專利名稱：異種血管內(nèi)皮細胞生長因子疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及促進血管生成的一種因子——血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)，具體地說通過免疫來源于不同于人類的其它物種，如嚙齒類、鳥類、兩棲類等的同源VEGF基因，在體內(nèi)產(chǎn)生交叉免疫反應(yīng)，中和VEGF的作用，抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖。
背景技術(shù)：
本發(fā)明所用術(shù)語注釋血管生成是指從已存在的血管系統(tǒng)生成新的血管的過程。
內(nèi)皮是指襯在漿液腔、淋巴管及血管內(nèi)壁上的扁平細胞的薄層。
cDNA是指將單鏈mRNA在體外經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到的雙鏈互補的DNA片段。
PCR是指聚合酶鏈式反應(yīng)。
RT-PCR是指反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)。
Da(或kDa)是指道爾頓(或千道爾頓)。
bp是指堿基對。
Hind III，SnaB I，EcoR I均為文中所出現(xiàn)的限制性內(nèi)切酶名稱。
血管生成(angiogenesis)是指從已存在的血管系統(tǒng)生成新的血管的過程。血管生成是正常組織生長與發(fā)育所必需的過程，而在成年人中，除了女性的生殖系統(tǒng)及機體的修復(fù)過程(如傷口愈合)有血管生成外，其它組織則少見，且其過程一般較短暫并受機體嚴格調(diào)控。與之相反，在某些病理性疾病中，如腫瘤、Kaposi肉瘤、類風濕性關(guān)節(jié)炎、增生性視網(wǎng)膜病、牛皮癬、硬皮病等，常發(fā)生無控制的血管發(fā)生。
受機體嚴格調(diào)控的及不受調(diào)控的血管生成是以相似的方式進行的。毛細血管是由基底膜包裹內(nèi)皮細胞和外膜細胞形成的。當血管生成開始時，由內(nèi)皮細胞和血細胞釋放的金屬蛋白水解酶逐步侵蝕基底膜，然后位于血管腔內(nèi)的內(nèi)皮細胞伸出基底膜。在血管生長因子的刺激下，內(nèi)皮細胞通過受侵蝕的基底膜遷移。遷移的內(nèi)皮細胞從母血管分岔形成“新芽”，內(nèi)皮細胞在這里開始有絲分裂和增殖。內(nèi)皮細胞新芽彼此合并形成毛細環(huán)，從而產(chǎn)生新的血管。
內(nèi)皮細胞生長與存活的最重要的因子之一是血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)。VEGF是一類特異性血管內(nèi)皮刺激因子，它高效特異地作用于血管內(nèi)皮細胞，刺激血管發(fā)生和生長，同時增加血管的通透性，促進血管內(nèi)血漿蛋白等物質(zhì)外滲，為血管內(nèi)皮細胞的遷移，毛細血管網(wǎng)形成提供良好基質(zhì)。VEGF及其受體在生理性、病理性的血管生成中發(fā)揮重要作用，例如，VEGF與腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，VEGF在牛皮癬和類風濕性關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮作用，糖尿病引發(fā)的視網(wǎng)膜病變與眼內(nèi)高水平的VEGF有關(guān)，等等。
VEGF是由兩條亞基間及亞基內(nèi)二硫鍵交聯(lián)形成的同源二聚體糖蛋白。不同種屬的VEGF之間的同源性不同。親源性較遠的鳥類、兩棲類的VEGF與人、鼠基因的同源性約為65-70％，而哺乳動物，如人、鼠、牛的VEGF之間的同源性約為80-85％。

圖1顯示了非洲爪蟾、小鼠與人類的VEGF蛋白序列同源性的比較，其中非洲爪蟾與小鼠VEGF的同源性為75％，非洲爪蟾與人VEGF的同源性為73％，小鼠與人VEGF的同源性為88％。
VEGF的生物學活性的表現(xiàn)是通過與高親和的受體的結(jié)合而介導(dǎo)的。VEGF受體選擇性地表達于胚胎發(fā)育、傷口愈合過程中及其它與血管生成相關(guān)的病理性疾病的內(nèi)皮細胞上。VEGF受體是典型的III型酪氨酸激酶(class III receptor-type tyrosine kinase)，包括含5-7個免疫球蛋白樣環(huán)組成的配體結(jié)合部位的胞外區(qū)，跨膜區(qū)和具酪氨酸激酶活性的胞內(nèi)區(qū)。
顯然，可以通過阻斷VEGF與其受體的相互結(jié)合而抑制新生血管的產(chǎn)生，進而抑制與血管生成相關(guān)疾病的發(fā)生與發(fā)展，尤其是可以抑制腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移?，F(xiàn)有關(guān)抑制VEGF作用的方式主要為抗VEGF的單克隆抗體、可溶性的VEGF受體等等。
抗VEGF的單克隆抗體在體內(nèi)直接與VEGF結(jié)合，中和VEGF的刺激血管內(nèi)皮細胞增殖的作用，其使用劑量很大，可達500mg-1000mg/天；作用時間短暫，很快將在體內(nèi)被清除；同時單克隆抗體采用真核系統(tǒng)進行表達，表達量較低，純化工藝復(fù)雜，成本很高。可溶性的VEGF受體也是通過在體內(nèi)直接競爭性的與VEGF結(jié)合，中和VEGF的作用，但它也存在與單克隆抗體相同的問題，使用劑量大、作用時間短、生產(chǎn)成本高等，這些都為它們的廣泛應(yīng)用帶來了較大的困難。
本發(fā)明將為阻斷VEGF的作用提供一個新的思路，它并不直接中和VEGF的作用，而是利用不同種屬VEGF之間的同源性，間接的通過注射異種VEGF的DNA疫苗或蛋白疫苗使機體產(chǎn)生交叉免疫反應(yīng)，產(chǎn)生VEGF的交叉抗體而中和機體自身VEGF的作用。異種VEGF疫苗的使用劑量很低，同時它激發(fā)機體的免疫反應(yīng)，故作用時間持久；而且采用原核系統(tǒng)(如大腸桿菌系統(tǒng))或酵母進行表達，純化工藝簡單，成本低。
發(fā)明的目的本發(fā)明為血管生成相關(guān)疾病，特別是腫瘤，能克服上述治療中的缺點，從而提供新的治療手段。利用不同于人類的異種VEGF作為交叉抗原誘導(dǎo)機體產(chǎn)生對針對自身的VEGF的交叉抗體，中和VEGF的作用，抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖，從而抑制與血管生成相關(guān)疾病的發(fā)生與發(fā)展，特別是抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移。為此分別設(shè)計、構(gòu)建并表達了異種VEGF的DNA疫苗與蛋白疫苗。發(fā)明的主要技術(shù)內(nèi)容抑制刺激血管內(nèi)皮細胞增殖的重要生長因子——血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)，即可以抑制與血管生成相關(guān)疾病的發(fā)生與發(fā)展，特別是抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移。現(xiàn)已有一些抑制VEGF的藥物，如抗VEGF的單克隆抗體、可溶性VEGF受體等，應(yīng)用于治療與血管生成相關(guān)疾病的臨床或臨床前研究，包括腫瘤、牛皮癬、類風濕性關(guān)節(jié)炎等。但它們的應(yīng)用存在很多問題，如生產(chǎn)成本高、使用劑量大、作用時間不持久等等。我們設(shè)計并構(gòu)建的異種VEGF的DNA疫苗和蛋白疫苗，是一種全新觀念的疫苗，它由異種同源的VEGF組成，利用不同種屬VEGF之間的差異性使機體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體，又利用其同源性使產(chǎn)生的抗體與機體自身的VEGF可以發(fā)生交叉反應(yīng)，從而中和機體自身的VEGF的作用，抑制新生血管中的內(nèi)皮細胞的增殖，抑制與血管生成相關(guān)疾病的發(fā)生與發(fā)展，特別是抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移。
異種VEGF的DNA疫苗和蛋白疫苗的主要特點是該異種VEGF基因是來源于不同于人類的其它物種，如嚙齒類、鳥類、兩棲類等，其中來源于兩棲類，如非洲爪蟾的VEGF蛋白大小約21.5千道爾頓(kDa)，包含至少194個氨基酸；非洲爪蟾VEGF的核苷酸及蛋白序列來自SEQ No.1。來源于嚙齒類，如小鼠的VEGF蛋白大小約21千道爾頓(kDa)，包含至少190個氨基酸；小鼠VEGF的核苷酸及蛋白序列來自SEQ No.2。
異種VEGF的DNA疫苗和蛋白疫苗的制備方法是利用非洲爪蟾的cDNA文庫經(jīng)聚合酶鏈式反應(yīng)合成非洲爪蟾VEGF cDNA片段后，構(gòu)建入過渡質(zhì)粒pCR2.1中，經(jīng)測序驗證序列，再構(gòu)建入哺乳動物細胞真核表達載體，得到DNA疫苗；同時構(gòu)建入原核表達載體(如大腸桿菌的表達載體)，構(gòu)建入酵母表達載體，分別表達后，進行分離純化得到目的蛋白——非洲爪蟾VEGF重組蛋白，得到蛋白疫苗。同樣可分別得到小鼠VEGF的DNA疫苗和蛋白疫苗。將這兩種疫苗分別免疫小鼠，檢測其抗原性及抗腫瘤作用。
異種VEGF的DNA疫苗和蛋白疫苗的構(gòu)建過程詳見圖2。其構(gòu)建過程詳細解釋如下一、來源于非洲爪蟾VEGF基因的獲得選擇非洲爪蟾的cDNA文庫作為聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)的模板，設(shè)計并合成相應(yīng)的引物(上游引物為5’ATCATGAACTTTCTGCCGAGCTG 3’，下游引物為5’GATTCACCGTCGTGGCTTTTC 3’)，利用PCR合成非洲爪蟾VEGF的cDNA片段，得到片段的大小與預(yù)計的相同(600bp左右)(見圖4)。回收PCR產(chǎn)物片段后，插入載體pCR2.1(購自Invitrogen公司)，得到重組質(zhì)粒pCR2.1-xV，通過Perkin-Elmer公司的DNA測序儀對其測序，結(jié)果表明PCR產(chǎn)物的序列與非洲爪蟾VEGF基因序列一致，證明得到了來源于非洲爪蟾的VEGF基因。二、來源于小鼠VEGF基因的獲得選擇小鼠的血管內(nèi)皮細胞株EOMA作為模板mRNA的來源，設(shè)計并合成相應(yīng)的引物(上游引物為5’CGAAGCTTCATGAACTTTCTGCTCTCTTG 3’，為了便于克隆，設(shè)計入HindIII酶切位點；下游引物為5’TAGAATTCTCACCGCCTTGGCTTGTCAC 3’，為了便于克隆，設(shè)計入EcoRI酶切位點)，利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)合成小鼠VEGF的cDNA，得到片段的大小與預(yù)計的相同(580bp左右)(見圖6)?；厥誖T-PCR產(chǎn)物片段后，插入載體pCR2.1(購自Invitrogen公司)，得到重組質(zhì)粒pCR2.1-mV，通過Perkin-Elmer公司的DNA測序儀對其測序，結(jié)果表明RT-PCR產(chǎn)物的序列與小鼠VEGF基因序列一致，證明得到了來源于小鼠的VEGF基因。三、非洲爪蟾及小鼠VEGF的真核表達載體的構(gòu)建及表達使用pSecTag 2A(購自Invitrogen公司)(見圖7)作為表達載體，它具有真核基因表達調(diào)控序列CMV啟動子，鼠的Igκ信號肽序列，以及牛生長因子加尾信號，使目的基因能在真核細胞中分泌表達。
將編碼非洲爪蟾VEGF的基因片段克隆到pSecTag 2A的EcoR I酶切位點中，得到重組質(zhì)粒xVEGF-p，構(gòu)建過程詳見圖8。同時將編碼小鼠VEGF的基因片段克隆到pSecTag 2A的雙酶(EcoRI/HindIII)位點中，得到重組質(zhì)粒mVEGF-p。
通過脂質(zhì)體法將兩種重組質(zhì)粒分別導(dǎo)入真核哺乳動物細胞——COS1中，分別得到轉(zhuǎn)染后的細胞培養(yǎng)液及裂解液。
將細胞培養(yǎng)液及裂解液分別包被96孔板，用羊抗鼠VEGF單克隆抗體作為一抗，用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測目的蛋白的表達情況，結(jié)果見圖9。重組質(zhì)粒xVEGF-p和mVEGF-p的暫時表達產(chǎn)物均能在細胞培養(yǎng)液中而不是在細胞裂解液中檢測到，說明非洲爪蟾及小鼠的VEGF均能以分泌形式在真核哺乳動物細胞中表達。四、非洲爪蟾及小鼠VEGF在大腸桿菌中的表達使用pET-32a(購自NOVAGEN公司)作為表達載體(見圖10)，它是以T7啟動子引發(fā)受IPTG調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄。表達產(chǎn)物是N-端與硫氧還蛋白相融合的重組非洲爪蟾或小鼠VEGF，可利用金屬螯合柱親和層析一步純化。硫氧還蛋白與VEGF之間存在腸激酶的酶切位點(Arg-Arg-Arg-Arg-Lys↓)，便于目的蛋白純化后去除硫氧還蛋白。
將兩種重組表達質(zhì)粒在大腸桿菌菌株BL21(DE3)中進行表達，電泳結(jié)果表明得到的目的蛋白大小與預(yù)計的相似，并經(jīng)免疫印跡法鑒定。重組非洲爪蟾及小鼠VEGF蛋白的表達量可達總蛋白量的30％以上，主要以包涵體形式存在，在變性條件下可經(jīng)金屬螯合柱親和層析一步得到純化，純度可達95％以上，再通過透析得到復(fù)性，其復(fù)性效率可達50％以上。經(jīng)腸激酶酶解后可得到非洲爪蟾及小鼠VEGF蛋白，經(jīng)離子交換層析Q Sepharose Fast Flow(購自Pharmacia公司)純化，去除硫氧還蛋白后，純度可達98％以上，產(chǎn)量可達300-500mg/L。五、非洲爪蟾及小鼠VEGF在甲醇酵母中的表達將編碼非洲爪蟾及小鼠VEGF的基因片段克隆到酵母的表達載體——pPIC9K(購自Invitrogen公司)(見圖11)的雙酶(SnaB I/EcoR I)位點中，以利用甲醇酵母中的α因子分泌信號分泌表達目的蛋白。
利用pPIC9K質(zhì)粒介導(dǎo)非洲爪蟾及小鼠VEGF基因整合到甲醇酵母染色體上后，用甲醇誘導(dǎo)目的蛋白的表達。表達的目的蛋白是以可溶的形式存在于甲醇酵母的培養(yǎng)基中，利用離子交換層析Q SepharoseFast Flow可一步純化，純度可達95％以上，產(chǎn)量可達700-900mg/L。六、非洲爪蟾及小鼠VEGF免疫小鼠——DNA免疫和蛋白免疫DNA免疫將6-8周齡的雌性BALB/c小鼠隨機分為免疫組和對照組(每組5只)，免疫組小鼠每只分別肌肉注射重組質(zhì)粒xVEGF-p和mVEGF-p 100μg，同時對照組1小鼠每只肌肉注射空載體pSecTag2A 100μg，對照組2小鼠每只肌肉注射0.9％生理鹽水100μl，每周一次，共四次。初次免疫后0、1、2、4、6、8和13周尾靜脈采血，檢測血清中抗VEGF抗體的滴度，結(jié)果見圖12A。
蛋白免疫將6-8周齡的雌性BALB/c小鼠隨機分為免疫組和對照組(每組5只)，免疫組小鼠每只腹腔注射100μg重組蛋白(先與等體積的完全付氏佐劑完全混勻)——非洲爪蟾及小鼠VEGF，四周后用相同量(與等體積的不完全付氏佐劑完全混勻)加強一次。對照組用生理鹽水代替蛋白樣品。在初次免疫后0、1、2、4、6、8和13周尾靜脈采血，檢測血清中抗VEGF抗體的滴度，結(jié)果見圖12B。
結(jié)果表明，DNA或蛋白免疫中，初次免疫后兩周非洲爪蟾VEGF免疫組開始產(chǎn)生抗小鼠VEGF抗體，以后逐漸升高，至第8周抗體滴度達到最高，并一直保持到第13周。而小鼠VEGF免疫組的抗體滴度與對照組無差異?？梢钥闯觯珼NA免疫及蛋白免疫中，只有非洲爪蟾的VEGF能誘導(dǎo)產(chǎn)生交叉抗小鼠VEGF抗體。
經(jīng)免疫印跡法檢測，也證實非洲爪蟾VEGF免疫組的抗血清能同時與非洲爪蟾VEGF蛋白、小鼠VEGF蛋白以及人VEGF蛋白反應(yīng)，而小鼠VEGF免疫組及對照組的抗血清均不能與非洲爪蟾VEGF蛋白、小鼠VEGF蛋白以及人VEGF蛋白反應(yīng)，結(jié)果見圖13。七、非洲爪蟾VEGF疫苗異種免疫的抗腫瘤作用——預(yù)防性免疫將6-8周齡的雌性BALB/c小鼠隨機分為治療組和對照組(每組10只)，治療組小鼠每只分別肌肉注射重組質(zhì)粒xVEGF-p和mVEGF-p100μg，同時對照組1小鼠每只肌肉注射空載體pSecTag 2A 100μg，對照組2小鼠每只肌肉注射0.9％生理鹽水100μl，每周一次，共四次。最后一次免疫后的第7天于治療組和對照組小鼠的背部皮下分別接種1×106個Meth-A細胞(來源于BALB/c小鼠的纖維肉瘤細胞株)、H22肝癌細胞(來源于BALB/c小鼠的肝癌細胞株)及MA 782/5S乳腺癌細胞(來源于BALB/c小鼠的乳腺癌細胞株)。每隔3天，用游標卡尺測量小鼠的腫瘤大小，并觀察小鼠的體重變化。
將治療組和對照組中的小鼠的腫瘤體積對時間作曲線，其結(jié)果見圖14。可以看出，經(jīng)非洲爪蟾VEGF質(zhì)粒DNA免疫的小鼠，成功地抑制了三種不同腫瘤的生長，所有小鼠12天內(nèi)均未見腫瘤生長，70％的小鼠觀察期結(jié)束未見腫瘤生長。小鼠腫瘤大小與對照組相比有顯著性差異(P＜0.01)。而小鼠VEGF免疫組與對照組腫瘤生長迅速，小鼠生存期短。
采用非洲爪蟾VEGF重組蛋白免疫也可得到類似的結(jié)果。八、非洲爪蟾VEGF疫苗異種免疫的抗腫瘤作用——治療性免疫六至八周齡的雌性BALB/c小鼠分別在其背部皮下接種1×106個Meth-A細胞、H22細胞及MA 782/5S細胞，5天后當腫瘤大小為100-200mm3時，各組分別肌肉注射100μg重組質(zhì)粒，同時對照組1小鼠每只肌肉注射空載體pSecTag 2A 100μg，對照組2小鼠每只肌肉注射0.9％生理鹽水100μl。每周一次，共4次。每隔3天，用游標卡尺測量小鼠腫瘤的大小并觀察小鼠的體重變化，記錄小鼠的生存時間。
將治療組及對照組中小鼠的腫瘤體積對時間作曲線，其結(jié)果見圖15(A，B，C)。治療組和對照組小鼠的生存曲線見圖15(D，E，F(xiàn))?？梢钥闯?，經(jīng)非洲爪蟾VEGF質(zhì)粒DNA治療的小鼠的腫瘤生長得到控制，30％的腫瘤進一步消退，荷瘤小鼠的生存期延長。小鼠腫瘤大小及生存期與對照組相比有顯著性差異(P＜0.01)。而小鼠VEGF治療組與對照組的腫瘤則持續(xù)生長，無顯著性差異。
采用非洲爪蟾VEGF重組蛋白免疫也可得到類似的結(jié)果。九、非洲爪蟾VEGF疫苗異種免疫的抗腫瘤作用——獲得性免疫收集免疫小鼠的抗血清，經(jīng)親和層析(CM affi-gel blue gel kit，購自Bio-Rad公司)純化免疫球蛋白(即抗體)，進行獲得性免疫治療。
將6-8周齡的雌性BALB/c小鼠隨機分組(每組10只)，小鼠每只分別靜脈注射100mg/kg的純化后的來自xVEGF-p治療組、mVEGF-p治療組、pSecTag 2A對照組和生理鹽水對照組的免疫球蛋白。第2天于小鼠的背部皮下分別接種1×106個Meth-A細胞。每隔3天，用游標卡尺測量小鼠的腫瘤大小，并觀察小鼠的體重變化。
圖16顯示第25天各組小鼠的腫瘤大小。結(jié)果表明，來自xVEGF-p治療組的免疫球蛋白可抑制Meth-A腫瘤細胞的生長，具有顯著性差異(p＜0.01)；而來自mVEGF-p、pSecTag 2A及生理鹽水組的免疫球蛋白均不能抑制腫瘤細胞的生長。這說明免疫非洲爪蟾VEGF產(chǎn)生的交叉抗體的確可以中和小鼠體內(nèi)VEGF的作用，抑制腫瘤中新生血管的生成，從而抑制腫瘤的生長。十、非洲爪蟾VEGF免疫小鼠的抗血清抑制血管內(nèi)皮細胞生長的作用經(jīng)上純化免疫球蛋白用MTT法檢測抑制血管內(nèi)皮細胞生長的作用。抑制結(jié)果見圖17，結(jié)果表明只有非洲爪蟾VEGF免疫的抗血清能特異地抑制由VEGF刺激的血管內(nèi)皮細胞的增殖，其抑制存在劑量依賴關(guān)系；而小鼠VEGF治療組及兩個對照組均對由VEGF刺激的血管內(nèi)皮細胞的增殖沒有抑制作用。這說明非洲爪蟾VEGF治療組產(chǎn)生的與小鼠VEGF的交叉中和抗體能特異地中和VEGF在體外刺激血管內(nèi)皮細胞增殖的作用，從細胞水平上進一步證實了異種VEGF免疫抑制新生血管生成的作用。本發(fā)明的優(yōu)點1.應(yīng)用異種同源VEGF基因，產(chǎn)生免疫交叉反應(yīng)，抑制VEGF的作用；2.可應(yīng)用于多種與血管生成相關(guān)疾病的治療，包括腫瘤、Kaposi肉瘤、類風濕性關(guān)節(jié)炎、增生性視網(wǎng)膜病、牛皮癬、硬皮病等；3.可抑制多種腫瘤(尤其是實體瘤)的生長和轉(zhuǎn)移；4.目前應(yīng)用的VEGF單克隆抗體、VEGF的可溶性受體等治療劑量量很大，多采用真核表達系統(tǒng)進行表達，純化工藝復(fù)雜，成本很高；而異種VEGF疫苗治療劑量低，可采用原核系統(tǒng)或酵母進行表達，純化工藝簡單，成本低。
附圖及圖片的簡要說明圖1顯示非洲爪蟾、小鼠、人類VEGF蛋白序列的同源性比較。圖2顯示異種VEGF的DNA疫苗和蛋白疫苗的構(gòu)建過程。圖3顯示編碼非洲爪蟾VEGF的核苷酸序列及相應(yīng)蛋白的氨基酸序列，即SEQ No.1。圖4 PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳后的照片，顯示獲得非洲爪蟾VEGF基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳分析的結(jié)果。
圖中序號說明M)DNA的分子量標準——100bp DNA標準；1)陰性對照(無模板DNA)；2)模板來自非洲爪蟾的cDNA文庫。
箭頭顯示合成的非洲爪蟾VEGF基因的位置。圖5顯示編碼小鼠VEGF的核苷酸序列及相應(yīng)蛋白的氨基酸序列，即SEQ No.2。圖6 RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳后的照片，顯示獲得小鼠VEGF基因的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳分析的結(jié)果。圖中序號說明M)DNA的分子量標準——100bp DNA標準；1)陰性對照(無模板mRNA)；2)模板mRNA來自小鼠內(nèi)皮細胞株EOMA。
箭頭顯示合成的小鼠VEGF基因的位置。圖7顯示真核哺乳動物表達載體pSecTag2A的示意圖。圖8顯示重組質(zhì)粒xVEGF-p的構(gòu)建過程。圖9顯示用ELISA檢測的重組質(zhì)粒在真核哺乳動物細胞COS-1中的暫時表達情況。圖10顯示原核表達載體pET32a的示意圖。圖11顯示甲醇酵母表達載體pPIC9K的示意圖。圖12顯示免疫后小鼠血清中產(chǎn)生抗小鼠VEGF抗體的情況(A)表示DNA免疫后，抗小鼠VEGF抗體的產(chǎn)生情況；其中，●表示xVEGF-p免疫組，○表示mVEGF-p免疫組，■表示pSecTag 2A對照組，▲表示生理鹽水對照組。
(B)表示蛋白免疫后，抗小鼠VEGF抗體的產(chǎn)生情況。
其中，●表示非洲爪蟾VEGF重組蛋白免疫組，○表示小鼠VEGF重組蛋白免疫組，▲表示生理鹽水對照組。圖13顯示小鼠免疫血清與重組非洲爪蟾VEGF、小鼠VEGF120、小鼠VEGF164、小鼠VEGF188、人VEGF165及人堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、人胎盤生長因子(PlGF)雜交的免疫印跡。
(A)來自非洲爪蟾VEGF免疫的抗血清(B)來自小鼠VEGF免疫的抗血清圖14顯示非洲爪蟾VEGF的預(yù)防性免疫治療中，治療組與對照組的腫瘤體積與時間的關(guān)系。
橫坐標表示治療時間(天數(shù))，縱坐標表示腫瘤的體積(mm3)。
(A)Meth-A纖維肉瘤細胞(B)H22肝癌細胞(C)MA782/5S乳腺癌細胞其中，●表示xVEGF-p治療組，○表示mVEGF-p治療組，■表示pSecTag 2A對照組，▲表示生理鹽水對照組。圖15 A，B，C顯示非洲爪蟾VEGF的治療性免疫治療中，治療組與對照組的腫瘤體積與時間的關(guān)系。橫坐標表示治療時間(天數(shù))，縱坐標表示腫瘤的體積(mm3)。
D，E，F(xiàn)治療組與對照組小鼠的生存曲線比較。橫坐標表示治療時間(天數(shù))，縱坐標表示生存率(％)。
(A，D)Meth-A纖維肉瘤細胞(B，E)H22肝癌細胞(C，F(xiàn))MA782/5S乳腺癌細胞其中，●表示xVEGF-p治療組，○表示mVEGF-p治療組，■表示pSecTag 2A對照組，▲表示生理鹽水對照組。圖16顯示用純化后免疫球蛋白進行獲得性免疫治療第25天后各組的腫瘤大小。
其中，XVEGF表示xVEGF-p治療組，MVEGF表示mVEGF-p治療組，c-p表示pSecTag 2A對照組，saline表示生理鹽水對照組。圖17顯示純化后免疫球蛋白對血管內(nèi)皮細胞增殖的體外抑制效果。
橫坐標表示純化后免疫球蛋白的濃度(μg/ml)，縱坐標表示抑制率(％)。
其中，■表示xVEGF-p治療組，○表示mVEGF-p治療組，●表示pSecTag 2A對照組，▲表示生理鹽水對照組。
實施例1來源于非洲爪蟾VEGF基因的獲得圖3中顯示了編碼非洲爪蟾VEGF的核苷酸序列及相應(yīng)蛋白的氨基酸序列(SEQ No.1)。
選擇非洲爪蟾的cDNA文庫作為PCR的模板，設(shè)計并合成相應(yīng)的引物(上游引物為5’ATCATGAACTTTCTGCCGAGCTG 3’，下游引物為5’GATTCACCGTCGTGGCTTTTC 3’)，利用PCR合成非洲爪蟾VEGF的cDNA片段，得到片段的大小與預(yù)計的相同(600bp左右)(見圖4)。回收PCR產(chǎn)物片段后，插入載體pCR2.1(購自Invitrogen公司)，得到重組質(zhì)粒pCR2.1-xV，通過Perkin-Elmer公司的DNA測序儀對其測序，結(jié)果表明PCR產(chǎn)物的序列與非洲爪蟾VEGF基因序列一致，證明得到了來源于非洲爪蟾的VEGF基因。實施例2來源于小鼠VEGF基因的獲得圖5中顯示了編碼小鼠VEGF的核苷酸序列及相應(yīng)蛋白的氨基酸序列(SEQ No.2)。
選擇小鼠的內(nèi)皮細胞株EOMA作為模板mRNA的來源，設(shè)計并合成相應(yīng)的引物(上游引物為5’CGAAGCTTCATGAACTTTCTGCTCTCTTG 3’，為便于克隆，設(shè)計入HindIII酶切位點；下游引物為5’TAGAATTCTCACCGCCTTGGCTTGTCAC 3’，為便于克隆，設(shè)計入EcoRI酶切位點)，利用RT-PCR合成小鼠VEGF的cDNA，得到片段的大小與預(yù)計的相同(580bp左右)(見圖6)?；厥誖T-PCR產(chǎn)物片段后，插入載體pCR2.1(購自Invitrogen公司)，得到重組質(zhì)粒pCR2.1-mV，通過Perkin-Elmer公司的DNA測序儀對其測序，結(jié)果表明RT-PCR產(chǎn)物的序列與小鼠VEGF基因序列一致，證明得到了來源于小鼠的VEGF基因。實施例3非洲爪蟾及小鼠VEGF的真核表達載體的構(gòu)建及表達使用pSecTag 2A(購自Invitrogen公司)(見圖7)作為表達載體，它具有真核基因表達調(diào)控序列CMV啟動子，鼠的Igκ信號肽序列，以及牛生長因子加尾信號，使目的基因能在真核細胞中分泌表達。
將編碼非洲爪蟾VEGF的基因片段克隆到pSecTag 2A的EcoR I酶切位點中，得到重組質(zhì)粒xVEGF-p，構(gòu)建過程詳見圖8。同時將編碼小鼠VEGF的基因片段克隆到pSecTag 2A的雙酶(EcoRI/HindIII)位點中，得到重組質(zhì)粒mVEGF-p。
通過脂質(zhì)體法將兩種重組質(zhì)粒分別導(dǎo)入真核哺乳動物細胞——COS1中，其具體步驟如下1.將COS1細胞以2×105/cm2的密度接種于60mm組織培養(yǎng)皿，以含10％熱滅活的胎牛血清(10％FCS)的DMEM培養(yǎng)基于37℃，含5％CO2濃度的孵箱中培育24小時。
2.在無菌試管中配置下列溶液后，室溫溫育30-45分鐘。
溶液AxVEGF-p及mVEGF-p 2μg，對照組1加空載體pSecTag 2A2μg，對照組2不加質(zhì)粒DNA，分別用無血清的DMEM培養(yǎng)基補足至200μl溶液B40μl脂質(zhì)體加入760μl的無血清培養(yǎng)基中3.溶液A各組中分別加入溶液B 200μl，室溫溫育10-15分鐘。
4.移去細胞培養(yǎng)液，并用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞一次。
5.加160μl無血清培養(yǎng)基至溶液A、B混合物中，混勻后小心滴加至細胞上，輕輕混勻，置于37℃，含5％CO2濃度的孵箱中培育24小時。
6.移去轉(zhuǎn)染液，加5ml完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時，分別得到細胞培養(yǎng)液及細胞裂解液。
將細胞培養(yǎng)液及細胞裂解液分別包被96孔板，用羊抗鼠VEGF單克隆抗體作為一抗，用ELISA檢測目的蛋白的表達情況，結(jié)果見圖9。重組質(zhì)粒xVEGF-p和mVEGF-p的暫時表達產(chǎn)物均能在細胞培養(yǎng)液中而不是在細胞裂解液中檢測到，說明非洲爪蟾及小鼠的VEGF均能以分泌形式在真核哺乳動物細胞中表達。實施例4非洲爪蟾及小鼠VEGF在大腸桿菌中的表達使用pET-32a(NOVAGEN)作為表達載體(見圖10)，它是以T7啟動子引發(fā)受IPTG調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄。表達產(chǎn)物是N-端與硫氧還蛋白相融合的重組非洲爪蟾及小鼠VEGF，可利用金屬螯合柱親和層析一步純化。硫氧還蛋白與VEGF之間存在腸激酶的酶切位點(Arg-Arg-Arg-Arg-Lys↓)，便于目的蛋白純化后將硫氧還蛋白去除。
將兩種重組表達質(zhì)粒在大腸桿菌菌株BL21(DE3)中進行表達，電泳結(jié)果表明得到的目的蛋白大小與預(yù)計的相似，并經(jīng)免疫印跡法鑒定。重組非洲爪蟾及小鼠VEGF蛋白的表達量可達總蛋白量的30％以上，主要以包涵體形式存在，在變性條件下可經(jīng)金屬螯合柱親和層析一步得到純化，純度可達95％以上，再通過透析得到復(fù)性，其復(fù)性效率可達50％以上。經(jīng)腸激酶酶解后可得到非洲爪蟾及小鼠VEGF蛋白，經(jīng)離子交換層析Q Sepharose Fast Flow(購自Pharmacia公司)純化，去除硫氧還蛋白后，純度可達98％以上，產(chǎn)量可達300-500mg/L。實施例5非洲爪蟾及小鼠VEGF在甲醇酵母中的表達將編碼非洲爪蟾及小鼠VEGF的基因片段克隆到酵母的表達載體——pPIC9K(購自Invitrogen公司)(見圖11)的雙酶(SnaB I/EcoR I)位點中，以利用甲醇酵母中的α因子分泌信號分泌表達目的蛋白。
利用pPIC9K質(zhì)粒介導(dǎo)非洲爪蟾及小鼠VEGF基因整合到甲醇酵母染色體上后，用甲醇誘導(dǎo)目的蛋白的表達。表達的目的蛋白是以可溶的形式存在于甲醇酵母的培養(yǎng)基中，利用離子交換層析Q SepharoseFast Flow可一步純化，純度可達95％以上，產(chǎn)量可達700-900mg/L。實施例6非洲爪蟾及小鼠VEGF免疫小鼠——DNA免疫和蛋白免疫DNA免疫將6-8周齡的雌性BALB/c小鼠隨機分為免疫組和對照組(每組5只)，免疫組小鼠每只分別肌肉注射重組質(zhì)粒xVEGF-p和mVEGF-p 100μg，同時對照組小鼠每只肌肉注射0.9％生理鹽水100μl，每周一次，共四次。初次免疫后0、1、2、4、6、8和13周尾靜脈采血，檢測血清中抗VEGF抗體的滴度，結(jié)果見圖12A。
蛋白免疫將6-8周齡的雌性BALB/c小鼠隨機分為免疫組和對照組(每組5只)，免疫組小鼠每只腹腔注射100μg重組蛋白(先與等體積的完全弗氏佐劑完全混勻)——非洲爪蟾及小鼠VEGF，四周后用相同量(與等體積的不完全弗氏佐劑完全混勻)加強一次。對照組用生理鹽水代替蛋白樣品。在初次免疫后0、1、2、4、6、8和13周尾靜脈采血，檢測血清中抗VEGF抗體的滴度，結(jié)果見圖12B。
結(jié)果表明，DNA或蛋白免疫中，初次免疫后兩周非洲爪蟾VEGF免疫組開始產(chǎn)生抗小鼠VEGF抗體，以后逐漸升高，至第8周抗體滴度達到最高，并一直保持到第13周。而小鼠VEGF免疫組的抗體滴度與對照組無差異。可以看出，DNA免疫及蛋白免疫中，只有非洲爪蟾的VEGF能誘導(dǎo)產(chǎn)生交叉抗小鼠VEGF抗體。
經(jīng)免疫印跡法檢測，也證實非洲爪蟾VEGF免疫組的抗血清能同時與非洲爪蟾VEGF蛋白、小鼠VEGF蛋白以及人VEGF反應(yīng)，而小鼠VEGF免疫組及對照組的抗血清均不能與非洲爪蟾VEGF蛋白、小鼠VEGF蛋白以及人VEGF反應(yīng)，結(jié)果見圖13。實施例7非洲爪蟾VEGF疫苗異種免疫的抗腫瘤作用——預(yù)防性免疫將6-8周齡的雌性BALB/c小鼠隨機分為治療組和對照組(每組10只)，治療組小鼠每只分別肌肉注射重組質(zhì)粒xVEGF-p和mVEGF-p100μg，同時對照組1小鼠每只肌肉注射空載體pSecTag 2A 100μg，對照組2小鼠每只肌肉注射0.9％生理鹽水100μl，每周一次，共四次。最后一次免疫后的第7天于治療組和對照組小鼠的背部皮下分別接種1×106個Meth-A細胞(來源于BALB/c小鼠的纖維肉瘤細胞株)、H22肝癌細胞(來源于BALB/c小鼠的肝癌細胞株)及MA 782/5S乳腺癌細胞(來源于BALB/c小鼠的乳腺癌細胞株)。每隔3天，用游標卡尺測量小鼠的腫瘤大小，并觀察小鼠的體重變化。
將治療組和對照組中的小鼠的腫瘤體積對時間作曲線，其結(jié)果見圖14。
可以看出，經(jīng)非洲爪蟾VEGF質(zhì)粒DNA免疫的小鼠，成功地抑制了三種不同腫瘤的生長，所有小鼠12天內(nèi)均未見腫瘤生長，70％的小鼠觀察期結(jié)束未見腫瘤生長。小鼠腫瘤大小與對照組相比有顯著性差異(P＜0.01)。而小鼠VEGF免疫組與對照組腫瘤生長迅速，小鼠生存期短。
采用非洲爪蟾VEGF重組蛋白免疫也可得到類似的結(jié)果。實施例8非洲爪蟾VEGF疫苗異種免疫的抗腫瘤作用——治療性免疫六至八周齡的雌性BALB/c小鼠分別在其背部皮下接種1×106個Meth-A細胞、H22細胞及MA 782/5S細胞，5天后當腫瘤大小為100-200mm3時，各組分別肌肉注射100μg重組質(zhì)粒，同時對照組1小鼠每只肌肉注射空載體pSecTag 2A 100μg，對照組2小鼠每只肌肉注射0.9％生理鹽水100μl。每周一次，共4次。每隔3天，用游標卡尺測量小鼠腫瘤的大小并觀察小鼠的體重變化，記錄小鼠的生存時間。
將治療組及對照組中小鼠的腫瘤體積對時間作曲線，其結(jié)果見圖15(A，B，C)。治療組和對照組小鼠的生存曲線見圖15(D，E，F(xiàn))。
可以看出，經(jīng)非洲爪蟾VEGF質(zhì)粒DNA治療的小鼠的腫瘤生長得到控制，30％的腫瘤進一步消退，荷瘤小鼠的生存期延長。小鼠腫瘤大小及生存期與對照組相比有顯著性差異(P＜0.01)。而小鼠VEGF治療組與對照組的腫瘤則持續(xù)生長，無顯著性差異。
采用非洲爪蟾VEGF重組蛋白免疫也可得到類似的結(jié)果。實施例9非洲爪蟾VEGF疫苗異種免疫的抗腫瘤作用——獲得性免疫收集免疫小鼠的抗血清，經(jīng)親和層析(CM affi-gel blue gel kit，購自Bio-Rad公司)純化免疫球蛋白，進行獲得性免疫治療。
將6-8周齡的雌性BALB/c小鼠隨機分組(每組10只)，小鼠每只分別靜脈注射100mg/kg的純化后的來自xVEGF-p治療組、mVEGF-p治療組、pSecTag 2A對照組和生理鹽水對照組的免疫球蛋白。第2天于小鼠的背部皮下分別接種1×106個Meth-A細胞。每隔3天，用游標卡尺測量小鼠的腫瘤大小，并觀察小鼠的體重變化。
圖16顯示第25天各組小鼠的腫瘤大小。
結(jié)果表明，來自xVEGF-p治療組的免疫球蛋白可抑制Meth-A腫瘤細胞的生長，而來自mVEGF-p、pSecTag 2A及生理鹽水組的免疫球蛋白均不能抑制腫瘤細胞的生長。這說明免疫非洲爪蟾VEGF產(chǎn)生的交叉抗體的確可以中和小鼠體內(nèi)VEGF的作用，抑制腫瘤中新生血管的生成，從而抑制腫瘤的生長。實施例10非洲爪蟾VEGF免疫小鼠抗血清抑制血管內(nèi)皮細胞生長的作用經(jīng)上個實施例純化免疫球蛋白用四唑鹽(MTT)比色法檢測抑制血管內(nèi)皮細胞生長的作用。具體方法如下1.分離小鼠靜脈的血管內(nèi)皮細胞，用小鼠VEGF(終濃度為300ng/ml)刺激并維持在對數(shù)生長中期。
2.以2.5×104細胞/孔的密度將小鼠血管內(nèi)皮細胞接種于96孔板，培養(yǎng)基含300ng/ml的小鼠VEGF，置于37C，含5％CO2濃度的孵箱中培育24小時。
3.加入不同濃度的純化好的免疫球蛋白，分別來自非洲爪蟾VEGF治療組、小鼠VEGF治療組、空載體pSecTag 2A對照組和生理鹽水對照組，置于37℃，含5％CO2濃度的孵箱中培育72小時。
4.每孔加入10μl MTT溶液(5mg/ml)，置于37℃，含5％CO2濃度的孵箱中培育4小時。
5.每孔加入50μl裂解液(20％SDS/50％DMF)，置于37℃，含5％CO2濃度的孵箱放置過夜。
6.使用酶標儀檢測570-650nm的波長的光吸收值。
7.使用下列公式計算血管內(nèi)皮細胞的抑制率 抑制結(jié)果見圖17，結(jié)果表明只有非洲爪蟾VEGF免疫的抗血清能特異地抑制由VEGF刺激的血管內(nèi)皮細胞的增殖，其抑制存在劑量依賴關(guān)系；而小鼠VEGF治療組及兩個對照組均對由VEGF刺激的血管內(nèi)皮細胞的增殖沒有抑制作用。這說明非洲爪蟾VEGF治療組產(chǎn)生的與小鼠VEGF的交叉中和抗體能特異地中和VEGF在體外刺激血管內(nèi)皮細胞增殖的作用，從細胞水平上進一步證實了異種VEGF免疫抑制新生血管生成的作用。
權(quán)利要求
1.異種血管內(nèi)皮細胞生長因子疫苗其特征是由異種同源的血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)，如嚙齒類、鳥類、兩棲類的DNA疫苗和蛋白疫苗組成；來源于兩棲類的非洲爪蟾的血管內(nèi)皮細胞生長因子的蛋白大小約21.5千道爾頓(kDa)，包含至少194個氨基酸；來源于嚙齒類的小鼠血管內(nèi)皮細胞生長因子的蛋白大小約21千道爾頓(kDa)，包含至少190個氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述異種血管內(nèi)皮細胞生長因子疫苗其特征在于非洲爪蟾血管內(nèi)皮細胞生長因子的核苷酸及蛋白序列來自SEQNo.1；小鼠血管內(nèi)皮細胞生長因子的核苷酸及蛋白序列來自SEQNo.2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的異種血管內(nèi)皮細胞生長因子疫苗其特征在于抑制新生血管中的內(nèi)皮細胞的增殖，抑制與血管生成相關(guān)疾病的發(fā)生與發(fā)展，特別是抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移；用異種同源的血管內(nèi)皮細胞生長因子的不同種屬之間的差異性使機體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體，又用其同源性使產(chǎn)生的抗體與機體自身的VEGF可以發(fā)生交叉反應(yīng)，從而中和機體自身的VEGF。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的異種血管內(nèi)皮細胞生長因子疫苗其特征在于用于抑制多種與血管生成相關(guān)疾病的治療，有腫瘤、Kaposi肉瘤、類風濕性關(guān)節(jié)炎、增生性視網(wǎng)膜病、牛皮癬、硬皮病。
5.異種血管內(nèi)皮細胞生長因子疫苗的制備方法其特征在于利用非洲爪蟾的cDNA文庫經(jīng)聚合酶鏈式反應(yīng)，合成非洲爪蟾血管內(nèi)皮細胞生長因子cDNA片段后，或小鼠內(nèi)皮細胞的總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)合成小鼠血管內(nèi)皮細胞生長因子cDNA片段后，分別構(gòu)建入過渡質(zhì)粒pCR2.1中，經(jīng)測序驗證序列，再構(gòu)建入哺乳動物細胞真核表達載體，得到DNA疫苗；同時構(gòu)建入原核表達載體(如大腸桿菌的表達載體)，構(gòu)建入酵母表達載體，分別表達后，進行分離純化得到目的蛋白——非洲爪蟾或小鼠血管內(nèi)皮細胞生長因子重組蛋白，得到蛋白疫苗。經(jīng)免疫小鼠，產(chǎn)生抗體，測定抗體的滴度和抗腫瘤作用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的異種血管內(nèi)皮細胞生長因子疫苗其特征在于表達蛋白可利用金屬螯合柱親和層析一步純化，透析復(fù)性后，經(jīng)腸激酶酶解后，再經(jīng)離子交換層析得到純化。
全文摘要
本發(fā)明提供異種血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)疫苗及其制備方法，通過免疫來源于不同于人類的其它物種，如嚙齒類、鳥類、兩棲類等的同源VEGF的DNA疫苗或蛋白疫苗，在體內(nèi)產(chǎn)生交叉免疫反應(yīng)，中和VEGF的作用，抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖。該異種VEGF疫苗能抑制與血管生成相關(guān)疾病的發(fā)生與發(fā)展，特別是抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移，進一步擴大并充實了抗腫瘤血管生成治療方法。該異種VEGF疫苗的使用劑量低，作用時間持久，純化工藝簡單，成本低。
文檔編號A61P19/04GK1406629SQ0110873
公開日2003年4月2日 申請日期2001年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月13日
發(fā)明者魏于全, 楊莉, 黃媚娟, 牛挺, 趙霞 申請人:四川大學華西醫(yī)院