專利名稱：蛋白粉生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白粉的生產(chǎn)方法以及含有此蛋白粉的緩釋制劑。此外，本發(fā)明涉及含有特定基料等的緩釋制劑。
背景技術(shù)：
近來，由于基因工程和細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，人們已利用大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)、酵母、動物細(xì)胞或諸如山羊、倉鼠等的活體大量生產(chǎn)蛋白質(zhì)，并且應(yīng)用于藥物用途。然而，由于這些蛋白質(zhì)對酸性條件和肽酶具有非常高的反應(yīng)活性，它們不能通過口服給藥吸收。因而它們通常通過皮下或肌內(nèi)給藥。然而，由于它們的生物半衰期通常較短，因而必須頻繁給藥。頻繁注射會給患者帶來明顯的身體負(fù)擔(dān)。
例如，生長激素(下面有時(shí)稱作GH)，一種原產(chǎn)于和分泌于腦垂體前部中的代表性激素，它是一種具有廣泛不同生理學(xué)活性的蛋白質(zhì)，例如促進(jìn)身體生長、葡萄糖和脂質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)合成代謝以及細(xì)胞增生和分化。并且GH近來已在基因重組技術(shù)領(lǐng)域中通過利用大腸埃希氏桿菌大規(guī)模生產(chǎn)，并且臨床和世界范圍地應(yīng)用于藥物用途。然而，由于生物半衰期較短，為維持有效的血液含量就必須頻繁施用GH。特別是，在垂體性侏儒的病例中，需要用幾個(gè)月至10年的時(shí)間對嬰兒或少年患者進(jìn)行長期的每日皮下給藥。
為解決蛋白質(zhì)藥劑的這種特殊問題，人們研究了各種藥物傳遞系統(tǒng)。此系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)例是可在一段長的時(shí)間內(nèi)持續(xù)釋放蛋白質(zhì)的緩釋制劑。JI-A8-217691(WO 96/07399)公開了一種緩釋制劑的生產(chǎn)方法，其中所說的緩釋制劑中含有通過使用水溶性肽型生理學(xué)活性物和氧化鋅等與生物降解性聚合物的水溶液制備的水不溶性或水微溶性多價(jià)金屬鹽。此外，JP-A 8-503950(WO 94/12158)公開了一種多孔性顆粒狀微膠囊的生產(chǎn)方法，作為緩釋制劑的生產(chǎn)方法，其中所說的緩釋制劑中含有人GH(下面有時(shí)稱作hGH)和生物降解性聚合物，此方法是通過將hGH和聚合物的有機(jī)溶劑溶液噴霧到液體氮中，這種多孔性顆粒中保留有生物學(xué)活性。另外，JP-A 10-504017(WO 95/29664)公開了一種緩釋微膠囊的生產(chǎn)方法，通過將固體碳酸鋅等分散在聚合物溶液中，然后加入生理學(xué)活性物質(zhì)(激素等)，以便使生理學(xué)活性物質(zhì)和金屬陽離子分開式地分散在生物降解性聚合物中。盡管JP-A(WO 98/27980)和JP-A 10-7538(WO 97/01331)公開了含生理學(xué)活性多肽的緩釋制劑的生產(chǎn)方法，但沒有公開將生理學(xué)活性多肽凍干的條件。
由此可見，為構(gòu)建能夠保留蛋白質(zhì)生理學(xué)活性的藥物傳遞系統(tǒng)，人們作了很多嘗試。然而，針對蛋白質(zhì)的具有較高有序結(jié)構(gòu)的特殊問題，可能存在涉及蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的問題，這些問題起因于在制劑生產(chǎn)步驟過程中的變性、制劑中蛋白質(zhì)隨時(shí)間而變化導(dǎo)致的變性和/或給藥后的體內(nèi)變性等。具體說，緩釋制劑可能具有諸如蛋白質(zhì)攝入到制劑中的效率較低、給藥初期階段藥物的過量釋放、難以控制藥物長時(shí)間的釋放、制劑給藥后藥物的血液含量低等的問題仍未解決。
然而，當(dāng)以細(xì)分粉末的形式制備蛋白質(zhì)時(shí)，預(yù)期由于分子遷移性下降可以進(jìn)一步構(gòu)建蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。
JP-A 4-500527(WO 90/13285)公開了一種細(xì)分蛋白粉的生產(chǎn)方法，通過將蛋白水溶液噴霧到液化氣中，以便使溶液冷凍，然后干燥。
此外，《藥學(xué)雜志》(Journal of pharmaceutical Science)Vol.87，p152(1998)中報(bào)道了一種通過噴霧干燥生產(chǎn)細(xì)分蛋白粉的方法。然而，此報(bào)道公開了變性程度會增加，其與噴霧形成的蛋白水溶液顆粒的粒度成相反的有關(guān)，并且應(yīng)當(dāng)添加大量表面活性劑來控制之。
另外，WO 99/48519(其在本申請優(yōu)先權(quán)日之后公開)公開了一種生理學(xué)活性多肽粉的生產(chǎn)方法，通過將水溶混性有機(jī)溶劑和/或揮發(fā)性鹽添加到生理學(xué)活性多肽水溶液中并且將溶液凍干。
此外，JP-A 9-248177公開一種干燥微生物細(xì)胞的生產(chǎn)方法，通過將微生物細(xì)胞培養(yǎng)物液滴滴落到冷卻至冰點(diǎn)以下的金屬板上，以便將細(xì)胞快速冷凍。
通常來說，凍干的冷卻速率慢于-10℃/min。例如，Iyakuhin noToketsukanso(藥物凍干)(Yoji OHOHASHI，制備和機(jī)器，第8頁，1988年1月15日，Crest有限公司出版)描述如下。“在用普通小瓶凍干時(shí)，進(jìn)行快速冷凍處理，或者使用含高濃度糖類的溶液，以致于它可以形成玻璃態(tài)，這種玻璃態(tài)不會經(jīng)常遇到除非使用特定的裝置。即，冷卻速率為0.3至5.0℃/min。”另一方面，在將水溶液噴霧到液化氣如液化氮等中的情形中，冷卻速率極快，如在液化氮中時(shí)快于-300℃/min。
本文所用的冷卻速率中的減號簡單地用來表達(dá)冷卻。因此，例如冷卻速率為-300℃/min時(shí)，是指將待測物料以每1分鐘300℃的速率冷卻，并且當(dāng)以每30秒150℃的速率冷卻待測物料時(shí)，冷卻速率表示為-300℃/min。更具體說，當(dāng)將待測物料在30秒內(nèi)從20℃冷卻至-130℃時(shí)，冷卻速率表示為-300℃/min。
與噴霧干燥類似，在包括將蛋白溶液噴霧到液化氣中、將溶液冷凍然后干燥的蛋白粉生產(chǎn)方法中，很大可能會引起蛋白質(zhì)的變性。此外，由于使用液化氣作為液體制冷劑，需要大規(guī)模和昂貴的設(shè)備來應(yīng)付隔熱和設(shè)備材料因溫度差異而熱脹冷縮、保持無菌條件、排空液化氣問題。
另外，盡管通過使用大量的表面活性劑可以獲得平均顆粒粒度為幾微米的細(xì)分蛋白粉，但產(chǎn)品的用途因使用了大量表面活性劑而受限。
因而，期望簡單和方便地提供保留有其較高有序結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定蛋白粉，無需與液化氣接觸。
發(fā)明公開本發(fā)明者為解決上述問題而進(jìn)行了研究，并且發(fā)現(xiàn)當(dāng)生產(chǎn)蛋白粉時(shí)，通過控制冷凍含蛋白溶液的冷卻速率，可以獲得保持其較高有序結(jié)構(gòu)的蛋白粉。此外，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，通過將上述獲得的蛋白粉粉化，可以獲得細(xì)分粉末。另外，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將上述獲得的蛋白質(zhì)用于生產(chǎn)緩釋制劑時(shí)，可以改進(jìn)制劑的蛋白捕獲比、給藥初期階段藥物的過量釋放以及緩釋特性。
而且，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)冷凍溶液時(shí)通過灑落(apply)或滴落含蛋白溶液來控制冷卻速率，可以獲得高度保持其較高有序結(jié)構(gòu)的蛋白粉。
此外，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，通過使用藥劑凍干時(shí)常用的冷凍-干燥器的架子(shelf)來完成上述冷凍，可以較便宜和較簡單以及方便地獲得所需的產(chǎn)品。
基于這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明者完成了本發(fā)明。
也就是說，本發(fā)明涉及(1)一種蛋白粉的生產(chǎn)方法，包括將含蛋白的溶液與致冷劑載體接觸，以約-300至-10℃/min的冷卻速率將溶液冷凍，然后干燥；
(2)根據(jù)上述(1)的方法，其中將含蛋白的溶液灑落或滴落到制冷劑載體上；(3)根據(jù)上述(2)的方法，其中灑落或滴落直徑為約0.1至40mm的滴落流體；(4)根據(jù)上述(1)的方法，其中冷凍是通過防止含蛋白溶液與液體制冷劑直接接觸來完成；(5)根據(jù)上述(1)的方法，其中向含蛋白的溶液添加揮發(fā)性鹽或水溶混性有機(jī)溶劑；(6)根據(jù)上述(5)的方法，其中揮發(fā)性鹽是乙酸銨；(7)可根據(jù)上述(1)的方法獲得的蛋白粉；(8)根據(jù)上述(7)的蛋白粉，其中蛋白質(zhì)的分子量為約5,000至1,000,000道爾頓；(9)根據(jù)上述(7)的蛋白粉，其中蛋白質(zhì)選自激素、細(xì)胞因子、造血因子、生長因子和酶；(10)根據(jù)上述(7)的蛋白粉，其中蛋白質(zhì)是生長激素或胰島素；(11)根據(jù)上述(7)的蛋白粉，其中蛋白質(zhì)以含蛋白溶液中總的α-螺旋含量計(jì)保留了45％或更多的α-螺旋；(12)一種細(xì)分蛋白粉的生產(chǎn)方法，包括將上述(7)的蛋白粉粉化；(13)根據(jù)上述(12)的方法，其中粉化進(jìn)行到致使獲得平均顆粒粒度為約0.5至20μm的細(xì)分蛋白粉；(14)一種緩釋制劑，含有可根據(jù)上述(12)的方法獲得的細(xì)分蛋白粉；(15)根據(jù)上述(14)的緩釋制劑，其中緩釋制劑的基料是得自活體的材料或合成聚合物；(16)根據(jù)上述(15)的緩釋制劑，其中得自活體的材料或合成聚合物是生物降解性聚合物；(17)一種緩釋制劑，含有乳酸/乙醇酸摩爾比為60/40至70/60乳酸/乙醇酸的乳酸/乙醇酸共聚物和生長激素；(18)一種緩釋制劑的生產(chǎn)方法，包括使用根據(jù)上述(12)的方法獲得的細(xì)分蛋白粉；(19)上述(7)的細(xì)分蛋白粉在制造緩釋制劑中的用途；(20)根據(jù)上述(1)的方法，其中不通過噴霧來冷凍含蛋白溶液；
(21)根據(jù)上述(1)的方法，其中將含蛋白的溶液以約10至250mL/5min每1300cm2的制冷劑載體的速率灑落或滴落，在灑落或滴落之前將所說的制冷劑冷卻至約-25℃或更低；(22)根據(jù)上述(1)的方法，其中干燥在減壓條件下進(jìn)行；和(23)根據(jù)上述(1)的方法，其中通過使用冷凍-干燥器的架子來進(jìn)行冷凍。
附圖簡介

圖1顯示了給免疫抑制型SD大鼠給藥hGH粉制備的微膠囊后的hGH血清含量的變化，其中hGH粉分別通過灑落[灑落量10mL/5min(-▲-)、60mL/5min(-●-)]和噴霧[噴霧量50mL/5min(-△-)、80mL/5min(-○-)]的方式將含hGH溶液冷凍而獲得。
發(fā)明的最好實(shí)施方式本發(fā)明中所用的蛋白質(zhì)可以是任何蛋白質(zhì)，如天然產(chǎn)物、合成產(chǎn)物、半合成產(chǎn)物以及通過基因重組技術(shù)生產(chǎn)的產(chǎn)物等等。此外，可以包括它們的衍生物、類似物和突變蛋白?？偟膩碚f，為獲得大量高純度的蛋白質(zhì)，經(jīng)常使用的是基因重組技術(shù)。
本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)的實(shí)例包括分子量優(yōu)選為約5,000-1,000,000道爾頓、更優(yōu)選約6,000至約200,000道爾頓的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)的具體實(shí)例包括激素、細(xì)胞因子、造血因子、生長因子等等。
上述的激素可以是具有對抗和拮抗功能任一種的激素。激素的實(shí)例包括胰島素、生長激素(GH)、促乳素、促甲狀腺激素(TSH)、促黃體素(LH)、促卵泡激素(FSH)、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、胸腺素、甲狀旁腺素(PTH)等。激素優(yōu)選是胰島素和生長激素，更優(yōu)選是生長激素。
生長激素的實(shí)例可以是得自任何物種的生長激素，優(yōu)選得自人類。盡管本發(fā)明中使用的生長激素可以得自天然來源，如從垂體前葉等中提取的生長激素，但它們優(yōu)選是基因重組型GH(JP-B 6-12996，JP-B 6-48987)，更優(yōu)選是具有與N-末端不含甲硫氨酸(methionine)的天然存在型的結(jié)構(gòu)相同的重組型hGH。這種與N-末端不含甲硫氨酸的天然存在型的結(jié)構(gòu)相同的重組型hGH可以按照J(rèn)P-A 10-72489(EP-A 812856)或WO 00/20439中描述的方法獲得。GH可以是金屬鹽(包括金屬絡(luò)合物；金屬是鋅等)，并且也可以使用基本上不含金屬的GH。作為hGH，不僅可以使用分子量為約22k道爾頓的hGH，還可以使用分子量約20k道爾頓的hGH(JP-A 7-101877，JP-A10-265404)。另外，作為hGH，還可以使用hGH的衍生物或其相關(guān)的蛋白質(zhì)(WO 99/03887)。
細(xì)胞因子，例如，包括淋巴因子和單核因子。淋巴因子的實(shí)例包括干擾素(α、β和γ)和白介素(IL-2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12)等。單核因子的實(shí)例包括白介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子(TNF)等。優(yōu)選的細(xì)胞因子是淋巴因子等，更優(yōu)選是干擾素等，特別優(yōu)選是干擾素-α。
造血因子的實(shí)例包括紅細(xì)胞生成素(EPO)、集落刺激因子(G-CSF、GM-CSF、M-CSF等)、血小板生成素(TPO)、血小板衍生生長因子、巨核細(xì)胞增效劑等。
生長因子的實(shí)例包括堿性和酸性成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)及其家族(例如，EGF、TGF-α、TGF-β、PDGF、酸性FGF、堿性FGF、FGF-9等)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)及其家族(例如，BDNF、NT-3、NT-4、CNTF、GDNF等)、胰島素樣生長因子(例如，IGF-1、IGF-2等)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)及其家族等等。
酶的實(shí)例包括超氧化物歧化酶(SOD)、尿激酶、組織纖溶酶源激活物(TPA)、天冬酰胺酶、激肽釋放酶等。
另外，本發(fā)明所用的蛋白質(zhì)包括胸腺生成素、血液胸腺因子(FTS)及其衍生物(US專利4,229,438)、其它胸腺因子[Igku no Ayumi，Vol.125，No.20，pp.835-843(1983)]等等。
本發(fā)明使用的蛋白質(zhì)優(yōu)選是激素，更優(yōu)選是生長激素和胰島素，并且特別優(yōu)選是人生長激素。
本發(fā)明中，蛋白質(zhì)可以含有金屬。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)含有金屬時(shí)，金屬的含量優(yōu)選不大于0.1％(w/w)，更優(yōu)選不大于0.01％(w/w)。由此，基本上不含金屬的生理學(xué)活性多肽是最適合于本發(fā)明的。例如，晶體胰島素通常含有少量諸如鋅、鎳、鈷和鎘等的重金屬。含0.4％(w/w)鋅的胰島素以穩(wěn)定的六聚體的形式存在，并且似乎在與可生物降解聚合物的金屬鹽的相互作用中呈相對惰性。
如果必要，可以預(yù)先除去蛋白質(zhì)中存在的金屬，作為去除蛋白質(zhì)金屬的方法，可以利用已知的方法。例如，將胰島素的酸性鹽酸水溶液對水或乙酸銨水溶液的透析并且將透析液凍干，可以提供含微量金屬的無定形胰島素。
當(dāng)需要將所需的蛋白質(zhì)從組織、體液、化學(xué)合成粗制品或重組細(xì)胞或重組真菌中純化或提純時(shí)，可以采用蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)分離或提純方法(“蛋白質(zhì)”，Kazuo SATAKE著，Asakura Shoten出版；“生理學(xué)活性肽”，PharmaciaReview，第3號，日本Pharmaceutical Society出版)。具體說，通過結(jié)合一些液相色譜法(“蛋白質(zhì)式肽的高速液相色譜法”，Nobuo UI等編)，可以高產(chǎn)量地獲得高純度的蛋白質(zhì)，同時(shí)不損失生理學(xué)活性。如果必要，可以優(yōu)選采用脫鹽步驟作為提純過程的最后一步。
本發(fā)明含蛋白溶液的溶劑沒有特別的限制，只要它可以溶解蛋白質(zhì)。優(yōu)選，溶劑具有-130℃或更高的冰點(diǎn)。其具體的實(shí)例包括水、醇(例如，甲醇、乙醇、異丙醇等)、丙酮、水與上述醇的混合溶劑、水與諸如丙酮等的有機(jī)溶劑的混合溶劑等等。優(yōu)選，使用水。有機(jī)溶劑，如醇、丙酮等，可以用作下述的“水溶混性有機(jī)溶劑”。
優(yōu)選，向使用上述溶劑的含蛋白溶液中添加揮發(fā)性鹽或水溶混性有機(jī)溶劑。通過將添加揮發(fā)性鹽或水溶混性有機(jī)溶劑而獲得的含蛋白溶液凍干，可以制備出容易處理(優(yōu)良的被處理性)和非常細(xì)(具有較小的顆粒粒度)的蛋白粉。
可以添加到含蛋白溶液中的揮發(fā)性鹽是，例如，銨鹽(如乙酸銨、碳酸氫銨、碳酸銨、氯化銨等，優(yōu)選乙酸銨)?？梢允褂脫]發(fā)性鹽的按適宜比例的摻混物。揮發(fā)性鹽的添加量相對于含蛋白溶液以摩爾比計(jì)是，例如，約1至約80倍摩爾(特別是，約10倍至約80倍摩爾)，優(yōu)選約15倍至約70倍摩爾，更優(yōu)選約15倍至約50倍摩爾，首選約15倍至約40倍摩爾。
可以添加到含蛋白溶液中的水溶混性有機(jī)溶劑的實(shí)例包括上述醇、丙酮等。可以使用具有適宜混合比的上述有機(jī)溶劑的摻混物。優(yōu)選的有機(jī)溶劑是醇，更優(yōu)選單獨(dú)使用乙醇。水溶混性有機(jī)溶劑的添加量(濃度)，以體積比計(jì)，是約0.03至0.5％(V/V)，優(yōu)選約0.06至0.25％(V/V)，更優(yōu)選約0.1至0.15％(V/V)。
向含蛋白溶液添加的水溶混性有機(jī)溶劑和/或揮發(fā)性鹽可以單獨(dú)使用，或者以摻混物的形式使用。當(dāng)使用水溶混性有機(jī)溶劑和揮發(fā)性鹽的摻混物時(shí)，可以將它們分別按照上述的量添加到含蛋白溶液中。
優(yōu)選，向含蛋白溶液添加揮發(fā)性鹽。更優(yōu)選，添加銨鹽，并且更優(yōu)選添加乙酸銨。
作冷凍處理用的含蛋白溶液的濃度是，例如0.01％(W/V)至30％(W/V)，優(yōu)選0.03％(W/V)至10％(W/V)，更優(yōu)選0.05％(W/V)至3％(W/V)等，然而對其不作特別的限制。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)是hGH時(shí)，含蛋白溶液中的hGH濃度優(yōu)選是約0.01％(W/V)至約5％(W/V)，優(yōu)選約0.05％(W/V)至約2％(W/V)，更優(yōu)選約0.05％(W/V)至約0.5％(W/V)。
作冷凍處理用的含蛋白溶液中的蛋白質(zhì)優(yōu)選是單一蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中的含蛋白溶液的冷凍和干燥方法沒有具體的限制。然而，優(yōu)選減壓干燥(例如，真空干燥)。例如，可以通過使用冷凍-干燥器(凍干器)以連續(xù)步驟的方式完成冷凍-干燥，或者可以通過冷凍-干燥器來干燥沒有使用冷凍-干燥器已獨(dú)立冷凍過的含蛋白溶液。
冷凍用的設(shè)備沒有具體的限制。然而，出于經(jīng)濟(jì)、簡單和方便生產(chǎn)蛋白粉的觀點(diǎn)，優(yōu)選使用可注射藥劑凍干時(shí)常用的冷凍-干燥器的架子(冷凍-干燥器架)。這種冷凍-干燥器的詳細(xì)介紹可見Masakazu KOBAYASHI“藥物生產(chǎn)和冷凍-干燥技術(shù)”(Seizai to Kikai，第17-23、25-35和38-46號)。根據(jù)這些文獻(xiàn)，通過使用用普通鹽水冷卻的冷凍-干燥器架子，可以將溫度降至-70℃。這些冷凍-干燥器的實(shí)例包括Kyowa Shinkuu Gijyutsu K.K.制造的機(jī)器(例如，RL系列、RLC系列、RLE系列、R2L系列、R2LW系列或Triomaster系列)；Nippon Shinkuu Gijyutsu K.K制造的機(jī)器(例如，DF系列、DFM系列)等等。此外，由于這些冷凍-千燥器的預(yù)冷凍機(jī)原本是按使物料可以在無菌和無塵條件下處理以便采用可注射制劑生產(chǎn)中的干燥器來設(shè)計(jì)的，因此這種冷凍-干燥器適合生長蛋白粉。其中使用液化氣作為冷凍-干燥器的主要制冷劑，并且經(jīng)過第二制冷劑引入，其還可以使冷凍-干燥器架的溫度降低至低于普通鹽水所達(dá)到的溫度。例如，其中使用液化氮作為主要制冷劑并且經(jīng)由氫氟醚(hydrofluoroether)(HFE3M制造)冷卻，使用HFE-7100(3M制造)時(shí)可以使溫度降至-135℃并且使用HFE-72100(3M制造)時(shí)可以使溫度降至-117℃。通過使用此方法，可以防止含蛋白溶液與液化氣的直接接觸，并且可以避免諸如必需要進(jìn)行液化氣無菌和無塵處理的難題。優(yōu)選架子溫度為約-130至-20℃，更優(yōu)選約-100至-30℃，并且更優(yōu)選約-80至-40℃。由此，通過用冷凍-干燥器架冷凍含蛋白溶液，可以使冷凍的物料很快依次轉(zhuǎn)載至真空干燥步驟。
優(yōu)選，在放在冷凍-干燥器架上的制冷劑載體上完成冷凍。制冷劑載體沒有具體的限制。然而，優(yōu)選制冷劑載體是，例如，板、盤等，當(dāng)允許含蛋白溶液灑落或滴落時(shí)優(yōu)選是盤等。上述的板、盤等不限于具有平的表面，而是可以具有不平坦或者彎曲的表面。上述的板、盤等可以由任何材料制成，只要它們可以經(jīng)得起本發(fā)明的冷卻速率。優(yōu)選，使用由金屬制成(例如，不銹鋼等)的制冷劑載體。優(yōu)選，灑落或滴落開始時(shí)的制冷劑載體(如盤)的溫度為約-25℃或更低(如-25℃至-100℃。特別是-25℃至-50℃)。此外，含蛋白溶液可以灑落或滴落在已冷凍的溶液上。灑落或滴落開始時(shí)，冷凍的含蛋白溶液的表面溫度優(yōu)選為約-25℃或更低(如-25℃至-100℃。特別是-25℃至-50℃)。制冷劑載體及冷凍的含蛋白溶液的表面溫度可以通過例如溫度傳感器[例如，熱電偶(T型Okazaki Seisakusyo制造)]測定。
當(dāng)用冷凍-干燥器來干燥沒有使用冷凍-干燥器已獨(dú)立冷卻的含蛋白溶液時(shí)，可以通過例如將冷凍的溶液在保持其冷凍狀態(tài)的情況下轉(zhuǎn)移至冷凍-干燥器架子上來完成干燥。
本發(fā)明中，可以根據(jù)含蛋白溶液的特定類型、其蛋白質(zhì)濃度、添加劑濃度等，來適宜地控制含蛋白溶液的冷卻速率。正常情況下，本發(fā)明的含蛋白溶液的冷卻速率為約-300至-10℃/min，優(yōu)選約-250至-40℃/min，更優(yōu)選-210至-40℃/min，特別是-210至-70℃/min。本發(fā)明的冷卻速率可以基于灑落或滴落之前含蛋白溶液的溫度、灑落或滴落之后含蛋白溶液在冷凍時(shí)的溫度以及到冷凍完成時(shí)所需要的時(shí)間來計(jì)算。灑落或滴落之后含蛋白溶液在冷凍時(shí)的溫度用與上述相同的溫度傳感器來測定。
為獲得上述的冷卻速率，例如，可以以約10至250mL/5min、優(yōu)選約15至200mL/5min、更優(yōu)選約20至175mL/5min每1300cm2制冷劑載體的速率將含蛋白溶液灑落或滴落，其中在灑落或滴落之前將所說的制冷劑載體冷卻至約-25℃或更低(優(yōu)選約-100至-25℃，更優(yōu)選約-100至-30℃，再優(yōu)選約-80至-40℃)。含蛋白溶液的接觸(灑落或滴落)速率可以適宜地選自上述冷卻速率可以達(dá)到的范圍。在接觸過程中，可以適宜地改變含蛋白溶液的灑落或滴落速率。在灑落或滴落期間，制冷劑的溫度可以是約-2℃等等。
本發(fā)明中，“灑落”(application)意指使含蛋白溶液從開口(如，含蛋白溶液的裝料噴嘴)以連續(xù)流體的形式與制冷劑載體接觸，但不形成液滴。
本發(fā)明中，“滴落”(dropping)意指使含蛋白溶液從開口(如，含蛋白溶液的裝料噴嘴)以液滴形式的不連續(xù)流體方式與制冷劑載體接觸。
當(dāng)灑落或滴落時(shí)，可以一次性將全部量的亟待冷凍的含蛋白溶液灑落或滴落。然而，優(yōu)選將溶液分成數(shù)份，并且將它們間斷式地灑落或滴落，以便使已冷凍部分的溫度降低，由此保持所需的冷卻速率。當(dāng)間斷式灑落或滴落含蛋白溶液時(shí)，優(yōu)選間隔一定的時(shí)間來進(jìn)行各自的灑落或滴落操作，以便制冷劑載體或已冷凍部分的溫度降低至-25℃或更低。
本發(fā)明中，“滴落流體”既指上述的不形成液滴接觸的連續(xù)流體，又指滴落時(shí)的不連續(xù)流體。當(dāng)灑落或滴落含蛋白溶液時(shí)，滴落流體的直徑(水平橫截面的最大長度)是，例如，約0.1至40mm，優(yōu)選約0.2至40mm，更優(yōu)選約0.3至10mm。盡管當(dāng)灑落或滴落含蛋白溶液時(shí)，滴落流體優(yōu)選呈柱狀，但根據(jù)開口的形狀可以呈各種形狀，如具有多角形橫截面(如三角形、正方形、五角形或六角形橫截面等)的棱柱。當(dāng)?shù)温浜鞍兹芤簳r(shí)，液滴的直徑優(yōu)選為約0.1至10mm，更優(yōu)選約0.7至7mm，再優(yōu)選約1至5mm。當(dāng)?shù)温浜鞍兹芤簳r(shí)，開口(如裝料噴嘴)的直徑優(yōu)選為約0.05至10mm，更優(yōu)選約0.1至5mm。此外，當(dāng)?shù)温浜鞍兹芤簳r(shí)，液滴的重量優(yōu)選為約0.0005至500mg，更優(yōu)選約0.2至180mg，再優(yōu)選約0.5至65mg。
本發(fā)明中，當(dāng)灑落或滴落含蛋白溶液時(shí)可以在制冷劑載體上面形成冰襯。
此外，本發(fā)明中，含蛋白溶液可以按成層的狀態(tài)冷凍。層厚優(yōu)選約0.5至100mm，更優(yōu)選約1至80mm厚，再優(yōu)選約3至50mm厚。
優(yōu)選，可以對通過本發(fā)明獲得的蛋白粉進(jìn)行粉化處理，以獲得進(jìn)一步細(xì)分的顆粒。作為粉化處理，可以使用藥品生產(chǎn)中已知的各種粉化方法。粉化方法的實(shí)例包括干粉化，如射流磨法(jet mill method)。此外，作為濕粉化，例如，將蛋白粉分散在其可溶性溶劑中，并且用聲處理(探針型或浴型)、攪拌型粉化器(Polytron(Kinemachica制造))、小型混合器、Fillmix(Tokushukika制造)、Cleamix(M Tech制造)等處理分散液，接著除去溶劑。也可以通過將蛋白粉在不溶性溶劑(如二氯甲烷等)中輕微攪拌或振動來粉化本發(fā)明方法獲得的蛋白粉。
當(dāng)將如此獲得的蛋白粉用于緩釋制劑時(shí)、優(yōu)選將蛋白粉直接添加到基料中(例如，生物降解性聚合物溶液)，接著用聲處理、攪拌型粉化器等對混合物進(jìn)行粉化處理。
例如，當(dāng)使用約9mm旋轉(zhuǎn)直徑的Polytron(Kinemachiaca制造)作為攪拌型粉化器時(shí)，優(yōu)選粉化處理在約500至40,000rpm、更優(yōu)選約1,000至35,000rpm、再優(yōu)選約5,000至30,000rpm的轉(zhuǎn)數(shù)下進(jìn)行。此時(shí)，攪拌進(jìn)行優(yōu)選約5秒至30分鐘，更優(yōu)選約10秒至20分鐘，再優(yōu)選約15秒至10分鐘。例如，當(dāng)使用9mm旋轉(zhuǎn)直徑的Polytron(Kinemachiaca制造)作為攪拌型粉化器時(shí)，優(yōu)選在約500至40,000rpm下粉化處理5秒至30分鐘，更優(yōu)選在約1,000至35,000rpm下處理約10秒至20分鐘，再優(yōu)選在約5,000至30,000rpm下處理約15秒至10分鐘。
粉化處理后的細(xì)分蛋白粉的平均顆粒粒度可根據(jù)施用粉末用的具體藥物傳遞系統(tǒng)而不同，總的來說平均顆粒粒度優(yōu)選為約0.5至20μm，更優(yōu)選約0.7至10μm，再優(yōu)選約1-5μm。本發(fā)明細(xì)分蛋白粉的平均顆粒粒度可以通過激光衍射型顆粒粒度分布分析儀(SALD 2000AShimadzu制造)來測量。在上述測量中，將細(xì)分蛋白粉分散在粉末的不溶性溶劑中(如二氯甲烷等)，接著用相同溶劑適宜稀釋至上述顆粒粒度分布分析儀可測范圍，以便測量平均顆粒粒度。
本發(fā)明生產(chǎn)的蛋白粉和細(xì)分蛋白粉，與經(jīng)本發(fā)明方法處理之前的含蛋白溶液(例如，含蛋白水溶液)中的蛋白質(zhì)比較起來，高比率地保留了蛋白質(zhì)的較高有序結(jié)構(gòu)。
用FT-IR光譜分析可以證實(shí)蛋白粉和細(xì)分蛋白粉中的蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。此分析在Carpenter等的評論中有詳細(xì)描述(歐洲藥學(xué)和生物藥學(xué)雜志(European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics)，Vol.45，pp231-238，1998)。此評論中報(bào)道了通過凍干獲得的蛋白粉和細(xì)分蛋白粉中的α-螺旋含量下降至小于蛋白水溶液中的含量，因?yàn)樽冃猿潭仍礁?，?螺旋含量的下降率越高，其中所說的α-螺旋是二級結(jié)構(gòu)中的一種。于是，可以通過本發(fā)明方法獲得的蛋白粉或細(xì)分蛋白粉中的α-螺旋含量與經(jīng)本發(fā)明方法處理之前含蛋白溶液(如含蛋白水溶液)中的α-螺旋含量之比，來定義較高有序結(jié)構(gòu)的變性程度，其中所說的α-含量通過FT-IR光譜分析來測定。
當(dāng)如上所述定義蛋白質(zhì)的變性程度時(shí)，本發(fā)明獲得的蛋白粉和細(xì)分蛋白粉中保留了優(yōu)選約45％或更多、更優(yōu)選約50％或更多的α-螺旋。
本發(fā)明獲得的保留有較高有序結(jié)構(gòu)(具體說，二級結(jié)構(gòu)，更具體說是α-螺旋)的蛋白粉和細(xì)分蛋白粉可以用于各種藥物傳遞系統(tǒng)。其給藥途徑的實(shí)例包括通過肺給藥、通過粘膜給藥(眼、口腔、鼻、子宮、陰道、直腸)、口服給藥、皮內(nèi)、肌內(nèi)或皮下注射或埋入、器官等中注射或埋入等等。蛋白粉和細(xì)分蛋白粉可以就其本身的粉狀形式給藥。或者，可以通過將它們配制在各種藥物制劑中來給藥(例如，片劑、粒劑、緩釋制劑等)，優(yōu)選緩釋制劑。緩釋制劑可以通過壓型法(compression)、噴霧驟冷法、噴霧干燥法、乳化法、相分離法(凝聚法(coacervation method))、水中干燥法(in-water dryingmethed)(S/O/W法)等使用蛋白粉或細(xì)分蛋白粉以及各種下述的基料來制備。
制備上述緩釋制劑用的基料可以是得自活體的任何基料或者通過合成獲得的基料(如，合成聚合物)。在很多情形中，使用合成聚合物。
得自活體的基料的實(shí)例包括明膠、膠原、脂肪和油類(脂質(zhì)、甘油三酸酯等)、血清中衍生的蛋白質(zhì)(白蛋白、球蛋白等)、角蛋白、殼多糖、脫乙酰殼多糖、出芽短梗霉聚糖、纖維素類(羥甲基纖維素、羧甲基纖維素等)等等。
作為聚合物，可以使用任何生物降解性聚合物和非生物降解性聚合物。然而，優(yōu)選使用生物降解性聚合物。
生物降解性聚合物的實(shí)例包括由一種或多種α-羥基羧酸(如，乙醇酸、乳酸等)、羥基二羧酸(如，蘋果酸等)、羥基三羧基(如，檸檬酸等)等通過無催化劑的脫水縮聚合成并且具有自由羧基的聚合物、其混合物、聚-α-氰基丙烯酸酯、聚氨基酸(如，聚-γ-芐基-L-谷氨酸)和馬來酸酐共聚物(如，苯乙烯/馬來酸共聚物等)。聚合物可以是均聚物或共聚物。聚合可以是無規(guī)、嵌段或接枝型的。當(dāng)上述α-羥基羧酸、羥基二羧酸和羥基三羧酸在它們的分子結(jié)構(gòu)中具有光學(xué)活性中心時(shí)，它們可以是D-、L-或DL構(gòu)型。
這些聚合物中，優(yōu)選具有自由末端羧基的生物降解性聚合物，例如由α-羥基羧酸(如，乙醇酸、乳酸等)合成的聚合物(如，乳酸/乙醇酸共聚物、聚乳酸等)和聚-α-氰基丙烯酸酯。更優(yōu)選的生物降解性聚合物是由α-羥基羧酸合成的聚合物，特別優(yōu)選乳酸/乙醇酸共聚物等。本說明書中，有時(shí)將乳酸/乙醇酸共聚物以及諸如聚乳酸和聚乙醇酸的均聚物稱作乳酸/乙醇酸聚合物。
當(dāng)所用的生物降解性聚合物是乳酸/乙醇酸聚合物(乳酸/乙醇酸共聚物或均聚物)時(shí)，其組成比(mol％)優(yōu)選為約100/0至約40/60，更優(yōu)選約85/15至50/50。
上述乳酸/乙醇酸聚合物的重均分子量優(yōu)選為約3,000至約50,000，更優(yōu)選約3,000至約25,000，再優(yōu)選約5,000至約20,000。
乳酸/乙醇酸聚合物的分散度(重均分子量/數(shù)均分子量)優(yōu)選為約1.2至約4.0，更優(yōu)選約1.5至約3.5。
就重均分子量和分散度而言，本說明書認(rèn)為前者是按照聚苯乙烯測定的，通過凝膠滲透色譜法(CPC)使用重均分子量分別為120,000、52,000、22,000、9,200、5,050、2,950、1,050、580和162的9個(gè)聚苯乙烯作為參比物，并且從中計(jì)算出后者。使用GPC柱KF804L×2(日本Showa Denko制造)和RI監(jiān)測器L-3300(日本Hitachi，Ltd.制造)，用氯仿作為流動相，進(jìn)行上述測定。
具有自由末端羧基的生物降解性聚合物是其中按GCP測定的數(shù)均分子量與按端基定量法測定的數(shù)均分子量差不多彼此一致的生物降解性聚合物。按端基定量法測定的數(shù)均分子量如下計(jì)算將約1至3g生物降解性聚合物溶解在丙酮(25ml)和甲醇(5ml)的混合溶劑中，并且將溶液快速用0.05N氫氧化鉀醇(乙)溶液滴定，同時(shí)在室溫(20℃)下攪拌，用酚酞作指示劑，測定羧基含量；按照如下等式計(jì)算端基定量法測定的數(shù)均分子量端基定量法測定的數(shù)均分子量＝2000×A/BA生物降解性聚合物的重量(g)B達(dá)到滴定終點(diǎn)時(shí)所加的0.05N氫氧化鉀(乙)醇溶液的量端基定量法測定的數(shù)均分子量是絕對值，而GPC測定的數(shù)均分子量是因各種分析條件(如，流動相類型、柱、參比物的種類、所選的切片寬度、所選的基線等)不同而變化的相對值；因此很難具有這兩個(gè)數(shù)值的絕對數(shù)值表示。然而，所述的“按GPC測定的數(shù)均分子量與按端基定量法測定的數(shù)均分子量差不多彼此一致”意指，例如，對由一種或多種α-羥基羧酸合成的聚合物來說，按端基定量法測定的數(shù)均分子量在按GPC測定的數(shù)均分子量的約0.5至約2倍、優(yōu)選約0.7至約1.5倍范圍內(nèi)。
例如，在具有自由末端羧基并且是由一種或多種α-羥基羧酸通過無催化劑的脫水縮聚聚合合成的聚合物中，按GPC測定的數(shù)均分子量和按端基定量法測定的數(shù)均分子量差不多彼此一致。另一方面，在基本上沒有自由末端羧基并且是由環(huán)狀二聚物通過使用催化劑的開環(huán)聚合合成的聚合物中，按端基定量法測定的數(shù)均分子量明顯大于按GPC測定的數(shù)均分子量(2倍或更多)。這個(gè)區(qū)別可以清楚地區(qū)分具有自由末端羧基的聚合物與沒有自由末端羧基的聚合物。
具有自由末端羧基的乳酸/乙醇酸聚合物可以通過本領(lǐng)域已知的工藝來生產(chǎn)，例如按照J(rèn)P-A 61-28521中所述的工藝(例如，通過無催化劑的脫水縮聚反應(yīng)或在無機(jī)固體酸催化劑的存在下的脫水縮聚反應(yīng))。
根據(jù)組成比或重均分子量，乳酸/乙醇酸聚合物的分解/消除率有很大的不同。通過降低乙醇酸的比率或增加分子量，可以延長生理學(xué)活性多肽釋放持續(xù)時(shí)間(例如，至約6個(gè)月)，因?yàn)榉纸?消除率通常隨乙醇酸比率降低而延遲。相反，通過增加乙醇酸的比率或降低分子量，可以縮短藥物釋放持續(xù)時(shí)間(例如，至約1周)。為獲得可以在1周至2個(gè)月期間內(nèi)有效釋放生理學(xué)活性多肽的緩釋制劑，優(yōu)選使用其組成比和重均分子量屬于上述范圍的乳酸/乙醇酸聚合物。
因此，優(yōu)選根據(jù)生理學(xué)活性多肽的所需類型和所需持續(xù)時(shí)間來選擇本發(fā)明所用的生物降解性聚合物的組成。在一個(gè)具體的實(shí)例中，例如當(dāng)使用GH作為生理學(xué)活性多肽時(shí)，生物降解性聚合物優(yōu)選是乳酸/乙醇酸聚合物，更優(yōu)選乳酸/乙醇酸共聚物。在乳酸/乙醇酸共聚物中，乳酸/乙醇酸組成比(mol％)優(yōu)選為約85/15至約50/50，更優(yōu)選約75/25至約50/50。乳酸/乙醇酸共聚物的重均分子量優(yōu)選為約8,000至約20,000，更優(yōu)選約10,000至約20,000。此外，乳酸/乙醇酸聚合物的分散度(重均分子量/數(shù)均分子量)為約1.2至約4.0，更優(yōu)選約1.5至約3.5。
所用的乳酸/乙醇酸聚合物可以通過已知方法來生產(chǎn)，例如上述公開出版物等中描述的方法。聚合物優(yōu)選通過無催化劑的脫水縮聚來生產(chǎn)。優(yōu)選，使用其中按端基定量法測定的數(shù)均分子量量與按GPC測定的數(shù)均分子差不多彼此一致的乳酸/乙醇酸聚合物(PLGA)。
此外，可以按一定比率摻混使用組成比和/或重均分子量不同的兩類乳酸/乙醇酸聚合物。典型的實(shí)例是其中乳酸/乙醇酸組成比(mol％)為約75/25且重均分子量為約10,000的乳酸/乙醇酸聚合物與其中乳酸/乙醇酸組成比(mol％)約50/50且重均分子量為約12,000的乳酸/乙醇酸共聚物的混合物。此混合物中這些共聚物的重量比優(yōu)選分別為約25/75至75/25。
本發(fā)明中所用的生物降解性聚合物可以是上述提及的生物降解性聚合物的金屬鹽。例如，可以使用WO97/01331中所述的生物降解性聚合物等的各種多價(jià)金屬鹽。優(yōu)選，可以使用乳酸/乙醇酸聚合物的多價(jià)金屬鹽等，(更優(yōu)選，鋅鹽、鈣鹽、鎂鹽等，再優(yōu)選鋅鹽等)。本發(fā)明中所用的多價(jià)金屬鹽中的金屬沒有特別的限制，只要它不會對活體產(chǎn)生不利的作用。多價(jià)金屬鹽的例子是二價(jià)鹽(如，F(xiàn)e、Zn、Cu、Ca、Mg、Al、Sn、Mn等)，三價(jià)鹽(如，F(xiàn)e、Al、Mn等)、四價(jià)鹽(如，Sn等)等等。
本說明書中，有時(shí)將生物降解性聚合物的金屬鹽也稱作生物降解性聚合物。例如，有時(shí)將乳酸/乙醇酸聚合物的多價(jià)金屬鹽也稱作乳酸/乙醇酸聚合物。
上述生物降解性聚合物的多價(jià)金屬鹽可以通過WO 97/01331中所述的方法或根據(jù)其它方法來生產(chǎn)。
當(dāng)生物降解性聚合物的多價(jià)金屬鹽是鋅鹽時(shí)，其還可以通過將生物降解性聚合物與氧化鋅在有機(jī)溶劑的存在下反應(yīng)來生產(chǎn)。例如，可以按照以下方法來生產(chǎn)生物降解性聚合物的鋅鹽。
首先，通過將生物降解性聚合物與氧化鋅共存于有機(jī)溶劑中，制備生物降解性聚合物-氧化鋅絡(luò)合物的有機(jī)溶劑溶液。在此情形中，生物降解性聚合物在溶劑中的濃度取決于其分子量或有機(jī)溶劑的類型等，例如濃度為約0.1至約80％(W/W)，優(yōu)選約1至約70％(W/W)，更優(yōu)選約2至約60％(W/W)。氧化鋅的添加量取決于有機(jī)溶劑的類型而不同，例如，以生物降解性聚合物的量計(jì)，添加量為約0.001至約2％(W/W)，優(yōu)選約0.01至約1.5％(W/W)，更優(yōu)選約0.1至約1％(W/W)，如JP-A 10-231252所述。根據(jù)向有機(jī)溶劑添加生物降解性聚合物和氧化鋅的順序，可以將粉末狀態(tài)或在有機(jī)溶劑中懸浮狀態(tài)的氧化鋅添加到通過將生物降解性聚合物溶于有機(jī)溶劑中制備的溶液中，或者相反，將生物降解性聚合物的有機(jī)溶劑溶液添加到通過將氧化鋅懸浮在有機(jī)溶劑中制備的懸浮液中?？梢詫⒍汲史勰顟B(tài)的生物降解性聚合物和氧化鋅混合，然后可以添加有機(jī)溶劑。
生產(chǎn)緩釋制劑時(shí)溶解生物降解性聚合物用的有機(jī)溶劑優(yōu)選具有不超過120℃的沸點(diǎn)。此有機(jī)溶劑的實(shí)例包括鹵化烴類(如，二氯甲烷、氯仿。四氯化碳等)、醇類(如，乙醇、甲醇、1，4-丁二醇、1，5-戊二醇等)、乙酸乙酯、乙腈等等。這些溶劑也可以是按一定比率的混合物使用。單獨(dú)使用的優(yōu)選的有機(jī)溶劑包括二氯甲烷和乙腈等。以混合物形式使用的優(yōu)選的有機(jī)溶劑，例如，鹵化烴類(如，二氯甲烷、氯仿等)與醇類(如，乙醇、甲醇、1，4-丁二醇、1，5-戊二醇等)或乙腈的組合。特別是，廣泛使用二氯甲烷和乙腈的組合。鹵化烴類相對于醇類或乙腈的混合比(體積比)為約40∶1至約1∶1，優(yōu)選約20∶1至約1∶1。具體說，優(yōu)選單獨(dú)使用鹵化烴(如，二氯甲烷等)，或使用基本上由鹵化烴與乙腈的9∶1至1∶1混合比的混合溶劑。生物降解性聚合物在溶液中的濃度取決于分子量、有機(jī)溶劑類型等而不同。例如，可以是約0.01至約80％(W/W)、優(yōu)選約0.1至約70％(W/W)、更優(yōu)選約1至約60％(W/W)。
緩釋制劑的生產(chǎn)是通過從S/O分散液中除去有機(jī)溶劑，其中將蛋白粉(S相)分散到得自活體的物料或合成聚合物(如，生物降解性聚合物)在有機(jī)溶劑(O相)中的溶液中，所說的蛋白粉(S相)是通過將已添加有水溶混性有機(jī)溶劑和/或揮發(fā)性鹽的含蛋白溶液(如，生理學(xué)活性多肽溶液)凍干獲得的。該生產(chǎn)方法是，例如，(a)水中干燥法(S/O/W法)、(b)相分離法(凝聚法)和(c)噴霧干燥法，或根據(jù)這些方法的其它方法。下面將描述生產(chǎn)微膠囊的方法，將所說的微膠囊作為緩釋制劑。
(a)水中干燥法(S/O/W法)根據(jù)此法，首先將水溶混性有機(jī)溶劑和/或揮發(fā)性鹽添加到蛋白質(zhì)的水溶液中，然后通過凍干獲得蛋白粉(S相)。將生物降解性聚合物溶解在有機(jī)溶劑中，然后將上述蛋白粉分散在所得的有機(jī)溶劑溶液中。蛋白質(zhì)與生物降解性聚合物的比(重量比)為，例如，約1∶1000至約1∶1，優(yōu)選約1∶200至約1∶5，更優(yōu)選約1∶100至約1∶5。
優(yōu)選，施加外部物理能量使蛋白粉分散和均勻粉化在有機(jī)溶劑溶液中。為此，可以使用例如超聲波輻射、渦輪機(jī)攪拌、均質(zhì)機(jī)等等。蛋白粉在有機(jī)溶劑溶液中的平均顆粒粒度優(yōu)選為約0.5至20μm，更優(yōu)選約0.7至10μm，再優(yōu)選約1至5μm，并且此通過使用本發(fā)明方法獲得的蛋白粉容易實(shí)現(xiàn)。
然后，將如此制備的有機(jī)溶劑分散液(S/O分散液)再添加到水性溶劑中(W相)中，然后施加上述相同的外部物理能量，如超聲波輻射、渦輪機(jī)攪拌、均質(zhì)機(jī)等等，形成S/O/W乳液。之后，蒸發(fā)O相的有機(jī)溶劑，得到微膠囊。水相的體積通常選擇是O相體積的約1倍至約10,000倍，優(yōu)選約2倍至約5,000倍，更優(yōu)選約5倍至約2,000倍。
可以向上述的外加水相中添加乳化劑?？梢允褂萌魏文軌蛐纬赏ǔＧ闆r下穩(wěn)定的S/O/W乳液的乳化劑。上述乳化劑的實(shí)例包括陰離子表面活性劑、非離子表面活性劑、聚氧乙烯蓖麻油的衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、羧甲基纖維素、卵磷脂、明膠、透明質(zhì)酸等。這些乳化劑可以摻混物的形式添加。乳化劑在外加水相中的濃度優(yōu)選為約0.001至20％(W/W)、更優(yōu)選約0.01至10％(W/W)、特別優(yōu)選約0.05至5％(W/W)。
通過離心或過濾回收如此獲得的微膠囊，用蒸餾水洗滌去除附著在微膠囊表面的乳化劑等，再分散于蒸餾水水中并且凍干。然后，如果必要，通過溫?zé)徇M(jìn)一步除去微膠囊中的水分和有機(jī)溶劑。溫?zé)峥梢栽跍p壓條件下進(jìn)行。對溫?zé)釛l件而言，可以在不低于生物降解性聚合物的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度且不高到會引起各個(gè)微膠囊顆粒附聚的溫度下進(jìn)行加熱和干燥。優(yōu)選，在比生物降解性聚合物的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度低10℃至比此玻璃化轉(zhuǎn)變溫度高約20℃的溫度范圍下進(jìn)行加熱和干燥。玻璃化轉(zhuǎn)變溫度定義為當(dāng)溫度以每分鐘10至20℃的速率增加時(shí)使用差式掃描量熱計(jì)獲得的中間玻璃化轉(zhuǎn)變點(diǎn)。
(b)相分離法(凝聚法)當(dāng)通過此法生產(chǎn)微膠囊時(shí)，將凝聚劑在攪拌條件下逐漸添加到上述(a)描述的S/O分散液中，以便沉淀和固化微膠囊。凝聚劑的用量為約0.01至約1,000倍體積、優(yōu)選約0.05至約500倍體積、特別優(yōu)選約0.1至約200倍體積?？梢允褂萌魏文蹌?，只要它是可與溶解生物降解性聚合物用的有機(jī)溶劑相溶混的聚合的礦物油或植物油化合物，并且它不能溶解所用的生物降解性聚合物。具體說，凝聚劑的實(shí)例包括硅油、芝麻油、大豆油、玉米油、棉籽油、椰油、亞麻子油、礦物油、正己烷和正庚烷等?？梢越Y(jié)合使用它們的兩種或更多種。過濾回收如此獲得的微膠囊，用庚烷等重復(fù)洗滌以去除凝聚劑。此外，按與上述(a)中所述的相同方式進(jìn)行洗滌，然后凍干。
在通過水中干燥法或凝聚法生產(chǎn)微膠囊時(shí)，可以添加抗附聚劑來防止顆粒附聚，可以使用的抗附聚劑的實(shí)例是，例如，水溶性多糖，如甘露糖醇、乳糖、葡萄糖、淀粉(如玉米淀粉等)、透明質(zhì)酸及其堿金屬鹽；蛋白質(zhì)，如甘氨酸、血纖蛋白、膠原；以及無機(jī)鹽，如氯化鈉和磷酸氫鈉等。
(c)噴霧干燥法當(dāng)通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)微膠囊時(shí)，通過噴嘴將上述(a)所述的S/O分散液噴霧到噴霧干燥器的干燥室中，以便使有機(jī)溶劑以細(xì)滴的形式在短時(shí)間內(nèi)揮發(fā)，以獲得微膠囊。這種噴嘴包括，例如，雙液噴嘴型、壓力式噴嘴型和旋轉(zhuǎn)盤型。如果必要，通過另一個(gè)噴嘴噴霧上述抗附聚劑的水溶液以便防止各微膠囊顆粒附聚也是有利的。如果必要，按與上述(a)中所述的相同方式洗滌如此獲得的微膠囊，接著加熱(如果必要，在減壓條件下)以去除水分和有機(jī)溶劑。
本發(fā)明的緩釋制劑優(yōu)選是細(xì)分顆粒(微粒)的狀態(tài)。因?yàn)椋忈屩苿┩ㄟ^注射針給藥(通常用于皮下注射或肌內(nèi)注射)時(shí)，以免患者感到過分疼痛。緩釋制劑的顆粒粒度為，例如，平均顆粒粒度為約0.1至300μm，優(yōu)選約1至150μm，更優(yōu)選約2至100μm。
緩釋制劑中的蛋白質(zhì)含量為，例如，約0.1至40％(W/W)、優(yōu)選約0.2至20％(W/W)。蛋白質(zhì)的平均顆粒粒度優(yōu)選不超過約0.5至20μm，更優(yōu)選約0.7至至10μm，再優(yōu)選約1至5μm。
包含在緩釋制劑中的得自活體的聚合物或合成聚合物的量為，例如，約30至99.9％(W/W)、優(yōu)選約60至97％(W/W)。更優(yōu)選約70至90％(W/W)。
蛋白質(zhì)從緩釋制劑中的初期釋放率[給藥后1天(24小時(shí))的初期釋放率]優(yōu)選不超過約50％，更優(yōu)選約1至40％，再優(yōu)選約3至35％。初期釋放率可以通過皮下給藥后第一個(gè)24小時(shí)的初期釋放量來計(jì)算。初期釋放量可以從測定緩釋制劑皮下給藥后24小時(shí)血液濃度的AUC(濃度曲線下面積)中獲得；并且將AUC值應(yīng)用到劑量-AUC的標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線上，此曲線通過含蛋白溶液的皮下給藥獲得。
例如，緩釋制劑可以以微膠囊的形式使用，或者可以使用微膠囊作為源材料來用于制備各種劑型，并且能夠以腸胃外制劑(例如，肌肉、皮下組織、器官等的注射用制劑或埋入；鼻腔、直腸、子宮等上的粘膜給藥用的制劑)、口服制劑(固體制劑，如膠囊劑(如，硬膠囊、軟膠囊等)、粒劑、粉劑等、液體制劑，如懸浮劑等)等等的形式給藥。
具體說，緩釋制劑優(yōu)選是注射用制劑。例如，在緩釋制劑是微膠囊的情況中，可以通過水懸浮液的方式來獲得注射用的實(shí)際緩釋制劑，其中將微膠囊與分散劑(例如，表面活性劑如吐溫80、HCO-60等；多糖，如羧甲基纖維素、藻酸鈉、透明質(zhì)酸等)、防腐劑(例如，對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯等)、張力劑(tonicity agent)(例如，氯化鈉、甘露糖醇、山梨糖醇、葡萄糖等)等一起懸浮。也可以通過油狀懸浮液的方式獲得注射用的實(shí)際緩釋制劑，其中將微膠囊與植物油如芝麻油、玉米油、其混合物、與磷脂如卵磷脂或中鏈脂肪酸甘油三酸酯(如Miglyol 812)一起懸浮。
當(dāng)緩釋制劑是，例如，微膠囊時(shí)，用于注射懸浮液的緩釋制劑可以選擇滿足分散度要求和可穿過注射針的顆粒粒度。例如，顆粒粒度的范圍是平均顆粒粒度為約0.1至約300μm，更優(yōu)選約1至約150μm，更優(yōu)選約2至約100μm。
制備上述微膠囊無菌制劑的方法包括(但不限于)其中整個(gè)生產(chǎn)過程為無菌的方法，其中使用γ射線作為滅菌劑的方法以及其中在制造過程中添加抗菌劑的方法。
該緩釋制劑可以安全地在哺乳動物中使用(例如，人、牛、豬、狗、貓、小鼠、大鼠、兔等)，并且具有低毒性。
緩釋制劑的適應(yīng)征取決于所用的蛋白質(zhì)而不同。當(dāng)使用胰島素作為蛋白質(zhì)時(shí)，緩釋制劑可用于預(yù)防或治療糖尿痛；當(dāng)使用干擾素-α?xí)r，可預(yù)防或治療病毒性肝炎(如C型肝炎、抗原陽性活性肝炎等)和癌癥(如腎癌、多發(fā)性骨髓瘤等)；當(dāng)使用紅細(xì)胞生成素時(shí)可預(yù)防或治療貧血(如腎滲析過程中的貧血等)；當(dāng)使用G-CSF時(shí)，可預(yù)防或治療中性白細(xì)胞減少(如，在癌癥治療中等)；當(dāng)使用IL-2時(shí)，可預(yù)防或治療癌癥(如，血管內(nèi)皮瘤等)；當(dāng)使用FGF時(shí)，可預(yù)防或治療骨折、創(chuàng)傷(如，褥瘡等)、牙周炎和胃腸潰瘍；當(dāng)使用FGF-9時(shí)，可預(yù)防或治療血小板減少癥；當(dāng)使用NGF時(shí)，可預(yù)防或治療老年性癡呆；當(dāng)使用TPA時(shí)，可預(yù)防或治療血栓形成；并且當(dāng)使用腫瘤壞死因子可預(yù)防或治療惡性腫瘤。此外，根據(jù)GH的生長激素作用，除治療垂體性侏儒外，施用含GH的緩釋制劑還可以治療特納氏綜合征、慢性腎病、軟骨發(fā)育不全、成人垂體機(jī)能減退甚至衰退，如成人生長激素缺乏(成人GHD)、AIDS等。另外，由于據(jù)報(bào)道GH適用于諸如唐氏先天愚癥、銀綜合征(Silver syndrome)、成軟骨細(xì)胞過少和幼年慢性關(guān)節(jié)炎，提供杰出的治療效果，因此含GH的緩釋制劑可以用于這些疾病。含GH的緩釋制劑還可對預(yù)防或治療充血性心力衰竭等是有效的。此外，含GH緩釋制劑可以用于，例如，AIDS患者器官移植和化學(xué)治療時(shí)的生血、營養(yǎng)改善、腎貧血(renal anenmia)、心絞痛、高脂血、肥胖、加速燒傷、損傷和潰瘍的愈合、外科侵襲(手術(shù)、外傷)/早期術(shù)后恢復(fù)、膿毒病、預(yù)防因骨質(zhì)疏松引起的骨折、因骨質(zhì)疏松引起的骨折患者早期術(shù)后恢復(fù)、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、褥瘡等等。此外，預(yù)期此制劑可有效用作用于改善體弱老人生活質(zhì)量(QOL)的抗衰老劑，或者預(yù)期可通過hGH的神經(jīng)防護(hù)活性抑制神經(jīng)變性疾病的發(fā)展并改善之(阿耳茨海默氏病、帕金森氏病和腦血管疾病等)。與每天皮下注射GH相比，通過緩釋制劑的形式配制GH，可以獲得抗這些疾病的更好的藥理學(xué)活性。
盡管緩釋制劑的劑量取決于蛋白質(zhì)的類型和含量、釋放的持續(xù)時(shí)間、目標(biāo)疾病、針對的動物種類和其它因素而不同，但劑量可以設(shè)定為任何量，只要可以在體內(nèi)維持有效濃度的蛋白質(zhì)。例如，當(dāng)緩釋制劑是為夠兩周釋放而設(shè)計(jì)的時(shí)，蛋白質(zhì)的劑量可以適宜地選擇為優(yōu)選約0.0001至約10mg/kg體重、更優(yōu)選約0.05至約1mg/kg體重每個(gè)成人。當(dāng)緩釋制劑是為夠1個(gè)月釋放而設(shè)計(jì)的時(shí)，蛋白質(zhì)的劑量可以適宜地選擇為優(yōu)選約0.0002至約20mg/kg體重，更優(yōu)選約0.1至約2mg/kg體重。
緩釋制劑的優(yōu)選的給藥次數(shù)可以適宜地選擇為每周一次，每兩周一次，每月一次，每兩個(gè)月一次等等，根據(jù)蛋白質(zhì)的類型和含量、劑型、釋放的持續(xù)時(shí)間、目標(biāo)疾病、針對的動物種類和其它因素。優(yōu)選，將緩釋制劑設(shè)計(jì)成1周釋放至2月釋放，更優(yōu)選1周至1月釋放。
例如，當(dāng)緩釋制劑在約2周的期間內(nèi)可以有效釋放蛋白質(zhì)時(shí)，優(yōu)選使用乳酸/乙醇酸摩爾比為55∶45至45∶55(例如約50∶50)的乳酸/乙醇酸聚合物作為緩釋制劑的基料。此外，優(yōu)選乳酸/乙醇酸聚合物的重均分子量為約10,000至15,000(如，13,000)。
當(dāng)緩釋制劑中作為活性成分的蛋白質(zhì)是，例如，胰島素時(shí)，每次給糖尿病患者的給藥劑量適宜地選擇為通常約0.001至約1mg/kg體重，優(yōu)選約0.01至約0.2mg/kg體重，作為優(yōu)選成分。并且優(yōu)選的給藥次數(shù)是一周一次。
當(dāng)緩釋制劑中作為活性成分的蛋白質(zhì)是GH時(shí)，劑量可以設(shè)定成任何量，只要可以在體內(nèi)維持有效濃度的GH，但取決于GH的類型和含量、釋放的持續(xù)時(shí)間、目標(biāo)疾病、針對的動物種類和其它因素而不同。就治療上述疾病而言，當(dāng)緩釋制劑是為夠兩個(gè)月釋放而設(shè)定的時(shí)，則GH的劑量，為安全給藥起見，可以適宜地選擇為約0.01至約5mg/kg體重(約0.03至約15IU/mg/kg體重)、更優(yōu)選約0.05至約1mg/kg體重(約0.15至約3IU/mg/kg體重)每個(gè)兒童或成人。優(yōu)選的給藥次數(shù)可以適宜地選擇為一周一次、每兩周一次、一月一次等，取決于GH的含量、劑型、釋放持續(xù)時(shí)間、目標(biāo)疾病、針對的動物種類和其它因素。
優(yōu)選，將緩釋制劑儲存在常溫或冷地。更優(yōu)選，將緩釋制劑在冷地儲存?！俺亍焙汀袄涞亍卑慈毡舅幍涠x。即，“常溫”指15至25℃，并且“冷地”指不超過15℃。在“冷地”，更優(yōu)選約2至8℃。
另一方面，提供可以有效釋放GH約3至5周的含GH緩釋制劑是合意的。在完成本發(fā)明的過程中，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，通過使用緩釋制劑用的特定基料，可以獲得為約3至5周釋放而設(shè)計(jì)的含GH緩釋制劑。
為約3至5周釋放而設(shè)計(jì)的含GH緩釋制劑可以按照，例如，上述的微膠囊生產(chǎn)方法來獲得?？梢酝ㄟ^任何工藝，包括本發(fā)明中的工藝，來生產(chǎn)制備微膠囊用的GH粉。GH粉的平均顆粒粒度優(yōu)選為約0.5至20μm，更優(yōu)選為約0.7至10μm，再優(yōu)選約1至5μm。另外，就GH變性程度的定義來說，GH粉保留了約45％或更多、優(yōu)選約50％或更多的α-螺旋。
作為緩釋制劑的基料，優(yōu)選使用乳酸/乙醇酸摩爾比為約60∶40至70∶30(如約65∶35)的乳酸/乙醇酸聚合物。此外，優(yōu)選乳酸/乙醇酸聚合物的重均分子量為約10,000至18,000(如，14,500)。
當(dāng)使用如此獲得的為約3至5周釋放而設(shè)計(jì)的含GH緩釋制劑作為治療上述疾病用的注射制劑時(shí)，作為活性成分的GH的劑量，為安全給藥起見，可以適宜地選擇為約0.02至約10mg/kg體重(約0.06至約30IU/mg/kg體重)、更優(yōu)選約0.1至約2mg/kg體重(約0.15至約3IU/mg/kg體重)每個(gè)兒童或成人。
實(shí)施例下面將通過以下實(shí)施例、對比實(shí)施例、參考實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)實(shí)施例的方式對本發(fā)明作更詳細(xì)描述，這些實(shí)施例不能理解為是對本發(fā)明范圍的限制。
在以下實(shí)施例中，當(dāng)難于證實(shí)冷凍時(shí)，為計(jì)算冷卻速率，計(jì)算任意單位時(shí)間(長于10秒)內(nèi)的溫度下降，并且取計(jì)算出的最大值作為冷卻速率。
實(shí)施例1冷凍牛血清白蛋白(BSA)水溶液并隨后真空干燥將20倍摩爾當(dāng)量的乙酸銨添加到BSA水溶液中(BSA的最終濃度＝2mg/ml)并且通過0.22μm濾器過濾此混合物，制備冷凍-千燥用的溶液制劑(制劑1)。在將溶液冷卻至10℃以下之后，將其具有約0.3至0.5mm流體直徑的規(guī)定量部分灑落到每5分鐘-45至-40℃下冷卻的冷凍-干燥器架的盤上(面積約1,300cm2)，并且冷凍干燥(Triomaster A04Kyowa Vacuum(冷凝容量10kg型))，以制備BSA粉。在灑落期間，盤的溫度為-40至-30℃。在1.85g乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)(乳酸/乙醇酸(摩爾比)＝約50/50，換算成聚苯乙烯的重均分子量＝約13,000)和10mg氧化鋅存在于2.7mL二氯甲烷的溶液(O)中，用Polytron(Kinemachica制造)處理140mg BSA(S)，以便使粉末分散和粉化在溶液中。在向100μl所得S/O分散液中添加2.5mL二氯甲烷之后，通過激光衍射顆粒粒度分析儀(Shimadzu制造的SALD2000A)測定細(xì)分BSA粉的平均顆粒粒度。
表1顯示了根據(jù)上述工藝通過冷凍制劑1獲得的細(xì)分BSA粉的平均顆粒粒度。通過將灑落到盤上的量調(diào)節(jié)至10mL/5min至80mL/5min，使制劑1的平均冷卻速率變至-108.7℃/min(最大-156℃/min)至-35.1℃/min(最小-32.4℃/min)。由此，可以將細(xì)分BSA粉的平均顆粒粒度控制到1.2μm至6.1μm。
表1

表1(續(xù))

實(shí)施例2冷凍BSA水溶液并隨后真空干燥按照實(shí)施例1所述的相同方式，制備制劑1的BSA水溶液。將溶液的溫度調(diào)節(jié)至室溫，并且將其具有約0.3至0.5mm流體直徑的規(guī)定量部分灑落到每5分鐘在-45至-40℃下冷卻的冷凍-干燥器架的盤上(面積約1,300cm2)，并且冷凍干燥(RL-603BSKyowa Vacuum(冷凝容量60kg型))，以無菌制備BSA粉。在灑落期間，盤的溫度為-40至-30℃。通過使用所得的BSA粉，按照實(shí)施例1所述的相同方式，測定細(xì)分BSA粉的平均顆粒粒度。
表2顯示了根據(jù)上述工藝通過冷凍制劑1獲得的細(xì)分BSA粉的平均顆粒粒度。通過將灑落到盤上的量調(diào)節(jié)至30mL/5min至60mL/5min，使制劑1的平均冷卻速率變至-98.9℃/min(最大-101.1℃/min)至-80.6℃/min(最小-70.3℃/min)。由此，可以將細(xì)分BSA粉的平均顆粒粒度控制到1.2μm至5.0μm。
表2

實(shí)施例3冷凍hGH水溶液并隨后真空干燥將20倍摩爾當(dāng)量的乙酸銨添加到基因重組型hGH中(hGH的最終濃度＝2mg/mL)并且通過0.22μm濾器過濾此混合物，制備冷凍-干燥用的溶液制劑(制劑2)。在將溶液冷卻至10℃以下之后，將其具有約0.3至0.5mm流體直徑的規(guī)定量部分灑落到每5分鐘在-45至-40℃下冷卻的冷凍-干燥器架的盤上(面積約1,300cm2)，并且冷凍干燥(Triomaster A04Kyowa Vacuum(冷凝容量10kg型))，以制備凍干粉(以下簡稱hGH粉)。在灑落期間，盤的溫度為-40至-30℃。通過使用所得的hGH粉，按照實(shí)施例1所述的相同方式測定細(xì)分hGH粉的平均顆粒粒度。
表3顯示了根據(jù)上述工藝通過冷凍制劑2獲得的細(xì)分hGH粉的平均顆粒粒度。通過將灑落到盤上的量調(diào)節(jié)至10mL/5min至86mL/5min，使制劑2的平均冷卻速率變至-201.0℃/min(最大-203.7℃/min)至-72.5℃/min(最小-54.6℃/min)。由此，可以將細(xì)分hGH粉的平均顆粒粒度控制到1.4μm至4.7μm。
表3

實(shí)施例4冷凍hGH水溶液并隨后真空干燥制備制劑2。將溫度調(diào)節(jié)至室溫，并且將其具有約0.3至0.5mm流體直徑的規(guī)定量部分灑落到每5分鐘在-45至-40℃下冷卻的冷凍-干燥器架的盤上(面積約1,300cm2)，并且冷凍干燥(RL-603BSKyowa Vacuum(冷凝容量10kg型))，以無菌制備hGH粉。在灑落期間，盤的溫度為-40至-30℃。通過使用所得的hGH粉，按照實(shí)施例1所述的相同方式，測定細(xì)分hGH粉的平均顆粒粒度。
表4顯示了根據(jù)上述工藝通過冷凍制劑2獲得的細(xì)分hGH粉的平均顆粒粒度。通過將灑落到盤上的量調(diào)節(jié)至50mL/5min至80mL/5min，使制劑2的平均冷卻速率變至-84.6℃/min(最大-87.4℃/min)至-67.3℃/min(最小-54.9℃/min)。由此，可以將細(xì)分hGH粉的平均顆粒粒度控制到2.7μm至5.5μm。
表4

實(shí)施例5A冷凍BSA水溶液并隨后真空干燥制備制劑1的BSA水溶液。將溶液的溫度調(diào)節(jié)至室溫，并且將其規(guī)定量部分以約2至3mm流體直徑的液滴形式滴加到每5分鐘在-45至-40℃下冷卻的冷凍-干燥器架的盤上(面積約1,300cm2)，并且冷凍干燥(RL-603BSKyowa Vacuum(冷凝容量60kg型))，以制備BSA粉。在滴加期間，盤的溫度為每盤滴速為60mL/5min時(shí)，盤溫度為-40至-32℃；每盤滴速為80mL/5min時(shí)，盤溫度為-32至-22℃；每盤滴速為140mL/5min時(shí)，盤溫度為-34至-9℃；每盤滴速為160mL/5℃時(shí)，盤溫度為-26至-8℃；每盤滴速為150mL/5min時(shí)，盤溫度為-22至-4℃。通過使用所得的BSA粉，按照實(shí)施例1所述的相同方式，測定細(xì)分BSA粉的平均顆粒粒度。當(dāng)每盤滴速為150mL/5min，將裝料噴嘴的2mm直徑硅管換成4mm直徑。
表5顯示了根據(jù)上述工藝通過冷凍制劑1獲得的細(xì)分BSA粉的平均顆粒粒度。通過將滴落到盤上的滴速調(diào)節(jié)至60mL/5min至160mL/5min，使制劑1的平均冷卻速率變至-92.6℃/min(最大-101.1℃/min)至-33.4℃/min(最小-32.6℃/min)。由此，可以將細(xì)分BSA粉的平均顆粒粒度控制到1.3μm至20.0μm。
表5

*換管實(shí)施例5B冷凍BSA水溶液并隨后真空干燥制備制劑1的BSA水溶液。將溶液的溫度調(diào)節(jié)至室溫，并且將其規(guī)定量部分以約2至3mm流體直徑的液滴形式連續(xù)滴加到每5分鐘在-50至-40℃下冷卻的冷凍-干燥器架的盤上(面積約1,300cm2)，并且冷凍干燥(RL-402BSKyowa Vacuum(冷凝容量40kg型))，以無菌制備BSA粉。在滴加500mL制劑1期間，盤的溫度為每盤滴速為60mL/5min時(shí)，盤溫度為-40至-31℃；每盤滴速為80mL/5min時(shí)，盤溫度為-38至-30℃；每盤滴速為120mL/5min時(shí)，盤溫度為-28至-12℃。
在1.69g乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)(乳酸/乙醇酸(摩爾比)＝約65/35，換算成聚苯乙烯的重均分子量＝約14,500)和10mg氧化鋅存在于2.7mL二氯甲烷的溶液(O)中，用Polytron(Kinemachica制造)處理300mg所得的BSA，以便使粉末分散和粉化在溶液中。在向100μl所得S/O分散液中添加2.5mL二氯甲烷之后，通過激光衍射顆粒粒度分析儀(Shimadzu制造的SALD2000A)測定細(xì)分BSA粉的平均顆粒粒度。
表6顯示了根據(jù)上述工藝通過冷凍制劑1獲得的細(xì)分BSA粉的平均顆粒粒度。通過將滴落到盤上的滴速調(diào)節(jié)至60mL/5min至120mL/5min，使制劑1的平均冷卻速率變至-93.7℃/min(最大-104.2℃/min)至-59.8℃/min(最小-57.4℃/min)。由此，可以將細(xì)分BSA粉的平均顆粒粒度控制到1.2μm至2.4μm。
表6

實(shí)施例6A冷凍hGH水溶液并隨后真空干燥制備制劑2。將溫度調(diào)節(jié)至室溫，并且將其規(guī)定量部分以約2至3mm流體直徑的液滴形式連續(xù)滴加到在-45至-40℃下冷卻的冷凍-干燥器架的盤上(面積約1,300cm2)，并且冷凍干燥(Triomaster A04Kyowa Vacuum(冷凝容量10kg型))，以制備hGH粉。在滴加期間，盤的溫度為每盤滴速為140mL/5min時(shí)，盤溫度為-38至-18℃；每盤滴速為160mL/5min時(shí)，盤溫度為-28至-2℃。通過使用所得的hGH粉，按照實(shí)施例1所述的相同方式，測定細(xì)分hGH粉的平均顆粒粒度。
表7顯示了根據(jù)上述工藝通過冷凍制劑2獲得的細(xì)分hGH粉的平均顆粒粒度。通過將滴落到盤上的滴速調(diào)節(jié)至140mL/5min至160mL/5min，使制劑2的平均冷卻速率變至-74.1℃/min(最大-79.2℃/min)至-42.6℃/min(最小-39.8℃/min)。由此，可以將細(xì)分hGH粉的平均顆粒粒度控制到1.9μm至5.9μm。
表7

實(shí)施例6B冷凍hGH水溶液并隨后真空干燥將20倍摩爾當(dāng)量的乙酸銨添加到hGH水溶液中(hGH的最終濃度＝5mg/ml)并且通過0.22μm濾器過濾此混合物，制備冷凍-干燥用的溶液制劑(制劑3)，并且還制備制劑2的hGH水溶液。將每種制劑調(diào)節(jié)至室溫，并且將其規(guī)定量部分以約2至3mm流體直徑的液滴形式連續(xù)滴加到在-50至-40℃下冷卻的冷凍-干燥器架的盤上(面積約1,300cm2)，并且冷凍干燥(RL-402BSKyowa Vacuum(冷凝容量40kg型))，以無菌制備hGH粉。在滴加期間，盤的溫度為每盤滴速為60mL/5min時(shí)，盤溫度為-35至-25℃(亟待備接觸的溶液的量1L)；每盤滴速為80mL/5min時(shí)，盤溫度為-31至-24℃(亟待備接觸的溶液的量500mL)；每盤滴速為94mL/5min時(shí)，盤溫度為約-30℃(亟待備接觸的溶液的量250mL)。通過使用所得的hGH粉，按照實(shí)施例5B所述的相同方式，測定細(xì)分hGH粉的平均顆粒粒度。
表8顯示了根據(jù)上述工藝通過冷凍制劑2和3獲得的細(xì)分hGH粉的平均顆粒粒度，當(dāng)制劑2的平均冷卻速率為-87.4℃/min(最大-95.3℃/min)至-83.5℃/min(最小-76.6℃/min)時(shí)，可以將細(xì)分hGH粉的平均顆粒粒度控制到1.3μm至1.8μm。對制劑3的細(xì)分hGH而言，當(dāng)平均冷卻速率為-93.4℃/min時(shí)，可以將細(xì)分hGH粉的平均顆粒粒度控制到1.8μm。
表8

表8(續(xù))

實(shí)施例6C冷凍hGH水溶液并隨后真空干燥制備制劑2的hGH水溶液。將此溶液的溫度調(diào)節(jié)至室溫，并且將其規(guī)定量部分以約2至3mm流體直徑的液滴形式連續(xù)滴加到在-50至-40℃下冷卻的冷凍-干燥器架的盤上(面積約1,300cm2)，以便接觸1L溶液，并且冷凍干燥(RL-402BSKyowa Vacuum(冷凝容量40kg型))，以無菌制備hGH粉。
通過使用在每盤滴速為60mL/5min或80mL/5min下獲得的hGH粉，按照實(shí)施例5B所述的相同方式，測定細(xì)分hGH粉的平均顆粒粒度。此外，通過使用在每盤滴速為120mL/5min或140mL/5min下獲得的hGH粉，按照實(shí)施例1所述的相同方式，測定細(xì)分hGH粉的平均顆粒粒度。
表9顯示了根據(jù)上述工藝通過冷凍制劑2和3獲得的細(xì)分hGH粉的平均顆粒粒度。當(dāng)接觸1LhGH水溶液時(shí)，可以通過將滴速控制到60mL/5min至140mL/5min，將細(xì)分hGH粉的平均顆粒粒度控制到1.6μm至4.0μm。
表9

表9(續(xù))

參考實(shí)施例1冷凍真空干燥BSA水溶液制備制劑1的BSA水溶液。將溶液添加到盤上，以便形成厚度為1mm、2mm或5mm的溶液層，并且冷卻至約-5％至0℃。將冷卻的BSA水溶液通過冷凍干燥器(Triomaster A04Kyowa Vacuum(冷凝容量10kg型))在-50至-40℃下冷凍，以制備冷凍干燥粉(以下簡稱BSA粉)。通過使用所得的BSA粉，按照實(shí)施例1所述的相同方式，測定細(xì)分BSA粉的平均顆粒粒度。
表10顯示了根據(jù)上述工藝通過冷凍制劑1獲得的細(xì)分BSA粉的平均顆粒粒度。上述冷凍干燥的平均冷卻速率變至大于-2.1℃/min至-1.6℃/min，并且所得細(xì)分BSA粉的平均顆粒粒度為28.9μm至35.0μm。
表10

參考實(shí)施例2冷凍真空干燥BSA水溶液制備制劑1的BSA水溶液。將溶液添加到盤上，以便形成厚度為1mm的溶液層，并且放入冷凍干燥器(Triomaster A04Kyowa Vacuum(冷凝容量10kg型))中。將溶液的溫度控制到0℃。然后，以-4℃/hr的冷卻速率冷卻冷凍-干燥器架，以便冷凍BSA溶液，接著冷凍-干燥以制備BSA粉。通過使用所得的BSA粉，按照實(shí)施例1所述的相同方式，測定細(xì)分BSA粉的平均顆粒粒度。
表11顯示了根據(jù)上述工藝通過冷凍制劑1獲得的細(xì)分BSA粉的平均顆粒粒度。上述冷凍干燥的平均冷卻速率與冷凍干燥器架相同，即-4℃/hr。此時(shí)，所得細(xì)分BSA粉的平均顆粒粒度為32.5μm。
表11

比較實(shí)施例1-6C與對比實(shí)施例1和2的結(jié)果，證實(shí)了冷卻速率越慢，細(xì)分蛋白粉的平均顆粒粒度變得越大。
實(shí)施例7冷凍hGH水溶液并隨后真空干燥制備制劑2的hGH水溶液。將此溶液調(diào)節(jié)至室溫并且將規(guī)定量部分間歇式噴霧到低于-25℃的冷凍干燥器架的盤上(面積約1,300cm2)，并且冷凍干燥(Triomaster A04Kyowa Vacuum(冷凝容量10kg型))，以制備hGH粉。通過使用此hGH粉，按照實(shí)施例1所述的相同方式，測定細(xì)分hGH粉的平均顆粒粒度。
表12顯示了根據(jù)上述工藝通過冷凍制劑2獲得的細(xì)分hGH粉的平均顆粒粒度。當(dāng)將制劑2噴向盤的噴霧速率控制到50ml/5min至100mL/5分鐘時(shí)，制劑2的平均冷卻速率變至-65.3℃/min(最大-73.9℃/min)至-37.3℃/min(最小-34.3℃/min)，并且通過將滴速控制到60mL/5min至140mL/5min，可以將細(xì)分hGH粉的平均顆粒粒度控制到1.5μm至9.5μm。
表12

實(shí)施例8生產(chǎn)含hGH的微膠囊向1.85g乳酸/乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝50/50，換算成聚苯乙烯的平均分子量值＝13,000，粘度＝0.145dL/g)和10mg氧化鋅存在于2.7mL二氯甲烷的溶液中添加140mg實(shí)施例3獲得的hGH粉，其中灑落量為10或60(每盤5min的量(mL))。然后，通過使用Polytron(可商購得自Kinemachica)將其粉化。將此S/O分散液添加到800mL聚乙烯醇的0.1％水溶液中。然后，將所得的液體攪拌并且使用均混機(jī)乳化。在室溫下攪拌3小時(shí)，使二氯甲烷蒸發(fā)，將分散液離心(約1,800rpm)，以收集微膠囊。接下來，用400mL蒸餾水洗滌微膠囊2次，接著加入0.2g D-甘露糖醇，然后冷凍干燥。此外，將所得的物質(zhì)在46℃真空下干燥3天，除去剩余的溶劑。由此，獲得兩種含hGH的微膠囊。
實(shí)施例9生產(chǎn)含hGH的微膠囊按照實(shí)施例8所述的相同方式，通過使用實(shí)施例7制備的hGH粉，獲得兩種含hGH的微膠囊，其中噴霧量為50和80(每盤5min的量(mL))。
實(shí)施例10生產(chǎn)含hGH的微膠囊向1.69g乳酸/乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸(摩爾比)＝約65/35，換算成聚苯乙烯的平均分子量值＝14,500)和10mg氧化鋅存在于2.7mL二氯甲烷的溶液中添加300mg通過在94mL/5min(亟待接觸的量250mL)滴速下冷凍實(shí)施例6B的制劑2并且干燥而獲得的hGH粉。然后，通過使用Polyron(可商購得自Kinemachica)將其粉化。將此S/O分散液添加到800mL聚乙烯醇的0.1％水溶液中。然后，將所得的液體攪拌并且使用均混機(jī)乳化。在室溫下攪拌3小時(shí)，使二氯甲烷蒸發(fā)，將分散液離心(約1,800rpm)，以收集微膠囊。接下來，用400mL蒸餾水洗滌微膠囊2次，接著加入0.2g D-甘露糖醇，然后冷凍干燥。此外，將所得的物質(zhì)在46℃真空下干燥3天，除去剩余的溶劑。由此，獲得兩種含hGH的微膠囊。
實(shí)施例11生產(chǎn)含hGH的微膠囊向1.69g乳酸/乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸(摩爾比)＝約65/35，換算成聚苯乙烯的平均分子量值＝14,500)和10mg氧化鋅存在于2.7mL二氯甲烷的溶液中添加300mg通過在80mL/5min(亟待接觸的量100mL)滴速下冷凍實(shí)施例6B的制劑3并且干燥而獲得的hGH粉。然后，通過使用Polytron(可商購得自Kinemachica)將其粉化。將此S/O分散液添加到800mL聚乙烯醇的0.1％水溶液中。然后，將所得的液體攪拌并且使用均混機(jī)乳化。在室溫下攪拌3小時(shí)，使二氯甲烷蒸發(fā)，將分散液離心(約1,800rpm)，以收集微膠囊。接下來，用400mL蒸餾水洗滌微膠囊2次，接著加入0.2g D-甘露糖醇，然后冷凍干燥。此外，將所得的物質(zhì)在46℃真空下干燥3天，除去剩余的溶劑。由此，獲得兩種含hGH的微膠囊。
實(shí)施例12生產(chǎn)含hGH的微膠囊向1.69g乳酸/乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸(摩爾比)＝約65/35，換算成聚苯乙烯的平均分子量值＝14,500)和10mg氧化鋅存在于2.565mL二氯甲烷的溶液中添加300mg通過在94mL/5min(亟待接觸的量250mL)滴速下冷凍實(shí)施例6B的制劑2并且干燥而獲得的hGH粉。然后，通過使用Polytron(可商購得自Kinemachica)將其粉化。將此S/O分散液添加到800mL聚乙烯醇的0.1％水溶液中。然后，將所得的液體攪拌并且使用均混機(jī)乳化。在室溫下攪拌3小時(shí)，使二氯甲烷蒸發(fā)，將分散液離心(約1,800rpm)，以收集微膠囊。接下來，用400mL蒸餾水洗滌微膠囊2次，接著加入0.2g D-甘露糖醇，然后冷凍干燥。此外，將所得的物質(zhì)在46℃真空下干燥3天，除去剩余的溶劑。由此，獲得兩種含hGH的微膠囊。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1體內(nèi)釋放特性將實(shí)施例8和9獲得的微膠囊給免疫抑制型SD大鼠(雄性，6周齡)皮下給藥(6mg量的hGH/大鼠)。然后，隨時(shí)間經(jīng)過陸續(xù)收集大鼠血液。通過放射免疫測定(可從EIKEN CHEMICAL有限公司按Ab珠HGH的名稱商購獲得)測定血清hGH，以評價(jià)hGH釋放特性。在微膠囊第一次給藥之前3天，皮下注射0.4mg/大鼠量的PrografTM(可從Fujisawa藥劑有限公司商購獲得)，在微膠囊第一次給藥時(shí)注射0.2mg/大鼠量的PrografTM，并且在第一個(gè)給藥之后第4天、第7天、第11天和第14天時(shí)，皮下注射0.2mg/大鼠量的PrografTM，由此制備免疫抑制型SD大鼠。結(jié)果見圖1。
從圖1的結(jié)果中明顯看出，施用通過灑落獲得的hGH粉制備的微膠囊后，血液hGH含量高于施用通過噴霧獲得的hGH粉制備的微膠囊后的血液hGH。這個(gè)結(jié)果表明，使用通過灑落獲得的hGH制備的微膠囊制劑具有更高的生物利用性。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2通過FT-IR分析細(xì)分蛋白粉的較高有序結(jié)構(gòu)通過FT-IR(《藥物科學(xué)雜志》，Vol.87，pp.1412-1420(1998))分析兩種hGH粉的較高有序結(jié)構(gòu)，即實(shí)施例4獲得的hGH粉，其中灑落量為80(每盤5min的量(mL))和實(shí)施例7獲得的hGH，其中噴霧量為80(每盤5min的量(mL))。結(jié)果以平均±S.D(n＝3)示于表13中。從表1中可以看出，實(shí)施例4通過灑落獲得的hGH粉中的α-螺旋含量高于實(shí)施例7通過噴霧獲得的hGH粉。由于hGH在重水中的α-螺旋含量為59％，因此與重水中的α-螺旋含量相比，實(shí)施例7通過噴霧獲得的hGH粉保留了39％的α-螺旋。另一方面，與重水中的α-螺旋含量相比，實(shí)施例4通過灑落獲得的hGH粉保留了59％的α-螺旋。
表13

工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明，可以簡單和方便地生產(chǎn)出可高度保留其較高有序結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定蛋白粉，而無需與液化氣體接觸。因此，與通過在液化氣中噴霧含蛋白溶液以便將溶液冷凍然后干燥來生產(chǎn)細(xì)分蛋白粉的工藝相比，無需大規(guī)模和昂貴的設(shè)備來應(yīng)付隔熱和設(shè)備材料因溫度差異而熱脹冷縮、保持無菌條件、排空液化氣問題。
此外，通過簡單和方便的粉化處理便可以將本發(fā)明獲得的蛋白粉轉(zhuǎn)變成細(xì)分蛋白粉，并且通過使用此細(xì)分蛋白粉，可以提供緩釋制劑，此緩釋制劑可以長時(shí)間地提供穩(wěn)定的高血液含量的蛋白質(zhì)。
另外，當(dāng)使用乳酸和乙醇酸摩爾比為約60∶40至70∶30的乳酸-乙醇酸共聚物作為基料生產(chǎn)含生長激素的制劑時(shí)，可以生產(chǎn)出能夠在約1個(gè)月內(nèi)釋放生長激素的緩釋制劑。
權(quán)利要求
1.一種蛋白粉的生產(chǎn)方法，包括將含蛋白的溶液與致冷劑載體接觸，以約-300至-10℃/min的冷卻速率將溶液冷凍，然后干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中將含蛋白的溶液灑落或滴落到制冷劑載體上。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中灑落或滴落直徑為約0.1至40mm的滴落流體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中冷凍是通過防止含蛋白溶液與液體制冷劑直接接觸來完成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中向含蛋白的溶液添加揮發(fā)性鹽或水溶混性有機(jī)溶劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中揮發(fā)性鹽是乙酸銨。
7.可根據(jù)權(quán)利要求1的方法獲得的蛋白粉。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的蛋白粉，其中蛋白質(zhì)的分子量為約5,000至1,000,000道爾頓。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的蛋白粉，其中蛋白質(zhì)選自激素、細(xì)胞因子、造血因子、生長因子和酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的蛋白粉，其中蛋白質(zhì)是生長激素或胰島素。
11.根據(jù)權(quán)利要求7的蛋白粉，其中蛋白質(zhì)以含蛋白溶液中總的α-螺旋含量計(jì)保留了45％或更多的α-螺旋。
12.一種細(xì)分蛋白粉的生產(chǎn)方法，包括將權(quán)利要求7的蛋白粉粉化。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中粉化進(jìn)行到致使獲得平均顆粒粒度為約0.5至20μm的細(xì)分蛋白粉。
14.一種緩釋制劑，含有可根據(jù)權(quán)利要求12的方法獲得的細(xì)分蛋白粉。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的緩釋制劑，其中緩釋制劑的基料是得自活體的材料或合成聚合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的緩釋制劑，其中得自活體的材料或合成聚合物是生物降解性聚合物。
17.一種緩釋制劑，含有乳酸/乙醇酸摩爾比為60/40至70/60的乳酸/乙醇酸共聚物和生長激素。
18.一種緩釋制劑的生產(chǎn)方法，包括使用根據(jù)權(quán)利要求12的方法獲得的細(xì)分蛋白粉。
19.權(quán)利要求7的細(xì)分蛋白粉在制造緩釋制劑中的用途。
全文摘要
一種方便生產(chǎn)可高度保留較高有序結(jié)構(gòu)的蛋白粉的方法,包括將含蛋白的溶液以約－300至－10℃/min的冷卻速率冷凍,然后干燥。
文檔編號A61K9/19GK1384751SQ00814866
公開日2002年12月11日 申請日期2000年9月14日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月17日
發(fā)明者山縣豐, 道圓隆行, 淺川直樹, 高田重行 申請人:武田藥品工業(yè)株式會社