專利名稱：催化切割β－胡蘿卜素的新型雙加氧酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化細(xì)菌、酵母、真菌、昆蟲、動物、和植物細(xì)胞、種子、組織、和完整生物體的領(lǐng)域。更具體的說，本發(fā)明涉及將編碼類胡蘿卜素/類視黃質(zhì)(retinoid)生物合成途徑的一種或多種特定酶的重組核酸序列整合到合適宿主細(xì)胞或生物體中，它們在轉(zhuǎn)化之后展示期望表型，而且可用于例如商業(yè)生產(chǎn)。另外，本發(fā)明提供了通過生物技術(shù)來實(shí)現(xiàn)氧化切割C40類胡蘿卜素而產(chǎn)生類胡蘿卜素/類視黃質(zhì)途徑的不同特征性代謝物的手段和方法。
背景技術(shù)：
維生素A(視黃醇)及其衍生物(視黃醛、視黃酸)(在說明書全文中使用術(shù)語“類視黃質(zhì)”)代表在動物中涉及廣泛基礎(chǔ)生理過程的一組化學(xué)類化合物。它們在例如視覺、生殖、代謝、細(xì)胞分化、骨骼發(fā)育、和胚胎形成過程中的圖式形成中是必不可少的。為了研究類視黃質(zhì)(諸如維生素A)的作用，已經(jīng)使用了幾種物種(如小鼠、大鼠、雞、和豬)作為脊椎動物模型生物體，而在無脊椎動物中大多數(shù)研究是用黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)進(jìn)行的。蠅視覺系統(tǒng)數(shù)十年來一直作為使用電生理學(xué)、光化學(xué)、遺傳學(xué)、和分子生物學(xué)研究受體多樣性和維生素A利用的模型。
維生素A及其最重要的衍生物視黃醛和視黃酸(RA)由20個碳原子組成(C20)且屬于化學(xué)類的類異戊二烯。動物通常不能從頭合成類視黃質(zhì)。動物的類視黃質(zhì)生物合成依賴于由食物攝取具有維生素A原活性的類胡蘿卜素。在那些能夠由類胡蘿卜素合成類視黃質(zhì)的動物中，必須酶促切割維生素原。例如在哺乳動物中，已經(jīng)在衍生自小腸和肝的粗提物中描述了這種酶活性。該酶催化對稱氧化切割β-胡蘿卜素而形成兩個分子視黃醛，在生化上表征為15，15’-β-胡蘿卜素雙加氧酶(β-diox I)。這些酶在整個動物界中參與類胡蘿卜素代謝/類視黃質(zhì)形成。例如，

圖1和圖9圖解了在哺乳動物中描述的類視黃質(zhì)形成的生物合成途徑。除了β-胡蘿卜素，還可以切割葉黃素(含氧類胡蘿卜素)，只要它們具有未取代β-芷香酮環(huán)(如β-隱黃素)即可；而且在不同的動物物種中，已經(jīng)報導(dǎo)了對不同于β-胡蘿卜素的類胡蘿卜素進(jìn)行代謝而形成羥化類視黃質(zhì)的能力(如昆蟲綱中的玉米黃質(zhì)和黃體素)。為了進(jìn)一步代謝，必須酶促修飾產(chǎn)生的視黃醛而形成視黃醇(維生素A)或視黃酸。
在細(xì)菌和植物中也發(fā)現(xiàn)了對類胡蘿卜素的酶促氧化切割。在高等植物中發(fā)現(xiàn)了偏心切割類胡蘿卜素的許多范例。這些范例包括番紅花(crocus)中saffron的形成、柑橘水果中檸烏素和其它阿樸類胡蘿卜素的形成，最有趣的是植物激素脫落酸(ABA，參與例如秋季落葉和種子休眠的一種生長調(diào)節(jié)劑)。ABA衍生自在11-12碳雙鍵處氧化切割9-順式-環(huán)氧-類胡蘿卜素。最近，對ABA生物合成缺陷的玉米突變體vp14的研究提供了對這種切割反應(yīng)更好的分子理解，并克隆和分子表征了動物來源的第一種類胡蘿卜素切割酶(β-diox I)。由該發(fā)現(xiàn)提出了問題，即相似的酶是如何參與動物的類胡蘿卜素代謝/類視黃質(zhì)代謝，催化氧化切割具有維生素A原活性的類胡蘿卜素。在隨后的實(shí)驗(yàn)中，的確鑒定并表征了相似的酶(β-diox II)，它們也參與類胡蘿卜素/類視黃質(zhì)途徑并特異切割β-胡蘿卜素而形成β-阿樸胡蘿卜素醛(β-apocarotenal，視黃酸的前體)。因而，除了β-diox I是一類新型β-胡蘿卜素特異酶以外，依照本發(fā)明能夠鑒定的另一類新型酶(β-diox II)也進(jìn)行對相同底物即β-胡蘿卜素的氧化切割。
在動物中，已經(jīng)在體外對這些重要類型的酶在類胡蘿卜素代謝/類視黃質(zhì)形成中的功能研究了近40年。然而，試圖分離并純化這樣的蛋白質(zhì)和鑒定它們的分子結(jié)構(gòu)的所有嘗試都失敗了。這些酶的分子結(jié)構(gòu)的公開(包括它們的核苷酸序列(cDNA)和它們的氨基酸序列)對于研究維生素A/類視黃質(zhì)在動物和在醫(yī)學(xué)中的作用的多個領(lǐng)域而言將是重要的。另外，該遺傳物質(zhì)可用于轉(zhuǎn)化完整的存活生物體，從而得以在例如植物和微生物中生成類視黃質(zhì)(諸如維生素A和視黃酸)以增加它們的營養(yǎng)價值。
在脊椎動物中，已經(jīng)有爭議的討論了在維生素A及其衍生物的生物合成中對β-胡蘿卜素的對稱/不對稱切割。除了β-diox I，本發(fā)明還提供了對來自小鼠、人、和斑馬魚的cDNA的鑒定，它們編碼稱為β-dioxII的第二類胡蘿卜素雙加氧酶，該酶專一催化不對稱氧化切割β-胡蘿卜素而形成β-阿樸胡蘿卜素醛和β-芷香酮(已知是來自例如玫瑰的花香物質(zhì))。除了β-胡蘿卜素，該酶還氧化切割番茄紅素。它的推導(dǎo)氨基酸序列與β，β-胡蘿卜素-15，15’-雙加氧酶享有顯著的序列同一性，而且兩類酶即β-diox I與β-diox II具有幾個保守基元。至于它們的功能，由該酶形成的阿樸胡蘿卜素醛擔(dān)當(dāng)視黃酸生物合成的前體(以及其它可能的生理學(xué)作用)。因而，與果蠅相反，在脊椎動物中對胡蘿卜素的兩種(對稱和不對稱)切割途徑都存在，在這里揭示了胡蘿卜素代謝的更高復(fù)雜性。
在人中，正如普遍知道的，視黃醛(即β-diox I的切割產(chǎn)物)是視覺的決定性因素。同樣清楚的是，決定完整生物體或單個細(xì)胞中視黃酸直接前體可利用性的酶對視黃酸信號途徑及由此介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答將具有廣泛影響。
類視黃質(zhì)具有幾種醫(yī)學(xué)應(yīng)用，如癌癥治療。作為(預(yù)防性或治療性)藥物制劑中的活性成份，類視黃質(zhì)可用于預(yù)防和/或治療不同類型的癌癥。例如，動物模型顯示類視黃質(zhì)可調(diào)控細(xì)胞生長、分化、和凋亡，并在幾種組織(諸如肺、皮膚、乳腺、前列腺、和膀胱)中遏制癌發(fā)生。后者還應(yīng)用于對展示口腔、子宮頸、支氣管上皮、皮膚、及其它組織和器官惡變前或惡性損傷的患者的臨床研究。有些類視黃質(zhì)在體外甚至對高度惡性細(xì)胞顯示抗腫瘤活性，正如通過抑制增殖和誘導(dǎo)分化或凋亡所證明的。治療效果的突出范例是全-反式視黃酸引起前髓細(xì)胞白血病細(xì)胞分化成粒細(xì)胞，全-反式視黃酸目前成功的用于治療這類癌癥(Nason-Burchenal和Dmitroysky，在《Retinoids》(類視黃質(zhì))中，第301頁，1990；Xu和Lotan，在《Retinoids》(類視黃質(zhì))中，第323頁，1999)。
本發(fā)明首次提供了參與動物類胡蘿卜素/類視黃質(zhì)代謝、催化氧化切割具有維生素A原活性的類胡蘿卜素的酶的完整分子表征。本發(fā)明的成就，包括編碼這些基因類型的完整核苷酸序列的發(fā)現(xiàn)，能夠通過提供依照本發(fā)明轉(zhuǎn)化的植物或其部分來改進(jìn)營養(yǎng)狀況，尤其是在不發(fā)達(dá)國家。依照本發(fā)明，提供了稱為β-diox II的一類新型酶，它也進(jìn)行對β-胡蘿卜素的氧化切割。但是與β-diox I相反，它產(chǎn)生β-阿樸胡蘿卜素醛即視黃酸的第二種已知前體。因此，本發(fā)明提供了特異氧化切割β-胡蘿卜素并積累視黃酸前體的兩類新型酶。
例如，維生素A缺乏是以谷物為生(諸如以稻米作為主要或幾乎唯一主食)的世界人口部分中導(dǎo)致嚴(yán)重臨床癥狀的很嚴(yán)重健康問題。僅在東南亞，估計每年有500萬兒童形成眼疾干眼病，其中25萬最終失明。另外，雖然維生素A缺乏不是死亡的終極決定因素，但是它與潛在致命的苦惱諸如腹瀉、呼吸道疾病、和兒童疾病(諸如麻疹)的易感性升高有關(guān)聯(lián)。依照UNICEF匯編的統(tǒng)計結(jié)果，改進(jìn)維生素原營養(yǎng)每年能夠在1-4歲兒童中防止100-200萬人的死亡，還能防止稍后的孩童時期中25-50萬人的死亡。出于這些原因，非常希望提高主食中的維生素A水平。
在發(fā)達(dá)國家，維生素缺乏不再形成普遍問題，因?yàn)橹参锸称诽峁┝俗銐虻木S生素A原，而且可以由動物產(chǎn)品直接獲得維生素A。然而，出于預(yù)防原因或者在困擾例如再吸收或?qū)⒕S生素原正確切割成維生素A的某些臨床和/或遺傳紊亂或功能失常時，可能希望提供類視黃質(zhì)作為例如所謂“功能食品”的功能成份。
盡管涉及視黃醇及其類似物的完全化學(xué)合成有許多發(fā)表物和專利，但仍強(qiáng)烈需要在營養(yǎng)、診斷和藥物/治療應(yīng)用中具有高度價值的這些物質(zhì)的生物技術(shù)生產(chǎn)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)化細(xì)菌、酵母、真菌、昆蟲、動物、和植物細(xì)胞、種子、組織、和完整生物體以產(chǎn)生能夠表達(dá)不對稱切割β-胡蘿卜素雙加氧酶(β-diox II)多肽或其功能片段并積累β-阿樸胡蘿卜素醛和β-芷香酮以及阿樸番茄紅素醛(apo1ycopenal)的轉(zhuǎn)化體的手段和方法。本發(fā)明還提供了通過生物技術(shù)使用天然或轉(zhuǎn)化后積累β-胡蘿卜素或者由培養(yǎng)基攝取β-胡蘿卜素的細(xì)胞、組織、器官、或完整生物體生產(chǎn)類視黃質(zhì)的手段和方法。本發(fā)明還提供了編碼衍生自不同來源和分類群的存活生物體的所述新型β-胡蘿卜素雙加氧酶且設(shè)計適用于進(jìn)行本發(fā)明方法的DNA分子，及包含所述分子的質(zhì)?；蜉d體系統(tǒng)。另外，本發(fā)明提供了展示改良的營養(yǎng)品質(zhì)或生理狀況且包含上述DNA分子和/或使用本發(fā)明方法生成的轉(zhuǎn)基因細(xì)菌、酵母、真菌、昆蟲、動物、和植物細(xì)胞、種子、組織、和完整生物體。另外，本發(fā)明提供了展示針對β-diox II多肽的特異免疫反應(yīng)性且適用于診斷、治療、和篩選目的以及分離并純化所述多肽的抗體。最后，本發(fā)明提供了在基因療法領(lǐng)域使用依照本發(fā)明的DNA分子的手段和方法。
因而，本發(fā)明提供了切割β-胡蘿卜素的酶在本身不含類視黃質(zhì)的生物體(諸如植物材料、真菌、和細(xì)菌)中的從頭導(dǎo)入和表達(dá)，以及修飾現(xiàn)有的類視黃質(zhì)生物合成以調(diào)控某些目的類視黃質(zhì)的積累。另外，本發(fā)明提供了DNA探針和序列信息，使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠由其它來源(諸如本說明書全文中未公開的動物物種)克隆相應(yīng)基因和/或cDNA。
另外，本發(fā)明提供了包含基因產(chǎn)物或其功能活性片段作為活性成份的藥物制劑，以及簡單且合適的診斷測試系統(tǒng)以進(jìn)一步證明這些分子的功能性。
圖的簡述圖1顯示了動物中類視黃質(zhì)形成的主要步驟。以粗箭頭強(qiáng)調(diào)維生素A形成中的關(guān)鍵步驟；只顯示了類視黃質(zhì)的全-反式異構(gòu)體。
圖2顯示了生成并積累β-胡蘿卜素的大腸桿菌(大腸桿菌(+)菌株)中因表達(dá)黑腹果蠅β-胡蘿卜素雙加氧酶而引起的相對于對照(大腸桿菌(-)菌株)由黃色(β-胡蘿卜素)至幾乎白色(類視黃質(zhì))的顏色變化。
圖3給出了在用表達(dá)果蠅β-胡蘿卜素雙加氧酶cDNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的生成β-胡蘿卜素的大腸桿菌(大腸桿菌(+)菌株)中形成的類視黃質(zhì)相對于用載體對照(pBAD-TOPO)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(-)菌株的HPLC分析和光譜鑒定?？潭葪l指示360nm吸光度0.01。A.大腸桿菌(+)菌株(上線)和大腸桿茵(-)菌株(下線)的甲醛/氯仿提取物。B.由相應(yīng)視黃醛異構(gòu)體產(chǎn)生相應(yīng)肟(順式和反式)的羥胺/甲醇提取物。在上線中，真實(shí)標(biāo)準(zhǔn)物是分開的。在中線中顯示了大腸桿菌(+)菌株提取物的異構(gòu)組成。在下線中顯示了大腸桿菌(-)菌株提取物的HPLC圖譜。
圖4圖解了由大腸桿菌(+)菌株提取的主要物質(zhì)相對于真實(shí)標(biāo)準(zhǔn)物(點(diǎn)線)的吸收光譜(正己烷)。
圖5展示了β-diox-gex融合蛋白在不同條件下的酶活性。將融合蛋白β-diox-gex在不同條件下在含50mM Tricine/NaOH(pH7.6)和100mM NaCl的緩沖液中保溫。加入5μl β-胡蘿卜素(80μM，溶于乙醇)開始反應(yīng)。于30℃保溫2小、時后終止反應(yīng)并抽提。進(jìn)行HPLC分析并顯示360nm的HPLC圖譜?？潭葪l指示360nm吸光度0.005。A.在存在5μMFeSO4和10mM L-抗壞血酸時保溫；B.在不存在FeSO4/抗壞血酸時保溫；C.在存在10mM EDTA時保溫；D.在保溫前將融合蛋白于95℃保溫10分鐘。
圖6描述了來自黑腹果蠅的β-diox II的cDNA序列和推導(dǎo)氨基酸序列。
圖7是vp14(玉米)、RPE65(視網(wǎng)膜色素上皮，牛)、和β-dioxI(果蠅)的推導(dǎo)氨基酸序列的線性比對。以黑色指示同一性，以灰色指示依照PAM250矩陣的保守氨基酸。我們使用目視比對和程序比對?？梢栽诶绂?diox I序列的第549-570位找到高度保守區(qū)。迄今為止鑒定的所有β-diox同系物均享有這一共有基元，它是依照本發(fā)明的酶的特征。
圖8圖解了身體不同部分中β-diox I的mRNA水平。通過RT-PCR研究了β-diox mRNA的表達(dá)模式。只在頭部可檢測到β-diox mRNA。由衍生自成年果蠅(雌性和雄性)頭、胸、和腹部的總RNA制劑合成cDNA。使用一組跨越內(nèi)含子的引物研究相同RNA樣品中核糖體蛋白質(zhì)rp49(FLYBASE編號FBgn0002626)的mRNA水平作為對照。
圖9是哺乳動物β-胡蘿卜素/類視黃質(zhì)代謝的示意圖。實(shí)心箭頭指示通過對稱切割途徑形成維生素A?？梢詫⑿纬傻囊朁S醛進(jìn)一步代謝成視黃醇和視黃酯(貯存物)或者氧化成視黃酸。斷線箭頭指示通過不對稱切割β-胡蘿卜素而形成β-(8’，10’，12’)-阿樸胡蘿卜素醛。為了形成視黃酸，必需通過與脂肪酸β-氧化相似的機(jī)制縮短β-阿樸胡蘿卜素醛。
圖10是小鼠中兩類胡蘿卜素雙加氧酶的推導(dǎo)氨基酸序列的比較。小鼠β-diox I(小鼠-1)與小鼠β-diox II(小鼠-2)的推導(dǎo)氨基酸序列的線性比對。以黑色指示同一性，以灰色指示依照PAM250矩陣的保守氨基酸。以星號標(biāo)記可能涉及結(jié)合輔因子Fe2+的6個保守組氨酸殘基。
圖11顯示了對在β-diox II酶活性體外測試中形成的產(chǎn)物的分析。將表達(dá)β-diox II的大腸桿菌粗提物在存在β-胡蘿卜素時保溫2小時。然后提取形成的化合物并進(jìn)行HPLC分析。A.甲醛/氯仿提取物；B.羥胺/甲醇提取物。在存在甲醛/氯仿時提取之后，可以檢測到停留4.6分鐘的化合物；而在存在羥胺/氯仿時，它的停留時間變成了16分鐘。C.峰1的UV/VIS光譜；D.峰2的UV/VIS光譜。
圖12顯示了合成并積累β-胡蘿卜素和番茄紅素的大腸桿菌菌株在分別表達(dá)β-diox I或β-diox II之后的顏色。A.積累β-胡蘿卜素的大腸桿茵對照菌株；B.表達(dá)β-diox的積累β-胡蘿卜素的大腸桿茵菌株；C.表達(dá)β-diox II的積累β-胡蘿卜素的大腸桿菌菌株；D.表達(dá)β-diox II的積累番茄紅素的大腸桿菌菌株；E.積累番茄紅素的對照菌株。
圖13顯示了通過HPLC分析對大腸桿菌提取物檢測胡蘿卜素切割產(chǎn)物。生成β-胡蘿卜素的大腸桿菌菌株中形成的胡蘿卜素切割產(chǎn)物的HPLC分析。用羥胺/甲醇法(von Lintig J和Vogt K，J.Biol.Chem.，27511915-11920，2000)抽提細(xì)茵。A.表達(dá)β-diox I的大腸桿菌菌株提取物(上線)相對于對照菌株(下線)。圖中指示了所發(fā)現(xiàn)的類視黃質(zhì)的組成。B.表達(dá)β-diox II的大腸桿菌菌株提取物(上線)相對于對照菌株(下線)。能夠檢測到6種物質(zhì)，并根據(jù)它們的UV/VIS光譜分成兩種不同類型的化合物(第1類峰2、5、和6；第2類峰1、3、和4)。C.峰2的UV/VIS光譜作為第1類化合物的代表；D.峰4的UV/VIS光譜作為第2類化合物的代表。
圖14是果蠅(果蠅β-diox I，SEQ ID NO2)、小鼠-2(小家鼠(Mus musculus)，SEQ ID NO17)、人-2(人，SEQ ID NO21)、和斑馬魚-2(Danio rerio，SEQ ID NO19)的推導(dǎo)氨基酸序列的線性比對。以黑色指示同一性。箭頭指示與果蠅β-diox具有假設(shè)同源性的區(qū)域?？梢栽诶绂?diox序列的第549-570位找到高度保守區(qū)。迄今為止鑒定的所有β-diox同系物均享有這一共有基元，它是依照本發(fā)明的酶的特征。
圖15是后生動物多烯鏈雙加氧酶和植物VP14的系統(tǒng)樹計算。系統(tǒng)樹計算基于序列距離法并利用所有后生動物多烯鏈雙加氧酶和植物VP14推導(dǎo)氨基酸序列的鄰接(NJ)算法(Saito N和Nei M，Mol.Biol.Evol.，4406-425，1987)。通過生物體名稱后面的編號1和2來指示兩種不同類型的脊椎動物胡蘿卜素雙加氧酶。除了本文報導(dǎo)的序列，還使用了如下序列人-1(AAG15380)、小鼠-1(Redmond TM、GentlemanS、Duncan T、Yu S、Wiggert B、Gantt E、和Cunningham FX Jr.，J.Biol.Chem.，在線，2000)、RPE65人(XP001366)、RPE65牛(A47143)、果蠅(von Lintig J和Vogt K，J.Biol.Chem，27511915-11920，2000)、VP14(AAB62181)。
圖16展示了對小鼠不同組織中兩類胡蘿卜素雙加氧酶穩(wěn)定狀態(tài)mRNA水平的評估。通過RT-PCR分析小鼠多種組織中β-diox I、β-dioxII、和β-肌動蛋白的mRNA水平。將反應(yīng)產(chǎn)物上樣至TBE-瓊脂糖(1.2％)凝膠以進(jìn)行分析。用溴化乙啶將凝膠染色并顯示照片。對每份樣品在存在(+)和不存在(-)逆轉(zhuǎn)錄酶時進(jìn)行分析以證明PCR產(chǎn)物衍生自mRNA。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了具有特異切割β-胡蘿卜素和番茄紅素而分別形成β-阿樸胡蘿卜素醛和β-芷香酮及阿樸番茄紅素醛的生物學(xué)活性的分離新型β-胡蘿卜素雙加氧酶(β-diox II)多肽或其功能片段。依照本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，根據(jù)得自小鼠的序列信息，所述β-dioxII多肽或其功能片段包含選自下組的一種或多種氨基酸序列SEQ IDNO17的第29-47位、第96-118位、第361-368位、和第466-487位氨基酸序列，其中優(yōu)選第二項(xiàng)和第四項(xiàng)。對這些區(qū)域特別是SEQ IDNO17第96-118位和第466-487位所列區(qū)域特別感興趣是因?yàn)橐呀?jīng)證明它們在性質(zhì)上是高度保守的。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易的設(shè)計、合成、并使用衍生自SEQ ID NO16所列DNA序列且包含選自下組的一種或多種核酸序列的相應(yīng)核酸探針SEQ ID NO16的第115-141位、第286-354位、第1081-1104位、和第1396-1461位核酸序列，其中優(yōu)選第二項(xiàng)和第四項(xiàng)，作為合適篩選工具進(jìn)行表達(dá)分析或用于揭示具有上文所述酶活性因而為本發(fā)明所涵蓋的這種新型酶的其它成員。顯然，如圖14所述，這同樣適用于本文提供的同源β-diox II序列。例如，所述β-diox II多肽或其功能片段包含例如SEQ ID NO19(斑馬魚)的第55-63位、第112-134位、第378-385位、和第482-503位及SEQ ID NO21(人)的第59-67位、第116-138位、第385-392位、和第490-511位的一種或多種氨基酸序列，其中優(yōu)選相應(yīng)的第二項(xiàng)和第四項(xiàng)。因此，如上所述，可以容易的設(shè)計、合成、并使用衍生自SEQ ID NO18和/或20所列DNA序列且包含選自下組的一種或多種核酸序列的相應(yīng)核酸探針SEQ ID NO18的第191-217位、第362-430位、第378-385位和第482-503位及SEQ ID NO20的第175-201位、第346-414位、第1153-1176位、和第1468-1533位核酸序列，其中優(yōu)選相應(yīng)的第二項(xiàng)和第四項(xiàng)。依照本發(fā)明的原理，可以容易的鑒定并使用所有這些β-diox II同系物以及來自還有一些不同來源的其它同系物。
本發(fā)明部分基于基本上所有植物、真菌、和細(xì)菌本身不含類視黃質(zhì)的事實(shí)。雖然所有植物、有些真菌、和許多細(xì)菌能夠合成β-胡蘿卜素，但是它們通常不具有能夠?qū)ⅵ?胡蘿卜素切割成類視黃質(zhì)的酶。這些生物體因而可依照本發(fā)明用作β-胡蘿卜素的來源，從而在導(dǎo)入例如編碼II型β-胡蘿卜素雙加氧酶的cDNA后合成類視黃質(zhì)。另外，積累香葉基-香葉基-二磷酸(GGPP)但天然或因其它原因缺乏下游酶而基本上不生成β-胡蘿卜素的這些生物體也可用于本發(fā)明的內(nèi)容。β-胡蘿卜素的合成需要八氫番茄紅素合酶(psy)，它參與包含兩步反應(yīng)的第一個類胡蘿卜素特異反應(yīng)，導(dǎo)致兩分子GGPP頭頭縮合而形成第一種尚無顏色的胡蘿卜素產(chǎn)物八氫番茄紅素。另外，進(jìn)一步的酶促途徑必需另外三種植物酶的互補(bǔ)各自催化導(dǎo)入兩個雙鍵的八氫番茄紅素去飽和酶(PDS)和ζ-胡蘿卜素去飽和酶(ZDS)，以及番茄紅素β-環(huán)化酶。為了減少轉(zhuǎn)化工作，可以在本發(fā)明的-個優(yōu)選實(shí)施方案中使用能夠?qū)胪耆ワ柡托蛄兴枰乃兴膫€雙鍵并將八氫番茄紅素直接轉(zhuǎn)變成番茄紅素的細(xì)菌胡蘿卜素去飽和酶，諸如衍生自歐文氏茵的CrtI(參閱Xudong Ye等人，“Engineering the Proyitamin A(β-Carotene)Biosynthetic Pathway into(Carotenoid-Free)RiceEndosperm”(將維生素A原(β-胡蘿卜素)生物合成途徑導(dǎo)入(不含類胡蘿卜素的)稻胚乳)，Science，287303-305，2000)。例如，可以將能夠優(yōu)選表達(dá)植物八氫番茄紅素合酶(psy)(GenBank編號X78814)和細(xì)菌八氫番茄紅素去飽和酶(crtI)(GenBank編號D90087)二者的載體用于指導(dǎo)在例如通?；旧喜缓惡}卜素的質(zhì)體中形成番茄紅素。另外，可以容易的設(shè)計能夠表達(dá)番茄紅素β-環(huán)化酶(GenBank編號X98796)的第二種載體并用于共轉(zhuǎn)化。然而，正如轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)可以證明的，導(dǎo)入編碼所述番茄紅素β-環(huán)化酶的核酸序列可能并不是必不可少的，因?yàn)槭褂冒琾sy和crtI聯(lián)合表達(dá)盒的一次轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體顯示積累β-胡蘿卜素以及黃體素和玉米黃質(zhì)。為了使該途徑進(jìn)行至形成類視黃質(zhì)諸如視黃酸或維生素A及其衍生物，可以單獨(dú)導(dǎo)入編碼依照本發(fā)明的多肽或其功能片段的核酸序列，或者聯(lián)合任何上述其它酶一起導(dǎo)入。因而，本發(fā)明能夠在依照本發(fā)明適當(dāng)選擇的指定宿主中完全導(dǎo)入或補(bǔ)足類胡蘿卜素/類視黃質(zhì)途徑。
說明書全文中用于區(qū)分某些靶細(xì)胞或組織的術(shù)語“包含類胡蘿卜素”或“基本上不含類胡蘿卜素”指未依照本發(fā)明轉(zhuǎn)化的相應(yīng)植物或其它材料已知通?；旧喜缓惡}卜素，如貯存器官(諸如稻胚乳等)也是如此。不合類胡蘿卜素并不排除那些以幾乎檢測不到的量積累類胡蘿卜素的細(xì)胞或組織。優(yōu)選的是，該術(shù)語應(yīng)當(dāng)定義為具有類胡蘿卜素含量0.001％w/w或更低的質(zhì)體包含物質(zhì)。
關(guān)于選擇合適來源用于生成切割類胡蘿卜素的酶，應(yīng)當(dāng)理解，除了本文公開的來自果蠅的β-diox I及來自人(Homo sapiens)、小家鼠(Mus musculus)、和斑馬魚(Danio rerio)的β-diox II序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過例如常規(guī)篩選可以容易的找到、分離、并使用所有功能等同DNA分子及其片段，諸如關(guān)于SEQ ID NO1、16、18、和/或20所列序列的等位基因變體、同系、或合成修飾(人為的)的序列，來自現(xiàn)有生物體、編碼展示相同期望活性即將β-胡蘿卜素不對稱切割成類視黃質(zhì)的酶或其功能片段的序列，和與黑腹果蠅(SEQ ID NO1)、小家鼠(SEQ ID NO16)、Danio rerio(SEQ ID NO18)、和/或人(SEQ ID NO20)的部分或完整序列基本上同源的序列，例如用于保證具有期望生物學(xué)或酶活性即特異切割β-胡蘿卜素和番茄紅素而分別形成β-阿樸胡蘿卜素醛和β-芷香酮及阿樸番茄紅素醛的β-diox II多肽或其功能片段的表達(dá)，或用于測定所述多肽或其功能片段的特征性核酸的存在。例如，通過使用黑腹果蠅(SEQ ID NO1)的序列信息，可以通過本領(lǐng)域知道的且下文進(jìn)一步詳細(xì)描述的常規(guī)篩選流程鑒定來自人(SEQ ID NO20)、Danio rerio(SEQ ID NO18)、和小家鼠(SEQ ID NO16)的脊椎動物β-diox II同系物，它們也為本發(fā)明所涵蓋。
因而，這些DNA序列優(yōu)選選自下組(1)SEQ ID NO16和/或SEQ ID NO18和/或SEQ ID NO20中所列DNA序列或其互補(bǔ)鏈；和(2)SEQ ID NO16的第115-141位、第286-354位、第1081-1104位、和第1396-1461位DNA序列或其互補(bǔ)鏈；和(3)SEQ ID NO18的第191-217位、第362-430位、第1160-1183位、和第1472-1537位DNA序列或其互補(bǔ)鏈；和(4)SEQ ID NO20的第175-201位、第346-414位、第1153-1176位、和第1468-1533位DNA序列或其互補(bǔ)鏈；和(5)在高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與(1)、(2)、(3)、和(4)中所定義的DNA序列或其互補(bǔ)鏈發(fā)生雜交的DNA序列或其功能片段；和(6)若非遺傳密碼的簡并性將與(1)、(2)、(3)、(4)、和(5)中所定義的DNA序列發(fā)生雜交的DNA序列。
雜交嚴(yán)謹(jǐn)度指核酸雜合體表現(xiàn)穩(wěn)定的條件。這些條件對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是顯然的。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的，雜合體的穩(wěn)定性由雜合體的解鏈溫度(Tm)反映，序列同源性每降低1％，解鏈溫度降低大約1-1.5℃。雜合體的穩(wěn)定性通常是鈉離子濃度和溫度的函數(shù)。通常在較高嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行雜交反應(yīng)，隨后是不同嚴(yán)謹(jǐn)度的清洗。
在用于本文時，高嚴(yán)謹(jǐn)度指只允許在1M Na+中、于65-68℃形成穩(wěn)定雜合體的那些核酸序列發(fā)生雜交的條件。可以通過例如含6x SSC、5x Denhardt氏液、1％SDS(十二烷基磺酸鈉)、0.1M焦磷酸鈉、和0.1mg/ml變性鮭魚精DNA(作為非特異競爭劑)的水溶液中的雜交來提供高嚴(yán)謹(jǐn)條件。雜交后，可以在幾個步驟中進(jìn)行高嚴(yán)謹(jǐn)度的清洗，最后一次清洗(大約30分鐘)是于雜交溫度下、在0.2-0.1x SSC、0.1％SDS中進(jìn)行的。
中嚴(yán)謹(jǐn)度指相當(dāng)于在上述溶液中、但于大約60-62℃雜交的條件。在這種情況中，最后一次清洗是于雜交溫度下、在1x SSC、0.1％SDS中進(jìn)行的。
低嚴(yán)謹(jǐn)度指相當(dāng)于在上述溶液中、但于大約50-52℃雜交的條件。在這種情況中，最后一次清洗是于雜交溫度、在2x SSC、0.1％SDS中進(jìn)行的。
應(yīng)當(dāng)理解，可以使用多種緩沖液(如基于甲醛的緩沖液)和溫度來修改和重復(fù)這些條件。Denhardt氏液和SSC對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是眾所周知的，其它合適雜交緩沖液也如此(參閱例如Sambrook等人，《Molecular Cloning》(分子克隆)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989；或Ausubel等人編的《Current Protocols in Molecular Biology》(分子生物學(xué)通用方案)，John Wiley ＆ Sons公司，1990)。必須憑經(jīng)驗(yàn)確定最佳雜交條件，因?yàn)樘结樀拈L度和GC含量也有一定影響。
在本文中應(yīng)當(dāng)提到，術(shù)語與β-diox II編碼DNA序列“基本上同源的DNA序列”指編碼與SEQ ID NO17、19、和21中分別所列的小家鼠、Danio rerio、和/或人β-diox II氨基酸序列至少45％、優(yōu)選至少60％、更優(yōu)選至少75％、最優(yōu)選至少90％同一的氨基酸序列的DNA序列，和代表具有特異切割β-胡蘿卜素而形成β-阿樸胡蘿卜素醛的生物學(xué)活性和/或具有特異結(jié)合針對本發(fā)明多肽或其功能片段所制備的抗體的能力的多肽或其功能片段的DNA序列。
依照一個優(yōu)選實(shí)施方案，這些DNA序列是cDNA、基因組、或人造(合成)DNA序列的形式，而且可以如本領(lǐng)域所知道的(參閱例如Sambrook等人，同上)或下文具體所述進(jìn)行制備。
通過本文提供的指導(dǎo)，可以依照本領(lǐng)域眾所周知的方法獲得本發(fā)明的核酸。例如，可以通過化學(xué)合成、使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、或者通過篩選由認(rèn)定具有β-diox II或以可檢測水平表達(dá)β-diox II的來源構(gòu)建的基因組文庫或合適cDNA文庫而獲得本發(fā)明的DNA。
用于合成目的核酸的化學(xué)法在本領(lǐng)域是知道的，包括三酯、亞磷酸酯、亞磷酰胺、和H-磷酸酯方法，PCR和其它自身引物法，以及固相支持物上的寡核苷酸合成。若知道核酸的完整序列，或者可以獲得與編碼鏈互補(bǔ)的核酸序列，則可以使用這些方法。或者，若知道目標(biāo)氨基酸序列，則可以使用每種氨基酸殘基的已知和優(yōu)選編碼殘基來推斷可能的核酸序列。
用于分離β-diox II編碼基因的其它方法是如(Sambrook等人，第14章，1989)所述使用PCR技術(shù)。該方法需要使用能夠與β-diox II核酸發(fā)生雜交的寡核苷酸探針。下文描述了選擇寡核苷酸的策略。
用設(shè)計用于鑒定目的基因或其編碼的蛋白質(zhì)的探針或分析工具篩選文庫。對于cDNA表達(dá)文庫，合適方法包括識別并特異結(jié)合β-diox II的單克隆或多克隆抗體；長度為大約20-80個堿基、編碼來自相同或不同物種的已知或可疑β-diox II cDNA的寡核苷酸；和/或編碼相同或雜交基因的互補(bǔ)或同源cDNA或其片段。適用于篩選基因組DNA文庫的探針包括但不限于寡核苷酸、編碼相同或雜交DNA的cDNA或其片段、和/或同源基因組DNA或其片段。
可以通過在合適雜交條件下用探針即本文公開或提及的核酸(包括可衍生自SEQ ID NO1、16、18、和/或20中所列序列的寡核苷酸)篩選合適cDNA或基因組文庫來分離編碼β-diox II的核酸。合適文庫可以由商業(yè)途徑獲得，或者可以由例如細(xì)胞系、組織樣品、等等制備。
在用于本文時，探針指例如所具有的核苷酸序列所包含的10-50、優(yōu)選15-30、最優(yōu)選至少20個連續(xù)堿基與例如SEQ ID NO1、16、18、和/或20中所列的等同或更多數(shù)目的連續(xù)堿基相同(或互補(bǔ))的單鏈DNA或RNA。選擇作為探針的核酸序列的長度和確定性應(yīng)足以將假陽性結(jié)果降至最小。核苷酸序列可以基于上文所述β-diox II中保守或高度同源的核苷酸序列或區(qū)域。用作探針的核酸在一個或多個位置可以是簡并的。在不知道所篩選文庫的來源物種的偏愛密碼子用法時，簡并寡核苷酸的使用可能是特別重要的。
用于構(gòu)建探針的優(yōu)選區(qū)域包括5’和/或3’編碼序列、預(yù)測編碼配體結(jié)合位點(diǎn)的序列、等等。例如，本文公開的全長cDNA克隆或其片段可用作探針。優(yōu)選的是，用雜交后易于檢測的合適標(biāo)記物手段標(biāo)記本發(fā)明的核酸探針。例如合適標(biāo)記物手段是放射性標(biāo)記物。標(biāo)記DNA片段的優(yōu)選方法是在隨機(jī)引發(fā)反應(yīng)中用DNA聚合酶的Klenow片段摻入α32PdATP，正如本領(lǐng)域眾所周知的。通常用γ32P標(biāo)記的ATP和多核苷酸激酶末端標(biāo)記寡核苷酸。然而，也可以使用其它方法(如非放射性)來標(biāo)記寡核苷酸或片段，包括例如酶標(biāo)記、合適熒光團(tuán)的熒光標(biāo)記、和生物素化。
例如用包含基本上完整β-diox II編碼序列的DNA一部分或基于所述或等同DNA一部分的合適寡核苷酸篩選文庫之后，通過檢測雜交信號來鑒定陽性克隆；通過限制酶作圖和/或DNA序列分析來表征所鑒定的克隆；然后通過例如與本文所列序列的比較來進(jìn)行檢驗(yàn)，以確定它們是否包含編碼完整β-diox II的DNA序列(即它們是否包含轉(zhuǎn)錄起始和終止密碼子)。若所選擇克隆是不完整的，則可將它們用于再次篩選相同或不同文庫以獲得交疊克隆。若文庫是基因組文庫，則交疊克隆可能包含外顯子和內(nèi)含子。若文庫是cDNA文庫，則交疊克隆將包含開放讀碼框。在這兩種情況中，可以通過與本文提供的DNA和推導(dǎo)氨基酸序列的比較來鑒定完整克隆。
為了檢測內(nèi)源β-diox II的任何異常，可以使用本發(fā)明的核苷酸序列作為雜交探針進(jìn)行遺傳篩選。同樣，根據(jù)本文提供的核酸序列，可以設(shè)計反義或核酶型治療劑。
設(shè)想可以通過核苷酸替代、核苷酸刪除、核苷酸插入、或核苷酸片段的倒置及其任意聯(lián)合而容易的修飾本發(fā)明的核酸。這些突變體可用于例如生成具有與自然界中發(fā)現(xiàn)的β-diox II序列不同的氨基酸序列的β-diox II突變體。誘變可以是預(yù)先確定的(位點(diǎn)特異的)或隨機(jī)的。非沉默突變的突變不應(yīng)改變序列的讀碼框，而且優(yōu)選不產(chǎn)生可發(fā)生雜交而形成二級mRNA結(jié)構(gòu)(諸如環(huán)或發(fā)夾)的互補(bǔ)區(qū)。
另外，本發(fā)明設(shè)想并能夠使用本文提供的序列數(shù)據(jù)進(jìn)行親緣和功能基因組研究。親緣研究被作為測序和作圖的輔助活動進(jìn)行，并設(shè)計用于提供關(guān)于生物學(xué)功能(包括例如同源性搜索、二級結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)、差異cDNA篩選、表達(dá)克隆、遺傳連鎖分析、定位克隆、和誘變分析)的有趣且可能重要的線索。與親緣研究相反，功能研究通常使用細(xì)胞或動物來試圖了解序列與生物學(xué)功能的更直接關(guān)聯(lián)，包括例如篩選諸如酵母、果蠅、線粒體、人組織、小鼠、和蛙等系統(tǒng)中的表型變化，使用旨在控制基因表達(dá)或蛋白質(zhì)作用的基因“敲除”或其它方法以提供將序列與功能相聯(lián)系的有用信息。這些技術(shù)在本領(lǐng)域是眾所周知的。
上述方法的使用應(yīng)當(dāng)優(yōu)選達(dá)到一條或多條如下標(biāo)準(zhǔn)(1)對基因序列的抑制應(yīng)當(dāng)具有序列特異性，從而基本上消除假陽性結(jié)果；(2)應(yīng)當(dāng)具有廣泛的應(yīng)用性，即它應(yīng)當(dāng)有可能對高豐度和低豐度兩類基因，以及產(chǎn)物是胞內(nèi)、膜結(jié)合、或胞外的序列有效；(3)應(yīng)當(dāng)可應(yīng)用于預(yù)測目的(人)狀況的模型；(4)應(yīng)當(dāng)能夠進(jìn)行劑量-應(yīng)答研究以測定目標(biāo)最受影響的劑量；(5)目標(biāo)確認(rèn)研究所需要的信息量應(yīng)當(dāng)優(yōu)選最小的，即該技術(shù)能夠直接研究EST，而無需獲得全長基因序列、啟動子和其它調(diào)控信息、或蛋白質(zhì)序列/結(jié)構(gòu)的前提條件；(6)應(yīng)當(dāng)可用于高通量模式。
因此，本發(fā)明提供了應(yīng)用上述所有方法和技術(shù)(包括“敲除”、胞內(nèi)抗體、aptamer、反義寡核苷酸、和核酶)的足夠指導(dǎo)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，衍生自任何上述β-diox II序列(諸如SEQ IDNO1、16、18和/或20中所列序列)的β-diox II特異反義寡核苷酸可用于生物體發(fā)育任何階段的類視黃質(zhì)/維生素A缺陷相關(guān)模型中的劑量-應(yīng)答研究。在另-個優(yōu)選實(shí)施方案中，使用特別設(shè)計的核酶，以通過操作其作用機(jī)制固有的元件來進(jìn)行優(yōu)化后的序列特異抑制。例如，可以設(shè)計只結(jié)合它們的靶的核酶，并且通過選擇15個核苷酸(完全屬于典型ESR的信息限制之內(nèi))的靶序列，在統(tǒng)計學(xué)上確保靶序列在基因組中將只出現(xiàn)一次。因此，本發(fā)明一般性地提供了特別設(shè)計的核酶，只與它的靶(預(yù)計在基因組中只出現(xiàn)一次)相互作用，高度確保只抑制特定靶。更具體的說，本發(fā)明提供了獨(dú)特裝備的核酶，以進(jìn)行能夠證實(shí)特定mRNA靶的抑制是由β-diox II介導(dǎo)的狀況或表型的改變的真實(shí)起因的幾類重要控制。例如，已知將核酶的催化核心突變使之不能夠進(jìn)行切割但就高度特異結(jié)合它的靶而言仍發(fā)揮功能。這些“滅活”的核酶相對于有活性的核酶不產(chǎn)生或只產(chǎn)生基本上降低的靶向抑制-使之成為很有效的陰性對照?；蛘?，可以使催化核心維持活性形式，但是修飾靶向臂，使得它們不再結(jié)合靶序列。若發(fā)生非特異切割，則這種構(gòu)建物應(yīng)當(dāng)顯示活性。既然核酶包含不連續(xù)的結(jié)合臂，那么核酶兩個結(jié)合臂將分開結(jié)合，并在維持特異性的同時為核酶增加選擇性。由于這種不連續(xù)結(jié)合臂的結(jié)合強(qiáng)度相對低于例如連續(xù)反義結(jié)合，所以核酶與靶序列之間的任何錯配預(yù)計不能有效結(jié)合，從而使靶在切割前就脫落。
對于上文例示的方法和技術(shù)，可以使用完整序列及其(功能性)片段，特別是上文所述片段。
如果需要，可以依照確立流程使用衍生自β-diox II的探針由細(xì)胞或組織克隆編碼β-diox相關(guān)蛋白質(zhì)或多肽的核酸。具體而言，可以如下制備這些DNA1)由合適細(xì)胞或組織分離mRNA，例如通過DNA探針的雜交或者通過在合適表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)和期望多肽表達(dá)的篩選來選擇期望mRNA，制備與mRNA互補(bǔ)的單鏈cDNA并由此制備雙鏈cDNA，或2)例如使用DNA探針或者使用合適表達(dá)系統(tǒng)并篩選期望多肽的表達(dá)，由cDNA文庫分離cDNA并篩選期望cDNA，或3)將步驟1)或2)的雙鏈DNA摻入合適表達(dá)載體，4)用載體轉(zhuǎn)化合適宿主細(xì)胞并分離期望DNA。
通過已知方法分離聚腺苷酸化mRNA(步驟1)。分離方法包括例如在存在去污劑和核糖核酸酶抑制劑(例如肝素、異硫氰酸胍、或巰基乙醇)時將細(xì)胞勻漿，用氯仿/酚混合液抽提mRNA(任選存在鹽和緩沖液、去污劑、和/或陽離子螯合劑)，并用乙醇、異丙醇、等由剩余含鹽水相沉淀mRNA。通過氯化銫梯度離心及隨后的乙醇沉淀和/或?qū)游龇?例如親和層析，例如寡(dT)纖維素或寡(U)sepharose層析)，將分離的mRNA進(jìn)一步純化。優(yōu)選的是，通過梯度(例如線性蔗糖梯度)離心或合適大小分級分離柱(例如瓊脂糖凝膠)的層析將這些純化的mRNA依照大小分開。
通過用DNA探針直接篩選mRNA或者通過在合適細(xì)胞或無細(xì)胞系統(tǒng)中翻譯并篩選獲得的多肽來選擇期望mRNA。優(yōu)選使用DNA雜交探針來實(shí)現(xiàn)期望mRNA的選擇，由此避免翻譯的額外步驟。合適DNA探針是核苷酸序列已知、由編碼β-diox II或相關(guān)蛋白質(zhì)的DNA衍生的至少17個核苷酸組成的DNA。或者，可以使用EST序列信息來生成合適DNA探針。
合成DNA探針是依照下文詳述的已知方法合成的，優(yōu)選使用固相磷酸三酯、亞磷酸三酯、或亞磷酰胺方法的逐步縮合，例如通過磷酸三酯法縮合二核苷酸偶聯(lián)單位。如(Ike Y等人，Nucleic Acids Research，11477，1983)所述，通過在適當(dāng)縮合步驟中使用受保護(hù)形式的兩種、三種、或四種核苷酸dA、dC、dG、和/或dT的混合物或相應(yīng)二核苷酸偶聯(lián)單位，使這些方法適用于合成期望寡核苷酸的混合物。
為了雜交，標(biāo)記DNA探針，例如通過眾所周知的激酶反應(yīng)進(jìn)行放射性標(biāo)記。依照已知流程進(jìn)行大小分離后的mRNA與含標(biāo)記物的DNA探針的雜交，即在含添加劑(例如鈣螯合劑、粘度調(diào)節(jié)化合物、蛋白質(zhì)、無關(guān)DNA、等)的緩沖液和鹽溶液中、于有利于選擇性雜交的溫度(例如0-80℃，例如25-50℃或65℃左右，優(yōu)選比雜交雙鏈DNA解鏈溫度低20℃左右)進(jìn)行雜交。
可以在細(xì)胞(例如蛙卵母細(xì)胞)或無細(xì)胞系統(tǒng)(例如網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物或麥胚提取物)中翻譯分級分離后的mRNA。對獲得的多肽篩選β-diox II活性或與針對β-diox II或其相關(guān)蛋白質(zhì)制備的抗體的反應(yīng)(例如在免疫測定法中，例如放射性免疫測定法、酶免疫測定法、或熒光標(biāo)記物免疫測定法)。這些免疫測定法及多克隆和單克隆抗體的制備在本領(lǐng)域是眾所周知的并相應(yīng)應(yīng)用。依照本發(fā)明，提供了多克隆抗體。
由選擇的mRNA模板制備單鏈cDNA在本領(lǐng)域是眾所周知的，由單鏈DNA制備雙鏈DNA也一樣。將mRNA模板與脫氧核苷三磷酸(任選放射性標(biāo)記的脫氧核苷三磷酸，從而能夠篩選反應(yīng)結(jié)果)、引物序列(諸如能夠與mRNA的聚(A)尾發(fā)生雜交的寡dT殘基)、和合適酶(諸如逆轉(zhuǎn)錄酶，例如來自鳥類成髓細(xì)胞性白血病病毒(AMV))的混合液一起保溫。例如通過堿性水解降解模板mRNA之后，將cDNA與脫氧核苷三磷酸和合適酶的混合液一起保溫，以產(chǎn)生雙鏈DNA。合適的酶是例如逆轉(zhuǎn)錄酶、大腸桿茵DNA聚合酶I的Klenow片段、或T4 DNA聚合酶。通常，由單鏈cDNA自發(fā)形成的發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)作為合成第二條鏈的引物。通過S1核酸酶的消化除去該發(fā)夾結(jié)構(gòu)?；蛘?，在水解mRNA模板之前首先通過均聚脫氧核苷酸尾延伸單鏈DNA的3’端，隨后合成第二條cDNA鏈。
或者，由cDNA文庫分離雙鏈DNA并篩選期望cDNA(步驟2)。cDNA文庫是如下構(gòu)建的如上所述由合適細(xì)胞(例如雞胚細(xì)胞、人單核白細(xì)胞、或人胚肺上皮細(xì)胞)分離mRNA并由此制備單鏈和雙鏈cDNA。遵循確立流程用合適限制性內(nèi)切核酸酶消化該cDNA并摻入λ噬茵體(例如λcharon4A或λgt11)。如上所述使用DNA探針篩選復(fù)制在硝酸纖維素膜上的cDNA文庫，或者在合適表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)并對獲得的多肽篩選與針對期望β-diox II的特異抗體的反應(yīng)。
本領(lǐng)域知道多種方法可以將雙鏈DNA摻入適當(dāng)載體(步驟3)。例如，可以通過在存在相應(yīng)脫氧核苷三磷酸和酶(諸如末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶)時的保溫而向雙鏈DNA和載體DNA添加互補(bǔ)均聚物。然后通過互補(bǔ)均聚尾之間的堿基配對將載體和雙鏈DNA連接到一起，最后通過特定連接酶(諸如連接酶)進(jìn)行連接。其它可能性是向雙鏈DNA的末端添加合成接頭，或者通過平端或粘端連接將雙鏈DNA摻入載體。
用獲得的雜合載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)宿主細(xì)胞(步驟4)和選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(步驟5)在本領(lǐng)域是眾所周知的。雜合載體和宿主細(xì)胞可能特別適用于生成DNA或生成期望的β-diox II。
除了可用于生成重組β-diox II蛋白質(zhì)，這些核酸還可用作探針，從而使本領(lǐng)域技術(shù)人員易于鑒定和/或分離編碼β-diox II的核酸。核酸可以是未標(biāo)記的，或者已用可檢測模塊標(biāo)記。另外，依照本發(fā)明的核酸可用于例如測定β-diox II特異核酸的存在甚至數(shù)量的方法，所述方法包括將β-diox II的編碼(或互補(bǔ))DNA(或RNA)與待測樣品核酸進(jìn)行雜交，并測定β-diox II的存在和(任選的)數(shù)量。另一方面，本發(fā)明提供了與編碼β-diox II的核酸序列互補(bǔ)或在嚴(yán)謹(jǐn)條件下發(fā)生雜交的核酸序列。這些寡核苷酸可有效用于反義和/或核酶方法，包括基因療法。
本發(fā)明還提供了用于擴(kuò)增核酸待測樣品的方法，包括用β-dioxII的編碼(或互補(bǔ))核酸(DNA或RNA)引發(fā)核酸聚合酶(鏈?zhǔn)?反應(yīng)。
因此，本發(fā)明的DNA序列可作為標(biāo)準(zhǔn)，確定用于由其它來源克隆基本上同源的DNA序列的新PCR引物。另外，可以通過本領(lǐng)域知道的、例如Sambrook等人(同上)描述的方法將它們和這些同源DNA序列整合到載體中，從而在適當(dāng)宿主系統(tǒng)中表達(dá)或過度表達(dá)編碼的多肽。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，DNA序列自身也可用于轉(zhuǎn)化本發(fā)明的合適宿主系統(tǒng)以獲得所編碼多肽的過度表達(dá)。
如上所述，本發(fā)明由此提供了特異DNA分子，以及包含所述DNA分子的質(zhì)粒或載體系統(tǒng)，它們在可操作表達(dá)盒內(nèi)包含能夠指導(dǎo)在功能上有活性(即指導(dǎo)由β-胡蘿卜素生成類視黃質(zhì))的β-胡蘿卜素雙加氧酶II生成的DNA序列。優(yōu)選的是，所述DNA分子還包含至少一種選擇標(biāo)記基因或cDNA，它可操作連接允許其在細(xì)菌、酵母、真菌、昆蟲、動物、或植物細(xì)胞、種子、組織、或完整生物體中表達(dá)的組成性、誘導(dǎo)性、或組織特異性啟動子序列。若選擇含質(zhì)體材料進(jìn)行轉(zhuǎn)化，則優(yōu)選將編碼核苷酸序列融合合適質(zhì)體運(yùn)輸肽編碼序列，二者都優(yōu)選在組織特異性或組成性啟動子的控制下表達(dá)。
依照本發(fā)明的多肽包括β-diox II及其衍生物，所述衍生物保留了β-diox II的至少一種共有結(jié)構(gòu)決定簇。
“共有結(jié)構(gòu)決定簇”指研究的衍生物具有β-diox II的至少一種結(jié)構(gòu)特征。結(jié)構(gòu)特征包括具有能夠與針對天然發(fā)生的或變性的β-dioxII多肽或其片段制備的抗體發(fā)生交叉反應(yīng)的表位或抗原性位點(diǎn)、具有與β-diox II的氨基酸序列同一性、和具有共有的結(jié)構(gòu)/功能關(guān)聯(lián)。因而，由本發(fā)明提供的β-diox II包括由初級轉(zhuǎn)錄本的其它剪接產(chǎn)生的mRNA編碼的剪接變體、氨基酸突變體、糖基化變體、和保留了β-dioxII的生理學(xué)和/或物理學(xué)特性的其它β-diox II共價衍生物。例示性衍生物包括通過替代、化學(xué)、酶促、或其它適當(dāng)手段用非天然發(fā)生氨基酸的模塊共價修飾本發(fā)明蛋白質(zhì)獲得的分子。這種模塊可以是可檢測模塊，諸如酶或放射性同位素。還包括由特定物種(優(yōu)選哺乳動物)發(fā)現(xiàn)的β-diox II天然發(fā)生變體或同系物。這種變體或同系物可能是由相同基因家族的相關(guān)基因、特定基因的等位基因變體編碼的，或者代表β-diox II基因的其它方式剪接的變體。
保留共有結(jié)構(gòu)特征的衍生物可以是β-diox II的片段。β-diox II的片段包括它的單個結(jié)構(gòu)域，以及衍生自結(jié)構(gòu)域的更小多肽。優(yōu)選的是，衍生自依照本發(fā)明的β-diox II的更小多肽確定了β-diox II的一個特征性特征即可。在理論上，片段可以是幾乎任何大小，只要它們保留β-diox II的一個特征即可。優(yōu)選的是，片段的長度是5-200個氨基酸。將較長的片段看作全長β-diox II的截短型，通常為術(shù)語“β-diox II”所涵蓋。β-diox II多肽的例示性片段分別是SEQ ID NO17的第39-47位、第96-118位、第361-368位、和第466-487位，SEQID NO19的第55-63位、第112-134位、第378-385位、和第482-503位，SEQ ID NO21的第59-67位、第116-138位、第385-392位、和第490-511位氨基酸序列。
β-diox II的衍生物還包括它們的突變體，可以包含氨基酸刪除、添加、或替代，只要滿足維持β-diox II的至少一個特征性特征的要求即可。因而，可以進(jìn)行保守氨基酸替代而基本上不改變β-diox II的本性，5’或3’端截短的形式也一樣。此外，可以對本發(fā)明所包括的β-diox II片段進(jìn)行刪除和替代?？梢杂删幋aβ-diox II的DNA生成β-diox II突變體，即對所述DNA進(jìn)行體外誘變，導(dǎo)致例如一個或多個氨基酸的添加、交換、和/或刪除。例如，可以通過重組方法制備β-dioxII的替代、刪除、或插入變體，并篩選與天然形式β-diox II的免疫交叉反應(yīng)性。
本發(fā)明還提供了β-diox II多肽及其衍生物，所述衍生物保留了β-diox II的至少一種共有抗原決定簇。
“共有抗原性決定簇”指研究的衍生物具有β-diox II的至少一種抗原性功能?？乖怨δ馨ň哂心軌蚺c針對天然發(fā)生的或變性的β-diox II多肽或其片段制備的抗體發(fā)生交叉反應(yīng)的表位或抗原性位點(diǎn)。
保留共有抗原性決定簇的衍生物可以是β-diox II的片段。β-diox II的片段包括它的單個結(jié)構(gòu)域，以及衍生自結(jié)構(gòu)域的更小多肽。優(yōu)選的是，衍生自依照本發(fā)明的β-diox II的更小多肽確定了β-dioxII的一個特征性表位。在理論上，片段可以是幾乎任何大小，只要它們保留β-diox II的一個特征即可。優(yōu)選的是，片段的長度是5-500個氨基酸。將較長的片段看作全長β-diox II的截短型，通常為術(shù)語“β-diox II”所涵蓋。
本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)β-diox II多肽的方法，包括(1)在合適宿主中表達(dá)由上文所述DNA編碼的多肽，并(2)依照本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)技術(shù)分離所述β-diox II多肽。另外，提供了通過上述過程獲得或可獲得的蛋白質(zhì)。
優(yōu)選的是，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其衍生物是以分離形式提供的。“分離的”指蛋白質(zhì)或其衍生物經(jīng)鑒定不含其天然環(huán)境中的一種或多種成份。分離的β-diox II包括重組細(xì)胞培養(yǎng)物中的β-diox II。表達(dá)重組β-diox II基因的生物體中存在的β-diox II，無論β-diox II蛋白質(zhì)是分離的”或其它形式的，都包括于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
如果需要，在任何所述系統(tǒng)(細(xì)菌、真菌、植物、動物、等)中形成的類視黃質(zhì)(諸如β-阿樸胡蘿卜素醛、β-芷香酮、和阿樸番茄紅素醛)可以進(jìn)一步代謝成視黃醇、視黃酯、視黃酸、及其相應(yīng)立體異構(gòu)體。那些修飾可用于改進(jìn)切割反應(yīng)的效率和/或積累期望的類視黃質(zhì)。特定類視黃質(zhì)的積累可能是有用的，因?yàn)轭愐朁S質(zhì)根據(jù)其氧化狀態(tài)(醇、醛、和酸)和立體異構(gòu)形式而發(fā)揮不同生物學(xué)功能，例如視黃醛/視黃醇在視覺中的功能，視黃酸在發(fā)育過程和分化中的功能，而視黃酯是動物體內(nèi)維生素A的正常貯存物?？梢酝ㄟ^類視黃質(zhì)修飾酶與β-diox II的共表達(dá)來實(shí)現(xiàn)期望類視黃質(zhì)衍生物的積累。通過那些功能聯(lián)合，例如可以在作為飼料、食品、和/或飼料和食品添加劑的植物和/或細(xì)菌中實(shí)現(xiàn)視黃酯的積累，或者可以實(shí)現(xiàn)特定類視黃質(zhì)(例如9-順式視黃酸，即RXR轉(zhuǎn)錄因子的配體)的生物合成。另外，動物起源的類視黃質(zhì)結(jié)合蛋白的共表達(dá)可以改進(jìn)期望類視黃質(zhì)的產(chǎn)量。
依照本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，將下列酶或酶組合與β-dioxII一起共表達(dá)。例如，若希望將視黃醛轉(zhuǎn)變成視黃醇，可以使用醇脫氫酶(如AF059256)和/或視黃醛脫氫酶/還原酶(如AW211228)。在意欲由視黃醇生成視黃酯的情況中，可以使用視黃醇酰基轉(zhuǎn)移酶(如AF071510)。若應(yīng)當(dāng)由視黃醛生成視黃酸，則將選擇視黃醛氧化酶(如AB017482)。另外，若希望共表達(dá)類視黃質(zhì)結(jié)合蛋白，則可設(shè)想選擇視黃醇結(jié)合蛋白(如AJ236884)。最后，可以共表達(dá)將上述化合物的全-反式結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成13-順式、11-順式、9-順式、或-順式異構(gòu)體的不同異構(gòu)酶。
依照本發(fā)明，提供了轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、種子、組織、或完整植株以及用于轉(zhuǎn)化微生物(諸如酵母、真菌、和細(xì)菌)以生成能夠介導(dǎo)類視黃質(zhì)合成的轉(zhuǎn)化體的手段和方法。依照本發(fā)明的另一方面，所述方法還可用于修飾動物中的類視黃質(zhì)代謝。
選擇用于轉(zhuǎn)化的宿主材料應(yīng)當(dāng)表達(dá)導(dǎo)入的基因，而且它們的表達(dá)優(yōu)選是純合的。通常，基因?qū)⒖刹僮鬟B接在特定植物、昆蟲、動物、或微生物(諸如包括酵母在內(nèi)的真菌和細(xì)菌)的靶向宿主細(xì)胞中在功能上有活性的啟動子。其表達(dá)水平應(yīng)當(dāng)足以獲得期望來自該基因的特征。例如，選擇標(biāo)記基因的表達(dá)應(yīng)當(dāng)提供對依照本發(fā)明方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體的適當(dāng)選擇。相似的，展示將β-胡蘿卜素切割成類胡蘿卜素/類視黃質(zhì)的期望活性、用于增強(qiáng)營養(yǎng)品質(zhì)的酶的編碼基因的表達(dá)應(yīng)當(dāng)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化體相對于未進(jìn)行本發(fā)明轉(zhuǎn)化方法的相同物種具有相對較高含量的所編碼基因產(chǎn)物。另一方面，通常希望限制目的基因的過度表達(dá)以避免顯著不利的影響植物、昆蟲、真菌、動物、或微生物的正常生理，即其表達(dá)程度不至于使得它們的培養(yǎng)變得困難。
可以在用于在轉(zhuǎn)化的原核或真核宿主細(xì)胞、種子、組織、或完整生物體中表達(dá)的表達(dá)盒中使用編碼β-胡蘿卜素雙加氧酶的基因。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，即在目的靶宿主中導(dǎo)入切割β-胡蘿卜素而形成類視黃質(zhì)的能力，優(yōu)選使用包含轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(與編碼β-胡蘿卜素雙加氧酶II的基因相連)的可操作表達(dá)盒進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
轉(zhuǎn)錄起始區(qū)對宿主而言可以是天然或類似的，或者是外源或異源的。外源指在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)所導(dǎo)入的野生型宿主中未曾發(fā)現(xiàn)有該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。
在植物材料中，對與貯存蛋白(諸如谷蛋白、patatin、napin、cruciferin、β-conglycinin、菜豆蛋白、等)有關(guān)的那些轉(zhuǎn)錄起始區(qū)特別感興趣。
轉(zhuǎn)錄盒將包含(以轉(zhuǎn)錄的5’-3’方向)轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)、編碼β-胡蘿卜素雙加氧酶II或其功能片段(保留其特異的酶促、免疫原性、或生物學(xué)活性)的DNA序列、及在靶向宿主材料(諸如植物或微生物)中有功能的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)。終止區(qū)可以是相對于轉(zhuǎn)錄起始區(qū)是天然的，可以是相對于目的DNA序列是天然的，或者可以衍生自其它來源。可以由根癌土壤桿菌的Ti質(zhì)粒獲得適用于植物材料的合適終止區(qū)，諸如章魚堿合酶和胭脂堿合酶終止區(qū)(參閱Guerineau等人，Mol.Gen.Genet.，262141-144，1991；Proudfeot，Cell，64671-674，1991；Sanfacon等人，Genes Dev.，5141-149，1991；Mogen等人，Plant Cell，21261-1272，1990；Munroe等人，Gene，91151-158，1990；Ballas等人，Nucl.Acids Res.，177891-7903，1989；Joshi等人，Nucl.Acids Res.，159627-9639，1987)。
為了在植物或含質(zhì)體材料中表達(dá)β-胡蘿卜素雙加氧酶II，優(yōu)選將編碼序列融合編碼運(yùn)輸肽的序列，它在表達(dá)和翻譯后指導(dǎo)將切除運(yùn)輸肽的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至發(fā)生類胡蘿卜素生物合成的(植物)質(zhì)體，諸如葉綠體。例如，可以在翻譯水平將β-diox II cDNA融合編碼核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(核糖體二磷酸羧化酶-加氧酶)小亞基運(yùn)輸肽的序列或編碼其它質(zhì)體蛋白運(yùn)輸肽的序列。這些運(yùn)輸肽在本領(lǐng)域是知道的(參閱例如Von Heijne等人，Plant Mol.Biol.Rep.，9104-126，1991；Clark等人，J.Biol.Chem.，26417544-17550，1989；Della-Cioppa等人，Plant Physiol.，84965-968，1987；Romer等人，Biochim.Biophys.Res.Commun.，1961414-1421，1993；和Shah等人，Science，233478-481，1986)?？捎糜谶M(jìn)行本發(fā)明的任何基因可以利用天然或異源運(yùn)輸肽。
構(gòu)建物還可包含任何其它必需調(diào)節(jié)基因，諸如植物翻譯共有序列(Joshi，1987，同上)、內(nèi)含子(Luehrsen和Walbot，Mol.Gen.Genet.，22581-93，1991)、等，它們可操作連接編碼β-胡蘿卜素雙加氧酶II的核苷酸序列。希望導(dǎo)入的編碼基因內(nèi)的內(nèi)含子序列可以通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄本并使之有效轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核外而提高表達(dá)水平。在已知的這些內(nèi)含子序列中包括植物遍在蛋白基因的內(nèi)含子(Cornejo，Plant Mol.Biol.，23567-581，1993)。另外，已經(jīng)觀察到將相同構(gòu)建物插入基因組的不同基因座可以改變植物中的表達(dá)水平。據(jù)認(rèn)為這種影響部分由于基因在染色體上的位置所致，即不同隔離群將具有不同的表達(dá)水平(參閱例如Hoever等人，Transgenic Res.，3159-166，1994)。可用于構(gòu)建表達(dá)盒的其它調(diào)控DNA序列包括例如能夠調(diào)控(誘導(dǎo)或遏制)相連DNA序列在植物組織中的轉(zhuǎn)錄的序列。
已知例如某些植物基因受到多種內(nèi)部或外部因素的誘導(dǎo)，諸如植物激素、熱休克、化學(xué)藥品、病原體、缺氧、光、應(yīng)激、等。
另一組可被調(diào)控的DNA序列包括存在于煙草PR(發(fā)病相關(guān))蛋白基因中且由化學(xué)調(diào)節(jié)劑(諸如EP-A 0 332 104中所述)方式誘導(dǎo)的化學(xué)驅(qū)動序列。
在植物、動物、昆蟲、真菌、或微生物中表達(dá)外源基因的另一個考慮事項(xiàng)是轉(zhuǎn)基因基因組的穩(wěn)定水平，即外源基因由群體分離的趨向。若將選擇標(biāo)記與目的基因或表達(dá)盒連接，則可以施加選擇以維持轉(zhuǎn)基因宿主生物體或其部分。
在表達(dá)盒構(gòu)建物中包含5’前導(dǎo)序列可能是有利的。這些前導(dǎo)序列可以增強(qiáng)翻譯。翻譯前導(dǎo)序列在本領(lǐng)域是知道的，包括微小RNA病毒前導(dǎo)序列，例如EMCV前導(dǎo)序列(腦心肌炎病毒5’非編碼區(qū)；Elroy-Stein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，866126-6130，1989)；馬鈴薯Y病毒組，例如TEV前導(dǎo)序列(煙草蝕刻病毒；Allisson等人，Virology，1549-20，1986)；人免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BiP；Macejak和Sarnow，Nature，35390-94，1991)；來自苜?；ㄈ~病毒外殼蛋白mRNA的非翻譯前導(dǎo)序列(AMV RNA 4；Jobling和Gehrke，Nature，325622-625，1987)；煙草花葉病毒前導(dǎo)序列(TMV；Gallie等人，Molecular Biology of RNA，237-256，1989)；和玉米褪綠斑駁病毒前導(dǎo)序列(MCMV；Lommel等人，Virology，81382-385，1991；Della-Cioppa等人，1987，同上)。
根據(jù)在哪里表達(dá)編碼β-胡蘿卜素雙加氧酶II的DNA序列，可能希望合成具有宿主偏愛密碼子或者葉綠體或質(zhì)體偏愛密碼子的序列。可以由具體目的植物物種中最大表達(dá)量的蛋白質(zhì)中的最高頻率密碼子確定植物偏愛密碼子(參閱EP-A 0 359 472；EP-A 0 386 962；W0 91/16432；Perlak等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88324-3328，1991；和Murray等人，Nucl.Acids Res.，17477-498，1989)。這樣，可以優(yōu)化核苷酸序列用于在任何靶向宿主中表達(dá)。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，可以優(yōu)化或合成基因序列的所有或任何部分。即也可以使用合成或部分優(yōu)化的序列。關(guān)于葉綠體偏愛基因的構(gòu)建，參閱USPN 5,545,817。
編碼β-diox II的表達(dá)系統(tǒng)可用于研究β-diox II活性，特別是在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、組織、或動物中。優(yōu)選已經(jīng)削弱了β-diox II表達(dá)的系統(tǒng)，特別是通過轉(zhuǎn)座子插入手段來實(shí)現(xiàn)這種削弱的系統(tǒng)。依照本發(fā)明的突變細(xì)胞、組織、或動物其β-diox II表達(dá)受損。尤其是那些表達(dá)嚴(yán)重削弱但不受限制的表達(dá)突變體可用于研究β-diox II活性。它們顯示對推定上游信號劑與β-diox II特定靶結(jié)構(gòu)域的受調(diào)相互作用以及對預(yù)測介導(dǎo)其生物學(xué)應(yīng)答的下游靶的修飾的敏感性增加。因此，本發(fā)明還提供了用于評估試劑靶向β-diox II活性的能力的方法，包括將本文所述β-diox II突變體暴露于該試劑，并判斷對β-diox II生物學(xué)活性的影響。
在制備轉(zhuǎn)錄盒時，可以操作多種DNA片段以提供處于正確取向和正確讀碼框的DNA序列。為此目的，可以采用銜接頭或接頭來連接DNA片段，或者可以包括其它操作以提供方便的限制性位點(diǎn)、除去多余DNA、除去限制性位點(diǎn)、等。為此目的，可以采用體外誘變、引物修復(fù)、限制性消化、退火、切除、連接、等，其中可能涉及插入、刪除、或替代(如轉(zhuǎn)換和顛換)。
可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法將攜帶編碼天然或突變β-胡蘿卜素雙加氧酶的cDNA或基因組DNA的表達(dá)盒置于表達(dá)載體中。在用于本文時，載體(或質(zhì)粒)指用于將異源DNA導(dǎo)入細(xì)胞以進(jìn)行表達(dá)或復(fù)制的離散元件。這些載體的選擇和使用完全屬于本領(lǐng)域技術(shù)范圍之內(nèi)?？梢垣@得許多載體，而且適當(dāng)載體的選擇將依賴于載體的意欲用途(即它是用于DNA擴(kuò)增還是用于DNA表達(dá))、將插入載體的DNA的大小、將用載體轉(zhuǎn)化的宿主的類型(植物、動物、昆蟲、真菌、或微生物)、和將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法。根據(jù)其功能(DNA擴(kuò)增或DNA表達(dá))和相容宿主細(xì)胞，每種載體都包含多種元件。典型表達(dá)載體通常包含但不限于編碼細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)和抗生素抗性基因的原核DNA元件，提供表達(dá)載體在細(xì)菌宿主中的生長和選擇；克隆位點(diǎn)，用于插入外源DNA序列，在本文中是編碼能夠切割β-胡蘿卜素而形成類胡蘿卜素/類視黃質(zhì)的酶的DNA序列；控制外源基因轉(zhuǎn)錄起始的真核DNA元件，諸如啟動子；和控制轉(zhuǎn)錄本加工的DNA元件，諸如轉(zhuǎn)錄終止/聚腺苷酸化序列。它還可包含最終將載體整合到靶向宿主染色體中所需要的序列。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)載體還包含編碼選擇標(biāo)記的基因(在功能上連接啟動子)，諸如潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(van den Elzen等人，Plant Mol.Biol.，5299-392，1985)。賦予抗生素抗性因而適合于作為選擇標(biāo)記的基因的其它范例包括新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(Velten等人，EMBO.J.，32723-2730，1984)；衍生自Tn5的卡那霉素抗性(NPT II)基因(Bevan等人，Nature，304184-187，1983)；PAT基因(Thompson等人，EMBO J.，62519-2523，1987)；和氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶基因。關(guān)于適用于本發(fā)明的植物表達(dá)載體和選擇標(biāo)記基因的一般描述參閱Gruber等人，《Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology》(植物分子生物學(xué)和生物技術(shù)的方法)，第89-119頁，CRC出版社，1993。至于適用于酵母的選擇標(biāo)記，可以使用因標(biāo)記基因的表型表達(dá)而便于選擇轉(zhuǎn)化體的任何標(biāo)記基因。適用于酵母的標(biāo)記是例如賦予抗生素G418、潮霉素、或博來霉素抗性的基因，或者在營養(yǎng)缺陷型酵母突變體中提供原養(yǎng)型的基因(例如URA3、LEU2、LYS2、TRP1、或HIS3基因)。
適用于哺乳動物細(xì)胞的選擇標(biāo)記是能夠鑒定有能力攝取β-diox核酸的細(xì)胞的基因，諸如二氫葉酸還原酶(DHFR，氨甲蝶呤抗性)、胸苷激酶，或者賦予G418或潮霉素抗性的基因。將哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)化體置于只有已經(jīng)攝取并表達(dá)標(biāo)記的轉(zhuǎn)化體唯一適合于存活的選擇壓力下。在以DHFR或谷氨酰胺合酶(GS)作為標(biāo)記的情況中，可以通過在逐漸提高壓力的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體來施加選擇壓力，由此導(dǎo)致選擇基因和編碼β-diox II的相連DNA二者的擴(kuò)增(在其染色體整合位點(diǎn))。擴(kuò)增指生成生長所必需的蛋白質(zhì)更加需要的基因與編碼期望蛋白質(zhì)的密切相連基因在重組細(xì)胞染色體內(nèi)重復(fù)串聯(lián)的過程。期望蛋白質(zhì)的增量通常是由因此擴(kuò)增的DNA合成的。
用于分別控制目的基因和標(biāo)記基因的表達(dá)的啟動子元件可以是任何植物相容啟動子。它們可以是植物基因啟動子，諸如核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(核糖體二磷酸羧化酶-加氧酶)小亞基的啟動子或來自根癌土壤桿菌腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒的啟動子，像胭脂堿合酶和章魚堿合酶啟動子；或者是病毒啟動子，諸如花椰菜花葉病毒(CaMV)19S和35S啟動子或玄參花葉病毒35S啟動子。關(guān)于適用于本發(fā)明的已知植物啟動子的回顧，參閱例如國際申請WO 91/19806。
“組織特異性”啟動子提供期望基因產(chǎn)物在表達(dá)類胡蘿卜素或葉黃素生物合成途徑產(chǎn)物的組織中特別高的積累；盡管在植物的其它部分也可以發(fā)生一些表達(dá)。已知的組織特異性啟動子的范例包括谷蛋白1啟動子(Kim等人，Plant Cell Physiol.，34595-603，1993；Okita等人，J.Biol.Chem.，26412573-12581，1989；Zheng等人，PlantH.，4357-366，1993)、針對塊莖的I型patatin啟動子(Bevan等人，Nucl.Acids Res.，144625-4638，1986)；與馬鈴著塊莖ADPGPP基因相連的啟動子(Muller等人，Mol.Gen.Genet.，224136-146，1990)；β-conglycinin(也稱為7S蛋白質(zhì)，驅(qū)動種子定向轉(zhuǎn)錄)的大豆啟動子(Bray，Planta，172364-370，1987)；和來自玉米胚乳玉米蛋白基因的種子定向啟動子(Pedersen等人，Cell，291015-1026，1982)?？捎糜诒景l(fā)明的另一類啟動子是植物遍在蛋白啟動子。植物遍在蛋白啟動子在本領(lǐng)域是眾所周知的，正如Kay等人，Science，2361299，1987和EP-A 0 342 926所證明的。同樣適用于本發(fā)明的是肌動蛋白啟動子、組蛋白啟動子、和微管蛋白啟動子。EP-A0 332 104描述了優(yōu)選的化學(xué)誘導(dǎo)啟動子的范例，諸如煙草PR-1a啟動子。另一類優(yōu)選啟動子是創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動子。這一類的優(yōu)選啟動子包括下列所述Stanford等人，Mol.Gen.Genet.，215200-208，1989；Xu等人，Plant Mol.Biol.，22573-588，1993；Logemann等人，Plant Cell，1151-158，1989；Rohrmeier和Lehle，PlantMol.Biol.，22783-792，1993；Firek等人，Plant Mol.Biol.，22192-142，1993；和Warner等人，Plant J.，3191-201，1993。
依照一個優(yōu)選實(shí)施方案，用于表達(dá)β-胡蘿卜素雙加氧酶II的盒包含β-diox II cDNA，并在翻譯水平融合了編碼用于質(zhì)體輸入的運(yùn)輸肽的序列、聚腺苷酸化信號、和轉(zhuǎn)錄終止子，它們都可操作連接允許期望蛋白質(zhì)在植物細(xì)胞、種子、組織、或完整植株中表達(dá)的合適組成性、誘導(dǎo)性、或組織特異性啟動子。
此外，依照本發(fā)明的β-diox II基因優(yōu)選包含分泌序列以便于由細(xì)菌宿主分泌多肽，使之以可溶性天然肽而非包涵體的形式生成。根據(jù)情況，可以由細(xì)菌周質(zhì)間隙或培養(yǎng)基回收肽。
適用于酵母宿主的啟動序列可以是受控或組成性的，而且優(yōu)選衍生自高度表達(dá)的酵母基因，尤其是釀酒酵母基因。因而可以使用TRP1基因、ADHI或ADHII基因、酸性磷酸酶(PHO5)基因的啟動子；編碼α或a因子的酵母交配信息素基因的啟動子；衍生自編碼糖酵解酶的基因的啟動子，諸如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP)、3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、或葡萄糖激酶基因的啟動子；或來自TATA結(jié)合蛋白(TBP)基因的啟動子。另外，有可能使用包含一種酵母基因的上游激活序列(UAS)和另一種酵母基因的下游啟動子元件(包括功能性TATA盒)的雜合啟動子，例如包含PHO5基因的UAS和酵母GAP基因包含功能性TATA盒的雜合啟動子(PHO5-GAP雜合啟動子)。合適組成性PHO5啟動子是例如缺乏上游調(diào)控元件(UAS)、諸如PHO5(-173)啟動子元件(由PHO5基因的第-173位核苷酸開始，至第9位核苷酸結(jié)束)的縮短型酸性磷酸酶PHO5啟動子。
可以通過衍生自病毒(諸如多瘤病毒、腺病毒、禽痘病毒、牛乳頭瘤病毒、禽類肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒(CMV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒、和猿猴毒40(SV40))基因組、衍生自異源哺乳動物啟動子(諸如肌動蛋白啟動子或很強(qiáng)的啟動子如核糖體蛋白質(zhì)啟動子)、或者衍生自通常與β-diox序列相連的啟動子的啟動子來控制哺乳動物宿主中由載體轉(zhuǎn)錄β-diox II基因，條件是這些啟動子與宿主細(xì)胞系統(tǒng)是相容的。
可以通過將增強(qiáng)子序列插入載體來提高編碼β-diox II的DNA在高等真核生物中的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子相對不依賴于取向和定位。已知來自哺乳動物基因(如彈性蛋白酶和珠蛋白)的許多增強(qiáng)子序列。然而，通常采用來自真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。范例包括位于復(fù)制起點(diǎn)(第100-270位bp)晚期一側(cè)的SV40增強(qiáng)子和CMV早期啟動子增強(qiáng)子?？梢詫⒃鰪?qiáng)子剪接到載體中，位于β-diox II DNA的5’或3’，但是優(yōu)選位于啟動子的5’位點(diǎn)。
有利的是，編碼β-diox II的真核表達(dá)載體可以包含基因座控制區(qū)(LCR)。LCR能夠指導(dǎo)整合到宿主細(xì)胞染色質(zhì)中的轉(zhuǎn)基因的高水平整合位點(diǎn)獨(dú)立性表達(dá)，這尤其對在永久轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞系(其中載體發(fā)生了染色體整合)中表達(dá)β-diox II基因時、在設(shè)計用于基因療法應(yīng)用的載體時、或者在本文公開的或本領(lǐng)域已知的轉(zhuǎn)基因動物或其它宿主中是重要的。
依照本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，本文公開的表達(dá)盒和質(zhì)?；蜉d體系統(tǒng)額外包含編碼特異性類視黃質(zhì)修飾酶和/或類視黃質(zhì)結(jié)合蛋白的核酸序列，優(yōu)選與依照本發(fā)明的多肽共表達(dá)，正如上文所述。
適用于表達(dá)β-diox II的真核宿主細(xì)胞，包括真菌(包括酵母)、昆蟲、植物、動物、人或來自其它多細(xì)胞生物體的有核細(xì)胞，還將包含終止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定mRNA所必需的序列。通?？梢杂烧婧嘶虿《綝NA或cDNA的5’和3’非翻譯區(qū)獲得這些序列。這些區(qū)域包括轉(zhuǎn)錄成編碼β-diox II的mRNA非翻譯部分中的聚腺苷酸化片段的核苷酸區(qū)段。
可以通過幾種方法獲得本發(fā)明涵蓋的原核或真核宿主細(xì)胞、種子、組織、和完整生物體。本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會，可以根據(jù)轉(zhuǎn)化所靶向的宿主的類型(諸如植物，即單子葉或雙子葉)來選擇方法。這些方法通常包括直接基因轉(zhuǎn)移、化學(xué)誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移、電穿孔、顯微注射(Crossway等人，BioTechniques，4320-334，1986；Neuhaus等人，Theor.Appl.Genet.，7530-36，1987)、由土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、使用例如可以由Agracetus公司(麥迪遜，威斯康星)和Dupont公司(威爾明頓，特拉華)獲得的裝置的微彈加速法(參閱例如Sanford等人，美國專利號4,945,050；和Mc Cabe等人，Biotechnology，6923-926，1988)、等。
用于獲得本發(fā)明轉(zhuǎn)化植物或其部分的一種方法是直接基因轉(zhuǎn)移，其中在存在包含希望導(dǎo)入植物或其部分的核苷酸序列的DNA寡核苷酸時在合適條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞或以其它方式生長。供體DNA來源通常是包含期望基因的質(zhì)?；蚱渌线m載體。為了方便，這里參考了質(zhì)粒，應(yīng)當(dāng)理解，也涵蓋了包含期望基因的其它合適載體。
可以通過直接基因轉(zhuǎn)移處理攝取質(zhì)粒的任何合適植物組織。這些植物組織包括例如處于發(fā)育早期，特別是減數(shù)分裂前，尤其是減數(shù)分裂前1-2周的生殖結(jié)構(gòu)。通常，將減數(shù)分裂前的生殖器官浸泡在質(zhì)粒溶液中，諸如通過將質(zhì)粒溶液直接注射到植物中生殖器官處或附近。然后將植物自花授粉或與來自以相同方式處理的另一株植物的花粉交叉授粉。質(zhì)粒溶液通常在用于每個花結(jié)構(gòu)的大約0.1-10ml中包含大約10-50μg DNA，但是根據(jù)具體花結(jié)構(gòu)的大小可以高于或低于這個范圍。溶劑通常是無茵的水、鹽水、或緩沖液，或者是常規(guī)的植物培養(yǎng)基。如果需要，質(zhì)粒溶液還可以包含試劑，以化學(xué)誘導(dǎo)或增強(qiáng)質(zhì)粒攝取，諸如PEG、Ca2+、等。
在將生殖器官暴露于質(zhì)粒后，使花結(jié)構(gòu)生長至成熟并收獲種子。根據(jù)質(zhì)粒標(biāo)記，通過植物在標(biāo)記敏感或優(yōu)選標(biāo)記抗性培養(yǎng)基中的發(fā)芽或生長來選擇具有標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化植物。例如，由用具有卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒處理的植物獲得的種子將保持綠色，而不具有這種標(biāo)記基因的植物是白化體?？梢酝ㄟ^常規(guī)的Southern、Northern、和Western印跡技術(shù)進(jìn)一步證明期望基因的mRNA轉(zhuǎn)錄和肽表達(dá)的存在。
在適用于進(jìn)行本發(fā)明的另一種方法中，處理植物原生質(zhì)體以誘導(dǎo)依照本發(fā)明的質(zhì)?；蜉d體系統(tǒng)的攝取。原生質(zhì)體的制備在本領(lǐng)域是眾所周知的，通常包括用纖維素酶和其它酶消化植物細(xì)胞足夠時間以除去細(xì)胞壁。通常通過過篩和清洗由消化混合物分離原生質(zhì)體。然后將原生質(zhì)體懸浮于適當(dāng)培養(yǎng)基，諸如F培養(yǎng)基、CC培養(yǎng)基、等，濃度通常是104-107個細(xì)胞/ml。然后向此懸浮液中加入上文所述質(zhì)粒溶液和誘導(dǎo)劑(諸如聚乙二醇、Ca2+、仙臺病毒、等)?；蛘?，可以將質(zhì)粒包裹到脂質(zhì)體中。然后將質(zhì)粒與原生質(zhì)體的溶液于大約25℃保溫適當(dāng)時間，通常是大約1小時。在有些情況中，可能希望通過短時加熱至大約45℃例如2-5分鐘并迅速冷卻至保溫溫度而對混合物進(jìn)行熱休克。然后克隆處理后的原生質(zhì)體，并通過例如標(biāo)記基因的表達(dá)和常規(guī)的印跡技術(shù)來選擇期望基因的表達(dá)。然后以常規(guī)方式由克隆再生完整植株。
電穿孔技術(shù)是相似的，只是通常在電穿孔槽中在不存在或存在聚乙二醇、Ca2+、等時對裸露質(zhì)粒和原生質(zhì)體的混合物應(yīng)用電流。典型電穿孔包括1-10個脈沖的40-10,000DC伏特，持續(xù)時間1-2000微秒，各脈沖之間的間隔通常是0.2秒。也可以使用相似強(qiáng)度的交流脈沖。更具體的說，將帶電電容器在含質(zhì)粒和原生質(zhì)體懸浮液的電穿孔槽中放電。這種處理導(dǎo)致生物膜通透性的可逆升高，從而能夠插入依照本發(fā)明的DNA。電穿孔后的植物原生質(zhì)體再生它們的細(xì)胞壁，分裂，并形成愈傷組織(參閱例如Riggs等人，1986)。
適用于轉(zhuǎn)化靶細(xì)胞的另一種方法涉及土壤桿菌的使用。在這種方法中，將包含具有期望基因或基因盒的質(zhì)粒的土壤桿菌用于感染植物細(xì)胞并將質(zhì)粒插入靶細(xì)胞基因組。然后如上所述選擇并克隆表達(dá)期望基因的細(xì)胞。例如，通過質(zhì)粒(如Ri質(zhì)粒)和土壤桿菌(如發(fā)根土壤桿菌或根癌土壤桿菌)的手段將目的基因?qū)氚薪M織(如塊莖、根、谷粒、或豆莢)的一種方法是利用適用于在大腸桿菌中克隆的小型重組質(zhì)粒，其中已經(jīng)經(jīng)剪接了T-DNA片段。在T-DNA內(nèi)的一個位點(diǎn)處切開這種重組質(zhì)粒，并在開口處剪接一段“過客”DNA。過客DNA由將要導(dǎo)入植物DNA的本發(fā)明基因和選擇標(biāo)記(如抗生素抗性的基因)組成。然后將這種質(zhì)粒再次克隆到大型質(zhì)粒中，并導(dǎo)入攜帶未修飾Ri質(zhì)粒的土壤桿菌菌株。在細(xì)菌的生長過程中，有時會發(fā)生罕見的雙重重組，導(dǎo)致細(xì)菌中的T-DNA包含插入片段即過客DNA。通過在含抗生素的培養(yǎng)基上的存活來鑒定并選擇這些細(xì)菌。將這些細(xì)菌用于將它們的T-DNA(經(jīng)過客DNA修飾)插入植物基因組。利用發(fā)根土壤桿菌或根癌土壤桿菌的這種流程產(chǎn)生了可再生成健康、有活力植株的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞(參閱例如Hinchee等人，1988)。
另一種合適方法是用微彈轟擊細(xì)胞，所述微彈包被了轉(zhuǎn)化DNA(Wang等人，Plant Mol.Biol.，11433-439，1988)，或者通過壓力沖擊在含DNA的溶液中以待轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方向加速，由此因壓力沖擊而與溶液細(xì)微散布成霧狀(EP-A 0 434 616)。
微彈轟擊已經(jīng)發(fā)展成用于細(xì)胞(包括植物細(xì)胞)的有效轉(zhuǎn)化技術(shù)。Sanford等人(Particulate Science and Technology，527-37，1987)報導(dǎo)了利用微彈轟擊將核酸有效投遞至洋蔥(Allium cepa)植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。Christou等人(Platn Physiol.，87671-674，1988)報導(dǎo)了通過微彈轟擊用卡那霉素抗性基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)化大豆愈傷組織。相同作者報導(dǎo)了大約0.1-5％細(xì)胞被穿透，并發(fā)現(xiàn)可觀測水平的NPTII酶活性和轉(zhuǎn)化愈傷組織中高達(dá)400mg/L的卡那霉素抗性。McCabe等人(1988，同上)報導(dǎo)了使用微彈轟擊穩(wěn)定轉(zhuǎn)化大豆(Glycine max)。McCabe等人還報導(dǎo)了由R0嵌合植物回復(fù)轉(zhuǎn)化R1植物的發(fā)現(xiàn)(還可參閱Weissinger等人，Annual Rev.Genet.，22421-477，1988；Datta等人，Biotechnology，8736-740，1990(稻)；Klein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，854305-4309，1988(玉米)；Klein等人，Plant Physiol.，91440-444，1988(玉米)；Fromm等人，Biotechnology，8833-839，1990；和Gordon-Kamm等人，Plant Cell，2603-618，1990(玉米))。
或者，可以直接轉(zhuǎn)化植物質(zhì)體。已經(jīng)在高等植物中報導(dǎo)了葉綠體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化(參閱例如Svab等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90913-917，1993；Staub和Maliga，EMBO J.，12601-606，1993)。該方法依賴于包含選擇標(biāo)記的DNA的微粒槍投遞和通過同源重組將DNA打靶至質(zhì)體基因組。在這些方法中，可以通過質(zhì)體基因啟動子的使用或通過所處位置便于由選擇性啟動子序列(諸如由T7 RNA聚合酶識別的啟動子序列)的沉默的質(zhì)體傳播轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄激活來實(shí)現(xiàn)質(zhì)體基因表達(dá)。沉默質(zhì)體基因是通過由細(xì)胞核表達(dá)構(gòu)建物表達(dá)的特定RNA聚合酶激活的，并通過運(yùn)輸肽的使用將聚合酶靶向質(zhì)體?？梢赃@種方法通過由合適植物組織特異性啟動子表達(dá)的細(xì)胞核編碼、質(zhì)體定向的特異性RNA聚合酶來獲得組織特異性表達(dá)。McBride等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，977301-7305，1994)已經(jīng)報導(dǎo)了這種系統(tǒng)。
所有植物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)都產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植物的混合物。可以通過導(dǎo)入抗生素或除草劑基因使之能夠在含相應(yīng)有毒化合物的培養(yǎng)基上選擇來實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的選擇。除了那些用于選擇轉(zhuǎn)基因植物的標(biāo)記系統(tǒng)，新的所謂“陽性選擇系統(tǒng)”已經(jīng)成功用于植物轉(zhuǎn)化(PCT/EP94/00575、WO 94/20627)。與抗生素或除草劑抗性選擇系統(tǒng)(其中轉(zhuǎn)基因細(xì)胞獲得在選擇培養(yǎng)基上存活的能力，而殺死非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞)相反，這種方法有利于轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的再生和生長，并餓死而非殺死非轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。因此，將這種選擇策略稱為“陽性選擇”。已經(jīng)構(gòu)建了用于由土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的載體系統(tǒng)，并成功用于例如轉(zhuǎn)化馬鈴薯、煙草、和番茄(Haldrup A、Petersen SG、和Ollels FT，Platn Mol.Biol.，37287-296，1998)?；谶@種陽性選擇系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)依照本發(fā)明可用于導(dǎo)入包含β-diox II的構(gòu)建物以獲得表達(dá)β-diox II多肽的植物并由此能夠酶促切割β-胡蘿卜素而形成β-阿樸胡蘿卜素醛。另外，那些選擇系統(tǒng)的使用將具有優(yōu)點(diǎn)，即克服了在選擇系統(tǒng)中使用抗生素或除草劑基因的缺點(diǎn)，諸如基因產(chǎn)物的毒性或變應(yīng)原性和抗生素處理的干涉，正如本領(lǐng)域普遍知道的。
上文以例示方式列出的可能轉(zhuǎn)化方法并沒有宣稱是完全的，而且并非意欲以任何方式限制本發(fā)明的主題。
因此，本發(fā)明還包括以適當(dāng)方式用上文所列依照本發(fā)明的DNA分子或者用質(zhì)粒或載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核宿主細(xì)胞、種子、組織、或完整生物體，所述方式使得所述宿主細(xì)胞、種子、組織、或完整生物體能夠表達(dá)具有特異切割β-胡蘿卜素和番茄紅素而分別形成β-阿樸胡蘿卜素醛和β-芷香酮及阿樸番茄紅素醛的生物學(xué)活性和/或具有特異結(jié)合針對所述多肽或其功能片段所制備的抗體的能力的多肽或其功能片段。
依照本發(fā)明，原核或真核宿主細(xì)胞、種子、組織、或完整生物體選自下組細(xì)菌、酵母、真菌、昆蟲、動物、和植物細(xì)胞、種子、組織、或完整生物體。關(guān)于原核分類群，宿主可以選自下組原細(xì)菌(proteobacteria)，包括α、β、γ、δ、和ε亞門的成員；革蘭氏陽性細(xì)菌，包括放線茵綱(Actinomycetes)、硬壁茵門(Firmicutes)、梭菌屬(Clostridium)及其親緣、黃細(xì)菌(flavobacteria)、藍(lán)細(xì)菌(cyanobacteria)、綠色硫細(xì)菌(greensulfur bacteria)、綠色非硫細(xì)菌(green non-sulfur bacteria)、和古細(xì)菌(archaea)。屬于α亞門的合適原細(xì)菌可以選自下組土壤桿菌屬(Agrobacterium)、紅螺茵屬(Rhodospirillum)、紅假單胞茵屬(Rhodopseudomonas)、紅細(xì)菌屬(Rhodobacter)、紅微茵屬(Rhodomicrobium)、紅球形茵屬(Rhodopiia)、根瘤茵屬(Rhizobium)、硝化桿菌屬(Nitrobacter)、水螺茵屬(Aquaspirillum)、生絲微茵屬(Hyphomicrobium)、醋桿菌屬(Acetobacter)、拜葉林克氏茵屬(Beijerinckia)、副球菌屬(Paracoccus)、和假單胞茵屬(Pseudomonas)，優(yōu)選土壤桿菌屬和紅細(xì)菌屬，分別最優(yōu)選金黃色土壤桿菌(Agrobacterium aureus)和莢膜紅細(xì)菌(Rhodobacter capsulatus)。屬于β亞門的合適原細(xì)菌可以選自下組紅環(huán)茵屬(Rhodocyclus)、紅育茵屬(Rhodopherax)、Rhodovivax、螺茵屬(Spirillum)、亞硝化單胞茵屬(Nitrosomonas)、球衣茵屬(Spherotilus)、硫桿菌屬(Thiobacillus)、產(chǎn)堿茵屬(Alcaligenes)、假單胞茵屬(Pseudomonas)、博德特氏茵屬(Bordetella)、和奈瑟氏球菌屬(Neisseria)，優(yōu)選氧化氨的細(xì)菌諸如亞硝化單胞茵屬，最優(yōu)選亞硝化單胞菌ENI-11。屬于γ亞門的合適原細(xì)菌可以選自下組著色茵屬(Chromatium)、硫螺旋茵屬(Thiospirillum)、貝日阿托氏菌屬(Beggiatoa)、亮發(fā)茵屬(Leucothrix)、埃希氏茵屬(Escherichia)、和固氮菌屬(Azotobacter)，優(yōu)選腸桿菌科(Enterobacteriaceae)諸如大腸埃希氏茵(Escherichia coli)，最優(yōu)選大腸桿菌K12茵株諸如M15(描述為DZ 291，Villarejo等人，J.Bacteriol.，120466-474，1974)、HB101(ATCC編號33649)、和大腸埃希氏茵SG13009(Gottesman等人，J.Bacteriol.，148265-273，1981)。屬于δ亞門的合適原細(xì)菌可以選自下組蛭弧茵屬(Bdellovibrio)、脫硫弧茵屬(Desulfovibrio)、脫硫單胞茵屬(Desulfuromonas)、和粘細(xì)菌(Myxobacteria)諸如粘球菌屬(Myxococcus)，優(yōu)選黃色粘球菌(Myxococcus xanthus)。屬于ε亞門的合適原細(xì)菌可以選自下組卵硫菌屬(Thiorulum)、沃林氏茵屬(Wolinella)、和彎曲桿菌屬(Campylobacter)。合適的革蘭氏陽性細(xì)菌可以選自下組放線茵(Actinomycetes)諸如放線茵屬(Actinomyces)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、諾卡氏茵屬(Nocardia)、游動放線菌屬(Actinoplanes)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、小單孢菌屬(Micromonospora)、弗蘭克氏茵屬(Frankia)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)、和短桿菌屬(Brevibacterium)，硬壁茵門(Firmicutes)包括梭茵屬及其親緣諸如梭茵屬、芽孢桿菌屬(Bacillus)、脫硫腸狀茵屬(Desulfotomaculum)、高溫放線茵屬(Thermoactinomyces)、芽孢八疊球菌屬(Sporosarcina)、醋酸桿菌屬(Acetobacterium)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、消化球菌屬(Peptococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、瘤胃球茵屬(Rominococcus)、動性球菌屬(Planococcus)、枝原體屬(Mycoplasma)、無膽甾原體屬(Acheoleplasma)、和螺原體屬(Spiroplasma)，優(yōu)選枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。合適的黃細(xì)茵類可以選自下組擬桿菌屬(Bacteroides)、噬纖維菌屬(Cytophaga)、和黃桿菌屬(Flavobacterium)，優(yōu)選黃桿菌屬諸如黃桿菌ATCC 21588。合適的藍(lán)細(xì)菌類可以選自下組Chlorococcales，包括集胞藍(lán)細(xì)菌屬(Synechocystis)和聚球藍(lán)細(xì)菌屬(Synechococcus)，優(yōu)選集胞藍(lán)細(xì)菌之種(Synechocystis sp.)和聚球藍(lán)細(xì)菌之種(Synechococcus sp.)PS717。合適的綠色硫細(xì)菌可以選自下組綠菌屬(Chlorobium)，優(yōu)選泥生綠茵嗜硫代硫酸鹽小種(Chlorobium limicola f.thiosulfatophilum)。合適的綠色非硫細(xì)菌可以選自下組綠屈撓茵科(Chloroflexaceae)諸如綠屈撓菌屬(Chloroflexus)，優(yōu)選橙色綠屈撓茵(Chloroflexusaurantiacus)。合適的古細(xì)菌類可以選自下組鹽桿茵科(Halobacteriaceae)包括鹽桿菌屬(Halobacterium)，優(yōu)選鹽沼鹽桿菌(Halobacterium salinarum)。
關(guān)于真菌(包括酵母)的真核分類群，宿主可以選自下組子囊茵門(Ascomycota)包括酵母綱(Saccharomycetes)諸如畢赤酵母屬(Pichia)和酵母屬(Saccharomyces)，和變形子囊茵門(anamorphicAscomycota)包括曲霉屬(Aspergillus)，優(yōu)選釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和黑曲霉(Aspergillus niger)(如ATCC 9142)。
真核宿主系統(tǒng)包括優(yōu)選選自下組的昆蟲細(xì)胞SF9、SF21、Trychplusiani、和MB21。例如，可以在昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)中有利的表達(dá)依照本發(fā)明的多肽。適用于本發(fā)明方法的昆蟲細(xì)胞原則上包括能夠用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化并表達(dá)由其編碼的異源蛋白的任何鱗翅目(lepidopteran)細(xì)胞。具體而言，優(yōu)選使用Sf細(xì)胞系諸如草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)細(xì)胞系IPBL-SF-21 AE(Vaughn等人，In Vitro，13213-217，1977)。特別優(yōu)選衍生細(xì)胞系Sf9。然而，也可以采用其它細(xì)胞系，諸如粉紋(粉)夜蛾(Trichoplusia ni)368(Kutstack和Marmorosch，《Invertebrate Tissue Culture Applications inMedicine，Biology and Agriculture》(無脊椎動物組織培養(yǎng)在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、和農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用)，Academic出版社，紐約，美國，1976)。這些細(xì)胞系以及適用于本發(fā)明的其它昆蟲細(xì)胞系可以由商業(yè)途徑獲得(如Stratagene，拉霍亞，加利福尼亞，美國)。與在培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞中表達(dá)一樣，本發(fā)明還包括在完整昆蟲生物體中表達(dá)異源蛋白諸如β-diox II。病毒載體諸如桿狀病毒的使用能夠感染完整昆蟲，這在某些方面比培養(yǎng)細(xì)胞易于生長，因?yàn)樗鼈儗μ厥馍L條件的要求較少。大型昆蟲諸如蠶蛾能夠提供高產(chǎn)量的異源蛋白?？梢砸勒粘Ｒ?guī)提取技術(shù)由昆蟲提取蛋白質(zhì)。適用于本發(fā)明的表達(dá)載體包括能夠在昆蟲細(xì)胞系中表達(dá)外源蛋白的所有載體。一般而言，可用于哺乳動物和其它真核細(xì)胞的載體同樣可應(yīng)用于昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物。尤其優(yōu)選明確意欲用于昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物的桿狀病毒載體，而且可以通過商業(yè)途徑廣泛獲得(如Invitrogen和Clontech)。還知道能夠感染昆蟲細(xì)胞的其它病毒載體，諸如Sindbis病毒(Hahn等人，PNAS USA，892679-2683，1992)。選擇的桿狀病毒載體(回顧見Miller，Ann.Rev.Microbiol.，42177-179，1988)是苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)多核型多角體病毒(AcMNPV)。通常用異源基因取代AcMNPV的多角體蛋白基因的至少部分，因?yàn)槎嘟求w蛋白不是病毒繁殖所必需的。為了插入異源基因，使用轉(zhuǎn)移載體比較有利。優(yōu)選在大腸桿菌宿主中制備轉(zhuǎn)移栽體，然后通過同源重組過程將DNA插入片段轉(zhuǎn)移至AcMNPV。
真核宿主系統(tǒng)還包括動物細(xì)胞，優(yōu)選選自下組幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、人胚腎(HEK)細(xì)胞、和COS細(xì)胞，最優(yōu)選3T3和293細(xì)胞。
在本公開書中提到的宿主細(xì)胞包括體外培養(yǎng)的細(xì)胞和宿主生物體內(nèi)的細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了選自下組的轉(zhuǎn)基因植物材料原生質(zhì)體、細(xì)胞、愈傷組織、組織、器官、種子、胚、胚珠、合子、等，尤其是通過依照本發(fā)明方法進(jìn)行了轉(zhuǎn)化并包含可表達(dá)形式的本發(fā)明重組DNA的完整植株，以及用于生成所述轉(zhuǎn)基因植物材料的方法。
在用于本文時，術(shù)語“植物”通常包括真核藻類、有胚植物包括苔蘚植物門(Bryophyta)、蕨類植物門(Pteridophyta)、和種子植物門(Spermatophyta)諸如裸子植物亞門(Gymnospermae)和被子植物亞門(Angiospermae)，后者包括Magnoliopsida、Rosopsida(真-“雙子葉植物”)、和百合綱(Liliopsida)(“單子葉植物”)。代表性和優(yōu)選范例包括谷物種子，如稻、小麥、大麥、燕麥、莧屬植物、亞麻、黑小麥、黑麥、玉米、和其它草類；油料種子，諸如蕓苔種子、棉花種子、大豆、紅花、向日葵、椰子、棕櫚、等；其它可食用種子或含可食用部分的種子，包括西葫蘆、南瓜、芝麻、罌粟、葡萄、綠豆、花生、豌豆、菜豆、蘿卜、苜蓿、可可、咖啡、大麻；樹生堅果，諸如胡桃、巴旦杏、山核桃、鷹嘴豆、等。其它范例包括馬鈴薯、胡蘿卜、甘薯、制糖甜菜、番茄、胡椒、木薯、柳、櫟、榆、槭、蘋果、和香蕉。通常，本發(fā)明可應(yīng)用于栽培用于食品、藥物、飲料、等的物種。優(yōu)選的是，選擇用于轉(zhuǎn)化的靶植物栽培用于食品，諸如谷物、根、豆類、堅果、蔬菜、塊莖、水果、調(diào)味品、等。
可以遵循本領(lǐng)域眾所周知的如下流程將依照本發(fā)明生成的陽性轉(zhuǎn)化體再生成植株(參閱例如McCormick等人，Plant Cell Reports，581-84，1986)。然后栽培這些植株，在用相同轉(zhuǎn)化種或不同種授粉后可以對后代評估期望特性的存在和/或期望特性的表達(dá)程度，并鑒定具有期望表型特征的所得雜合體。第一項(xiàng)評估可以包括例如轉(zhuǎn)化植物的細(xì)菌/真菌抗性水平?？梢栽耘鄡纱蚋啻源_保目的表型特征得到穩(wěn)定維持和遺傳，然后收獲種子以確保已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了期望表型或其它特性。
本發(fā)明的范圍還包括轉(zhuǎn)基因植物，特別是通過本發(fā)明方法轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因可育植物及其無性繁殖和/或有性繁殖后代，它們?nèi)匀徽故疽蚰副局参锏霓D(zhuǎn)化而引起的新的和期望的特性。
術(shù)語“后代”理解為包括“無性繁殖”和“有性繁殖”產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物的后代。該定義還意欲包括可通過已知方法(諸如細(xì)胞融合體或突變體選擇)獲得的所有突變體和變體，以及轉(zhuǎn)化植物材料的所有雜交和融合產(chǎn)物，所述突變體和變體仍然展示最初轉(zhuǎn)化植物的特征性特性。
由先前通過本發(fā)明方法轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物或其后代起源、因而至少部分由轉(zhuǎn)基因細(xì)胞組成的植物部分，諸如花、莖、果實(shí)、葉、根，也是本發(fā)明的對象。本發(fā)明的另一方面涉及用于測量、分析、和評估依照本發(fā)明的核酸和/或氨基酸分子固有的定性和定量性質(zhì)的診斷手段和方法。例如，適當(dāng)設(shè)計的寡核苷酸(本文公開的序列的代表性例子)使之能夠進(jìn)行例如組織分型、表達(dá)作圖、和等位基因測定(SNP分析)，優(yōu)選在高通量裝置(諸-如DNA和蛋白質(zhì)微陣)中進(jìn)行，諸如此類。其它應(yīng)用領(lǐng)域包括生成特定構(gòu)建物作為基因治療工具，和生成抗體用于例如純化、治療、或診斷目的。
依照本發(fā)明的還有一個實(shí)施方案，提供了特異識別并結(jié)合β-dioxII的抗體。例如，可以生成針對具有SEQ ID NO17、19、或21中所列氨基酸序列的β-diox II蛋白質(zhì)的這些抗體?；蛘?，將β-diox II或諸如上文所述β-diox II片段(也可以通過體外方法合成)融合(通過重組表達(dá)或體外肽鍵)免疫原性多肽，繼而將這種融合多肽用于制備針對β-diox II表位的抗體。
可以由免疫動物的血清回收抗β-diox II多肽?？梢猿Ｒ?guī)方式由來自免疫動物的細(xì)胞制備單克隆抗體。
本發(fā)明的抗體可用于研究β-diox II的定位、篩選表達(dá)文庫以鑒定編碼β-diox II或功能性結(jié)構(gòu)域的核酸、以及純化β-diox II等。
依照本發(fā)明的抗體可以是天然類型的完整抗體，諸如IgE和IgM抗體，但是優(yōu)選IgG抗體。另外，本發(fā)明包括抗體片段，諸如Fab、F(ab’)2、Fv、和scFv。由于尺寸小即因此組織分布優(yōu)越，小片段(諸如Fv和scFv)具有用于診斷和治療應(yīng)用的有利特性。
尤其指出依照本發(fā)明的抗體的診斷和治療應(yīng)用。因此，它們可以是改變后包含效應(yīng)蛋白諸如毒素或標(biāo)記物的抗體。尤其優(yōu)選能夠在體內(nèi)將腫瘤中的抗體分布成像的標(biāo)記物。這些標(biāo)記物可以是易于在患者體內(nèi)顯影的放射性標(biāo)記物或不透射線標(biāo)記物，諸如金屬微粒。另外，它們可以是能夠在取自患者的組織樣品上顯影的熒光標(biāo)記物或其它標(biāo)記物。
重組DNA技術(shù)可用于改進(jìn)本發(fā)明的抗體。因而，可以構(gòu)建嵌合抗體以降低它們在診斷或治療應(yīng)用中的免疫原性。另外，可以通過CDR移植(參閱EP-A-239 400，Winter)和任選的框架修飾(參閱WO 90/07861，Protein Design Lab)將抗體人源化而將免疫原性最小化。
可以由動物血清獲得依照本發(fā)明的抗體，或者在單克隆抗體或其片段的情況下，可以在細(xì)胞培養(yǎng)物中生成。依照已確立流程，重組DNA技術(shù)可用于在細(xì)菌或優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物中生成抗體。選擇的細(xì)胞培養(yǎng)物系統(tǒng)優(yōu)選分泌抗體產(chǎn)物。
因此，本發(fā)明包括用于生成依照本發(fā)明的抗體的方法，包括培養(yǎng)已經(jīng)用包含表達(dá)盒的雜合載體轉(zhuǎn)化的宿主(如大腸桿菌或哺乳動物細(xì)胞)，所述表達(dá)盒包含啟動子，以及與之可操作連接的編碼信號肽的第一種DNA序列，并正確讀碼框中連接編碼抗體的第二種DNA序列，以及分離所述抗體。
雜交瘤細(xì)胞或哺乳動物宿主細(xì)胞的體外增殖是在合適培養(yǎng)基中進(jìn)行，它們是常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，例如Dulbecco氏修改的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)或RPMI 1640培養(yǎng)基，任選補(bǔ)充哺乳動物血清(如胎牛血清)或痕量元素和生長維持補(bǔ)充物(如飼養(yǎng)細(xì)胞，諸如正常小鼠腹膜滲出細(xì)胞、脾細(xì)胞、骨髓巨噬細(xì)胞、2-氨基乙醇、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、低密度脂蛋白、油酸、等)。作為宿主細(xì)胞的細(xì)菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞的增殖同樣是在本領(lǐng)域知道的合適培養(yǎng)基中進(jìn)行的，例如對于細(xì)菌而言使用培養(yǎng)基LB、NZCYM、NZYM、NZM、Terrific肉湯、SOB、SOC、2xYT、或M9基本培養(yǎng)基，對于酵母而言使用培養(yǎng)基YPD、YEPD、基本培養(yǎng)基、或完全基本Dropout培養(yǎng)基。
體外生產(chǎn)可提供相對較純的抗體制劑，并能夠擴(kuò)大規(guī)模以產(chǎn)生大量的期望抗體。用于細(xì)菌細(xì)胞、酵母、或哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)在本領(lǐng)域是知道的，包括均相懸浮培養(yǎng)(如氣升式反應(yīng)器或連續(xù)攪拌反應(yīng)器)、固定化或截留細(xì)胞培養(yǎng)(如中空纖維、微囊、瓊脂糖微珠、或陶柱)。
還可通過哺乳動物細(xì)胞的體內(nèi)增殖來獲得大量的期望抗體。為此目的，將生成期望抗體的雜交瘤細(xì)胞注射到組織相容哺乳動物中，引起抗體生成腫瘤的生長。任選的是，在注射前用烴尤其是礦物油諸如降植烷(四甲基十五烷)對動物進(jìn)行引發(fā)。1-3周后，由那些哺乳動物的體液分離抗體。例如，將通過合適骨髓瘤細(xì)胞與來自Balb/c小鼠的抗體生成脾細(xì)胞的融合獲得的雜交瘤細(xì)胞、或衍生自雜交瘤細(xì)胞系Sp2/O且生成期望抗體的轉(zhuǎn)染細(xì)胞腹膜內(nèi)注射到Balb/c小鼠體內(nèi)(該小鼠任選用降植烷預(yù)處理)，1-3周后，由動物采集腹水。
對細(xì)胞培養(yǎng)物上清液篩選期望抗體，優(yōu)選通過表達(dá)β-diox II的細(xì)胞的免疫熒光染色、通過免疫印跡、通過酶免疫測定法(如三明治測定法或斑點(diǎn)測定法)、或放射性免疫測定法進(jìn)行。
為了分離抗體，可以濃縮培養(yǎng)物上清液或腹水中的免疫球蛋白，例如通過硫酸銨沉淀、在吸濕材料諸如聚乙二醇中的透析、通過選擇性膜過濾、等。如果必需和/或希望，可通過常規(guī)的層析法純化抗體，例如凝膠過濾、離子交換層析、DEAE-纖維素層析、和/或免疫親和層析，如使用β-diox II蛋白質(zhì)或A蛋白進(jìn)行親和層析。
本發(fā)明還涉及分泌本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。本發(fā)明的優(yōu)選雜交瘤細(xì)胞在遺傳上是穩(wěn)定的，分泌具有期望特異性的本發(fā)明單克隆抗體，并能夠通過解凍和再次克隆由深層冷凍培養(yǎng)物活化。
本發(fā)明還涉及用于制備分泌針對β-diox II的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系的方法，其特征是用純化的β-diox II蛋白質(zhì)、含純化的β-diox II的抗原載體、或攜有β-diox II的細(xì)胞免疫合適哺乳動物(例如Balb/c小鼠)，將免疫動物的抗體生成細(xì)胞融合合適骨髓瘤細(xì)胞系的細(xì)胞，克隆在融合中獲得的雜合體細(xì)胞，并選擇分泌期望抗體的細(xì)胞克隆。例如，將用攜有β-diox II的細(xì)胞免疫的Balb/c小鼠的脾細(xì)胞融合骨髓瘤細(xì)胞系PAI或骨髓瘤細(xì)胞系Sp2/O-Agl4的細(xì)胞，對獲得的雜合體細(xì)胞篩選期望抗體的分泌，并克隆陽性雜交瘤細(xì)胞。
優(yōu)選用于制備雜交瘤細(xì)胞系的方法，其特征是通過在幾個月(如2-4個月)里幾次(如4-6次)皮下和/或腹膜內(nèi)注射107-108個人腫瘤起源且表達(dá)含合適佐劑的β-diox II的細(xì)胞來免疫Balb/c小鼠，最后一次注射后2-4天由免疫小鼠采集脾細(xì)胞，并在存在融合促進(jìn)劑(優(yōu)選聚乙二醇)時融合骨髓瘤細(xì)胞系PAI的細(xì)胞。優(yōu)選的是，骨髓瘤細(xì)胞在含大約30-50％分子量4000左右的聚乙二醇的溶液中融合3-20倍過量的來自免疫小鼠的脾細(xì)胞。融合后，在上文所述合適培養(yǎng)基中擴(kuò)增細(xì)胞，以規(guī)則時間間隔添加選擇性培養(yǎng)基(例如HAT培養(yǎng)基)以防止正常骨髓瘤細(xì)胞相對于期望雜交瘤細(xì)胞的過度生長。
本發(fā)明還涉及包含編碼針對β-diox II蛋白質(zhì)的抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的插入片段的重組DNA。根據(jù)定義，這些DNA包括編碼單鏈DNA、由所述編碼DNA及其互補(bǔ)DNA組成的雙鏈DNA、或這些互補(bǔ)(單鏈)DNA自身。
另外，編碼針對β-diox II的抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的DNA可以是具有編碼重鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的真實(shí)DNA序列或其突變體的酶促或化學(xué)合成DNA。真實(shí)DNA的突變體是編碼上述抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的DNA，其中一個或多個氨基酸被刪除或用一個或多個其它氨基酸替代。優(yōu)選的是，所述修飾位于抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR以外。這種突變DNA還可以是沉默突變體，其中一個或多個核苷酸被其它核苷酸替代，而新的密碼子編碼相同的氨基酸。這種突變體序列也是簡并序列。簡并序列在遺傳密碼的含義內(nèi)是簡并的，即其中有不限數(shù)目的核苷酸被其它核苷酸替代，而不改變最初編碼的氨基酸序列。這些簡并序列是有用的，因?yàn)樗鼈兙哂胁煌南拗菩晕稽c(diǎn)和/或特定宿主(特別是大腸桿菌)優(yōu)選的特定密碼子頻率，從而獲得重鏈?zhǔn)罂勺兘Y(jié)構(gòu)域和/或輕鏈?zhǔn)罂勺兘Y(jié)構(gòu)域的最佳表達(dá)。
術(shù)語“突變體”意欲包括通過依照本領(lǐng)域已知方法由真實(shí)DNA的體外誘變獲得的DNA突變體。
為了裝配完整的四聚體免疫球蛋白分子和表達(dá)嵌合抗體，將編碼重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的重組DNA插入片段融合編碼重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)DNA，然后轉(zhuǎn)移到適當(dāng)宿主細(xì)胞中，例如在摻入雜合體載體后進(jìn)行這種轉(zhuǎn)移。
在診斷組合物的情況中，優(yōu)選抗體與用于檢測抗體的手段一起提供，它可以是酶促、熒光、放射性同位素、或其它手段?？梢栽谝庥糜谠\斷的診斷試劑盒中提供同時、同時但分開、或順序使用的抗體和檢測手段。
例如，本發(fā)明提供了特征為指定受試者或個體中β-diox II水平的升高或降低的病理學(xué)的診斷方法。例如，獲取測試樣品，并在合適條件下接觸能夠特異結(jié)合β-diox II的試劑或能夠結(jié)合編碼β-dioxII的核酸分子的核苷酸序列，所述條件允許所述試劑或所述核苷酸序列與所述β-diox II靶氨基酸或核酸序列之間的特異結(jié)合。隨后，可以將所述測試樣品中所述特異結(jié)合的量與對照樣品中特異結(jié)合的量進(jìn)行比較，其中由所述測試樣品中所述特異結(jié)合量相對于所述對照樣品的升高或降低即可診斷與由β-diox II誘導(dǎo)的途徑有關(guān)的病理學(xué)。
本發(fā)明還提供了升高或降低細(xì)胞或組織中β-diox II的量的方法，這可以調(diào)控維生素A或其它類視黃質(zhì)的水平。例如，可以通過將包含編碼β-diox II或其功能性片段的核酸序列的核酸分子導(dǎo)入細(xì)胞或組織來升高指定靶細(xì)胞或組織中β-diox II的量。細(xì)胞或組織中β-diox II的量的升高可以誘導(dǎo)或促進(jìn)維生素A積累，這不僅將有利于人類，還將有利于頻繁給予維生素制劑以改進(jìn)營養(yǎng)品質(zhì)的動物和飼料。
生物學(xué)材料的保藏攜帶衍生自黑腹果蠅的β-胡蘿卜素雙加氧酶編碼基因的大腸桿菌細(xì)胞已經(jīng)根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏于德國不倫瑞克的DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)，鑒定參考號為“β-diox”，編號DSM 13304。
如下實(shí)施例是例示性的，而非限制本發(fā)明。
實(shí)施例質(zhì)粒構(gòu)建物積累β-胡蘿卜素的大腸桿菌菌株的構(gòu)建使用載體pFDY297構(gòu)建攜帶來自草生歐文氏菌(Erwiniaherbicola)的β-胡蘿卜素生物合成基因的質(zhì)粒。pFDY297是導(dǎo)入了pBluescriptSK的第1-485位bp的pACYC177(第486-3130位bp)衍生物。為了克隆來自草生歐文氏菌的β-胡蘿卜素生物合成基因，在PCR產(chǎn)物的兩端導(dǎo)入合適的內(nèi)切核酸酶限制性位點(diǎn)。首先將crtE基因插入pFDY297。使用引物5’-GCGTCGACCGCGGTCTACGGTTAACTG-3’(SEQ IDNO3)和5’-GGGGTACCCTTGAACCCAAAAGGGCGG-3’(SEQ ID NO4)及Expand PCR System即擴(kuò)增PCR系統(tǒng)(Boehringer，曼海姆，德國)，通過PCR由pBL376(Hundle BS等人，Mol.Gen.Genet.，245406-416，1994)擴(kuò)增CrtE，該質(zhì)粒編碼來自草生歐文氏茵的整個類胡蘿卜素生物合成基因簇。用KpnI和SalI消化PCR產(chǎn)物，并連接到pFDY297的適當(dāng)位點(diǎn)中，產(chǎn)生質(zhì)粒pCRTE。使用引物5’-GCTCTAGACGTCTGGCGACGGCCCGCCA-3’(SEQ ID NO5)和5’-GCGTCGACACCTACAGGCGATCCTGCG-3’(SEQ ID NO6)及Expand PCRSystem即擴(kuò)增PCR系統(tǒng)(Boehringer，曼海姆，德國)，通過PCR由pBL376擴(kuò)增基因crtB、crtI、和crtY。用XbaI和SalI消化PCR產(chǎn)物，并連接到pCRTE的適當(dāng)位點(diǎn)中，產(chǎn)生質(zhì)粒pORANGE。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中之后，得到的菌株能夠合成β-胡蘿卜素。由黑腹果蠅克隆β-diox我們由通過手工解剖得到的成年果蠅的頭部分離總RNA。使用寡(T)-銜接頭引物5’-GACCACGCGTATCGATGTCGACTTTTTTTTTTTT TTTTTT-3’(SEQ ID NO7)及Superscript逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco，德國)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。為了克隆全長cDNA，使用衍生自已發(fā)表EST片段(編號AI063857)的特異上游引物5’-GCAGCCGGTGTCTTCAAGA G-3’(SEQ ID NO8)和3’端的錨定引物5’-GACCACGCGTATCGATGTCG A-3’(SEQ ID NO9)及ExpandPCR System即擴(kuò)增PCR系統(tǒng)(Boehringer，曼海姆，德國)進(jìn)行PCR。0.8％瓊脂糖凝膠電泳之后，分離得到的PCR產(chǎn)物，直接連接到載體pBAD-TOPO(Invitrogen，荷蘭)中，并轉(zhuǎn)化到積累β-胡蘿卜素的大腸桿菌菌株中。使用這種克隆策略，將果蠅cDNA在翻譯水平上融合載體的短開放讀碼框，并受到可由L-阿拉伯糖誘導(dǎo)的正調(diào)控啟動子的控制。將細(xì)菌涂布在含氨芐青霉素(100μg/ml)、卡那霉素(50μg/ml)、和L-阿拉伯糖(0.2％)的LB瓊脂上。通過由黃色褪至幾乎白色來鑒定陽性菌落。為了分析得到的質(zhì)粒pβdiox并確認(rèn)其結(jié)構(gòu)，將兩條鏈完整測序。β-diox-gex的表達(dá)、純化、和酶活性為了表達(dá)β-diox，使用Gex上游引物5’-GGAATTCGCAGCCGGTGTCTTCAAGAG-3’(SEQ ID NO10)和Gex下游引物5’-CCTCGAGGTAGTCTTCCCATATAAGG-3’(SEQ ID NO11)及Expand PCR System即擴(kuò)增PCR系統(tǒng)(Boehringer，曼海姆，德國)擴(kuò)增cDNA。通過寡核苷酸引物在PCR產(chǎn)物的兩端導(dǎo)入了合適的限制性位點(diǎn)。EcoRI和NcoI的限制性消化之后，將PCR產(chǎn)物克隆到表達(dá)載體pGEX-4T-1(Pharmacia，弗賴堡，德國)的合適位點(diǎn)中。將得到的質(zhì)粒pβdiox-gex轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株JM109中。如制造商的方案所述，進(jìn)行融合蛋白β-diox-gex在大腸桿菌中的表達(dá)和隨后在谷胱甘肽sepharose 4B(Pharmacia，弗賴堡，德國)上的純化。β-diox酶活性的測定將純化的蛋白質(zhì)在300μl含50mM Tricine/NaOH(pH7.6)和100mMNaCl及0.05％屈立通X100的緩沖液中保溫。加入5μlβ-胡蘿卜素(80μM，溶于乙醇)開始反應(yīng)。分別加入FeSO4和L-抗壞血酸至終濃度5μM和10mM。于30℃保溫2小、時后，加入100μl 2M NH2OH(pH6.8)和200μl甲醇終止反應(yīng)。如上所述進(jìn)行抽提和HPLC分析。通過RT-PCR測定身體不同部分的mRNA水平由成年果蠅(雄性和雌性)分離總RNA。通過手工解剖獲得頭、胸、和腹部(事先已經(jīng)除去腿和翅)。為了測量β-diox的穩(wěn)定狀態(tài)mRNA的量，如(von Lintig J等人，Plant J.，12625-634，1997)所述進(jìn)行RT-PCR。使用寡(dT17)引物及Superscript逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco，德國)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用β-diox II的上游引物5’-CTGCAAACGGACCGACCACGT-3’(SEQ ID NO12)和下游引物5’-GCAAATCTATCGAAGATCGAG-3(SEQ ID NO13)及Taq聚合酶(Pharmacia，弗賴堡，德國)進(jìn)行PCR。使用跨越內(nèi)含子的上游引物5’-GACTTCATCCGCCACCAGTC-3’(SEQ ID NO14)和下游引物5’-CACCAGGAACTTCTTGAATCCG-3’(SEQ ID NO15)研究組成性表達(dá)的核糖體蛋白質(zhì)rp49的mRNA水平作為內(nèi)部對照。作為β-diox和rp49的兩個單獨(dú)引物測定法進(jìn)行PCR，并在一個測定法中聯(lián)合所有四種引物。由大腸桿菌提取β-胡蘿卜素和類視黃質(zhì)及HPLC分析在安全紅光下在50ml燒瓶中在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌菌株直至培養(yǎng)物的OD600達(dá)到1。加入L-阿拉伯糖(0.2％w/v)誘導(dǎo)β-diox的表達(dá)達(dá)6小時或16小時。然后離心收獲細(xì)菌。通過如下方案抽提沉淀A.將沉淀重懸于200μl 6M甲醛，并于30℃保溫2分鐘，然后加入2ml二氯甲烷。用4ml正己烷萃取胡蘿卜素和類視黃質(zhì)3次。將收集的有機(jī)相蒸發(fā)，并溶于HPLC溶劑。B.將沉淀重懸于2ml 1M NH2OH(溶于50％甲醇)，并于30℃保溫10分鐘。用石油醚萃取3次。將收集的有機(jī)相在N2流下干燥，并溶于HPLC溶劑。在配備multi-diode-array即多重二極管陣列(166型，Beckman)和System Gold Nouveau軟件(Beckman，美國)的System Gold(Beckman)上的Hypersil 3μm(Knaur，德國)上進(jìn)行HPLC分析。HPLC溶劑A(正己烷/乙醇99.75∶0.25)用于視黃醛，溶劑B(正己烷/乙醇99.5∶0.5)用于視黃醛肟。參照物全-反式、13-順式、和9-順式視黃醛購自Sigma(德國)；11-順式視黃醛由適應(yīng)黑暗的牛眼分離。分別通過NaBH4的還原或與NH2OH的反應(yīng)來獲得相應(yīng)的視黃醇和肟。為了將摩爾量量化，用確定量的參照物衡量峰積分。由小鼠不同組織制備總RNA為了實(shí)驗(yàn)，處死7周齡的BALB/c小鼠(雄性和雌性)，手工解剖不同組織(結(jié)腸、小腸、胃、脾、腦、肝、心、腎、肺、和睪丸)，并立即在液氮中冷凍。每種組織取50-100mg，用杵在研缽中用液氮勻漿，并使用RNeasy Kit即RNA簡易試劑盒(Qiagen，Hilden，德國)分離總RNA。通過分光光度法測定分離的總RNA的濃度。由小鼠克隆編碼β-diox同源蛋白的cDNA為了克隆編碼推定小鼠β-胡蘿卜素雙加氧酶的全長cDNA，使用5’/3’RACE試劑盒(Roche Molecular Biochemicals，曼海姆，德國)進(jìn)行RACE-PCR。使用500ng由肝分離的總RNA、寡dT錨定引物、及Superscript逆轉(zhuǎn)錄酶(Life Technologies公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用錨定引物和用于β，β-胡蘿卜素-15，15’雙加氧酶(β-diox I)的特異上游引物5’-ATGGAGATAATATTTGGCCAG-3’(SEQ ID NO22)或用于β-diox II的特異上游引物5’-ATGTTGGGACCGAAGCAAAGC-3(SEQ ID NO24)及Expand PCR System即擴(kuò)增PCR系統(tǒng)(Roche MolecularBiochemicals)進(jìn)行PCR。將PCR產(chǎn)物連接到載體pBAD-TOPO(Invitrogen，荷蘭)中，產(chǎn)生質(zhì)粒pDiox I和pDiox II。小鼠中β-胡蘿卜素雙加氧酶的組織特異性表達(dá)如(von Lintig J、Welsch R、Bonk M、Giuliano G、BatschauerA、和Kleinig H，Plant J.，12625-634，1997)所述，使用由不同組織分離的總RNA(100ng)進(jìn)行RT-PCR。使用如下引物組。β-dioxI上游引物5’-ATGGAGATAATATTTGGCCAG-3’(SEQ ID NO22)和下游引物5’-AACTCAGACACCACGATTC-3’(SEQ ID NO23)；β-diox II上游引物5’-ATGTTGGGACCGAAGCAAAGC-3’(SEQ ID NO24)和下游引物5’-TGTGCTCATGTAGTAATCACC-3’(SEQ ID NO25)。使用上游引物5’-CCAACCGTGAAAAGATGACCC-3’(SEQ ID NO26)和下游引物5’-CAGCAATGCCTGGGTACATGG-3’(SEQ ID NO27)分析β-肌動蛋白的mRNA作為各RNA樣品完整性的對照。酶活性的體外測定將質(zhì)粒pDiox II轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株XL1-blue(Stratagene公司)中以異源表達(dá)β-diox II多肽。于28℃培養(yǎng)細(xì)菌直至A600達(dá)到1.0。然后加入L-(+)-阿拉伯糖至終濃度0.8％(w/v)，并將細(xì)菌繼續(xù)培養(yǎng)3小時。收獲細(xì)菌之后，用弗氏壓碎器將它們在含50mM Tricine/KOH(pH7.6)、100mM NaCl、和1mM二硫蘇糖醇的緩沖液中破碎。將粗提物以20,000xg離心20分鐘。于4℃將上清液對相同緩沖液透析1小時。如(Nagao A、During A、Hoshino C、Terao J、Olson JA，Arch.Biochem.Biophys.，32857-63，1996)所述，加入吐溫40微團(tuán)中的β-胡蘿卜素(測定法中的終濃度是300μM β-胡蘿卜素和0.2％吐溫40)來測定粗提物(100μg總蛋白)中的酶活性。然后如(von Lintig J和Vogt K，J.Biol.Chem.，27511915-11920，2000)提取親脂性化合物并進(jìn)行HPLC分析。表達(dá)來自小鼠的兩類不同β-胡蘿卜素雙加氧酶、積累β-胡蘿卜素和番茄紅素的大腸桿茵菌株的HPLC分析將質(zhì)粒pDiox I和pDiox II轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌菌株中。培養(yǎng)條件和胡蘿卜素及其切割產(chǎn)物的分析如先前所述(von Lintig J和VogtK，J.Biol.Chem.，27511915-11920，2000)。切割產(chǎn)物的LC-MS和GC-MS質(zhì)譜將大腸桿菌菌株培養(yǎng)過夜，并離心收獲細(xì)菌。對于固相提取，將SPME注射器(100μm PDMS，Supelco，Deisenhofen，德國)在上清液中保溫15分鐘。然后將吸附至固相的化合物直接進(jìn)行GC-MS(GCHewlett-Packard 6890；MSHewlett-Packard 5973(70eV)，Waldbronn，德國)，溫度程序?yàn)橛善鹗?00℃以6℃/分鐘升至300℃。使用DB-1(30m x 0.25mm x 0.25μm薄膜厚度，J&W，F(xiàn)olsom，加拿大)作為柱，氦作為運(yùn)載氣體。對于LC-MS分析，如先前所述(von LintigJ和Vogt K，J.Biol.Chem.，27511915-11920，2000)，在存在羥胺時抽提細(xì)菌沉淀。在HP1100 HPLC模塊系統(tǒng)(Hewlett Parckard。Waldbronn，德國)上進(jìn)行LC/MS，該系統(tǒng)偶聯(lián)配備APcI界面(常壓化學(xué)離子化)的Micromass(曼徹斯特，英國)VG平臺II四極質(zhì)譜儀。使用二極管陣列檢測儀(DAD)監(jiān)測uV吸收。MS參數(shù)(APcI+型)如下來源溫度120℃；APcI探針溫度350℃；冠3.2kV；高壓透鏡0.5kV；錐電壓30V。以完全掃描模式(m/z 250-1000)操作系統(tǒng)。使用MassLynx 3.2軟件獲取并處理數(shù)據(jù)。對于峰分離，采用Bischoff(Leonberg，德國)Nucleosil RP-C18柱(5μm，250x4.6mm)并保持于25℃。流動相由乙腈/甲醇85∶15(v/v)混合物(A)和異丙醇(B)組成；梯度％A(分鐘)100(8)-70(10)-70(25)-100(28)-100(32)；流速1ml/分鐘；注射體積20μl。序列比較和系統(tǒng)發(fā)生樹分析使用載體NTI Suite 6.0(InforMax公司，牛津，英國)，產(chǎn)生的結(jié)果顯示于圖15。
使用化學(xué)藥品β-芷香酮(Roth，卡爾斯魯厄，德國)、12’-β-阿樸胡蘿卜素醛(BASF，路德維希港，德國)、和8’-β-阿樸胡蘿卜素醛(Sigma，Deisenhofen，德國)。結(jié)果搜索昆蟲EST庫以尋找vp14即植物類胡蘿卜素切割酶的同源物，發(fā)現(xiàn)了來自黑腹果蠅的已發(fā)表EST片段(編號AI063857)。為了克隆全長cDNA和直接測試β-胡蘿卜素雙加氧酶I活性，通過導(dǎo)入來自細(xì)菌草生歐文氏茵的一套β-胡蘿卜素生物合成基因(Hundle BS等人，S.a.)來構(gòu)建能夠合成并積累β-胡蘿卜素的大腸桿菌。該方法能夠通過茵落由黃色(β-胡蘿卜素)褪至幾乎白色(類視黃質(zhì))來檢測類視黃質(zhì)的形成，并提供了一種用于鑒定β-胡蘿卜素雙加氧酶I活性的快速且有效的體外測試系統(tǒng)。為此目的，由果蠅頭部分離總RNA并合成cDNA。使用衍生自EST片段的特異寡核苷酸和dT17錨定寡核苷酸進(jìn)行RACE-PCR。將得到的PCR產(chǎn)物直接克隆到表達(dá)載體pBAD-TOPO中，并轉(zhuǎn)化到所述大腸桿菌菌株中。將細(xì)胞涂布在含0.2％L-阿拉伯糖的LB培養(yǎng)基上以誘導(dǎo)推定β-胡蘿卜素雙加氧酶I的表達(dá)之后，找到幾個幾乎白色的菌落并進(jìn)行進(jìn)一步分析(圖2)。在安全紅光下進(jìn)行過夜培養(yǎng)，以使光氧化作用引起的β-胡蘿卜素的異構(gòu)化作用和非特異切割最小化。提取β-胡蘿卜素和類視黃質(zhì)并進(jìn)行HPLC分析。僅用載體轉(zhuǎn)化的對照菌株缺乏切割β-胡蘿卜素的能力，而且連痕量的類視黃質(zhì)都檢測不到。但是表達(dá)果蠅cDNA的細(xì)菌除了β-胡蘿卜素以外還包含顯著量的類視黃質(zhì)(圖3a)。通過停留時間(retention time)以及與真實(shí)標(biāo)準(zhǔn)物的共層析和通過它們的吸收光譜來鑒定類視黃質(zhì)(圖4)。占優(yōu)勢的視黃醛異構(gòu)體是全-反式形式，只有大約20％的13-順式形式。根據(jù)誘導(dǎo)后細(xì)菌的培養(yǎng)時間，還可能檢測到顯著量的全-反式視黃醇和13-順式視黃醇以及這些視黃醇異構(gòu)體的酯。所發(fā)現(xiàn)的類視黃質(zhì)異構(gòu)體與它們的β-胡蘿卜素前體的異構(gòu)組成是一致的，后者是通過分開的HPLC系統(tǒng)來鑒定的。為了確認(rèn)視黃醛的形成和改進(jìn)類視黃質(zhì)的產(chǎn)量以及分離它們的異構(gòu)體，還在存在羥胺時進(jìn)行抽提。圖3b顯示，這種處理導(dǎo)致全-反式和13-順式視黃醛肟的形成，伴隨其吸收光譜的相應(yīng)藍(lán)移。分析證明，除了視黃醛以外，大腸桿菌中還形成顯著量的視黃醇和視黃基酯(表1)。問題是，大腸桿菌是否還能夠由視黃醛生成視黃酸。為了分析視黃酸的形成，裂解細(xì)胞并使用已確立方案(Thaller C和Eichele G，Nature，327625-62814，1987)在HPLC系統(tǒng)上分析提取物。結(jié)果揭示，在這些條件下，在大腸桿菌中能夠檢測到顯著量的視黃醛和視黃醇，但是沒有形成視黃酸。
表1大腸桿菌(-)菌株 大腸桿菌(+)菌株全-反式視黃醛n.d. 4.713-順式視黃醛n.d. 1.5全-反式視黃醇n.d. 8.013-順式視黃醇n.d. 2.4n.d. 1.8∑類視黃質(zhì) -18.4β-胡蘿卜素 56.0 21.4n.d.檢測不到來自細(xì)菌培養(yǎng)物(于28℃培養(yǎng)16小時)的大腸桿菌(+)菌株和大腸桿菌(-)茵株中β-胡蘿卜素和類視黃質(zhì)的摩爾量(pmol/mg干重)。
總之，這些結(jié)果證明克隆的cDNA編碼β-胡蘿卜素雙加氧酶，相應(yīng)的，將其命名為β-diox I。既然在大腸桿菌測試系統(tǒng)中唯獨(dú)發(fā)現(xiàn)類視黃質(zhì)即C20化合物，因而可以推測對β-胡蘿卜素的中央切割得到催化，導(dǎo)致兩個分子視黃醛的形成。
為了進(jìn)一步分析β-diox I的酶特性，將cDNA克隆到表達(dá)載體pGEX-4T-1中并表達(dá)成融合蛋白。為了排除與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的N端融合會消除酶活性的可能性，將構(gòu)建物(β-diox-gex)轉(zhuǎn)化到合成β-胡蘿卜素的大腸桿茵菌株中。使用上文所述測試法，可以顯示類視黃質(zhì)的形成程度與未融合β-diox I相同(未顯示數(shù)據(jù))。在大腸桿菌中表達(dá)β-diox-gex之后，通過親和層析純化蛋白質(zhì)。無需加入去污劑就可實(shí)現(xiàn)純化，說明融合蛋白是可溶的，而且與膜不是緊密相連的。為了測試體外酶活性，將1μg純化蛋白質(zhì)在含0.05％屈立通X100的測定法中在存在β-胡蘿卜素時保溫2小時。為了分析形成的產(chǎn)物，加入羥胺/甲醇終止反應(yīng)，并在抽提后通過HPLC分析產(chǎn)物。分析揭示了視黃醛的形成(圖5)。在測定法中加入FeSO4/抗壞血酸導(dǎo)致切割產(chǎn)物的形成增加(圖5A)，而加人EDTA可以抑制β-胡蘿卜素向視黃醛的轉(zhuǎn)變(圖5C)。這些結(jié)果指示，雙加氧酶的酶促活性依賴鐵，正如在動物來源的幾種體外系統(tǒng)中所報導(dǎo)的?？傊?，迄今為止在大腸桿菌中鑒定的β-diox II酶活性同樣可以在體外用純化蛋白質(zhì)進(jìn)行測量，并導(dǎo)致相同產(chǎn)物的形成。
序列分析揭示，該cDNA編碼620個氨基酸的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO2)，計算分子量69.9kDa(圖6)。推導(dǎo)氨基酸序列與植物類視黃質(zhì)雙加氧酶vpl4、來自少動假單胞茵(Pseudomonas paucimobilis)的木質(zhì)素芪合酶、和藍(lán)細(xì)菌集胞藍(lán)細(xì)菌屬(Synechocystis)中功能未知的幾種蛋白質(zhì)享有序列同源性。然而，發(fā)現(xiàn)與RPE65(來自脊椎動物視網(wǎng)膜色素上皮的一種蛋白質(zhì)，首次描述于牛眼)有最高序列同源性。RPE65與β-diox I展示36.7％的整體序列同一性。使用程序Map進(jìn)行的β-diox I推導(dǎo)氨基酸序列、RPE65、與vp14的比對顯示獨(dú)特樣式的保守區(qū)(圖7)。與RPE65和vp14相比，昆蟲蛋白質(zhì)接近C端具有長延伸。植物蛋白質(zhì)vp14相對于其動物同源物的N端延伸很有可能歸因于用于質(zhì)體輸入的靶序列。β-diox II與細(xì)菌和植物雙加氧酶的序列同源性說明，我們正在研究存在于細(xì)菌、植物、和動物中的一種新型雙加氧酶。
通過RT-PCR研究β-diox I mRNA的表達(dá)模式。如圖8所示，mRNA唯獨(dú)限于頭部，而通過這種方法在胸部和腹部檢測不到β-diox ImRNA。雖然果蠅將3-羥基視黃醛用于視覺，但據(jù)顯示除了3-羥基類視黃質(zhì)(玉米黃質(zhì)和黃體素)以外，β-胡蘿卜素也可作為合適前體。另外，已經(jīng)證明果蠅能夠在β-芷香酮環(huán)第3位羥化視黃醛并形成非常見對映體(3S)-3-羥基視黃醛，它是環(huán)裂cyclorrhaph果蠅的獨(dú)特發(fā)色團(tuán)。這些結(jié)果證明，在果蠅中，β-胡蘿卜素切割和類視黃質(zhì)的進(jìn)一步代謝以及視覺循環(huán)都位于身體的相同部分。編碼新型胡蘿卜素雙加氧酶(β-diox II)的cDNA的克隆為了克隆編碼推定β-胡蘿卜素雙加氧酶的cDNA，我們搜索了小鼠EST數(shù)據(jù)庫并找到了與迄今為止由果蠅鑒定的β-diox I具有顯著肽序列相似性的兩個EST片段。一個EST片段(AWO44715)編碼小鼠β-dioxI(Redmond TM、Gentleman S、Duncan T、Yu S、Wiggert B、GanttE、和Cunningham FX Jr.，J.Biol.Chem.，在線，2000)，另一個(AW611061)與果蠅、雞、和小鼠β-diox I及小鼠RPE65具有顯著相似性。然而，它不是同一的，因而成為這類雙加氧酶的一種迄今未知的新代表。為了獲得全長cDNA，我們設(shè)計了由EST片段推導(dǎo)的上游引物。然后我們在衍生自7周齡BALB/c雄性小鼠肝臟的總RNA制劑上進(jìn)行了RACE-PCR。將PCR產(chǎn)物克隆到載體pBAD-TOPO中，并進(jìn)行序列分析。cDNA(SEQ ID NO16)編碼532個氨基酸的蛋白質(zhì)。序列比較揭示，推導(dǎo)氨基酸序列(SEQ ID NO17)與小鼠β，β-15，15’-雙加氧酶(β-dioxI)享有39％的序列同-性(圖10)。找到了幾個高度保守的氨基酸序列和可能涉及結(jié)合輔因子Fe2+的六個保守組氨酸，表明所編碼的蛋白質(zhì)屬于相同類型的酶。因而，除了β-diox I和RPE65以外，在小鼠中還存在第3種多烯鏈雙加氧酶即β-diox II。新型胡蘿卜素雙加氧酶催化β-胡蘿卜素的不對稱切割而導(dǎo)致β-10’-阿樸胡蘿卜素醛和β-芷香酮的形成為了在功能上鑒定β-diox II，我們將它在大腸桿菌中表達(dá)成重組蛋白，并在關(guān)于β-diox I所述條件下(Nagao A、During A、HoshinoC、Terao J、Olson JA，Arch.Biochem.Biophys.，32857-63，1996)進(jìn)行酶活性的體外測試。HPLC分析揭示未能由β-胡蘿卜素形成類視黃質(zhì)。但是可以檢測到停留時間為4.6分鐘的一種化合物(圖11A)。當(dāng)抽提過程中存在羥胺時，該化合物的停留時間由4.6分鐘變成16分鐘，指示該化合物具有醛基，由此可以形成相應(yīng)的肟(圖11B)。由新型β-胡蘿卜素雙加氧酶催化的推定β-胡蘿卜素切割產(chǎn)物在長達(dá)2小時的保溫時間里線性增加?；衔锏腢V/VIS吸收光譜與β-阿樸胡蘿卜素醛或β-阿樸胡蘿卜素醛肟類似(圖11C)。但是根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)室參照物原液的光譜比較，它們與8’-阿樸胡蘿卜素醛/肟和12’-β-阿樸胡蘿卜素醛/肟不相同。這些化合物的UV/VIS光譜與在文獻(xiàn)(Barua AB、和Olson JA，J.Nutr.，1301996-2001，2000)中找到的β-10’-阿樸胡蘿卜素醛(424nm)和β-10’-阿樸胡蘿卜素醛肟(435nm)的光譜類似。轉(zhuǎn)換率及由此形成的切割產(chǎn)物的量在體外相當(dāng)?shù)?，正如早就在?diox中所觀察到的。為了獲得大量的這種物質(zhì)用于進(jìn)一步的化學(xué)分析，我們決定利用早已成功用于鑒定果蠅β-diox I的大腸桿菌測試系統(tǒng)。表達(dá)小鼠β-diox I作為對照。在由β-胡蘿卜素形成類視黃質(zhì)的情況下，該測試系統(tǒng)提供了能夠通過細(xì)菌由黃色變成幾乎白色的顏色變化而使β-胡蘿卜素切割可視化的優(yōu)點(diǎn)。表達(dá)小鼠β-diox I的大腸桿菌變成白色，而在表達(dá)β-diox II的大腸桿菌中，看不到這種顯著的顏色變化，指示該酶催化在大腸桿菌中形成β-阿樸胡蘿卜素醛(圖12)。在表達(dá)小鼠β-diox II的大腸桿菌菌株中，β-胡蘿卜素含量顯著降低(22.8pmol/mg干重，而對照菌株為60.9pmol/mg干重)。為了鑒定這些化合物，如上所述提取這些化合物并進(jìn)行HPLC分析。可以鑒定到兩類物質(zhì)，吸收最大值分別位于424nm和386nm(圖13B和C)。具有相同光譜但停留時間不同的化合物的存在可能是由于所形成產(chǎn)物的立體異構(gòu)組成和/或由于所形成肟的順式和反式構(gòu)型。這一結(jié)果早在分析果蠅的β-diox I后就獲得了。根據(jù)誘導(dǎo)時間不同，首先可以檢測到推定的β-10’-阿樸胡蘿卜素醛，然后可檢測到推定的β-10’-阿樸胡蘿卜素醇，表明在大腸桿菌中醛轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的醇(未顯示數(shù)據(jù))。大腸桿菌中視黃醛向視黃醇的轉(zhuǎn)變早已通過表達(dá)來自果蠅或小鼠的β-diox I就發(fā)現(xiàn)了，正如本文所述(圖13A)。為了肯定的鑒定形成的推定β-10’-阿樸胡蘿卜素醛，我們將它轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的β-10’-阿樸胡蘿卜素醛肟并對其進(jìn)行LC-MS分析。因?yàn)槭窃贏PcI+模式中操作該系統(tǒng)，準(zhǔn)分子離子通常表現(xiàn)為[M+H]+信號。通過在m/z 392[M+H]+這是光譜的基峰的準(zhǔn)分子離子來鑒定10’-β-阿樸胡蘿卜素醛肟。偶數(shù)號[M+H]+質(zhì)譜信號清楚證明該化合物中氮的存在，由此可確定羥基轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的肟。沒有觀察到多烯鏈的片段化(產(chǎn)生特征性子離子)。另外，在405nm(肩)、424nm、和446nm顯示最大值的特征性UV光譜符合10’-β-阿樸胡蘿卜素醛肟的發(fā)色團(tuán)系統(tǒng)，而且與先前報導(dǎo)的光譜數(shù)據(jù)(Barua AB和0lson JA，J.Nutr.，1301996-2001，2000)是一致的。
由此，由β-胡蘿卜素形成了β-10’-阿樸胡蘿卜素醛。但是通過HPLc未能檢測到應(yīng)當(dāng)由對β-胡蘿卜素9’、10’雙鍵的氧化切割產(chǎn)生的第二種化合物即β-芷香酮。這可以是由于它的揮發(fā)性和/或由于它分配到培養(yǎng)基中。因此，我們在固相提取親脂性化合物后通過GC-MS分析了細(xì)菌生長培養(yǎng)基。在這種大腸桿菌菌株的培養(yǎng)基中，除了大量的吲哚以外，還可以檢測到顯著量的β-芷香酮，而在大腸桿菌對照菌株中未能發(fā)現(xiàn)?？傊?，這些分析證明β-diox II催化對β-胡蘿卜素在9’、10’碳雙鍵的不對稱切割，導(dǎo)致β-10’-阿樸胡蘿卜素醛和β-芷香酮的形成。因此，我們將該酶稱為β-β-胡蘿卜素-9’，10’-雙加氧酶(β-diox II)。但是應(yīng)當(dāng)注意的是，來自本文未鑒定的其它來源的β-dioxII可能攻擊其它雙鍵。因此，β-diox II的活性即不對稱切割β-胡蘿卜素不限于上文公開的9’、10’碳雙鍵。
為了測試該酶是否催化對不同于β-胡蘿卜素的胡蘿卜素的氧化切割，我們將它轉(zhuǎn)化到能夠合成并積累番茄紅素的大腸桿菌菌株中(圖12)。如上所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在該菌株中，能夠檢測到顯著量的推定阿樸番茄紅素醛。這可以通過將醛轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的肟來顯示(未顯示數(shù)據(jù))。因此，這種新型胡蘿卜素雙加氧酶在大腸桿菌測試系統(tǒng)中同樣催化對番茄紅素的氧化切割，導(dǎo)致阿樸番茄紅素醛(暫時通過它們的UV/VIS光譜來鑒定)的形成。由人和斑馬魚克隆編碼新型胡蘿卜素雙加氧酶的cDNA為了確認(rèn)其它后生動物中存在這第二類雙加氧酶，我們在數(shù)據(jù)庫中搜索具有序列同一性的EST片段。我們找到了來自人和斑馬魚的EST片段。然后我們克隆了全長cDNA并測序。由衍生自人肝的總RNA克隆的cDNA(SEQ ID NO20)編碼556個氨基酸的蛋白質(zhì)(SEQID NO21)。而由斑馬魚分離的cDNA(SEQ ID NO18)編碼549個氨基酸的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO19)。推導(dǎo)氨基酸序列與小鼠β-diox II享有72和49％的序列同一性。我們進(jìn)行了基于序列距離法的系統(tǒng)樹計算并利用與后生動物多烯鏈雙加氧酶和植物VP14推導(dǎo)氨基酸序列的鄰接算法。如圖15所示，在脊椎動物中發(fā)現(xiàn)了三組多烯鏈雙加氧酶-兩類不同的β-胡蘿卜素雙加氧酶(I和II)和RPE65。在果蠅和Caenorhabditiselegans中，在整個基因組中只找到了一類雙加氧酶(I)。根據(jù)大腸桿菌測試系統(tǒng)的判斷，C.elegans雙加氧酶催化對β-胡蘿卜素的對稱切割而形成視黃醛。序列分析揭示，三種脊椎動物多烯鏈雙加氧酶很有可能來自共同祖先。因此，編碼這類酶的其它基因即β-diox和RPE65的存在顯然與脊椎動物胡蘿卜素/類視黃質(zhì)代謝有關(guān)。新型胡蘿卜素雙加氧酶的組織特異性表達(dá)我們分析了來自7周齡BALB/c小鼠(雄性和雌性)的幾種組織的總RNA，并通過RT-PCR評估了兩類胡蘿卜素雙加氧酶的穩(wěn)定狀態(tài)mRNA水平。在小腸、肝、腎、和睪丸中能夠檢測到兩類胡蘿卜素雙加氧酶mRNA的RT-PCR產(chǎn)物。在脾和腦中還存在該新型胡蘿卜素雙加氧酶的mRNA，在肺和心中能夠檢測到兩類胡蘿卜素雙加氧酶的低豐度穩(wěn)態(tài)mRNA水平(圖16)。通過分析β-肌動蛋白mRNA確認(rèn)了RNA制劑的完整性。通過在測定法中省略逆轉(zhuǎn)錄酶，可以顯示RT-PCR產(chǎn)物衍生自mRNA而非DNA污染。通過用人cDNA riboprobe分析的多組織mRNA印跡，我們可以在心和肝中發(fā)現(xiàn)新型胡蘿卜素雙加氧酶的2.2kb信使，而主要在腎中觀察到β-diox II的2.4kb轉(zhuǎn)錄本(未顯示數(shù)據(jù))。反映上述結(jié)果的討論依照本發(fā)明，果蠅β-diox I是在分子水平上鑒定的第一種β-胡蘿卜素雙加氧酶。在研究本發(fā)明原理的實(shí)驗(yàn)過程中，可以證明有兩種由β-胡蘿卜素作為底物開始的可替換途徑，其特征為具有同源β-diox I和II基因類型的不同酶活性。本文公開的信息提供了打開進(jìn)一步研究動物中類胡蘿卜素/類視黃質(zhì)代謝的廣闊領(lǐng)域的鑰匙。
β-diox I編碼620個氨基酸的蛋白質(zhì)，計算分子量69.9kDa。序列比較揭示β-diox I屬于迄今為止只在細(xì)菌和植物中發(fā)現(xiàn)的新型雙加氧酶。可以在關(guān)于植物類胡蘿卜素切割酶vp14所報導(dǎo)的相同條件下測量β-diox I的酶活性，前者在ABA生物合成途徑中負(fù)責(zé)切割9-順式-新黃素。在動物中，已經(jīng)報導(dǎo)了β-胡蘿卜素雙加氧酶活性依賴鐵。向測定法中加入FeSO4/抗壞血酸導(dǎo)致酶活性升高，而加入EDTA顯著減少視黃醛的形成。可以不加入輔因子諸如硫醇試劑或電子受體而測量酶活性。這指示β-diox II依賴Fe2+，而且酶活性不需要其它輔因子，正如關(guān)于植物vp14所報導(dǎo)的。既然β-胡蘿卜素在水性環(huán)境下是不溶的，就在存在0.05％屈立通X100時進(jìn)行酶活性的測試。在體內(nèi)，β-胡蘿卜素是不能自由擴(kuò)散的，而是必須結(jié)合親脂性結(jié)構(gòu)諸如膜或結(jié)合蛋白。因此，問題是β-diox是否結(jié)合膜而與其親脂性底物發(fā)生相互作用?？梢詿o需加入去污劑而純化β-diox融合蛋白，這針對的是它的可溶狀態(tài)而非膜結(jié)合拓?fù)鋵W(xué)。但是融合蛋白的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶部分也可能有助于它的可溶性。既然果蠅的視覺發(fā)色團(tuán)是3-羥基視黃醛，我們測試了β-diox I是否能夠使用玉米黃質(zhì)作為底物而直接形成這種羥化類視黃質(zhì)，但是在我們所應(yīng)用的條件下，該酶未能催化這種反應(yīng)。另外，我們在積累玉米黃質(zhì)的大腸桿菌菌株中表達(dá)β-diox I，但是只能夠檢測到未羥化類視黃質(zhì)的形成。在這種大腸桿菌菌株中，發(fā)現(xiàn)了顯著量的β-胡蘿卜素即玉米黃質(zhì)的直接前體，它可以作為β-diox I的底物。這一結(jié)果的解釋可能在于果蠅能夠在β-芷香酮環(huán)第3位羥化視黃醛的事實(shí)。總之，我們能夠顯示β-diox I催化對β-胡蘿卜素的對稱切割。
β-diox I基因位于果蠅基因組中3號染色體的87F。已經(jīng)通過細(xì)胞學(xué)方法將果蠅突變體ninaB正好定位在這一區(qū)域(FlyBase Mapseotion 87)。在所有類型的光受體中，突變體表型具有降低的視紫質(zhì)含量。但是可以通過飲食添加視黃醛來挽救突變體表型，而甚至更高劑量的β-胡蘿卜素卻不能。視覺色素發(fā)色團(tuán)的有效性和視黃酸對視覺色素蛋白質(zhì)模塊(視蛋白)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控二者都依賴β-diox II酶活性。因此，似乎有可能ninaB表型是由β-diox I中的突變引起的。
發(fā)現(xiàn)β-diox I與RPE65(首次描述于牛眼的一種多邊合作)有最高序列同源性。因此，問題是RPE65是否是β-diox I的脊椎動物相應(yīng)物。雖然尚不知道RPE65的準(zhǔn)確功能，已經(jīng)有人提出它在維生素A代謝中發(fā)揮作用，最近發(fā)現(xiàn)該基因中的突變對人早期發(fā)作視黃醛營養(yǎng)不良的嚴(yán)重形式負(fù)有責(zé)任。在破壞了RPE65基因的小鼠眼中，全-反式維生素A發(fā)生積累。由此得出結(jié)論，RPE65參與哺乳動物視覺循環(huán)中維生素A全-反式向11-順式的異構(gòu)化。但是由RPE-膜級分除去RPE65之后，全-反式視黃醇向11-順式視黃醇的異構(gòu)化不受影響。根據(jù)我們的知識，在RPE中從未報導(dǎo)過β-胡蘿卜素雙加氧酶活性，在脊椎動物的眼中也從未測量到顯著量的它的底物β-胡蘿卜素。我們在所述測試系統(tǒng)中表達(dá)了通過RT-PCR由牛RPE克隆的RPE65，但是未能檢測到類視黃質(zhì)的形成或偏心切割產(chǎn)物諸如阿樸胡蘿卜素醛的形成。因此，RPE65的準(zhǔn)確功能仍需進(jìn)一步研究，我們推測其它尚未發(fā)現(xiàn)的具有不同組織特異性(小腸、肝)的該家族成員負(fù)責(zé)脊椎動物β-胡蘿卜素雙加氧酶活性。β-diox I與RPE65以及植物和細(xì)菌雙加氧酶的序列同源性說明我們正在研究催化切割共軛碳雙鍵的新型雙加氧酶。這種反應(yīng)類型涉及對類胡蘿卜素的切割以及多種其它化合物。所述大腸桿茵測試系統(tǒng)提供了鑒定涉及類視黃質(zhì)形成的新基因和篩選本發(fā)明酶的潛在激動劑或拮抗劑的有力工具。另外，生成類視黃質(zhì)的大腸桿茵菌株可成功的用于鑒定胡蘿卜素/類視黃質(zhì)代謝的其它步驟。
依照本發(fā)明的另一方面，我們報導(dǎo)了來自小鼠、人、和斑馬魚且催化對β-胡蘿卜素的不對稱切割的第二種新型胡蘿卜素雙加氧酶的克隆、鑒定、和組織特異性表達(dá)。通過在合成β-胡蘿卜素的大腸桿茵茵株中表達(dá)該酶，顯示了由β-胡蘿卜素形成β-阿樸胡蘿卜素醛。可以通過吸收光譜、醛向相應(yīng)肟的轉(zhuǎn)變、和通過LC-MS或GC-MS來鑒定所形成的切割產(chǎn)物是β-10’-阿樸胡蘿卜素醛和β-芷香酮。在體外，酶催化與大腸桿菌測試系統(tǒng)中相同的反應(yīng)。因此，所鑒定的酶催化對其底物β-胡蘿卜素的多烯主鏈中9’、10’雙鍵的氧化切割。
除了上文討論的與β-diox I的整體序列同一性以外，還存在獨(dú)特保守樣式的組氨酸殘基，它們可能涉及輔因子Fe2+的結(jié)合。因而，包括RPE65在內(nèi)，在脊椎動物中發(fā)現(xiàn)了多烯鏈雙加氧酶家族的三種不同代表。RPE65蛋白質(zhì)的生化功能仍待闡明，我們顯示除了對β-胡蘿卜素的對稱切割以外還發(fā)生不對稱切割，斷然解決了關(guān)于這種反應(yīng)的意義的爭論。關(guān)于組織特異性表達(dá)的分析顯示，在幾種組織(如小腸和肝)中-起發(fā)現(xiàn)了兩類酶的mRNA。這些發(fā)現(xiàn)在分子水平上確認(rèn)了在相同組織中存在對β-胡蘿卜素的對稱和不對稱切割二者這一生化結(jié)果。小鼠與人中的表達(dá)模式是不一致的。這可能是由于胡蘿卜素代謝的物種間差異，或是反映所研究個體的年齡和營養(yǎng)狀況的差異，因而有可能存在另一種因素可用于解釋在幾次研究中獲得的相互矛盾的結(jié)果。在用組織勻漿物進(jìn)行的早期研究中，可以發(fā)現(xiàn)由不對稱切割β-胡蘿卜素產(chǎn)生的不同鏈長的多種β-阿樸胡蘿卜素醛。因此，幾位作者將術(shù)語隨機(jī)切割用于這種反應(yīng)。在這里，我們顯示了酶β-diox II不催化這種副反應(yīng)，而是對9’、10’雙鍵特異的。在體外發(fā)現(xiàn)的不同于10’-β-阿樸胡蘿卜素醛的β-阿樸胡蘿卜素醛的形成可能是由初級切割產(chǎn)物的進(jìn)一步代謝或其它尚不知道的胡蘿卜素雙加氧酶引起的。但是難以獲得后生動物多烯鏈雙加氧酶的體外活性，而且已經(jīng)報導(dǎo)了在水性環(huán)境中通過非酶促降解而由β-胡蘿卜素形成β-阿樸胡蘿卜素醛(Henry LK、Puspitasari-Nienaber NL、Jaren-Galan M、van Breemen RB、Catignani GL、和Schwartz SJ，J.Agric.Food Chem.，485008-5013，2000)在對編碼這種新型胡蘿卜素雙加氧酶(β-diox II)的cDNA進(jìn)行分子鑒定之后，即產(chǎn)生了其在脊椎動物胡蘿卜素代謝中的生理學(xué)相關(guān)性的問題。已經(jīng)在大鼠和雞中顯示β-阿樸胡蘿卜素醛可以是RA形成的生物學(xué)活潑前體。在吸收這些化合物之后，首先形成相應(yīng)的酸，然后變短產(chǎn)生視黃酸。相同研究還顯示只有小部分的β-阿樸胡蘿卜素醛受到β-diox的攻擊而產(chǎn)生視黃醛。這種可能性對于考慮如本文所述在幾種組織中共表達(dá)兩類雙加氧酶而言可能是重要的。還發(fā)現(xiàn)幾種組織能夠合成RA，而且發(fā)現(xiàn)視黃醛即對稱切割β-胡蘿卜素的初級產(chǎn)物并不是中間物。通過分析由β-阿樸胡蘿卜素醛形成RA，提出了與脂肪酸β-氧化相似的機(jī)制。在這些研究中，通過給予檸檬醛-視黃醛脫氫酶(催化將視黃醛氧化成RA)的有效抑制劑，可以確保了由β-阿樸胡蘿卜素醛形成RA。因此，不對稱切割反應(yīng)很有可能代表RA形成另外途徑的第一步，而且可能有助于身體、某些組織、或細(xì)胞中的RA穩(wěn)態(tài)。由不對稱切割β-芷香酮產(chǎn)生的第二種產(chǎn)物已知是植物香氣化合物。這種短鏈化合物是揮發(fā)性的，而在動物中的推定生理學(xué)作用仍待研究。
在果蠅中，維生素A是專一地通過對稱切割反應(yīng)而形成的。在脊椎動物中，發(fā)現(xiàn)有兩類不同的胡蘿卜素雙加氧酶β-diox I和β-diox II以及RPE65蛋白質(zhì)。序列比較顯示，脊椎動物雙加氧酶來自共同祖先。與果蠅相反，在脊椎動物中，RA在發(fā)育和細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用。因而，不同β-胡蘿卜素雙加氧酶的存在可能與RA作用的出現(xiàn)有關(guān)。通過斑馬魚胚胎的原位雜交，在原腸胚形成之前發(fā)現(xiàn)了β-diox的斑馬魚同源物的高穩(wěn)態(tài)mRNA水平。只在器官形成之后可檢測到β-胡蘿卜素-9’，10’-雙加氧酶的斑馬魚同源物。關(guān)于小鼠已經(jīng)報導(dǎo)了在發(fā)育早期發(fā)現(xiàn)有β-diox I的高穩(wěn)態(tài)mRNA水平(Redmond TM、Gentleman S、DuncanT、Yu S、Wiggert B、Gantt E、和Cunningham FX Jr.，J.Biol.Chem.，在線，2000)。這表明，由對稱氧化切割反應(yīng)催化的由β-胡蘿卜素形成類視黃質(zhì)可能有助于胚胎中的類視黃質(zhì)穩(wěn)態(tài)。因此，除了母源預(yù)先形成的維生素A，由維生素原開始的從頭生物合成似乎是發(fā)育過程中類視黃質(zhì)的重要來源。但是不對稱切割反應(yīng)在發(fā)育晚期在某些組織中可能有助于RA形成。關(guān)于這一點(diǎn)，β-diox II在腦和肺中的表達(dá)可能是有關(guān)聯(lián)的。在神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞分化過程中，RA發(fā)揮重要作用。在雪貂模型中，在某些條件下，諸如暴露于香煙的煙霧，報導(dǎo)了β-胡蘿卜素對肺的毒性。關(guān)于這一點(diǎn)，有人爭論對β-胡蘿卜素的不對稱切割可能涉及這些毒性作用(回顧參閱Russell RM，Am.J.Clin.Nutr.，71878-884，2000)。另外，已經(jīng)在體外在睪丸、小腸、肝、腎、和肺中發(fā)現(xiàn)了可由β-胡蘿卜素形成RA。在這里我們顯示，在所有這些組織中發(fā)現(xiàn)了編碼兩種不同類型胡蘿卜素雙加氧酶的mRNA。這說明，除了小腸和肝以外，還有幾種組織可能通過由β-胡蘿卜素內(nèi)源形成類視黃質(zhì)而促進(jìn)它們自身的RA穩(wěn)態(tài)，這是類視黃質(zhì)穩(wěn)態(tài)中至今仍被低估、未受賞識的特征。
正如在大腸桿菌測試系統(tǒng)中所判斷的，該酶能夠催化對番茄紅素的氧化切割。這表明胡蘿卜素的多烯鏈主鏈在底物特異性方面發(fā)揮重要作用，而β-胡蘿卜素的芷香酮環(huán)結(jié)構(gòu)似乎關(guān)聯(lián)微小。在分析了小鼠β-diox I之后也獲得了這一結(jié)果。已經(jīng)報導(dǎo)了番茄紅素對人健康的有利影響。番茄紅素主要在肝中積累，但也在腸、前列腺、和睪丸(即表達(dá)β-diox I和β-diox II二者的mRNA的組織)中積累。對番茄紅素的切割和阿樸番茄紅素醛的形成是脊椎動物生理學(xué)中推定作用的指示。在脊椎動物中，存在配體未知的幾種核受體，如孤兒受體。除了在β-胡蘿卜素切割的情況下可能是RA形成的推定前體之外，可以推測，通過β-胡蘿卜素和/或番茄紅素的不對稱切割反應(yīng)形成的化合物還可能代表這些受體的推定配體。
總之，本文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)對催化β-胡蘿卜素的不對稱切割的酶即β-胡蘿卜素-9’，10’-雙加氧酶進(jìn)行了分子鑒定。因而，除了β-胡蘿卜素的對稱切割之外，在脊椎動物中還存在第二種酶活性。涉及切割β-胡蘿卜素的酶的分子鑒定將為研究衍生自胡蘿卜素的代謝物對動物生理和人類健康的影響開辟了新的道路。
最近幾年，對類視黃質(zhì)受體及其配體以及它們在發(fā)育和細(xì)胞分化中的各種作用的了解有了極大進(jìn)步。憑借本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)，切割反應(yīng)對組織分布的影響、類視黃質(zhì)的異構(gòu)特異性、和維生素A攝取的調(diào)控不久可能得到進(jìn)一步闡明。
另外，編碼β-胡蘿卜素雙加氧酶I和II的cDNA的鑒定對醫(yī)學(xué)、制藥學(xué)、和生物技術(shù)的應(yīng)用具有極大影響。在醫(yī)學(xué)中，由人或哺乳動物克隆相應(yīng)基因能夠更詳細(xì)的在生理學(xué)上表征哺乳動物胡蘿卜素/類視黃質(zhì)代謝，并將影響由維生素A及其衍生物引起的多種作用，由此可提供幾種治療性應(yīng)用。
已知維生素A缺乏是-個嚴(yán)重問題。配備必需調(diào)控序列的cDNA可用于在不含類視黃質(zhì)的生物體諸如大多數(shù)植物、大多數(shù)細(xì)菌、和真菌中進(jìn)行表達(dá)。因此，依照本發(fā)明可以在用于食品工藝的農(nóng)作物和微生物中實(shí)現(xiàn)維生素A生產(chǎn)，或更常說的，在至今不含類視黃質(zhì)但能夠合成維生素A原(β-胡蘿卜素)的生物體中生產(chǎn)維生素A。
顯然，根據(jù)上文傳授，本發(fā)明的許多修改和變異是可能的。因此，應(yīng)當(dāng)理解，在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)，可以不同于本文具體所述而實(shí)踐本發(fā)明。
序列表<110>greenovation Pflanzenbiotechnoloaie GmbH<120>催化切割β-胡蘿卜素的雙加氧酶<130>催化切割β-胡蘿卜素的雙加氧酶<140><141><150>00105822.1<151>2000-03-20<150>99125895.5<151>1999-12-24<160>27<170>PatentIn 2.1版<210>1<211>2037<212>DNA<213>黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)<220><221>CDS<222>(1)..(1860)<400>1atg gca gcc ggt gtc ttc aag agt ttt atg cgc gac ttc ttt gcg gtg48Met Ala Ala Gly Val Phe Lys Ser Phe Met Arg Asp Phe Phe Ala Val1 5 10 15aaa tac gat gag cag cga aat gat ccg caa gcg gaa cga ctg gat ggc96Lys Tyr Asp Glu Gln Arg Asn Asp Pro Gln Ala Glu Arg Leu Asp Gly20 25 30aac gga cga ctg tat ccc aac tgc tcg tcg gat gtg tgg ctg cga tcc144Asn Gly Arg Leu Tyr Pro Asn Cys Ser Ser Asp Val Trp Leu Arg Ser35 40 45tgc gag cgg gag ata gtt gat ccc att gag ggc cat cac agc ggg cac192Cys Glu Arg Glu Ile Val Asp Pro Ile Glu Gly His His Ser Gly His50 55 60att ccc aaa tgg ata tgc ggt agt ctg ttg cgc aat gga ccc ggc agc240Ile Pro Lys Trp Ile Cys Gly Ser Leu Leu Arg Asn Gly Pro Gly Ser65 70 75 80tgg aag gtg ggc gac atg acc ttc ggc cat ctg ttc gac tgc tcc gcc288Trp Lys Val Gly Asp Met Thr phe Gly His Leu Phe Asp Cys Ser Ala85 90 95ctg ctg cac cga ttt gcc att cgg aat gga cgc gtc acc tac cag aat336Leu Leu His Arg Phe Ala Ile Arg Asn Gly Arg Val Thr Tyr Gln Asn100 105 110cgc ttc gtg gac acg gaa aca ctg cga aag aat cgc tct gcc cag cgg384Arg phe Val Asp Thr Glu Thr Leu Arg Lys Asn Arg Ser Ala Gln Arg115 120 125att gtg gtc acg gag ttt ggc aca gct gct gtt ccg gat ccc tgt cac432Ile Val Val Thr Glu Phe Gly Thr Ala Ala Val Pro Asp Pro Cys His130 135 140tcg atc ttc gat aga ttt gcg gcc att ttt cga ccg gat agt gga acg480Ser Ile Phe Asp Arg Phe Ala Ala Ile Phe Arg Pro Asp Ser Gly Thr145 150 155 160gat aac tcg atg att tcc ara tat cct ttc ggg gat cag tat tac aca528Asp Ash Ser Met Ile Ser Ile Tyr Pro Phe Gly Asp Gln Tyr Tyr Thr165 170 175ttt acg gag acg cct ttt atg cat aga ata aat ccc tgc act ttg gcc576Phe Thr Glu Thr Pro Phe Met His Arg Ile Ash Pro Cys Thr Leu Ala180 185 190acc gaa gca cga atc tgc acc acc gac ttc gtg ggc gtg gtg aac cac624Thr Glu Ala Arg Ile Cys Thr Thr Asp Phe Val Gly Val Val Asn His195 200 205aca tcg cat ccg cat gtt ctt ccc agt ggc act gtc tac aac ctg ggc672Thr Ser His Pro His Val Leu Pro Ser Gly Thr Val Tyr Asn Leu Gly210 215 220acc aca atg acc aga tct gga ccg gca tac act ata crc agt ttc ccg720Thr Thr Met Thr Arg Ser Giy Pro Ala Tyr Thr Ile Leu Ser Phe Pro225 230 235 240cac ggc gag cag atg ttc gag gat gct cat gtg gtg gcc aca ctg ccg768His Gly Glu Gln Met Phe Glu Asp Ala His Val Val Ala Thr Leu Pro245 250 255tgc cgc tgg aaa ctg cat ccc ggt tat atg cac acc ttc ggc tta acg816Cys Arg Trp Lys Leu His Pro Gly Tyr Met His Thr Phe Gly Leu Thr260 265 270gat cac tac ttt gtg att gtg gag cag ccg ttg tcc gtt tcg ctt acg864Asp His Tyr Phe Val Ile Val Glu Gln Pro Leu Ser Val Ser Leu Thr275 280 285gag tat atc aaa gcc cag cra ggt gga cag aat tta tcg gcg tgt crc912Glu Tyr Ile Lys Ala Gln Leu Gly Gly Gln Asn Leu Ser Ala Cys Leu290 295 300aag tgg ttc gag gat cga ccg aca cra ttt cac ctt ata gat cgg gtt960Lys Trp Phe Glu Asp Arg Pro Thr Leu Phe His Leu Ile Asp Arg Val305 310 315 320tcc ggc aaa ctg gtg cag acc tac gaa tcg gaa gcc ttc ttc tac ctg1008Ser Gly Lys Leu Val Gln Thr Tyr Glu Ser Glu Ala Phe Phe Tyr Leu325 330 335cac arc atc aac tgc ttt gaa cgg gat ggc cac gtg gtg gtg gac att1056His Ile Ile Asn Cys Phe Glu Arg Asp Gly His Val Val Val Asp Ile340 345 350tgc agc tac agg aat ccc gag atg atc aac tgc atg tat ctg gag gcc1104Cys Ser Tyr Arg Asn Pro Glu Met Ile Asn Cys Met Tyr Leu Glu Ala355 360 365att gcc aat atg caa acg aat ccc aat tat gct acc crc ttt cgt gga1152Ile Ala Asn Met Gln Thr Asn Pro Asn Tyr Ala Thr Leu Phe Arg Gly
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210 215 220Pro Gly Glu Lys Gln Asp Asp Asp Ala Asp Leu Ser Gly Ala Glu Ile225 230 235 240Leu Cys Ser Ile Pro Ala Ala Asp Pro Arg Lys Pro Ser Tyr Tyr His245 250 255Ser Phe Val Met Ser Glu Asn Tyr Ile Val Phe Ile Glu Gln Pro Ile260 265 270Lys Leu Asp Leu Leu Lys Phe Met Leu Tyr Arg Ile Ala Gly Lys Ser275 280 285Phe His Lys Val Met Ser Trp Asn Pro Glu Leu Asp Thr Ile Phe His290 295 300Val Ala Asp Arg His Thr Gly Gln Leu Leu Asn Thr Lys Tyr Tyr Ser305 310 315 320Ser Ala Met Phe Ala Leu His Gln Ile Asn Ala Tyr Glu Glu Asn Gly325 330 335Tyr Leu Ile Met Asp Met Cys Cys Gly Asp Asp Gly Asn Val Ile Gly340 345 350Glu Phe Thr Leu Glu Asn Leu Gln Ser Thr Gly Glu Asp Leu Asp Lys355 360 365Phe Phe Asn Ser Leu Cys Thr Asn Leu Pro Arg Arg Tyr Val Leu Pro370 375 380Leu Glu Val Lys Glu Asp Glu Pro Asn Asp Gln Asn Leu Ile Asn Leu385 390 395 400Pro Tyr Thr Thr Ala Ser Ala Val Lys Thr Gln Thr Gly Val Phe Leu405 410 415Tyr His Glu Asp Leu Tyr Asn Asp Asp Leu Leu Gln Tyr Gly Gly Leu420 425 430Glu Phe Pro Gln 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Ala Ser Thr Glu Lys245 250 255Gly Lys Pro Ser Tyr Tyr His Ser Phe Gly Met Thr Arg Asn Tyr Ile260 265 270Ile Phe Ile Glu Gln Pro Leu Lys Met Asn Leu Trp Lys Ile Ala Thr275 280 285Ser Lys Ile Arg Gly Lys Ala Phe Ser Asp Gly Ile Ser Trp Glu Pro290 295 300Gln Cys Asn Thr Arg Phe His Val Val Glu Lys Arg Thr Gly Gln Leu305 310 315 320Leu Pro Gly Arg Tyr Tyr Ser Lys Pro Phe Val Thr Phe His Gln Ile325 330 335Asn Ala Phe Glu Asp Gln Gly Cys Val Ile Ile Asp Leu Cys Cys Gln340 345 350Asp Asn Gly Arg Thr Leu Glu Val Tyr Gln Leu Gln Asn Leu Arg Lys355 360 365Ala Gly Glu Gly Leu Asp Gln Val His Asn Ser Ala Ala Lys Ser Phe370 375 380Pro Arg Arg Phe Val Leu Pro Leu Asn Val Ser Leu Asn Ala Pro Glu385 390 395 400Gly Asp Asn Leu Ser Pro Leu Ser Tyr Thr Ser Ala Ser Ala Val Lys405 410 415Gln Ala Asp Gly Thr Ile Cys Cys Ser His Glu Asn Leu His Gln Glu420 425 430Asp Leu Glu Lys Glu Gly Gly Ile Glu Phe Pro Gln Ile Tyr Tyr Asp435 440 445Arg Phe Ser Gly Lys Lys Tyr His Phe Phe Tyr Gly Cys Gly Phe Arg450 455 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21<210>27<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述β-肌動蛋白RT-PCR下游引物<400>27cagcaatgcc tgggtacatg g 2權(quán)利要求
1.具有特異切割β-胡蘿卜素和番茄紅素而分別形成β-阿樸胡蘿卜素醛和β-芷香酮及阿樸番茄紅素醛的生物學(xué)活性的分離β-胡蘿卜素雙加氧酶(β-diox II)多肽或其功能片段。
2.依照權(quán)利要求1的β-diox II多肽或其功能片段，其包含選自下組的一種或多種氨基酸序列SEQ ID NO17的第39-47位、第96-118位、第361-368位、和第466-487位，SEQ ID NO19的第55-63位、第112-134位、第378-385位、和第482-503位，SEQ ID NO21的第59-67位、第116-138位、第385-392位、和第490-511位氨基酸序列。
3.依照權(quán)利要求1或2的β-diox II多肽或其功能片段，其具有與SEQ ID NO17、19、或21中所列氨基酸序列至少45％同一的氨基酸序列。
4.依照權(quán)利要求1或2的β-diox II多肽或其功能片段，其具有與SEQ ID NO17、19、或21中所列氨基酸序列至少60％同一的氨基酸序列。
5.依照權(quán)利要求1或2的β-diox II多肽或其功能片段，其具有與SEQ ID NO17、19、或21中所列氨基酸序列至少75％同一的氨基酸序列。
6.依照權(quán)利要求1或2的β-diox II多肽或其功能片段，其具有與SEQ ID NO17、19、或21中所列氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。
7.依照權(quán)利要求1或2的β-diox II多肽或其功能片段，其具有SEQ ID NO17、19、或21中所列氨基酸序列或其部分。
8.依照權(quán)利要求1或2的β-diox II多肽或其功能片段，其具有由選自下組的DNA序列編碼的氨基酸序列(1)SEQ ID NO16和/或SEQ ID NO18和/或SEQ ID NO20中所列DNA序列或其互補(bǔ)鏈；和(2)SEQ ID NO16的第115-141位、第286-354位、第1081-1104位、和第1396-1461位DNA序列或其互補(bǔ)鏈；和(3)SEQ ID NO18的第191-217位、第362-430位、第1160-1183位、和第1472-1537位DNA序列或其互補(bǔ)鏈；和(4)SEQ ID NO20的第175-201位、第346-414位、第1153-1176位、和第1468-1533位DNA序列或其互補(bǔ)鏈；和(5)在高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與(1)、(2)、(3)、和(4)中所定義的DNA序列或其互補(bǔ)鏈發(fā)生雜交的DNA序列或其功能片段；和(6)若非遺傳密碼的簡并性將與(1)、(2)、(3)、(4)、和(5)中所定義的DNA序列發(fā)生雜交的DNA序列。
9.包含編碼依照權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的β-diox II多肽或其功能片段的DNA序列的DNA分子。
10.包含用于保證β-diox II多肽或其功能片段的表達(dá)或者用于測定所述多肽或其功能片段的特征性核酸的存在的DNA序列的DNA分子，所述多肽或其功能片段具有特異切割β-胡蘿卜素和番茄紅素而分別形成β-阿樸胡蘿卜素醛和β-芷香酮及阿樸番茄紅素醛的生物學(xué)活性，所述核酸選自下組(1)SEQ ID NO16和/或SEQ ID NO18和/或SEQ ID NO20中所列DNA序列或其互補(bǔ)鏈；和(2)SEQ ID NO16的第115-141位、第286-354位、第1081-1104位、和第1396-1461位DNA序列或其互補(bǔ)鏈；和(3)SEQ ID NO18的第191-217位、第362-430位、第1160-1183位、和第1472-1537位DNA序列或其互補(bǔ)鏈；和(4)SEQ ID NO20的第175-201位、第346-414位、第1153-1176位、和第1468-1533位DNA序列或其互補(bǔ)鏈；和(5)在高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與(1)、(2)、(3)、和(4)中所定義的DNA序列或其互補(bǔ)鏈發(fā)生雜交的DNA序列或其功能片段；和(6)若非遺傳密碼的簡并性將與(1)、(2)、(3)、(4)、和(5)中所定義的DNA序列發(fā)生雜交的DNA序列。
11.依照權(quán)利要求9或10的DNA分子，其所包含的DNA序列是cDNA、基因組、或人造DNA序列。
12.依照權(quán)利要求9-11任一項(xiàng)的DNA分子，其包含至少一種選擇標(biāo)記基因或cDNA，它可操作連接允許其在細(xì)茵、真菌包括酵母、昆蟲、動物、或植物細(xì)胞、種子、組織、或完整生物體中表達(dá)的組成性、誘導(dǎo)性、或組織特異性啟動子序列。
13.依照權(quán)利要求9-12任一項(xiàng)的DNA分子，其中編碼核苷酸序列與合適質(zhì)體運(yùn)輸肽編碼序列相融合，二者都優(yōu)選在組織特異性或組成性啟動子的控制下表達(dá)。
14.包含依照權(quán)利要求9-13任一項(xiàng)的一種或多種DNA分子的質(zhì)?；蜉d體系統(tǒng)。
15.用于生成β-diox II多肽的方法，包括下列步驟(1)在合適宿主中表達(dá)由依照權(quán)利要求9-14中任一項(xiàng)的DNA編碼的多肽，并(2)分離所述β-diox II多肽。
16.由權(quán)利要求15的方法獲得的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。
17.以適當(dāng)方式用依照權(quán)利要求9-13任一項(xiàng)的DNA分子或者用依照權(quán)利要求14的質(zhì)?；蜉d體系統(tǒng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核宿主細(xì)胞、種子、組織、或完整生物體，所述方式使得所述宿主細(xì)胞、種子、組織、或完整生物體能夠表達(dá)具有特異切割β-胡蘿卜素和番茄紅素而分別形成β-阿樸胡蘿卜素醛和β-芷香酮及阿樸番茄紅素醛的生物學(xué)活性和/或具有特異結(jié)合針對所述多肽或其功能片段所制備的抗體的能力的多肽或其功能片段。
18.依照權(quán)利要求17的原核或真核宿主細(xì)胞、種子、組織、或完整生物體，其選自下組細(xì)菌、真菌包括酵母、昆蟲、動物、和植物細(xì)胞、種子、組織、或完整生物體。
19.依照權(quán)利要求18的原核宿主細(xì)胞或完整生物體，其是選自下組的細(xì)菌原細(xì)菌，包括α、β、γ、δ、和ε亞門的成員；革蘭氏陽性細(xì)菌，包括放線茵綱(Actinomycetes)、硬壁茵門(Firmicutes)、梭茵屬(Clostridium)及其親緣、黃細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、綠色硫細(xì)菌、綠色非硫細(xì)菌、和古細(xì)菌。
20.依照權(quán)利要求19的原核宿主細(xì)胞或完整生物體，其屬于選自下組的原細(xì)菌類土壤桿菌屬(Agrobacterium)、紅細(xì)菌屬(Rhodobacter)、氧化氨的細(xì)菌諸如亞硝化單胞茵屬(Nitrosomonas)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、粘細(xì)菌(Myxobacteria)諸如粘球菌屬(Myxococcus)，優(yōu)選金黃色土壤桿茵(Agrobacterium aureus)、莢膜紅細(xì)菌(Rhodobacter capsulatus)、亞硝化單胞茵屬之種(Nitrosomonas sp.)ENI-11、大腸埃希氏茵(Escherichia coli)、和黃色粘球菌(Myxococcus xanthus)。
21.依照權(quán)利要求19的原核宿主細(xì)胞或完整生物體，其屬于選自下組的革蘭氏陽性細(xì)菌放線茵綱(Actinomycetes)和厚壁茵門(Firmicutes)包括梭茵屬(Clostridium)及其親緣，諸如芽孢桿菌屬(Bacillus)和乳球菌屬(Lactococcus)，優(yōu)選枯草芽孢桿茵(Bacillus subtilis)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。
22.依照權(quán)利要求19的原核宿主細(xì)胞或完整生物體，其屬于選自下組的黃細(xì)菌擬桿茵屬(Bacteroides)、噬纖維茵屬(Cytophaga)、和黃桿菌屬(Flavobacterium)，優(yōu)選黃桿菌諸如黃桿菌ATCC 21588。
23.依照權(quán)利要求19的原核宿主細(xì)胞或完整生物體，其屬于選自下組的藍(lán)細(xì)菌Chlorococcales，包括集胞藍(lán)細(xì)菌屬(Synechocystis)和聚球藍(lán)細(xì)菌屬(Synechococcus)，優(yōu)選集胞藍(lán)細(xì)菌屬之種和聚球藍(lán)細(xì)菌屬之種PS717。
24.依照權(quán)利要求19的原核宿主細(xì)胞或完整生物體，其屬于選自下組的綠色硫細(xì)菌或綠色非硫細(xì)菌分別是綠茵屬(Chlorobium)或綠屈撓茵科(Chloroflexaceae)諸如綠屈撓茵屬(Chloroflexus)，分別優(yōu)選泥生綠茵嗜硫代硫酸鹽小種(Chlorobium limicolaf.thiosulfatophilum)和橙色綠屈撓茵(Chloroflexusaurantiacus)。
25.依照權(quán)利要求19的原核宿主細(xì)胞或完整生物體，其屬于選自下組的古細(xì)菌鹽桿菌科(Halobacteriaceae)諸如鹽桿菌屬(Halobacterium)，優(yōu)選鹽沼鹽桿菌(Halobacterium salinarum)。
26.依照權(quán)利要求18的真核宿主細(xì)胞或完整生物體，其是選自下組的真菌包括酵母子囊茵門(Ascomycota)包括酵母綱(Saccharomycetes)諸如畢赤酵母屬(Pichia)和酵母屬(Saccharomyces)，和變形子囊茵門(anamorphic Ascomycota)包括曲霉屬(Aspergillus)，優(yōu)選釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和黑曲霉(Aspergillusniger)。
27.依照權(quán)利要求18的真核宿主細(xì)胞，其是選自下組的昆蟲細(xì)胞SF9、SF21、Trychplusiani、和MB21。
28.依照權(quán)利要求18的真核宿主細(xì)胞，其是選自下組的動物細(xì)胞幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、人胚腎(HEK)細(xì)胞、和COS細(xì)胞，最優(yōu)選NIH 3T3和293細(xì)胞。
29.依照權(quán)利要求18的真核宿主細(xì)胞、種子、組織、或完整生物體，其是選自下組的植物細(xì)胞、種子、組織、或完整生物體真核藻類、有胚植物包括苔蘚植物門(Bryophyta)、蕨類植物門(Pteridophyta)、和被子植物門(Spermatophyta)諸如裸子植物亞門(Gymnospermae)和被子植物亞門(Angiospermae)，后者包括Magnoliopsida、Rosopsida、和百合綱(Liliopsida)(“單子葉植物”)。
30.依照權(quán)利要求29的真核宿主細(xì)胞、種子、組織、或完整生物體，其選自下組谷物種子，優(yōu)選稻、小麥、大麥、燕麥、莧屬植物、亞麻、黑小麥、黑麥、和玉米；油料種子，優(yōu)選蕓苔種子、棉花種子、大豆、紅花、向日葵、椰子、和棕櫚；選自下組的其它可食用種子或含可食用部分的種子西葫蘆、南瓜、芝麻、罌粟、葡萄、綠豆、花生、豌豆、菜豆、蘿卜、苜蓿、可可、咖啡、大麻；樹生堅果，優(yōu)選胡桃、巴旦杏、山核桃、和鷹嘴豆；馬鈴薯、胡蘿卜、甘薯、制糖甜菜、番茄、胡椒、木薯、柳、櫟、榆、槭、蘋果、和香蕉。
31.轉(zhuǎn)化細(xì)菌、真菌、酵母、昆蟲、動物、或植物細(xì)胞、種子、組織、或完整生物體以產(chǎn)生能夠表達(dá)β-胡蘿卜素雙加氧酶(β-diox II)多肽或其功能片段的轉(zhuǎn)化體的方法，所述多肽或其功能片段具有特異切割β-胡蘿卜素和番茄紅素而分別形成β-阿樸胡蘿卜素醛和β-芷香酮及阿樸番茄紅素醛的生物學(xué)活性和/或具有特異結(jié)合針對所述多肽或其功能片段所產(chǎn)生的抗體的能力，該方法包括用依照權(quán)利要求9-13任一項(xiàng)的DNA分子或者用依照權(quán)利要求14的質(zhì)?；蜉d體系統(tǒng)轉(zhuǎn)化所述細(xì)菌、真菌包括酵母、昆蟲、動物、或植物細(xì)胞、種子、組織、或完整生物體。
32.由依照權(quán)利要求31產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體提供或再生的轉(zhuǎn)化細(xì)菌、真菌包括酵母、昆蟲、動物、或植物細(xì)胞、種子、組織或完整生物體。
33.依照權(quán)利要求32的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、種子、組織、或完整生物體，其選自下組真核藻類、有胚植物包括苔蘚植物門(Bryophyta)、蕨類植物門(Pteridophyta)、和種子植物門(Spermatophyta)諸如裸子植物亞門(Gymnospermae)和被子植物亞門(Angiospermae)，后者包括Magnoliopsida、Rosopsida、和百合綱(Liliopsida)(“單子葉植物”)。
34.依照權(quán)利要求33的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、種子、組織、或完整生物體，其選自下組谷物種子，優(yōu)選稻、小麥、大麥、燕麥、莧屬植物、亞麻、黑小麥、黑麥、和玉米；油料種子，優(yōu)選蕓苔種子、棉花種子、大豆、紅花、向日葵、椰子、和棕櫚；選自下組的其它可食用種子或含可食用部分的種子西葫蘆、南瓜、芝麻、罌粟、葡萄、綠豆、花生、豌豆、菜豆、蘿卜、苜蓿、可可、咖啡、大麻；樹生堅果，優(yōu)選胡桃、巴旦杏、山核桃、和鷹嘴豆；馬鈴薯、胡蘿卜、甘薯、制糖甜菜、番茄、胡椒、木薯、柳、櫟、榆、槭、蘋果、和香蕉。
35.能夠與權(quán)利要求1-8和16任一項(xiàng)的多肽發(fā)生特異免疫反應(yīng)的抗體。
36.依照權(quán)利要求9-13任一項(xiàng)的DNA分子用于診斷和/或治療目的的用途。
37.依照權(quán)利要求1-8和16任一項(xiàng)的多肽用于治療目的的用途。
38.依照權(quán)利要求35的抗體用于權(quán)利要求1-8和16任一項(xiàng)的多肽的分離和/或量化和用于診斷和/或治療目的的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)化細(xì)菌、真菌(包括酵母)、動物、和植物細(xì)胞、種子、組織、和完整植株以產(chǎn)生能夠表達(dá)新型β－胡蘿卜素雙加氧酶并積累胡蘿卜素/類視黃質(zhì)途徑重要代謝物(諸如維生素A醛和視黃酸)的轉(zhuǎn)化體的手段和方法。本發(fā)明還提供了通過生物技術(shù)使用天然或轉(zhuǎn)化后積累β－胡蘿卜素或者由培養(yǎng)基攝取β－胡蘿卜素的細(xì)胞、組織、器官、或完整植株生產(chǎn)類視黃質(zhì)的手段和方法。本發(fā)明還提供了編碼衍生自不同來源和分類群的存活生物體、對稱和不對稱切割β－胡蘿卜素的雙加氧酶且設(shè)計適用于進(jìn)行本發(fā)明方法的DNA分子，及包含所述分子的質(zhì)?；蜉d體系統(tǒng)。另外，本發(fā)明提供了展示改良的營養(yǎng)品質(zhì)或生理狀況且包含這些DNA分子和/或使用本發(fā)明方法生成的轉(zhuǎn)基因細(xì)菌、真菌(包括酵母)、動物、和植物細(xì)胞、種子、組織、和完整植株。
文檔編號A61K48/00GK1425062SQ00818539
公開日2003年6月18日 申請日期2000年12月27日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月24日
發(fā)明者J·馮林提格, K·沃格特 申請人:辛根塔參與股份公司