專(zhuān)利名稱(chēng)：具有神經(jīng)保護(hù)作用的黃芩根提取物及含有該提取物的藥學(xué)制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有神經(jīng)保護(hù)活性的黃芩根提取物以及含有作為藥學(xué)活性成分的該黃芩根提取物的藥學(xué)制劑，適用于預(yù)防和治療腦疾病的藥學(xué)制劑。
黃芩根在東方醫(yī)學(xué)中作藥用，它是由黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)，一種唇形科多年生草本植物的根經(jīng)剝皮和干燥而得到。已知黃芩根含有多種類(lèi)黃酮，如漢黃芩素、黃芩素、黃芩黃素。
在東方醫(yī)學(xué)中，該植物一般用于除濕熱、止血和安胎。最近，已新發(fā)現(xiàn)了它的各種藥學(xué)活性，包括抗菌活性、抗炎活性(Michinori Kubo等人，化學(xué)與藥學(xué)通報(bào)，32(7),1984)、抗過(guò)敏活性、促膽汁分泌活性、肝保護(hù)活性、利尿、治療高脂血癥、腸蠕動(dòng)抑制活性和抗癌活性(國(guó)家中醫(yī)藥管理局；中國(guó)藥典，上海，上海科學(xué)技術(shù)出版社，1998，第1682-1694頁(yè)(State Administration of Traditional ChineseMedicine；Chinese Pharmacopoeia,shanghai,Shanghai Science&TechnologyPress,1998,pp 1682-1694))。黃芩根在臨床上已被用于各種用于治療高血壓、腦脊髓膜炎、輕度癱瘓等的處方中、以ox benzoar為基礎(chǔ)的用于激活心臟的丸劑中(Kim等人，Prescription,Young Lim Publications,seoul,1990,pp111-113,pp263-264,p338)。例如，在以黃連(Coptis)根莖為基礎(chǔ)的用于對(duì)抗毒性作用的頓服劑藥物中、以龍膽(Gentiana Scabra Bunge.Var.buergeriMax.)為基礎(chǔ)的用于治療激括肝功能的頓服劑藥物中和以O(shè)stericum Koreanum(Maximowz)Kitagawa為基礎(chǔ)的用于治療癱瘓的頓服劑藥物中以及Ox benzoar為基礎(chǔ)的用于預(yù)防突發(fā)的心力衰竭的丸劑中含有黃芩根。
黃芩根是以O(shè)stericum koreanum(Maximowz)Kitagawa為基礎(chǔ)的用于治療癱瘓的頓服藥和以O(shè)x benzoar為基礎(chǔ)的用于預(yù)防突發(fā)的心力衰竭的丸劑的主要成分，在本發(fā)明中對(duì)其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損害的保護(hù)活性進(jìn)行測(cè)定。目前尚未提出有效地用于治療早期癱瘓的化學(xué)藥物。
為了在已積累了大量數(shù)據(jù)的東方醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)上提出一種對(duì)早期癱瘓的有效治療，本發(fā)明者已在黃芩根對(duì)早期癱瘓的藥物作用及其治療機(jī)理方面進(jìn)行了深入而全面的研究，最后發(fā)現(xiàn)黃芩根提取物具有對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損害的保護(hù)作用。
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)作用的黃芩根提取物。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種具有預(yù)防和治療與神經(jīng)細(xì)胞損害有關(guān)的腦疾病的治療活性的藥學(xué)制劑。
本發(fā)明的一方面提供了一種具有神經(jīng)保護(hù)活性的黃芩根提取物，該提取物由以下方法制得在提取劑中浸泡黃芩根，所說(shuō)的提取劑選自水、低級(jí)醇及其混合物；濃縮該提取利并凍干該濃縮物。
本發(fā)明另一方面提供了一種具有神經(jīng)保護(hù)活性的藥學(xué)制劑，該藥學(xué)制劑包括與藥學(xué)上可接受基質(zhì)結(jié)合的藥學(xué)有效成分黃芩根提取物，該黃芩根提取物由以下方法制得在選自水、低級(jí)醇及其混合物的提取劑中浸泡黃芩根；濃縮該提取劑并凍干該濃縮物。


圖1表示曲線，其中在大鼠上誘發(fā)缺血和完成再灌注以后，在未控制體溫(a)和外部控制體溫(b)情況下，作出關(guān)于各注射劑量的黃芩根提取物的體溫對(duì)時(shí)間的曲線。
圖2表示在模型組(a和b)、對(duì)照組(c)和黃芩根治療組(d、e和f)上造成10分鐘的缺血以后的第7天大鼠的少量海馬的顯微照片。
圖3表示在誘發(fā)10分鐘缺血的7天的以隨劑量而定方式的黃芩根提取物的神經(jīng)保護(hù)作用的柱狀圖。
圖4表示采用MTT測(cè)定(a)和LDH測(cè)定(b)測(cè)得的黃芩根提取物的抗氧化活性柱狀圖。
在Pulsinelli,1979提出的4-血管堵塞模型上測(cè)試黃芩根對(duì)癱瘓的療效。在該模型中，其代表為前腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ?，它通過(guò)暫時(shí)性堵塞提供大鼠腦血液的血管和再灌注以發(fā)生海馬部位神經(jīng)細(xì)胞的損害。該神經(jīng)細(xì)胞損害為自然細(xì)胞壞死，其過(guò)程遵循細(xì)胞凋亡途徑。已知用于治療這種模型的藥物表現(xiàn)出對(duì)所有患有局部缺血如人癱瘓的動(dòng)物模型具有治療作用。實(shí)際上，這些藥物已表現(xiàn)出臨床應(yīng)用的前景。為進(jìn)行缺血性神經(jīng)細(xì)胞損害的研究，對(duì)于患有完全前腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ蛠?lái)說(shuō)，目前優(yōu)選4-血管堵塞造成的患有前腦缺血的動(dòng)物模型，因?yàn)樵?-血管堵塞時(shí)不影響后腦的血流，因此排除了該研究中呼吸和系統(tǒng)循環(huán)的影響。
在本發(fā)明中描述了黃芩根對(duì)由大腦缺血造成的神經(jīng)細(xì)胞損害的保護(hù)作用。為此目的，在造成大腦缺血以后立即注射黃芩根提取物，并在注射一周后計(jì)算在海馬的CA1亞區(qū)存活的神經(jīng)細(xì)胞以確定黃芩根是否有效地治療由神經(jīng)細(xì)胞凋亡造成的癱瘓。還測(cè)定了黃芩根的抗氧化活性以研究其神經(jīng)保護(hù)機(jī)理。在這方面，在試管中觀察其對(duì)經(jīng)培養(yǎng)和被過(guò)氧化氫氧化破壞的PCl2細(xì)胞系的抗氧化活性。在該模型中，由于已知該細(xì)胞損害與在細(xì)胞凋亡途徑中起作用的一組caspases的誘發(fā)有關(guān)，因此采用免疫組織化學(xué)以確定該黃芩根是否對(duì)在該caspases組的酶作用中起主要作用的caspase3(cpp32)的誘發(fā)具有抑制活性。
為了在這種實(shí)驗(yàn)中使用，采用溶劑從黃芩根中提取獲得提取物。作為適用于這種提取的溶劑，可以采用水、低級(jí)醇及其混合物。這些低級(jí)醇的實(shí)施例包括甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇和叔丁醇，優(yōu)選甲醇和乙醇。為得到提取物，將黃芩根浸泡于溶劑中，并將提取物過(guò)濾、濃縮和凍干。
根據(jù)以下的實(shí)施例可以更好地理解本發(fā)明，但這些實(shí)施例的提出是用于例舉，而不應(yīng)被理解為對(duì)本發(fā)明的限定。
實(shí)施例1黃芩根提取物的制備在70％的甲醇水溶液中三次超聲處理3kg干燥的黃芩根15分鐘。在合并收集以后，將該提取物過(guò)濾和真空濃縮，然后將該濃縮物凍干得到160g的凍干提取物。
實(shí)施例2在蒸餾水中三次超聲處理3kg干燥的黃芩根15分鐘。在合并收集以后，將該提取物過(guò)濾和真空濃縮，然后將該濃縮物凍干得到150g的凍干提取物。
實(shí)施例3在一級(jí)乙醇中三次超聲處理3kg干燥的黃芩根15分鐘。在合并收集以后，將該提取物過(guò)濾和真空濃縮，然后將該濃縮物凍干得到1450g的凍干提取物。
實(shí)驗(yàn)例實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在試驗(yàn)前，使體重約為170g(SLC，日本)的5周齡Wister雌性大白鼠自由獲取飼料和水一周以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。
材料試驗(yàn)前，黃芩根由草藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室，東醫(yī)學(xué)院，KyungHee大學(xué)，韓國(guó)(LaboratoryofHerbology,College of Oriental Medicine,Kyung Hee University,Korea)證實(shí)。
缺血誘發(fā)麻醉后，以以下方式將Wister大鼠背部置于趨實(shí)體容器中內(nèi)在該容器的水平模上將尾巴固定地指向向下30°角度，同時(shí)將鼻和嘴固定在與麻醉裝置相連的塑料錐形物中(Ohameda V.M.C/Boc Health Care,Cypranne,U.K.)。首先采用處在氮和氧的混合物(N270％和O230％)中的5％的異氟烷完成麻醉，然后用1.5％的異氟烷維持。
將尾巴固定在手術(shù)臺(tái)上同時(shí)伸出頸椎骨。首先，打開(kāi)喉嚨部位。然后置備硅管環(huán)于頸總動(dòng)脈處，根據(jù)能夠形成再灌注的方案造成缺血。為在造成缺血時(shí)阻斷通過(guò)微血管的血液循環(huán)，通過(guò)以下方式將線穿過(guò)鼠體將頸和椎旁肌肉定位于氣管、食道和外頸靜脈之前，而頸總動(dòng)脈則在該線上；然后采用手術(shù)夾將傷口縫合。
接著，將大鼠的胃置于枕骨部位以進(jìn)行手術(shù)。在手術(shù)放大器的輔助下，對(duì)枕骨下第一頸椎部位進(jìn)行手術(shù)。將大小為1mm或更小的微電凝針接近翼孔，小心操作以免損害肌肉，穿過(guò)第一頸椎的翼孔進(jìn)入椎動(dòng)脈運(yùn)行的通道。間歇地往該針中流入電流以將該椎動(dòng)脈電凝。在確認(rèn)完成電凝和采用手術(shù)顯微鏡堵塞通行于椎骨通道的椎動(dòng)脈以后，用手術(shù)夾縫合。24小時(shí)后，除去手術(shù)夾。然后，用動(dòng)脈瘤夾堵塞頸總動(dòng)脈10分鐘以造成缺血。如果在1分鐘內(nèi)輕微的反射消失，則進(jìn)一步緊密地縫合頸部位。實(shí)驗(yàn)中排除了盡管縫合緊密但仍不表現(xiàn)出輕微反射消失的大鼠，因?yàn)檎J(rèn)定它們?cè)贑A1神經(jīng)細(xì)胞對(duì)側(cè)已經(jīng)發(fā)生了完全的、平行的損害。還排除了發(fā)生痙攣的那些大鼠。10分鐘后，從頸總動(dòng)脈除去動(dòng)脈瘤夾，然后對(duì)動(dòng)脈進(jìn)行再灌注。只選擇那些在再灌注之后表現(xiàn)出為時(shí)20±5分鐘的知覺(jué)喪失的大鼠進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
在誘發(fā)缺血以后以30分鐘的時(shí)間間隔對(duì)大鼠的體溫進(jìn)行6小時(shí)的監(jiān)測(cè)。如果體溫下降，則記錄體溫的變化且對(duì)體溫不進(jìn)行控制。在另一實(shí)驗(yàn)中，阻止體溫的下降以排除由于低體溫而造成的對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。在這種青況下，采用一種利用直腸溫度的自動(dòng)溫度控制器以在誘發(fā)缺血、再灌注和復(fù)原時(shí)期將大鼠的體溫保持在37±0.5℃。用插到直腸至少約6em長(zhǎng)度的探針測(cè)定體溫，因?yàn)橹蹦c溫度反映腦的溫度(MiyazawaT等人，J.Cerb Blood Flow Metab 1992:12:817-822)。
草藥樣品的給藥和實(shí)驗(yàn)組的選擇為了測(cè)定黃芩根對(duì)大鼠前腦缺血的治療作用，以不同的劑量給予大鼠該草藥提取物。在誘發(fā)前腦缺血后的0和90分鐘時(shí)給予該提取物。將在上述實(shí)施例中制得的黃芩根提取物溶于0.89％鹽水中，并以250mg、500mg和1,000mg有效成分每kg體重的劑量和同體積的注射量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。以相同的方式作為模型組的第一組進(jìn)行外科手術(shù)，但沒(méi)有誘發(fā)前腦缺血。對(duì)于用作對(duì)照組的第二組，在誘發(fā)前腦缺血之后在給予草藥提取物的相同時(shí)間間隔處以相同的方式腹膜內(nèi)注射劑量為2.0ml/kg的生理鹽水。在誘發(fā)前腦缺血以后的0和90分鐘處，分別以250mg/kg、500mg/kg和1,000mg/kg的劑量分別對(duì)第三、四和五組進(jìn)行黃芩根提取物的腹膜內(nèi)注射。
組織標(biāo)本的制備在誘發(fā)前腦缺血一周以后，用水合氯醛(35.0mg/kg i.p.)麻醉大鼠并打開(kāi)其胸部。切開(kāi)右心耳并將注射器小心地插到左心室，然后緩慢但不斷地往心臟注入肝素化的0.5％的亞硝酸鈉生理鹽水，然后采用4.0％的福爾馬林固定劑進(jìn)行心臟灌注。接著，移除腦并在0.1M磷酸鹽緩沖的福爾馬林對(duì)其進(jìn)行后定影2小時(shí)，然后注入30％蔗糖在4℃下過(guò)夜。從被固定的腦上制造從前鹵部位延伸-2.5mm和-4.0mm的背海馬部位的冠狀堵塞。接著，用滑動(dòng)切片機(jī)低溫切開(kāi)冠狀堵塞。收集厚度為30μm的海馬組織切片用于樣本制備。
觀塞受損的神經(jīng)細(xì)胞在用甲酚紫對(duì)含有背部海馬的組織切片進(jìn)行染色和固定以后，在1,000μm長(zhǎng)的中間區(qū)域?qū)ι窠?jīng)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，它最易于延遲背部海馬CA1中的神經(jīng)死亡(CramB.J等人，Neuroscience 1988；27:387-402)。在250功率放大的條件下，取在三種不同腦組織切片的左右面上具有普通形態(tài)的錐體細(xì)胞數(shù)目的平均值，即由三位不同的觀測(cè)者在總共6個(gè)部位測(cè)得神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)目。
PCl2細(xì)胞培養(yǎng)和抗氧化作用的測(cè)定在96-孔板上，其中向每一個(gè)含有DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle medium,Gibco BRL,U.S.A)孔中加入1％的青霉素-鏈霉素(Gibco BRL,U.S.A)和10％胎兒牛血清(Gibco BRL,U.S.A)，在培養(yǎng)器中于37℃下以3×104的細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度將購(gòu)自韓國(guó)細(xì)胞系銀行(Korea Cell Line Bank)PC12細(xì)胞(大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤系)培養(yǎng)過(guò)夜。將黃芩根提取物溶于處于DPBS(杜爾貝科磷酸鹽緩沖的鹽水，sigma U.S.A)的10％的DMSO(二甲基亞砜，Sigma U.S.A)溶液中以得到含有最終濃度為10.0、25.0、50.0和100.0μg/ml的提取物的溶液。用這些溶液對(duì)細(xì)胞預(yù)處理三小時(shí)。為進(jìn)行比較，加入等體積的處在DPBS中的10％的DMSO溶液作為對(duì)照。在培養(yǎng)基中所含的DMSO的最終濃度為0.5％。三小時(shí)的預(yù)處理以后，用新鮮的含有0.5mM的H2O2的培養(yǎng)基代替加有提取物的培養(yǎng)基并在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)。
為了測(cè)定LDH(乳糖脫氫酶)活性，將30μl的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到新96-孔板的每一個(gè)孔上，然后在每孔中加入30μl含有0.75mM丙酮酸鹽和1.4mM NADH的溶液，接著在37℃下培養(yǎng)30分鐘。然后，將著著色溶液(2,4-二硝基苯基肼，YoungDong,Korea)與該培養(yǎng)基反應(yīng)，并用0.4N的NaOH堿化以顯色，在405nm處在微板讀出器中測(cè)定吸光率。將測(cè)量表示為占所測(cè)得的該孔的吸光率的百分?jǐn)?shù)，在該孔中加入10％的Triton X-100至最終濃度為0.1％到細(xì)胞完全溶解。為進(jìn)行顯著性試驗(yàn)，將該測(cè)量與加有處在PDBS中的10％DMSO的對(duì)照組的結(jié)果進(jìn)行比較。在37℃下用150.0μl濃度的0.5mg/ml的MTT對(duì)該96-板的每一孔中的細(xì)胞處理4小時(shí)，然后在存在50.0μl的DMSO的情況下攪拌，然后采用微板讀出器測(cè)定在570nm處的吸光率。將測(cè)得的吸光率的值表示為所測(cè)的加有10％DMSO/DPBS的對(duì)照組的吸光率的百分?jǐn)?shù)。
抗TNF-α的抑制活性為了測(cè)定黃芩根的神經(jīng)保護(hù)機(jī)理，還測(cè)定了其抗TNF-α的抑制活性。采用不同濃度的黃芩根提取物與LPS結(jié)合來(lái)處理BV-2細(xì)胞，在該處理20小時(shí)以后，得到上清液。在96-孔板上分別地培養(yǎng)L929細(xì)胞并將各孔中所用的培養(yǎng)基用50μl的新鮮的游離于血清的DMEM取代。在每一孔中，加入50μl的培養(yǎng)基、50μl的rTNF和50μl的上清液，并對(duì)其進(jìn)行連續(xù)稀釋?zhuān)缓蠹尤?0μl的DMEM+10％FBS+放線菌素D(50μg/m1)。
在培養(yǎng)18小時(shí)之后，除去每孔的上清液。在加入100μl的結(jié)晶紫之后，用流動(dòng)的水清洗細(xì)胞10分鐘并干燥。將這些細(xì)胞懸浮在100μl的0.5％SDS中，渦動(dòng)30分鐘并在板讀出器上在590nm處測(cè)定其吸光率。為了測(cè)定NO的產(chǎn)量，利用了Griess反應(yīng)。在這方面，將50μl的Griess反應(yīng)劑加到每一孔上，并將其在室溫下放置10分鐘。在板讀出器上測(cè)定在550nm處的吸光率以測(cè)定黃芩根對(duì)NO產(chǎn)量的抑制活性。結(jié)果如以下表1所示。
表1
免疫組織化學(xué)選擇先前灌注的厚度為40μm的組織切片。將cpp32抗體用作基本免疫染色抗體，而將抗兔抗體用作第二抗體。將該組織切片浸漬于0.1M的PBS(PH7.2)中5分鐘，兩次用Triton-X100清洗15分鐘并兩次用0.1M的PBS和0.5％的BSA的混合物青洗15分鐘，并在室溫下與基本抗體反應(yīng)過(guò)夜。在兩次用0.1M的PBS和0.5％的BSA的混合物清洗以后，將該切片與第二抗體反應(yīng)60分鐘。兩次重復(fù)用0.1M的PBS和0.5％的BSA的混合物清洗15分鐘，然后將該組織切片以50∶1的比率與ABC(抗生物素蛋白-輔酶R-過(guò)氧物酶)軛合物在室溫下反應(yīng)60分鐘。在用0.1M的PBS清洗15分鐘以后，將各組織切片與含有0.05％的DAB(3,3’-二氨基對(duì)二氨基聯(lián)苯，SigmaU.S.A)的0.1M的PBS和0.03％的過(guò)氧化氫反應(yīng)。在顯色以后，往各組織切片中加入0.1M的PBS以終止反應(yīng)，然后將其制備成樣本。
統(tǒng)計(jì)為了測(cè)定該草藥提取物的療效，采用Student’s t-檢驗(yàn)，其中將各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組進(jìn)行比較。
結(jié)果1．劑量、體溫影響和缺血誘發(fā)時(shí)限為了測(cè)定取決于劑量的療效，將不同量的黃芩根提取物溶于0.89％生理鹽水中并腹膜內(nèi)注射250mg、500mg和1,000mg每kg體重和總體積為2.0ml的劑量。以干黃芩根重量為基數(shù)，這些劑量分別相應(yīng)為0.73g/kg、1.45g/kg和2.89g/kg。
強(qiáng)制性地分別將四只大鼠分別造成缺血5、10、20和30分鐘以確定在大鼠上誘發(fā)缺血的最佳時(shí)限。在再灌注以后，將它們處死以提供海馬組織切片，然后研究神經(jīng)細(xì)胞的損失。在缺血誘發(fā)10分鐘時(shí)，觀察在海馬CA1亞區(qū)中受損的錐體細(xì)胞達(dá)到全部細(xì)胞數(shù)目的1/4，因而將該時(shí)限確定為用于測(cè)定該草藥的醫(yī)藥效果最佳時(shí)限。
關(guān)于溫度參數(shù)，在注射高濃度的該消毒的樣品以后，對(duì)誘發(fā)大腦缺血和進(jìn)行再灌注的大鼠的體溫進(jìn)行6小時(shí)的監(jiān)測(cè)。結(jié)果如圖1a和1b所示。在圖1a中所作的體溫表明在誘發(fā)缺血以后以各種劑量的黃芩根提取物注射的大鼠體溫過(guò)低。另一方面，在圖1b中，在短暫的全體大腦缺血期間，注射進(jìn)各種劑量(250,500和1,000mg/kg)的黃芩根提取物的大鼠的體溫保護(hù)恒定(體溫正常)(直腸溫度36.5-37.5℃)。在這兩種情況下，在誘發(fā)全體大腦缺血的0和90分鐘，將2.0ml的黃芩根0.89％的生理鹽水溶液以250mg、500mg和1,000mg/kg的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射，并在大鼠的直腸內(nèi)測(cè)定其體溫。圖1a和1b給出了平均±標(biāo)準(zhǔn)偏差值。括號(hào)內(nèi)的數(shù)字表示采用的大鼠的數(shù)。
在該過(guò)程中，觀察到黃芩根給藥組體溫降低。已知在誘發(fā)缺血期間體溫降低是為了防止神經(jīng)細(xì)胞受損，由此表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)作用(Busto等人，J.Cereb.BloodFlow Metab.1987,7:720-738)。在缺血誘發(fā)和再灌注之后，當(dāng)以250mg/kg劑量的黃芩根給藥時(shí)沒(méi)有觀察到體溫下降，但以500和1,000mg/kg給藥時(shí)則監(jiān)測(cè)到體溫下降(圖1a)。在這方面，在缺血誘發(fā)之后的0和90分鐘處腹膜內(nèi)給予該藥物。具體地說(shuō)，如果以1,000mg/kg的劑量給予黃芩根，則在缺血誘發(fā)時(shí)測(cè)得的體溫為37.6±0.5℃，而在2小時(shí)后為36.9±0.4℃。然后，在缺血誘發(fā)的6小時(shí)后體溫漸漸地降到35.1±0.4℃，它比缺血誘發(fā)時(shí)的溫度(37.7±0.5℃)下降了2.5℃。在以500mg/kg的劑量給藥時(shí)，2小時(shí)后體溫從缺血誘發(fā)時(shí)的37.7±0.5℃下降到37.1±0.3℃，6小時(shí)降到35.9±0.4℃，體溫下降了約1.8℃。
為了確定黃芩根的神經(jīng)保護(hù)作用是否與體溫下降有關(guān)，強(qiáng)制性地將注射進(jìn)黃芩根提取物的大鼠的體溫維持恒定。也就是說(shuō)，在缺血誘發(fā)12小時(shí)之后強(qiáng)制性將表現(xiàn)出體溫下降的兩提取物注射組的體溫保持恒定(圖1b)，同時(shí)觀察神經(jīng)細(xì)胞的損失。對(duì)于不表現(xiàn)出顯著的體溫下降的250mg/kg給藥組，將自動(dòng)溫度控器的溫度設(shè)定在37℃以阻止體溫的部分下降。
2．觀察受損神經(jīng)細(xì)胞已報(bào)道，如果在由4-血管堵塞引發(fā)大腦缺血之后進(jìn)行再灌注，則在海馬CA1亞區(qū)中的錐體細(xì)胞最易于形成缺血并在再灌注的72小時(shí)后開(kāi)始發(fā)生細(xì)胞死亡(Pulsinelli W.A.等人，Ann Neurol 1982,11:491-498)。在該研究中，在再灌注的一周后將大鼠處死，在該時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)細(xì)胞已完全受損；同時(shí)將由對(duì)側(cè)海馬獲得的組織切片置于光學(xué)顯微鏡下以觀察在海馬CA1亞區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的延遲死亡。結(jié)果如在圖2a到2f所示，它是在模型組、對(duì)照組和黃芩根治療組中，在誘發(fā)10分鐘缺血的7天后大鼠的少量海馬的顯微圖片。
在冠狀縫之后，用甲酚紫對(duì)冠狀海馬的組織切片進(jìn)行著色以標(biāo)記在海馬CA1亞區(qū)由于完全缺血引起的選擇性、延遲的神經(jīng)細(xì)胞損失。
在圖2a的模型組中，箭頭指示CA1錐體神經(jīng)細(xì)胞的徑跡。圖2b所示的海馬組織切片的顯著之處在于大部分的CA1亞區(qū)錐體神經(jīng)細(xì)胞具有不變的(E常的)著色圖案。在圖2c的對(duì)照組，箭頭所示的錐體層著色輕微而在CA1亞區(qū)內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的損害發(fā)生有限。圖2d表示錐體神經(jīng)細(xì)胞已發(fā)生了細(xì)胞凝結(jié)的變化并發(fā)生了特征化的顯著的神經(jīng)膠質(zhì)增生的損害。如圖2e和2f所示，以1,000mg/kg的劑量給予的黃芩根提取物的實(shí)驗(yàn)組的CA1亞區(qū)錐體神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)目顯著減少，因?yàn)檫@些細(xì)胞受到了不可逆的損害。在圖2a到2f中，其范圍為100.0μm長(zhǎng)。
在未發(fā)生缺血的模擬操作的大鼠上，在490μm長(zhǎng)的錐體層內(nèi)觀察正常海馬神經(jīng)細(xì)胞(圖2a和2b)。
如圖2c和2d所示在對(duì)照組中誘發(fā)細(xì)胞凋亡。其原理是一旦由某些外部和內(nèi)部刺激物誘發(fā)其細(xì)胞凋亡，則這些細(xì)胞收縮，喪失其固有的由其分化所形成的形狀。此外，細(xì)胞收縮阻斷了其與周?chē)?xì)胞的結(jié)合，從而阻礙了凋亡細(xì)胞對(duì)周?chē)?xì)胞的相互作用。在收縮進(jìn)行時(shí)形成凋亡體，而細(xì)胞膜似乎膨張成大皰。在誘發(fā)缺血之后給予生理鹽水的對(duì)照組的海馬CA1亞區(qū)，由圖2d的形態(tài)學(xué)變化測(cè)定發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生了凋亡。與圖2b的情況不同，圖2d所示的是凋亡組織，其有用細(xì)胞從周?chē)?xì)胞分離而該組織正在分解。此外，發(fā)生凋亡的神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞體失去了其特征性的錐體形態(tài)，形成某種單一細(xì)胞。如果這種凋亡進(jìn)一步進(jìn)行，則核染色質(zhì)會(huì)凝結(jié)同時(shí)核膜會(huì)破裂。如圖2e和2f顯見(jiàn)，作為對(duì)照，藥物治療組的海馬CA1亞區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)與正常細(xì)胞的形態(tài)類(lèi)似。這里由于很難將在CA1亞區(qū)周?chē)膲乃赖纳窠?jīng)細(xì)胞與正在生長(zhǎng)的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞區(qū)分，因而只計(jì)算了CA1亞區(qū)存活的錐體細(xì)胞。很容易觀察到這些細(xì)胞，因?yàn)槠浣】笛由斓暮酥荏w和其中心處的圓核顯然不同于周?chē)氖戎行粤＜?xì)胞。在圖2f中，觀察到游離的細(xì)胞伴隨著收縮的細(xì)胞體穿過(guò)海馬，它間接地表明這種損害大到足以誘發(fā)細(xì)胞凋亡。盡管有這些巨大的損害，但大量的細(xì)胞受到凋亡的防護(hù)，具有正常的錐體形態(tài)。此外，已發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞保持與先前一樣與鄰近細(xì)胞的結(jié)合。這些結(jié)果表明，黃芩根提取物可以保護(hù)海馬CA1亞區(qū)神經(jīng)細(xì)胞免受4-血管堵塞引起的損害。雖然還未認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的黃芩根提取物將神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞循環(huán)從凋亡途徑轉(zhuǎn)到細(xì)胞存活途徑，但在凋亡途徑的該階段，認(rèn)定黃芩根提取物在保護(hù)免于凋亡方面非常有用(圖2e和2f)。
3．黃芩根提取物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用為了測(cè)定該黃芩根提取物的神經(jīng)保護(hù)作用，在誘發(fā)大腦缺血以后的0和90分鐘進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。
圖3顯示了在體溫被控制到不低于37℃(圖1b)的大鼠上所見(jiàn)的神經(jīng)保護(hù)作用。在誘發(fā)缺血以后的0和90分鐘，以250mg/kg、500mg/kg和1,000mg/kg的劑量注射本發(fā)明的黃芩根提取物。對(duì)于對(duì)照組，采用2.0ml/kg體積的0.89％的生理鹽水。為了制作柱狀圖，所觀察到的正常存在于半球區(qū)域且各自大小為1×1mm的CA1錐體神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并求其平均。括號(hào)內(nèi)的數(shù)字代表所用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)目。該柱狀圖是在平均±標(biāo)準(zhǔn)偏差值的基礎(chǔ)上作出的。采用Student’st-檢驗(yàn)分析各組數(shù)據(jù)，其中每個(gè)受試組與對(duì)照組進(jìn)行比較(*p＜0.05)。
在注射生理鹽水的對(duì)照組中，測(cè)得存活細(xì)胞為47.8±3.1細(xì)胞/ml，它明顯低于模型組所測(cè)得的181±7.9細(xì)胞/mm的結(jié)果。另一方面，在這些受試組中發(fā)生了顯著的保護(hù)作用，當(dāng)注射1,000mg/kg劑量的黃芩根提取物時(shí)測(cè)得的存活細(xì)胞為84.4±14.7細(xì)胞/mm，而在注射500mg/kg劑量的黃芩根提取物時(shí)為78.8±11.2細(xì)胞/mm(p＜0.05)。但是，從該測(cè)定中認(rèn)識(shí)到250mg/kg的劑量并不帶來(lái)顯著的神經(jīng)保護(hù)作用，即61.4±14.8細(xì)胞/mm。神經(jīng)保護(hù)的有效劑量1,000mg/kg和500mg/kg分別比對(duì)照組多保護(hù)了27.4％和23.2％的神經(jīng)細(xì)胞。這兩種有效劑量之間的差別不顯著(表2，圖3)。
表2在進(jìn)行4-VO10分鐘后的7天黃芩根提取物對(duì)CA1亞區(qū)細(xì)胞的保護(hù)作用
a平均和SEM表示為存活細(xì)胞/mmb神經(jīng)保護(hù)比率
4．黃芩根的抗氧化作用以3×104/孔的數(shù)量接種PCl2，并在37℃下培養(yǎng)充足的時(shí)間以將其粘附到孔上。在培養(yǎng)12小時(shí)以后，用10.0μg/ml、20.0μg/ml、50.0μg/ml或100.0μg/ml濃度的黃芩根對(duì)這些粘附細(xì)胞預(yù)處理3小時(shí)，然后在新鮮的含有0.5mM的H2O2的培養(yǎng)基中在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)。還加入與預(yù)處理相同濃度的黃芩根提取物和該新鮮培養(yǎng)基。在培養(yǎng)24小時(shí)后，采用LDH和MTT測(cè)定分析該細(xì)胞。結(jié)果如圖4所示。與用10％DMSO/DPBS處理的對(duì)照組比較進(jìn)行Student’st-檢驗(yàn)。在圖4a中，采用平均±標(biāo)準(zhǔn)偏差值(n=6)表示MTT還原測(cè)定的結(jié)果。在柱狀圖4b中根據(jù)全部細(xì)胞溶解百分?jǐn)?shù)的平均±標(biāo)準(zhǔn)偏差值作出線條作為L(zhǎng)DH測(cè)定的結(jié)果(n=6)，*p＜0.05,**p＜0.01。
如果在用同等濃度的黃芩根提取物預(yù)處理3小時(shí)后在存在0.5mM H2O2和10.0、25.0、50.0和100.0μg/ml的黃芩根提取物的情況下使這些粘附細(xì)胞承受24小時(shí)的氧化壓力，則根據(jù)MTT測(cè)定(圖4a)發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞表現(xiàn)出高于對(duì)照組的113.9％(25.0μg/ml,p＜0.05)、111.1％(50.0μg/ml,p＜0.05)和113.7％(100.0μg/ml,p＜0.05)的抗氧化壓力。但是，通過(guò)LDH測(cè)定(圖4b)從用黃芩根處理的組上并沒(méi)有檢測(cè)到顯著的抗氧化作用。
如果只考慮一種藥物的功效，則黃芩根提取物由于以下原因而具有良好的神經(jīng)保護(hù)作用。在采用4-VO模型的神經(jīng)保護(hù)測(cè)試中所用的藥物主要被例舉為谷酸酸酯(鹽)受體拮抗劑、鈣離通道拮抗劑、GABA神經(jīng)遞質(zhì)促進(jìn)劑、NOS抑制劑和抗氧化劑。雖然它們的功效無(wú)法比較，因?yàn)槿狈ζ湓囼?yàn)數(shù)據(jù)，但是大部分這些藥物還提供了以下例舉的15-25％的防御水平如LY231617 25-30％、L-NAME23％,3-溴-7-硝基引唑20％、MK-801(2mg/kg,i.p.)24％、eliprodil(20mg/kg,i.p.)25％、NBQX(30mg/kg,i.p.)42％,7-NI 17.5％、GYK152466 11％和LY30016823％(O’Neill M.J.等人，Eur.J.Pharmacol.1996,310)。在考慮到由于大部分的草藥藥物是由各種草藥復(fù)合組成的，因而草藥藥物幾乎不具有副作用這一因素下，黃芩根提取物的重要性更顯突出。而且，如果與已知的其它草藥物數(shù)據(jù)相比，如16.8％(1,000mg/kg)和16.3％(500mg/kg)的大黃(Rhubarb)、17.8％(1,200mg/kg)和15.6％(600mg/kg)的天麻(Gastrodia edadta Bl)、13.7％(1,000mg/kg)的(Magnoliaobovata)和 18.4％(1,000mg/kg)與16.6％(500mg/kg)的大黃(rhubarb)、日本厚樸(Magnolia obovata)、枸桔(Poncirus trifoliate Rafim)果、加拿大飛蓬(Erigeron CanadensisL.)，本發(fā)明的黃芩根提取物具有顯著的高抗氧化活性。
結(jié)論觀察該黃芩根提取物對(duì)由4-血管堵塞引起的大鼠的大腦缺血的神經(jīng)保護(hù)作用可以得出以下的結(jié)論。
1．注射250mg/kg劑量的黃芩根提取物并不發(fā)生體溫下降，而注射1,000mg/kg或500mg/kg則會(huì)在誘發(fā)大腦缺血的1小時(shí)后開(kāi)始降低體溫，并將低溫至多保持到誘發(fā)大腦缺血之后6小時(shí)。
2．在誘發(fā)大腦缺血后控制體溫的情況下，1,000mg/kg和500mg/kg注射劑量的黃芩根提取物保護(hù)誘發(fā)大腦缺血的大鼠神經(jīng)細(xì)胞受損，其有效率比未注射黃芩根提取物相比高27.4％和23.2％。
3．研究該黃芩根提取物的神經(jīng)保護(hù)作用是否與抗氧化作用有關(guān)。在同等濃度的提取物預(yù)處理以后，在10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml濃度的黃芩根提取物存在下使細(xì)胞承受0.5mM H2O2的氧化壓力24小時(shí)，如MTT測(cè)定所測(cè)得的，在25μg/ml-、50μg/ml-和100μg/ml-治療組上獲得顯著的抗H2O2細(xì)胞損害的保護(hù)作用。此外，10μg/ml和100μg/ml濃度的黃芩根提取物表現(xiàn)出抗NO產(chǎn)量的抑制活性。
4．該黃芩根以10μg/ml到100μg/ml之間的取決于劑量的模式抑制了在BV 2細(xì)胞中TNF-α的產(chǎn)生。
因此，已觀察到該黃芩根提取物通過(guò)表現(xiàn)出對(duì)由于4-血管堵塞引起的前腦缺血所致的神經(jīng)細(xì)胞損害的保護(hù)活性以及對(duì)TNF-α產(chǎn)生的抑制和抗氧化活性，而能夠抵抗神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。由于具有這些活性，可以將該黃芩根提取物用為神經(jīng)保護(hù)劑。
實(shí)施例3急性毒性試驗(yàn)1．口服將ICR譜系的小鼠(25±5周齡)分成4組，每組10只，分別口服500、725、1,000和5,000mg/kg劑量的黃芩根提取物。對(duì)四組10-成員的Sprague Dawley血統(tǒng)小鼠進(jìn)行同樣的口服。在口服4周后，任何組都沒(méi)有小鼠死亡。此外，給藥組和對(duì)照組之間的外觀沒(méi)有差別。
2．腹膜給藥將ICR譜系的小鼠(25±5周齡)分成4組，每組10只，分別腹膜內(nèi)注射25、250、500和725mg/kg劑量的黃芩根提取物。對(duì)四組10-成員的Sprague Dawley譜系小鼠進(jìn)行同樣的腹膜內(nèi)注射。在腹膜內(nèi)注射后的4周期間，各組都沒(méi)有小鼠死亡。此外，給藥組和對(duì)照組之間的外表沒(méi)有差別。
從上述的結(jié)果可以得出的結(jié)論是本發(fā)明的黃芩根提取物不具有急性毒性。
因此，可以將本發(fā)明的黃芩根提取物制成適用于預(yù)防和治療神經(jīng)系統(tǒng)異常的藥學(xué)制劑。在這方面，可以將該提取物與藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體一起制備，并且可以是任何劑型如注射劑、液劑、糖漿、丸劑、膠囊等。
根據(jù)患者的性別、年齡、體重和疾病的嚴(yán)重性，可以以10mg-5,000mg的日劑量以一到三次分服的方式口服本發(fā)明的黃芩根提取物。
以下的制備實(shí)施例進(jìn)一步將本發(fā)明具體化制備實(shí)施例1黃芩根提取物100mg甲基亞硫酸氫鈉 3.0mg羥苯甲酸甲酯0.8mg羥苯甲酸丙酯0.1mg注射用無(wú)菌水至2ml將這些成分混合，同時(shí)將無(wú)菌水加至2ml的體積，并將該溶液裝到2ml的安瓿中得到注射溶液。
制備實(shí)施例2黃芩根提取物200mg乳糖100mg淀粉100mg硬脂酸鎂 適量將這些成分混合并制成片劑。
制備實(shí)施例3黃芩根提取物100mg乳糖 50mg淀粉 50mg
滑石2mg硬脂酸鎂 適量將這些成分以普通方式混合并裝于凝膠膠囊中。
制備實(shí)施例4黃芩根提取物 1,00mg糖 20g異構(gòu)化糖20g檸檬調(diào)味劑 適量無(wú)菌水 至100ml將這些成分以普通方式混合，裝于100ml的棕色瓶中，并消毒得到液體藥物。
上述實(shí)施例所得的數(shù)據(jù)結(jié)合表明本發(fā)明的黃芩根提取物及其藥學(xué)制劑表現(xiàn)出不具有毒性的神經(jīng)保護(hù)活性，因此它們適用于預(yù)防和治療腦疾病，如中風(fēng)、帕金森氏癥和老年性癡呆。
已經(jīng)以例舉的方式詳述了本發(fā)明，但應(yīng)理解所用術(shù)語(yǔ)意圖為說(shuō)明而不是限定的性質(zhì)。根據(jù)上述教導(dǎo)本發(fā)明可以有多種改進(jìn)和變型。但是，應(yīng)理解為在所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)，除非有特殊描述，其他方面均可實(shí)施。
權(quán)利要求
1．一種具有神經(jīng)保護(hù)活性的黃芩根提取物，由以下方法制得在提取劑中浸泡黃芩根，所說(shuō)的提取劑選自水、低級(jí)醇及其混合物；濃縮該提取劑并凍干該濃縮物。
2．一種具有神經(jīng)保護(hù)活性的藥學(xué)制劑，包括與藥學(xué)上可接受基質(zhì)結(jié)合的藥學(xué)有效成分黃芩根提取物，該黃芩根提取物由以下方法制得在選自水、低級(jí)醇及其混合物的提取劑中浸泡黃芩根；濃縮該提取劑并凍干該濃縮物。
3．如權(quán)利要求2所述的藥學(xué)制劑，該制劑用于預(yù)防和治療腦疾病。
4．如權(quán)利要求2所述的藥學(xué)制劑，其中該腦疾病包括中風(fēng)、帕金森氏癥和老年性癡呆。
全文摘要
公開(kāi)了一種黃芩根提取物和包括作為藥學(xué)有效成分的該提取物的藥學(xué)制劑。該黃芩根提取物具有重要的神經(jīng)保護(hù)活性,但不具有毒性,它適用于預(yù)防和治療腦疾病,如中風(fēng)、帕金森氏癥和老年性癡呆。
文檔編號(hào)A61K36/185GK1314180SQ0111084
公開(kāi)日2001年9月26日 申請(qǐng)日期2001年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月10日
發(fā)明者金頀哲, 安德均, 金善礖, 石庚浩, 金榮玉, 林康鉉 申請(qǐng)人:Sk株式會(huì)社, 金頀哲