專利名稱：通過錨定于膜的gp41肽的表達(dá)進(jìn)行HIV陽性病人的基因治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過錨定于膜的gp41肽的表達(dá)進(jìn)行HIV感染的基因治療。用此治療，第一次制造了編碼一種包含由可彎曲的連接體連接的源于HIV gp41的肽和一種羧基末端跨膜錨的融合蛋白的載體。
已提出非常廣泛多樣的治療方法來治療HIV感染。然而，已有的活性物質(zhì)已證實(shí)不被許多病人耐受。為了改進(jìn)AIDS的治療，正不斷地尋找新的作用點(diǎn)和有不同毒性特征的活性物質(zhì)。在此內(nèi)容中，已提出不同的基因治療方法，來抑制HIV復(fù)制中的不同步驟(參看SorgT.&Methali，M.Transfus.Sci.18，277-89(1977))。
Wild等(Wild，C.T.Shugars，D.C.Greenwell，T.K..McDanal，C.B.&Matthews，T.J.Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.91，9770-9774(1994))已提出一種建立在以下發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)上的治療方法，即來源于HIV的跨膜蛋白gp41(參照對(duì)應(yīng)于根據(jù)WIPO標(biāo)準(zhǔn)ST.254的數(shù)字代碼<400>的序列編號(hào)4)的肽，比如，例如，以前稱為DP178的T-20肽，能有效地抑制HIV融合和進(jìn)入細(xì)胞。T-20是一種肽，與gp41的具有七個(gè)重復(fù)的C端，即gp41的細(xì)胞外區(qū)域中兩個(gè)結(jié)構(gòu)域(參照序列編號(hào)4中位置539-589和622-662)之一重疊，并且能夠在體外有效地抑制HIV感染(Weissenhborn，W.，Dessen.，A.，Harrison，S.C.Skehel，J.J&Wiley，D.C.Nature 387，426-430(1997)；Chan，D.C.Fass，D.，Berger，J.M.&Kim，P.S.Cell 89.263-273(1997)；Furuta，R.A.，Wild，C.T.，Weng Y&Weiss，C.D.Nat.Struct.Biol.5，276-279(1998))。
在一個(gè)臨床研究(Kilby，J.M.，Hopkins S.，Venetta，T.M.等.Nat.Med.4，1302-1307(1998))中，就短期給藥而言，T-20證實(shí)可安全和有效地抑制HIV復(fù)制。然而，為達(dá)到抗病毒效果，且如果口服肽不是生物可利用的，具有非常短的半衰期，則需要非常大量的肽，并且大規(guī)模的生產(chǎn)仍是非常昂貴的，因此本發(fā)明的目的是通過基因治療方法使利用來源于gp41的肽進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)免疫成為可能。
本發(fā)明者因此首先克隆逆轉(zhuǎn)錄病毒載體MPIN的IRES-NEO盒(IRES內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)；NEO新霉素抗性基因)5’端的T20的編碼序列(參照

圖1，Hildinger et al.，Hum.Gene Ther.9(1998)33-42)。為達(dá)到T-20的分泌，一方面使肽在人低親和力神經(jīng)生長因子受體的信號(hào)肽(LNGFR，F(xiàn)ehse et al.，Human Gene Therapy 8(1997)1815)(構(gòu)建體M85 and M86)后直接表達(dá)，另一方面選擇一個(gè)構(gòu)建體，其包含T-20框內(nèi)的來源于Kaposi成纖維細(xì)胞生長因子的膜轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)(mts)(在膜轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)蛋白氨基酸位置43-58；Rojas，M.，Donahue，J.P.，Tan，Z.，Lin，Y.Z.Nat.Biotechnol.16，370-375(1998))的編碼序列(參照?qǐng)D1中結(jié)構(gòu)M89和M90)。使用這些構(gòu)建體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通過phoenix包裝細(xì)胞(Grignani，F(xiàn).，KINSELLA，t.，Mencarelli，A，等.，Cncer Res.58，14-19(1998))的轉(zhuǎn)染產(chǎn)生，上清液被用來感染T輔助細(xì)胞系PM-1(Bou-habib，D.C.et al.，J.Virol.68 6006-6013(1994))。作為對(duì)照，使用MPIN載體，其專門包含新霉素抗性基因作為一種外來基因。在G418選擇后，以HIV-1感染大量培養(yǎng)物，HIV-1產(chǎn)生自前病毒克隆NL4-3(Adachi，A.，GendelmanH.E.，Koenig，S.，F(xiàn)olks，T.，Willey，R.，Rabson，A.&Martin，M.A.，J.Virol.59 284-291(1986))或NL4-3/GFP(Welker，R.，Harris，M.，Cardel，B.&Krausslich，H.G.J.，Virol.72，8833-8840(1998))。這兩種克隆的不同之處在于，就NL4-3/GFP而言，綠色熒光蛋白(GFP)取代nef蛋白表達(dá)，因此HIV-1復(fù)制能夠在P24抗原產(chǎn)量基礎(chǔ)上和/或通過流式細(xì)胞儀來分析。與所有的預(yù)期相比較，通過上述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建體表達(dá)的T-20肽仍然令人吃驚地沒有導(dǎo)致任何類型的抗病毒活性。
一種編碼在T-20編碼區(qū)域框內(nèi)的整聯(lián)蛋白結(jié)合的RGD肽的序列被克隆進(jìn)入這些構(gòu)建體。這些構(gòu)建體的產(chǎn)生是基于RGD基序能使分泌肽保持在細(xì)胞膜上的考慮。然而，即使產(chǎn)生了包含RGD的被分泌的T-20肽(參照?qǐng)D1，M86)，仍可發(fā)現(xiàn)能繁殖的HIV復(fù)制。
在本發(fā)明的內(nèi)容中，現(xiàn)在令人吃驚地確定P24的產(chǎn)量和NL4-3/GFP的傳播能明顯地減少，前提是融合蛋白被表達(dá)，這種融合蛋白除了氨基末端的gp41肽之外，包含通過一種可彎曲的連接體連接到羧基末端的跨膜錨。在本文，名詞“gp41肽”意味著HIV的gp41蛋白的一個(gè)片段或它的一個(gè)片段，變異體或突變體。
例如，已確定P24產(chǎn)量能被減少多于102，前提是PM-1由一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，該載體表達(dá)一種融合蛋白，其中T-20通過一種可彎曲的肽連接體在C末端與一種跨膜肽(跨越膜的結(jié)構(gòu)域，MSD)(參照?qǐng)D1，M87)連接，其中融合蛋白有序列編號(hào)2所指示的序列。
本發(fā)明的對(duì)象因此是通式5’-SP-FI-鉸合部-MSD-3’的核酸序列，其中“5表示核酸序列的5’端，“3表示核酸序列的3’端，“SP”編碼信號(hào)肽，該信號(hào)肽介導(dǎo)一種被表達(dá)的肽轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，“FI”編碼HIV(優(yōu)選HIV-1)的gp41蛋白的片段，它包含源于具有七個(gè)重復(fù)的區(qū)域的部分，“MSD”編碼1型膜蛋白的跨膜錨，“鉸合部”編碼一種蛋白序列，其作為一種可彎曲的連接體，連接由“FI”和“MSD”編碼的肽。
編碼信號(hào)肽的序列來源于人類非免疫原性蛋白的編碼序列，優(yōu)選地選自細(xì)胞膜蛋白信號(hào)肽，比如，例如(人)低親和力神經(jīng)生長因子受體(LNGFR)，白細(xì)胞介素2受體(IL-2R)以及粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體(GM-CSFR)的編碼序列。
作為1型膜蛋白(即N端定位在細(xì)胞外，C端定位在細(xì)胞內(nèi)的膜蛋白)的跨膜錨，被使用的蛋白胞質(zhì)區(qū)域應(yīng)刪除，避免任何不需要的通過蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，能夠闡明沒有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用從表達(dá)的區(qū)域發(fā)散，他們不與其他相似的膜蛋白寡聚化從而以這種方式對(duì)細(xì)胞功能發(fā)揮間接作用。優(yōu)先考慮來自LNGFR或CD34的跨膜區(qū)的肽。核酸序列因此優(yōu)選包括MSD，即一種編碼這些跨膜錨的核酸序列和/或一種編碼胞質(zhì)區(qū)域被刪除的片段的核酸序列。
根據(jù)本發(fā)明，可以使用所有使gp41肽和跨膜錨間可彎曲的連接成為可能的可彎曲肽作為可彎曲的連接體，比如，例如，免疫球蛋白G(IgG)的鉸合部，人P-糖蛋白的連接體(C.A.Hrycyna等.，Biochemistry 37 13660-13673(1998))，人復(fù)制蛋白A的C端連接體(hsRPA；參照D.M.Jacobs等.，J.Biomol.NMR 14，321-331(1999))以及甲狀旁腺激素相關(guān)的蛋白的連接體(M.Weidler等.FEBSLett.444，239-244(1999))。連接體優(yōu)選最多到30個(gè)氨基酸的長度。因此根據(jù)本發(fā)明上式的核酸序列包括編碼這種連接體的核酸序列部分，優(yōu)選對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)1的核苷酸1636到1683的IgG鉸合部。
已經(jīng)提到，F(xiàn)I編碼一種對(duì)應(yīng)于HIV-gp41蛋白(參照序列編號(hào)4，包括HIV類似物種(分化體)的gp41蛋白)的序列的一部分的肽(指定為gp41肽)，其選自兩個(gè)具有七個(gè)重復(fù)的區(qū)域(參照序列編號(hào)3和4中的氨基酸位置539-589和622-662)之一。在這篇文章中“HIV”包括所有HIV類型，特別是HIV-1。在這篇文章中，例如，期望HIV-2 gp41肽的使用將導(dǎo)致和HIV-1的交叉反應(yīng)性，反之亦然。
由FI編碼的gp41肽優(yōu)選具有28個(gè)氨基酸的最小長度，因此FI包括至少84個(gè)核苷酸。在本發(fā)明的內(nèi)容中，特別將一個(gè)編碼由序列編號(hào)2中位置31到66(對(duì)應(yīng)于肽T-20)表示的氨基酸序列的核酸序列作為FI使用，優(yōu)選序列編號(hào)1中從核苷酸1528到核苷酸1635表示的序列。根據(jù)特定的實(shí)施方案，由FI編碼的肽最大長度為40個(gè)氨基酸，對(duì)應(yīng)于編碼區(qū)域FI的120個(gè)堿基的最大長度。
根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施方案，通式“SP-FI-鉸合部-MSD”的核酸序列具有序列編號(hào)1中從核苷酸1438到核苷酸1773表示的序列，該序列編碼序列編號(hào)2表示的融合蛋白。
本發(fā)明的另一對(duì)象是每種情況下由上述載體/核酸序列所編碼的融合蛋白，由通式NH2-sp-fi-鉸合部-msd-COOH表示，其中“NH2”表示蛋白的氨基末端“COOH”表示蛋白的羧基末端“sp”是信號(hào)肽，它使一個(gè)表達(dá)了的肽能夠轉(zhuǎn)移到內(nèi)織網(wǎng)，“fi”是HIV的gp41蛋白的片段，它包含來自于具有七個(gè)重復(fù)的區(qū)域的部分，“msd”是I型膜蛋白的跨膜錨，以及“鉸合部”是作為可彎曲的連接體連接“fi”和“msd”肽的蛋白序列。
關(guān)于“sp”，“fi”，“鉸合部”以及“msd”的定義，應(yīng)參考前面所述序列元件“SP”，“FI”，“鉸合部”和“MSD”的定義，其中融合蛋白和/或蛋白的獨(dú)立部分區(qū)域的結(jié)構(gòu)和功能特性已經(jīng)提到。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，融合蛋白具有序列編號(hào)2中表示的氨基酸序列。因此在剪切信號(hào)肽后獲得的融合蛋白(“fi-鉸合部-msd”)具有序列編號(hào)2中從位置31到位置111表示的序列。
因此本發(fā)明也包括上述融合蛋白的同源物和/或變異體和片段，它們基本上具有同樣的藥理學(xué)和生物學(xué)作用和/或免疫原性和編碼這些同源物和片段的核酸序列。在本文中，名詞“同源物”和“變異體”表示不同于迄今已知的天然序列或序列部分的序列，這種不同是通過個(gè)別氨基酸的替換，缺失或插入而產(chǎn)生的。本文中特別包括由序列編號(hào)2表示的蛋白的同系物，變異體和片段以及編碼這些蛋白的核酸序列。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種包含上述核酸序列的載體。載體優(yōu)選的是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，載體具有圖1所表示的結(jié)構(gòu)。編碼本發(fā)明融合蛋白的通式“SP-FI-鉸合部-MSD”表示的載體插入片段優(yōu)選具有序列編號(hào)1中表示的核酸序列。剛才提到的載體的一個(gè)樣品根據(jù)布達(dá)佩斯條約于1999年11月11日保藏于德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ)，Mascheroder Weg 1b，38124 Brunswick，德國，編號(hào)為DSM 13139。
上述提到的載體用于T-淋巴細(xì)胞和造血干細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染，從而將這些轉(zhuǎn)染的細(xì)胞給予HIV感染病人，用于治療性療法。本發(fā)明的載體特別適合在HIV感染的病人的基因治療性療法中使用(即直接(體內(nèi))應(yīng)用)，在這種情況下，載體優(yōu)選帶有靶向性，即對(duì)HIV靶細(xì)胞(CD4+細(xì)胞)有特異性。本發(fā)明進(jìn)一步涉及基因治療藥物，其包含上述載體。
下面參考實(shí)施例進(jìn)一步解釋本發(fā)明。
傳染性有復(fù)制能力的病毒通過在Hela細(xì)胞中轉(zhuǎn)染NL4-3或NL4-3/GFP-DNA而產(chǎn)生。假型無復(fù)制能力HI V通過PNL4-3env-GFP和293細(xì)胞中外殼表達(dá)質(zhì)粒之一的共同轉(zhuǎn)染而產(chǎn)生。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體如上所述(Grignani，F(xiàn).，Kinsella，T.，Mencarelli，A.，等.，CancerRes.58，14-19(1998))在Phoenix包裝細(xì)胞中被包裝。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的克隆M85和M86編碼人低親和力神經(jīng)生長因子受體(LNGFR)的信號(hào)肽的序列通過使用引物SPNot+(序列編號(hào)5)和SPBg12(序列編號(hào)6)從載體DLN起始的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，借此將NotI剪切位點(diǎn)插入5’末端，將Bg1II剪切位點(diǎn)插入3’末端(DLNFehse等，HumanGene Therapy 8(1997)1815)。使用引物T20Bg1+(M85；序列編號(hào)7)或T20Bg1-RGD+(M86；序列編號(hào)8)和T20Hind-(序列編號(hào)9)從NL4-3擴(kuò)增編碼融合抑制肽的序列，借此將Bg1II剪切位點(diǎn)插入5’末端，將HindIII剪切位點(diǎn)插入3’末端。片段連接進(jìn)入用NotI和HindIII消化的載體pBluescriptKS。
M87和M88使用5’引物從dLN擴(kuò)增dLNGFR的跨膜區(qū)域，它也包括鼠IgG重鏈的鉸合部和Bg1II剪切位點(diǎn)(鉸合部TMBg1+序列編號(hào)10)，以及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體dLN(U3-；序列編號(hào)11)的3’引物。將該P(yáng)CR產(chǎn)物，連同信號(hào)肽PCR產(chǎn)物(SPNot+/SPBg1-)一起插入載體pBluescriptKS(以NotI和HindIII消化后)中，T20(從NL4-3起始)的序列作為PCR產(chǎn)物隨后被插入，其包括側(cè)翼Bg1II剪切位點(diǎn)(通過使用對(duì)應(yīng)于序列編號(hào)7(見上)的PCR引物T20Bg1+和相應(yīng)于序列編號(hào)12的T20Bg1-)。
M89和M90使用引物RGD-T20Not+(M89；序列編號(hào)13)或T20Not+(M90；序列編號(hào)14)和T20mtsHind-(序列編號(hào)15)從NL4-3擴(kuò)增編碼帶有膜轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)(mts)的T20的序列。在5，引物中，存在NotI剪切位點(diǎn)，在3’引物中有HindIII剪切位點(diǎn)。膜轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)(mts)以3’引物引入。產(chǎn)物被插入以NotI和HindIII消化的載體pBluescriptKS。
然后將編碼不同的T20融合蛋白的基因作為NotI X HindIII片段與polio-IRES一起從SF1 MIN轉(zhuǎn)移到載體MP1N(Hildinger等，Hum.Gene Ther.9(1998)33-42)中。用HIV感染PM-1細(xì)胞(在0.5mL中有5×104)被TCID50(50％組織培養(yǎng)感染劑量)為3000到6000的有復(fù)制能力HIV感染。為分析P24產(chǎn)量，培養(yǎng)基在第5天改變，細(xì)胞孵育過夜，沒有細(xì)胞的殘余物使用P24 ELISA法按前面所述方法檢測(cè)(Konvalinka，J.，Litterst.，M.A.，Welker，R.，等，J.Virol.69，7180-7186(1995))。結(jié)果在圖2中表示。
用NL4-3/GFP進(jìn)行的感染用帶有FACScalibur(BecktonDickinson，Heidelberg，Germany)的流式細(xì)胞儀分析的指示進(jìn)行進(jìn)一步監(jiān)測(cè)。為此目的，PM-1(有或沒有載體MP1N和M85到M87)用0.01moi(moi感染復(fù)數(shù)；描述用于感染細(xì)胞的病毒顆粒的數(shù)目)NL-4/GFP感染，在第4，7和10天通過流式細(xì)胞儀析。不同培養(yǎng)過程中EGFP陽性百分比和如此用HIV感染的細(xì)胞在圖3中顯示。檢測(cè)閾值是大約0.1％陽性細(xì)胞。作用機(jī)制的研究為明確HIV復(fù)制在哪個(gè)階段被抑制，以克隆NL4-3env-GFP進(jìn)行“單輪”感染。由于在env基因中的突變，克隆NL4-3env-GFP是有復(fù)制缺陷的，并且表達(dá)GFP而不是nef。為產(chǎn)生感染的毒粒，載體以三種不同HIV克隆(HXB，YU2和JR-FL)的被膜和皰疹性口炎病毒的G蛋白(VSVG)被形成假型。HXB分類為親T，并使用共同受體CXCR4，而YU2和JR-FL是親M，使用CCR-5。上面提到的兩個(gè)克隆的env基因直接從初級(jí)HIV分離體克隆(He，J.，Chen，Y.，F(xiàn)arzan，M.等，Nature 385，645-649(1997))。這些HIV假型有能力“單輪”感染，但不在整個(gè)培養(yǎng)過程傳播。在PM1/M87細(xì)胞中(即在根據(jù)本發(fā)明以載體轉(zhuǎn)染的，編碼錨定于膜的T20融合蛋白死亡細(xì)胞中)，相對(duì)于VSV-G假型的情況感染通過三種不同HIV被膜被更強(qiáng)(因數(shù)為10-30)地抑制，VSV-G假型沒有發(fā)現(xiàn)顯著的抑制(參照?qǐng)D4)。就象游離T20肽(參照Wild C.T.等，Proc.Nal.Acad.Sci.USA91，9770-9774(1994))，遺傳學(xué)上表達(dá)的錨定于膜的T2 0融合蛋白也抑制通過不同的HIV變異體的被膜介導(dǎo)的進(jìn)入。這些結(jié)果清楚地顯示病毒在通過HIV-env介導(dǎo)的很可能是膜融合的病毒進(jìn)入階段被抑制。病毒進(jìn)入后的所有HIV復(fù)制步驟沒有受影響。
這些調(diào)查顯示錨定于膜的gp41肽有效地抑制HIV復(fù)制，而分泌的純gp41肽無效。
序列表<110>海因里?！宓佟獏f(xié)會(huì)<120>通過錨定于膜的gp41肽的表達(dá)進(jìn)行HIV陽性病人的基因治療<130>P055363<140><141><160>15<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>4148<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明M87(STHM)-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體MPIN，在IRES-NEO盒5′端含有編碼錨定于膜的T-20肽的插入序列。<220><221>misc_特征<222>(1438)..(1773)<223>STHM(含有錨定于膜的T-20肽的編碼區(qū)域的載體插入序列)<220><221>CDS<222>(1528)..(1773)<223>M87(STHM)插入序列中的區(qū)域，編碼錨定于膜的包含信號(hào)肽的T-20融合蛋白<220><221>信號(hào)肽<222>(1438)..(1527)<220><221>CDS<222>(1528)..(1773)<223>具有膜錨的T-20融合蛋白<220><221>misc_特征<222>(1528)..(1635)<223>編碼T-20的區(qū)域<220><221>misc_特征<222>(163 6)..(1683)<223>編碼鉸合部的區(qū)域<220><221>misc_特征<222>(1684)..(1773)<223>編碼膜錨的區(qū)域<220><221>misc_特征<222>(1793)..(2421)<223>Polio-IRES<220><221>misc特征<222>(2380)..(3267)<223>neoR cDNA<220><221>misc_特征<222>(31)..(36)<223>NheI剪切位點(diǎn)<220><221>misc_特征<222>(370)..(377)<223>AscI剪切位點(diǎn)<220><221>misc_特征<222>(400)..(405)<223>XmaI剪切位點(diǎn)<220><221>misc_特征<222>(696)..(701)<223>SacII剪切位點(diǎn)<220><221>misc_特征<222>(1421)..(1426)<223>SacII剪切位點(diǎn)<220><221>misc_特征<222>(1429)..(1436)<223>NotI剪切位點(diǎn)<220><221>misc_特征<222>(1775)..(1780)<223>SalI剪切位點(diǎn)<220><221>misc_特征<222>(1787)..(1792)<223>SphI剪切位點(diǎn)<220><221>misc_特征<222>(1793)..(1798)<223>HindIII剪切位點(diǎn)<220><221>misc_特征<222>(2422)..(2429)<223>NotI剪切位點(diǎn)<220><221>misc_特征<222>(3002)..(3007)<223>SphI剪切位點(diǎn)<220><221>misc_特征<222>(3447)..(3452)<223>HindIII剪切位點(diǎn)<220><221>misc_特征<222>(3586)..(3591)<223>NheI剪切位點(diǎn)<220><221>misc_特征<222>(4000)..(4007)<223>AscI剪切位點(diǎn)<220><221>misc_特征<222>(4030)..(4035)<223>XmaI剪切位點(diǎn)<400>1aatgaaagac cccacctgta ggtttggcaa gctagcttaa gtaacgccat tttgcaaggc 60atggaaaata cataactgag aatagagaag ttcagatcaa ggttaggaac agagagacag 120cagaatatgg gccaaacagg atatctgtgg taagcagttc ctgccccgct cagggccaag 180aacagatggt ccccagatgc ggtcccgccc tcagcagttt ctagagaacc atcagatgtt 240tccagggtgc cccaaggacc tgaaaatgac cctgtgcctt atttgaacta accaatcagt 300tcgcttctcg cttctgttcg cgcgcttctg ctccccgagc tcaataaaag agcccacaac 360ccctcactcg gcgcgccagt cctccgattg actgagtcgc ccgggtaccc gtgttctcaa 420taaaccctct tgcagttgca tccgactcgt ggtctcgctg atccttggga gggtctcctc 480agattgattg actgcccacc tcgggggtct ttcatttgga ggttccaccg agatttggag 540acccctgccc agggaccacc gacccccccg ccgggaggta agctggccag cggtcgtttc 600gtgtctgtct ctgtctttgt gcgtgtttgt gccggcatct aatgtttgcg cctgcgtctg 660tactagttgg ctaactagat ctgtatctgg cggtcccgcg gaagaactga cgagttcgta 720ttcccggccg cagcccctgg gagacgtccc agcggcctcg ggggcccgtt ttgtggccca 780ttctgtatca gttaacctac ccgagtcgga ctttttggag ctccgccact gtccgagggg 840tacgtggctt tgttggggga cgagagacag agacacttcc cgcccccgtc tgaatttttg 900ctttcggttt tacgccgaaa ccgcgccgcg cgtcttgtct gctgcagcat cgttctgtgt 960tgtctctgtc tgactgtgtt tctgtatttg tctgaaaatt agggccagac tgttaccact 1020cccttaagtt tgaccttagg tcactggaaa gatgtcgagc ggatcgctca caaccagtcg 1080gtagatgtca agaagagacg ttgggttacc ttctgctctg cagaatggcc aacctttaac 1140gtcggatggc cgcgagacgg cacctttaac cgagacctca tcacccaggt taagatcaag 1200gtcttttcac ctggcccgca tggacaccca gaccaggtcc cctacatcgt gacctgggaa 1260gccttggctt ttgacccccc tccctgggtc aagccctttg tacaccctaa gcctccgcct 1320cctcttcctc catccgcccc gtctctcccc cttgaacctc ctcgttcgac cccgcctcga 1380tcctcccttt atccagccct cactccttct ctaggcgcca ccgcggtggc ggccgcc 1437atg ggg gca ggt gcc acc ggc cgc gcc atg gac ggg ccg cgc ctg ctg1485Met Gly Ala Gly Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu Leu1 5 10 15ctg ttg ctg ctt ctg ggg gtg tcc ctt gga ggt gcc aga tct tac act1533Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala Arg Ser Tyr Thr20 25 30agc tta ata cac tcc tta att gaa gaa tcg caa aac cag caa gaa aag1581Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys35 40 45aat gaa caa gaa tta ttg gaa tta gat aaa tgg gca agt ttg tgg aat1629Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn50 55 60tgg ttt aga tct gtt cca aga gac tgt gga tgc aaa ccc tgt ata tgt1677Trp Phe Arg Ser Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys65 70 75 80acc ctc atc cct gtc tat tgc tcc atc ctg gct gct gtg gtt gtg ggc1725Thr Leu Ile Pro Val Tyr Cys Ser Ile Leu Ala Ala Val Val Val Gly85 90 95ctt gtg gcc tac ata gcc ttc aag agg tgg aac agg ggg atc ctc tag1773Leu Val Ala Tyr Ile Ala Phe Lys Arg Trp Asn Arg Gly Ile Leu100 105 110agtcgacctg caggcatgca agcttaaaac agctctgggg ttgtacccac cccagaggcc 1833cacgtggcgg ctagtactcc ggtattgcgg tacccttgta cgcctgtttt atactccctt 1893cccgtaactt agacgcacaa aaccaagttc aatagaaggg ggtacaaacc agtaccacca 1953cgaacaagca cttctgtttc cccggtgatg tcgtatacac tgcttgcgtg gttgaaagcg 2013acggatccgt tatccgctta tgtacttcga gaagcccagt accacctcgg aatctcaatg 2073cgttgcgctc agcactcaac cccatagtgt acttaggctg atgagtctcc acatccctca 2133ccggtgacgg tggtccaggt tgcgttggcg gcctacctat ggctaacgcc atgggacgct 2193agttgtgaac aaggtgtgaa gagcctattg agctacataa gaatcctccg gcccctgaat 2253gcggctaatc ccaaccctcg gagcaggtgg tcacaaacca gtgattggcc tgtcgtaacg 2313cgaagtccgt ggcggaaccg actactttgg gtgtccgtgt ttccttttat tttattgtgg 2373ctgcttatgg tgacaatcac agattgttat cataaagcga attggattgc ggccgctcta 2433gaactagtgg atctaattcc tgcagccaat atgggatcgg ccattgaaca agatggattg 2493cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag aggctattcg gctatgactg ggcacaacag 2553acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg cccggttctt 2613tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactgc aggacgaggc agcgcggcta 2673tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg 2733ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt 2793gctcctgccg agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat 2853ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg 2913atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag agcatcaggg gctcgcgcca 2973gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgc atgcccgacg gcgaggatct cgtcgtgacc 3033catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc 3093gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat 3153attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc tcgtgcttta cggtatcgcc 3213gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttcttg acgagttctt ctgagcggga 3273ctctggggtt cgaaatgacc gaccaagcga cgcccaacct gccatcacga gatttcgatt 3333ccaccgccgc cttctatgaa aggttgggct tcggaatcgt tttccgggac gccggctgga 3393tgatcctcca gcgcggggat ctcatgctgg agttcttcgc ccaccccgga tccaagctta 3453tcgataggcc taggcctatc gataggccta ggcctatcga taggcctaac acgagccata 3513gatagaataa aagattttat ttagtctcca gaaaaagggg ggaatgaaag accccacctg 3573taggtttggc aagctagctt aagtaagcca ttttgcaagg catggaaaaa tacataactg 3633agaatagaga agttcagatc aaggttagga acagagagac aggagaatat gggccaaaca 3693ggatatctgt ggtaagcagt tcctgccccg gctcagggcc aagaacagtt ggaacagcag 3753aatatgggcc aaacaggata tctgtggtaa gcagttcctg ccccggctca gggccaagaa 3813cagatggtcc ccagatgcgg tcccgccctc agcagtttct agagaaccat cagatgtttc 3873cagggtgccc caaggacctg aaatgaccct gtgccttatt tgaactaacc aatcagttcg 3933cttctcgctt ctgttcgcgc gcttctgctc cccgagctca ataaaagagc ccacaacccc 3993tcactcggcg cgccagtcct ccgatagact gcgtcgcccg gggtacccgt attcccaata 4053aagcctcttg ctgtttgcat ccgaatcgtg gactcgctga tccttgggag ggtctcctca 4113gattgattga ctgcccacct cgggggtctt tcatt 4148<210>2<211>111<212>PRT<213>人工序列<400>2Met Gly Ala Gly Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala Arg Ser Tyr Thr20 25 30Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys35 40 45Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn50 55 60Trp Phe Arg Ser Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys65 70 75 80Thr Leu Ile Pro Val Tyr Cys Ser Ile Leu Ala Ala Val Val Val Gly85 90 95Leu Val Ala Tyr Ile Ala Phe Lys Arg Trp Asn Arg Gly Ile Leu100 105 110<210>3<211>9709<212>DNA<213>1型人免疫缺陷病毒<220><221>CDS<222>(1)..(2562)<223>編碼HIV-1被膜糖蛋白的區(qū)域<400>3atg aga gtg aag gag aag tat cag cac ttg tgg aga tgg ggg tgg aaa48Met Arg Val Lys Glu Lys Tyr Gln His Leu Trp Arg Trp Gly Trp Lys1 5 10 15tgg ggc acc atg ctc ctt ggg ata ttg atg atc tgt agt gct aca gaa96Trp Gly Thr Met Leu Leu Gly Ile Leu Met Ile Cys Ser Ala Thr Glu
20 25 30aaa ttg tgg gtc aca gtc tat tat ggg gta cct gtg tgg aag gaa gca144Lys Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Glu Ala35 40 45acc acc act cta ttt tgt gca tca gat gct aaa gca tat gat aca gag192Thr Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Asp Thr Glu50 55 60gta cat aat gtt tgg gcc aca cat gcc tgt gta ccc aca gac ccc aac240Val His Asn Val Trp Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn65 70 75 80cca caa gaa gta gta ttg gta aat gtg aca gaa aat ttt aac atg tgg288Pro Gln Glu Val Val Leu Val Asn Val Thr Glu Asn Phe Asn Met Trp85 90 95aaa aat gac atg gta gaa cag atg cat gag gat ata atc agt tta tgg336Lys Asn Asp Met Val Glu Gln Met His Glu Asp Ile Ile Ser Leu Trp100 105 110gat caa agc cta aag cca tgt gta aaa tta acc cca ctc tgt gtt agt384Asp Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Ser115 120 125tta aag tgc act gat ttg aag aat gat act aat acc aat agt agt agc432Leu Lys Cys Thr Asp Leu Lys Asn Asp Thr Asn Thr Asn Ser Ser Ser130 135 140ggg aga atg ata atg gag aaa gga gag ata aaa aac tgc tct ttc aat480Gly Arg Met Ile Met Glu Lys Gly Glu Ile Lys Asn Cys Ser Phe Asn145 150 155 160atc agc aca agc ata aga gat aag gtg cag aaa gaa tat gca ttc ttt528Ile Ser Thr Ser Ile Arg Asp Lys Val Gln Lys Glu Tyr Ala Phe Phe165 170 175tat aaa ctt gat ata gta cca ata gat aat acc agc tat agg ttg ata576Tyr Lys Leu Asp Ile Val Pro Ile Asp Asn Thr Ser Tyr Arg Leu Ile180 185 190agt tgt aac acc tca gtc att aca cag gcc tgt cca aag gta tcc ttt624Ser Cys Asn Thr Ser Val Ile Thr Gln Ala Cys Pro Lys Val Ser Phe195 200 205gag cca att ccc ata cat tat tgt gcc ccg gct ggt ttt gcg att cta672Glu Pro Ile Pro Ile His Tyr Cys Ala Pro Ala Gly Phe Ala Ile Leu210 215 220aaa tgt aat aat aag acg ttc aat gga aca gga cca tgt aca aat gtc720Lys Cys Asn Asn Lys Thr Phe Asn Gly Thr Gly Pro Cys Thr Asn Val225 230 235 240agc aca gta caa tgt aca cat gga atc agg cca gta gta tca act caa768Ser Thr Val Gln Cys Thr His Gly Ile Arg Pro Val Val Ser Thr Gln245 250 255ctg ctg tta aat ggc agt cta gca gaa gaa gat gta gta att aga tct816Leu Leu Leu Asn Gly Ser Leu Ala Glu Glu Asp Val Val Ile Arg Ser260 265 270gcc aat ttc aca gac aat gct aaa acc ata ata gta cag ctg aac aca864Ala Asn Phe Thr Asp Asn Ala Lys Thr Ile Ile Val Gln Leu Asn Thr275 280 285tct gta gaa att aat tgt aca aga ccc aac aac aat aca aga aaa agt912Ser Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser290 295 300atc cgt atc cag agg gga cca ggg aga gca ttt gtt aca ata gga aaa960Ile Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Gly Lys305 310 315 320ata gga aat atg aga caa gca cat tgt aac att agt aga gca aaa tgg1008Ile Gly Asn Met Arg Gln Ala His Cys Asn Ile Ser Arg Ala Lys Trp325 330 335aat gcc act tta aaa cag ata gct agc aaa tta aga gaa caa ttt gga1056Asn Ala Thr Leu Lys Gln Ile Ala Ser Lys Leu Arg Glu Gln Phe Gly340 345 350aat aat aaa aca ata atc ttt aag caa tcc tca gga ggg gac cca gaa1104Asn Asn Lys Thr Ile Ile Phe Lys Gln Ser Ser Gly Gly Asp Pro Glu355 360 365att gta acg cac agt ttt aat tgt gga ggg gaa 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gga gta gca ccc1488Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro485 490 495acc aag gca aag aga aga gtg gtg cag aga gaa aaa aga gca gtg gga1536Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val Val Gln Arg Glu Lys Arg Ala Val Gly500 505 510ata gga gct ttg ttc ctt ggg ttc ttg gga gca gca gga agc act atg1584Ile Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met515 520 525ggc tgc acg tca atg acg ctg acg gta cag gcc aga caa tta ttg tct1632Gly Cys Thr Ser Met Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser530 535 540gat ata gtg cag cag cag aac aat ttg ctg agg gct att gag gcg caa1680Asp Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln545 550 555 560cag cat ctg ttg caa ctc aca gtc tgg ggc atc aaa cag ctc cag gca1728Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala565 570 575aga atc ctg gct gtg gaa aga tac cta aag gat caa cag ctc ctg ggg1776Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly580 585 590att tgg ggt tgc tct gga aaa ctc att tgc acc act gct gtg cct tgg1824Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp595 600 605aat gct agt tgg agt aat aaa tct ctg gaa cag att tgg aat aac atg1872Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp Asn Asn Met610 615 620acc tgg atg gag tgg gac aga gaa att aac aat tac aca agc tta ata1920Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile625 630 635 640cac tcc tta att gaa gaa tcg caa aac cag caa gaa aag aat gaa caa1968His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln645 650 655gaa tta ttg gaa tta gat aaa tgg gca agt ttg tgg aat tgg ttt aac2016Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe Asn660 665 670ata aca aat tgg ctg tgg tat ata aaa tta ttc ata atg ata gta gga2064Ile Thr Asn Trp Leu Trp Tyr Ile Lys Leu Phe Ile Met Ile Val Gly675 680 685ggc ttg gta ggt tta aga ata gtt ttt gct gta ctt tct ata gtg aat2112Gly Leu Val Gly Leu Arg Ile Val Phe Ala Val Leu Ser Ile Val Asn690 695 700aga gtt agg cag gga tat tca cca tta tcg ttt cag acc cac ctc 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Glu Ile Lys Asn Cys Ser Phe Asn145 150 155 160Ile Ser Thr Ser Ile Arg Asp Lys Val Gln Lys Glu Tyr Ala Phe Phe165 170 175Tyr Lys Leu Asp Ile Val Pro Ile Asp Asn Thr Ser Tyr Arg Leu Ile180 185 190Ser Cys Asn Thr Ser Val Ile Thr Gln Ala Cys Pro Lys Val Ser Phe195 200 205Glu Pro Ile Pro Ile His Tyr Cys Ala Pro Ala Gly Phe Ala Ile Leu210 215 220Lys Cys Asn Asn Lys Thr Phe Asn Gly Thr Gly Pro Cys Thr Asn Val225 230 235 240Ser Thr Val Gln Cys Thr His Gly Ile Arg Pro Val Val Ser Thr Gln245 250 255Leu Leu Leu Asn Gly Ser Leu Ala Glu Glu Asp Val Val Ile Arg Ser260 265 270Ala Asn Phe Thr Asp Asn Ala Lys Thr Ile Ile Val Gln Leu Asn Thr275 280 285Ser Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser290 295 300Ile Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Gly Lys305 310 315 320Ile Gly Asn Met Arg Gln Ala His Cys Asn Ile Ser Arg Ala Lys Trp325 330 335Asn Ala Thr Leu Lys Gln Ile Ala Ser Lys Leu Arg Glu Gln Phe Gly340 345 350Asn Asn Lys Thr Ile Ile Phe Lys Gln Ser Ser Gly Gly Asp 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權(quán)利要求
1.核酸序列，以通式SP-FI-鉸合部-MSD為特征，其中“SP”編碼信號(hào)肽，該信號(hào)肽介導(dǎo)一種表達(dá)的肽轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，“FI”編碼HIV gp41蛋白的片段，該片段包含一個(gè)來自于具有七個(gè)重復(fù)的區(qū)域的部分，“MSD”編碼1型膜蛋白的跨膜錨，和“鉸合部”編碼一種蛋白序列，該蛋白序列作為一種可彎曲的連接體連接由“T20”和“MSD”編碼的肽。
2.權(quán)利要求1的核酸序列，其特征在于SP是一種序列，該序列編碼低親和力神經(jīng)生長因子受體(LNGFR)、白介素2受體(IL-2R)或粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體(GM-CSFR)的信號(hào)肽。
3.權(quán)利要求1或2的核酸序列，其特征在于MSD是一種編碼LNGFR或CD34或其片段的跨膜錨的序列。
4.權(quán)利要求1至3的核酸序列，其特征在于鉸合部是一種編碼免疫球蛋白G(IgG)、人P-糖蛋白、人復(fù)制蛋白A和甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白的連接體的序列。
5.權(quán)利要求1至4的核酸序列，其特征在于FI編碼由序列編號(hào)2中從位置31到位置66所表示的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求5的核酸序列，其特征在于它具有由序列編號(hào)1中從核苷酸1528到核苷酸1635所表示的序列。
7.權(quán)利要求1至6的核酸序列，其特征在于它具有由序列編號(hào)1中從核苷酸1528到核苷酸1773所表示的序列。
8.載體，其特征在于它包含權(quán)利要求1至7的核酸序列。
9.權(quán)利要求8的載體，其特征在于它是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
10.權(quán)利要求9的載體，其特征在于它具有圖1表示的結(jié)構(gòu)。
11.權(quán)利要求10的載體，其特征在于它包含序列編號(hào)1表示的核酸序列。
12.權(quán)利要求11的載體，其保藏號(hào)為DSM 13139。
13.權(quán)利要求8至12的載體在T淋巴細(xì)胞和造血干細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染中的用途。
14.權(quán)利要求8至12的載體在HIV感染病人的基因治療性療法中的用途。
15.由權(quán)利要求8至12的載體轉(zhuǎn)染的T淋巴細(xì)胞或造血干細(xì)胞在HIV感染病人的基因治療性療法中的用途。
16.包含權(quán)利要求8至12的載體的基因治療藥物。
17.包含權(quán)利要求8至12的載體轉(zhuǎn)染的T淋巴細(xì)胞或造血干細(xì)胞的基因治療藥物。
18.由權(quán)利要求1至7的核酸序列編碼的通式“sp-fi-鉸合部-msd”的蛋白，其中“sp”，“fi”，“鉸合部”和“msd”具有權(quán)利要求1中指出的含意。
19.權(quán)利要求18的蛋白，其特征在于它具有序列編號(hào)2表示的序列。
20.通式“fi-鉸合部-msd”的蛋白，由權(quán)利要求1至7的核酸序列編碼，其中“fi”，“鉸合部”和“msd”具有權(quán)利要求1中指出的含意。
21.權(quán)利要求20的蛋白，其特征在于它具有由序列編號(hào)2中位置31到位置111表示的序列。
22.蛋白，其特征在于它是權(quán)利要求18至21的蛋白的突變體，變異體或衍生物。
23.核酸序列，其特征在于它編碼權(quán)利要求22的蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過錨定于膜的gp41肽的表達(dá)進(jìn)行HIV感染的基因工程治療。用此治療，第一次制造了編碼一種包含由可彎曲的連接體連接的源于HIV gp41的肽和一種羧基末端跨膜錨的融合蛋白的載體。
文檔編號(hào)A61K35/76GK1425072SQ00818655
公開日2003年6月18日 申請(qǐng)日期2000年11月24日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月25日
發(fā)明者M·－D·馮萊爾 申請(qǐng)人:海因里希－佩蒂－協(xié)會(huì)