專利名稱：特異性免疫抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型免疫抑制劑，特別是針對在器官移植的排斥反應(yīng)中使用的的特異性免疫抑制劑。
免疫應(yīng)答反應(yīng)是阻礙器官移植和破壞移植物的主要障礙。這些應(yīng)答反應(yīng)最初是由T細(xì)胞介導(dǎo)的。它們可以是Th細(xì)胞，可以是CD8+T CTL細(xì)胞，也可以兩者共同介導(dǎo)。(抗體參與了異種移植的超急排斥反應(yīng)和原因尚不明確的慢性排斥反應(yīng))。盡管免疫系統(tǒng)對外源性器官或物質(zhì)的識別所引起的免疫應(yīng)答反應(yīng)對器官移植產(chǎn)生許多困難，但對于那些已經(jīng)喪失了功能的器官除了移植沒有更有效的方法。而幾乎所有的器官移植、骨髓移植都需要長時間使用免疫抑制劑。
日前臨床使用的免疫抑制劑是環(huán)孢霉素A(CyA)和FK506，兩者都是非特異性廣譜型抑制劑，它們不僅抑制CD4+T細(xì)胞，也抑制CD8+T細(xì)胞。而在器官移植的急性排斥反應(yīng)和加速型排斥反應(yīng)中起主要作用的是CD4+T細(xì)胞。接受器官移植的患者幾乎一生要接受免疫抑制劑的治療。長期使用非特異性抑制劑將使患者的免疫系統(tǒng)受到破壞，增加患感染和腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。著手開發(fā)那些特異性抑制CD4+T細(xì)胞，而不抑制或少抑制CD8+T細(xì)胞的免疫抑制劑，是21世紀(jì)醫(yī)學(xué)和免疫學(xué)界要解決的主要項(xiàng)目之一。有人在體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，超抗原可以誘導(dǎo)免疫耐受，但大部分研究集中在基礎(chǔ)工作方面。這些文獻(xiàn)包括linda S.Cauley,Keith A Cauley,Fillipa Shub,et alTransferable anergySuperantigen treatment induces CD4+T cell tolerance that is reversible and requiresCD4-CD8-cells and interferon γ J.Exp.Med.186(1),71-81,1997、Toufic Renno,MichaelHahne and H.Robson MacdonaldProliferation is a prerequisite for bacterialsuperantigen-induced T cell apoptosis in vivo J.Exp.Med.181(6)2283-2287,1995以及Z.Q.Wang,T.Orlikowsky A.dudhane,V.Trejo et alStaphylococcal enterotoxin B-induced T-cellanergy is mediated by regulatory T cells Immunology 94,331-339,1998。在動物體內(nèi)使用超抗原，使其在細(xì)胞移植中發(fā)揮免疫抑制作用，達(dá)到嵌合體出現(xiàn)的工作尚未見報(bào)道。
本發(fā)明的目的是開發(fā)天然蛋白的特異性免疫抑制功能，研制一種抑制CD4+T細(xì)胞的特異性免疫抑制劑。
本發(fā)明研制的免疫抑制劑的主要活性成分是S-6菌株發(fā)酵代謝的一種超抗原物質(zhì)—金黃色葡萄球菌分泌的外毒素Staphylococcal enterotoxin B(即SEB)，即分子量在28366-29000的SEB蛋白，使用劑量為1-3mg/kg，并輔之以藥物可接受的載體、賦形劑等。
本發(fā)明的免疫抑制劑用小鼠進(jìn)行了體內(nèi)的效果實(shí)驗(yàn)，選用兩種MHC遺傳背景不同的小鼠進(jìn)行細(xì)胞移植，實(shí)驗(yàn)步驟為(A)對受者鼠注射超抗原SEB，然后再注射供體鼠淋巴細(xì)胞；(B)檢查細(xì)胞轉(zhuǎn)移后的7,14,2l,28,40天受者鼠體內(nèi)嵌合體出現(xiàn)水平(流式細(xì)胞技術(shù))；(C)檢查受體鼠淋巴細(xì)胞的體外免疫應(yīng)答反應(yīng)(混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng))；(D)檢查對T細(xì)胞抑制的特異性(流式細(xì)胞技術(shù))。
實(shí)驗(yàn)證明1．超抗原SEB在體內(nèi)有免疫抑制劑功能。
2．在異種細(xì)胞移植中，SEB具有針對CD4+T細(xì)胞的特異性免疫抑制劑作用，而不影響CD8+T細(xì)胞的數(shù)量。
3．在免疫系統(tǒng)完善條件下進(jìn)行異種細(xì)胞移植，SEB能誘導(dǎo)供、受體的組織相容性抗原嵌合體出現(xiàn)，同時淋巴細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)能力下降。
4．在受體鼠免疫系統(tǒng)完全正常條件下進(jìn)行異種細(xì)胞移植，超抗原可以使供體淋巴細(xì)胞在受者體內(nèi)生存40天以上，即嵌合體存在時間在21-40天以上。
5．混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果證明，外周淋巴細(xì)胞移植時使用超抗原SEB可以降低宿主的排斥反應(yīng)。
6．使用濃度低，比常用的免疫抑制劑的蛋白濃度低10-20倍以上。且無須連續(xù)注射，注射一次的持續(xù)抑制時間達(dá)7-21天。
實(shí)施例l免疫抑制劑的制備本實(shí)驗(yàn)使用的免疫抑制劑超抗原SEB(即金黃色葡萄球菌腸毒素B,Staphglo coccalentelotoxin B)系S-6菌球固體發(fā)酵產(chǎn)生。經(jīng)CM-纖維和CM-SEA抗血清親和層柱提純。并經(jīng)真空干燥，在4℃保存。電泳鑒定SEB純度達(dá)到90％前后。SEB分子量為28366～29000，等電點(diǎn)8.6,C-末端殘基賴氨酸，N-末端殘基谷氨酸。分裝1mg/支。
實(shí)施例2超抗原SEB在體內(nèi)的抑制效果實(shí)驗(yàn)1．實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)動物進(jìn)行不同劑量的SEB給藥，檢查SEB在體內(nèi)是否能特異性地抑制CD4+T細(xì)胞而不影響CD8+T細(xì)胞、當(dāng)CD4+T細(xì)胞受到抑制時，體外混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中的應(yīng)答反應(yīng)是否會下降，以及SEB的合適濃度和抑制效應(yīng)的持續(xù)時間。
2．實(shí)驗(yàn)動物C57BL/J小鼠。所有動物實(shí)驗(yàn)均在軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心的無特殊感染動物室(SPF)完成。
3．方法與步驟1)將實(shí)施例1所述SEB用無菌生理鹽水溶解，用0.22ml孔徑的濾器(Sigma購入)除菌過濾，制備成1mg/ml液體。
2)將實(shí)驗(yàn)動物分成四個組，分別注射1.0、1.5、2.5、3.0mg/kg的SEB，不注射SEB的動物作為對照。
3)在注射SEB之后的第7,14,21,28天，分別取出實(shí)驗(yàn)小鼠的肝臟，脾臟，制成單細(xì)胞懸浮液。用熒光抗體染色，用流式細(xì)胞技術(shù)測定細(xì)胞亞群的水平。判斷SEB在體內(nèi)是否有特異性抑制效應(yīng)，以及抑制效應(yīng)的合適濃度和持續(xù)時間。與此同時做體外混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，觀察體外對異源性抗原(異種淋巴細(xì)胞)的反應(yīng)性是否也降低。
4)將上述接受不同劑量SEB的鼠的肝，脾制成的單細(xì)胞細(xì)胞懸液在體外做混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，檢查在CD4+T細(xì)胞受到抑制時，受體淋巴細(xì)胞對異源性抗原的反應(yīng)性是否降低，如果降低則說明SEB有特異性抑制效應(yīng)。
表1不同劑量的SEB在體內(nèi)對CD4+T細(xì)胞的抑制率和時間
結(jié)果顯示SEB能特異性抑制CD4+T細(xì)胞，抑制效應(yīng)出現(xiàn)的的時間是第7-21天，抑制效應(yīng)的高峰期在用藥后的第21天。
表2 1.5mg/kgSEB在體內(nèi)對CD4+T，和CD8+T細(xì)胞的抑制率(％)
結(jié)果顯示1.5mg/kg的SEB在體內(nèi)僅影響CD4+T細(xì)胞的數(shù)量，而不影響CD8+T細(xì)胞的數(shù)量，說明SEB在體內(nèi)能特異性抑制CD4+T細(xì)胞而不抑制CD8+T。
表3不同濃度SEB注射后的體外混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)性
從表1和表3可以看出，SEB在1mg/kg-3mg/kg劑量下，隨抑制率的升高，淋巴細(xì)胞對外源性抗原的應(yīng)答反應(yīng)下降。結(jié)果顯示1-1.5mg/kg的SEB投入后第21天，受體淋巴細(xì)胞對外源性抗原的應(yīng)答反應(yīng)能力下降，而3.0mg/kg劑量組與外源性抗原的應(yīng)答反應(yīng)性沒有降低。
實(shí)施例3細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)1．實(shí)驗(yàn)動物C57BL/J小鼠H-2，基因型為H-2Kb陽性，H-2Kd陰性(H-2Kb+/H-2Kd-)。此鼠作為細(xì)胞移植的受體鼠。BABL/C小鼠作為細(xì)胞移植的供體鼠。其H-2基因型為H-2Kd陽性H-2Kb陰性(H-2Kb-/H-2kd+)。所有的動物實(shí)驗(yàn)均在軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心的SPF室完成。
2．實(shí)驗(yàn)步驟1)將供體鼠(BABL/C，基因型H-2Kd+)的脾臟在無菌條件下取出。用玻片輕輕磨碎，加5ml RPMI1640培養(yǎng)基用300目無菌尼龍膜過濾，制成懸浮單個細(xì)胞，1000轉(zhuǎn)/7分鐘離心，收集細(xì)胞部分。加入1ml Tris-NH4Cl裂解液，室溫靜置1～5分后，離心1000轉(zhuǎn)/7分鐘，去除Tris-NH4Cl液，加生理鹽水離心洗二次后，制備成濃度2.5×108～1×108個細(xì)胞/ml的懸浮液，以0.2ml體積靜脈注射給C57BL/J(基因型H-2Kb+)。
2)接受細(xì)胞移植的鼠在移植前后分別靜脈注射1.0、1.5、2.5、3.0mg/kg的SEB。
3)用流式細(xì)胞測定技術(shù)檢查細(xì)胞移植后1～50天的CD4+T、CD8+T,CD4/H-2KbH-2Kb,CD4/H-2Kd的水平，以證明在進(jìn)行異種淋巴細(xì)胞移植時①SEB在體內(nèi)是否特異性地抑制CD4+T細(xì)胞，而不影響CD8+T細(xì)胞的數(shù)量。
②SEB在體內(nèi)對CD4+T細(xì)胞的抑制強(qiáng)度，能達(dá)到使供體鼠基因H-2Kd在受體體內(nèi)出現(xiàn)嵌合體水平。
③當(dāng)嵌合體大量出現(xiàn)時，受體鼠淋巴細(xì)胞對異原性抗原(供體鼠淋巴細(xì)胞)的識別能力下降。體外混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果顯示出細(xì)胞增殖下降。
4)體內(nèi)注射1-2次SEB，對CD4+T細(xì)胞的抑制能力能持續(xù)7-21天；給藥劑量為1.0-3.0mg/kg水平。
測定上述細(xì)胞用熒光抗體(Sigma公司購入)染色后，用流式細(xì)胞儀測定并記錄結(jié)果。
將BABL/C鼠的肝臟用實(shí)施例2所述方法制成5×107細(xì)胞/ml，靜脈移植給C57BL/J鼠，在移植前、后注射3.0mg/kgSEB，在轉(zhuǎn)移細(xì)胞之后的不同時間用流式細(xì)胞技術(shù)檢查細(xì)胞移植后受體中是否有供體的H-2Kd蛋白以及嵌合體出現(xiàn)的時間和強(qiáng)度(％)。
表4細(xì)胞移植后的第21天受體鼠肝臟中H-2Kd的百分?jǐn)?shù)
結(jié)果顯示進(jìn)行異源性淋巴細(xì)胞移植時SEB能抑制體內(nèi)排斥反應(yīng)使嵌合體出現(xiàn)。
表5 SEB誘導(dǎo)嵌合體(H-2Kd)的出現(xiàn)的時間和數(shù)量(％)
表5結(jié)果顯示注射了超抗原SEB的小鼠在細(xì)胞移植后的第21天嵌合體出現(xiàn)，隨時間延長嵌合體增加。移植后的第40天嵌合體達(dá)到高峰，隨后下降。意味著注射一次SEB的有效時間長達(dá)21-40天。
實(shí)施例4混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)方法C57BL/J小鼠在細(xì)胞移植前、后接受高劑量SEB，7天之后將BABL/C小鼠的外周淋巴細(xì)胞5×107個細(xì)胞注射給受體鼠，細(xì)胞移植后的第7-50天，取出受體鼠肝，脾臟，用常規(guī)方法將脾細(xì)胞處理成5×107-5×106個細(xì)胞/ml的懸浮液。加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔0.1ml。作為刺激原的細(xì)胞是BABL/C鼠脾細(xì)胞。細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)基懸浮成1×107-5×106個細(xì)胞/ml置-20℃凍置1-2小時后，離心2000轉(zhuǎn)/20分鐘，收集碎片，用RPMI培養(yǎng)基將體積恢復(fù)原狀，取0.1ml置于受體脾細(xì)胞的培養(yǎng)孔中，置37℃ 5％CO2孵箱中培養(yǎng)6天，MTT(四甲基偶氧唑鹽，50mlMTT溶于10mlPBS除菌過濾后，使用)。染色490mu測定OD值，記錄受體淋巴細(xì)胞的增殖狀況。在嵌合體大量出現(xiàn)時，受體細(xì)胞對外源性細(xì)胞的反應(yīng)性下降。證明了SEB在體內(nèi)能特異性抑制CD4+T細(xì)胞，其抑制強(qiáng)度可以達(dá)到在受體鼠免疫系統(tǒng)完全不受破壞的條件下進(jìn)行細(xì)胞移植，能使使嵌合體出現(xiàn)。嵌合體出現(xiàn)的同時受體淋巴細(xì)胞對外源性識別下降，證明了SEB在體內(nèi)起到了特異性免疫抑制劑的作用。
表6細(xì)胞移植后的第21天受體鼠肝臟中H-2Kd的百分?jǐn)?shù)和混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的增殖指數(shù)
結(jié)果證明在做異種細(xì)胞移植時使用超抗原SEB，在細(xì)胞移植后的21-40天內(nèi)的肝臟中可以檢出供體鼠的H-2Kd蛋白，即在受體鼠體內(nèi)出現(xiàn)H-2Kb/H-2Kd嵌合體。與此同時受體對H-2Kd抗原的應(yīng)答反應(yīng)能力下降。
權(quán)利要求
1．一種在器官移植的排斥反應(yīng)中使用的免疫抑制劑，其特征是該免疫抑制劑的主要活性成分是金黃色葡萄球菌分泌的外毒素Staphylococcal enterotoxin B。
2．權(quán)利要求1所述的免疫抑制劑，其特征是所述超抗原的使用劑量是1-3mg/kg。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種針對在器官移植的排斥反應(yīng)中使用的特異性免疫抑制劑。該免疫抑制劑的主要活性成分是一種超抗原物質(zhì)－金黃色葡萄球菌分泌的外毒素Staphylococcalenterotoxin B(即SEB)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明,在異種細(xì)胞移植中,本發(fā)明的免疫抑制劑僅抑制CD文檔編號A61K39/085GK1310023SQ0110399
公開日2001年8月29日 申請日期2001年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月20日
發(fā)明者陳鈺 申請人:陳鈺