所述的調節(jié)劑，其中，揮發(fā)性物質可使受試者的CNV振幅面積與對照相比至少減少10％，且選自香菜、1，3-二甲氧基-5-甲基苯(DMMB)、白檀木、薔薇、迷迭香、香檸檬、薰衣香、橙子和甘菊。
10.權利要求7所述的調節(jié)劑，其中，揮發(fā)性物質為可使受試者的CNV振幅面積與對照相比至少增大10％的物質。
11.權利要求7所述的調節(jié)劑，其中，揮發(fā)性物質可使受試者的CNV振幅面積與對照相比至少增大10％，且選自檸檬油、茉莉、薄荷、羅勒、丁香和八角茴香。
12.揮發(fā)性物質的應用，該物質是調制皮膚免疫功能調節(jié)劑的有效成分，可明顯改變巴比土酸誘發(fā)睡眠測定方法中受試者的睡眠時間或可明顯改變CNV測定方法中受試者的CNV振幅面積。
13.受試者皮膚免疫功能的亢進方法，包括將對于希望或有必要使皮膚免疫功能亢進的受試者為可使該免疫功能亢進的足夠量的揮發(fā)性物質，即，將可明顯延長巴比土酸誘發(fā)睡眠測定方法中受試者的睡眠時間的物質和/或可明顯縮短CNV測定方法中受試者的CNV振幅面積的物質經呼吸道施用的過程。
14.受試者皮膚免疫功能的抑制方法，包括將對于希望或有必要抑制皮膚免疫功能的受試者為可抑制該免疫功能的足夠量的揮發(fā)性物質，即，將可明顯縮短巴比土酸誘發(fā)睡眠測定方法中受試者的睡眠時間的物質和/或可明顯增大CNV測定方法中受試者的CNV振幅面積的物質經呼吸道施用的過程。
15.權利要求13或14所述的方法，它可應用于人美容中的護膚方面。
全文摘要
本發(fā)明公開了以可刺激嗅覺受體的揮發(fā)性物質、典型的如特定的香料為有效成分的皮膚免疫功能調節(jié)劑。該調節(jié)劑通過調節(jié)皮膚免疫功能,例如可起到增強皮膚的屏障功能、預防或治療皮膚的接觸性過敏癥的作用。
文檔編號A61K31/045GK1378460SQ00814020
公開日2002年11月6日 申請日期2000年10月6日 優(yōu)先權日1999年10月8日
發(fā)明者細井純一, 土屋徹 申請人:株式會社資生堂