專利名稱：惡性瘧原蟲動(dòng)力素蛋白基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為一種惡性瘧原蟲新動(dòng)力素蛋白基因的免疫學(xué)作用，涉及生物醫(yī)學(xué)高技術(shù)中的基因的開發(fā)與應(yīng)用領(lǐng)域。
瘧疾是當(dāng)今世界上最致命的流行病之一。全球每年約有3億到5億人感染，2百萬人死亡。其生活史可以簡(jiǎn)單歸納如下當(dāng)雌性按蚊叮咬宿主時(shí)，單核的子孢子從血循環(huán)侵入肝細(xì)胞，并在此發(fā)育為成熟的肝內(nèi)期裂殖體，成熟的肝裂殖子從肝細(xì)胞內(nèi)釋放入血，侵入紅細(xì)胞進(jìn)行紅內(nèi)期無性生殖，經(jīng)過2至3天后發(fā)育為成熟的裂殖體，從每個(gè)感染紅細(xì)胞內(nèi)可釋放6至30個(gè)裂殖子，這些裂殖子再侵入其它紅細(xì)胞，進(jìn)行多輪擴(kuò)增，導(dǎo)致大量的紅細(xì)胞被感染、破裂，裂殖子和瘧原蟲的代謝產(chǎn)物、殘余和變性的血紅蛋白以及紅細(xì)胞碎片等一并進(jìn)入血流，刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性熱源質(zhì)，起周期性寒熱發(fā)作，并出現(xiàn)貧血及脾腫大。與此同時(shí)，少量裂殖子發(fā)育為有性期的雌、雄配子體，當(dāng)宿主再次被蚊子叮咬后隨血液進(jìn)入蚊體開始其生活史的蚊蟲期，生成下一代子孢子。由于惡性瘧原蟲生活周期的復(fù)雜性，以及惡性瘧原蟲抗原的高度多態(tài)性的特點(diǎn)，造成了目前仍未有很好的保護(hù)性抗原。
惡性瘧原蟲在人紅細(xì)胞的發(fā)育過程中對(duì)宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架進(jìn)行修飾，這種修飾對(duì)于惡性瘧原蟲本身的生存和致病性有著重要的意義。由于紅細(xì)胞本身缺乏細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)及細(xì)胞器，惡性瘧原蟲必需具備一個(gè)獨(dú)特的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，來完成這些修飾。同時(shí)惡性瘧原蟲在侵染紅細(xì)胞過程中，有許多微粒體和棒狀體釋放的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與。目前對(duì)于惡性瘧原蟲紅內(nèi)期的蛋白運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制還知之甚少。然而蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因在生物體內(nèi)是相對(duì)保守的，因此克隆惡性瘧原蟲蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因?qū)τ趷盒辕懺x生命特征的認(rèn)識(shí)及尋找新的惡性瘧原蟲免疫治療候選抗原具有重要意義。
動(dòng)力素蛋白(dynamin)家族是一種有內(nèi)源性GTP酶活性的高分子量GTP結(jié)合蛋白家族，它們?cè)诓煌纳矬w內(nèi)參與不同類型的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過程。因此惡性瘧原蟲動(dòng)力素蛋白可作為潛在的抗原候選基因。
本發(fā)明的目的在于尋找和克隆惡性瘧原蟲動(dòng)力素蛋白新基因，對(duì)該基因表達(dá)蛋白進(jìn)行免疫保護(hù)研究，為惡性瘧原蟲的免疫治療提供新的作用靶點(diǎn)。
本發(fā)明的內(nèi)容是應(yīng)用基因組信息學(xué)原理、分子克隆、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、cDNA文庫篩選、DNA序列測(cè)定技術(shù)、Western印跡雜交法，克隆鑒定惡性瘧原蟲動(dòng)力素蛋白新基因Pfdyn，并用惡性瘧原蟲體外抑制實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了免疫保護(hù)分析。
該基因達(dá)到的技術(shù)指標(biāo)為1.惡性瘧原蟲動(dòng)力素蛋白Pfdyn的cDNA全長(zhǎng)序列3014bp，AT含量為74.12％，，起始密碼子ATG位于315bp處，其鄰近的序列具有典型的Kozak序列特性(ANNATGG)。編碼的蛋白質(zhì)含837個(gè)氨基酸，N端具有三重GTP結(jié)合位點(diǎn)(圖1)。Pfdyn在惡性瘧原蟲3D7株和Dd2株間在1976bp處存在一個(gè)從A到G的變異，但不影響氨基酸的編碼頁序。
2.惡性瘧原蟲動(dòng)力素蛋白Pfdyn N端151個(gè)氨基酸重組蛋白在大腸桿菌BL21株中獲得了表達(dá)。(圖2)3.惡性瘧原蟲動(dòng)力素蛋白Pfdyn在紅內(nèi)期裂殖體期特異表達(dá)(圖3)。
4.抗惡性瘧原蟲動(dòng)力素蛋白Pfdyn多克隆IgG在體外可抑制惡性瘧原蟲Dd2株和FCC1株的生長(zhǎng)(圖4)。
本項(xiàng)發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)對(duì)篩選的惡性瘧原蟲動(dòng)力素蛋白Pfdyn進(jìn)行免疫學(xué)的研究，為惡性瘧原蟲的免疫治療提供了新的保護(hù)性候選抗原。
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1 Pfdyn cDNA及其編碼蛋白質(zhì)序列圖。
下劃線部分為三重GTP結(jié)合結(jié)構(gòu)域，斜體部分為Kozak序列。
圖2重組的Pfdyn N端多肽在大腸桿菌中的表達(dá)。
1，低分子量蛋白Marker；2，未誘導(dǎo)的含空白質(zhì)粒對(duì)照的裂解物；3，誘導(dǎo)的含空白質(zhì)粒對(duì)照的裂解物；4，未誘導(dǎo)的含Pfdyn N端片段質(zhì)粒的對(duì)照裂解物；5，誘導(dǎo)的含Pfdyn N端片段質(zhì)粒的裂解物。箭頭所指為重組蛋白帶。
圖3 Western印跡分析紅內(nèi)期Pfdyn基因的表達(dá)1，高分子量預(yù)染蛋白Marker；2，紅細(xì)胞對(duì)照；3，環(huán)狀體期感染紅細(xì)胞；4，裂殖體期感染紅細(xì)胞。箭頭所指為92Kd Pfdyn蛋白。
圖4抗Pfdyn IgG的惡性瘧原蟲體外生長(zhǎng)抑制曲線圖實(shí)施例1惡性瘧原蟲動(dòng)力素蛋白基因Pfdyn的克隆及序列分析1.篩選探針的制備從GenBank中查到酵母動(dòng)力素相關(guān)蛋白Vps1P(GenBank Number M33315)，找到其三重GTP結(jié)合保守區(qū)。根據(jù)第一個(gè)GTP結(jié)合區(qū)序列(IDLPQINVVGSQSSGKSSVLENIVGRDFLPRGTGIVTRRP，27Aa-66Aa)，應(yīng)用NCBI惡性瘧原蟲BLAST主頁(www.ncbi.nlm.nih.gov/malaria)的tBlastN程序，在惡性瘧原蟲11號(hào)染色體找到一段高度同源區(qū)。根據(jù)此序列，設(shè)計(jì)引物，上游5’-gatggaaacgtcaatgtac-3’；下游5’-ggattgtaacaaggagac-3’。利用PCR擴(kuò)增惡性瘧原蟲Dd2株紅內(nèi)期cDNAλZAP文庫(由美國ATCC所屬M(fèi)R4提供)。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5分，然后94℃變性30秒，53℃退火50秒，70℃延伸45秒，循環(huán)30次，70℃延伸5分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為200bp片段。
2.探針的標(biāo)記及文庫的篩選用膠回收試劑盒(A.Phamacia公司)進(jìn)行探針的回收，探針利用隨機(jī)引物試劑盒(Promega公司)進(jìn)行α-P32-ATP的標(biāo)記。以此標(biāo)記探針對(duì)惡性瘧原蟲Dd2株紅內(nèi)期cDNAλZAP文庫進(jìn)行篩選，獲得陽性克隆后，送于大連寶生公司進(jìn)行序列測(cè)定(圖1)。
3.cDNA全長(zhǎng)序列與編碼氨基酸的分析Pfdyn cDNA全長(zhǎng)3014bp(圖1)，AT含量為74.12％，具有典型的惡性瘧原蟲基因的性質(zhì)。編碼的蛋白質(zhì)含837個(gè)氨基酸，其相對(duì)分子量為92KD。起始密碼子ATG位于315bp處，其鄰近的序列具有典型的Kozak序列特性(ANNATGG)。將上述序列與惡性瘧原蟲數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)Pfdyn Dd2 cDNA序列與Pfdyn 3D7基因組序列在1976位有一個(gè)A-G的突變，但這一突變并不改變開放閱讀框架。實(shí)施例2Pfdyn N端151個(gè)氨基酸肽段免疫血清的制備及純化1.Pfdyn N端151個(gè)氨基酸肽段的亞克隆利用WINSTAR軟件分析，Pfdyn N端435bp到887bp序列具有很高的抗原性。根據(jù)此序列設(shè)計(jì)引物上游5′GGATCCGTAGTGGTAAGAGTAGTGTTCTTGA3’，包含BamH I位點(diǎn)(下劃線)，下游5′GAATTCTTAATCGCTTGTGGACATATCAGC3’，包含EcoR I位點(diǎn)(下劃線)，用此對(duì)引物經(jīng)PCR從Pf dyn cDNA克隆中擴(kuò)增得到453bp片段。將此片段經(jīng)BamH I、EcoR I酶切后，亞克隆于大腸桿菌表達(dá)載體pGEX-5X-1(A.Phamacia)。正確的克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21株，經(jīng)37℃ IPTG誘導(dǎo)3小時(shí)，得到Pfdyn N端150氨基酸的融合重組蛋白。(圖2)。2.免疫血清的制備及純化重組蛋白送于Bethyl公司制備免疫血清。100μg的蛋白免疫兔子，每?jī)芍芗訌?qiáng)一次，共加強(qiáng)5次。免疫血清經(jīng)兩次硫酸胺沉淀后，過DEAE-52柱純化得到IgG.實(shí)施例3Pf dyn基因紅內(nèi)期特異性表達(dá)1.惡性瘧原蟲紅內(nèi)期特異性全蛋白的制備惡性瘧原蟲Dd2(紅內(nèi)期瘧原蟲可分為環(huán)狀滋養(yǎng)體、成熟滋養(yǎng)體、裂殖體和裂殖子階段)蟲株經(jīng)5％山梨醇處理兩次后，48小時(shí)和72小時(shí)分別取相同體積的紅細(xì)胞，用等體積SDS電泳上樣緩沖液100℃煮沸5分鐘，用同樣體積的紅細(xì)胞作為陰性對(duì)照。2.Western印跡分析惡性瘧原蟲Pfdyn紅內(nèi)期的特異性表達(dá)等體積的惡性瘧原蟲紅內(nèi)期全蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移于PVDF膜上(Roche公司)，用BM化學(xué)發(fā)光試劑盒(Roche公司)檢測(cè)，以1∶1000免疫血清作為第一抗體。結(jié)果證明紅內(nèi)期裂殖體期有92KD特異表達(dá)帶(圖3)。實(shí)施例4惡性瘧原蟲的體外抑制1.正常人單核細(xì)胞的分離從正常中國成年人體內(nèi)取全血，以肝素抗凝。全血經(jīng)Ficoll-Hypaque密度梯度離心后，分離到單個(gè)核細(xì)胞。將細(xì)胞用RPMI1640不完全培養(yǎng)基(Gibico公司)重懸，37℃，5％CO2孵箱孵育90分鐘，洗去未粘附的細(xì)胞，貼壁的細(xì)胞用NSE染色(Sigma公司)確認(rèn)其中單核細(xì)胞數(shù)。2.惡性瘧原蟲體外抑制實(shí)驗(yàn)以兩次5％山梨醇處理的惡性瘧原蟲Dd2蟲株和FCC1蟲株作為實(shí)驗(yàn)蟲株，起始蟲血率為1％。在96孔培養(yǎng)板上設(shè)計(jì)如下實(shí)驗(yàn)(1)抗Pfdyn IgG；(2)抗Pfdyn IgG，單核細(xì)胞；(3)正常兔IgG；(4)正常兔IgG，單核細(xì)胞；(5)單核細(xì)胞。其中每孔中總體積為200μl，紅細(xì)胞與單核細(xì)胞比為200∶1，IgG濃度為原始IgG濃度的5％，10％，20％。5％CO2，5％O2，90％N2，37℃培養(yǎng)48小時(shí)后計(jì)數(shù)蟲血率。結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，抗Pfdyn IgG在一定濃度能有效抑制惡性瘧原蟲的生長(zhǎng)(圖4)。這種抑制與單核細(xì)胞的存在無關(guān)，說明抗Pfdyn IgG的抑制作用發(fā)生在裂殖子侵染階段。
由于本實(shí)驗(yàn)抗Pfdyn IgG在體外可有效抑制惡性瘧原蟲的生長(zhǎng)，據(jù)此可作為保護(hù)性候選抗原，應(yīng)用于惡性瘧原蟲的免疫治療。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及惡性瘧原蟲動(dòng)力素蛋白基因(Pfdyn)，其特征在于該基因在惡性瘧原蟲兩種不同株間高度保守，在紅內(nèi)期裂殖體期特異表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述之惡性瘧原蟲動(dòng)力素蛋白基因，其特征在于氨基端151個(gè)氨基酸肽段免疫產(chǎn)生的多克隆IgG，在體外可以抑制惡性瘧原蟲的生長(zhǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述之惡性瘧原蟲動(dòng)力素蛋白基因，其特征在于可作為惡性瘧原蟲免疫治療的候選靶抗原。
全文摘要
本發(fā)明涉及惡性瘧原蟲動(dòng)力素蛋白基因,該基因編碼含三重GTP結(jié)合結(jié)構(gòu)域的內(nèi)源性GTP酶,在惡性瘧原蟲紅內(nèi)期裂殖體期特異表達(dá)。該基因氨基端多肽片段產(chǎn)生的多抗,在體外可抑制兩株紅內(nèi)期惡性瘧原蟲的生長(zhǎng),可作為惡性瘧原蟲免疫治療的候選靶抗原,可以增進(jìn)對(duì)惡性瘧原蟲生活特性的認(rèn)識(shí)。
文檔編號(hào)A61K39/002GK1377967SQ0111025
公開日2002年11月6日 申請(qǐng)日期2001年4月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月4日
發(fā)明者王恒, 李會(huì)良 申請(qǐng)人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所