專利名稱：作為抑制素受體的β聚糖及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及內(nèi)分泌學領(lǐng)域，生殖生物學和細胞生物學，尤其是關(guān)于激素/生長因子信號傳導。更特別的是，本發(fā)明涉及抑制素受體的識別及其用途。
相關(guān)領(lǐng)域的描述抑制素和活化素最初被認為是性腺起源的蛋白質(zhì)激素，它們能可逆調(diào)節(jié)垂體前葉產(chǎn)生促卯泡成熟激素(FSH)(1)。這些蛋白質(zhì)是相關(guān)多肽的二硫鍵連接的二聚體?；罨赜蓛蓷lβ鏈構(gòu)成，而抑制素具有一條β鏈，它與一條相關(guān)的但趨異的α鏈連接(2)?，F(xiàn)在已知活化素在生殖和非生殖組織中起到了重要的內(nèi)分泌、旁分泌和自分泌作用。這些作用調(diào)節(jié)發(fā)育和成年動物中包括激素分泌和細胞增殖和分化過程(1，3)。雖然有抑制素不能封閉活化素反應的系統(tǒng)(5，6)，抑制素通常拮抗活化素的作用(4)。
抑制素和活化素屬于生長和分化因子的轉(zhuǎn)化性生長因子-β(TGF-β)超家族(7)。與該家族的其它代表性成員一樣，活化素顯示通過兩類跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體傳遞信號(8)。在1991年，克隆和確定了活化素II型受體，稱為ActRII的特征(9)。ActRII是第一種被確定特征的脊椎動物受體絲氨酸激酶(RSK)，也是任何TGF-β超家族成員中第一種在分子水平詳細描述的受體?，F(xiàn)在超過12種受體絲氨酸激酶家族成員已被鑒定出來，包括第二種II型活化素受體(ActRIIB)(10，11)、II型TGF-β受體(12)和化合物(13，14)和TGF-β(15)的I型受體。
抑制素、活化素和相關(guān)因子的廣泛的重要生物學作用，以及其與治療生殖、發(fā)育、骨骼、肝臟、造血和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的可能應用的關(guān)系，形成了探索其受體、信號傳導機制和調(diào)控的強有力的理由?？偟恼f，該工作涉及鑒定多種新的靶分子，并應提供針對治療內(nèi)分泌疾病和腫瘤病的治療方法的新的基礎。
活化素(β-β)和抑制素(α-β)結(jié)構(gòu)上相關(guān)，具有同樣的14kDa β亞基，但是抑制素二聚體還具有不同的18kDa α亞基。從濾泡液中分離了活化素和抑制素的同工型。這些包括活化素A(βA-βA)、活化素B(βB-βB)、活化素AB(βA-βB)、抑制素A(α-βA)和抑制素B(α-βB)?；谛蛄信帕泻捅Ｊ匕腚装彼釟埢亩ㄎ?，認為這些多肽與其它能得到晶體結(jié)構(gòu)信息的TGF-β家族成員結(jié)構(gòu)相似(16，17)。
迄今，已顯示抑制素僅在活化素反應的情況下具有活性，它通常拮抗活化素信號(5，18-20)，雖然近來報道了骨骼中活化素依賴性抑制素作用的抽象的方式。已顯示抑制素可與活化素競爭其靶細胞，抑制素能阻止活化素誘導的受體異源化(5，19)。未標記的抑制素直接與已標記的活化素競爭II型活化素受體，雖然其作為取代劑的能力大約比非標記的活化素低10倍(9，10)。
在活化素和抑制素中同時存在的β亞基將介導與II型活化素受體的結(jié)合?；罨嘏cActRII結(jié)合后，活化素-ActRII復合物隨后促進I型活化素受體絲氨酸激酶ALK4的募集和磷酸化(5，8，14)。這導致同源I型受體的磷酸化和下游Smad蛋白質(zhì)的激活(21，22)。抑制素還與II型活化素受體結(jié)合，但抑制素分子的α亞基不支持I型受體(即ALK4)的募集。這提示抑制素通過直接競爭受體結(jié)合位點來封閉信號傳導(5，18，19)，因此防止活化素與II型活化素受體結(jié)合(23)。然而，抑制素在一些組織和細胞內(nèi)不能拮抗活化素，這與抑制素作用需要其它成分的假設一致(5，24，25)。
先前的發(fā)現(xiàn)表明抑制素可能需要其它受體成分來與活化素成功競爭與II型活化素受體的接觸，從而功能性拮抗活化素的反應?？赡芎唵?、直接的在活化素和抑制素之間競爭與活化素II型受體的接觸單獨對于揭示抑制素對活化素反應的作用是不夠的。事實上，活化素抑制垂體ACTH分泌的作用不是由于大摩爾過量的抑制素的拮抗(6)。另外，在工程改造過度表達ActRII的K562紅白血病細胞(KAR6細胞)中，提高的ActRII表達即使在存在基本分子過量的抑制素下，也封閉抑制素拮抗活化素信號傳導的能力(5)。
在嘗試鑒定推測的抑制素-特異性受體成分中，用[125I]-標記的活化素和抑制素進行交聯(lián)實驗，來標記野生型K562紅白血病細胞和過度表達ActRII的KAR6細胞。結(jié)果顯示活化素與兩種細胞系中的I型和II型受體結(jié)合，標記的活化素與這兩種受體的結(jié)合被過量的未標記的活化素或未標記的抑制素取代(5)。如預期的，標記的抑制素能結(jié)合兩種細胞系中的II型受體，但不是I型受體。抑制素與II型受體的結(jié)合可被加入的未標記的活化素或抑制素取代。有趣的是，與標記的抑制素交聯(lián)的高分子量的蛋白質(zhì)在這兩個實驗中也是明顯的可通過加入過量未標記的抑制素而不是活化素而能被競爭性的被取代。
總的說，這些結(jié)果提示除了與ActRII結(jié)合，抑制素還與另一種高分子量的推測共受體結(jié)合，它可穩(wěn)定抑制素-ActRII相互作用，從而防止ActRII結(jié)合活化素和調(diào)節(jié)活化素反應。因此，在某些組織中缺乏抑制素對活化素反應的拮抗可通過缺少這類或類似的抑制素結(jié)合共受體成分解釋。卵巢腫瘤細胞系KK-1中類似的高分子量抑制素-結(jié)合成分的存在已被確認。高親和力抑制素與非鑒定的高分子量蛋白(24)。
β聚糖是III型TGF-β受體，最初被認為是三種顯示以高親和力結(jié)合TGF-β的細胞表面受體中最大的一種(26)。大鼠β聚糖cDNA編碼853個氨基酸的蛋白質(zhì)，含有一個大胞外結(jié)構(gòu)域、一個單跨膜結(jié)構(gòu)域和一個短C-末端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，缺乏可清楚識別的信號傳導基序(27，28)。β聚糖與三種TGF-β同工型以高親和力結(jié)合，據(jù)信在促進TGF-β與其信號傳導受體的結(jié)合中起到了輔助作用(22，29)。
成熟的β聚糖是蛋白聚糖，它含有硫酸乙酰肝素和硫酸軟骨素糖胺聚糖(GAG)鏈，得到在SDS-PAGE凝膠上在250-350kDA之間遷移的分子。不和糖胺聚糖結(jié)合的β聚糖核心多肽保留TGF-β活性，并作為100-110kDa的蛋白質(zhì)遷移(27，30，31)。近來的工作顯示β聚糖在介導對TGF-β的生理反應中的重要性，包括其自分泌調(diào)節(jié)人乳腺癌細胞增殖(32，33)及其觸發(fā)心內(nèi)膜細胞轉(zhuǎn)化的能力(34)。
現(xiàn)有技術(shù)的缺陷在于，沒有確定介導抑制素和活化素受體的相互作用的蛋白質(zhì)的特征。本發(fā)明填補了本領(lǐng)域該長期存在的需要和需求。
發(fā)明簡述在本發(fā)明的一個實施例中，描述了一種方法，其中抑制素敏感細胞中活化素誘導的信號傳導可以通過抑制抑制素/β聚糖復合物的形成上調(diào)。一種抗血清可以針對β聚糖的胞外表位，來防止抑制素與β聚糖結(jié)合。另外，形成抑制素/β聚糖復合物可由減少細胞中β聚糖的表達抑制，通過反義抑制或用同源重組等方法誘變一個或兩個β聚糖等位基因。該方法的一種可能用途是增強垂體細胞中的活化素信號傳導。這應導致促卵泡成熟激素(FSH)產(chǎn)生的增加，和生育力的增強。該方法還可用于治療許多病理性狀況，包括生殖、發(fā)育、皮膚、骨骼、肝臟、造血和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，例如前列腺癌。
在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了針對β聚糖胞外部分的抗血清。該抗血清抑制抑制素與β聚糖的結(jié)合，可摻入藥物組合物。
在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了一種抑制活化素-誘導的信號傳導的方法。這可通過增加抑制素/β聚糖復合物在靶細胞表面的形成實現(xiàn)。一種這樣的方法利用提高β聚糖在靶細胞中的表達，來提供額外β聚糖用于形成這些復合物。該方法還可通過施用額外的抑制素來增強。β聚糖表達可通過用組成型或用誘導型啟動子表達β聚糖的人工構(gòu)建體轉(zhuǎn)染靶細胞來提高。該方法還可用于對正常情況下對抑制素不反應的細胞引入抑制素敏感性?？捎迷摲椒ㄖ委熢S多病理性狀況，包括生殖、發(fā)育、皮膚、骨骼、肝臟、造血和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。實施例包括性腺癌、腎上腺癌和肝臟發(fā)育不良。該方法還可用于促進肝臟再生。
本發(fā)明的另一個實施例是一種篩選抑制抑制素/β聚糖復合物形成，來增加活化素信號傳導的方法。在可能的抑制素與β聚糖結(jié)合的抑制劑存在或不存在的條件下，培育表達β聚糖的細胞膜。進行競爭性結(jié)合試驗等試驗，比較結(jié)果。抑制抑制素/β聚糖復合物形成的化合物將導致更低水平的抑制素結(jié)合?？赡艿幕衔锟梢允请?、蛋白質(zhì)或小分子。另外，該方法可用于篩選增加抑制素/β聚糖復合物形成，從而抑制活化素信號傳導的化合物。對此，化合物應提高抑制素與膜的結(jié)合。
附圖簡述因此，獲得了上述引用的本發(fā)明的特征、優(yōu)點和目的，以及其它會變得清楚的方面，并可詳細理解，上面簡單總結(jié)的本發(fā)明更具體的描述將參考一些實施例并用


。這些附圖是說明書的一部分。然而應注意

了本發(fā)明的優(yōu)選實施例，因此不應認為限制了本發(fā)明的范圍。
圖1A和1B顯示β聚糖與抑制素高親和性結(jié)合，加強了抑制素與ActRII的結(jié)合。
在圖1A中，用磷酸鈣沉淀(35)ActRII-myc、β糖苷(BG)或(ActRII+BG)一起轉(zhuǎn)染標出的HEK293細胞。分離的細胞膜與約100pM[125I]抑制素A在存在或不存在各種濃度的未標記抑制素A競爭劑下培育。
圖1B顯示標準化的并表示成％特異性結(jié)合的圖1A的數(shù)據(jù)。用Prism軟件分析結(jié)合數(shù)據(jù)。
圖2A和2B說明抑制素與β聚糖(轉(zhuǎn)染和內(nèi)源的)共價交聯(lián)，提供了ActRII-β聚糖復合物的證據(jù)。
在圖2A中，β聚糖增加了抑制素A與ActRII的共價交聯(lián)?？蛰d體(pcDNA3)、ActRII-myc、β聚糖(BG)或ActRII和β聚糖同時(BG+ActRII-myc)轉(zhuǎn)染入HEK293細胞，然后與[125I]-抑制素A和DSS如前對于活化素所述(9)進行交聯(lián)。[125I]-抑制素A與表達β聚糖的細胞的結(jié)合和交聯(lián)在存在或不存在25nM未標記的抑制素A、25nM未標記的活化素A或5nM未標記的TGF-β1的條件下如指出的進行。用抗-β聚糖抗血清(R&D Systems，Inc.)或多克隆抗myc抗體(9E10)(Calbiochem，Inc.)免疫沉淀分離的交聯(lián)復合物。在還原條件下通過SDS-PAGE分辨交聯(lián)的蛋白質(zhì)，并通過放射性自顯影目測檢驗。標出了ActRII-myc、β聚糖核心多肽(核心)和含糖胺聚糖鏈的β聚糖(BG)的位置。分子量標記表示成Mr×10-3。
圖2B顯示了抑制素A和活化素A與內(nèi)源β糖苷復合物的共價交聯(lián)。[125I]抑制素A和[125I]-活化素A的結(jié)合和交聯(lián)在存在或不存在25nM未標記的抑制素A或25nM未標記的活化素A的條件下，如標出的在表達內(nèi)源受體KK-1細胞上進行。用抗-β聚糖抗血清(R&D Systems，Inc.)、抗-ActRII抗血清或正常大鼠血清免疫沉淀分離交聯(lián)復合物，在還原條件下用SDS-PAGE分辨，并用放射性自顯影目測檢驗。標出了ActRII、β聚糖核心多肽(BG核心)、含糖胺聚糖鏈的β聚糖(BG)和ALK4的位置。分子量標記表示成Mr×10-3。
圖3A-3F顯示了在正常成年大鼠大腦、垂體、卵巢和睪丸中β聚糖的免疫細胞化學定位。高倍亮視野顯微照相顯示前腦(圖3A)、垂體(圖3B和3C)、附睪(圖3D)、睪丸(3E)和卵巢(圖3F)中的β聚糖免疫染色。用箭頭標出了對β聚糖免疫陽性的細胞的典型例子(染成棕色)。條代表50微米?？s寫包括AL，垂體前葉；CT，結(jié)締組織；GC，粒層細胞；IL，垂體中葉；LC，睪丸間質(zhì)細胞；O，卵母細胞；PL，垂體后葉；ST，精小管；TT，Tenia Tecta；TC，卵泡膜細胞。
圖4A-4D顯示β聚糖可在促腎上腺皮質(zhì)激素、卵巢和紅白血病細胞中介導活化素信號傳導的功能拮抗。
在圖4A中，用3TPLux-報告質(zhì)粒(7)、CMV-β-半乳糖苷酶(β-GAL)和空載體或β聚糖(BG)cDNA，用Superfect轉(zhuǎn)染試劑(Qiagen)在優(yōu)化的條件下轉(zhuǎn)染AtT20細胞。用或不用2.5nM抑制素A(Inh A)和各種濃度的活化素A(Act A)處理細胞15小時，測量得到的熒光素酶活性。
在圖4B中，如圖4A中所述轉(zhuǎn)染AtT20細胞，然后用或不用1nN活化素A和一定濃度范圍的抑制素A處理。
在圖4C中，如上所述轉(zhuǎn)染KK-1卵巢腫瘤細胞，并用或不用0.3nM活化素A和一定范圍濃度的抑制素A處理。
在圖4D中，用β聚糖(BG)或空載體轉(zhuǎn)染K562-衍生的KAR6細胞，用IPTG處理誘導活化素受體表達，并用0.3nM活化素A和一定范圍濃度的抑制素A處理。熒光素酶活性用任意的熒光素酶單位(L U.)代表，標化到β-GAL活性。
圖5顯示抑制素A抑制大鼠垂體前葉細胞FSH分泌在抗-β聚糖血清的存在下以劑量依賴性方式抑制。大鼠垂體前葉細胞如所述脫離并鋪板(40)。鋪板4天后，洗滌細胞并在0.2％FBS-bPJ(36)中培育24小時。然后用新鮮培養(yǎng)液洗滌細胞，用正常家兔血清(NRS)或來自注射了GST與大鼠β聚糖殘基154-439(Ab-BG)的融合蛋白的家兔的抗血清處理。1小時后，用或不用25pM抑制素A處理細胞，并培育48小時。用放免法試劑盒(NIADDK的國家激素和垂體計劃)測量FSH。報告值表示成三份孔的無抑制素處理的百分數(shù)±SEM。
圖6示意性說明了假定的模型，其中β聚糖(BG)作為抑制素共受體。β聚糖或功能上相似的抑制素共受體的存在增加了與ActRII結(jié)合的抑制素，并從而防止活化素與ActRII的結(jié)合。除了封閉活化素信號傳導途徑外，抑制素/β聚糖/ActRII復合物的形成可指導新的下游信號。
發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明，可使用本領(lǐng)域能力內(nèi)的常規(guī)分子生物學、微生物學和重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)在文獻中有完整的解釋。見例如Maniatis，F(xiàn)ritsch & Sambrook，“Molecular CloningA Laboratory Manual”(1982)；“DNA CloningA LaboratoryManual”卷I和II(D.N.Glover編，1985)；“Oligonucleitide Synthesis”(M.J.Gait編，1984)；“Nucleic Acid Hybridization”[B.D.Hames & S.J.Higgins編(1985)]；“Animal Cell Culture”[R.I.Freshney編(1986)]；“ImmobilizedCells And Enzymoes”[IRL Press(1986)]；B.Perbal，“A practical Guide ToMolecular Cloning”(1984)。
因此，如果本文出現(xiàn)，下面的術(shù)語將具有下列定義。
本文所用的術(shù)語“cDNA”應指基因mRNA轉(zhuǎn)錄物的DNA拷貝。
本文所用的術(shù)語“衍生的氨基酸序列”應意味著通過閱讀cDNA中核苷酸堿基的三個一組的序列確定的氨基酸序列。
本文所用的術(shù)語“文庫篩選”指用標記的探針檢查是否在合適的條件下有序列與存在于特定DNA文庫中的探針互補的過程。另外“文庫篩選”可用PCR進行。
本文所用的術(shù)語“PCR”指聚合酶鏈式反應，它是Mullis的美國專利號4,683,195和4,683,202的主題，以及其它本領(lǐng)域現(xiàn)在已知的改進。
本文所描述的氨基酸優(yōu)選是“L”異構(gòu)形式的。然而“D”異構(gòu)形式的殘基可取代任何L-氨基酸，只要免疫球蛋白結(jié)合的所需的功能被多肽保留。NH2指存在于多肽氨基端的游離氨基。COOH指存在于多肽羧基端的游離羧基。與標準多肽命名法一致，J.Biol.Chem.2433552-59(1969)，氨基酸殘基的縮寫是本領(lǐng)域已知的。
應注意所有氨基酸殘基的序列在本文中是由化學式代表的，其左右朝向是從氨基端到羧基端的常規(guī)朝向。另外，應注意氨基酸殘基序列開始和結(jié)束處的劃線表示與一個或多個其它氨基酸殘基序列的肽鍵。
“復制子”是任何作為體內(nèi)的自主DNA復制單元；即能在其自身控制下復制的基因元件(例如質(zhì)粒、染色體、病毒)。
“載體”是復制子，例如質(zhì)粒、噬菌體或粘粒，另一條DNA區(qū)段與其結(jié)合，因此使得結(jié)合的區(qū)段復制。
“DNA分子”指脫氧核糖核苷酸(腺苷酸、鳥苷酸、胸腺嘧啶或胞嘧啶)的多聚形式，它可以是單鏈形式或雙鏈螺旋。該術(shù)語僅指分子的一級或二級結(jié)構(gòu)，不將其限于任何具體的三級形式。因此，該術(shù)語包括雙鏈DNA，尤其是線性DNA分子(例如限制性片段)、病毒、質(zhì)粒和染色體。在討論中，本文的結(jié)構(gòu)根據(jù)正常的常規(guī)僅是沿DNA非轉(zhuǎn)錄鏈的5’-3’方向的序列(即與mRNA序列相同的那條鏈)來給出。
“復制起始點”指參與DNA合成的DNA序列。
DNA“編碼序列”是雙鏈DNA序列，它在體內(nèi)當置于合適的調(diào)控序列控制下時轉(zhuǎn)錄和翻譯成多肽。編碼序列的邊界是由5’(氨基)端的起始密碼子和3’(羧基)端的翻譯終止密碼子確定的。編碼序列可包括但不限于原核序列、來自真核mRNA的cDNA，來自真核(例如哺乳動物)DNA的基因組DNA序列，和甚至合成的DNA序列。聚腺苷酸信號和轉(zhuǎn)錄終止序列總在編碼序列3’端。
轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列是DNA調(diào)控序列，例如啟動子、增強子、聚腺苷酸信號、終止子等，提供在宿主細胞中編碼序列的表達。
“啟動子序列”是一種能在細胞中與RNA聚合酶結(jié)合，引發(fā)下游(3’方向)編碼序列轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)控區(qū)域。為了限定本發(fā)明，啟動子序列在其3’末端與轉(zhuǎn)錄引發(fā)位點結(jié)合，向上游(5’方向)延伸，以包括引發(fā)在背景以上的可檢測水平的轉(zhuǎn)錄所需的最少數(shù)目的堿基或元件。在啟動子序列內(nèi)將發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄起始位點，以及負責結(jié)合RNA聚合酶的蛋白質(zhì)結(jié)合域(共有序列)。真核啟動子常常但不總是在-10和-35共有序列中含有Shine-Dalgarno序列。
“表達控制序列”是一種DNA序列，它控制和調(diào)節(jié)其它DNA序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯。當RNA聚合酶將編碼序列轉(zhuǎn)錄入mRNA，編碼序列在細胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列的“控制下”，然后翻譯成編碼序列編碼的蛋白質(zhì)。
“信號序列”可包含在編碼序列附近。該序列編碼信號肽，在多肽的N-末端，它與宿主細胞通訊以將多肽定向到細胞表面或?qū)⒍嚯姆置谌虢橘|(zhì)，宿主細胞在蛋白質(zhì)離開細胞前切下該信號肽?？砂l(fā)現(xiàn)信號肽與各種原核生物和真核生物天然的蛋白質(zhì)有關(guān)。
本文所用的術(shù)語“寡核苷酸”在指本發(fā)明的探針時，定義為含有兩個或多個核糖核苷酸，優(yōu)選三個以上的分子。其確切大小將由許多因素決定，它們又依賴于寡核苷酸的最終功能和用途。
本文所用的術(shù)語“引物”指寡核苷酸，不論它是以天然的純化的限制性消化產(chǎn)物存在，還是合成產(chǎn)生的，當置于某些條件下能作為合成的起始點，這些條件是誘導與核酸鏈互補的引物延伸產(chǎn)物的合成，即在核苷酸和誘導劑，例如DNA聚合酶和合適的溫度和pH條件下。引物可以是單鏈或雙鏈的，必需足夠長，在誘導劑的存在下引發(fā)所需延伸產(chǎn)物的合成。引物的確切長度將依賴于許多因素，包括溫度、引物來源和方法的使用。例如對于診斷用途，由靶序列的復雜性決定，寡核苷酸通常含有15-25個或更長的核苷酸，雖然它可以含有較少的核苷酸。
選擇本文中的引物，使其“基本”與特定靶DNA序列的不同鏈互補。這意味著引物必需足夠互補，與其相應的鏈雜交。因此，引物序列不需要反映模板的確切序列。例如，不互補的核苷酸片段可與引物的5’末端結(jié)合，而剩余的引物序列與該鏈互補。另外，可在引物中插入不互補的堿基或更長的序列，條件是引物序列足夠與序列互補或與其雜交，從而形成合成延伸產(chǎn)物的模板。
本文所用的術(shù)語“限制性內(nèi)切核酸酶”和“限制性酶”指酶，它們各自在特定核苷酸序列處或附近切割雙鏈DNA。
當DNA被引入細胞時，細胞被外源或異源DNA“轉(zhuǎn)化”。轉(zhuǎn)化的DNA可以或可以不整合(共價連接)到細胞基因組中。在例如原核生物、酵母和哺乳動物細胞中，轉(zhuǎn)化的DNA可以維持在游離狀態(tài)，例如質(zhì)粒中。對于真核細胞，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細胞是其中轉(zhuǎn)化的DNA整合到染色體中，從而它可以通過染色體復制被子代細胞繼承。該穩(wěn)定性由真核細胞建立含有一群含轉(zhuǎn)化的DNA的子代細胞的細胞系或克隆來證明?！翱寺　笔且蝗和ㄟ^有絲分裂衍生自單個細胞或祖先的細胞?！凹毎怠笔且粋€能在體外穩(wěn)定生長許多代的祖細胞的克隆。
當至少約75％(優(yōu)選至少約80％，最優(yōu)選至少約90％或95％)核苷酸在限定長度的DNA序列中匹配時，兩條DNA是“基本上同源的”?？赏ㄟ^用序列數(shù)據(jù)庫中標準軟件，或在例如如特定系統(tǒng)限定的嚴格條件下在Southern雜交實驗中比較序列，來鑒定基本同源的序列。限定合適的雜交條件在本領(lǐng)域技術(shù)水平內(nèi)。見例如Maniatis等，見上；DNA Cloning，卷I & II，見上；Nucleic Acid Hybridization，見上。
DNA構(gòu)建物中的“異源”區(qū)是在更大的DNA分子中一個可鑒定的DNA區(qū)段，它與該更大的分子天然不結(jié)合。因此，當異源區(qū)編碼哺乳動物基因時，該基因通常側(cè)接有在來源生物體的基因組內(nèi)不側(cè)接哺乳動物基因組DNA的DNA。在另一個例子中，編碼序列是一種構(gòu)建體，其中編碼序列本身在天然中不存在(如基因組編碼序列含有內(nèi)含子或合成性序列，具有與天然基因不同的密碼子的cDNA)。等位變體或天然存在的突變事件不產(chǎn)生如本文定義的DNA異源區(qū)。
通常用于這些研究的標記是放射性元素、酶、當接觸紫外光時發(fā)射熒光的化學物質(zhì)等。許多熒光物質(zhì)是已知的，并可用作標記。這些包括例如熒光素、羅丹明、金胺、Texas Red、AMCA藍和Lucifer Yellow。特別的檢測物質(zhì)是在山羊中制備的抗兔抗體，并通過異硫氰酸與熒光素偶聯(lián)。
蛋白質(zhì)還可用放射性元件或酶標記。放射性標記可通過任何目前可得的計數(shù)法檢測。優(yōu)選的同位素可選自3H、14C、32p、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90y、125I、131I和186Re。
酶標記也是有用的，并可用任何現(xiàn)在利用顯色、分光光度、熒光光度、電流測定或氣體定量技術(shù)來檢測。酶可以和所選的顆粒通過與橋聯(lián)分子，例如碳二亞胺、二異氰酸酯、戊二醛等偶聯(lián)。優(yōu)選的是過氧化物酶、β-葡糖苷酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶+過氧化物酶和堿性磷酸酶。其它標記物質(zhì)和方法參考例如美國專利號3,654,090、3,850,752和4,016,043的公開內(nèi)容。
本領(lǐng)域開發(fā)和利用的特定分析系統(tǒng)稱作受體實驗。在受體實驗中，要分析的物質(zhì)合適標記，然后用一定量的標記接種一些細胞測試集落，然后進行結(jié)合研究，測定標記物質(zhì)與細胞受體結(jié)合的程度。用該方法可確定親和力之間的差異。
本領(lǐng)域有用的實驗稱為“順式/反式”實驗。簡單說，該實驗使用兩種基因構(gòu)建物，其中一種是通常是當轉(zhuǎn)染入合適細胞系時，連續(xù)表達感興趣的特定受體的質(zhì)粒，第二種是在受體/配體復合物控制下表達報告子，例如熒光素酶的質(zhì)粒。因此例如，如果需要評估一種作為特定受體的配體的化合物，質(zhì)粒之一可以是導致在所選細胞系中表達受體的構(gòu)建體，而第二種質(zhì)粒將具有與熒光素酶基因連接的啟動子，其中插入了特定受體的反應元件。如果測試的化合物是受體的激動劑，配體將與受體復合，得到的復合物將與反應元件結(jié)合，引發(fā)熒光素酶基因的轉(zhuǎn)錄。然后進行光度測定得到的化學發(fā)光，獲得劑量應答曲線，并于已知配體的曲線比較。上述方法在美國專利號4,981,784中詳述。
一般說，含有促進插入的DNA片段有效轉(zhuǎn)錄的啟動子序列的表達載體可與宿主連用。表達載體通常含有復制起始點、啟動子、終止子以及能在轉(zhuǎn)化的細胞中提供表型選擇的特定基因。轉(zhuǎn)化的宿主可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法發(fā)酵和培養(yǎng)，實現(xiàn)最佳細胞生長。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法可用于構(gòu)建含有合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制信號的表達載體。見例如，Sambrook等，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual(第二版)Cold Spring Harbor Press，N.Y.中描述的技術(shù)。如果轉(zhuǎn)錄控制序列有效控制基因轉(zhuǎn)錄，基因及其轉(zhuǎn)錄控制序列被定義為“可操縱性連接”。本發(fā)明的載體包括但不限于質(zhì)粒載體和病毒載體。
本發(fā)明針對一種通過抑制抑制素/β聚糖復合物的形成，加大活化素誘導的信號傳導的方法?？捎冕槍Ζ戮厶前獗砦坏目寡逡种圃搹秃衔锏男纬?。另外，可通過減少細胞中β聚糖的表達限制能形成復合物的β聚糖量。β聚糖的表達可通過抗-β聚糖反義轉(zhuǎn)錄物，或通過誘變細胞中一個或兩個β聚糖等位基因減少。同源重組是一種可用于使β聚糖突變的方法。垂體細胞是該方法的可能目標，其中放大活化素信號傳導提高了促卵泡成熟激素(FSH)的產(chǎn)生和增強生殖力。另外，該方法可用于治療許多生殖、發(fā)育、皮膚、骨骼、肝臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，例如前列腺癌。
本發(fā)明還針對抗β聚糖抗血清，它抑制抑制素與β聚糖的結(jié)合?？寡蹇膳c藥物學上可接受的載體復合，形成藥物組合物。
還提供了通過增強抑制素/β聚糖復合物的形成抑制活化素-誘導的信號傳導的方法。實現(xiàn)該目的的主要方法是通過提高所述細胞中β聚糖的表達。還可施用其它抑制素，來促進復合物的形成。表達可通過轉(zhuǎn)染含有β聚糖基因的人工構(gòu)建物來增強。β聚糖基因可以組成型表達或在誘導型啟動子的控制下。該方法還可用于在正常情況下不和抑制素反應的細胞中引入對抑制素的敏感性。該方法可用于治療許多病理情況，包括生殖、反應、皮膚、骨骼、肝臟、造血和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。具體例子包括治療性腺癌、腎上腺癌或肝發(fā)育不良。該方法還可用于促進受傷肝組織的再生。
本發(fā)明還針對篩選抑制抑制素/β聚糖復合物形成，從而放大活化素信號傳導的化合物的方法。一種抑制素與β聚糖結(jié)合的測定法在表達β聚糖的細胞膜上進行。如果化合物在用化合物處理的細胞膜中，比未處理細胞的得到更低水平的抑制素結(jié)合，該化合物抑制抑制素/β聚糖復合物的形成，并放大活化素信號傳導。該方法可用于測試許多可能的化合物，包括肽、蛋白質(zhì)和小分子。另外，該方法可用于篩選化合物，它提高抑制素/β聚糖復合物的形成，從而抑制活化素信號傳導。對此，化合物應提高抑制素與膜的結(jié)合。
給出下列例子是為了說明本發(fā)明的各種實施例，而不是要以任何形式限制本發(fā)明。
實施例1競爭性結(jié)合研究重組人活化素A和抑制素A是用J.Mather(Genetech Inc.)提供的穩(wěn)定表達活化素的細胞系產(chǎn)生的，該細胞系由Wolfgang Fischer(PBL，Salk Institute)純化。[125I]活化素A和[125I]-抑制素A是用氯亞明T法如前所述(7)制備的。
對于結(jié)合研究，用DEAE Dextran和10微克ActRII和/或10微克β聚糖質(zhì)粒DNA瞬時轉(zhuǎn)染細胞。用DNA培養(yǎng)細胞4小時，用含10％DMSO的Hepes解離緩沖液(HDB)休克，在37℃和5％CO2下，含有10％胎牛血清和L-谷氨酰胺的DMEM中培養(yǎng)48小時。匯合的單層用Hepes解離緩沖液洗滌兩次，重新懸浮在結(jié)合緩沖液(HepesDissociation Buffer，含0.1％BSA，5mM MgSO4和1.8mM CaCl2)中。通過在最終0.4毫升體積的結(jié)合緩沖液中存在或不存在各種濃度的未標記抑制素或活化素的條件下，將約2×105個細胞與2×105cpm[125I]-抑制素A(約100pM)一起在室溫下保溫90分鐘，進行結(jié)合。結(jié)合后，離心沉淀細胞，用結(jié)合緩沖液洗滌兩次。用γ計數(shù)器定量結(jié)合的[125I]-抑制素A，用Prism程序進行結(jié)合數(shù)據(jù)的分析。
實施例2交聯(lián)研究在5％CO2下，完全DMEM(含有10％胎牛血清、青霉素、鏈霉素和L-谷氨酰胺)中生長到約40-60％匯合的細胞中進行交聯(lián)研究。細胞在10厘米培養(yǎng)皿中生長，然后用磷酸鈣沉淀法，用Hepes緩沖的鹽水(pH7.07)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后，細胞在5％CO2中培養(yǎng)48小時。用Hepes解離緩沖液漂洗各皿收集細胞，然后在含有1mM EDTA的Hepes解離緩沖液中培育10分鐘，釋放細胞。
將約106個重懸浮在Hepes解離緩沖液中的細胞與約2×106cpm[125I]-活化素A在總共500微升體積中室溫孵育1小時，一邊溫和振搖，進行共價交聯(lián)。該培養(yǎng)后，在各試管中加入1毫升冷Hepes解離緩沖液，然后離心沉淀細胞，重新懸浮在500微升HDB中，加到0.5mM二琥珀酰辛二酸(DSS)中，在冰上孵育30分鐘。在各試管中加入1毫升TBS淬滅反應。然后離心沉淀細胞，吸取并將沉淀在冰上溶于1毫升裂解緩沖液(20mM Tris-HCl，pH7.5，0.2mM EDTA，1％Triton X-100，1mMAEBSF，1mM EDTA，10微克/毫升亮抑肽酶、10微克/毫升胃酶抑素和1微克/毫升抑酶肽)30分鐘。離心除去TX-100-不溶性物質(zhì)，在各上清液中加入2微克抗-β聚糖或2微克抗-myc抗體。試管在4℃孵育16小時，在各試管中加入10微升50％蛋白質(zhì)G瓊脂糖(PGA)漿液沉淀免疫復合物，在4℃再保溫1小時，并離心沉淀固定的免疫復合物。用1毫升裂解緩沖液洗滌各蛋白質(zhì)G瓊脂糖沉淀三次，然后煮沸10分鐘，在25微升SDS樣品緩沖液中洗脫，通過SDS-PAGE分辨。所有SDS-PAGE在還原條件下，在聚丙烯酰胺3-8％Tris乙酸酯NuPAGE凝膠(Novex)上進行SDS-PAGE。干燥凝膠，通過放射性自顯影檢測條帶。
實施例3AtT20和KK-1細胞中的熒光素酶測定在瞬時轉(zhuǎn)染實驗中用良好確定特征的活化素/TGF-β-反應性熒光素酶報告質(zhì)粒3TPLux評估β聚糖的功能。測試了兩種小鼠細胞系；AtT20促皮質(zhì)激素細胞(在DMEM、10％FBS、2mML-谷氨酰胺和慶大霉素中生長)和KK-1卵細胞(在含有10％FBS、L-谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素的DMEMF12中生長)。胰蛋白酶消化細胞，以1.5-2×105個細胞/孔的密度在轉(zhuǎn)染24小時前鋪在6孔平板中。細胞在完全培養(yǎng)基中用約1微克3TPLux、0.1-0.2微克巨細胞病毒(CMV)-β-半乳糖苷酶(β-GAL)和0.1-0.3微克載體或β聚糖質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染在優(yōu)化的條件下，用市售的Superfect轉(zhuǎn)染試劑(Qiagen，Hilden，Germany)進行。在培養(yǎng)2.5小時后，用含2％FBS的培養(yǎng)基洗滌細胞，使其恢復5小時。15小時后用抑制素A和/或活化素A處理細胞15小時，然后收集在裂解緩沖液(1％Triton X-100、25mM甘氨酰甘氨酸，pH7.8，15mM MgSO4，4mM EGTA和1mM DTT)中。熒光素酶報告子活性是通過對相對的β-GAL活性標定確定的。
實施例4免疫細胞化學正常的成年雄性和雌性Sprague-dawley大鼠(175-250克，Sprague Dawley)保持在標準箱、食物和光照條件(23℃，12小時光，12小時暗，早六點開燈)下。如前所述(MacConell等，1998)進行免疫細胞化學實驗(ICC)。簡單說，深度麻醉大鼠，經(jīng)心臟灌注4％聚甲醛。取出組織(大腦、垂體、睪丸或卵巢)，預先在相同的固定劑中固定1小時。將大腦轉(zhuǎn)移到10％蔗糖/0.02M磷酸鉀緩沖的鹽水(KPBS)中，4℃過夜儲藏。在顯微切片機上切下30μm冷凍的冠狀切片，如下處理自由漂浮切片，用于ICC分析。垂體、睪丸和卵巢組織被包埋在石蠟中，切下10微米切片，加到Superfrost Plus載玻片(Fish Scientific)上，加工用于ICC分析。所有與使用動物有關(guān)的程序是根據(jù)聯(lián)邦、州和地方法律和團體和NIH規(guī)則進行的。
為了減少背景染色，組織切片在1％H2O2中保溫20分鐘，用KPBS漂洗，然后在含有0.3％Triton X-100、10％正常兔血清和2％BSA的KPBS中室溫保溫1小時。切片與25微克/毫升的β聚糖原始抗血清(R&D)在加有0.3％Triton X-100、2％正常兔血清和2％BSA的KPBS中4℃過夜溫育(作為對照，相鄰的切片單獨與正常山羊IgG或二抗溫育)。然后用KPBS漂洗組織切片，然后與1∶1,000稀釋的生物素化的家兔抗山羊二抗(Vector)在室溫下溫育1小時。KPBS洗滌過的組織與活化素-生物素-辣根過氧化物酶(Vector)的復合物室溫保溫1小時。然后過氧化物酶反應在0.03％DAB和0.015％H2O2的0.1M Tris-HCl，pH7.4保溫3-5分鐘得到可見的棕色的反應產(chǎn)物。將自由漂浮的腦切片放在Superfrost/Plus載玻片(FisherScientific)上，用光學顯微鏡觀察免疫反應性。
實施例5β聚糖高親和力的結(jié)合抑制素，提高抑制素與ActRII的結(jié)合。
在一個篩選潛在的抑制素結(jié)合蛋白的過程中，在表達β聚糖的細胞中檢測到抑制素結(jié)合。圖1顯示從轉(zhuǎn)染β聚糖的HEK293細胞上分離的膜顯示特異性的、高親和力的抑制素結(jié)合[Ki＝0.6(0.5-0.9)nM]，而來自用空載體轉(zhuǎn)染的細胞膜沒有可檢測的特異性抑制素結(jié)合。
為了進一步確定表達ActRII或共表達ActRII和β聚糖的細胞分離物的膜中抑制素的結(jié)合，將編碼這些受體的cDNA轉(zhuǎn)染入HEK 293細胞，并進行競爭性結(jié)合試驗。當ActRII單獨表達時，抑制素結(jié)合親和力十分低[Ki＝6.3nM(2.9-13.4)nM]，與先前的結(jié)果(9)一致，但當ActRII與β聚糖共表達時，增加了30倍[Ki＝0.2(0.1-0.3)nM](圖1B)另外，共表達ActRII和β聚糖使抑制素結(jié)合位點相對于單獨表達ActRII或β聚糖的細胞中結(jié)合位點數(shù)目增加了約12倍或6倍(圖1A)。用β聚糖和ActRIIB進行的實驗有相似結(jié)果；然而β聚糖對抑制素親和力和抑制素結(jié)合位點的數(shù)目的作用沒有如此劇烈(數(shù)據(jù)未顯示)。與β聚糖結(jié)合的活化素在HEK 293細胞中表達過程中檢測不到。另外，β聚糖不增加活化素與ActRII的結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)，表明β聚糖不能通過增加ActRII表達的方法來增加抑制素結(jié)合。
實施例6將抑制素與β聚糖共價交聯(lián)，和抑制素與ActRII-β聚糖復合物的共價交聯(lián)為了確定抑制素是否能和ActRII一起表達或不表達的β聚糖結(jié)合并形成復合物的能力，兩種受體在HEK 293細胞中表達。細胞用[125I]-抑制素，然后用共價交聯(lián)劑二琥珀酰辛二酸酯(DSS)處理細胞。然后用針對β聚糖胞外結(jié)構(gòu)域的ActRIImyc表位的抗體免疫沉淀交聯(lián)的抑制素-受體復合物。交聯(lián)的、免疫沉淀的復合物可通過SDS-PAGE分辨，并用放射性自顯影用肉眼觀察。
圖2A顯示了這樣的交聯(lián)實驗的結(jié)果，其中單獨用載體(泳道1)、單獨用ActRII(泳道2)、β聚糖(泳道3)或β聚糖和ActRII一起(泳道7-10)轉(zhuǎn)染細胞。用[125I]-抑制素交聯(lián)在SDS-PAGE分析上，在被空載體轉(zhuǎn)染的細胞中得不到任何可見復合物(圖2A，泳道1)。在被ActRII單獨(圖2A，泳道2)轉(zhuǎn)染的細胞中檢測到約75-85kDa的共價復合物，與先前報道的抑制素/活化素-ActRII(8，9，18，19)的交聯(lián)復合物大小一致。將[125I]-抑制素與單獨用β聚糖轉(zhuǎn)染的細胞交聯(lián)得到約110kDa的復合物，和另一條175-250kDa的擴散條帶(圖2A、泳道3)。先前用[125I]抑制素交聯(lián)的β聚糖的實驗已顯示具有相似遷移率(27，28)的復合物，代表β聚糖核心蛋白(約110kDa)和具有糖胺聚糖鏈(200-300kDa)的β聚糖。因此，抑制素標記后所見的條帶含有預測形式的β聚糖。
先前報道了在表達β聚糖的細胞中存在的大小范圍相同的抑制素復合物具有相似的高分子量(5，24，38)。加入25nM未標記的抑制素或5nM未標記的TGF-β防止抑制素與β聚糖交聯(lián)(圖2A，泳道4和6)。相反，25nM未標記的活化素沒有作用(圖2A，泳道5)。這些結(jié)果說明了活化素缺乏該蛋白聚糖的親和力，和β聚糖與抑制素的α亞基結(jié)合的可能性。TGF-β封閉抑制素交聯(lián)的能力表明抑制素的結(jié)合位點與β聚糖上的至少一種TGF-β結(jié)合位點重疊。
當ActRII和β聚糖共表達時，抑制素-交聯(lián)受體復合物的水平劇烈增加，[125I]-抑制素和ActRII和β聚糖之間的共價復合物是明顯的(圖2A，泳道7)。預計大小范圍內(nèi)的抑制素標記的復合物與針對ActRII的抗-myc抗體共同免疫沉淀(圖2A，泳道7)，提供了抑制素、ActRII和β聚糖相互作用，形成寡聚抑制素受體復合物的證據(jù)。25nM未標記的抑制素的存在在表達兩種受體的細胞中完全封閉了[125I]-抑制素對ActRII和β聚糖的標記(圖2A，泳道8)。相反加入25nM活化素或5nM TGF-β對用[125I]-抑制素標記的條帶強度幾乎沒有作用(圖2A，泳道9和10)。未標記的TGF-β不能封閉抑制素與和ActRII共表達的β聚糖交聯(lián)是和存在ActRII/β聚糖復合物，它與抑制素結(jié)合，而不是TGF-β結(jié)合一致的。
除了其與重組β聚糖和ActRII在轉(zhuǎn)染細胞中形成交聯(lián)的復合物的能力外，抑制素還與內(nèi)源β聚糖和ActRII在小鼠卵巢細胞系KK-1中結(jié)合并形成交聯(lián)的復合物(圖2B)(38)。可在用抗β聚糖抗血清(泳道2)或抗ActRII抗血清(泳道4)免疫沉淀后目測這些復合物。通過與過量的未標記抑制素A溫育，封閉標記的復合物的形成(圖2B)。免疫沉淀的復合物包括β聚糖核心蛋白、具有糖胺聚糖鏈的β聚糖和ActRII，但是活化素I型受體Alk4不存在于復合物中(圖2B)。用125I-活化素標記KK-1細胞，然后交聯(lián)和用抗-β聚糖抗體免疫沉淀，顯示內(nèi)源β聚糖不與活化素形成共價復合物(泳道7和9)。當活化素-交聯(lián)的細胞被抗-ActRII抗體免疫沉淀時，可見ActRII和Alk4，而不是β聚糖。
實施例7抑制素應答性組織中β聚糖的表達足夠的證據(jù)提示抑制素是一種下丘腦-垂體-性腺軸的重要的旁分泌/自分泌調(diào)節(jié)劑(39)。因此，用免疫細胞化學來評估是否β聚糖蛋白的組織特異性分布與記錄的有抑制素反應性的組織一致。令人驚奇的是，盡管相當長的時間以來已知β聚糖是一種TGF-β受體，β聚糖體內(nèi)的組織分布仍然很大程度上未被探索。圖3總結(jié)了正常成年大鼠大腦、垂體、卵巢和睪丸中β聚糖的免疫組織化學定位。
可能抑制素最廣為人知的功能是其選擇性抑制垂體前葉FSH分泌(1，40-42)。如圖3B所示，與β聚糖介導抑制素應答的作用一致，在正常成年雄性大鼠垂體腺的整個前葉中的細胞亞類中觀察到強β-聚糖-免疫應答，顯示優(yōu)勢胞質(zhì)定位。這些垂體前葉中的β聚糖-免疫陽性細胞類型可代表促性腺激素細胞和促乳激素細胞，因為這些垂體細胞類型主要分別是抑制素和TGF-β靶(43-45)。有趣的是，還在垂體中葉的一大類細胞中發(fā)現(xiàn)了強β聚糖-免疫應答(圖3C)。雖然該葉中的細胞上抑制素作用未被記錄，報道了TGF-β1與中葉的促黑激素細胞共同定位，表明它在調(diào)節(jié)該細胞類型中起到了作用(46)。β聚糖的陽性免疫染色在垂體的后葉中檢測不到(圖3C)。
在睪丸內(nèi)，在大鼠睪丸間質(zhì)細胞中觀察到輕微的β聚糖染色，但在支持細胞或精細胞中在任何階段沒有可見的可辨別染色(圖3D)。另外，附睪間質(zhì)染成對β聚糖陽性(圖3E)。β聚糖對睪丸間質(zhì)細胞的免疫定位與由睪丸支持細胞分泌的抑制素局部作用，以調(diào)節(jié)睪丸膠質(zhì)細胞中的類固醇生成作用的事實(47，48)，以及抑制素特異性結(jié)合位點被定位到該細胞類型的事實(49)一致。然而，精細胞上不能染色根據(jù)抑制素對配子聲稱的作用的報道，有些出乎意料(50，51)。
在粒層細胞、卵泡膜細胞和間隙細胞中觀察到卵巢內(nèi)陽性β聚糖免疫染色(圖3F)。與睪丸中的發(fā)現(xiàn)類似，該定位與記載的抑制素對大鼠卵泡膜細胞的雄激素生產(chǎn)的作用相符(47)。
在成年雄性大鼠大腦中，在前腦的tenia tecta中β聚糖-免疫反應性(ir)纖維(圖3A)。還在大鼠前腦的中隔海馬回核中發(fā)現(xiàn)β聚糖-ir纖維(數(shù)據(jù)未顯示)。值得注意的是，該β聚糖在tenia tecta中的中心定位對應于抑制素/活化素α-和βA-亞基mRNA在該相同區(qū)域中的存在(52)。因此可能大腦區(qū)域中分泌的成熟抑制素與類似定位的β聚糖相互作用。雖然α、βA和βB亞基蛋白和mRNA廣泛分布在大鼠大腦的整個rostrocaudal extent中(雖然是低水平)，β聚糖-ir纖維的檢測限于這兩個大腦區(qū)域，在大鼠大腦的任何區(qū)域未觀察到β聚糖的核周體染色。可能β聚糖在其它大腦區(qū)域中的表達由于低翻譯、迅速蛋白質(zhì)降解或蛋白質(zhì)的快速運輸在免疫組織化學的可檢測水平之下，表明大鼠的秋水仙素處理可能是目測對β聚糖免疫陽性細胞體必需的。還可能在這些區(qū)域內(nèi)表達與β聚糖不同的相關(guān)抑制素受體成分，進行與β聚糖類似的介導抑制素反應的功能。
實施例8β聚糖介導促腎上腺皮質(zhì)激素細胞和卵巢細胞系中活化素信號傳導的拮抗。
雖然許多活化素反應被抑制素有效封閉，還有抑制素對活化素反應沒有可測量作用的情況(5，6，53，54)。已顯示例如在過度表達ActRII的K562紅白血病細胞中，3TPLux報告質(zhì)?；罨亟閷У恼T導不受加入高濃度抑制素的影響(5)。先前描述了活化素A抑制促腎上腺皮質(zhì)激素細胞系AtT20中堿性ACTH的分泌的能力，其中抑制素類似的被發(fā)現(xiàn)對活化素反應沒有作用(6)。
為了直接測試β聚糖是否能介導抑制素封閉活化素信號傳導，將大鼠β聚糖cDNA和3TPLux報告子質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入AcT20細胞，來確定是否β聚糖能對這些細胞賦予抑制素反應性。在轉(zhuǎn)染后，測量抑制素封閉活化素誘導熒光素酶的活性。
圖4A顯示當AtT20被空3TPLux載體或表達β聚糖xDNA的3TPLux載體共轉(zhuǎn)染后，提高的活化素A濃度導致3TPLux活性劑量依賴性的增加。然而當另外用2.5nM抑制素處理細胞時，β聚糖轉(zhuǎn)染的細胞中活化素的反應大大下降，而被空載體轉(zhuǎn)染的細胞中活化素反應不受抑制素的影響(圖4A)。
為了測量該β聚糖介導的抑制素作用的劑量依賴性，再次用空載體或含有β聚糖的3TPLux質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞。用一定范圍濃度的抑制素A(圖4B)在存在或不存在1nM活化素A的情況下處理轉(zhuǎn)染的細胞。如圖4B所示，抑制素封閉3TPLux的活化素誘導的活性是劑量依賴性的，并且需要β聚糖。抑制素在表達β聚糖的細胞中的該作用是濃度依賴性的，抑制素的估計IC50具有8-10pM(圖4B)。
還測試了β聚糖對兩種其它細胞系的抑制素反應性的作用。雖然發(fā)現(xiàn)卵巢細胞系KK-1具有弱抑制素反應性(數(shù)據(jù)未顯示)，但是被β聚糖cDNA轉(zhuǎn)染的KK-1細胞變得對抑制素高度敏感。在過度表達活化素受體的K562紅白血病細胞(KAR6)中，3TPLux報告子質(zhì)粒的活化素介導的誘導在很大程度上未受加入高濃度抑制素的影響(5)。圖4D顯示KAR6細胞還顯示活化素誘導的熒光素酶報告活性在轉(zhuǎn)染β聚糖cDNA后，而不是在轉(zhuǎn)染空載體后抑制素依賴性的減少。
聯(lián)合結(jié)合和交聯(lián)結(jié)果，這些結(jié)果進一步支持了一種模型，其中β聚糖作為抑制素受體，初始抑制素與ActRII結(jié)合，從而限制活化素與ActRII的接觸，并拮抗活化素信號傳導。值得注意的是雖然β聚糖/ActRII的抑制素估計的親和力是約200pM，抑制素對功能性實驗中測試的這三種細胞類型的反應的IC50值范圍低得多(5-50pM)。在一些實驗中，在未加入抑制素時，β聚糖過度表達可變的抑制活化素誘導的報告子活性，提示β聚糖與ActRII在不存在抑制素的情況下相互作用，來干涉活化素信號傳導。不能排除可能抑制素/ActRII/β聚糖復合物還可引發(fā)新的與活化素誘導的不同的信號來產(chǎn)生不依賴于活化素或其受體復合物的抑制素反應。
實施例9
抗-β聚糖抗血清實驗為了研究內(nèi)源β聚糖在介導抑制素作用中的可能的生理學重要性，對β聚糖胞外功能域的一部分產(chǎn)生抗體，檢測了這些抗體對抑制素的生物反應的作用。在家兔中產(chǎn)生抗-β聚糖抗血清(Ab-BG)，針對之前報道得到的序列，得到能封閉β聚糖-依賴性TGF-β信號傳導的抗體(34)。圖5顯示抑制素將FSG分泌減少到對照或正常家兔血清(NRS)處理的細胞中測量的約30％。加入Ab-βG以劑量依賴形式逆轉(zhuǎn)該抑制素作用，而以等劑量加入的正常加入血清(NRS)沒有作用。這些數(shù)據(jù)表明β糖苷免疫中和抑制抑制素抑制原代垂體細胞分泌FSH的能力。這支持了β聚糖或免疫學上相關(guān)的蛋白質(zhì)與抑制素對垂體的作用有關(guān)的猜想。
實施例10抑制素與β聚糖和ActRII的相互作用的可能模型幾種生長因子和細胞因子需要細胞表面的蛋白聚糖來獲得與其相關(guān)的信號傳導受體的接觸，并施加生物應答(55)。本文列出的數(shù)據(jù)與一種模型(圖6)一致，其中抑制素/β聚糖復合物與活化素競爭與ActRII的接觸。這因此可以防止活化素/ActRII復合物的形成，這種復合物是隨后ALK4的補充和活化素信號傳導級聯(lián)必需的。該模型與對于TGF-β信號傳導提出的機制類似但結(jié)果不同，在后者中β聚糖濃縮細胞表面的TGF-β，將其遞呈給其協(xié)同II型受體來增強信號傳導(56)。近來提出的有關(guān)紅木(Mahogany)的蛋白聚糖促進拉美刺鼠的MSH拮抗劑與MSH受體(57，58)結(jié)合的作用最可能是與β聚糖對于本文報道的抑制素作用的影響。
本文引用了下列參考文獻1.Vale等，1988，蛋白質(zhì)激素的抑制素家族的化學和生物學鑒定。于Laurentian激素會議，1988 Clark，JH.(編)Resent Progresss in HormoneResearch，Inc.，San Diego卷44，1034。
2.Vale等，1998，活化素、抑制素和受體絲氨酸超家族以及Smad蛋白質(zhì)。于關(guān)于卵巢功能性Sapporo的第四屆Sapporo國際專題討論會，1998年一月到1998八月7-8。
3.Kessler Dam，DA(1994)脊椎動物胚胎誘導中胚層和神經(jīng)圖式。Science266596-604。
4.Vale W，Rivier C 1995活化素和抑制素。于Munson P(編)，藥物學原理基礎概念和臨床應用。Chapman & Hall，New York，883-886。
5.Lebrun，J-J，Vale WW 1997活化素和抑制素對I型和II型活化素受體的配體依賴性異二聚化作用和人紅細胞樣細胞分化的拮抗作用。
6.Bileziljian等，1991，活化素-A抑制AtT20細胞中鴉黑皮素原信使RNA聚集和促腎上腺皮質(zhì)激素的分泌，Mol Endocriniol 51389-1395。
7.Massague J 1990轉(zhuǎn)化生長因子β家族，Annu.Rev.Cell Biol 6597-641。
8.Attisano等，1996，活化素受體復合物的信號傳導的激活Mol.Cell.Biol.161066-1073。
9.Mathews LS，Vale WW 1991活化素受體，以后預測多種跨膜絲氨酸激酶的表達克隆，Cell 65973-982。
10.Mathews等，1992第二類活化素受體的克隆和在非洲爪蟾胚胎中的特征確定，Science 2551702-1705。
11.Attisano等，1992，新活化素受體不同的基因和另外的mRNA剪切產(chǎn)生了絲氨酸/蘇氨酸激酶受體的文庫，Cell 6897-108。
12.Lin等，1992，表達克隆TGF-βII型受體，一種功能上跨膜絲氨酸/蘇氨酸，Cell 68775-785。
13.Ten Dijke等，1993，活化素受體樣激酶一類具有預測的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的新的細胞表面受體亞類，Oncogene，82879-2887。
14.Carcamo等，1994，I型受體指定生長抑制和對轉(zhuǎn)化生長因子β和活化素的轉(zhuǎn)錄反應。Mol.Cell.Biol 143810-3821。
15.Yamashita等(1994)，用于轉(zhuǎn)化生長因子β的i型和II型受體的異源寡聚復合物的形成。J.Biol.Chem.26920172-20178。
16.Daopin S等，1992，轉(zhuǎn)化生長因子2的晶體結(jié)構(gòu)該超家族不尋常的折疊。Science 257373。
17.Griffith DL等，1996，重組人成骨蛋白1的三維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化生長因子β超家族的結(jié)構(gòu)范例，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93878-883。
18.Martens等，1997，抑制素在中國倉鼠卵巢細胞內(nèi)的活化素受體復合物水平上干涉活化素信號傳導，Endocrinology 1382928-36。
19.Xu等，1995，抑制素通過顯性-隱性機制拮抗活化素對肝細胞生長的抑制，J.Biol.Chem.2706308-6313。
20.Yu等，1987，F(xiàn)SH釋放蛋白質(zhì)和抑制素在紅細胞分化中的作用，Nature330765-767。
21.Derynck R，Zhang Y，F(xiàn)eng XH 1998 SmadsTGF-β反應的轉(zhuǎn)錄激活物，Cell 95737-740。
22.Massague J 1998 TGF-β信號轉(zhuǎn)導，Annu.Rev Biochem 67753-91。
23.Xu等，1995，顯陰性的骨形態(tài)發(fā)生蛋白4受體導致非洲爪蟾外胚層中的神經(jīng)化Biochem Biophys Res Commun 212212-9。
24.Woodruff T，1998，抑制素a-亞基敲除的小鼠的性腺腫瘤中抑制素受體的鑒定，Journal of Biological Chemistry 273398-403。
25.Hertan，R.等，1999，對培養(yǎng)物中羊垂體細胞鑒定抑制素的高親和力結(jié)合位點，Endocrinology 140，6-12。
26.Massague J，與B1985類似，β型轉(zhuǎn)化生長因子的細胞受體，J.Biol.Chem.2602636-2645。
27.Lopez-Casillas等，1991，膜蛋白聚糖β聚糖，TGF-β受體系統(tǒng)的一個成員的結(jié)構(gòu)和表達，Cell 67785-95。
28.Wang等，1991，TGF-βIII型受體的表達克隆和特征確定67797-805。
29.Derynck R，F(xiàn)eng XH，1997，TGF-β受體信號傳導，Biochem Biophys Acta1333F105-50。
30.Wang等，1991，TGF-βIII型受體的表達克隆和特征確定，Cell 67797-805。
31.Lopez-Casillas等，β聚糖可作為TGF-β接觸信號傳導受體的雙重調(diào)節(jié)劑配體結(jié)合與GAG接觸位點的作圖，J Cell Biol 124557-68。
32.Sun L，Chen C 1997，轉(zhuǎn)化生長因子βIII型受體的表達抑制人乳腺癌MDA-MB-231細胞的腫瘤原性，J.Biol.Chem.27225367-72。
33.Chen C，Wang XF，Sun L 1997，轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)III型受體的表達恢復人乳腺癌MCF-7細胞中的TGFβ1活性，J.Biol.Chem.27212862-7。
34.Brown等，1999，心臟中心內(nèi)膜細胞轉(zhuǎn)化對于III型TGF-β受體的要求，Science 2832080-2。
35.Chen C，Okayama H.1987，質(zhì)粒DNA對哺乳動物細胞的高效率轉(zhuǎn)化，Mol.Cell.Biol.72745-2752。
36.Vale W等，1983于酶學方法神經(jīng)內(nèi)分泌肽Conn P M(編)Academic Press，New York，pp.565-577。
37.Kananen K等，1995，攜帶小鼠抑制素α-亞基啟動子/猿病毒t-抗原融合基因的轉(zhuǎn)基因小鼠中的性腺腫瘤原性卵巢腫瘤的確定特征和促性腺素反應性粒層細胞系的建立，Molecular Endocrinology，9616-627。
38.Mason等，1985，卵巢卵泡液抑制素的互補DNA序列顯示前體結(jié)構(gòu)和與轉(zhuǎn)化生長因子β的同源性，Nature 318659-663。
39.Vale等，1990，生長因子的抑制素/活化素家族，于Sporn等(編)，肽生長因子及其受體，實驗藥物學手冊，Springer-Verlag，Heidelberg，卷95/II，211-248。
40.Mason等，1985，卵巢卵泡液抑制素的互補DNA序列顯示前體結(jié)構(gòu)和與轉(zhuǎn)化生長因子β的同源性，Nature 318659-663。
41.Mason等，1986，兩種人卵巢抑制素的結(jié)構(gòu)，Biochem Biophys Res Commun135957-64。
42.Mayo等，1986，來自豬卵巢和人胎盤的抑制素α-亞基cDNA，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 835849-5853。
43.Carroll等，1989，抑制素、活化素和濾泡素抑制素濾泡刺激性激素信使核糖核酸水平的調(diào)節(jié)，Mol.Endocrinol 31969-1976。
44.Sarkar DK，Kim KH，Minami S 1992，垂體腺中轉(zhuǎn)化生長因子β1信使RNA和蛋白質(zhì)表達-其對促乳激素分泌和促乳激素細胞生長的作用，Mol Endocrinol61825-183345.Sarkar等，1998，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-βI型和TGF-βII型受體在垂體促乳激素細胞中對分泌性TGF-β1調(diào)節(jié)的基因表達中的作用，Endicrinology1393620-8。
46.Burns G，Sarkar DK 1993，大鼠垂體腺中轉(zhuǎn)化生長因子β1-樣免疫反應性雌激素的作用，Endocrinology 1331444-9。
47.Hsueh等，1987，抑制素亞基的雜二聚體和同二聚體具在調(diào)節(jié)黃體素化激素刺激的雄激素生物合成中有不同的旁分泌作用，Proc.Natl.Acad.Sci.USA845082-5086。
48.Morris等，1988，富含原代睪丸足細胞的培養(yǎng)物產(chǎn)生的抑制素濾泡刺激性激素、雄激素和表皮生長因子的調(diào)控，Endocrinology 122717-725。
49.Krummen等，1994通過原位配體結(jié)合對睪丸中發(fā)育過程中抑制素和活化素結(jié)合位點定位，Biol.Reprod 50734-44。
50.Hakovirta等，1993，大鼠精小管上皮循環(huán)中活化素-A、抑制素-A和轉(zhuǎn)化生長因子-1對階段特異性脫氧核酸合成的作用，Endocrinology 1331664-l668。
51.van Dissel-Emiliani等，1989，抑制素減少成年小鼠和中國倉鼠睪丸中精原細胞數(shù)量，Endocrinology 1251899-1903。
52.Roberts VJ，Barth SL，Meunier H，Vale W 1996大鼠大腦中抑制素/活化素亞基和信使核糖核酸的雜交組織化學和免疫組織化學定位，J CompNeurology 364473-493。
53.Schubert D等，1990，活化素是一種神經(jīng)細胞存活分子，Nature344868-870。
54.Darland DC等，1995，睫狀神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的發(fā)育目標中濾泡素抑制素表達顯示了調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)表型的作用，Neutron，15857-866。
55.Schlessinger J等，1995，蛋白聚糖對生長因子活化的調(diào)節(jié)低親和力受體的作用是什么？Cell 83357-360。
56.Lopez-Casillas等，1993，β聚糖代表了TGF-β信號傳導受體的配體，Cell731435-44。
57.Gunn TM等，1999，小鼠mahogany基因座編碼人吸引素(attractin)的跨膜形式，Nature 398152-156。
58.Nagle D等，1999 Nature，398148-152。
本說明書中提到的任何專利表明了本發(fā)明涉及的領(lǐng)域的技術(shù)人員的水平。這些專利和出版物在此引入以供參考，其程度如同各獨立出版物特別并分別表明引入以供參考。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將不難理解本發(fā)明適合實施目的并獲得提到的結(jié)果和優(yōu)點，以及那些本文中提到的目的、結(jié)果和優(yōu)點。本文的實施例以及方法、程序、療法、分子和本文所述的具體化合物是優(yōu)選例的代表，是示范性的，不意味著限制本發(fā)明的范圍。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員可進行改變和其他用途，這些在權(quán)利要求限定的本發(fā)明的精神內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種增加細胞中活化素誘導的信號傳導的方法，其特征在于，該方法包括步驟抑制所述細胞表面抑制素/β聚糖復合物的形成。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述抑制素/β聚糖復合物的形成被針對β聚糖的胞外表位的抗-β聚糖抗血清所抑制。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述細胞中β聚糖的表達被抑制。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，β聚糖的表達被β聚糖的反義轉(zhuǎn)錄物抑制。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，β聚糖的表達被所述細胞中至少一個β聚糖等位基因的誘變抑制。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述β聚糖等位基因通過同源重組突變。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述細胞是垂體細胞。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，活化素信號傳導的增強提高了所述細胞中促卵泡成熟激素的產(chǎn)生。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法增加了生育力。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化素信號傳導的增加減輕了所述細胞中的病理狀況。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述病理狀況選自生殖、發(fā)育、皮膚、骨骼、肝臟、造血和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述病理狀況是前列腺癌。
13.一種針對β聚糖胞外部分的抗血清，其特征在于，所述抗血清抑制抑制素與β聚糖的結(jié)合。
14.一種藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物含有權(quán)利要求13所述的抗血清和藥物學載體。
15.一種抑制細胞中活化素誘導的信號傳導的方法，其特征在于，該方法包括步驟增加所述細胞表面形成的抑制素/β聚糖復合物。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述抑制素/β聚糖復合物的形成是通過提高所述細胞中β聚糖的表達增加的。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，該方法還包括步驟對所述細胞施用其它抑制素。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，通過用含有β聚糖基因的人工構(gòu)建物轉(zhuǎn)染所述細胞增加β聚糖表達。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述β聚糖基因組成型表達。
20.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述β聚糖基因是由誘導型啟動子表達的。
21.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述方法用于在活化素信號傳導不受抑制素正常影響的細胞中引起對抑制素的敏感性提高。
22.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述活化素信號傳導的抑制減輕了所述細胞中的病理狀況。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述病理狀況選自生殖、發(fā)育、皮膚、骨骼、肝臟、造血和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述病理狀況選自性腺癌、腎上腺癌和肝臟發(fā)育不良。
25.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，該方法用于促進受傷肝臟中的肝臟再生。
26.一種篩選抑制抑制素/β聚糖復合物形成，從而提高活化素信號傳導的化合物的方法，其特征在于，該方法包括步驟a)在所述化合物存在或不存在下培育來自表達β聚糖的細胞的膜；b)進行試驗，測量抑制素對β聚糖的結(jié)合；c)比較與所述化合物一起培養(yǎng)的細胞對未處理細胞的試驗結(jié)果，其中抑制抑制素/β聚糖復合物形成的化合物將導致更低水平的抑制素結(jié)合。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述化合物選自肽、蛋白質(zhì)和小分子。
28.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述試驗是標記和未標記抑制素之間的競爭性結(jié)合試驗。
29.一種用權(quán)利要求26所述的方法鑒定出的化合物。
30.一種篩選化合物的方法，該化合物提高抑制素/β聚糖復合物的形成，來抑制活化素信號傳導，其特征在于，該方法包括步驟a)在所述化合物存在或不存在下培育來自表達β聚糖的細胞的膜；b)進行試驗，測量抑制素與β聚糖的結(jié)合；c)比較與所述化合物一起培養(yǎng)的細胞對未處理細胞的試驗結(jié)果，其中提高抑制素/β聚糖復合物形成的化合物將導致更高水平的抑制素結(jié)合。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述化合物選自肽、蛋白質(zhì)和小分子。
32.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述試驗是標記和未標記抑制素之間的競爭性結(jié)合試驗。
33.一種用權(quán)利要求30所述的方法鑒定出的化合物。
全文摘要
抑制素和活化素是可逆調(diào)控多種調(diào)節(jié)系統(tǒng)的蛋白質(zhì)激素。競爭性結(jié)合實驗揭示了β聚糖、III型TGF－β受體，還起到了抑制素受體的作用。β聚糖上調(diào)抑制素與ActRII活化素受體的結(jié)合。通過上調(diào)抑制素與ActRII的結(jié)合，β聚糖有效隔絕了ActRII與活化素結(jié)合，從而減弱了活化素信號傳導。另外，ActRII－β聚糖復合物可產(chǎn)生與通過ActRII和ALK4的活化素信號傳導不同的新信號。β聚糖在大鼠大腦的不連續(xù)核和成年大鼠的垂體、睪丸和卵巢內(nèi)的特定類型細胞中產(chǎn)生。抑制素－反應性組織和細胞類型中β聚糖的存在，以及該蛋白聚糖能結(jié)合抑制素，并賦予抑制素敏感性的能力，與β糖苷作為抑制素特異性受體，調(diào)節(jié)各種組織中抑制素反應的作用一致。
文檔編號A61K48/00GK1450907SQ00818570
公開日2003年10月22日 申請日期2000年12月14日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月15日
發(fā)明者W·韋爾, P·C·格雷, A·L·布倫特, K·A·劉易斯, L·M·比利齊吉 申請人:研究發(fā)展基金會