專利名稱：3－亞甲基甾族化合物衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有治療作用的新的3-亞甲基甾族化合物衍生物，并且涉及含有3-亞烷基甾族化合物的藥物制劑的制備。
已知并且要求過在甾族化合物骨架的3位具有亞甲基取代基并且具有1-2或4-5雙鍵的甾族化合物用于治療用途(分別參見BE 696,235和BE 654,772)。推測的醫(yī)療適應(yīng)癥是根據(jù)合成代謝的雌激素的和孕激素作用。這些化合物中沒有一種做到預(yù)期有這樣的用途，并且沒有預(yù)期在其它領(lǐng)域有作為藥物的用途，盡管很多疾病仍然保持用現(xiàn)在可獲得的藥物進行不令人滿意的治療的狀況。特別地，免疫系統(tǒng)疾病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和自身免疫疾病需要更好的藥物。皮質(zhì)甾類物質(zhì)具有治療這些疾病的一定用途，但是就藥效和數(shù)量或者副作用的嚴(yán)重程度方面需要改進。
本發(fā)明提供3-亞甲基甾類衍生物及其前體藥物，所述甾類衍生物具有通式1 式1其中R1是H或者與R3一起形成β-環(huán)氧化物或者如果存在5-10或4-5雙鍵則R1不存在；R2是(C1-C5)烷基或CF3；R3是βH，βCH3或者與R1一起形成β-環(huán)氧化物或者如果存在5-10雙鍵則R3不存在；R4是H，低級烷基；
Y是[H，H][OH，H]，＝O，[OH，低級烷基]，[OH，(C2-C5)鏈烯基]，[OH，(C2-C5)鏈炔基]或者(C1-C6)亞烷基，其中所述烷基、鏈烯基、鏈炔基和亞烷基任選地被鹵化；或者＝NOR5，其中R5是H，低級烷基。
虛線代表任意的雙鍵。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的化合物是那些化合物，其中R4是H并且Y是[OH，H]，＝O，[OH，低級烷基]，[OH，(C2-C5)鏈烯基]，[OH，(C2-C5)鏈炔基]或(C1-C6)亞烷基，其中所述烷基、鏈烯基、鏈炔基和亞烷基可以任選地被鹵化。
本說明書中的術(shù)語具有下面的定義低級烷基是優(yōu)選具有1-6個碳原子的支鏈或直鏈烷基，象己基，異丁基，叔丁基，丙基，異丙基，乙基和甲基。最優(yōu)選的是具有1-3個碳原子的烷基。
(C1-C5)烷基是具有1-5個碳原子的支鏈或直鏈烷基，例如甲基、乙基、異丙基、丁基、仲丁基、叔丁基等；優(yōu)選的是具有1-3個碳原子的烷基。
(C2-C5)鏈烯基是具有2-5個碳原子的支鏈或直鏈鏈烯基，例如乙烯基，2-丁烯基等。優(yōu)選的是具有2-3個碳原子的鏈烯基。
(C2-C5)鏈炔基是具有2-5個碳原子的支鏈或直鏈鏈炔基，例如乙炔基和丙炔基等。優(yōu)選的是具有2-3個碳原子的鏈炔基。
(C1-C5)亞烷基是具有1-5個碳原子的支鏈或直鏈亞烷基，例如次甲基、亞丁基等。優(yōu)選的是具有2-3個碳原子的亞烷基。
鹵原子是氟、氯、溴和碘。
前體藥物是設(shè)計用來在接受者體內(nèi)形成用于治療的本發(fā)明的化合物。一般情況下，這樣的前體藥物是17-羥基官能團的酯或醚。
本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案是如上所述具有5-10雙鍵的化合物。最優(yōu)選的是化合物(7α，17α)-7-甲基-3-亞甲基-19-去甲孕甾-5(10)-烯-20-炔-17-醇。本發(fā)明排除下面的化合物(7α，17β)-7α-甲基-3-亞甲基-4-雌甾烯-17-醇，(7α，17α)-7-甲基-3-亞甲基-19-去甲孕甾-4-烯-17-醇，(7α，17α)-7-甲基-3-亞甲基-19，21-二去甲孕甾-4-烯-17-醇，(7α)-17-酮基-7-甲基-3-亞甲基-4-雌甾烯(estrene)，(7α，17α)-7-甲基-3-亞甲基-19-去甲孕甾-4-烯-20-炔-17-醇，17β-羥基-7α-甲基-3-亞甲基-17α-丙烯-2-基-4-雌甾烯以及17β-羥基-7α-甲基-3-亞甲基-17α-丁烯-2-基-4-雌甾烯。放棄的這部分涉及BE 696,235中的公開。
通過用間-氯過氧苯甲酸氧化其中符號具有如上定義的式2的化合物，能夠制備本發(fā)明的環(huán)氧化物化合物(R1和R3一起形成β-O-) 式2通過進行維悌希(wittig)反應(yīng)，使甲基三苯基鏻溴化物和叔丁醇鉀與相應(yīng)的3-酮基母體甾族化合物反應(yīng)，能夠獲得本發(fā)明化合物中的3-亞甲基基團，所述3-酮基母體甾族化合物特征在于式3，其中Y2和Y一樣，如上定義，除了其不是＝O并且其它符號具有如上定義的意義。 式3通過其中符號如上定義的式4的17-酮基衍生物的3-縮酮衍生物與烷基三苯基鏻溴化物進行維悌希反應(yīng)，之后水解3-縮酮官能團，能夠制備本發(fā)明的17-亞烷基化合物。通過將其中符號具有如上定義的意義的式4的3-縮酮化合物的17-酮基部分進行Wolff-Kishner還原，可以制備Y＝H，17位是H的本發(fā)明的化合物(式2)。通過17-酮基官能團(式4)與羥胺衍生物的縮合作用可以制備本發(fā)明的17-肟衍生物。通過將17-酮基化合物(Y＝O，式4)的16-位烷基化可以制備本發(fā)明的16-烷基化合物。 式4本領(lǐng)域已知用于轉(zhuǎn)化起始物的上述試劑以及它們與化合物反應(yīng)的方式，但是還沒有應(yīng)用于要制備以獲得本發(fā)明的化合物的這組化合物。通過文獻中描述的方法可以獲得起始物。特別相關(guān)的參考文獻是Van Vliet等，Recl.Trav.Chim.Pays-Bas；EN；105；4；1986；111-115，其全文引入本說明書作為參考。特別地，其中描述了通過用例如PtO2/H2將其中Y2是[OH，鏈烯基]或者[OH，鏈炔基]并且其它符號具有如上定義的式3的化合物催化氫化，能夠獲得其中Y2是[OH，低級烷基]并且其它符號具有如上定義的式3的17-烷基-3-酮基衍生物。
通過從將式6的4-烯-3-酮衍生物進行Birch還原后形成的化合物的混合物中純化，能夠獲得式5的衍生物，其中所述式5和式6中的符號都具有上述定義。 式5 式6通過雙鍵異構(gòu)化作用(根據(jù)van Vliet等1986所述方法)，能夠從式7的化合物獲得其中R3是H并且其它符號具有如上定義的式6的4-烯-3-酮衍生物。 式7
根據(jù)Grunwell等的方法，甾族化合物(Steroids)Vol.27，第759-771頁，1976，其公開內(nèi)容在此引作參考，能夠獲得其中R3是甲基并且其它符號具有如上定義的式6的4-烯-3-酮衍生物。
根據(jù)van Vliet等1986所述能夠準(zhǔn)備獲得作為起始物的式7的化合物的其它方法。
式1定義的化合物的用途是用于哺乳動物的免疫調(diào)節(jié)。本發(fā)明的化合物可以特別用于關(guān)節(jié)疾病的治療，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和自身免疫疾病(AIDs)，例如斯耶格倫(Sjgren’s) 綜合癥和系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)。其也能夠預(yù)防性地用于這樣的疾病。此外，根據(jù)本發(fā)明的化合物能夠用于制備含有本發(fā)明的化合物作為活性成分的藥物。
本發(fā)明還涉及含有混合有一種或多種藥學(xué)可接受助劑的本發(fā)明的甾族化合物的藥物組合物，所述助劑例如是標(biāo)準(zhǔn)參考Gennaro等，Remmington’s制藥科學(xué)(Remmington’s Pharmaceutical Sciences)，(第18版，Mack出版公司，1990，特別參見第8部分藥物制劑及其制備(Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture))中描述的那些?？梢詫⒁环N或多種本發(fā)明的甾族化合物與一種或多種藥學(xué)可接受的助劑的混合物壓制成固體劑量形式，例如丸劑，片劑，或者加工成膠囊或栓劑。借助藥學(xué)上合適的液體，也可以以溶液、懸浮液、乳狀液形式的注射劑型或者作為噴霧劑例如鼻用噴霧劑來施用本發(fā)明化合物。為了制備劑量單位，例如片劑，可以使用常規(guī)的添加劑例如填料、著色劑、聚合物粘合劑等的。一般情況下，可以使用不干擾活性化合物功能的任何藥學(xué)可接受添加劑。本發(fā)明的甾族化合物也可以包含在植入物、貼劑、凝膠和用于延緩釋放的任何其它制劑中。
可以與組合物一起施用的合適的載體包括乳糖、淀粉、纖維素衍生物等等，或者合適量的它們的混合物。
另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的甾族化合物制備用于調(diào)節(jié)哺乳動物的免疫系統(tǒng)的藥物的應(yīng)用。更具體地說，本發(fā)明涉及本發(fā)明的甾族化合物制備用于治療關(guān)節(jié)炎疾病例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和自身免疫疾病(AIDs)例如斯耶格倫綜合癥和系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的藥物的應(yīng)用。也可制備這樣的藥物用于這樣的疾病的預(yù)防性應(yīng)用。通過遵照各國家健康委員會的規(guī)章，優(yōu)選適當(dāng)?shù)刂苽渌幬铮貏e用于對人的治療。3-亞甲基甾族化合物衍生物(7α，17β)-7α-甲基-3-亞甲基-4-雌甾烯-17-醇，(7α，17α)-7-甲基-3-亞甲基-19-去甲孕甾-4-烯-17-醇，(7α，17α)-7-甲基-3-亞甲基-19，21-二去甲孕甾-4-烯-17-醇，(7α)-17-酮-7-甲基-3-亞甲基-4-雌甾烯，(7α，17α)-7-甲基-3-亞甲基-19-去甲孕甾-4-烯-20-炔-17-醇，17β-羥基-7α-甲基-3-亞甲基-17α-丙烯-2-基-4-雌甾烯以及17β-羥基-7α-甲基-3-亞甲基-17α-丁烯-2-烯-4-雌甾烯的用途在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
此外，本發(fā)明涉及治療關(guān)節(jié)炎疾病例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和自身免疫疾病(AIDs)例如斯耶格倫綜合癥和系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，包括對患者施用一種上述化合物(以合適的藥物劑量形式)。
本發(fā)明甾族化合物的劑量范圍是每次對需要治療受試者施用0.001-100mg。
所以實際應(yīng)用本發(fā)明的化合物的劑量單位可以含有0.001-100mg的活性成分。
可以證明并且在下面的方法中利用本發(fā)明化合物的免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)。
在延遲型過敏性(DTH)過程中，在小鼠體內(nèi)可以觀察到化合物對產(chǎn)生免疫反應(yīng)的作用(實施例16中詳細說明)。簡要地說，每天施用化合物并且接著用佐劑中的抗原對動物接種免疫。7天之后，通過局部注射抗原(大多數(shù)是在足上注射)局部攻擊動物，并且測量響應(yīng)抗原輸入而隨后產(chǎn)生的局部腫脹。
腫脹的程度與抗激發(fā)抗原的免疫應(yīng)答的產(chǎn)生相關(guān)。通過比較處理組和安慰劑處理組，可以確定本發(fā)明的化合物對產(chǎn)生腫脹的抑制作用。作為參照處理，可以利用施用糖皮質(zhì)激素。
還在關(guān)節(jié)炎小鼠身體上測試了本發(fā)明的化合物的作用。
在此方法中，用佐劑中大部分來自牛軟骨的II型膠原對小鼠免疫接種。三星期之后，用相同的抗原加強免疫。加強反應(yīng)之后大約7-10天，可以觀察到關(guān)節(jié)水腫(特別是后爪和前爪)。腫脹快速擴展導(dǎo)致紅腫、炎癥和正常功能畸變。通過X-射線分析可以觀察到正常關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的破壞。對這些關(guān)節(jié)進行組織學(xué)檢查，可以觀察到導(dǎo)致正常軟骨結(jié)構(gòu)破壞的嚴(yán)重炎癥。可以將觀察到的改變的程度分成等級；而且，也可以將組織學(xué)改變程度分成等級。
此外，對非肥胖糖尿病(NOD)-小鼠可以觀察到本發(fā)明化合物的作用。
在此過程中，小鼠自發(fā)地逐漸地產(chǎn)生自身免疫疾病，伴隨的癥狀類似于人胰島素依賴型糖尿病(IDDM)和斯耶格倫綜合癥。
斯耶格倫綜合癥的特征在于在唾液腺和淚腺中產(chǎn)生浸潤。在NOD小鼠中，特別是唾液腺以逐漸產(chǎn)生浸潤為特征。本發(fā)明的化合物劑量依賴地抑制下頜下腺中這些浸潤物的產(chǎn)生。
IDDM的特征在于在胰腺中產(chǎn)生浸潤物，導(dǎo)致產(chǎn)生胰島素的胰島的破壞。
所有這些胰島都逐漸破壞之后，不再產(chǎn)生胰島素，導(dǎo)致IDDM的發(fā)生。
下面的實施例詳細說明本發(fā)明。
實施例1(7α，17α)-7-甲基-3-亞甲基-19-去甲孕甾-5(10)-烯-20-炔-17-醇的制備氮氣下，向攪拌著的叔丁醇鉀(7.9g，70.4mmol)的130ml無水THF溶液中加入甲基三苯基鏻溴化物(26.4g，73.9mmol)。將該黃色懸浮液在室溫下攪拌45分鐘。向該懸浮液中快速加入(大約30秒)20g、即64mmol 7-甲異炔諾酮的200ml無水THF溶液，產(chǎn)生微放熱反應(yīng)(從20℃至33℃)。該黃色反應(yīng)混合物在室溫下攪拌30分鐘，倒入冰-水(700ml)中并且用乙酸乙酯(700ml)萃取。有機層用水(300ml)洗滌，干燥(Na2SO4)并且蒸發(fā)至干，得到41.8g黃色油狀物。
使用甲苯/乙酸乙酯95/5(v/v％)作為洗脫劑進行柱層析，得到19.5g無色油狀物，其中含有大約90％(7α，17α)-7-甲基-3-亞甲基-19-去甲孕甾-5(10)-烯-20-炔-17-醇和10％異構(gòu)Δ4衍生物。使用庚烷/石油醚作為溶劑進行重結(jié)晶(3次)，得到白色固體標(biāo)題化合物(6.44g，產(chǎn)率32％)，mp91.6℃。
實施例2(7α，17β)-7-甲基-3-亞甲基雌甾-5(10)-烯-17-醇的制備氮氣下，向攪拌著的叔丁醇鉀(1.26g，11.2mmol)的20ml無水THF溶液加入甲基三苯基鏻溴化物(4.21g，11.8mmol)。將該黃色懸浮液在室溫下攪拌45分鐘。向該懸浮液中快速加入(7α，17β)-7-甲基-3-酮基-雌甾-5(10)-烯-17-醇(3.4g，11.8mmol)的25ml無水THF溶液。該黃色反應(yīng)混合物在室溫下攪拌30分鐘，倒入冰-水中并且用乙酸乙酯萃取。有機層用水洗滌，干燥(Na2SO4)并且蒸發(fā)至干，得到5.3g標(biāo)題化合物，為黃色油狀物。使用甲苯/乙酸乙酯95/5(v/v％)作為洗脫劑進行柱層析，得到2.3g無色油狀物。使用庚烷/石油醚進行結(jié)晶，得到白色固體(7α，17β)-7-甲基-3-亞甲基雌甾-5(10)-烯-17-醇(1.47g，44％)，mp111.8℃。
實施例3(5β，7α，17α)-5，10-環(huán)氧-7-甲基-3-亞甲基-19-去甲孕甾-20-炔-17-醇的制備氮氣下在15ml無水二氯甲烷中攪拌根據(jù)實施例1獲得的化合物(7α，17α)-7-甲基-3-亞甲基-19-去甲孕甾-5(10)-烯-20-炔-17-醇(390mg，1.26mmol)。將該溶液冷卻到0℃并且加入間-氯過氧苯甲酸(1.26mmol，310mg 70％ mcpba)。該反應(yīng)混合物在0℃下攪拌2小時，用飽和硫代硫酸鈉溶液、飽和碳酸氫鈉溶液和飽和氯化鈉溶液洗滌，干燥(Na2SO4)并且蒸發(fā)至干，得到450mg粗產(chǎn)物(5β，7α，17α)-5，10-環(huán)氧-7-甲基-3-亞甲基-19-去甲孕甾-20-炔-17-醇。使用庚烷/乙酸乙酯95/5(v/v％)為洗脫劑進行柱層析，得到純的標(biāo)題化合物(150mg，37％)，為泡沫狀物質(zhì)。
實施例4
(5β，7α，17β)-5，10-環(huán)氧-7-甲基-3-亞甲基雌甾-17-醇的制備氮氣下在15ml無水二氯甲烷中攪拌根據(jù)實施例2獲得的化合物(7α，17β)-7-甲基-3-亞甲基雌甾-5(10)-烯-17-醇(350mg，1.22mmol)。將該溶液冷卻到0℃后加入間-氯過氧苯甲酸(1.22mmol，301mg 70％mcpba)。該反應(yīng)混合物在0℃下攪拌75分鐘，用飽和硫代硫酸鈉溶液、飽和碳酸氫鈉溶液和飽和氯化鈉溶液洗滌，干燥(Na25O4)并且蒸發(fā)至干，得到370mg粗產(chǎn)物(5β，7α，17β)-5，10-環(huán)氧-7-甲基-3-亞甲基雌甾-17-醇。使用庚烷/乙酸乙酯95/5(v/v％)為洗脫劑進行柱層析，得到進一步純化的標(biāo)題化合物(230mg，63％)。使用庚烷/乙酸乙酯95/5(v/v％)結(jié)晶，得到純的標(biāo)題化合物(120mg，33％)，為白色固體，mp.125℃。
實施例5(5α，7α，17α)-7-甲基-3-亞甲基-19-去甲孕甾-20-烯-17-醇的制備氮氣下，向攪拌著的叔丁醇鉀(196mg，1.75mmol)的2ml無水THF溶液中加入甲基三苯基鏻溴化物(688mg，1.93mmol)。將該黃色懸浮液在室溫下攪拌45分鐘。向該懸浮液中快速加入(5α，7α，17α)-7-甲基-3-酮基-19-去甲孕甾-20-烯-17-醇(220mg，0.7mmol)的3ml無水THF溶液。該黃色反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2.5小時，倒入冰-水中并且用乙酸乙酯萃取。有機層用水洗滌，干燥(Na2SO4)并且蒸發(fā)至干，得到500mg油狀物。
使用甲苯/乙酸乙酯95/5(v/v％)作為洗脫劑進行柱層析，得到200mg粗產(chǎn)物(5α，7α，17α)-7-甲基-3-亞甲基-19-去甲孕甾-20-烯-17-醇。用庚烷結(jié)晶得到純的標(biāo)題化合物(120mg，55％)，為白色固體，mp105℃。
實施例6(5α，7α，17α)-7-甲基-3-亞甲基-19-去甲孕甾-20-炔-17-醇的制備氮氣下，向攪拌著的叔丁醇鉀(527mg，4.7mmol)的4ml無水THF溶液中加入甲基三苯基鏻溴化物(1.85g，5.18mmol)。將該黃色懸浮液在室溫下攪拌45分鐘。向該懸浮液中快速加入(5α，7α，17α)-7-甲基-3-酮基-19-去甲孕甾-20-炔-17-醇(590mg，1.88mmol)的8ml無水THF溶液。該黃色反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2.5小時，倒入冰-水中并且用乙酸乙酯萃取。有機層用水洗滌，干燥(Na2SO4)并且蒸發(fā)至干，得到1.8g油狀物。使用甲苯/乙酸乙酯95/5(v/v％)作為洗脫劑進行柱層析，得到590mg粗產(chǎn)物(5α，7α，17α)-7-甲基-3-亞甲基-19-去甲孕甾-20-炔-17-醇。用庚烷結(jié)晶得到純的標(biāo)題化合物(290mg，50％)，為白色固體，mp97℃。
實施例7(5β，7α，17α)-7-甲基-3-亞甲基-19-去甲孕甾-17-醇的制備氮氣下，向攪拌著的叔丁醇鉀(1.62g，14.4mmol)的27ml無水THF溶液中加入甲基三苯基鏻溴化物(5.4g，15.1mmol)。將該黃色懸浮液在室溫下攪拌40分鐘。向該懸浮液中快速加入(5β，7α，17α)-7-甲基-3-酮基-19-去甲孕甾-17-醇(4.56g，14.4mmol)的50ml無水THF溶液。該黃色反應(yīng)混合物在室溫下攪拌30分鐘，倒入冰-水中并且用乙酸乙酯萃取。有機層用水和鹽水洗滌，干燥(Na2SO4)并且蒸發(fā)至干，得到8.2g油狀物。使用甲苯/乙酸乙酯95/5(v/v％)作為洗脫劑進行柱層析，得到(5β，7α，17α)-7-甲基-3-亞甲基-19-去甲孕甾-17-醇(3.65g，81％)，其靜置時固化，mp104℃。
實施例8(7α)-7-甲基-3，17-二亞甲基雌甾-5(10)-烯的制備氮氣下，向攪拌著的叔丁醇鉀(680mg，6mmol)的25ml無水THF溶液加入甲基三苯基鏻溴化物(2.2g，6mmol)。將該黃色懸浮液在室溫下攪拌30分鐘。向該懸浮液中快速(大約30秒)加入(7α)-7-甲基-3-酮基-17-亞甲基雌甾-5(10)-烯(850mg，3mmol)的25ml無水THF溶液，產(chǎn)生微放熱反應(yīng)。該反應(yīng)混合物在室溫下攪拌30分鐘，倒入冰-水(100ml)中并且用乙酸乙酯(100ml)萃取。有機層用水(50ml)洗滌，干燥(Na2SO4)并且蒸發(fā)至干，得到(7α)-7-甲基-3，17-二亞甲基雌甾-5(10)-烯(680mg，80％)，為無色油狀物，[α]D+115°(在乙醇中c0.185)。
實施例9(7α，16α，17β)-7，16-二甲基-3-亞甲基-17-(1-丙炔基)雌甾-5(10)-烯-17-醇的制備氮氣并-40℃下，在大約8分鐘內(nèi)將在30毫升蒸餾的THF中的(7α)-3，3-二甲氧基-7-甲基雌甾-5(10)-烯-17-酮(1.5g，4.5mmol)和1，3-二甲基-3，4，5，6-四氫-2(1H)-嘧啶酮(DMPU，1.2mL，9.9mmol)溶液加到攪拌著的雙(三甲代甲硅烷基)氨基化鋰(LiHMDS，4.96mL，1MTHF溶液)的15mL蒸餾的THF溶液中。將該反應(yīng)混合物在-40℃下攪拌45分鐘。加入碘甲烷(730μL，11.7mmol)的1mL蒸餾THF溶液并且攪拌1小時，使溫度溫?zé)嶂?℃。加入水和飽和氯化銨溶液并且用乙酸乙酯萃取。有機層用鹽水洗滌，干燥(Na2SO4)并且蒸發(fā)至干。使用庚烷/乙酸乙酯95/5(v/v％)作為洗脫劑進行柱層析，得到(7α，16α)-3，3-二甲氧基-7，16-二甲基雌甾-5(10)-烯-17-酮(990mg，產(chǎn)率65％)。
-70℃下，向nBuLi(9mL，1.6M己烷溶液)的19mL無水THF溶液中通入丙炔(大約4g，100mmol)，產(chǎn)生放熱反應(yīng)(自-70℃至-30℃)。氮氣下用大約5分鐘向該白色懸浮液中加入(7α，16α)-3，3-二甲氧基-7，16-二甲基雌甾-5(10)-烯-17-酮(990mg，2.86mmol)的10mL無水THF溶液。將反應(yīng)混合物攪拌45分鐘并且使溫度緩慢升至室溫。加入水和飽和氯化銨溶液并且用乙酸乙酯萃取。有機層用鹽水洗滌，干燥(Na2SO4)并且蒸發(fā)至干，得到(7α，16α，17β)-3，3-二甲氧基-7，16-二甲基-17-(1-丙炔基)雌甾-5(10)-烯-17-醇。向(7α，16α，17β)-3，3-二甲氧基-7，16-二甲基-17-(1-丙炔基)雌甾-5(10)-烯-17-醇(2.86mmol)的25mL乙醇溶液中加入草酸(72mg，0.57mmol)的6mL水溶液，并且將該反應(yīng)混合物在室溫下攪拌45分鐘。加入飽和的碳酸氫鈉溶液并且用乙酸乙酯萃取。有機層用鹽水洗滌，干燥(Na2SO4)并且蒸發(fā)至干。使用庚烷/乙酸乙酯9/1(v/v％)作為洗脫劑進行柱層析，得到(7α，16α，17β)-7，16-二甲基-17-羥基-17-(1-丙炔基)雌甾-5(10)-烯-3-酮(940mg，產(chǎn)率97％)。
氮氣下，向叔丁醇鉀(470mg，4.2mmol)的31ml無水甲苯懸浮液加入甲基三苯基鏻溴化物(1.7g，4.7mmol)。將該反應(yīng)混合物在回流下攪拌45分鐘。將反應(yīng)混合物冷卻到4℃，并且用大約10分鐘加入(7α，16α，17β)-7，16-二甲基-17-羥基-17-(1-丙炔基)雌甾-5(10)-烯-3-酮(940mg，2.76mmol)的39毫升無水甲苯溶液。該反應(yīng)混合物在4℃下攪拌20分鐘，加入稀釋氯化鈉并且用乙酸乙酯萃取。有機層用鹽水洗滌，干燥(Na2SO4)并且蒸發(fā)至干。使用庚烷/乙酸乙酯95/5(v/v％)作為洗脫劑進行柱層析，得到(7α，16α，17β)-7，16-二甲基-3-亞甲基-17-(1-丙炔基)雌甾-5(10)-烯-17-醇(630mg產(chǎn)率67％)，其為油狀物，將此產(chǎn)品從二噁烷中凍干[α]D+83°(在乙醇中c0.15)。
實施例10(7α，16α，17β)-16-乙基-7-甲基-3-亞甲基-17-(1-丙炔基)雌甾-5(10)-烯-17-醇的合成根據(jù)上述方法，從(7α)-3，3-二甲氧基-7-甲基雌甾-5(10)-烯-17-酮和碘乙烷起始制備該化合物，[α]D+54°(乙醇中c 0.13)。
實施例11(7α，17β)-7-甲基-3-亞甲基-17-(1-丙炔基)雌甾-5(10)-烯-17-醇的合成根據(jù)上述方法，從(7α)-3，3-二甲氧基-7-甲基雌甾-5(10)-烯-17-酮起始制備該化合物，[α]D+80°(乙醇中c 0.14)。
實施例12(7α，16β，17β)-16-乙基-7-甲基-3-亞甲基-19-去甲孕甾-5(10)-烯-20-炔-17-醇的合成根據(jù)上述方法，從(7α)-3，3-二甲氧基-7-甲基雌甾-5(10)-烯-17-酮起始制備該化合物，[α]D+94°(乙醇中c0.10)。
實施例13(7α)-3-亞甲基-7-甲基雌甾-5(10)-烯的制備室溫氮氣下，向(7α)-3，3-二甲氧基-7-甲基雌甾-5(10)-烯-17-酮(1g，3mmol)的17mL二甘醇懸浮液加入氫氧化鉀(1.5g，27mmol)和一水合肼(3ml，62mmol)。將反應(yīng)混合物在130℃加熱1小時之后在230℃加熱1小時15分鐘。利用Dean-Stark分水器去除水和過量的肼。將反應(yīng)混合物冷卻到室溫，加入水，并且用乙酸乙酯萃取。有機層用鹽水洗滌，干燥(Na2SO4)并且蒸發(fā)至干，得到粗產(chǎn)物(7α)-3，3-二甲氧基-7-甲基雌甾-5(10)-烯，根據(jù)上述方法將其轉(zhuǎn)化為(7α，16α，17β)-7，16-二甲基-3-亞甲基-17-(1-丙炔基)雌甾-5(10)-烯-17-醇，mp57℃。
實施例14(7α)-3-亞甲基-7-甲基雌甾-5(10)-烯-17-酮O-甲基肟的合成向6mL MeOH中的甲氧基胺。HCl(100mg，1.2mmol)和乙酸鈉(123mg，1.5mmol)的溶液加入(7α)-3，3-二甲氧基-7-甲基雌甾-5(10)-烯-17-酮(100mg，0.3mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌3天。加入水和飽和的碳酸氫鈉溶液并且用乙酸乙酯萃取。有機層用鹽水洗滌，干燥(Na2SO4)并且蒸發(fā)至干，得到粗產(chǎn)物(7α)-3，3-二甲氧基-7-甲基雌甾-5(10)-烯-17-酮O-甲基肟，根據(jù)上述方法將其轉(zhuǎn)化為(7α)-3-亞甲基-7-甲基雌甾-5(10)-烯-17-酮O-甲基肟，[α]D+149°(在乙醇中c0.11)。
實施例15(7α)-3-亞甲基-7-甲基雌甾-5(10)-烯-17-酮肟的合成根據(jù)上述方法，從(7α)-3，3-二甲氧基-7-甲基雌甾-5(10)-烯-17-酮和羥胺。HCl制備該肟化合物，mp 149℃。
實施例16延遲型過敏性(DTH)反應(yīng)使用8只一組的雌性Balb/c(Harlan，Zeist，The Netherlands)小鼠，在實驗開始時大約8周齡。在實驗開始之前在標(biāo)準(zhǔn)條件下在Macrolon籠中圈養(yǎng)這些小鼠并且使適應(yīng)環(huán)境3-5天。各組接受化合物或者安慰劑。
在處理的第一天和最后一天將小鼠稱重。通過頸后皮下注射(sc)或者通過口服管飼法從第1天至第11天每天用濃度范圍從1.2，3，4，6，至12mg/kg的試驗化合物處理動物一次。注射體積是0.1mL注射用賦形劑，其由含有0.5％明膠和5％甘露糖醇的生理鹽水組成。各項實驗包括安慰劑處理組(只有賦形劑)和作為參照化合物的4mg/kg地塞米松處理的組。
第2天，在胸真皮內(nèi)兩處，用得自Phase Sep的1mg/ml二甲基二十八烷基銨溴化物(dimethyl dioctadecylammonium bromide)(DDA)中3.75Lf破傷風(fēng)類毒素(Tetanus Toxoid)抗原(TT得自RIVM，Zeist，TheNetherlands)的0.1ml穩(wěn)定懸浮液對動物免疫接種。
第9天，用0.05mL每毫升含有50 Lf TT和1mg Al(OH)3的溶液在動物右[R]爪爪心側(cè)攻擊動物。左[L]爪(對照)只接受含有Al(OH)3的賦形劑。24和48小時之后，用測徑器密度計以毫米測量左和右爪掌厚度(分別是參量L和R)，并且根據(jù)計算式[(R-L)/L]×100％計算抗原-特異性爪腫脹百分比。
結(jié)果
實施例17非肥胖的糖尿病(NOD)-小鼠使用的NOD小鼠，或者是自養(yǎng)的(鼠種對來源自Hattori，Boston，USA，第58代)或者是來自Bomholtgard(Denmark)的6-7周齡小鼠。
只使用雌性小鼠來評價化合物對特征在于下頜下腺白細胞浸潤的自發(fā)性涎腺炎產(chǎn)生的作用。
在標(biāo)準(zhǔn)條件下圈養(yǎng)每組6-8只雌性小鼠，并且從第8周至14或20周齡每天一次(或者皮下或者口服)用0.1ml化合物(濃度是1.2，4，or12mg/kg/天)或安慰劑(只有賦形劑)處理或者不處理。從第12周開始對小鼠每周測定尿糖的存在(Diabur-test 5000，BoehringerMannheim)。
第8(處理前組)或者第14或20周，分別處理6或12周之后，麻醉下殺死動物；取出器官，剔除脂肪并稱重。將下頜下腺固定在升汞-甲醛溶液中18-24小時并且轉(zhuǎn)移到70％乙醇中。將組織切片包埋在石蠟中并且根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進行HE染色。由兩名獨立的觀察者根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法通過顯微鏡觀察對組織切片就浸潤評分。在該項試驗中能夠證明本發(fā)明化合物的活性。
實施例18
膠原性關(guān)節(jié)炎從Bomholtgard，Denmark購買雌性DBA-lJ/BOM小鼠。所有的動物均在標(biāo)準(zhǔn)條件下圈養(yǎng)并且使之適應(yīng)環(huán)境至少7天。
10-12周齡時，用100微克在等體積的弗氏完全佐劑(CFA，含有4mg/mL MT H37Ra，Difco實驗室，底特律，USA)中乳化的純II型牛膠原[CII](2mg/mL于0.05乙酸中)的乳液對所有的動物在尾根部真皮內(nèi)接種免疫。接種免疫之后第21天，腹膜內(nèi)加強注射施用溶解于鹽水中的100微克CII。從第一天(免疫前的這一天)開始直到第44天尸體剖檢，每天一次進行處理。
或者用試驗化合物(每天施用1.5mg/kg/天直到第22天，從這一天開始降低至一周3次)或者用環(huán)孢菌素A(開始100mg/kg/天，從第4天，20mg/kg)或者地塞米松(2mg/kg/天)或者賦形劑(5％Mulgofen(EL719，GAF)鹽水溶液)處理9-10只動物組成的組。包括沒有處理的對照組。
每周對小鼠稱重，并且從第19天開始，每2-3天，直到第44天尸體剖檢，由一名不知處理方案的觀察者對臨床關(guān)節(jié)炎活動度(目測外周關(guān)節(jié)中關(guān)節(jié)炎的出現(xiàn))評分(根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法)。
每只爪以0-2的分?jǐn)?shù)將關(guān)節(jié)炎臨床分級，并且每只小鼠表示為累積關(guān)節(jié)炎分?jǐn)?shù)，最大為8。在實驗結(jié)束時，分出膝和踝關(guān)節(jié)，并且用于X-射線分析，作為骨破壞的標(biāo)記物，接著立即在4％甲醛中固定用于組織學(xué)檢查。
用立體顯微鏡仔細檢查X-射線光片，并且根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法以0-5的分?jǐn)?shù)對關(guān)節(jié)的骨破壞評分，其范圍是沒有損傷到完全破壞。
在該項試驗中能夠證明本發(fā)明的化合物的活性。
權(quán)利要求
1.具有通式1的3-亞甲基甾族化合物衍生物或者其前體藥物， 式1其中R1是H或者與R3一起形成β-環(huán)氧化物或者如果存在5-10或4-5雙鍵則R1不存在；R2是(C1-C5)烷基或CF3；R3是βH，βCH3或者與R1一起形成β-環(huán)氧化物或者如果存在5-10雙鍵則R3不存在；R4是H，低級烷基；Y是[H，H][OH，H]，＝O，[OH，低級烷基]，[OH，(C2-C5)鏈烯基]，[OH，(C2-C5)鏈炔基]或者(C1-C6)亞烷基，其中所述烷基，鏈烯基，鏈炔基和亞烷基任選地被鹵化；或者＝NOR5，其中R5是H，低級烷基；虛線代表任意的雙鍵；前提是3-亞甲基甾族化合物衍生物不是下面所列的化合物中的任一種(7α，17β)-7α-甲基-3-亞甲基-4-雌甾烯-17-醇，(7α，17α)-7-甲基-3-亞甲基-19-去甲孕甾-4-烯-17-醇，(7α，17α)-7-甲基-3-亞甲基-19，21-二去甲孕甾-4-烯-17-醇，(7α)-17-酮基-7-甲基-3-亞甲基-4-雌甾烯，(7α，17α)-7-甲基-3-亞甲基-19-去甲孕甾-4-烯-20-炔-17-醇，17β-羥基-7α-甲基-3-亞甲基-17α-丙烯-2-基-4-雌甾烯，和17β-羥基-7α-甲基-3-亞甲基-17α-丁烯-2-基-4-雌甾烯。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的3-亞甲基甾族化合物衍生物，其特征在于所述3-亞甲基甾族化合物衍生物具有5-10雙鍵并且R1和R3不存在。
3. 3-亞甲基甾族化合物衍生物(7α，17α)-7-甲基-3-亞甲基-19-去甲孕甾-5(10)-烯-20-炔-17-醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的3-亞甲基甾族化合物衍生物作為藥物的用途。
5.含有根據(jù)權(quán)利要求1-3的3-亞甲基甾族化合物衍生物或者其藥學(xué)可接受鹽或者其溶劑合物及藥學(xué)可接受助劑的藥物組合物。
6.具有通式1的3-亞甲基甾族化合物衍生物或者其前體藥物 式1其中R1是H或者與R3一起形成β-環(huán)氧化物或者如果存在5-10或4-5雙鍵則R1不存在；R2是(C1-C5)烷基或CF3；R3是βH，βCH3或者與R1一起形成β-環(huán)氧化物或者如果存在5-10雙鍵則R3不存在；R4是H，低級烷基；Y是[H，H][OH，H]，＝O，[OH，低級烷基]，[OH，(C2-C5)鏈烯基]，[OH，(C2-C5)鏈炔基]或者(C1-C6)亞烷基，其中所述烷基、鏈烯基、鏈炔基和亞烷基任選地被鹵化；或者＝NOR5，其中R5是H，低級烷基；虛線代表任意的雙鍵；用于制備用于治療和/或預(yù)防關(guān)節(jié)炎疾病和/或自身免疫疾病的藥物的用途。
7.通過對需要所述治療或預(yù)防的患者施用權(quán)利要求中6定義的3-亞甲基甾族化合物衍生物而治療和/或預(yù)防關(guān)節(jié)炎疾病和/或自身免疫疾病的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于治療關(guān)節(jié)炎疾病和/或自身免疫疾病的具有通式1的3－亞甲基甾族化合物衍生物或者其前體藥物，其中R1是H或者與R3一起形成β－環(huán)氧化物或者如果存在5－10或4－5雙鍵則R1不存在；R2是(C
文檔編號A61P29/00GK1402734SQ00816356
公開日2003年3月12日 申請日期2000年11月23日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月29日
發(fā)明者R·普拉特, W·M·巴格楚斯 申請人:阿克佐諾貝爾公司