專利名稱：：重組明膠的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及重組明膠和含有重組明膠的組合物和藥劑，生產(chǎn)重組明膠的方法和在各種應(yīng)用中這些明膠的用途。
背景技術(shù)：
：明膠是膠原的衍生物，動物的主要結(jié)構(gòu)和結(jié)締蛋白。明膠衍生自膠原變性，含有具有Gly-X-Y重復(fù)的多肽序列，其中X和Y最常見是脯氨酸和羥脯氨酸殘基。這些序列形成三鏈螺旋結(jié)構(gòu)并影響明膠多肽的凝膠化能力。目前可得的明膠是通過通常是牛和豬來源的動物皮毛和骨骼加工提取的。明膠的生物物理性質(zhì)使它成為多用途的材料，廣泛用于各種應(yīng)用和工業(yè)。明膠用于例如許多藥物和醫(yī)學(xué)、照像、工業(yè)、化妝品和食品飲料產(chǎn)品以及制造過程中。因此明膠是商業(yè)上有價值和多用途的產(chǎn)品。明膠的生產(chǎn)明膠通常是用牛和豬來源，特別是從皮毛和骨骼中天然存在的膠原制造的。在某些情況下，可從例如魚、雞或馬來源中提取明膠。典型明膠生產(chǎn)的原料，例如皮和骨骼來自經(jīng)政府認(rèn)證的核查并適用于人類消費的動物。因為存在污染因子例如可轉(zhuǎn)移的海綿狀腦病(TSE)，特別是牛海綿狀腦病(BSE)和羊瘙癢病等(見例如Rohwer，R.G.(1996)DevBiolStand88247-256)對于該原料的感染性有擔(dān)心。這種問題對于用于藥物和醫(yī)學(xué)用途的明膠尤其關(guān)鍵。近來，對于這些材料(其中大部分來自牛來源)的安全性的關(guān)注增加了，導(dǎo)致各種含明膠的產(chǎn)品成為幾項規(guī)定措施的焦點，來減少與新變種克-雅氏病(nvCJD)，一種致命的人神經(jīng)疾病有關(guān)的牛海綿狀腦病(BSE)擴散的可能危險。有擔(dān)心目前用于從動物組織和骨骼提取明膠的方法的純化步驟不足以除去感染性，因為攜帶SE的組織(如腦組織等)的污染。美國和歐洲制造商規(guī)定在動物或人食品或藥物、醫(yī)學(xué)或化妝品應(yīng)用的明膠原料不能是來自數(shù)量正在增加的BSE國家的。另外，法規(guī)規(guī)定在明膠生產(chǎn)中不能使用某些材料，例如牛腦組織。目前的生產(chǎn)過程涉及幾個純化和凈化步驟，可能需要劇烈和冗長的提取模式。用煉油法處理動物皮毛和骨骼，提取的材料經(jīng)過各種化學(xué)處理，包括長時間接觸高酸性或堿性溶液。許多純化步驟涉及洗滌和過濾以及各種熱處理。用酸除鹽和石灰處理除去雜質(zhì)，例如非膠原的蛋白質(zhì)。骨骼必須脫脂?？稍谶^程中加入其它洗滌和過濾步驟，離子交換和其它化學(xué)和滅菌處理，來進一步純化材料。另外，在加工后仍可能存在污染物和雜質(zhì)，得到的明膠產(chǎn)物因此必須凈化，純化，常常在準(zhǔn)備使用前需要進一步濃縮。商品明膠常常分為A型和B型。這些分類反映了作為提取過程接受的預(yù)處理提取物來源。A型通常衍生自酸加工的材料，通常是豬皮，B型通常衍生自堿或石灰加工的材料，通常是牛骨(骨膠原)和皮毛。在A型明膠的提取中，方法通常涉及連續(xù)用水洗滌和用稀釋的酸處理新鮮或冷凍的豬皮。酸處理的豬皮再進行洗滌，然后重復(fù)提取，其中用熱水處理，特別是要部分水解存在的膠原。所得的提取物，明膠的稀溶液經(jīng)過濾和蒸發(fā)將得到的濃縮液冷卻或冷凍成凝膠。然后在干燥管道中處理凝膠，或通過連續(xù)干燥器或其它干燥裝置。在石灰法中，B型明膠衍生自供體毛皮和皮屑，對其洗滌并用石灰處理。石灰處理可長達1-3個月，通常在60天左右。洗滌經(jīng)石灰處理的毛皮，并用稀酸處理。然后用熱水水解毛皮，得到的提取物用如上面酸處理法所述的方法處理。還可以從骨膠原來源中加工B型明膠。洗滌硬骨，脫脂，連續(xù)用稀酸，例如鹽酸處理浸析。酸處理與骨骼的礦物質(zhì)成分反應(yīng)，它隨著酸溶液被除去，留下骨膠原或軟化的骨骼。該骨骼有機物質(zhì)洗去剩余的酸后，干燥儲藏或立即用石灰處理。石灰處理后，如上文從牛皮制備明膠所述處理骨膠原。在所有情況下，在最終過濾，去除礦物質(zhì)，濃縮和干燥步驟后，將得到的明膠產(chǎn)物分批，進行各種物理、化學(xué)和細菌學(xué)測試，來確定級別和純度，并根據(jù)商業(yè)需求磨碎和混合。在A和B型提取過程中，得到的明膠產(chǎn)物通常是明膠分子的混合物，大小從幾千到幾十萬道爾頓不等。魚明膠分為凝膠化或非凝膠化型，和通常作為A型明膠加工，用于一些商業(yè)應(yīng)用。凝膠化型通常衍生自一些溫水魚的皮膚，而非凝膠化型通常衍生自冷水魚。魚明膠具有廣泛變化的氨基酸組分，與動物明膠不同，脯氨酸和羥脯氨酸殘基比例通常較低。與其它動物明膠相反，魚明膠通常在低得多的溫度下，甚至在平均分子量相當(dāng)時仍保持液態(tài)。與動物明膠一樣，魚明膠是從魚皮中經(jīng)過處理然后水解提取的。另外，與動物提取過程相同，提取魚明膠的過程得到不均勻的產(chǎn)物?？偨Y(jié)明膠是用于各種應(yīng)用的重要產(chǎn)品。明膠的多種用途在于該獨特的蛋白質(zhì)混合物的不同特征和性能。目前提取的方法得到作為蛋白質(zhì)不均勻混合物的明膠產(chǎn)品，含有分子量分布廣泛的多肽。有時必需混合有時必須混合各種產(chǎn)物批料，來獲得含有適用于所需用途的具有物理性能的明膠混合物。需要更均一的產(chǎn)品和用更可重現(xiàn)的方法產(chǎn)生的明膠。需要能得到具有可重現(xiàn)物理特性的均一物質(zhì)，例如在各種產(chǎn)品和方法中，可得到具有特定特征，例如固定的分子量范圍的明膠將得到可重復(fù)和可調(diào)控的表現(xiàn)。因此需要制備明膠的可靠和可重復(fù)的方法，提供具有可控制特征的均一產(chǎn)品。另外，在藥物、化妝品、食品和飲料工業(yè)中，尤其需要除了從動物來源，例如牛、豬骨骼和組織提取獲得的以外的明膠來源。另外，由于目前可得的明膠是從動物來源如骨骼和組織生產(chǎn)的，有擔(dān)心含明膠產(chǎn)品的不良免疫原性和感染性(見例如Sakaguchi，M.等(1999)J.Aller.clin.Immunol.104695-699；Miyazawa等(1999)Vaccine172176-2180；Sakaguchi等(1999)Immunology96286-290；Kelso(1999)JAller.Clin.Immunol.103200-202；Asher(1999)DevBiolStand9941-44；和Verdrager(1999)Lancet3541304-1305)。另外，可得到不通過動物來源，如組織和骨骼提取的基礎(chǔ)物質(zhì)將克服各種倫理、宗教和社會要求。不需要從動物來源，例如組織和骨骼提取的重組物質(zhì)可用于例如制造食品和其它食用產(chǎn)品，包括膠囊化的藥物，適用于具有飲食限制的人，例如信奉猶太教和伊斯蘭教的人。雖然明膠制造商和最終用戶尋找和測試了許多目前可得的動物來源明膠的天然和合成的替代品，但是沒有發(fā)現(xiàn)通用的替代品。找到了針對一些用途的替代品，例如在VCAPS膠囊中使用纖維質(zhì)原料(CAPSUGEL；MorrisPlains，NJ)，或在照像乳液中用來自小鼠和大鼠膠原序列的非天然的明膠樣蛋白質(zhì)替代(見例如Werten，M.W.等(1999)Yeast151087-1096；和DeWolf，Anton等，歐洲申請?zhí)朎P1014176A2)。然而，對于大多數(shù)基于明膠的方法和產(chǎn)品來說，該關(guān)鍵物質(zhì)的性能不能重復(fù)，替代品未被接受。因此，需要一種以合成和可重復(fù)方式生產(chǎn)明膠的方法，其中得到的產(chǎn)品可作為具有所需性能的合理替代品?？偟恼f，需要一種能提供明膠性能的通用替代物質(zhì)，同時實現(xiàn)產(chǎn)品來源的可重復(fù)和受控。需要一種無需劇烈和冗長的加工的明膠生產(chǎn)方法，和制造得到更均一產(chǎn)品，能穩(wěn)定產(chǎn)生大量和不同類型的、適合多種應(yīng)用的明膠的方法。需要能輕易適合不同用途，并滿足現(xiàn)存的保健和其它需求的多用途明膠。本發(fā)明通過提供一種用重組法獲得通用的普遍替代材料解決了這些和其它需要，該材料適合用于目前使用明膠的非常廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域。本材料可設(shè)計成具有特定應(yīng)用所需的性質(zhì)和特征，因此能提供新的性能，用于之前不能使用的領(lǐng)域。發(fā)明簡述本發(fā)明針對重組明膠，含有重組明膠的組合物和藥物，以及制備和使用重組明膠的方法。在一個方面，本發(fā)明提供了一種含有重組明膠的組合物。在一個實施例中，重組明膠具有選自約5kDa、8kDa、9kDa、14kDa、16kDa、22kDa、23kDa、36kDa、44kDa和65kDa的分子量。在另一個實施例中，重組明膠具有約0-50kDa、約10-30kDa、約30-50kDa、約10-70kDa、約50-70kDa、約50-100kDa、約100-150kDa、約150-200kDa、約200-250kDa、約250-300kDa和約300-350kDa的分子量范圍。在一個方面，重組明膠具有大于300kDa的分子量。在另一個方面，本發(fā)明包含一種重組明膠，具有選自50、100、150、200、250和300的Bloom強度。在另一個實施例中，Bloom強度在0-100之間。在一些實施例中，本發(fā)明提供了一種含有重組明膠的組合物，其中重組是非羥化的、完全羥化的或部分羥化的。在許多方面，重組明膠具有的羥化百分?jǐn)?shù)，選自20-80％、30-80％、40-80％、60-80％、20-60％、30-60％、40-60％、20-30％、20-40％和30-40％。在其它實施例中，重組明膠被完全羥化，部分羥化或無羥化。在一個方面，本發(fā)明提供了一種含有重組明膠的組合物，其中重組明膠含有重組明膠多肽的均一混合物。在另一個方面，重組明膠是重組明膠多肽的非均質(zhì)混合物。在一個實施例中，本發(fā)明提供了一種含有重組明膠的組合物，其中重組明膠衍生自一種膠原而不含任何其它膠原。在具體實施例中，此一種膠原選自I型、II型、III型、IV型、V型、VI型、VII型、VIII型、IX型、X型、XI型、XII型、XIII型、XV型、XVI型、XVII型、XIX型和XX型膠原?？紤]了重組明膠組合物，其中重組明膠具有1.000EU/mg以下，0.500EU/mg以下，0.050EU/mg以下和0.005EU/mg以下的內(nèi)毒素含量的重組明膠。在特定實施例中，本發(fā)明的重組明膠含有選自SEQIDNO15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、31和33的氨基酸序列。還提供了編碼這些氨基酸序列的多聚核苷酸，以及含有該多聚核苷酸的表達載體和宿主細胞。在一些方面，本發(fā)明的宿主細胞是原核或真核的。在一個實施例中，真核宿主細胞選自酵母細胞、動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞和真菌細胞。本發(fā)明還提供了含有該多聚核苷酸的轉(zhuǎn)基因動物和轉(zhuǎn)基因植物。還提供了含有選自SEQIDNO26、27、28和29的氨基酸序列的重組明膠。在一個方面，本發(fā)明包括生產(chǎn)重組明膠的方法。一種方法包括提供重組膠原或原膠原或其片段或變體；加工重組膠原或原膠原或其片段或變體生產(chǎn)重組明膠。在一個方面，加工成重組明膠的重組膠原是重組人膠原。在另一方面，重組膠原是通過與至少一條編碼膠原或原膠原的多聚核苷酸和至少一條編碼翻譯后加工酶或其亞基的多聚核苷酸共表達而生產(chǎn)的。在一個實施例中，翻譯后加工酶是脯氨酰羥化酶。在本發(fā)明的另一種方法中，重組膠原是直接從改變的膠原構(gòu)建物中生產(chǎn)的。在另一個實施例中，重組明膠是通過共表達改變的膠原構(gòu)建物和至少一條編碼翻譯后加工酶或其亞基的多聚核苷酸而生產(chǎn)的。在一個實施例中，翻譯后加工酶是脯氨酰羥化酶。還提供了產(chǎn)生具有選定解鏈溫度的重組膠原的重組明膠的方法。在一個實施例中，該方法包括對重組明膠賦予對應(yīng)所選解鏈溫度的羥化百分?jǐn)?shù)。在另一個實施例中，賦予步驟包括在脯氨酰羥化酶的存在下從改變的膠原構(gòu)建物中生產(chǎn)重組明膠。在其它方面，賦予步驟包括從羥化的重組膠原中衍生重組明膠，或包括羥化非羥化的重組明膠。考慮了本發(fā)明中重組明膠的各種用途。特別是，本發(fā)明包括含有明膠的成膠囊劑、穩(wěn)定劑、薄膜形成劑、潤濕劑、乳化劑、增稠劑、膠凝劑、膠態(tài)劑、粘合劑、絮凝劑和精煉劑。本發(fā)明在一個實施例中提供了一種含有重組明膠的藥物組合物。在另一個實施例中，重組明膠是人重組明膠。在另一個實施例中，重組明膠無免疫原性。在特定實施例中，本發(fā)明提供了一種含有重組明膠的硬明膠膠囊、軟明膠膠囊、血漿補充劑、膠體體積置換物質(zhì)、異植體涂層、醫(yī)用海綿、醫(yī)用栓、藥物穩(wěn)定劑和微載體。在一個方面，本發(fā)明包括一種試劑盒，它含有含有重組明膠的組合物，以及對個體傳輸該組合物的裝置。還考慮了含有重組明膠的食用組合物，例如蛋白質(zhì)補充劑、脂肪替代品、營養(yǎng)補充劑、食用糖衣和各種含有重組明膠的微膠囊。還考慮了含有重組明膠的照像組合物，以及其中重組明膠部分或完全羥化的實施例。本發(fā)明還提供了含有重組明膠的化妝品組合物。在其它實施例中，本發(fā)明包括一種含有重組明膠的化妝品組合物，一種含有重組明膠的工業(yè)組合物，一種含有重組明膠的細胞培養(yǎng)組合物，和一種含有重組明膠的實驗室用組合物。還考慮了其它實施例，例如含有本發(fā)明的重組明膠的微陣列或編碼這些重組明膠的多聚核苷酸。附圖簡述圖1列出了重組明膠表達的結(jié)果。圖2A和2B列出了顯示重組明膠支持細胞附著的結(jié)果。圖3列出了顯示蛋白酶解產(chǎn)生穩(wěn)定的重組明膠的結(jié)果。圖4列出了顯示羥化的重組明膠生產(chǎn)的結(jié)果。圖5列出了顯示體外羥化后重組明膠純化的結(jié)果。圖6列出了存在或不存在脯氨酰4-羥化酶時表達的重組明膠的穩(wěn)定性的結(jié)果。圖7列出了顯示補充表達培養(yǎng)基增強重組明膠表達的結(jié)果。圖8列出了市售明膠與交聯(lián)的重組明膠比較的結(jié)果。圖9列出了市售明膠的分子量分布比較結(jié)果。圖10A、10B、10C、10D、10E和10F列出了顯示120℃下市售明膠水解的結(jié)果。圖11A、11B、11C和11D列出了顯示150℃下市售明膠水解的結(jié)果。圖12A和12B列出了顯示重組I型和III型人膠原酸和熱水解的結(jié)果。圖13顯示了重組人I型膠原酶解的結(jié)果。圖14列出了用重組人I型膠原免疫的豚鼠的抗血清蛋白質(zhì)印跡分析重組人膠原和重組人明膠。圖15A和15B列出了顯示用重組人I型膠原免疫的豚鼠的抗血清與I型膠原的特定的溴化氰片段的反應(yīng)。圖16A和16B顯示用重組人I型膠原免疫的豚鼠抗血清不與重組人明膠反應(yīng)的ELISA結(jié)果。發(fā)明詳述在描述本發(fā)明的蛋白質(zhì)、核苷酸序列和方法之前，應(yīng)理解本發(fā)明不限于所述的具體方法、步驟、細胞系、載體和試劑，因為這些可以改變。還應(yīng)理解本文所用的術(shù)語僅為描述特定實施例，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。必須注意本文和在權(quán)利要求中所用的單個“一”、“一個”和“該”包括復(fù)數(shù)，除非上下文明確說明。因此例如“一個宿主細胞”指一個或多個這樣的宿主細胞及其本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的等價物，“一種抗體”指一種或多種抗體及其本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的等價物，等等。除非另外定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的意義。雖然在實施和測試本發(fā)明中可使用任何與本文所屬的相似或等價的方法和材料，現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法、裝置和材料。所有本文提到的出版物在此引入以供參考，用于描述和公開細胞系、載體和方法等，它們在可與本發(fā)明結(jié)合使用的出版物中有所報道。本文中的任何陳述都不被認(rèn)為是承認(rèn)本發(fā)明無權(quán)根據(jù)先前的發(fā)明提前公開。本文引用的所有文獻在此完整引入以供參考。本發(fā)明的實施將使用(除非另外說明)本領(lǐng)域能力范圍內(nèi)的化學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)和藥物學(xué)的方法。這些技術(shù)在文獻中有完整解釋。見例如Gennaro，A.R.編(1990)Remington’sPharmaceuticalScience，第18版，MackPublishingCo.；Colowick，S.等編，MethodsinEnzymology，AcademicPress，Inc.；HandbookofExperimentalImmunology，Vols.I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell編，1986，BlackwellScientificPublications)；Maniatis，T.等編(1989)MolecularCloningALaboratoryManual第二版，I-III卷，ColdSpringHarborLaboratoryPress；Ausubel，F(xiàn).M.等編(1999)ShortProtocolsinMolecularBiology，第四版，JohnWiley&Sons；Ream等編(1998)MolecularBiologyTechniquesAnIntensiveLaboratoryCourse，AcademicPress)；PCR(IntroductiontoBiotechniquesSeries)，第二版(Newton&Graham編，1997，SpringerVerlag)。定義術(shù)語“膠原”指任一已知膠原類型，包括膠原I-XX，和任何其它膠原，不論天然、合成、半合成或重組的。該術(shù)語也包括原膠原。術(shù)語膠原包含任何一條多聚核苷酸編碼的單鏈多肽，和膠原鏈的同三聚和異三聚集合。術(shù)語“膠原”特別包括其變體和片段，及其功能性等價物和衍生物，它們優(yōu)選保留至少一種膠原的結(jié)構(gòu)或功能特征，例如(Gly-X-Y)n結(jié)構(gòu)域。術(shù)語“原膠原”指對應(yīng)膠原I-XX型任何一種的原膠原，以及對應(yīng)任何其它膠原，不論是合成、半合成或重組的原膠原，它們具有額外的C-末端和/或N-末端前肽或端肽，其有輔助三聚體裝配、溶解性、純化或任何其它功能，然后由與膠原產(chǎn)生有關(guān)的N-蛋白酶、C-蛋白酶或其它酶(例如蛋白水解酶)切割。術(shù)語原膠原特別包含其變體和片段，及其功能性等價物和衍生物，其優(yōu)選保留膠原的至少一個結(jié)構(gòu)或功能特征，例如(Gly-X-Y)n結(jié)構(gòu)域。本文所用的“明膠”指任何明膠，不論是用傳統(tǒng)方法提取或重組或原生物合成的，或任何具有明膠的至少一種結(jié)構(gòu)和/或功能特征的分子。明膠目前是通過提取衍生自動物(例如牛、豬、嚙齒類、雞、馬、魚)來源，如骨骼和組織的膠原獲得的。術(shù)語明膠同時包括包含在明膠產(chǎn)物中的一種以上多肽的組合，和形成明膠物質(zhì)的單獨的多肽。因此，本發(fā)明所使用的重組明膠同時包括構(gòu)成本發(fā)明明膠多肽的重組明膠物質(zhì)，和本發(fā)明的單獨的明膠多肽?？裳苌髂z的多肽是膠原、原膠原和其它具有膠原的至少一種結(jié)構(gòu)和/或功能特征的多肽。該多肽可以含有一條膠原鏈或膠原同三聚體或異三聚體或其任何片段、衍生物、寡聚體、聚合物或其亞基，含有至少一種膠原結(jié)構(gòu)域(Gly-X-Y區(qū))。該術(shù)語特別指天然情況下不存在的經(jīng)工程改造過的序列，例如經(jīng)改變的膠原的構(gòu)建體等。經(jīng)改變膠原的構(gòu)建體是含有通過缺失、添加、取代或其它改變從天然存在的膠原基因改變的序列的多聚核苷酸?！白魟笔侨魏渭拥剿幬锘蛞呙缰刑岣?、增強或輔助其作用的藥劑。在疫苗制劑中使用的佐劑可以是免疫性藥劑，它能通過對非特異性刺激因子產(chǎn)生免疫應(yīng)答來增強免疫應(yīng)答。佐劑常用于滅活疫苗。術(shù)語“等位基因”或“等位基因序列”指基因序列的交換形式。等位基因可從核酸序列中的至少一個突變得到，可導(dǎo)致改變的mRNA或多肽，其結(jié)構(gòu)或功能可以改變也可以不改變。任何給定的天然或重組基因可以不具有，具有一種或多種等位基因形式。產(chǎn)生等位基因的通常突變改變常常歸因于天然缺失、添加或核苷酸的替換。這些改變類型中每一種都可以在給定序列中發(fā)生一次或多次單獨發(fā)生或聯(lián)合其它改變，。“改變的”多聚核苷酸序列包括具有不同的核苷酸缺失、插入或取代，得到編碼相同或功能上等價的多肽的多聚核苷酸的多聚核苷酸序列。該定義中包括顯示多態(tài)性的序列，它可用或不可用特定的寡核苷酸探針，或通過除去與等位基因的不正確或預(yù)計的雜交可以檢測的序列，具有除了該多聚核苷酸序列正常染色體座位以外的基因座。“改變的”多肽可以含有氨基酸殘基的缺失、插入或取代，它產(chǎn)生隱性改變并導(dǎo)致功能上等價的多肽。可在極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或殘基的兩性性質(zhì)基礎(chǔ)上產(chǎn)生精密的氨基酸取代，只要保留編碼的多肽的生物學(xué)或免疫學(xué)活性。例如，帶負電的氨基酸可包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電的氨基酸可包括賴氨酸和精氨酸；具有不帶電的極性頭部基團，具有相似的親水性的氨基酸可包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸、甘氨酸和丙氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺、絲氨酸和蘇氨酸和苯丙氨酸和酪氨酸。本文所用的這些術(shù)語“氨基酸”或“多肽”序列或“多肽”指寡肽、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列及其片段，和天然存在或合成的分子。多肽或氨基酸片段是多肽保留該多肽的至少一種結(jié)構(gòu)和/或功能特征的任何部分。在本發(fā)明的至少一個實施例中，多肽片段是保留至少一個(Gly-X-Y)n區(qū)的片段。本文所用的術(shù)語“動物”例如在“動物膠原”中包含任何膠原，例如天然，合成，半合成或重組的。動物來源包括例如哺乳動物來源，包括但不限于牛、豬、馬、嚙齒類和羊來源以及其它動物來源，包括但不限于雞和魚來源和非脊椎動物來源?！翱乖浴敝府?dāng)引入體內(nèi)時，一種物質(zhì)能夠刺激免疫應(yīng)答并產(chǎn)生抗體的能力。能顯示抗原性的因子稱為抗原性的?？乖砸蜃涌砂ǖ幌抻诟鞣N大分子，例如蛋白質(zhì)、脂蛋白、多糖、核酸、細菌和細菌組分、以及病毒和病毒組分。本文所用的術(shù)語“互補”或“互補性”指多聚核苷酸通過堿基配對的天然結(jié)合。例如序列“A-G-T”與互補序列“T-C-A”結(jié)合。兩條單鏈分子之間的互補性可以是“部分的”，當(dāng)僅核酸中的一些可以結(jié)合，或完整的，當(dāng)單鏈分子之間存在完全互補。核酸鏈之間的互補程度對核酸鏈雜交的效力和強度有顯著影響。這對擴增反應(yīng)特別重要，它依賴于核酸鏈之間的結(jié)合，在設(shè)計和使用例如肽核酸(PNA)分子中也很重要?！叭笔А笔前被峄蚝塑账嵝蛄械母淖兌鴮?dǎo)致一個或多個氨基酸殘基或核苷酸的缺失。用于多聚核苷酸的術(shù)語“衍生的”指化學(xué)修飾編碼特定多肽的多聚核苷酸或與編碼特定多肽的多聚核苷酸互補的多聚核苷酸。這種修飾包括例如用烷基、?；虬被脫Q氫。本文用于多肽的術(shù)語“衍生的”指通過羥化、糖基化、聚乙二醇化或任何相似方法修飾的多肽。術(shù)語“衍生物”包含其有衍生出它的分子的至少一種結(jié)構(gòu)和/或功能特征的分子。當(dāng)一個分子含有在正常情況下不是分子一部分的額外化學(xué)基團時，它被稱為“化學(xué)衍生物”。該基團可改善分子的溶解性、吸收性、生物半衰期等?；鶊F還可以降低分子的毒性，消除或弱化分子的任何不良副作用等。能介導(dǎo)這些效果的基團是本領(lǐng)域一般可得的，并可在Remington’sPharmaceuticalSciences，見上中找到。將這些基團與分子偶聯(lián)的方法是本領(lǐng)域熟知的。作為術(shù)語用于本文的“賦形劑”是任何在藥物、疫苗或其它藥物組合物配制中用作稀釋劑或載體的惰性物質(zhì)，來賦予合適的一致性或形成藥物、疫苗或藥物組合物。本文所用的術(shù)語“功能性等價物”指具有特定多肽或多聚核苷酸的至少一種功能和/或結(jié)構(gòu)特征的多肽或多聚核苷酸。功能性等價物可含有能表現(xiàn)出特定功能的修飾。術(shù)語“功能性等價物”將包括分子的片段、突變體、雜交物、變體、同類物或化學(xué)衍生物。“融合蛋白”是其中肽序列來自不同蛋白質(zhì)并可操縱性地連接的蛋白質(zhì)。術(shù)語“雜交”指核酸序列與互補序列通過堿基配對結(jié)合的過程。雜交條件可用例如預(yù)雜交和雜交溶液中鹽或甲酰胺濃度，或雜交溫度限定，是本領(lǐng)域熟知的。雜交可在各種嚴(yán)格條件下發(fā)生。特別是，可通過降低鹽濃度，提高甲酰胺濃度，或提高雜交溫度來提高嚴(yán)格度。例如，為了本發(fā)明，高嚴(yán)格條件下的雜交發(fā)生在約37℃-42℃下，約50％甲酰胺中，降低的嚴(yán)格條件下，在約35％-25％甲酰胺中，約30-35℃下。特別是，雜交在最高的嚴(yán)格條件下，42℃，50％甲酰胺，5XSSPE，0.3％SDS和200微克/毫升剪切和變性的鮭魚精DNA中發(fā)生。對應(yīng)具體嚴(yán)格水平的溫度范圍可用本領(lǐng)域已知的方法進一步縮小，例如，通過計算感興趣的核酸的嘌呤和嘧啶比，據(jù)此調(diào)節(jié)溫度。為了除去非專一信號，可依次洗滌印跡，例如在遞增的嚴(yán)格條件下，達0.1XSSC和0.5％SDS在室溫下洗滌。上述范圍和條件的變化是本領(lǐng)域熟知的?！懊庖咴浴鄙婕霸谏矬w內(nèi)引起免疫應(yīng)答的能力。顯示免疫原性性質(zhì)的因子稱為免疫原性的。因子可包括但不限于各種大分子，例如蛋白質(zhì)、脂蛋白、多糖、核酸、細菌和細菌組分，以及病毒和病毒組分。免疫原性因子通常具有較高的分子量(通常大于10kDa)?！案腥拘浴敝改芨腥净蚰墚a(chǎn)生感染，指微生物，例如細菌或病毒在體內(nèi)的侵襲和復(fù)制。術(shù)語“插入”或“添加”指多肽或多聚核苷酸中的改變，分別導(dǎo)致與天然存在的分子相比加入一個或多個氨基酸或核苷酸。本文所用的術(shù)語“分離的”指不僅從存在于來自蛋白質(zhì)天然來源的蛋白質(zhì)，還從一般其它成分中分離得到的分子，優(yōu)選指在如果存在僅一種溶劑、緩沖劑、離子或其它通常存在于該溶液中的組分中發(fā)現(xiàn)的分子。本文所用的術(shù)語“分離的”和“純化的”不包括其天然來源中存在的分子。術(shù)語“微陣列”指任何核酸、氨基酸、抗體等在基質(zhì)上的排列。基質(zhì)可以是任何合適的載體，例如珠、玻璃、紙、硝基纖維素、尼龍、或任何合適的膜等?；|(zhì)可以是任何剛性或半剛性的載體，包括但不限于膜、濾膜、晶片、芯片、玻片、纖維、珠，包括磁性或非磁性的珠、凝膠、管材、皿、聚合物、微粒、毛細管等?；|(zhì)可提供包裹的表面和/或具有各種表面形式，例如小凹孔、針、溝、渠和細孔，在其上可結(jié)合核酸和氨基酸等。術(shù)語“微生物”可包括但不限于病毒、細菌、衣原體、立克次氏體、支原體、脲原體、真菌和寄生蟲，包括感染性寄生蟲例如原生動物。術(shù)語“核酸”或“多聚核苷酸”序列或“多聚核苷酸”指寡核苷酸、核苷酸或多聚核苷酸或其任何片段，天然或合成來源的DNA或RNA，它們可以是單鏈或雙鏈，并且可代表正義或反義鏈，肽核酸(PNA)或天然或合成來源的任何DNA樣或RNA樣物質(zhì)。多聚核苷酸片段是任何保留多聚核苷酸的至少一種結(jié)構(gòu)或功能特征的多聚核苷酸序列的部分。在本發(fā)明的一個實施例中，多聚核苷酸片段是編碼至少一個(Gly-X-Y)n區(qū)的多聚核苷酸片段。多聚核苷酸片段長度可變，例如長度可大于60個核苷酸，至少長100個核苷酸，至少1000個核苷酸或至少10,000個核苷酸。詞組“相似性百分?jǐn)?shù)”(％相似性)指在比較兩條或多條多肽或多聚核苷酸序列中發(fā)現(xiàn)的序列相似性百分?jǐn)?shù)。相似性百分?jǐn)?shù)可通過本領(lǐng)域熟知的方法確定。例如氨基酸序列之間的相似性百分?jǐn)?shù)可以用Clustal法計算(見例如Higgins，D.G.和P.M.Sharp(1988)Gene73237-244)。Clustal算法將序列通過檢測所有堿基之間的距離分成簇。配對排列簇，然后排列組。通過將序列A的長度減去序列A中缺口殘基的數(shù)目，減去序列B中缺口殘基的數(shù)目的差，除以序列A和序列B之間的殘基匹配和，乘以100計算兩條氨基酸序列，例如序列A和序列B之間的相似性百分?jǐn)?shù)。兩條氨基酸序列之間低或無同源性的缺口不包括在相似性百分?jǐn)?shù)的計算中。可用本領(lǐng)域已知的其它方法計算相似性百分?jǐn)?shù)，通過改變雜交條件，并可用MEGALIGN程序(DNASTARInc.，Madison，Wisconsin)電子化計算。本文所用的術(shù)語“植物”包括指一種或多種植物，即任何真核自養(yǎng)生物，例如被子植物和裸子植物、單子葉和雙子葉植物等，包括但不限于大豆、棉花、苜蓿、亞麻、番茄、甘蔗、甜菜、向日葵、馬鈴薯、煙草、玉米、小麥、水稻、萵苣、香蕉、木薯、紅花、含油種子、油菜、芥菜、蕓苔、大麻、藻類、海草等。術(shù)語“植物”還包括一種或多種植物細胞。術(shù)語“植物細胞”包括但不限于植物組織和器官，如種子、懸浮培養(yǎng)物、種胚、分生組織區(qū)、愈傷組織、葉、根、芽、配子體、孢子體、花粉、塊莖、球莖、鱗莖、花、果、球花、小孢子等。術(shù)語“翻譯后加工酶”指任何催化例如任何膠原或原膠原翻譯后修飾的酶。術(shù)語包括但不限于脯氨酰羥化酶、肽基脯氨酰異構(gòu)酶、膠原半乳糖苷羥賴氨酰葡糖轉(zhuǎn)移酶、羥賴氨酰半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶、C-蛋白酶、N-蛋白酶、賴氨酰羥化酶和賴氨酰氧化酶。本文所用的術(shù)語“啟動子”通常指能引發(fā)，指導(dǎo)和介導(dǎo)多聚核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的核酸序列的調(diào)控區(qū)。啟動子可以另外含有識別序列，例如上游或下游啟動子元件，它們可以影響轉(zhuǎn)錄速率。術(shù)語“非組成型啟動子”指通過特定組織誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的啟動子，或可以在環(huán)境或發(fā)育調(diào)控下誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，并包括抑制型和誘導(dǎo)型啟動子，例如傾向組織的，組織專一性的和細胞類型特異性的啟動子。這種啟動子包括但不限于可被低氧或冷壓力誘導(dǎo)的AdH1啟動子，被熱壓力誘導(dǎo)的Hsp70啟動子和可被光誘導(dǎo)的PPDK啟動子。“傾向組織的”啟動子是在某些組織中優(yōu)先引發(fā)轉(zhuǎn)錄的啟動子。“細胞類型特異性”的啟動子是主要在例如血管細胞的至少一個器官中的某些細胞類型中驅(qū)動表達的啟動子?！罢T導(dǎo)型”或“抑制型”啟動子是那些在環(huán)境控制下，例如轉(zhuǎn)染受到例如環(huán)境條件，如缺氧條件，存在光，生物壓力等，或內(nèi)部、化學(xué)或生物信號，如甘油醛磷酸脫氫酶、AOX1和AOX2甲醇誘導(dǎo)啟動子或物理損傷的影響。本文所用的術(shù)語“組成型啟動子”指引發(fā)、指導(dǎo)、介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，并且在大部分環(huán)境條件下和在發(fā)育或細胞分化的狀態(tài)下具有活性的啟動子。組成型啟動子的例子包括但不限于花椰菜花葉病毒(CaMv)35S，衍生自根瘤土壤桿菌T-DNA的1’-或2’-啟動子、遍在蛋白1啟動子、Smas啟動子、肉桂醇脫氫酶啟動子、甘油醛脫氫酶啟動子和Nos啟動子等。本文所用的術(shù)語“純化”描述了指定的分子存在于基本不存在其它生物大分子，例如多聚核苷酸、蛋白質(zhì)等的狀態(tài)下。術(shù)語優(yōu)選考慮感興趣的分子存在于溶液中或至少占80％重量；優(yōu)選至少85％重量；更優(yōu)選至少95％重量；和最優(yōu)選至少99.8％重量。可存在水、緩沖液和其它小分子，尤其是具有小于1kDa的分子量的分子。本文所用的術(shù)語“基本純化的”指從其天然環(huán)境取出的，分離或分開，并至少60％，優(yōu)選75％，最優(yōu)選90％無其它天然結(jié)合成分的核酸或氨基酸序列?！叭〈笔且粋€或多個氨基酸或核苷酸被不同的氨基酸或核苷酸分別置換。本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)染”指在細胞中引入表達載體的過程。各種轉(zhuǎn)染技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，例如顯微注射、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染或用基因槍。本文限定的“轉(zhuǎn)化”描述了外源核酸序列，例如DNA進入和改變受體細胞的過程。轉(zhuǎn)化可以在天然或人工條件下用各種本領(lǐng)域已知的方法發(fā)生。轉(zhuǎn)化可以依賴于任何已知方法，用于在原核或真核宿主細胞中插入外源核酸序列?；谝D(zhuǎn)化的宿主細胞的類型選擇方法，并且可包括但不限于病毒感染、電泳、熱休克、脂轉(zhuǎn)染和顆粒轟擊。這種“經(jīng)轉(zhuǎn)染的”細胞包括穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細胞，其中插入的DNA能作為自動復(fù)制質(zhì)?；蜃鳛樗拗魅旧w的一部分來復(fù)制，還包括瞬時表達插入的核酸一段有限時間的細胞。本文所用的術(shù)語“疫苗”指已殺死的或改變的微生物、活的減毒生物或活的完全烈性生物或任何其它因子，包括但不限于肽、蛋白質(zhì)、生物大分子或核酸的天然、合成或半合成的制備物，施用該制備物產(chǎn)生或人工提高對特定疾病的免疫力，以防止類似物質(zhì)的另一次感染。疫苗可以是活的或滅活的微生物或制劑，包括病毒和細菌，以及亞基、合成的、半合成或基于重組DNA的病毒和細菌。疫苗可以是單價(一種菌株/微生物/疾病疫苗)的，含有一種微生物或因子(例如脊髓灰質(zhì)炎病毒)，或一種微生物或因子的多種抗原。疫苗還可以是多價的，例如二價，三價等(混合的疫苗)，含有一種以上的微生物或制劑(例如麻疹-腮腺炎-風(fēng)疹(MMR)疫苗)或一種以上微生物或因子的抗原。從活微生物制備活的疫苗。減毒的疫苗是從微生物制備的活疫苗，它經(jīng)過物理改變或在實驗室動物宿主中系列傳代，或感染組織/細胞培養(yǎng)物，這種處理產(chǎn)生無毒的株或毒性減弱的株，但維持其產(chǎn)生保護性免疫的能力?；畹臏p毒疫苗的例子包括麻疹、腮腺炎、風(fēng)疹和犬瘟熱疫苗。滅活的疫苗是其中通過例如化學(xué)或物理處理(例如甲醛、β-丙內(nèi)酯或γ輻照)破壞了感染性微生物組分，而不影響病毒包被或膜蛋白下的細菌的抗原性或免疫原性。滅活的或亞基疫苗的例子包括流感、甲肝和脊髓灰質(zhì)炎(IPV)疫苗。亞基疫苗由來自病毒、細菌或其它能引起免疫應(yīng)答的關(guān)鍵大分子組成。這些成分可用許多方法獲得，例如通過從微生物純化，用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生等。亞基疫苗可含有任何感染因子的合成模擬物。亞基疫苗可包括大分子，例如細菌蛋白讀數(shù)(如破傷風(fēng)、白喉)、病毒蛋白(如流感病毒)、莢膜細菌(如流感嗜血菌和肺炎鏈球菌)的多糖和重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的病毒樣顆粒(如乙肝表面抗原)等。合成的疫苗是模擬病原體表面抗原的小合成肽構(gòu)成的，是免疫原性的，或可以是在重組DNA技術(shù)幫助下制造的疫苗，包括核酸經(jīng)過修改的完整病毒。半合成疫苗或偶聯(lián)疫苗由與蛋白質(zhì)載體分子結(jié)合的源于微生物的多糖構(gòu)成。DNA疫苗含有編碼抗原的重組DNA，在攝取DNA的宿主細胞中表達后，誘導(dǎo)針對所編碼的抗原的體液和細胞免疫應(yīng)答。對于多種感染性因子已經(jīng)開發(fā)了疫苗。本發(fā)明針對不論所涉及的因子，可用于疫苗制劑的重組明膠，因此不限于本文為了說明特別描述的疫苗。疫苗包括但不限于痘病毒(天花)、脊髓灰質(zhì)炎病毒(Salk和Sabin疫苗)。腮腺炎、麻疹、風(fēng)疹、白喉、破傷風(fēng)、水痘-帶狀皰疹(水痘/帶狀皰疹)、百日咳(百日咳)、卡介苗(BCG，結(jié)核病)、流感嗜血桿菌、腦膜炎、狂犬病、流行性霍亂、日本腦炎病毒、傷寒沙門氏菌、志賀氏菌、甲肝、乙肝、腺病毒、黃熱病、口蹄疫、單純皰疹病毒、呼吸道合胞病毒、輪狀病毒、登革熱、西尼羅河熱病毒、土耳其皰疹病毒(馬立克氏病)、流感和炭疽。本文所用的術(shù)語疫苗包括指各種已經(jīng)發(fā)生或?qū)⒁l(fā)生的感染性和自身免疫病，以及癌癥的疫苗，例如針對各種感染性和自身免疫疾病的疫苗，如針對HIV、HCV、瘧疾的疫苗，和對乳腺、肺、結(jié)腸、膀胱和卵巢癌的疫苗。多肽或氨基酸“變體”是改變自一種或多種來自特定氨基酸序列的氨基酸序列。多肽變體可以具有保守改變，其中取代的氨基酸具有與被置換的氨基酸具有類似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性能，例如用異亮氨酸取代亮氨酸。變體還可以具有非保守取代，其中取代的氨基酸可居于與被取代的氨基酸不同的生理性質(zhì)，例如用色氨酸置換甘氨酸。類似的小變化還可以包括氨基酸缺失或插入，或同時包括兩者。優(yōu)選氨基酸變體維持特定多肽的某些結(jié)構(gòu)或功能特征。確定取代、插入或除去哪些氨基酸殘基的指導(dǎo)可用本領(lǐng)域熟知的計算機程序，例如LASERGENE軟件(DNASTAR，Inc.Madison，WI)找到。多聚核苷酸變體是一種特定多聚核苷酸序列的變體，優(yōu)選與特定的多聚核苷酸序列具有至少約80％、更優(yōu)選至少約90％，最優(yōu)選至少約95％。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解由于基因編碼的簡并性，可產(chǎn)生編碼特定蛋白質(zhì)的多種不同的多聚核苷酸序列，其中一些與任何已知和天然存在的基因的多聚核苷酸序列的同源性最小。因此，本發(fā)明考慮可通過根據(jù)可能的密碼子選擇選擇組合制備的每一種可能的多聚核苷酸序列變體。可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)密碼子三個一組的基因編碼產(chǎn)生這些組合，所有都被視為特別公開。發(fā)明本發(fā)明提供了重組明膠和生產(chǎn)這些明膠的方法。本發(fā)明的重組明膠提供了穩(wěn)定和改善的表現(xiàn)，能克服各種健康和其它的擔(dān)心。用本發(fā)明的方法，可直接制造明膠而不用從動物來源通過劇烈和冗長的過程提取。本發(fā)明的重組明膠無病原體，例如病原性細菌，可傳染性海綿狀腦病(TSE)等。本發(fā)明的方法使可變性最小化，并在一定程度上實現(xiàn)了目前提取方法中不可獲得的可重復(fù)性。對于使用動物衍生的產(chǎn)品，安全性因素，例如對可能的免疫原性，例如抗原性和過敏原性反應(yīng)的關(guān)注提高了。目前使用的動物來源的明膠混合物不能完全確定特征，純化或復(fù)制目前在藥物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中一直受到關(guān)注。其它的安全性關(guān)注在于提取和純化過程中導(dǎo)致的細菌污染和內(nèi)毒素混入。本發(fā)明的重組明膠克服了這些問題，因為它們基本上無細菌污染或內(nèi)毒素。另外，本發(fā)明的重組人明膠與目前使用的動物衍生的相似產(chǎn)品相比提供了明顯的優(yōu)點，因為使用從天然人序列衍生的明膠可消除由于使用非人的動物衍生的蛋白引起免疫應(yīng)答的危險。另外，本發(fā)明的明膠可以各種不同的物質(zhì)產(chǎn)生，具有針對不同應(yīng)用優(yōu)化的特征。得到的產(chǎn)品比目前可得的衍生自動物的明膠內(nèi)部更一致和均勻。在一個實施例中，本發(fā)明提供了一種重組明膠?？捎酶鞣N物種的序列產(chǎn)生明膠，包括但不限于人、牛、豬、馬、嚙齒類、雞、羊和魚物種，或來自無脊椎動物。本發(fā)明的明膠與目前制備方法產(chǎn)生的明膠產(chǎn)品相比純度提高，蛋白質(zhì)負荷減少，內(nèi)毒素和其它污染物，包括核酸、多肽、朊病毒等的水平減少。該明膠因此比目前的方法制備的明膠安全，可以高劑量施給人和動物，同時使不良副反應(yīng)的危險最小化。本發(fā)明的明膠與商品明膠相比具有更高的活性和實用性，因為該明膠是直接制備的，具有針對于具體用途優(yōu)化的特征，提高了人們使用和配制明膠的能力。雖然目前從動物來源提取的明膠是不均一的產(chǎn)物，分子量在給定的批或樣品中差異很大，本發(fā)明的明膠包括一致、均勻和可重復(fù)的產(chǎn)品。本發(fā)明的重組明膠可用各種方法生產(chǎn)。在一個方法中，重組明膠通過重組膠原生產(chǎn)(見實施例7、10、11)。在另一種方法中，重組明膠是通過表達經(jīng)改變了的膠原構(gòu)建物，即含有編碼至少一個膠原結(jié)構(gòu)域，但不編碼天然存在的膠原的多聚核苷酸直接產(chǎn)生的(見例如實施例1、4和6)。在另一個方面，重組明膠衍生自不是全長天然存在的膠原或原膠原，但含有至少一個膠原結(jié)構(gòu)域的多肽(見例如SEQIDNO15-25、30、31和33)。重組明膠還可以是含有其它N-末端或C-末端前肽的序列(見例如SEQIDNO26-29)。在一個方面，本發(fā)明重組明膠衍生自重組膠原或原膠原。膠原分子通常是含有(Gly-X-Y)n重復(fù)(它在正常生物學(xué)體積下形成三鏈螺旋結(jié)構(gòu)域)的多肽鏈三聚體裝配而成的。(見例如vanderRest等(1991)FASEBJ.52814-2823)。目前，在脊椎動物中已鑒定出約二十種不同的膠原類型，包括牛、羊、豬、雞和人膠原。天然存在的膠原各種不同類型的結(jié)構(gòu)和生物功能的詳細描述是本領(lǐng)域可得的，例如在Ayad等(1998)TheExtracellularMatrixFactsBook，AcademicPress，SanDiego，CA；Burgeon，R.E.和Nimmi(1992)“膠原類型分子結(jié)構(gòu)和組織分布”于Clin.Orthop.282250-272；Kielty，C.M.等(1993)“膠原家族胞外基質(zhì)中的結(jié)構(gòu)，裝配和組織”ConnectiveTissueAndItsHeritableDisorders，MolecularGenetics，AndMedicalAspects，Royce，P.M.和B.Steinmann編，Wiley-Liss，NY，pp.103-147；和Prockop，D.J.和K.I.Kivirikko(1995)“膠原分子生物學(xué)，疾病和治療性能”，Annu.Rev.Biochem.64403-434。I型膠原是骨骼和肌肉的主要纖維膠原，占生物體全部膠原的約80-90％。I型膠原是多細胞生物胞外基質(zhì)的主要的結(jié)構(gòu)大分子，占總蛋白質(zhì)量的約20％。I型膠原是雜三聚分子，含有兩條α1(I)鏈和一條α2(I)鏈，分別由COL1A1和COL1A2基因編碼。其它膠原類型比I型膠原少，顯示不同的分布情況。例如，II型膠原是軟骨和玻璃液中的主要膠原，而III型膠原以高水平存在于血管中，而在皮膚中較少一些。III型膠原是皮膚和血管中的主要纖維膠原。III型膠原是同三聚膠原，含有三條相同的α1(III)鏈，由COL3A1基因編碼。純化的II型膠原可從組織中通過本領(lǐng)域已知的方法，例如Byers等(1974)Biochemistry135243-5248和Miller和Rhodes(1982)MethodsinEnzymology8233-64的方法制備。翻譯后加工酶是原膠原和膠原蛋白生物合成重要的。例如，脯氨酰4-羥化酶是細胞合成原膠原或膠原必需的翻譯后加工酶。該酶將重復(fù)的-Gly-X-Y-序列中Y位置的脯氨酰殘基羥化成4-羥脯氨酸(見例如Prockop等(1984)N.Engl.J.Med.311376-386)。新合成的鏈不能維持穩(wěn)定的三鏈螺旋構(gòu)形，除非合適數(shù)量的Y-位置脯氨酰殘基被羥化。另外，如果不發(fā)生羥化或羥化不夠，多肽不能正確分泌，可能會降解。脊椎動物脯氨酰4-羥化酶是α2β2四聚體(見例如Berg和Proekop(1973)J.Biol.Chem.2481175-1192；和Tuderman等(1975)Eur.J.Biochem.529-16)。α亞基含有與脯氨酰殘基羥化有關(guān)的催化位點，但在缺乏β亞基的情況下是不溶的。β亞基，蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶催化巰基-二硫鍵互換，導(dǎo)致形成對建立穩(wěn)定蛋白必需的二硫鍵。當(dāng)作為脯氨酰4-羥化酶四聚體的一部分時，β亞基保留50％蛋白質(zhì)二硫異構(gòu)酶活性(見例如Pihlajaniemi等(1987)EmboJ.6643-649；Parkkonen等(1988)Biochem.J.2561005-1011；和Koivu等(1987)J.Biol.Chem.2626447-6449)。在例如Sf9昆蟲細胞和酵母細胞中通過同時表達α和β亞基產(chǎn)生了活性重組人脯氨酰4-羥化酶(見例如Vuori等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA897467-7470；美國專利號5,539,859)。除了脯氨酰4-羥化酶，在文獻中已鑒定和報道了其它膠原翻譯后加工酶，包括C-蛋白酶，N-蛋白酶，賴氨酰氧化酶和賴氨酰羥化酶等(見例如Olsen等(1991)CellBiologyofExtracellularMatrix，第二版，Hay編，PlenumPress，NewYork)。本發(fā)明特別考慮了如需要，用任何能夠羥化，例如脯氨酸羥化和/或賴氨酸羥化的生物學(xué)或化學(xué)化合物羥化本發(fā)明的重組明膠。這包括例如內(nèi)源性或外源性補充的來自任何物種的脯氨酰4-羥化酶，包括脯氨酰4-羥化酶的各種同工型，和具有所需活性的脯氨酰4-羥化酶的任何變體或片段或亞基，不論是天然的，合成的或半合成的，和脯氨酰3-羥化酶等其它羥化酶(見例如美國專利號5,928,922，在此完整引入以供參考)。在一個實施例中，脯氨酰羥化酶活性是由衍生自編碼重組膠原或明膠的多聚核苷酸，或編碼可衍生重組明膠的多肽的相同物種的脯氨酰羥化酶賦予的。在另一個實施例中，脯氨酰4-羥化酶來自人，所編碼的多聚核苷酸衍生自人序列。本發(fā)明提供了操縱明膠的熱塑性，產(chǎn)生具有所需物理特征的物質(zhì)的方法。在一種方法中，在具有內(nèi)源脯氨酰羥化酶或其它羥化酶的宿主系統(tǒng)，例如某些哺乳動物或昆蟲細胞，或轉(zhuǎn)基因動物或植物或植物細胞中表達編碼的多聚核苷酸。在這樣的系統(tǒng)中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有各種羥化百分?jǐn)?shù)，即無羥化，部分羥化和完全羥化的重組明膠混合物的方法。例如，在一種具有不同羥化百分?jǐn)?shù)的重組明膠中，通過在例如轉(zhuǎn)基因動物中通過內(nèi)源脯氨酰羥化酶賦予羥化，羥化百分?jǐn)?shù)的分布從無羥化到完全羥化，產(chǎn)生的物質(zhì)的解鏈溫度在28℃-36℃，Tm中間值約30-32℃。如需要，可沿溫度梯度分離不同的物質(zhì)組分，因為如果下游用途需要篩選例如羥化更完全的物質(zhì)，例如充分羥化，在例如體溫下(37℃)維持三鏈螺旋結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，這是必需的。在另一個實施例中，重組明膠在某一系統(tǒng)，例如轉(zhuǎn)基因動物中產(chǎn)生，其中用外源脯氨酰羥化酶提供羥化。在一個方面，這種產(chǎn)生重組明膠的方法提供了重組明膠，范圍在非羥化到完全羥化。羥化更完全的重組明膠的部分在外源脯氨酰羥化酶的存在下，比僅存在內(nèi)源性脯氨酰羥化酶產(chǎn)生的重組物質(zhì)要多得多。因此，產(chǎn)生的物質(zhì)的解鏈溫度可在例如28-40℃，具有約34-36℃的Tm中值。這種明膠混合物適用于各種應(yīng)用，例如明膠膠囊制造，而不需要任何羥化部分的分級和分離。上述方法提供了具有各種解鏈溫度的重組物質(zhì)的生產(chǎn)，它們不難分離，例如可用溫度梯度將在特定溫度，如36℃下是固態(tài)的物質(zhì)與在特定溫度下是液體的物質(zhì)分開。另外，本發(fā)明提供了成本低廉的生產(chǎn)物質(zhì)的方法，該物質(zhì)不經(jīng)過分離就適合在大批量用途中使用。例如，凝膠膠囊的制造與使用上述方法產(chǎn)生的重組明膠有關(guān)，其中具有一定解鏈溫度范圍的重組物質(zhì)具有約33℃的理想解鏈溫度。在本方法中，可直接在所需系統(tǒng)，例如轉(zhuǎn)基因動物中產(chǎn)生重組明膠，或通過水解，例如酸、熱或酶，在所需系統(tǒng)中從重組膠原衍生。在一個實施例中，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生含有重組膠原的重組明膠，和從重組膠原生產(chǎn)重組明膠的方法。在一個方面，該方法包括表達至少一條編碼膠原或原膠原，或其片段或變體的多聚核苷酸，和翻譯后加工酶或其亞基的多聚核苷酸，和至少一條編碼膠原翻譯后加工酶或其亞基的多聚核苷酸(見例如美國專利號5,593,859，在此完整引入以供參考)。本發(fā)明的重組明膠可用本領(lǐng)域已知的方法衍生自重組膠原(見例如Veis，A.(1965)IntRevConnectTissueRes.，3113-200)例如所有膠原到明膠提取法的共同特征是膠原蛋白的二級結(jié)構(gòu)喪失，在大部分情況下是膠原結(jié)構(gòu)改變。用于產(chǎn)生本發(fā)明的明膠的膠原可用不同方法加工，視所需明膠類型決定?？蓮闹亟M產(chǎn)生的膠原或原膠原或其它膠原性多肽，或從細胞培養(yǎng)物，例如脊椎動物細胞培養(yǎng)物，用各種本領(lǐng)域已知的方法衍生本發(fā)明的重組動物明膠。例如，明膠可直接從細胞團塊或培養(yǎng)液中通過利用明膠在升溫下的溶解度，及其在低或高pH，低或高鹽濃度和高溫下的穩(wěn)定性衍生出來。從膠原產(chǎn)生明膠組合物的方法、過程和技術(shù)包括在升溫下用蛋白水解酶消化，利用去污劑、熱或各種本領(lǐng)域熟知的變性劑使膠原的三鏈螺旋結(jié)構(gòu)變性。另外，可用與從動物和屠宰場來源提取明膠有關(guān)的各種步驟，包括用石灰或酸處理，在水溶液中熱提取，離子交換層析、交流過濾和各種干燥方法，從重組膠原中衍生本發(fā)明的明膠。在一個方面，本發(fā)明的明膠由三鏈螺旋構(gòu)成，含有至少一種膠原亞基，膠原鏈或其片段。特定膠原鏈、亞基或其片段中的Gly-X-Y單元可以是相同或不同的。優(yōu)選X和Y是脯氨酸或羥脯氨酸，組成鏈的每第三個殘基是甘氨酸。X和Y的氨基酸是脯氨酸或羥脯氨酸，各Gly-X-Y是相同或不同的。在另一個實施例中，本發(fā)明的重組明膠含有(Gly-X-Y)n的氨基酸序列，其中X和Y是任何氨基酸。在一個實施例中，該明膠衍生自一種基本無其它類型的膠原的重組膠原。在一個方面，重組膠原是I型膠原。在另一個方面，重組膠原是III型膠原。在本發(fā)明的另一個方面，重組膠原是人重組膠原?？紤]了本發(fā)明的其它實施例，其中重組膠原是任何一種膠原類型，例如膠原類型I-XX的任何一種，或任何其它膠原，天然、合成或半合成的膠原。特別考慮了實施例，其中重組明膠衍生自膠原I-XX型任何一種或多種，或任何其它天然、合成或半合成的膠原。本發(fā)明產(chǎn)生重組明膠的方法比傳統(tǒng)的明膠提取法有許多優(yōu)點。最重要的是，該方法提供了含有天然膠原序列的可靠的非組織來源的明膠。另外，目前的提取方法不能使用任何人明膠的天然來源，例如那些在各種醫(yī)學(xué)應(yīng)用中可能是有利的。本發(fā)明特別提供了衍生自人序列的重組明膠。重組人明膠在醫(yī)學(xué)和藥學(xué)方法中使用是非免疫原性的，還考慮了它的各種用途。在另一個方面，本發(fā)明提供了從能表達經(jīng)各種形式的工程改造的構(gòu)建物中生產(chǎn)該明膠。本發(fā)明特別考慮了用重組脯氨酰羥化酶和各種合成構(gòu)建物，包括非天然膠原構(gòu)建物產(chǎn)生明膠。另外，本發(fā)明提供了可設(shè)計成具有特定應(yīng)用所需的特定特征的重組明膠。還考慮了產(chǎn)生這些明膠的方法。用目前的方法，可以產(chǎn)生具有所需凝膠強度、粘度、解鏈特征、等電情況、pH、羥化程度、氨基酸組成、味道、顏色等的明膠。在本發(fā)明的一個方法中，產(chǎn)生了非水解的明膠，然后如需要可以完全或部分水解。明膠性能明膠的各種物理性能限定了它在特定應(yīng)用中的用途。明膠提供了基于例如其兩性性質(zhì)、其形成熱-可逆凝膠、其保護性膠態(tài)和表面活性性能，及其對粘度和穩(wěn)定性的作用的獨特表現(xiàn)。在各種應(yīng)用中使用明膠，例如乳化劑、增稠劑或穩(wěn)定劑；作為薄膜或糖衣的形成劑；作為接合劑；作為粘合劑或膠水；或作為絮凝劑。原料，預(yù)處理的形式和提取過程都影響在傳統(tǒng)過程中獲得的明膠多肽的組成。目前可得的動物產(chǎn)品因此是不均一多肽鏈的蛋白質(zhì)混合物。明膠分子可以相當(dāng)大，一種特定樣品中的分子量范圍從幾百到幾千kDa。特定批中的明膠分子量分布可以是關(guān)鍵的，因為分子量分布可影響例如明膠樣品的粘度和/或凝膠強度。總的說，明膠溶液的粘度隨著濃度升高和溫度降低提高。對于用作穩(wěn)定劑或增稠劑，優(yōu)選粘度更高的溶液。在一些應(yīng)用中，例如在各種乳化液中。優(yōu)選液態(tài)明膠，明膠溶液的粘度隨著明膠組分的分子量提高而提高。因此高粘度明膠溶液可以組成高濃度的低分子量明膠，或低濃度的高分子量明膠。粘度還影響凝膠特性，包括凝結(jié)和融化點。高粘度明膠溶液提供了具有比低粘度明膠溶液融化和凝結(jié)速率高的明膠。明膠的熱可逆性和熱塑性是在許多應(yīng)用中被探索過的性質(zhì)，例如在凝膠膠囊和片劑的制造中。可適當(dāng)加熱、塑造或成型，并冷卻形成膠囊或片劑糖衣，它們在穩(wěn)定溫度下具有獨特性質(zhì)。明膠在口腔溫度下開始融化。方便吞服，在體溫下變?yōu)橐后w。各種凝膠強度的明膠適用于不同應(yīng)用。通常通過計算Bloom值測量特定凝膠的堅固度或強度，它可以用國際標(biāo)準(zhǔn)和方法確定。簡單說，Bloom強度是以6.67％明膠溶液在恒溫水浴中放置18小時形成的凝膠強度的量度。用標(biāo)準(zhǔn)紋理分析儀測量將一標(biāo)準(zhǔn)AOAC(法定農(nóng)業(yè)化學(xué)家協(xié)會)插棒壓入凝膠4毫米的重量，以克計。如果壓入插棒所需的以克計算的重量是200克，特定的明膠具有200的Bloom值。(見例如，UnitedStatesPharmacopoeiaandOfficialMethodsofAnalysisofAOACInternational，17版，卷II)。因此可根據(jù)Bloom強度對商品明膠分析并出售。不同范圍的Bloom值適合不同的明膠用途；例如用于各種工業(yè)應(yīng)用，例如混凝土穩(wěn)定，砂型鑄造、模具、膠水、涂層等的明膠可從各種不同Bloom強度中選擇，視所需的表現(xiàn)特征而定。在各種藥物產(chǎn)品的制備中還需要各種Bloom強度的明膠。例如，軟明膠膠囊通常用具有約150-175Bloom值的骨膠原或皮明膠，和/或用Bloom值約190-210的豬衍生的明膠，或其混合物制造，而硬明膠膠囊可使用具有約220-260的Bloom值的明膠。在食品應(yīng)用中，作為棉花糖或其它糖果制品中的增稠劑的明膠可具有約250的Bloom強度。各種應(yīng)用，包括某些照像應(yīng)用中的乳化液和各種工業(yè)涂層涉及使用非凝結(jié)明膠。本發(fā)明提供了具有不同Bloom強度的重組明膠的生產(chǎn)方法。在一個方面，本發(fā)明提供了例如具有約50，100，150，200，250和300的Bloom強度的明膠。在一個實施例中，本發(fā)明提供了具有約400的Bloom強度的重組明膠的生產(chǎn)方法。這樣的明膠可用于例如制造凝膠膠囊，可制造更輕和更薄的膠囊，因為需要使用較少材料來提供具有足夠強度的凝膠。還考慮了Bloom強度低于100，包括從0-100的重明膠。本發(fā)明提供了設(shè)計具有具體應(yīng)用所需的物理特性的重組明膠。在一個實施例中，本發(fā)明提供了含有特定分子量或分子量范圍的單一分子的重組明膠，和生產(chǎn)這些重組明膠的方法。該均勻和單一的物質(zhì)是有利的，因為它們提供了具有可預(yù)測表現(xiàn)的可靠產(chǎn)品來源，使產(chǎn)品表現(xiàn)和制造參數(shù)中的可變性最小化。目前，來自不同批量的明膠有時必需混合，來產(chǎn)生具有所需物理性質(zhì)，例如由特定分子量或分子量范圍提供的粘度和凝膠強度等的混合物。在對于具有特定分子量范圍的重組明膠比具有特定分子量的重組明膠更好的應(yīng)用領(lǐng)域中，本發(fā)明提供了這種物質(zhì)。用本發(fā)明的重組明膠，制造商可以例如將批量的具有特定分子量的重組明膠以一定的百分?jǐn)?shù)混合，以得到具有所需分子量范圍的混合物。另外，該重組明膠本身比目前市售的產(chǎn)品更均勻，具有更好的一致性。在本發(fā)明的一個方法中，用酸或熱水解加工重組具有，以產(chǎn)生分子量范圍比目前出售的明膠產(chǎn)品分子量范圍窄的重組明膠。用合適和受控的水解條件，該方法產(chǎn)生分子量分布與市售明膠類似的重組人明膠，以及范圍比目前出售的產(chǎn)品分子量范圍窄的重組明膠(見實施例9和10)。本發(fā)明提供了單一分子量或特定分子量范圍的重組明膠，除去可變性和不可預(yù)見性，能夠微調(diào)過程和可預(yù)見的行為。該方法能夠出售具有任何所需分子量或分子量范圍的重組明膠。例如，在一個實施例中，重組明膠具有大于300kDa的分子量。在另一個實施例中，重組明膠具有約150-250kDa、或約250-350kDa的分子量范圍。特別考慮了其它分子量范圍，包括但不限于下列分子量范圍約0-50kDa、約50-100kDa、約100-150kDa、約150-200kDa、約200-250kDa、約250-300kDa和約300-350kDa。在另一個方面，可產(chǎn)生具有與市售明膠類似的分子量，約10-70kDa的重組明膠。在優(yōu)選例中本發(fā)明提供了分子量范圍較小的重組明膠，它目前未出售，例如約1030kDa、約30-50kDa和約50-70kDa。在具體實施例中，提供了鏈長賦予適用于所要的領(lǐng)域的特定性能的重組明膠。在本發(fā)明的各個實施例中，考慮了具有約1kDa、5kDa、8kDa、9kDa、14kDa、16kDa、22kDa、23kDa、44kDa和65kDa的單一分子量的重組明膠。特別是，在本發(fā)明的一種方法中，從截短的膠原序列，例如表2中列出的序列產(chǎn)生明膠。這些序列代表特定膠原結(jié)構(gòu)域，編碼明膠的短形式。該明膠能維持明膠有價值的物理特性，例如薄膜形成性，雖然比常規(guī)衍生的動物明膠平均分子量小或大?？芍圃旄鞣N膠原序列的改變，包括例如膠原、膠原鏈、亞基或其片段的變性，或改變羥化的程度，產(chǎn)生具有特定物理性能的明膠，即比常規(guī)明膠的融化點高或低，具有不同的氨基酸組成，特定的分子量或范圍等，這些變化在本文中特別考慮。典型形成原纖維的膠原分子，例如I型膠原的分子量是300kDa。在一些應(yīng)用中，例如使用高分子量明膠的那些，可能需要產(chǎn)生比目前提取的明膠更大的分子量。因此，在本發(fā)明的一個實施例中，可產(chǎn)生含有比目前抽提出商品明膠的膠原大的分子的明膠?？芍苯訉⑺玫降母叻肿恿棵髂z產(chǎn)品用于各種其物理性質(zhì)所需的用途，或可分離和隨后處理，產(chǎn)生較小的分子。在一個實施例中，可用大于常規(guī)動物來源的膠原生產(chǎn)明膠。例如，可修改該產(chǎn)生方法適應(yīng)衍生自vestimentiferan管蟲(Riftiapachyptilla)(分子量約2600kDa)和環(huán)節(jié)動物(Alvinellapompejana)(分子量約1700kDa)的體壁的酸可溶性表皮膠原。這些膠原可適應(yīng)該生產(chǎn)方法，生產(chǎn)比從其提取目前可得的明膠的分子產(chǎn)生更大的分子，可處理得到的產(chǎn)物以產(chǎn)生所需的明膠。特別考慮可通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)各種分子量的明膠。例如，可改變該重組明膠的特征，如羥化百分?jǐn)?shù)，交聯(lián)程度等，生產(chǎn)具有所需分子量的重組明膠。在一個方面，例如，本發(fā)明提供了一種通過使用本領(lǐng)域已知的交聯(lián)劑，交聯(lián)明膠多肽產(chǎn)生大分子量重組明膠的方法(見討論，下文)。在本發(fā)明的另一個方面，從含有多拷貝的完整或片段的天然膠原序列表達可衍生明膠的多肽。例如在一個實施例中，本發(fā)明提供了一種經(jīng)改變的膠原構(gòu)建物，它含有I型膠原的膠原結(jié)構(gòu)域的多個拷貝。在另一個實施例中，構(gòu)建物含有I型和III型膠原結(jié)構(gòu)域的拷貝。本發(fā)明提供了單個或多個編碼任何膠原，包括膠原I-XX型的全部或部分序列的拷貝。特別考慮本發(fā)明能產(chǎn)生衍生自一種以上膠原類型的明膠。在一個實施例中，在表達系統(tǒng)，例如宿主細胞，轉(zhuǎn)基因動物等中表達衍生自一種以上膠原的重組明膠，從而產(chǎn)生明膠混合物。在另一個實施例中，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生明膠，而不從膠原或原膠原三鏈螺旋階段衍生的方法。在一個方面，這涉及通過在高溫表達系統(tǒng)，例如依賴嗜熱性生物的系統(tǒng)中表達各種構(gòu)建物，產(chǎn)生重組明膠。該系統(tǒng)不能形成三鏈螺旋，而使得脯氨酰羥化酶具有活性。該明膠還可以衍生自含有突變、添加或缺失，防止三鏈螺旋形成的膠原構(gòu)建體。在另一個方面，這涉及從截短的構(gòu)建物產(chǎn)生明膠，該構(gòu)建物不能在常溫，如37℃下形成三鏈螺旋。另外，可在三鏈螺旋形成的抑制劑，例如聚陰離子(與生物合成性膠原構(gòu)建物一起表達)存在下產(chǎn)生明膠。另外，本發(fā)明的生物合成的明膠可以衍生自重組產(chǎn)生的膠原鏈，它們不形成三鏈螺旋。在另一個實施例中，本發(fā)明提供了一種從非羥化膠原或其中脯氨酰殘基只是部分而未完全羥化的膠原中衍生明膠的方法。在一個方面，該方法包括從在不存在脯氨酰羥化酶條件下，例如在沒有脯氨酰羥化酶的昆蟲表達系統(tǒng)中表達的膠原衍生明膠(見例如，Myllyharju等(1997)J.Biol.Chem.272，21824-21830)。在本發(fā)明的一個方法中，明膠衍生自部分羥化或非羥化的膠原?？赏ㄟ^體外施用羥化酶賦予羥化。在一個方法中，可對細菌或酵母宿主細胞提供羥脯氨酸來使得低程度的羥脯氨酸替代脯氨酸。本發(fā)明包括完全羥化的、部分羥化的和非羥化的重組明膠。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法包括生產(chǎn)具有特定羥化程度的明膠或明膠前體。在另一個方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)20-80％羥化，優(yōu)選約30-60％羥化，最優(yōu)選約40％羥化的明膠。(見實施例4和5)?？赏ㄟ^混合特定百分?jǐn)?shù)的具有不同羥化程度的重組明膠獲得本發(fā)明的部分羥化的重組明膠，或可以直接獲得(見實施例4和5)。另外，本發(fā)明提供了通過對非羥化的重組明膠體外施用脯氨酰羥化酶，并控制反應(yīng)長短，實現(xiàn)重組明膠的部分羥化。目前可得的動物來源的明膠的熱特性可變程度有限。本發(fā)明特別提供了產(chǎn)生重組明膠的方法，其中重組明膠具有針對于特定應(yīng)用理想的特定熱特性。用本發(fā)明的方法，例如可用各種方法操縱重組明膠的融化點和/或凝膠強度。可用各種本領(lǐng)域熟知的技術(shù)測量重組明膠的溫度穩(wěn)定性和/或凝膠強度。一般而言，明膠的融化點隨著羥化程度的提高而升高。用本發(fā)明的方法，可能通過操縱羥化和/或交聯(lián)產(chǎn)生高分子量的明膠，它比目前出售的動物來源的明膠凝膠強度低和/或融化點低。因此，本發(fā)明提供了具有在各種商品中不能獲得的性能的重組明膠，它適用于需要高分子量明膠，以獲得提高的薄膜強度等，但需要不凝結(jié)或低凝膠強度的產(chǎn)品的用途。在一個實施例中，本發(fā)明提供了由于脯氨酸殘基的不完整羥化具有低溫穩(wěn)定性的重組明膠。這些重組明膠可用于各種用途。在用目前的提取方法產(chǎn)生的明膠中，僅魚明膠提供了不凝結(jié)的高平均分子量的膜形成蛋白。非凝結(jié)的魚明膠的非凝結(jié)和冷水熔解性能可與目前可得的水解牛和豬明膠相當(dāng)，但后兩者的薄膜強度和柔性相應(yīng)喪失，因為水解的明膠平均分子量低。因此在一個實施例中，本發(fā)明提供了比目前可得的動物來源的物質(zhì)具有較低凝膠強度和較高分子量的部分羥化的重組明膠。具有更高的分子量，更低的凝膠強度的重組明膠還可以用于各種需要穩(wěn)定性，但需要無凝結(jié)性或低凝結(jié)性，以維持藥物產(chǎn)品的延展性和完整性的藥物領(lǐng)域。這種重組明膠可用作例如血漿容量擴張劑，因為其分子量可以提供穩(wěn)定性，提高在循環(huán)中的保留時間，改變的凝固點將防止物質(zhì)在室溫下凝結(jié)，使得不用施用容量擴張劑保溫。在一個實施例中，本發(fā)明提供了一種部分羥化的重組明膠，它適合用于藥物領(lǐng)域，例如，作為血漿容量擴張劑。在另一個方面，通過在不存在脯氨酰羥化酶的條件下，例如在沒有脯氨酰羥化酶的昆蟲表達系統(tǒng)中，表達重組明膠，或表達衍生出該重組明膠的多肽獲得部分羥化的重組明膠。(見例如Myllyharju等(1997)J.Biol.Chem.272，21824-21830)。在生產(chǎn)的時候發(fā)生羥化，或隨后可通過體外生物學(xué)或化學(xué)修飾施加。在本發(fā)明的一種方法中，重組明膠可衍生自部分羥化或完全羥化的明膠。組成的膠原分子的賴氨酸殘基之間的共價交聯(lián)的存在大大強化了用目前可得的方法從天然來源衍生的明膠。交聯(lián)天然在胞外空間中，在交聯(lián)分泌和原纖維形成后發(fā)生。胞外酶賴氨酰氧化酶隨后除去膠原分子中的某些賴氨酸和羥賴氨酸的氨基，得到高度反應(yīng)性的醛基，它自發(fā)反應(yīng)形成共價鍵。得到的交聯(lián)膠原產(chǎn)生凝膠強度和粘性提高的明膠。特別是，高度的交聯(lián)導(dǎo)致具有更高融化溫度和更高凝膠強度的明膠。在一個方面，本發(fā)明提供了交聯(lián)的重組明膠，得到更高分子量的明膠(見實施例7)?？捎貌煌椒▽崿F(xiàn)交聯(lián)，例如用生物學(xué)或化學(xué)修飾。例如在一個實施例中，在賴氨酰羥化酶和賴氨酰氧化酶存在下，表達可衍生明膠的重組明膠或多肽。在另一個實施例中，在表達后通過交聯(lián)修飾多肽。在另一個方面，本發(fā)明提供了通過化學(xué)方法，例如通過反應(yīng)性化學(xué)交聯(lián)劑，例如1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)實現(xiàn)交聯(lián)。(見實施例7)。還可用其它化學(xué)交聯(lián)劑，例如二(磺基琥珀酰氨基)軟木酸酯(BS3)、3，3’-二硫二(磺基琥珀酰氨基)丙酸酯(DTSSP)和Tris-磺基琥珀酰氨基氨基三乙酸酯(磺基-TSAT)，如本領(lǐng)域已知的各種試劑。另外，本發(fā)明提供了生產(chǎn)具有各種程度的交聯(lián)的重組明膠的方法，用于獲得所需融化點、凝膠強度和粘度的重組明膠。本發(fā)明提供了操縱重組明膠的分子量、羥化水平和交聯(lián)程度的方法，使得建立不同和特別的Bloom強度，以及不同和特定水平的粘度的重組明膠。脯氨酸羥化在天然膠原形成中起到中心作用。序列X-Lys-Gly中的特定賴氨酰殘基的羥化也在膠原合成和原纖維形成中起到了重要的作用。修飾的賴氨酸殘基上的羥基作為糖類的結(jié)合位點和作為形成穩(wěn)定分子間交聯(lián)的中心位點。這些修飾需要特定酶，賴氨酰羥化酶和賴氨酰氧化酶的表達。因此在本發(fā)明的一個方面，考慮了這些酶與本發(fā)明的多肽的共表達。在宿主細胞中表達編碼賴氨酰羥化酶的基因(Hautala等(1992)Genomics1362-69)，然后通過引入編碼明膠或衍生出明膠的多肽的序列進一步修飾，如本發(fā)明所述。本發(fā)明的重組明膠因此能由內(nèi)源表達的賴氨酰羥化酶和賴氨酰氧化酶的活性進行翻譯后修飾。本發(fā)明的重組明膠還可通過表達外源的賴氨酰羥化酶和賴氨酰氧化酶修飾。在一個實施例中，產(chǎn)生的重組明膠是非羥化的，隨后通過賴氨酰羥化酶的酶活性，產(chǎn)生所需的賴氨酸殘基的羥化程度。改變賴氨酰羥化程度的能力是生產(chǎn)明膠和可衍生出明膠的多肽中必需的，不同程度的交聯(lián)導(dǎo)致所需的凝膠強度和粘度。在另一個實施例中，含有羥賴氨酸殘基的多肽還可以在例如酵母細胞中表達，其中通過脯氨酰羥化酶的活性產(chǎn)生了羥脯氨酸(見實施例1和4)。在一些實施例中，可配制經(jīng)修飾的重組明膠或能衍生出明膠的多肽，并施給動物或人，作為內(nèi)源性酶活性的底物，例如賴氨酰氧化酶，使得膠原多肽以穩(wěn)定的交聯(lián)形式摻入組織。因此，本發(fā)明的一個方面提供了具有商品用途的所需凝膠強度和粘度，而不需要賴氨酰羥化酶或賴氨酰氧化酶的重組明膠的生產(chǎn)方法。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生具有特定膠凝點的明膠的方法。在一個實施例中，本方法提供了具有15-35℃的凝結(jié)或膠凝點的明膠。在另一個實施例中，重組明膠具有15-25℃，25-35℃和20-30℃的膠凝點。在各種方面，本發(fā)明提供了非水解，完全水解或水解到不同程度的重組明膠，例如作為水解或非水解產(chǎn)品混合物的明膠。另外，本發(fā)明提供了生產(chǎn)具有不同水解程度的重組明膠的方法(見實施例9和10)。明膠水解物通常是冷水可溶的，用于各種用途，特別是藥物和食物工業(yè)，其中具有非膠凝性質(zhì)的明膠是理想的。用于藥物工業(yè)的明膠水解物是薄膜形成劑、微囊化過程、關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)減壓配方、壓片和各種營養(yǎng)制劑。在化妝品工業(yè)，在洗發(fā)水和護發(fā)素、乳液和其它配方，包括唇膏和指甲配方等中使用明膠水解物。明膠水解物在蛋白質(zhì)和機能飲料和食品中作為營養(yǎng)補充物；用作酒、啤酒和果汁澄清的澄清劑；用作添加劑，例如食品調(diào)味劑和色素的微囊化。明膠水解物由于其薄膜形成特征被用于工業(yè)應(yīng)用，例如對半導(dǎo)體制備中的元件涂層。在本發(fā)明的一個實施例中，從膠原序列產(chǎn)生明膠，其中特定的天然結(jié)構(gòu)域有缺失或添加，以改變表達產(chǎn)品的行為。本發(fā)明還考慮生產(chǎn)重組明膠的方法，其中明膠是直接從經(jīng)改變了的明膠構(gòu)建物中產(chǎn)生的，不產(chǎn)生完整的三鏈垂直螺旋。特別是，本發(fā)明考慮產(chǎn)生含有表達各種工程改造的構(gòu)建物的方法。這些構(gòu)建物不編碼標(biāo)準(zhǔn)的三鏈螺旋膠原。例如，特定缺失可消除膠原酶反應(yīng)性區(qū)域，和各種引起免疫原性，如抗原性和免疫原性反應(yīng)的方法。各種膠原的特定結(jié)構(gòu)域與特定活性有關(guān)(見例如Shahan等(1999)Con.Tiss.Res.40221-232；Raff等(2000)HumanGenet10619-28，都在此完整引入以供參考)。特別的是，本發(fā)明特別提供了生產(chǎn)衍生自改變了的膠原構(gòu)建物的方式，這構(gòu)建物消除或減少，或提高了與特定活性有關(guān)的一種膠原基因的特定區(qū)域。特別是，該區(qū)域能夠完全或部分缺失，來產(chǎn)生缺乏或減少特定活性的明膠，或可加入特定區(qū)域的額外拷貝，來產(chǎn)生具有增強的活性的明膠。例如，鑒定了血小板細胞表面上α2β1整合蛋白受體識別的I型和III型膠原序列(Knight等，(1998)J.Biol.Chem.其參考文獻在此完整引入以供參考)。這些明膠可包含在例如與吻合術(shù)和血管移植有關(guān)的產(chǎn)品中，包括伸展的包被和移植裝置。該產(chǎn)品與不良副作用相關(guān)，例如血栓形成，它的發(fā)生與使用這些產(chǎn)品有關(guān)，因為膠原產(chǎn)品中存在而小板聚集區(qū)。在一個方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生重組明膠的方法，該明膠不包括血小板反應(yīng)區(qū)，因此使血小板聚集的危險最小化(見實施例2)。因此，本發(fā)明在一個實施例中提供了含有重組明膠的伸展涂層。在一個優(yōu)選例中，重組明膠是重組人明膠。在一些情況下，例如各種傷口護理用途中，理想的是提供含有能誘導(dǎo)特定聚集活性的結(jié)構(gòu)域的重組明膠。可從不編碼α2β1受體識別的區(qū)域的膠原構(gòu)建物，或從具有一個或多個這些區(qū)域的拷貝的構(gòu)建物表達本發(fā)明的明膠，從而提供均勻和一致的明膠產(chǎn)品。在一個方面，本發(fā)明提供了通過高效重組表達生產(chǎn)重組明膠的方法。該生產(chǎn)方法與目前的提取方法相反，提供了高超的適應(yīng)性，因為可使用多種表達系統(tǒng)的任何一種。例如可在酵母或植物生物團塊中獲得生產(chǎn)原料?？赏ㄟ^例如指定本發(fā)明方法產(chǎn)生的特定明膠分子的獨特大小，來優(yōu)化一些生產(chǎn)系統(tǒng)的分泌。在許多實施例中，衍生出這些明膠的明膠或多肽在表達系統(tǒng)中產(chǎn)生，這些表達系統(tǒng)包括但不限于酵母、動物、植物和昆蟲表達系統(tǒng)?？紤]了轉(zhuǎn)基因動物和轉(zhuǎn)基因植物等表達系統(tǒng)。本發(fā)明提供了表達至少一種編碼明膠的多聚核苷酸或在細胞中衍生出明膠的多聚核苷酸。在一個實施例中，本發(fā)明提供了表達多種編碼明膠或在細胞中衍生出明膠的多肽的多聚核苷酸，例如產(chǎn)生了作為同源或異源多肽的重組明膠。本發(fā)明還提供了編碼膠原加工或翻譯后加工酶或其亞基在細胞中的表達。不同的翻譯后修飾和不同的翻譯后加工酶，例如脯氨酰羥化酶、賴氨酰羥化酶等可影響例如本發(fā)明明膠的Bloom強度和其它物理性質(zhì)。本發(fā)明的重組明膠衍生自膠原序列。衍生出本發(fā)明的多聚核苷酸的編碼序列可選自人或非人序列，視最終明膠產(chǎn)品的用途所需的性能而定。對于藥物學(xué)和醫(yī)學(xué)用途，重組人明膠是優(yōu)選的。非人來源包括非人哺乳動物來源，如牛、豬和馬來源，以及其它動物來源，例如雞和魚。特別考慮了非天然序列。本領(lǐng)域一般描述了編碼膠原的核酸序列。(見例如Fuller和Boedtker(1981)Biochemistry20996-1006；Sandell等(1984)JBiolChem2597826-34；Kohno等(1984)JBiolChem.25913668-13673；French等(1985)gene39311-312；Metsaranta等(1991)JBiolChem26616862-16869；Metsaranta等(1991)BiochemBiophysActa1089241-243；Wood等(1987)Gene61225-230；Glumoff等(1994)BiochemBiophysActa121741-48；Shirai等(1998)MatrixBiology1785-88；Tromp等(1988)BiochemJ.253919-912；Kuivaniemi等(1988)BiochemJ.252633-640；和Ala-Kokko等(1989)BiochemJ.260509-516)。另見同時申請的共同擁有的美國臨時申請＿＿＿，題為“動物膠原和明膠”，2000年11月10日提交，在此完整引入以供參考)。本發(fā)明的核酸序列可經(jīng)工程改造，為了各種目的改變用于產(chǎn)生重組明膠或從其衍生重組明膠的多肽的編碼序列，包括但不限于修改基因產(chǎn)物加工和表達的改變。例如，可用另一種分泌信號取代天然的分泌信號。用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)，例如定點誘變、PCR-定向誘變、盒式誘變和其它本領(lǐng)域熟知的技術(shù)來插入新限制性位點，或改變糖基化模式，磷酸化，蛋白水解轉(zhuǎn)換/破壞等。另外，當(dāng)在使用特定宿主細胞的表達系統(tǒng)中產(chǎn)生明膠時，本發(fā)明的多聚核苷酸在任何三聯(lián)體氨基酸密碼子的沉默位置改變，從而更好的符合特定宿主生物體的密碼子傾向?？筛鶕?jù)本發(fā)明使用的改變的多聚核苷酸序列包括在天然膠原序列中含有缺失、添加或取代不同的核苷酸殘基的序列。這些多聚核苷酸可編碼相同或功能上等價的基因產(chǎn)物?；虍a(chǎn)物本身可在膠原序列中含有氨基酸殘基的缺失、添加或取代。將本發(fā)明的多聚核苷酸進一步與編碼多肽的變體的序列有關(guān)?？捎酶鞣N本領(lǐng)域已知的方法引入合適核苷酸改變編碼多肽變體，制備編碼的氨基酸變體。氨基酸序列變體構(gòu)建中的兩個重要變量是突變的位置和突變的性質(zhì)。優(yōu)選通過多聚核苷酸突變得到自然界不存在的氨基酸序列，構(gòu)建本發(fā)明明膠或衍生出本發(fā)明明膠的氨基酸序列變體。在與來自不同物種的膠原中不同的位置(可變位置)或在高度保守的區(qū)域(恒定區(qū)域)中制備這些氨基酸改變。這些位置上的位點通常系列修飾，例如通過用保守選擇取代第一個(例如用不同的疏水性氨基酸取代疏水性氨基酸)，然后用更加不同的選擇(例如用疏水性氨基酸取代帶電的氨基酸)然后可在靶位點制造缺失和插入。由于基因密碼固有的簡并性，本發(fā)明的實施中還可使用基本編碼相同或功能上等價的氨基酸序列或多肽的其它天然、合成、半合成或重組起源的多聚核苷酸序列。本發(fā)明還特別考慮了所有簡并變體和密碼子優(yōu)化的序列。另外本發(fā)明特別提供了能與特定序列在嚴(yán)格條件下雜交的多聚核苷酸。表達該方法適用于本領(lǐng)域可得的表達系統(tǒng)范圍。雖然下文描述了許多這樣的重組系統(tǒng)，但是應(yīng)理解本方法的應(yīng)用不限于下文舉例說明的系統(tǒng)?？衫酶鞣N表達系統(tǒng)來包含和表達編碼本發(fā)明的重組明膠或編碼能衍生出這些明膠的多肽的序列。這些包括但不限于微生物，例如用重組噬菌體、質(zhì)?；蛘沉：怂岜磉_載體轉(zhuǎn)化的細菌；用酵母表達載體轉(zhuǎn)化的酵母；用病毒病毒載體(如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統(tǒng)；用真菌載體轉(zhuǎn)化的絲狀真菌；用病毒病毒載體(例如花椰菜花葉病毒CaMV；煙草花葉病毒TMV)或用細菌表達載體(如pET或pBR322質(zhì)粒)；或動物細胞系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的植物細胞系統(tǒng)；或動物細胞系統(tǒng)。適合用于表達本發(fā)明的多聚核苷酸的控制元件或調(diào)控序列是載體的非翻譯區(qū)，包括增強子、啟動子和5’和3’非翻譯區(qū)，它們與宿主細胞蛋白反應(yīng)，來進行轉(zhuǎn)錄和翻譯。這些元件的強度和專一性可變。視利用的載體系統(tǒng)和宿主，可使用任何數(shù)量的合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件。啟動子是位于結(jié)構(gòu)基因起始密碼子上游的非翻譯序列，它控制核酸在其控制下轉(zhuǎn)錄?？烧T導(dǎo)啟動子是響應(yīng)培養(yǎng)條件的改變，例如因存在或不存在一種營養(yǎng)物而改變其轉(zhuǎn)錄起始水平的啟動子。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道許多可在適合本發(fā)明的宿主中被識別的啟動子?？捎杀绢I(lǐng)域技術(shù)人員選擇合適的啟動子、增強子和其它控制元件。例如，當(dāng)在細菌系統(tǒng)中克隆時，可使用可誘導(dǎo)啟動子，例如BLUESCRIPT噬菌粒(Stratagene，LaJolla，Calif.)或pSPORT1質(zhì)粒(GIBCOBRL)雜交lacZ啟動子等。在昆蟲細胞中，可使用桿狀病毒多角體啟動子。在植物系統(tǒng)中，可將衍生自植物細胞基因組的啟動子或增強子(例如熱休克啟動子、RUBISCO小亞基啟動子；葉綠素a/b結(jié)合蛋白啟動子)的啟動子或增強子；各種儲藏蛋白基因的啟動子或來自植物病毒(如病毒啟動子或前導(dǎo)序列，CaMV的35SRNA啟動子；TMV的外被蛋白啟動子等)克隆入載體。在哺乳動物細胞系統(tǒng)中，優(yōu)選來自哺乳動物細胞基因組的啟動子(如金屬硫蛋白啟動子，肌動蛋白啟動子等)或來自哺乳動物病毒(如腺病毒晚啟動子、CMV、SV40、LTR、TK和痘病毒7.5K啟動子)的啟動子。如需要產(chǎn)生含有多個編碼所需多肽的序列拷貝的細胞系時，可與合適的可選擇標(biāo)記一起使用基于SV40或EBV的載體。這些啟動子可與編碼本發(fā)明的明膠或明膠前體的多聚核苷酸可操縱性連接，例如通過從其天然基因除去啟動子，將編碼多聚核苷酸置于啟動子序列的3’末端。用于本發(fā)明的啟動子包括但不限于，原核啟動子、包括例如乳糖啟動子、阿拉伯糖啟動子、堿性磷酸酶啟動子、色氨酸啟動子和雜合啟動子，例如tac啟動子、酵母啟動子，包括例如3-磷酸甘油酸激酶、其它糖酵解酶啟動子(己糖激酶、丙酮酸脫氫酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶等)、醇脫氫酶啟動子、醇氧化酶(AOX)1或2啟動子、金屬硫蛋白啟動子、麥芽糖啟動子和半乳糖啟動子；和真核啟動子，包括例如病毒多瘤、傳染性上皮瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、SV40病毒的啟動子和靶真核細胞的啟動子，例如黑曲霉的葡糖淀粉酶啟動子，肌動蛋白或遍在蛋白啟動子、哺乳動物的免疫球蛋白啟動子和天然膠原啟動子(見例如Boer等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA8021-25；Hitzeman等(1980)J.Biol.Chem.2552073；Fiers等(1978)Nature273113；Mulligan和Berg(1980)Science2091422-1427；Pavlakis等(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA787398-7402；Greenway等(1982)Gene18355-360；Gray等(1982)Nature295503-508；Reyes等(1982)Nature297598-601；Canaani和Berg(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA795166-5170；Gorman等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA796777-6781；和Nunberg等(1984)Mol.andCell..Biol.11(4)2306-2315)。本方法編碼明膠和明膠前體的多肽序列可以在組成型啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下，廣泛指導(dǎo)表達。另外，用于本方法的多聚核苷酸在特定的組織或細胞類型，或在更精確的環(huán)境條件或發(fā)育控制下表達。在這些情況下指導(dǎo)表達的啟動子稱作可誘導(dǎo)啟動子。就使用組織特異性啟動子的情況而言，蛋白質(zhì)表達在需要提取蛋白質(zhì)的組織中特別高。視所需組織而定，表達可靶向胚乳、糊粉層、種胚(或其部分如胚鱗和子葉)、果皮、莖、葉、塊莖、根等。已知的組織特異性啟動子的例子包括指向塊莖的I類patatin啟動子，與馬鈴薯塊莖ADPGPP基因相關(guān)的啟動子，大豆β-conglycinin(7S蛋白)啟動子，它驅(qū)動針對種子的轉(zhuǎn)錄，和來自玉米胚乳玉米蛋白基因的針對種子的啟動子(見例如Bevan等(1986)NucleicAcidsRes.144625-38；Muller等(1990)Mol.Gen.Genet.224136-46；Bray(1987)Planta172364-370；和Pederson等(1982)Cell291015-1026)。通常通過在載體中插入增強子序列提高本發(fā)明編碼明膠或明膠前體的序列的轉(zhuǎn)錄。增強子是順式激活元件，通常約10-300bp，它起到提高啟動子轉(zhuǎn)錄起始速率的作用。許多增強子對于真核細胞和原核細胞都是已知的，普通技術(shù)人員可為感興趣的宿主細胞選擇合適的增強子(見例如Yaniv(1982)Nature29717-18)。本發(fā)明的明膠和明膠前體可以表達成分泌蛋白。當(dāng)用于表達蛋白質(zhì)的是經(jīng)工程改造的細胞是非人宿主細胞，用另一種能被宿主細胞的分泌靶向機制更有效識別的分泌信號肽替換膠原蛋白的分泌信號肽常常是有利的。合適的分泌信號序列對于獲得最佳真菌表達哺乳動物基因特別重要。例如見Brake等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA814642。原核、酵母、真菌、昆蟲或哺乳動物細胞的其它信號序列是本領(lǐng)域熟知的，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠簡單的選擇適合所選宿主細胞的信號序列。在使用的特定細胞系統(tǒng)中包含合適的增強子可增強表達效力，如文獻中所述的那些(見例如，Scharf，D.等(1994)ResultsProbl.CellDiffer20125-162)。另外，可選擇宿主細胞株調(diào)節(jié)插入的序列的表達或以所需的方式加工表達的蛋白質(zhì)的能力。這種多肽的修飾包括但不限于乙?；Ⅳ然?、糖基化、磷酸化、脂化、異戊二烯化和?；?。切割蛋白質(zhì)“前/預(yù)”形式的翻譯后加工還可用于促進正確的插入、折疊和/或功能?？蛇x擇不同的宿主細胞，例如CHO、HeLa、MDCK、HEK293和WI38，它具有該翻譯后活性的特定的細胞機制和特征性機制，并可選擇用于確保外源蛋白質(zhì)的正確修飾和加工。根據(jù)本發(fā)明，可在合適的宿主細胞中表達編碼重組明膠或可衍生出明膠的多肽的多聚核苷酸序列。在本發(fā)明的優(yōu)選例中，重組明膠是人明膠。在本發(fā)明的其它優(yōu)選例中，多肽序列衍生自I型膠原序列，無任何其它類型的膠原的編碼序列，或II型膠原序列，無任何其它類型的膠原的編碼序列，或III型膠原序列，無任何其它類型的膠原的編碼序列。在另一個實施例中，編碼多聚核苷酸衍生自特定數(shù)量的I型和III型膠原，例如編碼的多肽產(chǎn)生或衍生的明膠含有確定數(shù)量的I型和III型膠原的混合物。為了表達衍生出該明膠的膠原，或表達導(dǎo)致生產(chǎn)該明膠的天然膠原序列，將編碼膠原的核苷酸序列，或功能性等價物，或其它序列，例如截短的膠原序列，例如存在于表2的那些插入合適的表達載體中，即含有摻入的編碼序列轉(zhuǎn)錄和翻譯必需的元件，或在RNA病毒載體情況下，復(fù)制和翻譯必需的元件的載體中?？捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法構(gòu)建含有本發(fā)明的多聚核苷酸和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括標(biāo)準(zhǔn)DNA克隆技術(shù)，例如體外重組技術(shù)，合成技術(shù)和體內(nèi)重組。見例如，Maniatis等，見上和Ausubel等，見上；和Ausubel，F(xiàn).M.(1997)ShortProtocolsinMolecularBiology，第四版，JohnWiley&Sons，NewYork，NY所描述的技術(shù)。可用各種表達載體表達該多肽。例如，典型的表達載體含有編碼復(fù)制起始點的元件；插入外源核苷酸序列的克隆位點；控制外源基因轉(zhuǎn)錄起始的元件，例如啟動子，和控制轉(zhuǎn)錄過程的元件，例如轉(zhuǎn)錄/終止/聚腺苷酸序列。用于本發(fā)明的表達載體還含有載體最終插入染色體所需的序列。另外，編碼與控制轉(zhuǎn)錄起始的啟動子功能性連接的選擇標(biāo)記的基因還可以在表達內(nèi)，例如，抗生素抗性基因，提供在宿主中表達載體的生長和選擇。本發(fā)明的載體可在宿主細胞中自動復(fù)制，或可以整合入宿主基因組。對于原核細胞和真核細胞的各種細菌、酵母和各種病毒復(fù)制序列，具有自主復(fù)制序列的合適載體是熟知的。當(dāng)載體和宿主細胞基因組DNA中發(fā)現(xiàn)的序列同源時，可整合到宿主細胞中。為了長期、高產(chǎn)率產(chǎn)生重組蛋白，優(yōu)選穩(wěn)定表達。例如，可用含有病毒復(fù)制起始位點或合適的表達控制元件(例如啟動子、增強子序列，轉(zhuǎn)錄終止子、聚腺苷酸位點等)和在相同或不同載體上的可選擇標(biāo)記的表達載體轉(zhuǎn)化穩(wěn)定表達該多肽的細胞系。引入外源DNA后，在富集培養(yǎng)基中使細胞生長1-2日，然后切換到選擇性培養(yǎng)基。重組質(zhì)粒中的選擇性標(biāo)記對選擇賦予抗性，使成功表達引入序列的細胞生長和回收。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細胞的抗性克隆可以用適合細胞類型的組織培養(yǎng)技術(shù)增殖。本方法可有利的用于產(chǎn)生表達所需多肽的細胞系。例如，由半乳糖啟動子驅(qū)動的用于本發(fā)明方法的各種序列的表達可通過在非抑制、非誘導(dǎo)糖上培養(yǎng)，從而在加入半乳糖后非常迅速的誘導(dǎo)；在葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)培養(yǎng)物，然后通過離心和洗滌細胞除去葡萄糖，重新懸浮在半乳糖培養(yǎng)基中；通過使細胞在含有葡萄糖和半乳糖的培養(yǎng)基中生長，從而在半乳糖誘導(dǎo)發(fā)生前傾向代謝葡萄糖?？捎萌魏螖?shù)量的選擇系統(tǒng)回收轉(zhuǎn)化細胞系。這些包括但不限于可分別用于tk-或aprf細胞中的單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶和腺苷酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(見例如Wigler，M.等(1977)Cell11223；Lowy，I.等(1980)Cell22817)另外，可用抗代謝物、抗生素或除草劑抗性作為選擇的基礎(chǔ)。因此，本發(fā)明考慮使用這些可選擇標(biāo)記，例如賦予氨甲蝶呤抗性的dhfr；賦予氨基糖苷新霉素和G-418抗性的npt；和分別賦予綠黃隆和膦基麥黃酮乙酰轉(zhuǎn)移酶抗性的als或pat(見例如Wigler，M.等(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.773567；和Colberre-Garapin，F(xiàn).等(1981)J.Mol.Biol.1501-14)。描述了其它可選擇基因，例如trpB，它使細胞利用吲哚而不是色氨酸；hisD，它使細胞利用組氨醇而不是組氨酸。(見例如Hartman，S.C.和R.C.Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA858047-51)。近來，使用可見標(biāo)記獲得了流行，這些標(biāo)記例如花色素苷、β-半乳糖苷酶及其底物GUS，和熒光素酶及其底物熒光素，目前廣泛使用，不僅用于鑒定轉(zhuǎn)化物，還用于定量測定特定載體系統(tǒng)的瞬時或穩(wěn)定蛋白表達。(見例如Rhodes，C.A.等(1995)MethodsMol.Biol.55121-131)。如上所述，用于本生產(chǎn)方法的表達載體通常含有一標(biāo)記基因，它賦予細胞可選擇表型。通?？蛇x擇標(biāo)記基因編碼抗生素抗性，合適的基因包括編碼至少一種基因，選自對抗生素大觀霉素抗性，編碼鏈霉素抗性的鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(SPT)基因、編碼卡那霉素或遺傳霉素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTH)基因，潮霉素抗性基因，編碼對抑制乙酰乳酸合成酶(ALS)作用的除草劑，特別是硫脲型除草劑抗性的基因，(如S4和/或Hra突變)，編碼對抑制谷氨酰胺合成酶作用的除草劑的抗性的基因，例如膦基麥黃酮或basta(例如bar基因)或其它本領(lǐng)域已知的類似基因。bar基因編碼對除草劑basta的抗性，nptII基因編碼對抗生素卡那霉素和遺傳霉素的抗性，ALS基因編碼對除草劑綠黃酮的抗性。其它檢測宿主細胞在轉(zhuǎn)化后含有感興趣的多聚核苷酸的方法包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法。這些方法包括但不限于核酸雜交，包括DNA-DNA或DNA-RNA雜交，和各種蛋白質(zhì)活體鑒定或免疫分析技術(shù)，包括基于膜-、溶液-或芯片得到技術(shù)，用于檢測和/或定量多聚核苷酸或多肽。另外，可選擇宿主細胞株，它調(diào)節(jié)插入序列的表達，或以所需的特定方式修飾和加工基因產(chǎn)物。這種蛋白質(zhì)產(chǎn)物的修飾(例如糖基化)和加工(例如切割)可以對于是蛋白質(zhì)功能重要的。不同宿主細胞具有蛋白質(zhì)翻譯后加工和修飾的特征性和專一性的機制?？蛇x擇合適的細胞系或宿主系統(tǒng)確保表達的外源蛋白質(zhì)的正確修飾和加工。對此，可使用具有正確加工初級轉(zhuǎn)錄物，糖基化和磷酸化基因產(chǎn)物的細胞機制的真核宿主細胞。這些哺乳動物宿主細胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、WI38等。專一性起始信號也可用于實現(xiàn)本發(fā)明多聚核苷酸的更有效的翻譯。這些信號包括ATG起始密碼子和鄰接的序列。就編碼該多肽和任何翻譯所需的起始或上游序列插入合適的表達載體而言，不需要額外的翻譯控制信號。然而對于僅插入編碼序列或其部分的情況下，必須提供外源翻譯控制信號，包括ATG起始密碼子。另外，起始密碼子必須在正確的閱讀框中，來確保整個插入物的翻譯。這些外源翻譯元件和起始密碼子可以是各種來源，包括天然和合成的(見例如Bittner等(1987)MethodsinEnzymol，153516-544)?？捎镁幋a翻譯后加工酶的至少一種多聚核苷酸和至少一種編碼本發(fā)明的明膠或可衍生出明膠的多肽的多聚核苷酸感染、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化本發(fā)明的宿主細胞。這些多聚核苷酸包括編碼膠原翻譯后加工酶，例如脯氨酰4-羥化酶、膠原糖基轉(zhuǎn)移酶、C蛋白酶、N-蛋白酶、賴氨酰氧化酶或賴氨酰羥化酶的多聚核苷酸，可插入天然中不產(chǎn)生翻譯后加工酶的細胞，例如酵母細胞，或天然不產(chǎn)生足量翻譯后加工酶的細胞，例如各種昆蟲和哺乳動物細胞，例如外源酶可需要產(chǎn)生某些翻譯后影響。在本發(fā)明的一個實施例中，翻譯后加工酶是脯氨酰4-羥化酶，多聚核苷酸編碼脯氨酰羥化酶的α亞基和β亞基。在一個優(yōu)選例中，編碼脯氨酰4-羥化酶的α亞基和β亞基的多聚核苷酸插入產(chǎn)生生物活性脯氨酰4-羥化酶的細胞，與編碼明膠或可衍生出明膠的多肽的多聚核苷酸共同表達。編碼翻譯后加工酶的多聚核苷酸可衍生自任何來源，不論天然、合成或重組的。在一個優(yōu)選例中，翻譯后加工酶衍生自產(chǎn)生重組明膠的相同物種。在一個實施例中，產(chǎn)生的重組明膠是人重組明膠，翻譯后加工酶是人脯氨酰4-羥化酶。本發(fā)明表達的明膠或明膠前體優(yōu)選分泌入培養(yǎng)基，并可用各種本領(lǐng)域已知的方法，例如通過層析純化到均一。在一個實施例中，重組明膠或明膠前體用尺寸排阻層析純化。然而，還可用其它本領(lǐng)域已知的純化技術(shù)，包括但不限于離子交換層析、疏水作用層析(HIC)和反相層析。(見例如Maniatis等，見上，Ausubel等，見上和Scopes(1994)ProteinPurificationPrinciplesandPractice，Springer-VerlagNewYorkInc.，NY)。原核在原核系統(tǒng)，例如細菌系統(tǒng)中，可根據(jù)表達的多肽所要的用途選擇許多表達載體中的任一種。例如，當(dāng)要產(chǎn)生大量重組明膠或可衍生出這些明膠的多肽時，可使用指導(dǎo)能高水平表達可輕易純化的融合蛋白產(chǎn)物的載體。這些載體包括但不限于多功能大腸桿菌克隆和表達載體，例如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中可以將編碼序列連接到載體的閱讀框內(nèi)，與氨基酸末端Met序列和隨后的7個β-半乳糖苷酶的殘基連接，從而產(chǎn)生雜交蛋白；pIN載體(VanHeeke，G.和S.M.Schuster(1989)J.Biol.Chem.2645503-5509)等。pGEX載體(Promega，Madison，Wis.)和pET(Invitrogen)載體也可用于表達作為與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白的外源多肽。一般這些融合蛋白是可溶的，并可輕易的用本領(lǐng)域的各種已知方法從裂解細胞中純化出來，例如通過吸附到谷胱甘肽-瓊脂糖珠上，然后在游離谷胱甘肽的存在下洗脫。這些系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)可設(shè)計成包含凝血酶或凝血因子Xa蛋白酶切割位點，從而克隆的感興趣多肽可從GST分子上釋放。酵母在優(yōu)選例中，本方法提供了用酵母表達系統(tǒng)產(chǎn)生重組明膠的方法。在優(yōu)選例中，直接從改變的膠原構(gòu)建物或從膠原多肽的加工中直接產(chǎn)生明膠。在酵母系統(tǒng)中可使用含有組成型、非組成型或誘導(dǎo)型的啟動子的載體。(見例如Ausubel等，見上，13章。)在一些方面，用含有指導(dǎo)DNA整合入染色體的序列的載體在釀酒酵母中表達。在一個實施例中，本發(fā)明的重組明膠或可衍生出這些明膠的多肽可用來自例如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的宿主細胞表達。釀酒酵母可與本領(lǐng)域中可得的許多表達載體中的任一個一起使用，包括許多含有組成型或誘導(dǎo)型啟動子的載體，例如α因子、AOX、GAL1-10和PGH(見例如Ausubel等，見上和Grant等(1987)MethodsEnzymol.153516-544)。常用表達載體是含有在酵母中增殖的2μ復(fù)制起始點和大腸桿菌中的ColE1起始點的穿梭載體，包括用于有效轉(zhuǎn)錄外源基因的酵母啟動子和終止子。摻入2μ質(zhì)粒的載體包括但不限于pWYG4和pYES2，它們具有2μORI-STB元件，GAL1-10啟動子等。在本發(fā)明的一個需要羥化產(chǎn)物的方法中，涉及共同表達膠原翻譯后加工酶，例如脯氨酰4-羥化酶。在本發(fā)明的一個方法中，用pWYG4載體，用Nco1克隆位點插入脯氨酰4-羥化酶的α或β亞基的基因，并提供α或β亞基的ATG起始密碼子。在一個方法中，用指導(dǎo)整合入宿主染色體的表達載體還可用表達載體是pWYG7L，它具有完整的2αORI、STB、REP1和REP2，和GAL7啟動子，和FLP終止子。當(dāng)與翻譯后加工酶，例如脯氨酰4-羥化酶表達時，脯氨酰4-羥化酶的α或β亞基的基因以其5’末端在BamH7或Nco1位點插入多接頭。含有脯氨酰4-羥化酶的載體基因在除去細胞壁，以產(chǎn)生原生質(zhì)球前后轉(zhuǎn)化入釀酒酵母，該原生質(zhì)球在在用鈣和聚乙二醇處理后或用鋰離子處理完整的細胞后攝取DNA?？捎镁哂锌蛇x擇標(biāo)記基因例如LEU2、TRP1、URA3、HIS3或Leu2-D的亮氨酸、色氨酸、尿嘧啶或組氨酸營養(yǎng)缺陷的宿主酵母細胞選擇轉(zhuǎn)化子。在本發(fā)明的另一個實施例中，本發(fā)明產(chǎn)生重組明膠的方法使用來自畢赤酵母或其它非釀酒酵母，具有在大批量生產(chǎn)的過程中生產(chǎn)高產(chǎn)量的重組蛋白質(zhì)的優(yōu)點的株的宿主細胞。畢赤表達系統(tǒng)包括利用原核(例如大腸桿菌)表達系統(tǒng)-高水平表達，容易放大和低廉的生長-和真核表達系統(tǒng)-蛋白質(zhì)加工、折疊和翻譯后修飾的優(yōu)點。這些表達系統(tǒng)可用各種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法和試劑盒構(gòu)建，例如InvitrogenCorporation(SanDiego，CA)可購得畢赤表達盒。在甲醇向性的酵母，例如巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)或(Pichiamethanolica)等中有許多甲醇反應(yīng)性基因，它們各自的表達受到甲醇反應(yīng)性調(diào)控區(qū)(也稱為啟動子)控制。這些甲醇反應(yīng)性啟動子任一適合用于實施本發(fā)明。特定調(diào)控區(qū)的例子包括巴斯德畢赤酵母的醇氧化酶AOX1基因的啟動子、巴斯德畢赤酵母第二醇氧化酶AOX2啟動子、FLD1啟動子、巴斯德畢赤酵母的二羥基丙酮合成酶(DAS)的啟動子、P40啟動子的啟動子等。通常，巴斯德畢赤酵母中的表達是通過精密調(diào)節(jié)AOX1基因的啟動子獲得的(見例如Ellis等(1985)Mol.Cell.Biol.51111和美國專利號4,855,231)。還可用GPH啟動子實現(xiàn)組成型表達。本發(fā)明方法中優(yōu)選使用的另一種酵母表達系統(tǒng)利用甲醇向性酵母多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)。該系統(tǒng)可用于例如本發(fā)明需要高產(chǎn)量的生產(chǎn)方法。在甲醇生長導(dǎo)致誘導(dǎo)甲醇代謝的關(guān)鍵酶，例如MOX(甲醇氧化酶)、DAS(二羥丙酮合成酶)和FMHD(甲酸脫氫酶)。這些酶可占全部細胞蛋白質(zhì)的30-40％。編碼MOX、DAS和FMDH生產(chǎn)的基因受到強啟動子的控制，它受到在甲醇上生長的誘導(dǎo)，在葡萄糖上生長的抑制。根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，這三種啟動子中的任一可用于獲得異源基因在多形漢遜酵母中的高水平表達。在本發(fā)明的一種方法中，編碼的多聚核苷酸被克隆入在誘導(dǎo)型多形漢遜酵母的控制下表達載體。如果需要分泌產(chǎn)物，將編碼酵母分泌信號序列的多聚核苷酸，例如MFα1與本發(fā)明的多肽的編碼序列在閱讀框中融合。表達載體優(yōu)選含有營養(yǎng)缺陷的標(biāo)記基因，例如URA3或LEU2，或任何本領(lǐng)域已知的標(biāo)記，它們可用于補償營養(yǎng)缺陷宿主的缺陷性。另外，可使用顯性可選擇標(biāo)記，如zeocin或blastacin。然后用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)用表達載體轉(zhuǎn)化多形漢遜酵母宿主細胞。多形漢遜酵母轉(zhuǎn)化的一個有趣而有用的特征是將多達100個表達載體的拷貝自發(fā)整合到基因組中。在大多數(shù)情況下，整合的多聚體序列顯示頭-尾排列。整合的外源DNA在幾種重組菌株中，甚至在非選擇性條件下也顯示穩(wěn)定的有絲分裂。該高拷貝整合的現(xiàn)象也幫助了系統(tǒng)的高生產(chǎn)力性能。植物本發(fā)明還考慮在植物表達系統(tǒng)中，包括植物宿主細胞和轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生本發(fā)明的重組明膠或可以衍生出重組明膠的多肽(見例如TransgenicPlantsAProductionSystemforIndustrialandPharmaceuticalProteins，Owen和Pen編，JohnWiley&Sons，1996；TransgenicPlants，GalunandBreiman編，ImperialCollegePress，1997；和AppliedPlantBiotechnology，Chopra等編，SciencePublishersInc.1999)。在使用植物表達載體的情況下，序列的表達可由許多啟動子中的任一個驅(qū)動。例如，可單獨或聯(lián)合TMV的ω前導(dǎo)序列使用病毒啟動子，如CaMV的35SRNA和19SRNA啟動子(見例如Brisson等，(1984)Nature310511-514；和Takamatsu等(1987)EMBOJ.6307-311)。植物表達載體和報道基因是本領(lǐng)域公知的(見例如Gruber等(1993)MethodsofPlantBiologyandBiotechnology，CRCPress)。另外可使用植物啟動子，例如RUBISCO的小亞基或熱休克啟動子，例如大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B。(見例如Coruzzi，G.等(1984)EMBOJ.31671-1680；Broglie，R.等(1984)Science224838-843；Winter，J.等(1991)Resultsprobl.CellDiffer1785-105；和6urley等(1986)Mol.Cell.Biol.6559-565)。這些構(gòu)建物可用Ti噬菌體、Ri噬菌體、植物病毒載體、DNA直接轉(zhuǎn)化、顯微注射、電穿孔、病原體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、顆粒轟擊或任何其它本領(lǐng)域已知的方法，例如一般可得的綜述所述的那些(見例如Hobb，S.或Murry，L.E.在McGrawHillYearbookofScienceandTechnology(1992)McGrawHill，NewYork，N.Y.pp.191-196；Weissbach&Weissbach(1988)MethodsforPlantMolecularBiology，AcademicPress，NY，VIII節(jié)，pp.421-463；和Grierson和Corey，PlantMolecularBiology，第二版，Blackie，London，Ch.7-9(1988)。)在許多實施例中，本發(fā)明的重組明膠或可以衍生出重組明膠的多肽通過基于種子的生產(chǎn)技術(shù)，使用例如蕓苔、玉米、大豆、水稻和大麥種子在種子中生產(chǎn)。在這些實施例中，在種子發(fā)芽/蛻皮中回收蛋白質(zhì)。在其它實施例中，蛋白質(zhì)直接表達入胚乳或進入植物的其它部分，因此明膠是非提取的，植物本身作為蛋白質(zhì)來源等的飲食補充?？捎糜谥笇?dǎo)多聚核苷酸表達的啟動子可以是異源或非異源的。這些啟動子還可以用于驅(qū)動反義核酸的表達如所需減少、增加或改變表達。在植物或植物細胞中的轉(zhuǎn)錄最大化的其它修改是本領(lǐng)域已知的。例如，與一啟動子可操縱連接的多聚核苷酸序列還可包含至少一種因子，它改變編碼的多肽或相關(guān)翻譯后加工酶的轉(zhuǎn)錄速度，例如肽輸出信號序列、密碼子使用、內(nèi)含子、聚腺苷酸和轉(zhuǎn)錄終止位點。修飾構(gòu)建物提高植物表達水平的方法是本領(lǐng)域已知的(見例如Rogers等(1985)J.Biol.Chem.2603731；和Cornejo等(1993)PlantMolBiol23567-58)。在工程改造影響多聚核苷酸轉(zhuǎn)錄速率的植物系統(tǒng)中，各種本領(lǐng)域已知的因素，包括調(diào)控序列，例如正或負激活序列、增強子和沉默子，以及染色質(zhì)。用于在植物中表達外源基因的典型載體是本領(lǐng)域熟知的，包括但不限于衍生自根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的腫瘤誘導(dǎo)性(Ti)質(zhì)粒的載體。這些載體是植物整合載體，它們在轉(zhuǎn)化后，將一部分DNA整合入宿主植物的基因組(見例如Rogers等(1987)Meth.InEnzymol.153253-277；Schardl等(1987)Gene611-11；和Berger等；Proc.Natl.Acad.Sci.USA868402-8406)。本領(lǐng)域可得轉(zhuǎn)化植物細胞的方法，包括例如直接基因轉(zhuǎn)移，體外原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，植物病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，顯微注射，電穿孔，土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化和顆粒轟擊。(見例如Paszkowski等(1984)EMBOJ.32717-2722；美國專利號4,684,611；歐洲申請?zhí)?67553；美國專利號4,407,956；美國專利號4,536,475；Crossway等(1986)Biotechniques4320-334；Riggs等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA835602-5606；Hinchee等(1988Biotechnology6915-921；和美國專利號4,945,050)。本領(lǐng)域描述了轉(zhuǎn)化例如水稻、小麥、玉米、高粱和大麥的標(biāo)準(zhǔn)方法(見例如Christou等(1992)TrendsinBiotechnology10239和Lee等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA886389)?？捎门c轉(zhuǎn)化玉米或水稻類似的技術(shù)轉(zhuǎn)化小麥(見例如Fromm等(1990)Bio/Technology8833；和Gordon-kamm等，見上)。在本領(lǐng)域建立了其它可用于生產(chǎn)表達本發(fā)明中的重組明膠或可以衍生出重組明膠的多肽的植物的方法。(見例如美國專利號5,959,091；美國專利號5,859,347；美國專利號5,763,241；美國專利號5,659,122；美國專利號5,593,874；美國專利號5,495,071；美國專利號5,424,412；美國專利號5,362,865；美國專利號5,229,112。)本發(fā)明還提供了一種通過提供植物或植物細胞的生物質(zhì)產(chǎn)生多肽的方法，該生物質(zhì)含有至少一種編碼重組明膠或可衍生出重組明膠的多肽的多聚核苷酸序列，其中該多聚核苷酸序列與有效表達多肽的啟動子可操縱性連接。在另一個實施例中，本方法還包括共同表達至少一種編碼催化翻譯后修飾的酶或其亞基的多聚核苷酸序列，其中多聚核苷酸序列與啟動子可操縱性連接。在這些方法中，重組明膠或膠原性多肽從生物質(zhì)中提取。真菌還用絲狀真菌生產(chǎn)該多肽。在絲狀真菌中表達和/或分泌重組蛋白質(zhì)的載體是本領(lǐng)域熟知的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可用本領(lǐng)域可得的方法和產(chǎn)品，在引用的這些方法中使用這些載體。(見例如美國專利號5,834,191)。昆蟲昆蟲細胞系統(tǒng)能大量產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。在一種這樣的系統(tǒng)中，使用苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)核型多角體病毒(AcNPV)作為載體，在草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)細胞或粉斑夜蛾(Trichoplusia)幼蟲中表達外源基因。本發(fā)明編碼明膠或明膠前體的序列可克隆入病毒的非必需區(qū)域(例如多角體基因)，置于AcNPV啟動子(例如多角體啟動子)的控制下。編碼序列的成功插入將導(dǎo)致多角體基因失活，產(chǎn)生非閉合的重組病毒(即缺乏多角體基因蛋白質(zhì)包被的病毒)。然后用這些重組的病毒感染草地夜蛾細胞或粉斑夜蛾幼蟲，在其中表達編碼明膠或明膠前體的多聚核苷酸。(見例如Englhard，E.K.等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.913224-3227；Smith等，(1983)J.Virol.46584；和美國專利號4,215,051)。該表達系統(tǒng)的其它例子可在例如Ausubel等見上中發(fā)現(xiàn)?？稍诶ハx細胞，例如通過感染含有合適多聚核苷酸序列，包括那些編碼任何可能需要的翻譯后加工酶的多聚核苷酸序列的桿狀病毒載體，實現(xiàn)本發(fā)明多肽的重組生產(chǎn)。桿狀病毒是在昆蟲細胞中大量生產(chǎn)各種重組蛋白的非常有效的載體?？墒褂酶鞣N本領(lǐng)域已知的方法來構(gòu)建含有編碼本發(fā)明的明膠或明膠前體和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的序列的表達載體。(見例如Luckow等(1989)Virology17031-39和Gruenwald，S.和Heitz，J.(1993)BaeulovirusExpressionVectorSystemProcedures&MethodsManual，Pharmingen，SanDiego，CA)。動物本發(fā)明提供了在動物系統(tǒng)中表達本發(fā)明的重組明膠或可以衍生出重組明膠的多肽的方法。這些系統(tǒng)包括哺乳動物和無脊椎動物宿主細胞和轉(zhuǎn)基因動物。在哺乳動物宿主細胞中，可利用許多表達系統(tǒng)。就使用腺病毒作為表達載體而言，本發(fā)明編碼多肽的序列可與腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯復(fù)合物，包括晚期啟動子和三聯(lián)前導(dǎo)序列連接。然后可將該嵌合的基因通過體外或體內(nèi)重組插入腺病毒基因組。在病毒基因組的非必需區(qū)(如E1或E3區(qū))插入將得到活的重組病毒，它能在感染的宿主中編碼本發(fā)明中的多肽(見例如Logan，J.和Shenk，T.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.813655-3659)。另外，可使用痘病毒7.5K啟動子。(見例如Mackett等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA797415-7419；Mackett等(1982).J.Virol.49857-864；和Panicali等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA794927-4931)。另外，各種本領(lǐng)域已知的轉(zhuǎn)錄增強子，例如Rous肉瘤病毒(RSV)增強子，可用于增強哺乳動物宿主細胞中的表達。SemlikiForest病毒是優(yōu)選的表達系統(tǒng)，因為該病毒具有廣譜的宿主范圍，從而可能感染哺乳動物細胞系。用這種病毒載體感染哺乳動物宿主細胞，例如幼倉鼠腎(BHK)細胞和中國倉鼠卵巢(CHO)細胞可得到非常高的重組表達水平。更特別的是，考慮SemliskiForest病毒可用于各式各樣的宿主，因為系統(tǒng)不基于染色體整合，因此將是在針對鑒定結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系和測試各種雜交分子的效果的研究中獲得重組動物膠原修飾的快速途徑。Olkkonen等(1994)MethodsCellbiol4343-53描述了構(gòu)建用于在哺乳動物宿主細胞中表達外源蛋白質(zhì)的SemilkiForest病毒載體的方法。另外，可用含有dhfr基因和所需多聚核苷酸的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染二氫葉酸還原酶缺陷(dhfr)的CHO細胞。對提高氨甲蝶呤濃度抗性的CHO細胞的篩選將經(jīng)過基因擴增，如本領(lǐng)域已知的提供了所需重組蛋白的更高的表達水平。還可用轉(zhuǎn)基因動物系統(tǒng)表達本發(fā)明的重組明膠或可以衍生出重組明膠的多肽?？稍诓溉閯游镏型ㄟ^可操縱性連接編碼多肽和啟動子以及其它能在哺乳動物腺體中有效表達其它所需或任選的調(diào)控序列，構(gòu)建這些系統(tǒng)。類似的，可同時在使用合適的表達系統(tǒng)的靶細胞中產(chǎn)生影響翻譯后修飾的所需或任選的翻譯后加工酶。用轉(zhuǎn)基因動物重組產(chǎn)生動物的方法是本領(lǐng)域已知的(見例如美國專利號4,736,866；美國專利號5,824,838；美國專利號5,487,992；和美國專利號5,614,396；和同時申請的美國臨時申請?zhí)?8/987,292)。明膠的用途明膠在各種藥物或醫(yī)學(xué)產(chǎn)品和裝置的制造中作為一種組分。估計85％的藥物產(chǎn)品含有某種形式的牛衍生的物質(zhì)，包括目前在各種產(chǎn)品中使用的牛明膠，例如藥物穩(wěn)定劑、血漿補充劑、海綿、硬和軟明膠膠囊、栓劑等。利用明膠的成膜性。在特別設(shè)計用于藥物口服固體劑型，包括緩釋膠囊和片劑的各種薄膜包裝系統(tǒng)中，明膠在藥物產(chǎn)業(yè)中，例如在藥物和疫苗，食品和飲料產(chǎn)品和工藝中，在工業(yè)引用中，例如混凝土穩(wěn)定化中作為各種形式的穩(wěn)定劑，和在各種實驗室溶液中，例如各種細胞制劑中作為穩(wěn)定劑。在食品和飲料工業(yè)中長期使用各種可食形式的明膠。明膠廣泛用于各種糖果和甜點工業(yè)，特別是布丁、糖霜、奶油夾心和乳品和冷凍產(chǎn)品中。明膠在各種裱花料和湯和調(diào)味汁中作為乳化劑和增稠劑。明膠用于各種飲料，包括酒和果汁的澄清劑和凈酒劑。明膠用于各種低脂和脫脂產(chǎn)品，例如蛋黃醬和沙拉醬中用作增稠劑和穩(wěn)定劑，并在其它地方作為脂肪替代品。明膠還廣泛用于調(diào)味劑、色素和維生素的微囊化。明膠還可在各種高能和營養(yǎng)飲料和食品(例如那些在減肥和運動產(chǎn)業(yè)中流行的)中用作蛋白質(zhì)補充物。作為薄膜形成物，明膠用于對水果。肉類、熟食上衣，和各種糖果制品，包括硬糖和口香糖等。在化妝品工業(yè)中，明膠出現(xiàn)在各種護發(fā)和護膚品中。明膠在許多洗發(fā)精、摩絲、霜、乳液、面膜、唇膏、指甲水和產(chǎn)品，和其它美容裝置和用途中用作增稠劑和基礎(chǔ)劑。明膠還在化妝品工業(yè)中用于微囊化和包裝各種產(chǎn)品。明膠用于各式各樣的工業(yè)用途。例如，明膠在各種制造過程中廣泛用作膠水和粘合劑。明膠可用于各種粘合劑和膠水制劑，例如用于制造可重新水化的膠紙包裝帶、木膠貼、各級紙板箱和紙的紙面粘合，和提供各種可在重新濕潤后重新活化的粘性表面的應(yīng)用。明膠在各種電子裝置中作為光敏感性涂層，在各種光刻法中作為光致抗蝕基底，例如在彩色電視機和攝像機制造中。在半導(dǎo)體制造中，明膠用于構(gòu)建引線框和涂覆各種半導(dǎo)體元件。明膠用于各種印刷用途和制造特殊質(zhì)量的紙，例如用于債券和股票證明等。長期確定了明膠在各種照像應(yīng)用中的用途。明膠用作照像溶液中的各種活性成分，包括用于X光和照像膠片顯影的溶液。長期用于各種照像蝕刻法的明膠也作為各種類型膠片的成分，并大量用于各種膠片層和紙制品的鹵化銀化學(xué)中。銀明膠膠片是縮微膠片形式和其它信息儲藏形式。用明膠作為各種薄膜的自密封元件等。明膠還是用于各種實驗室應(yīng)用的有價值物質(zhì)。例如，明膠可用于各種細胞培養(yǎng)用途，提供細胞附著和生長的合適表面，例如平板和燒杯涂層，微珠或其它底物，或提供生長介質(zhì)中合適的細胞來源。用水解或低凝膠強度的明膠作為各種方法中的生物緩沖液，例如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)和其它免疫測定的涂層和封阻溶液。明膠還在各種用于生物化學(xué)和電泳分析的凝膠，包括酶顯影凝膠中作為組分。藥物本發(fā)明還考慮了重組明膠在各種藥物和醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的用途。特別是在一個實施例中，本發(fā)明提供了含有重組明膠的藥物組合物。在一個優(yōu)選例中，重組明膠衍生自人來源。該重組明膠提供了之前在本領(lǐng)域中沒有的優(yōu)點用衍生自天然人膠原序列的明膠，減少了明膠物質(zhì)免疫原性的危險，因為該明膠在受控環(huán)境中重組產(chǎn)生，因此最大程度減少了引入加工過程中TSE或病原體和內(nèi)毒素等因子的感染性的危險。商品物質(zhì)的內(nèi)毒素水平通常在約1.0-1.5EU/mg明膠(見例如Schaegger，H.和G.vonJagow(1987)anal.Biochem.166368-379；Friberger，P.等(1987)在“DetectionofBacterialEndotoxinswiththeLimulusAmeocyterLysateTest”，Prog.Clin.Biol.Res.231149-169)。在本發(fā)明的方法中，內(nèi)毒素水平可減少2-3個數(shù)量級。(見實施例8)。本發(fā)明因此在一個實施例中提供了衍生自人來源，基本無內(nèi)毒素的重組明膠。除了提供不含與動物衍生的物質(zhì)有關(guān)的免疫原性和感染性因素的明膠材料，本發(fā)明提供了可重復(fù)的組合型產(chǎn)物來源。特別是，本發(fā)明的明膠可作為相同分子的同源混合物存在?？商貏e引入和組合型實現(xiàn)特定醫(yī)學(xué)用途中所需的物理特征。本發(fā)明因此能提供可靠和組合型的產(chǎn)物，，最大程度減少與可獲得性和使用目前明膠產(chǎn)物有關(guān)的可變性。在特定實施例中，本發(fā)明的重組明膠可用于制造膠囊，包括硬殼或硬膠囊，通常從明膠溶液生產(chǎn)，和軟殼和軟膠囊，通常從明膠薄膜制備。在本發(fā)明的特定實施例中，作為制造這些膠囊的方法，提供了含有重組明膠的硬凝膠膠囊和軟凝膠膠囊。明膠的熱可逆性是許多應(yīng)用，例如制造這些凝膠膠囊和片劑中利用的特性?？蛇m當(dāng)加熱、成型或塑造明膠，可用于在穩(wěn)態(tài)溫度下形成具有特定性質(zhì)膠囊或片劑糖衣。所選的明膠可在口腔溫度下開始融化，方便吞服，在體內(nèi)溫度，例如胃內(nèi)變?yōu)橐后w。在一個實施例中，本發(fā)明提供了具有市售明膠和糖衣的熔解速度的重組明膠。在另一個實施例中，本發(fā)明提供了具有改進的彈性，適用于膠囊和糖衣的重組明膠。在某些應(yīng)用，例如制造凝膠膠囊中，明膠隨著時間發(fā)脆和發(fā)硬是限制目前銷售的動物來源明膠的儲藏期和實用性的重要參數(shù)。隨時間保持粘性是寶貴的優(yōu)點，尤其對于含明膠產(chǎn)品的制造商而言。另外，一些制造過程，例如硬明膠膠囊的制造目前需要不同類型明膠的混合物，例如A型和B型明膠，以產(chǎn)生具有所需性質(zhì)的物質(zhì)，因為在硬明膠膠囊中單獨使用B型明膠會太脆，不適合制造和使用。本發(fā)明重組明膠具有更高的純度，比目前可得的材料特性更好。因此，本發(fā)明的明膠可提供穩(wěn)定的物質(zhì)，和行為更可重復(fù)和預(yù)測的物質(zhì)。另外，用本發(fā)明的方法，可以工程改造重組明膠，它在一個分子或在分子的明確混合物中具有兩類明膠的結(jié)構(gòu)特征。本發(fā)明的重組明膠還可在各種藥物產(chǎn)品中，例如在藥物或疫苗中用作穩(wěn)定劑。(見例如共同申請，同時擁有的美國臨時申請?zhí)枺撸撸?，題為“疫苗中的重組明膠”，2000年11月10日提交，在此完整引入以供參考)。各種膠原的不同區(qū)域與不同活性有關(guān)，例如III型明膠的不同區(qū)域與凝血級聯(lián)中的活性位點有關(guān)。因此在一個實施例中，本發(fā)明考慮使用編碼含有特定膠原或一些特定膠原的特定活性位點的重組明膠的多聚核苷酸。這些多聚核苷酸可以各種方式，例如在微陣列中使用。因此，這些多聚核苷酸可用作診斷工具，來鑒定對應(yīng)于樣品中感興趣的膠原結(jié)構(gòu)域的mRNA多聚核苷酸改變的連接。編碼的多肽可用于各種篩選藥物和化合物的方法，這些藥物和化合物可抑制或增強與特定膠原結(jié)構(gòu)域有關(guān)的活性和/或表達。本發(fā)明還可用于衣殼包裝，包括微囊化、壓片、栓劑和各種藥物制劑。本發(fā)明還考慮使用本文提供的明膠在醫(yī)用海綿，例如止血海綿等中在傷口處理和各種手術(shù)應(yīng)用中的用途，例如作為用于防止在胎兒鏡檢查和其它手術(shù)中除去孔后的滲漏。因此，在一個方面，本發(fā)明包括含有重組明膠的海綿，其中海綿適用于醫(yī)藥過程。在一個優(yōu)選例中，重組明膠是重組人明膠。本發(fā)明的重組明膠可設(shè)計成適用于特定應(yīng)用的具有特定物理性質(zhì)。本發(fā)明提供了改變分子量、凝膠強度和最終明膠制劑的pH，來提供具有所需特定性質(zhì)的明膠，從而以目前可得的物質(zhì)不能達到的程度滿足消費者的特定需要。市售動物衍生的溶液明膠，例如用于疫苗制劑的分子量分布在約0-30kD和約0-60kD之間(見實施例7和9)。本發(fā)明提供了一種在合適的水解條件下產(chǎn)生重組人明膠的方法，從而得到具有對應(yīng)于市售明膠的分子量分布的重組人明膠，可用于相同的目的。另外，本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有不能從商業(yè)物質(zhì)獲得的更窄的分子量分布，例如約10-30kDa或約30-50kDa的明膠的方法。本發(fā)明的重組明膠及其組合物還可用于各種外科手術(shù)，包括用于引導(dǎo)和支持神經(jīng)再生的生物可降解導(dǎo)線，用于大手術(shù)中的膠體體積置換，用于密封各種孔部位，例如導(dǎo)管插入位點和其它切割和傷口的明膠海綿塞，和在聚酯移植物中，例如作為抗感染密封材料。(見例如Mligilche，N.L.等(1999)East.Afr.Med.J.76(7)400-406；Beyer等(1997)Br.J.Anaesth.781(1)4-50；Luks等(1999)Am.J.Obstet.Gynecol.181(4)995-996；和Farooq等(1999)J.Surg.Res.87(1)57-61)。本藥物組合物可施給個體，用于治療各種關(guān)節(jié)病癥，包括關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)病和其它與軟骨降解和關(guān)節(jié)靈活性有關(guān)的病況。在一個優(yōu)選例中，重組明膠含有一種修飾的氨基酸序列，它具有更高濃度的精氨酸、羥脯氨酸和羥賴氨酸，和其它與在軟骨中產(chǎn)生膠原和蛋白糖苷有關(guān)的其它氨基酸(見例如Oesser等(1999)J.Nutr.129(10)1891-1895)。還考慮了用本發(fā)明的明膠合成的微球。這些微囊化的顆?？捎糜诶缍ㄏ騻鬟f治療性蛋白或小分子，提供非炎癥性和生物適合的傳遞系統(tǒng)。(見例如Brown等(1998)ArthritisRheum，412185-2195)。在另一個方面，本發(fā)明考慮口腔施用本發(fā)明的重組明膠，來環(huán)節(jié)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的疾病作用(Arborelius等(1999)RheumatolInt18129-135)。在內(nèi)服藥制品中，理想的是提供重組明膠，它在胃腸道的酸性環(huán)境中具有能抵抗降解的穩(wěn)定性。本領(lǐng)域可得的各種微囊化、各種制劑和藥物輸送系統(tǒng)技術(shù)在各種來源中有描述(見例如Gennaro，A.R.編，(1990)Remington’sPharmaceuticalSciences，18版，MackPublishingCo.，EastonPA)。用本領(lǐng)域已知的方法不難確定給藥的最有效和便利的途徑，和特定情況最合適的制劑。合適的給藥途徑可以包括例如口腔、直腸、透粘膜或小腸內(nèi)給藥和胃腸外給藥，包括肌肉內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、或眼內(nèi)注射?？伸o脈內(nèi)、皮或口腔內(nèi)傳遞疫苗，并采用活的減毒、亞基、單價、二價、三價等形式。也考慮了腸內(nèi)緩釋制劑等。可以局部而不是以全身方式施用組合物。本發(fā)明還提供了一種含有重組明膠的藥物組合物，其中組合物適合作為噴霧傳遞，用于舌或鼻內(nèi)傳遞。食品在食品工業(yè)中，明膠的物理性質(zhì)和純蛋白組合物使它適合各種用途，包括作為各種食用產(chǎn)品和營養(yǎng)補充劑的組分。明膠可以本身是食品，提供無糖的純蛋白來源。另外，明膠的物理和結(jié)構(gòu)特征對于各種食品制造和包裝用途是有用的。例如，用明膠作為凝結(jié)劑和增稠劑；作為乳化劑和發(fā)泡劑；防止乳凝聚或蛋白液體分離；用于“感覺”，或改進穩(wěn)定性和質(zhì)地；維持濕度；和在粘合和包裝中用作可食用薄膜。食用明膠可作為純蛋白質(zhì)的很有價值的來源。因此，在一個方面，本發(fā)明提供了含有重組明膠的蛋白補充劑。本發(fā)明的明膠可用例如特定和理想量的必需氨基酸制備。本發(fā)明提供了生產(chǎn)各種凝膠、箔或粉末形式，具有對于特定應(yīng)用或終產(chǎn)物特別優(yōu)化的特征的食用明膠的方法。本發(fā)明提供了含有不同比例的氨基酸殘基的重組明膠產(chǎn)物。通常明膠含有大部分人必需氨基酸，包括例如賴氨酸、精氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。在一個實施例中，本發(fā)明提供了含有特定比例的氨基酸的所需明膠。例如，用于要補充運動員飲食的食品的明膠含有較高水平的賴氨酸，它對于肌肉生長是有益的，和精氨酸，它作為肌動蛋白的前體，與肌肉細胞的能量代謝有關(guān)?？偟膩碇v明膠可用于提高食品的營養(yǎng)價值，補充和提高其它蛋白質(zhì)來源，例如肉和乳制品的氨基酸組分。明膠幾乎無味或具有淡味，因此作為美味和有營養(yǎng)的食品補充劑。用水解的明膠作為甜點和糖果以及其它含熱量的食品中作為濃縮糖溶液的替代品，減少熱量的含量。明膠還可用作具有高營養(yǎng)價值的食品中蛋白質(zhì)的來源，例如在減肥食品工業(yè)或高能食品中產(chǎn)生的低熱量食品。另外作用一種蛋白質(zhì)來源的添加物，明膠可作為噴霧或干燥的方便食品和調(diào)味劑中的無糖載體或填充物質(zhì)，或作為酒和果汁中的澄清劑和凈酒劑。明膠賦予的所需要的性能，包括例如質(zhì)地、顏色和澄度的能力具有高度價值。這些產(chǎn)品的質(zhì)地在很大程度上由使用成分的類型、制劑變化和加工和儲藏產(chǎn)品的方法決定。在糖果應(yīng)用中，明膠出現(xiàn)在各種凝膠制品中，例如軟果糕和流行的口香糖產(chǎn)品。明膠用作膠凝劑，提供了從柔軟而有彈性到松脆和硬的質(zhì)地。最終產(chǎn)物的質(zhì)地和口感由所用明膠的Bloom強度、濃度和配方?jīng)Q定。另外，明膠的膠體性質(zhì)提供了顏色和染料的基質(zhì)，獲得終產(chǎn)物所需的不透明性或澄度，以及顏色。因此，在一個方面，本發(fā)明能夠在膠凝糖果制品的制造中提供所需質(zhì)地性質(zhì)、量度和澄度的明膠。在另一個方面，選擇合適的明膠，它具有較低的粘度，因為高粘度會使沉淀的糖漿在制造過程中產(chǎn)生不理想的拖尾，導(dǎo)致有缺陷的產(chǎn)物。一般來說，明膠bloom值越高，產(chǎn)品越硬，因此提高明膠含量可使產(chǎn)品質(zhì)地變得更硬，更容易咀嚼。在生產(chǎn)泡泡糖產(chǎn)品中廣泛利用的一種明膠是它能產(chǎn)生和支持泡沫，并促使在氣/液界面糖果在包裹的氣泡周圍形成薄膜迅速凝固。泡泡糖產(chǎn)品是糖果產(chǎn)品中的一個大家族，包括棉花糖、糖霜、牛軋?zhí)呛惋灨珊捅〈囡炛械膴A心。特定產(chǎn)品所需的充氣程度和凝固時間由使用的明膠的類型和級別，以及最終產(chǎn)品中明膠的濃度決定。改變所用明膠的類型和部分將改變充氣產(chǎn)品的質(zhì)地。例如，具有高Bloom值或凝膠強度的明膠產(chǎn)生較脆的口感，而具有較低bloom值的明膠提供了更有彈性的質(zhì)地。明膠在水果糖和其它類型的用絲光糖的糖果制品，例如太妃糖和飴糖(它們含有脂肪，輕微發(fā)泡)的制造中有許多功能。例如，明膠幫助脂肪的乳化；改善分布和穩(wěn)定性；提供所需的質(zhì)地和咀嚼性，以及發(fā)泡能力；并對終產(chǎn)物的儲藏期有作用，例如通過控制蔗糖結(jié)晶。具有約150-200Bloom值的明膠通常以0.5-1.5％w/w的用量水平用于這些產(chǎn)品。因此，在一個方面，本發(fā)明考慮用于食品的具有約150-200Bloom值的重組明膠。明膠為稀奶油提供了粘性質(zhì)地，它同時具有固相和液相界面，由分散在糖漿中的粉末糖和脂肪構(gòu)成。明膠作為粘合劑，防止形成易碎的質(zhì)地，并抑制破裂。在甘草等產(chǎn)品中，明膠常常和小麥粉等物質(zhì)混合作為粘合劑，大大改善了水分保持，并防止在制造中破裂或碎裂。明膠還幫助防止糖果制品，例如甘草在儲藏中干燥，延長產(chǎn)品的儲藏期限。本發(fā)明因此在一個實施例中提供了一種含有重組明膠的粘合劑，該粘合劑可以是食品的一部分。本發(fā)明還提供了含有重組明膠的濕潤劑，該濕潤劑能用于食品?？傻玫礁鞣N形式的膠凝產(chǎn)品，包括快餐制品，干燥混合的粉末混合物，或片劑，其中溶解并凝結(jié)了糖、明膠、酸、調(diào)味劑和色素。在這些用途中利用了明膠形成熔點在25-35℃的彈性質(zhì)地，熱可逆性凝膠的能力。最終的質(zhì)地、硬度和這些凝膠產(chǎn)品的沉淀速度由明膠的濃度和物理性質(zhì)，具體是bloom強度和粘度水平控制。在明膠甜點的生產(chǎn)中，用較低濃度的較高疾病的明膠產(chǎn)生具有特定硬度的膠凝產(chǎn)品，與使用較高濃度的較低強度的明膠可提供優(yōu)點，包括經(jīng)濟上的優(yōu)點，以及可改進的澄度和顏色的顯示。因此在一個實施例中，本發(fā)明提供了含有重組明膠的膠凝劑，其中膠凝劑適用于可食用產(chǎn)品。明膠常用于制造各種乳制品，例如冰淇淋、酸奶和布丁，其中需要特定的質(zhì)地和口感；特別是明膠提供了柔軟、質(zhì)地均勻的穩(wěn)定和奶油口感。明膠應(yīng)用于與其它水狀膠體混合，作為低脂蛋黃醬和沙拉調(diào)料。隨著低脂或脫脂乳制品數(shù)量和需求的廣泛增長，明膠可對產(chǎn)品質(zhì)地、稠度、和最終產(chǎn)品的口感有突出的貢獻。由于其脂肪樣的融化特性，具有約25-35℃的融點的明膠提供了所需的感官性質(zhì)，或“融于口”的特征，因此模仿了全脂產(chǎn)品的質(zhì)地。在一個關(guān)心健康的社會中，明膠非常適合用作低脂或脫脂酸奶產(chǎn)品的穩(wěn)定劑，提高稠度和口感，并在無脂肪的條件下建立柔軟、柔和和奶油般的質(zhì)地。另外，明膠通過防止脫水收縮或分離乳清蛋白穩(wěn)定這些產(chǎn)品。在該方面，明膠的作用是形成與水結(jié)合的凝膠網(wǎng)絡(luò)，防止乳清蛋白的滲出和分離，從而對產(chǎn)品的儲藏期有幫助。明膠還可用于制備增稠的奶油，其中明膠的膠凝和乳化性質(zhì)用于提高奶油粘度。明膠在制造軟冰淇淋、軟干酪產(chǎn)品、酸牛奶甜點，例如乳酪蛋糕中，和調(diào)味的基于牛乳的甜點，例如奶油凍、chiffon和蛋奶酥中具有廣泛的用途。奶油粘度可以通過改變所用的明膠的濃度和凝膠性質(zhì)隨需要變化。通常這些用途的明膠水平范圍是0.2-0.8％w/w，雖然更高或更低的凝膠強度在各種產(chǎn)品中是理想的。本發(fā)明提供了含有重組明膠的穩(wěn)定劑。在食品和健康工業(yè)中對少脂肪或無脂肪的產(chǎn)品具有正在增長的需求。明膠的減肥飲食性質(zhì)，包括其在不存在脂肪的情況下提供蛋白質(zhì)的能力使其在減肥產(chǎn)業(yè)中，以及為病人設(shè)計的產(chǎn)品、恢復(fù)期病人和具有特定飲食敏感性或需要的個人中是有用的。明膠的蛋白質(zhì)含量增加了無糖營養(yǎng)價值。除了其營養(yǎng)價值，明膠是可高度消化的，并可因此在易于吸收的液態(tài)食品中使用。純明膠不含脂肪、糖、嘌呤或膽固醇。明膠的物理性質(zhì)、蛋白含量、沒有強烈的味道使得它在許多產(chǎn)品中是優(yōu)選的脂肪替代品。明膠在例如低脂黃油和人造黃油中用作乳液穩(wěn)定劑。作為增稠和粘合劑，明膠可完全或部分替代許多食品中所含的脂肪。例如，脂肪可以代替高熱量的粘合劑，例如奶油、黃油和其它乳制品脂肪；蛋黃；和其它淀粉產(chǎn)品。另外，明膠的水分保持性能幫助結(jié)合大量水分，使得膳食后更有滿足和脹慢感。明膠的感覺或口感是關(guān)鍵的，因為許多無脂肪或低脂產(chǎn)品尋求盡可能的模擬脂肪的口感，以及味道。通過在低脂配方中使用明膠，可能實現(xiàn)優(yōu)選的質(zhì)地和口感。所用的明膠量由在最終產(chǎn)品中如存在的脂肪含量決定。例如，在60％的脂肪含量，使用0.5％w/w的明膠，而在25％的低脂水平，用約3.5％w/w的明膠維持產(chǎn)品完整和感覺表現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的明膠可具有與包含其的食品相似的融點，或優(yōu)選人的體溫或口腔溫度，導(dǎo)致明膠在食用時的溫度下融化，和相應(yīng)的濃厚口感。另外，明膠的清淡味道不影響特定食品的味道。最后，明膠是高度可消化的。用明膠作為脂肪替代品使得熱量減少，而質(zhì)地和豐富度不相應(yīng)減少，沒有對味覺和消化性的不良影響。本發(fā)明在一個方面提供了一種含有明膠的脂肪替代品，其中脂肪替代品用于可食用產(chǎn)品。在一個優(yōu)選例中，重組明膠具有約25-35℃的融點。明膠通過滲透和填充組織中的任何空穴改善各種罐頭和保藏食品，包括熟火腿等肉類的外觀和切片特性。在罐頭肉類產(chǎn)品中，明膠用于吸收在高壓殺菌過程中釋放的汁液，提高剪切性能并提供產(chǎn)品令人滿意的外觀。在這些情況下，應(yīng)選擇具有低鈣含量的明膠，因為會發(fā)生肉汁中磷酸鈣從磷酸鹽中沉淀出來。在罐頭應(yīng)用，例如海鮮罐頭中，用具有高凝膠強度的明膠抵抗在滅菌過程中的熱處理。依賴滅菌的程度和所選的凝膠強度，凝膠水平通常范圍在0.5-5.0％w/w。凝膠還作為罐頭海鮮和肉類，以及各種膠凍(肉凍)產(chǎn)品中的粘合劑和膠凝劑。明膠在香腸腸衣中有用，其中它用作將調(diào)味品與薩拉米香腸等產(chǎn)品的切片結(jié)合起來的粘合劑。香腸浸在明膠的濃縮溶液中包衣，該明膠一般具有高bloom強度和高粘度，給明膠足夠的時間凝固并抑制從產(chǎn)品表面流走。這種腸衣還可用于例如制造大豆和其它替代肉制品，和各種水果、肉類和熟食的涂層。在一個方面，本發(fā)明提供了含有重組明膠的可食用涂層。明膠還用于各種調(diào)味劑、色素和其它添加劑、維生素的微囊化。特別考慮了各種可用作穩(wěn)定劑、增稠劑、膜形成劑、粘合劑、可食用涂層、膠凝劑、蛋白補充劑、乳化劑、色素、調(diào)味劑和維生素的微囊化劑等，可用于各種食品補充，包括營養(yǎng)和飲食補充物，以及脂肪替代品的各種重組明膠。在一個實施例中，本發(fā)明的明膠用于為了具有猶太教、伊斯蘭、素食或其它飲食習(xí)慣，限制含有特定動物來源產(chǎn)品的食物攝取的消費者所制備的食物的加工或包裝，或其成分。除了用于人類消費的可食用產(chǎn)品，明膠在制造寵物食品、零食和口香糖中用作粘合劑。除了在這些產(chǎn)品中提供了明膠的結(jié)構(gòu)優(yōu)點，明膠的高蛋白含量還對減輕動物骨骼系統(tǒng)的變性疾病有緩解征兆，并改善了毛皮生長和質(zhì)地。照像在另一個方面，本發(fā)明包括含有重組明膠的照像組合物。優(yōu)選重組明膠是部分羥化的。明膠是各種照像術(shù)和產(chǎn)品，包括例如膠卷和像紙的關(guān)鍵成分。明膠用作光感性產(chǎn)品的粘合劑，其中它的凝膠沉淀和薄膜形成特性提供了澄清、均一和耐久的涂層，它可涉及一次應(yīng)用中的多個涂層。明膠作為粘合劑建立和提供了均一的穩(wěn)定性固化和所需的粘合性。明膠還穩(wěn)定偶聯(lián)物并在彩色照像產(chǎn)品中干燥乳劑。明膠在照像涂層，包括鹵化銀乳液涂層。頂部涂層或表面涂層、中間層和背涂層中是不可缺少的。明膠的化學(xué)和膠體性質(zhì)能精確預(yù)測，并化學(xué)熟化照像用鹵化銀乳液。一些乳化液使用非凝結(jié)魚明膠，它可在高達40％的濃度下，低至20℃的溫度下的溶液中維持液態(tài)。在一個實施例中，重組明膠具有低分子量和低凝結(jié)溫度。在另一個實施例中，重組明膠具有比目前非凝結(jié)魚衍生的明膠或動物衍生的明膠水解物中更低的凝結(jié)溫度，而更高的分子量。本發(fā)明的重組明膠可用于各種照像用途，例如支持膠片和像紙上的鹵化銀。在一個實施例中，重組明膠具有15-25℃之間的凝結(jié)溫度。重組明膠可噴霧干燥或允許是低密度、冷水可溶的粉末或薄膜，因此有利于各種技術(shù)應(yīng)用，例如光致抗蝕系統(tǒng)。本發(fā)明還用于明膠濾膜。例如，本發(fā)明考慮為客戶特別設(shè)計的照像明膠產(chǎn)品，來符合各種特別需要的確切性能，以及制備這些明膠的方法。其它由于本發(fā)明明膠更特別和完整的化學(xué)組成，以及其相應(yīng)的物理性質(zhì)穩(wěn)定性，它提供了與市售明膠相比各種技術(shù)優(yōu)點。本發(fā)明的重組明膠因此可用于目前涉及提取的明膠的技術(shù)應(yīng)用。例如，該明膠可用于各種工藝過程，包括但不限于紙上漿和照相凹版印刷、珂羅版、絲網(wǎng)印刷工藝、微囊化染料、轉(zhuǎn)印紙和其它通過與阿拉伯樹膠形成凝聚復(fù)合物用明膠涂層的紙張和紙板。本發(fā)明的明膠還可用于電鍍，來確保光滑沉積，并在一些聚合反應(yīng)中作為保護性膠體，以及作為半導(dǎo)體制造中的薄膜形成劑。在另一個實施例中，該明膠用作特定質(zhì)量的紙張，包括股票證書、銀行支票等的粘合劑。該明膠還用作火柴膠的粘合劑，對火柴提供較低的密度和更均勻的燃燒，以及加固帆布或紙張襯底上的粘性顆粒，來制造粘性紙。明膠的不同性能，包括其作為保護性膠體，和隨著pH的改變改變其電荷的能力，合起來使得明膠適用作微囊化中的材料。明膠及其衍生物因此可用于各種微囊化裝置和技術(shù)，例如用于無碳紙的微囊化墨水；廣告和制備中的香料；用于多組分粘合劑的化學(xué)物質(zhì)；和維生素和營養(yǎng)補充劑。明膠及其衍生物的微囊化能力還用于制造包裝材料，包括使氧、香味和水蒸氣滲透性最小化的包裝。明膠因此廣泛用于軟包裝，例如食品、藥物和其它敏感產(chǎn)品的包裝。明膠提供的粘合作用和表面張力的減少使得它們能用于根外肥料。由于明膠氨基酸的穩(wěn)定性和低降解，因此維持了肥料提供的確切氮濃度，并使得長期維持。明膠還在肥料顆粒的制造中用作生物可降解粘合劑。由于其氨基酸組成，明膠可作為氮的復(fù)合來源，用于例如產(chǎn)黃青霉合成青霉素，例如各種起始培養(yǎng)物和抗生素的制備(見例如Leonhartsberger等(1993)JBiotechnol30299-313)。本發(fā)明的重組明膠可用于各種實驗室用途，其中本發(fā)明重組明膠的復(fù)制性和均一性受到了高度評價，使得最大限度減少實驗室過程和組合物中的不良可變性。例如，本發(fā)明的明膠可用于各種組織培養(yǎng)用途，在生長培養(yǎng)液中提供合適的蛋白質(zhì)來源，并在一些應(yīng)用中提供細胞生長基質(zhì)或支架，或其它細胞結(jié)合和生長的表面。本發(fā)明還提供了含有重組明膠的細胞保存制劑。例如，這些制劑能用于保存血小板細胞的制備物，保護溶液直到施用和使用。本發(fā)明考慮含有水解或低凝膠強度的重組明膠的生物緩沖液，例如各種封阻和涂層溶液。在其它實施例中，本發(fā)明提供了可重現(xiàn)的重組明膠，用于各種生物化學(xué)和電泳分析用的凝膠，包括酶學(xué)用凝膠。本發(fā)明還包括用重組明膠包裹的微載體珠。這些用于哺乳動物細胞培養(yǎng)的微載體提供了結(jié)合依賴性細胞的生長表面。例如，可用本發(fā)明的重組明膠包裹的多糖和聚苯乙烯珠提供細胞結(jié)合和生長的合適表面。在一個實施例中，本發(fā)明的微載體珠被能誘導(dǎo)特定細胞分化和生長的含有活性膠原結(jié)構(gòu)域特定重組明膠包裹。各種膠原的不同區(qū)域與不同活性有關(guān)，例如III型明膠的不同區(qū)域與凝血級聯(lián)中的活性位點有關(guān)。因此在一個實施例中，本發(fā)明考慮使用編碼含有特定膠原或一些特定膠原的特定活性位點的重組明膠的多聚核苷酸。這些多聚核苷酸可以各種方式，例如在微陣列中使用。重組明膠、多肽和編碼本發(fā)明的重組明膠的多聚核苷酸可用于新穎微陣列技術(shù)和篩選方法。膠原原纖維和固定化的膠原與血小板牢固結(jié)合，因為血小板具有膠原的多個結(jié)合位點，將多個膠原分子彼此聚合在一起。血小板和膠原通過其膠原受體的相互作用導(dǎo)致血小板活化，和隨后形成血小板聚集物。例如，可作為具有目前膠原和明膠來源不能獲得的均一性、純度和可復(fù)制性的微纖維，制備含有III型膠原的生物活性區(qū)域的重組明膠。從該重組明膠衍生出的微纖維可存在于基質(zhì)，例如陣列或芯片中，用于篩選通過與例如III型膠原或其它形成膠原的纖維相互作用防止血小板聚集的化合物?？珊Y選化合物、小分子、肽或其它生物分子(例如抗體)防止、減少或減慢血小板與特定膠原纖維內(nèi)部的特定區(qū)域，例如RGD序列的相互作用介導(dǎo)的凝血形成或血小板聚集的能力。另外，微陣列還可用于檢測不同整合蛋白與不同的膠原和明膠微纖維區(qū)域的相互作用。任何形成原纖維的膠原，例如I、II、III、V或XI型膠原的重組明膠產(chǎn)生的微纖維可用于篩選膠原誘導(dǎo)的血小板聚集物拮抗劑。還考慮了編碼重組明膠或其片段的多聚核苷酸的微陣列。這些微陣列用于篩選和分離編碼膠原或明膠的多聚核苷酸，例如DNA或RNA的變體，確定在正常對疾病組織中不同水平表達。在另一個實施例中，本發(fā)明提供了用于祖細胞分化、組織再生治療、組織工程的純化的人明膠。胞外基質(zhì)的組分與細胞增殖和分化的調(diào)節(jié)有關(guān)。用植入堿性成纖維細胞生長因子的明膠微球加速增殖和人工表皮模型中的毛細血管形成(Kawai等(2000)Biomaterials，21489-499)。IV型膠原抑制細胞增殖和神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化，同時促進神經(jīng)元祖細胞的分化(Ali等(1998)BrainResDevBrainRes11031-38)。另外，I型膠原誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細胞的成骨分化，而II、III和V型膠原不誘導(dǎo)(Mizuno和Kuboki(1995)BiochemBiophysResCommun2111091-1098；和Mizuno等(1997)Bone20101-107)?？偟恼f，在細胞培養(yǎng)物中使用明膠導(dǎo)致更高的細胞密度，并提高和延長造血干細胞和其它祖細胞中的細胞存活率(Tun等(2000)ASAIOJ46522-526)。用作載體基質(zhì)或傳遞載體的明膠支持了傳遞骨髓衍生的間充質(zhì)祖細胞和基于軟骨再生治療的間充質(zhì)細胞傳遞的骨軟骨分化(Angele等(1999)TissueEng5545-554Ponticiello等(2000)JBiomedMaterRes52246-255；和Young等(1998)JOrthopRes16406-413)。本發(fā)明提供了重組明膠，用于細胞培養(yǎng)，例如促進細胞結(jié)合，細胞增殖和細胞分化。在一些實施例中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)設(shè)計提供所需細胞結(jié)合、細胞增殖或細胞分化活性的特定重組明膠的方法。例如，如果需要促進神經(jīng)元祖細胞的分化，可產(chǎn)生含有負責(zé)該活性的IV型膠原的特定區(qū)域的重組明膠。本發(fā)明提供了一種含有重組明膠的化妝品組合物。該組合物可施給個體，來改善和修復(fù)粗糙和開裂的指甲，并改善頭發(fā)的質(zhì)地。明膠的低過敏原性和水合性質(zhì)，及其提供質(zhì)地、顏色和澄度，以及成膜的能力，使其在許多化妝品和洗滌用品中成為必需的成分。例如，明膠是護發(fā)產(chǎn)品，例如洗發(fā)水和護發(fā)素的有價值成分。在一個實施例中，本發(fā)明提供了一種含有重組明膠的濕潤劑，該濕潤劑適用于化妝品應(yīng)用。明膠的薄膜形成作用可改善頭發(fā)，尤其是之前用化學(xué)制劑處理過的損傷了的頭發(fā)的光澤和易梳理性。明膠還用于各種化妝過程，包括頭發(fā)護理過程，例如永久波浪和漂染，其中用明膠等蛋白質(zhì)保護頭發(fā)結(jié)構(gòu)。還考慮了重組明膠在乳液、面膜、霜、唇膏和其它化妝產(chǎn)品中的用途，因為明膠的薄膜形成性能對皮膚的光滑和柔軟有貢獻。在一個方面，本發(fā)明考慮了一種含有重組明膠的化妝組合物，它施用治療磨損或脆弱的指甲等。明膠的不同性質(zhì)，包括其作為保護性膠體，和隨pH改變改變其電荷的性質(zhì)，合起來使得明膠成為一種適用于微囊化的物質(zhì)。明膠及其衍生物因此可用于各種微囊化裝置和技術(shù)，例如在廣告和樣品制造中香料的微囊化。下列實施例更詳細的描述了本發(fā)明。提供了下列制備物和實施例使本領(lǐng)域技術(shù)人員能更清楚的理解，并實施本發(fā)明。然而本發(fā)明不限于示范實施例的范圍，它們僅為了說明本發(fā)明的一個方面，功能上等價的方法在本發(fā)明范圍內(nèi)。事實上，除了本文描述的那些，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)上文的描述和附圖可理解本發(fā)明的各種修改。這些修改也將在權(quán)利要求的范圍內(nèi)。實施例除非另外說明，在本發(fā)明的實施例中使用了下列材料和方法。實施例1重組明膠的直接表達用PCR擴增人I型膠原α1(I)cDNA的特定片段并克隆入質(zhì)粒pPICZαA或pPIC9K中(InvitrogenCorp.Carlsbad，CA)。用于克隆的特定PCR引物列于下文表1。表2中用SEQIDNO15-25和30、31和33列出了特定明膠。另外根據(jù)人前-α1(I)膠原原另外鑒定出這些重組明膠(Genbank登錄號CAA98968)。所用的表達質(zhì)粒含有不同長度的α1(I)cDNA序列，它與酵母雜交因子α前分泌原序列融合。還可使用其它本領(lǐng)域已知的信號序列，例如酵母轉(zhuǎn)化酶(SUC2)、酵母酸性磷酸酶(PHO)序列，天然前膠原信號序列和人血清白蛋白的信號序列。應(yīng)選擇在特定表達系統(tǒng)中提供特定明膠片段表達的最佳水平的信號序列。表1表2用電穿孔將表達質(zhì)粒引入巴斯德畢赤酵母，通過與his4營養(yǎng)缺陷型(pPIC9K載體)互補或通過zeocin抗性(pPICZαA載體)篩選轉(zhuǎn)化株。通過甲醇誘導(dǎo)的醇氧化酶啟動子(PAOX1)調(diào)節(jié)重組蛋白質(zhì)表達。已描述了巴斯德畢赤酵母宿主細胞含有人脯氨酰4-羥化酶(P4H)，負責(zé)膠原內(nèi)羥脯氨酸翻譯后合成的酶的α和β亞基整合拷貝，(見例如Vuorela，M.等(1997)EMBOJ166702-6712)。酵母菌株在緩沖的極限甘油培養(yǎng)基中生長，用含有甲醇(0.5％)取代甘油作為碳源的相同培養(yǎng)基誘導(dǎo)重組蛋白表達，如Invitrogen畢赤表達手冊上所述的。用10-20％TricineSDS-PAGE分析條件培養(yǎng)基和搖瓶培養(yǎng)物中提取物的脯氨酰4-羥化酶活性鑒定產(chǎn)明膠的菌株。共同表達脯氨酰4-羥化酶和膠原片段導(dǎo)致具有天然人序列的重組明膠表達。表達片段并分泌入培養(yǎng)基。從培養(yǎng)基中通過丙酮沉淀、陰離子或陽離子交換層析或其任何組合回收和純化重組明膠。在4℃，通過經(jīng)無細胞培養(yǎng)上清液中加入丙酮至最終濃度40％，進行丙酮沉淀。通過離心收集主要含有內(nèi)源性酵母蛋白的所得的沉淀物。然后在該上清液中加入丙酮至最終濃度80％，導(dǎo)致明膠沉淀，然后通過離心收集，對水透析過夜并凍干。通過陰離子和陽離子混合交換層析獲得高純度的明膠。在室溫下進行層析純化。用電泳估測膠原蛋白的大小，與基于氨基酸組分的分子量計算比較是本領(lǐng)域已知的(Butkowski等(1982)MethodsEnzymol82410-423)。重組明膠的N-末端序列分析顯示與明膠片段融合的前原序列的正確加工，將蛋白質(zhì)定向到酵母分泌途徑。在該系統(tǒng)中產(chǎn)生的明膠僅含人膠原衍生的序列。另外，重組明膠代表了條件培養(yǎng)基中的主要成分，因為巴斯德畢赤酵母細胞分泌很少的蛋白質(zhì)。所表達的重組明膠具有確定的大小，用SDS-PAGE測量范圍在約5kDa-65kDa之間，對應(yīng)于例如約5kDa(泳道2，SEQIDNO18)、約10kDa(泳道3，SEQIDNO19)、約16kDa(泳道4，SEQIDNO24)、約18kDa(泳道5，SEQIDNO20)、約20kDa(泳道6，SEQIDNO28)(也具有計算分子量17,914Da，未在表I中列出)、約33kDa(泳道7，SEQIDNO27)(也具有計算分子量29,625Da，未在表1中列出)、約41kDa(泳道8，SEQIDNO25)和約50kDa(泳道9，SEQIDNO22)的明膠，如圖1所表明(泳道10代表水解的重組人膠原I型，如實施例10所述制備的)。實施例2重組人明膠支持細胞結(jié)合活性本發(fā)明的重組人明膠片段顯示體外細胞結(jié)合活性。在下列實驗中，用下列來自人I型膠原(如實施例1所述，列于表2，SEQIDNO19、SEQIDNO20、SEQIDNO21和SEQIDNO22)的α1鏈的重組人明膠結(jié)構(gòu)域包裹96-孔Maxisorp板(Nunc)。VITROGEN牛膠原(CohesionTechnologies；PaloAltoCA)和牛血清白蛋白分別作為陽性和陰性對照。各蛋白在0.1MNaHCO3、pH10.0中稀釋到0.1mg/ml，包裹板4℃過夜。人包皮成纖維細胞(HFF)或人臍帶靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC，來自Clonetics，第5代)接種于包裹的平板，37℃培養(yǎng)60分鐘。一式三份進行實驗。然后用試劑WST-1測量細胞結(jié)合程度，在ELISA閱讀儀中450mM處閱讀吸光度。圖2A顯示重組人明膠支持HFF與Maxisorp板的結(jié)合，對于這些細胞，結(jié)合直接與包裹各孔的人重組明膠的分子量成正比。特別是，SEQIDNO19、SEQIDNO20和SEQIDNO21的重組明膠支持HFF比用BSA所見的結(jié)合程度更高。圖2B顯示不同的重組人明膠支持內(nèi)皮細胞結(jié)合。還用通過熱水解重組人膠原(如下文實施例9所述)制備的重組人明膠顯示細胞結(jié)合活性，使用分子量范圍在0-30kDa和0-50kDa的重組明膠。實施例3蛋白水解穩(wěn)定性明膠片段的鑒定發(fā)現(xiàn)重組明膠片段在其表達和積聚在重組巴斯德畢赤酵母細胞的培養(yǎng)基中時有蛋白水解修飾。I型膠原α1鏈的螺旋結(jié)合域的幾個不同部分的表達導(dǎo)致鑒定出一種具有高超的蛋白水解穩(wěn)定性的重組明膠。三種不同的明膠片段被克隆入質(zhì)粒pPICZαA，在巴斯德畢赤酵母細胞中表達重組蛋白時評估了其相對穩(wěn)定性。在上文實施例2中敘述了第一種菌株，對應(yīng)于SEQIDNO19。用編碼人α1(I)螺旋結(jié)構(gòu)域氨基酸殘基179-280(SEQIDNO15)和615-715(SEQIDNO23)構(gòu)建了其它菌株。如實施例1所述，用引物SEQIDNO5和SEQIDNO6，以及SEQIDNO3和SEQIDNO7構(gòu)建了這些重組明膠。用XhoI和XbaI消化PCR產(chǎn)物，克隆并如上所述制備用于電穿孔。培養(yǎng)菌株，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達，用SDS-PAGE比較表達的明膠片段。圖3顯示了經(jīng)過蛋白水解的SEQIDNO15(泳道2)的重組明膠和SEQIDNO19(泳道3)的重組明膠，而SEQIDNO23(泳道4)的重組明膠仍然是完全完整的。該結(jié)果顯示能夠產(chǎn)生具有高度穩(wěn)定性的本發(fā)明的重組明膠片段。實施例4羥化的重組人明膠表達在酵母中尚未檢測到脯氨酰4-羥化酶。工程改造巴斯德畢赤酵母來表達活性脯氨酰4-羥化酶，先前用于產(chǎn)生羥化的膠原(見美國專利號5,593,859)。為了表達羥化的重組人明膠，用編碼人α1(I)膠原重組物(SEQIDNO19，表2)100個氨基酸的明膠表達盒轉(zhuǎn)化該菌株，該序列是用引物SEQIDNO1和SEQIDNO2通過PCR產(chǎn)生的。用XhoI-XbaI消化PCRDNA產(chǎn)物(約330bp)連接入pPICZαA(Invitrogen)的XhoI-XbaI位點，建立質(zhì)粒pDO7。從pDO7分離出1048bpCelII-AgeI片段，它含有含有AOX1啟動子區(qū)域的3’部分、交配因子α的分泌信號、SEQIDNO19的重組明膠、來自pPICZαA的多接頭序列、和56個堿基對的AOX1轉(zhuǎn)錄終止子。該片段連接入pPIC9K(Invitrogen)的CelII-AgeI位點，來建立pDO41。用StuI-線性化的質(zhì)粒pDO41通過電穿孔轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母菌株αβ8(his4)，鋪在右旋糖苷極限平板上，選擇與his4營養(yǎng)缺陷型互補的轉(zhuǎn)化株。長出了約20個his+轉(zhuǎn)化株，并用實施例1所述的甲醇誘導(dǎo)。用SDS-PAGE分析條件培養(yǎng)基鑒定出表達SEQIDNO19的菌株(圖4)。從培養(yǎng)基通過丙酮沉淀純化來自陽性菌株的重組明膠片段，并用如Hare，P.E.(1977)MethodsinEnzymology473-18所述的氨基酸分析進一步分析。從這些菌株之一的明膠產(chǎn)品的氨基酸分析顯示在分泌的重組明膠中存在羥脯氨酸。在圖4，分離物#2中所示，從該菌株分離的明膠測定出羥脯氨酸對脯氨酸得到比值是0.29，表明明膠和脯氨酰4-羥化酶共表達。從不表達脯氨酰4-羥化酶的巴斯德畢赤酵母中表達和純化了非羥化的重組明膠。該重組明膠內(nèi)的脯氨酸殘基然后在體外用脯氨酰4-羥化酶活性轉(zhuǎn)化成羥脯氨酸殘基。通過PCR，用引物SEQIDNO3和SEQIDNO4建立明膠表達，導(dǎo)致SEQIDNO24的重組明膠的表達。用XhoI-XbaI消化并純化了525堿基對的PCR產(chǎn)物，連接到XhoI-XbaI消化的pPICZαA。用PmeI使質(zhì)粒成為線性，電穿孔進入巴斯德畢赤酵母株X-33(Invitrogen)。在含有500微克/毫升zeocin的YPD平板上生長選擇轉(zhuǎn)化株。如上所述測試菌株的明膠表達，從陽性分離物的培養(yǎng)基中純化重組的非羥化明膠。通過壓力透析過10kDa分子量截留膜濃縮條件培養(yǎng)基，將樣品針對緩沖液A(50mMTris-HClpH9.0，50mMNaCl)。透析物質(zhì)在用緩沖液A平衡的Q-瓊脂糖柱上層析。在這些條件下明膠不與柱結(jié)合，因此存在于流出組分中。大部分污染的酵母蛋白與柱結(jié)合，并用緩沖液B(緩沖液A+0.5MNaCl)洗脫。對50mM乙酸鈉，pH4.5透析流出組分，重組明膠進一步在用相同緩沖液中平衡的SP-瓊脂糖上純化。重組明膠與柱結(jié)合，分步用0.2MNaCl洗脫。熱變性1mg/ml的純化的明膠(100℃10分鐘)，與純化的P4H以酶底物1∶30的比值在下列組分存在下混合50mMTris-HClpH7.8、2mM維生素C、2mMα-酮戊二酸、0.1mMFeSO4、10μMDTT、10mg/ml牛血清白蛋白和100單位催化酶(SigmaChmicalCo.，St.Louis，MO)(見例如Kivirikko，K.I.和Myllyla，R.(1982)MethodsinEnzymol.82245-304；和Vuori，K.等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.897467-7470)。反應(yīng)在37℃進行16小時。然后用層析在Q-瓊脂糖上如上所述純化重組明膠。用0.5MNaCl從柱上洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)，并收集(圖5，泳道7、8和9)。用SDS-PAGE分析流出和洗脫組分，來顯示回收明膠的純度(圖5)。在流過透析組分后進行明膠的氨基酸分析(圖5；泳道3-6)。氨基酸分析顯示87％明膠被羥化。當(dāng)明膠在羥脯氨酸摩爾數(shù)/脯氨酸摩爾數(shù)+羥脯氨酸摩爾數(shù)等于0.5時實現(xiàn)了100％的羥化。實施例5存在或不存在脯氨酰4-羥化酶下明膠的穩(wěn)定性根據(jù)上述方法表達了18kDa的重組明膠(SEQIDNO20)。用凝膠電泳分析表達的片段。在脯氨酰4-羥化酶存在下表達的重組明膠比在不存在脯氨酰4-羥化酶的條件下表達的明膠的穩(wěn)定性顯著高(見圖6)。在表達脯氨酰4-羥化酶的巴斯德畢赤酵母株中探索了脯氨酰羥化對重組人明膠穩(wěn)定性的作用，和穩(wěn)定性的增強。用引物SEQIDNO1和SEQIDNO7通過PCR構(gòu)建編碼SEQIDNO20(pDO32)的質(zhì)粒。如上所述純化、消化和克隆PCR產(chǎn)物。在缺乏脯氨酰羥化酶的宿主細胞中和含有α和β脯氨酰4-羥化酶亞基的宿主細胞中表達相同的α1(I)cDNA。用PmeI打開的pDO32株X-33(野生型巴斯德畢赤酵母)、兩種表達脯氨酰4-羥化酶的株株P(guān)4H-2和株αβ8電穿孔三種巴斯德畢赤酵母株，如美國專利號5,593,859中和Vourela等(1997)EMBOJ166702-6712所述。用針對500微克/毫升zeocin的抗性選擇轉(zhuǎn)化株。如上所述生長和誘導(dǎo)了各轉(zhuǎn)化的8個分離物，用SDS-PAGE分析表達的重組人明膠的穩(wěn)定性(見圖6)。在野生型巴斯德畢赤酵母株X-33中，觀察到約等摩爾量的完整重組明膠和蛋白水解片段(在凝膠上就在重組明膠下遷移，在圖右側(cè)用箭頭標(biāo)出)(圖6，株X-33)。在共表達脯氨酰4-羥化酶的兩種株中，蛋白水解片段量顯著下降，顯示脯氨酰4-羥化酶與重組人明膠共同表達通過顯著減少明膠的蛋白水解，增強明膠穩(wěn)定性(圖6，株P(guān)4H-2和株αβ8)。實施例6表達培養(yǎng)基補充物增強重組人明膠表達先前的報道已經(jīng)表明補充酪蛋白氨基酸的培養(yǎng)基減少巴斯德畢赤酵母中某些蛋白表達過程中可見的蛋白水解量(Clare，J.J.等(1991)Gene105202-215)。在用各種補料豐富表達培養(yǎng)基后測量巴斯德畢赤酵母中表達的該重組明膠的破壞。在該具體研究中，使用實施例5中所述的巴斯德畢赤酵母株αβ8，其表達重組人明膠片段SEQIDNO20(實施例5和表2)。在補充了不同濃度(0-20％)各種補充成分，包括酪蛋白氨基酸、酪胨、酵母抽提液、蛋白胨、肽胺、胰蛋白胨、Gelatone、乳清蛋白和大豆胨的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)重組明膠。幾種配方，包括乳清蛋白水解物、大豆胨、肽胨和肽胺(Difcolaboratories，Detroit，MI)提高了重組明膠表達水平(圖7，乳清蛋白和大豆胨)。這些結(jié)果表明在重組明膠表達過程中使用特定的培養(yǎng)基補充物可導(dǎo)致生產(chǎn)增加。在一個方面，使用大豆胨作為培養(yǎng)基補充物提供了一種導(dǎo)致重組明膠表達增加的植物衍生的培養(yǎng)基成分(而不是動物衍生的)。這可以提供無動物材料的環(huán)境，用于生產(chǎn)可以用于各種應(yīng)用的重組明膠。實施例7重組人明膠的交聯(lián)通過將10.8毫克重組人膠原I型溶于5毫升水，然后針對20mM磷酸鈉，pH7.2透析，制備重組人膠原的漿液(如美國專利號5,593,859所述獲得)。漿液的最終重組人膠原濃度是2毫克/毫升。將10微升或5微升20％1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，PierceChemicalCo.)溶液加到1毫升上述的人膠原漿液中，進行交聯(lián)重組人明膠的制備。交聯(lián)反應(yīng)在室溫下過夜發(fā)生。針對水透析除去未反應(yīng)的EDC。用6％甘氨酸SDS-PAGE分析分析得到的交聯(lián)重組人明膠。圖8顯示重組人明膠(泳道，標(biāo)記UNL5-4)、交聯(lián)重組人明膠(泳道6、標(biāo)記的UNL-5-4)、交聯(lián)的重組人明膠(泳道5、標(biāo)記的UNL-5-4，0.1％EDC；泳道4，標(biāo)記的UNL-5-4，0.2％EDC)、從SigmaChmicalCo.獲得的市售的硬膠囊明膠(泳道3)和市售的明膠(A型，來自豬皮，約300Bloom，泳道2)。如圖8的SDS-PAGE分析所示，商品膠囊明膠和Sigma明膠含有作為主要成分的α鏈(分子量約110kDa)，以及分子量稍小或稍大的明膠成分(分子量范圍約200-250kDa)。重組人膠原經(jīng)由α鏈構(gòu)成。然而交聯(lián)后，交聯(lián)的重組明膠由α鏈和分子量更高的明膠成片條帶構(gòu)成，與市售明膠市售膠囊明膠相似。這表明顯示與市售膠囊明膠具有相似分子量分布的重組人明膠可以通過交聯(lián)重組人膠原制備。交聯(lián)的重組明膠可在需要更高的凝膠強度和更高的粘性的應(yīng)用中使用。實施例8市售明膠和可溶性重組人明膠的內(nèi)毒素水平用LimulusAmeobocyte裂解液測試，如本領(lǐng)域已知(見例如Friberger，P.等(1987)Prog.Clin.Biol.Res.231149-169)測定了Kind&Knox(K&K)出售的可溶性明膠和本發(fā)明重組明膠(如實施例9所述制備)的內(nèi)毒素水平。測試了三種不同的明膠濃度。如表3所示，熱水解本發(fā)明的重組人膠原I型(rhcI)產(chǎn)生的重組人明膠基本上無內(nèi)毒素。市售材料的內(nèi)毒素水平是約1-1.5EU/毫克蛋白。如本發(fā)明所述制備明膠的方法得到的明膠比市售制品的內(nèi)毒素水平低得多，大約是2-3個數(shù)量級。該低內(nèi)毒素水平使得本發(fā)明的重組明膠特別在某些應(yīng)用中，例如藥物穩(wěn)定化中具有吸引力。表3實施例9通過熱和酸水解衍生的明膠開發(fā)了水解方法(酸、熱和酶)產(chǎn)生分子量分布與目前可得的可溶性動物衍生的明膠相似的可溶性重組人明膠，用于例如疫苗制劑中的穩(wěn)定劑。對于這些實驗，用完整的重組人I型和III型膠原作為起始材料。通過改變水解條件，可能改變最終材料的分子量，產(chǎn)生具有確定分子量的材料。市售明膠的分子量分布將這些重組人明膠與市售明膠作了比較。獲得LeinerDavis，GreatLake，Kind&Knox和Dynagel產(chǎn)生的4種低分子量明膠用于確定特征。所有檢測的明膠在室溫下是可溶的。圖9和表4中顯示了TricineSDS-PAGE凝膠上明膠的分子量分布。凝膠圖樣表明市售明膠的分子量分布大約是0-55kDa，除了Dynagel-1樣品，它具有0-30kDa的分子量分布。凝膠圖樣還解釋了分子量分布的兩種情況。在一個例子中，衍生自LeinerDavis和GreatLake的樣品，用SDS-PAGE觀察到7條明顯的條帶。第二個樣品中的圖樣，衍生自Dynagel和Kind&Knox樣品，顯示在凝膠上連續(xù)的物質(zhì)分布，沒有明顯的條帶分離。Dynagel-1和Dynagel-2的分子量分布很不同，盡管是同一廠商由于同一應(yīng)用制備的。該結(jié)果表明目前可得的明膠中批與批之間的變動可能是十分顯著的。表4*分子量用1.26的系數(shù)調(diào)整，它是標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的平均殘基分子量(115)對膠原蛋白的平均殘基分子量(91.6)的比。如下進行明膠的熱水解。將市售干明膠溶于40-50℃的水，制備5％明膠溶液。用0.1NNaOH或0.1NHCl在制備熱水解中調(diào)節(jié)溶液的pH。在巴斯德畢赤酵母中表達I型和III型重組人膠原，并如美國專利號5,593,859中所述純化。最終的重組人膠原溶于10mMHCl，針對水透析并凍干。凍干的重組人膠原溶于40-50℃的水，制備3％溶液。如下在熱水解前調(diào)節(jié)溶液的pH。在1毫升Reacti-Vials(Pierce)中進行熱水解。水解溫度在100-150℃變動，視實驗而定。水解溶液的pH如表明的從pH2-7變動。水解時間也從1-32小時變動，視溶液的溫度和pH而定。在各時間間隔對明膠水解物取樣，用SDS-PAGE分析。120℃市售明膠的水解將來自Sigma的高分子量樣品溶于6種不同的pH溶液中(5％明膠)并在120℃水解。pH2和pH3溶液水解2.5個小時，每半小時取樣。pH4溶液水解5個小時，每小時取樣。pH5、pH6和pH7溶液水解24小時，水解14小時后每兩小時取樣。在Tricine10-20％SDS-凝膠上如圖10A、10B、10C、10D、10E和10F所示分析水解情況。凝膠情況顯示溶液pH越低，明膠水解發(fā)生越快。凝膠圖樣還揭示在水解物中有兩種水解情況。一種圖樣顯示基于凝膠的幾種明顯分子條帶(見pH2和pH3溶液的水解結(jié)果，圖10A和10B)，雖然其它圖樣顯示凝膠上材料的連續(xù)分布(見pH4、pH5、pH6和pH7溶液水解結(jié)果，圖10C、10D、10E和10F)。這些結(jié)果顯示上面描述的方法或其變體產(chǎn)生兩種不同類型的材料，如所示明膠的分析所見(SDS-PAGE上物質(zhì)的清晰條帶對連續(xù)分布)。這些實驗結(jié)果還表明各種大小的可溶性明膠產(chǎn)生的高分子量明膠的降解。表5顯示用Sigma明膠在pH6.0的溶液中120℃水解后獲得的分子量分布。表5市售明膠150℃的水解將Sigma的高分子量明膠樣品(來自豬皮的A型，250kDa)溶于4種不同的pH溶液(5％明膠)，在150℃水解達10小時。每兩小時對水解物取樣用于分析。用Tricine10-20％SDS-PAGE凝膠如圖11A、11B、11C和11D所示分析水解圖樣。凝膠圖樣表明150℃明膠降解比120℃更快。另外，在150℃進行的明膠水解產(chǎn)生較低分子量的明膠片段。表6顯示Sigma明膠在150℃，pH6的溶液中水解后的分子量分布。表6實施例10重組人膠原I和III的酸和熱水解在中性pH條件(pH7)下水解重組人I型膠原達8小時，或在酸性pH條件(pH2)下達3小時。還在中性和酸性條件下120℃水解重組人III型膠原達6小時。如實施例9所述進行水解。用Tricine10-20％SDS-PAGE凝膠分析人I型和III型重組水解物，如圖12A和12B中所示。SDS凝膠水解圖樣表明重組人膠原的熱水解與衍生自天然來源的高分子量明膠的水解情況是相同的(圖9，圖10A-10F和圖11A-11D，到12A和12B)。與天然明膠(pH7)的水解相似，重組人膠原的酸水解顯示幾條明顯的分子量條帶，雖然中性水解顯示更連續(xù)的分子量分布。重組人明膠的中性水解物分子量分布在熱降解6-8個小時后是約0-70kDa。酸性條件下水解發(fā)生得更快。重組人明膠的酸性水解物的分子量分布更窄，在2-3個小時熱處理后是約0-10kDa。為了進一步精煉所討論的熱水解的重組人明膠，我們證明了酵母多基因重組表達方法對于產(chǎn)生具有明顯的人I型α1(I)鏈分泌片段的可用性。該技術(shù)使我們能產(chǎn)生明確的，高度同源的明膠片段，大小范圍在6-65kDa之間。這代表可用于特定用途的明膠的大小和生物物理性質(zhì)。實施例11I型重組人膠原的酶水解用表7所列的蛋白酶酶水解重組人I型膠原。重組人I型膠原與各種酶一起在37℃培養(yǎng)，使用表7中所列出的底物酶比(w/w)。用Tricine10-20％SDS-PAGE凝膠分析處理過獲得的重組I型水解物。SDS-PAGE凝膠圖樣表明酶水解重組人膠原得到不同的明膠分子量分布。用木瓜蛋白酶酶得到連續(xù)的水解條帶，如圖13和表7所示，而用蛋白酶X水解得到幾條明顯的分子量條帶。如表7所示，該方法產(chǎn)生的重組明膠具有不同的水解圖樣，作為特定酶水解的結(jié)果。這代表了在產(chǎn)生可用于不同應(yīng)用的明膠的尺寸和生物物理性質(zhì)中的靈活性。表7實施例12針對不同重組明膠的針對重組人I型膠原的抗體測試了在巴斯德畢赤酵母中產(chǎn)生人重組I型膠原作為豚鼠的接觸致敏劑的可能過敏反應(yīng)，稱為最大化研究。在研究過程后，收集血清調(diào)查重組人I型膠原在豚鼠中的免疫原性。將1克rHCI浸入10毫升0.9％氯化鈉注射液(SCI)或芝麻油中，37℃保溫72小時。提取物然后在3000rpm離心15分鐘，收集上清液用于給藥。Hartley豚鼠在誘導(dǎo)期內(nèi)接觸治療物和對照溶液。該時期涉及在鉗住的區(qū)域上成對三次皮下注射(ID)。第一對ID注射(頭部)由等體積的SCI中弗氏完全佐劑(FCA)的乳液構(gòu)成。ID注射的第二對(中間)由測試提取物(重組人I型膠原)構(gòu)成。第三對(尾部)含有測試提取物和等體積的FCA的乳液。以相同方式處理陽性和陰性對照動物，除了測試提取物不包括第二對和第三對注射。在ID注射后的第6日，評估了測試位點的刺激證據(jù)。然后用10％SLS的石油醚溶液預(yù)處理，并用玻璃棒按摩使皮膚吸收，敞開放置24小時。在第7日，在各測試動物剃去毛的部位局部施用浸有0.4毫升測試目標(biāo)提取物的4.25厘米直徑的Whatman3號濾紙盤。局部誘導(dǎo)涂用后第13天，攻擊動物。鉗住各動物右側(cè)的某個部位。翌日，將含有0.3毫升測試提取物、載體對照提取物或陽性對照溶液的HillTop室加到鉗住的部位并放在動物上24小時。除去室24、48和72小時后對給藥位點的紅斑和水腫評分。72小時后，收集血液并使其凝結(jié)，然后在2800rpm離心15分鐘。從各試管除去血清，將血清樣本儲藏在-70℃直到使用。然后分析免疫接種的豚鼠血清中針對重組人I型膠原(rhcI)、重組人III型膠原(rhcIII)、VITROGEN牛膠原(CohesionTechnologies；PaloAlto，CA)和各種本發(fā)明的重組人明膠片段，包括6kDa(SEQIDNO18)、10kDa(SEQIDNO19)、18kDa(SEQIDNO20)、33kDa(SEQIDNO27)、50kDa(SEQIDNO22)和65kDa(SEQIDNO33)(見表2和實施例1)片段的抗體的存在。重組膠原和重組明膠在8％Tris-甘氨酸或10-20％TricineSDS-PAGE凝膠上電泳。用研究中使用的各豚鼠的抗血清作蛋白質(zhì)印跡分析。圖14顯示重組人I型膠原特異性抗體存在于用重組人I型膠原接種的豚鼠血清中。在任何檢測的血清中用蛋白質(zhì)印跡分析未觀察到任何針對重組明膠的抗體反應(yīng)性。圖14顯示了該研究中1只豚鼠抗血清的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果。分析了來自至少4只不同豚鼠的血清，各顯示與圖14公開的相同的結(jié)果。理想的是闡明了在rhcI注射入豚鼠后觀察到的引起抗原性反應(yīng)的I型膠原的可能表位。重組人膠原I型在變性和柱層析后分離成α1(I)和α2(I)成分。如Bornstein和Piez(1966)Biochemistry53460所述進行重組I型膠原α1(I)和重組I型膠原α2(I)鏈的由溴化氰(CNBr)切割。如上所述，用SDS-PAGE分離完整的α鏈和得到的肽片段，并用蛋白質(zhì)印跡分析其對于豚鼠血清的反應(yīng)性。圖15A顯示了重組人I型膠原的完整和經(jīng)CNBr切割的α1(I)和α2(I)鏈的考馬斯染色的SDS-PAGE。蛋白質(zhì)印跡分析顯示對rhcI反應(yīng)的豚鼠抗血清針對I型膠原的α2鏈及其特定的CNBr片段。未檢測到針對I型膠原α1鏈的反應(yīng)性(圖15B)。上述蛋白質(zhì)印跡分析利用在SDS-PAGE上電泳檢測了豚鼠血清對于重組人I型膠原、CNBr片段和重組人明膠的反應(yīng)性。為了檢測豚鼠抗血清對于這些多肽在非變性條件下的誘導(dǎo)，進行了直接ELISA分析(圖16)。數(shù)據(jù)顯示豚鼠抗血清識別rhcI的天然構(gòu)象。本發(fā)明的重組明膠在ELISA中都不和豚鼠抗血清反應(yīng)，不論明膠片段在熱變性之前或之后是否存在。如果熱變性在分析前，rhcI在ELISA中甚至更具反應(yīng)性(數(shù)據(jù)未顯示)。這表明血清中的多克隆抗體主要識別序列表位，而不是螺旋結(jié)構(gòu)?？偟恼f，這些結(jié)果表明如這些例子中所示，可用本發(fā)明的方法免除與存在于人膠原I型上的抗原性表位，特別是α2鏈有關(guān)的擔(dān)心。本發(fā)明因此提供了產(chǎn)生缺乏抗原表位的重組明膠的方法，它在需要低抗原性明膠的特定應(yīng)用中是有用的。本發(fā)明所述方法和系統(tǒng)的各種修改和變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是明白的，不違背本發(fā)明的范圍和精神。雖然本發(fā)明已聯(lián)系特別的優(yōu)選例進行了描述，應(yīng)理解所要求的本發(fā)明不會不恰當(dāng)?shù)谋贿@些具體實施例所限。對于本領(lǐng)域和相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員明顯的實施本發(fā)明的各種模式的各種變化在權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本文引用的全部文獻在此完整引入以供參考。序列表序列表<110>法布羅根股份有限公司(FIBROGEN，INC.)<120>重組明膠<130>FG0219PCT<140><141><160>33<170>PatentInVer.2.0<210>1<211>51<212>DNA<213>人(Homosapiens)<400>1gtatctctcgagaagagagaggctgaagctggtctgcctggtgccaagggt51<210>2<211>34<212>DNA<213>人(Homosapiens)<400>2tagactattatctctcgccagcgggaccagcagg34<210>3<211>51<212>DNA<213>人(Homosapiens)<400>3gtatctctcgagaagagagaggctgaggctggagctcagggaccccctggc51<210>4<211>40<212>DNA<213>人(Homosapiens)<400>4atgctctagattattacttgtcaccaggggcaccagcagg40<210>5<211>54<212>DNA<213>人(Homosapiens)<400>5gtatctctcgagaagagagaggctgaagctggccccatgggtccctctggtcct54<210>6<211>39<212>DNA<213>人(Homosapiens)<400>6tgctctagatcattaagcatctcccttggcaccatccaa39<210>7<211>45<212>DNA<213>人(Homosapiens)<400>7tgctctagactattaaggcgcgccagcatcacccttagcaccatc45<210>8<211>48<212>DNA<213>人(Homosapiens)<400>8tgctctagatcattaaggcgcgccaggttcaccgctgttacccttggg48<210>9<211>39<212>DNA<213>人(Homosapiens)<400>9tgctctagatcattatctctcgcctcttgctccagaggg39<210>10<211>57<212>DNA<213>人(Homosapiens)<400>10gtgcccgtggtcaggctggtgtgatgggattccctggacctaaaggtgctgcttaat57<210>11<211>64<212>DNA<213>人(Homosapiens)<400>11ctagattaagcagcacctttaggtccagggaatcccatcacaccagcctgaccacgggca60ccag64<210>12<211>40<212>DNA<213>人(Homosapiens)<400>12atgctctagattattaaggagaaccgtctcgtccagggga40<210>13<211>37<212>DNA<213>人(Homosapiens)<400>13ctagtctagattatcttgctccagaggggccaggggc37<210>14<211>37<212>DNA<213>人(Homosapiens)<400>14ctagtctagattagcgagcacctttggctccaggagc37<210>15<211>102<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>15GlyProMetGlyProSerGlyProArgGlyLeuProGlyProProGly151015AlaProGlyProGlnGlyPheGlnGlyProProGlyGluProGlyGlu202530ProGlyAlaSerGlyProMetGlyProArgGlyProProGlyProPro354045GlyLysAsnGlyAspAspGlyGluAlaGlyLysProGlyArgProGly505560GluArgGlyProProGlyProGlnGlyAlaArgGlyLeuProGlyThr65707580AlaGlyLeuProGlyMetLysGlyHisArgGlyPheSerGlyLeuAsp859095GlyAlaLysGlyAspAla100<210>16<211>261<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>16GlyProMetGlyProSerGlyProArgGlyLeuProGlyProProGly151015AlaProGlyProGlnGlyPheGlnGlyProProGlyGluProGlyGlu202530ProGlyAlaSerGlyProMetGlyProArgGlyProProGlyProPro354045GlyLysAsnGlyAspAspGlyGluAlaGlyLysProGlyArgProGly505560GluArgGlyProProGlyProGlnGlyAlaArgGlyLeuProGlyThr65707580AlaGlyLeuProGlyMetLysGlyHisArgGlyPheSerGlyLeuAsp859095GlyAlaLysGlyAspAlaGlyProAlaGlyProLysGlyGluProGly100105110SerProGlyGluAsnGlyAlaProGlyGlnMetGlyProArgGlyLeu115120125ProGlyGluArgGlyArgProGlyAlaProGlyProAlaGlyAlaArg130135140GlyAsnAspGlyAlaThrGlyAlaAlaGlyProProGlyProThrGly145150155160ProAlaGlyProProGlyPheProGlyAlaValGlyAlaLysGlyGlu165170175AlaGlyProGlnGlyProArgGlySerGluGlyProGlnGlyValArg180185190GlyGluProGlyProProGlyProAlaGlyAlaAlaGlyProAlaGly195200205AsnProGlyAlaAspGlyGlnProGlyAlaLysGlyAlaAsnGlyAla210215220ProGlyIleAlaGlyAlaProGlyPheProGlyAlaArgGlyProSer225230235240GlyProGlnGlyProGlyGlyProProGlyProLysGlyAsnSerGly245250255GluProGlyAlaPro260<210>17<211>501<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>17GlyProMetGlyProSerGlyProArgGlyLeuProGlyProProGly151015AlaProGlyProGlnGlyPheGlnGlyProProGlyGluProGlyGlu202530ProGlyAlaSerGlyProMetGlyProArgGlyProProGl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0335SerAlaGlyProProGlyAlaThrGlyPheProGlyAlaAlaGlyArg340345350ValGlyProProGlyProSerGlyAsnAlaGlyProProGlyProPro355360365GlyProAlaGlyLysGluGlyGlyLysGlyProArgGlyGluThrGly370375380ProAlaGlyArgProGlyGluValGlyProProGlyProProGlyPro385390395400AlaGlyGluLysGlySerProGlyAlaAspGlyProAlaGlyAlaPro405410415GlyThrProGlyProGlnGlyIleAlaGlyGlnArgGlyValValGly420425430LeuProGlyGlnArgGlyGluArgGlyPheProGlyLeuProGlyPro435440445SerGlyGluProGlyLysGlnGlyProSerGlyAlaSerGlyGluArg450455460GlyProProGlyProMetGlyProProGlyLeuAlaGlyProProGly465470475480GluSerGlyArgGluGlyAlaProAlaAlaGluGlySerProGlyArg485490495AspGlySerProGlyAlaLysGlyAspArgGlyGluThrGlyProAla500505510GlyProProGlyAlaProGlyAlaProGlyAlaProGlyProValGly515520525ProAlaGlyLysSerGlyAspArgGlyGluThrGlyProAlaGlyPro530535540AlaGlyProValGlyProValGlyAlaArgGlyProAlaGlyProGln545550555560GlyProArgGlyAspLysGlyGluThrGlyGluGlnGlyAspArgGly565570575IleLysGlyHisArgGlyPheSerGlyLeuGlnGlyProProGlyPro580585590ProGlySerProGlyGluGlnGlyProSerGlyAlaSerGlyProAla595600605GlyProArgGlyProProGlySerAlaGlyAlaProGlyLysAspGly610615620LeuAsnGlyLeuProGlyProIleGlyProProGlyProArgGlyArg625630635640ThrGlyAspAlaGlyProValGlyProProGlyProProGlyProPro645650655GlyProProGlyProPro660權(quán)利要求1.一種含有重組明膠的組合物。2.一種重組明膠，其特征在于，該重組明膠具有選自約5kDa、約8kDa、約9kDa、kDa、約14kDa、約16kDa、約22kDa、約23kDa、約36kDa、約44kDa和約65kDa的分子量。3.一種重組明膠，其特征在于，該重組明膠具有選自約0-50kDa、約10-30kDa、約30-50kDa、約10-70kDa、約50-70kDa、約50-100kDa、約100-150kDa、約150-200kDa、約200-250kDa、約250-300kDa和約300-350kDa的分子量范圍。4.一種分子量大于300kDa的重組明膠。5.一種重組明膠，其特征在于，該重組明膠具有選自50、100、150、200、250和300的Bloom強度。6.一種Bloom強度在0-100之間的重組明膠。7.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，該重組明膠部分羥化。8.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，該重組明膠具有選自20-80％、30-80％、40-80％、60-80％、20-60％、30-60％、40-60％、20-30％、20-40％和30-40％的羥化百分?jǐn)?shù)。9.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述重組明膠未羥化。10.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述重組明膠水解。11.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述重組明膠水解。12.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述重組明膠是重組明膠多肽的均一混合物。13.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述重組明膠是重組明膠多肽的不均一混合物。14.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述重組明膠衍生自不含其它膠原的一類膠原。15.如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，所述一類膠原選自I型、II型、III型、IV型、V型、VI型、VII型、VIII型、IX型、X型、XI型、XII型、XIII型、XIV型、XV型、XVI型、XVII型、XVIII型、XIX型和XX型膠原。16.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述重組明膠具有低于1.000EU/毫克的內(nèi)毒素水平。17.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述重組明膠具有低于0.500EU/毫克的內(nèi)毒素水平。18.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述重組明膠具有低于0.050EU/毫克的內(nèi)毒素水平。19.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述重組明膠具有低于0.005EU/毫克的內(nèi)毒素水平。20.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述重組明膠是重組人明膠。21.一種重組明膠，其特征在于，該重組明膠含有選自SEQIDNO15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、31和33的氨基酸序列。22.一種分離和純化的多聚核苷酸，其特征在于，該多聚核苷酸編碼選自SEQIDNO15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、31和33的氨基酸序列。23.一種含有權(quán)利要求22所述的多聚核苷酸的表達載體。24.一種含有權(quán)利要求22所述的多聚核苷酸的宿主細胞。25.如權(quán)利要求24所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞是原核細胞。26.如權(quán)利要求24所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞是真核細胞。27.如權(quán)利要求24所述的真核宿主細胞，其特征在于，真核宿主細胞選自酵母細胞、動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞和真菌細胞。28.一種含有權(quán)利要求22所述的多聚核苷酸的轉(zhuǎn)基因動物。29.一種含有權(quán)利要求22所述的多聚核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物。30.一種重組明膠，其特征在于，該重組明膠含有選自SEQIDNO26、27、28和29的氨基酸序列。31.一種產(chǎn)生重組明膠的方法，其特征在于，該方法包括(a)提供了重組膠原或原膠原，或其片段或變體；和(b)加工重組膠原或原膠原，或其片段或變體，產(chǎn)生重組明膠。32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，重組膠原是重組人膠原。33.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，重組膠原或原膠原是通過共表達至少一種編碼膠原或原膠原的多聚核苷酸和至少一種編碼膠原翻譯后加工酶或其亞基的多聚核苷酸產(chǎn)生的。34.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述翻譯后加工酶是脯氨酰羥化酶。35.一種產(chǎn)生重組明膠的方法，其特征在于，該方法包括直接從改變的膠原構(gòu)建物產(chǎn)生重組膠原。36.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述重組明膠是通過共表達經(jīng)改變了的膠原構(gòu)建物和至少一條編碼翻譯后加工酶或其亞基的多聚核苷酸產(chǎn)生的。37.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述翻譯后加工酶是脯氨酰羥化酶。38.一種產(chǎn)生具有所選融化溫度的重組明膠的方法，其特征在于，該方法包括對重組明膠進行對應(yīng)于所選融化溫度的一定百分?jǐn)?shù)的羥化。39.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，進行步驟包括在脯氨酰羥化酶的存在下，從改變的膠原構(gòu)建物中產(chǎn)生重組明膠。40.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，進行步驟包括從羥化的重組膠原中衍生出重組明膠。41.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，進行步驟包括羥化未羥化的重組明膠。42.一種含有重組明膠的粘合劑。43.一種含有重組明膠的膠囊。44.一種含有重組明膠的穩(wěn)定劑。45.一種含有重組明膠的成膜劑。46.一種含有重組明膠的濕潤劑。47.一種含有重組明膠的乳化劑。48.一種含有重組明膠的增稠劑。49.一種含有重組明膠的膠凝劑。50.一種含有重組明膠的膠態(tài)劑。51.一種含有重組明膠的粘合劑。52.一種含有重組明膠的藥物組合物。53.如權(quán)利要求52所述的藥物組合物，其特征在于，所述重組明膠是重組人明膠。54.一種含有重組明膠的硬凝膠膠囊。55.一種含有重組明膠的軟凝膠膠囊。56.一種含有重組明膠的血漿容量擴張劑。57.一種含有重組明膠的膠體體積置換物質(zhì)。58.一種含有重組明膠的移植物涂層。59.一種含有重組明膠的醫(yī)用海綿。60.一種含有重組明膠的醫(yī)用栓。61.一種含有重組明膠的藥物穩(wěn)定劑。62.一種含有重組明膠的微載體。63.一種試劑盒，其特征在于，該試劑盒含有(a)含有重組明膠的組合物；和(b)用于將組合物傳遞給個體的裝置。64.一種含有重組明膠的可食用組合物。65.一種含有重組明膠的蛋白質(zhì)補充劑。66.一種含有重組明膠的脂肪替代品。67.一種含有重組明膠的營養(yǎng)補充劑。68.一種含有重組明膠的可食涂層。69.一種含有部分羥化的重組明膠的照相組合物。70.一種含有完全羥化的重組明膠的照相組合物。71.一種含有重組明膠的化妝品組合物。72.一種含有重組明膠的工業(yè)組合物。73.一種含有重組明膠的細胞培養(yǎng)組合物。74.一種含有重組明膠的實驗室用組合物。全文摘要本發(fā)明提供了重組明膠及其組合物,以及它的生產(chǎn)和使用方法。文檔編號A61P31/04GK1423659SQ00818371公開日2003年6月11日申請日期2000年11月10日優(yōu)先權(quán)日1999年11月12日發(fā)明者R·C·常,K·I·基維里克,T·B·內(nèi)夫,D·R·奧爾森,J·W·波拉克申請人:法布羅根股份有限公司