專利名稱：使Akt癌基因失活并活化p38前細(xì)胞凋亡基因的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是根據(jù)國(guó)家健康研究院RO1-CA58880號(hào)和乳腺癌研究計(jì)劃ROI-CA77858號(hào)提出的，因此政府享有本發(fā)明的權(quán)利。
本發(fā)明普遍地涉及分子生物學(xué)、腫瘤學(xué)和基因治療領(lǐng)域。更具體來(lái)說(shuō)，它涉及基于E1A基因的癌癥治療方法的建立，該方法針對(duì)Akt癌基因和/或p38前細(xì)胞凋亡基因。本發(fā)明提供了包括磷酸化Akt表達(dá)的癌癥和/或下調(diào)磷酸化p38的基因治療方法。
癌癥已成為西方國(guó)家中主要的死因之一，僅次于心臟病而排在第二。目前的估計(jì)預(yù)期在美國(guó)三個(gè)人中就有一個(gè)會(huì)罹患癌癥，每五人中有一個(gè)會(huì)死于癌癥。所有癌癥都有重大問(wèn)題尚待解決，這就使得揭示導(dǎo)致癌癥的不同分子過(guò)程成為必要。
癌癥是使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌變細(xì)胞的多步驟分子過(guò)程的結(jié)果。在兩個(gè)DNA腫瘤病毒、腺病毒和多瘤病毒中所做的研究提供了支持這一假說(shuō)的分子模型。在腺病毒的例子中發(fā)現(xiàn)初級(jí)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化需要早期區(qū)1A(E1A)和1B(E1B)基因的表達(dá)(Houweling等，1980)。其中，E1A基因產(chǎn)物與SV40中等T抗原或者活化的H-ras基因共同作用使初級(jí)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化(Ruley，1985)。
在過(guò)去10年間，許多人類惡性腫瘤被發(fā)現(xiàn)與人基因組中的癌基因的存在和表達(dá)有關(guān)。腫瘤發(fā)生牽扯到20種以上的不同癌基因，并且這些癌基因被認(rèn)為在人類癌癥中起著直接的作用(Weinberg，1985)。這些癌基因中有許多是從被稱為“原癌基因”的正常細(xì)胞相應(yīng)成分經(jīng)進(jìn)化發(fā)展而來(lái)的，這導(dǎo)致基因表達(dá)或者基因產(chǎn)物活性的改變。有許多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)將原癌基因與細(xì)胞生長(zhǎng)聯(lián)系在一起，其包括它們?cè)谂咛グl(fā)育中的表達(dá)(Muller等，1982)，以及對(duì)增殖信號(hào)的應(yīng)答(Campisi等，1983)。而且，許多原癌基因與生長(zhǎng)因子或生長(zhǎng)因子受體有關(guān)。這些觀察報(bào)告暗示在轉(zhuǎn)化過(guò)程中涉及到多種功能，不同癌基因在細(xì)胞水平上可能表現(xiàn)出類似的功能。
腺病毒E1A基因編碼具有許多有趣特性的幾個(gè)相關(guān)蛋白質(zhì)。E1A不僅在轉(zhuǎn)化中輔助第二個(gè)癌基因(H-ras)，而且另外一個(gè)密切相關(guān)的功能使得E1A能將初級(jí)細(xì)胞永生化(Ruley，1985)。例如，向初級(jí)細(xì)胞中導(dǎo)入E1A基因產(chǎn)物顯示能使這些細(xì)胞在有血清的情況下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)具有無(wú)限增殖能力。E1A的另一個(gè)有趣的功能模式是“反式激活”，其中E1A基因產(chǎn)物能刺激由多種病毒和細(xì)胞啟動(dòng)子(包括腺病毒早期和主要晚期啟動(dòng)子)起始的轉(zhuǎn)錄。但是，反式激活不是所有啟動(dòng)子的通常情況。在某些情況中，E1A導(dǎo)致與增強(qiáng)子元件相連的細(xì)胞啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄下降(Haley等，1984)。已經(jīng)證實(shí)外源加入的E1A基因通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)NM23基因(它與低轉(zhuǎn)移潛力相關(guān))可以減少ras-轉(zhuǎn)化的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛力(Pozzatti等，1988；Wallich等，1985)。
另一個(gè)病毒癌蛋白，SV40大抗原(LT)與E1A和c-myc有結(jié)構(gòu)和功能上的同源性(Figge等，1988)。LT、E1A和c-myc的轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)域具有氨基酸序列同源性和類似的二級(jí)結(jié)構(gòu)(Figge等，1988)。這三個(gè)蛋白質(zhì)與腫瘤抑制子成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因產(chǎn)物(Rb)形成復(fù)合體(Whyte等，1988，DeCapric等，1988，Rustgi等，1991)，并且LT和E1A的Rb結(jié)合結(jié)構(gòu)域與它們的轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)域相符?；谶@一類似性，可以相信LT和E1A是通過(guò)結(jié)合細(xì)胞Rb，消除其腫瘤抑制功能從而使細(xì)胞轉(zhuǎn)化。利用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞通過(guò)癌基因協(xié)作檢測(cè)法確定將LT、E1A和c-myc也被分組到永生化癌基因中(參見(jiàn)Weinberg，1985)。
盡管在鑒定造成惡性腫瘤發(fā)展的某些成分中取得了進(jìn)展，很顯然現(xiàn)有技術(shù)中缺乏抑制癌癥發(fā)生的有效手段。Hung及其合作者的工作確定了E1A基因事實(shí)上能抑制多種癌癥中的轉(zhuǎn)化、腫瘤發(fā)生和細(xì)胞凋亡(參見(jiàn)，例如Yu等，1991、1992和1993；以及Hung等的綜述，1995，Yu和Hung，1995，和Mymryk，1996)。此外，Hung及其合作者在抑制癌基因轉(zhuǎn)化中取得了進(jìn)展。某些進(jìn)展，特別是在癌基因(被不同地稱為c-erbB-2、HER-2或neu(文中指neu癌基因)過(guò)表達(dá)介導(dǎo)的腫瘤病例中取得的進(jìn)展，在美國(guó)專利5,814,315、5,651,964、5,641,484和5,643,567中有描述(每個(gè)全文引入此處作為參考文獻(xiàn))。同樣由Hung及其合作者提出的美國(guó)專利6,197,794(此處引入作為參考文獻(xiàn))描述了小E1A基因的構(gòu)建，所述基因只包含E1A基因中抗癌作用所需要的區(qū)域，從而提供了抗癌療法。此外，在授予Frisch的美國(guó)專利5,776,743中描述了通過(guò)導(dǎo)入E1A基因使腫瘤細(xì)胞對(duì)化學(xué)和輻射療法敏感。
這些專利明確了E1A作為腫瘤抑制被基因的功能，并進(jìn)一步暗示E1A是治療多種人類癌癥的潛在治療劑。的確，利用E1A作為腫瘤抑制基因在人癌癥的動(dòng)物模型中取得的成功有益于I期人臨床實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展，目前是由位于西雅圖的Virginia Mason Medical Center的Targeted Genetics Corporation、休斯頓的M.D.Anderson Cancer Center、底特律的Wayne State University和芝加哥的Rush Presbyterian St.Luke′s Medical Center贊助的。此外，Targeted Genetics的歐洲伙伴-Groupe Fournier已經(jīng)接到衛(wèi)生部的批準(zhǔn)，開(kāi)始在法國(guó)作相應(yīng)的臨床實(shí)驗(yàn)。
盡管有這些進(jìn)展，還有幾種癌癥涉及到其他癌基因和信號(hào)分子，它們還沒(méi)有被從治療的角度充分地討論。例如，有一類癌癥中Akt癌基因過(guò)表達(dá)。Akt(又稱為PKBγ和RAC-PKγ)是絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT/PKB家族的成員，首次分離自小鼠腦cDNA，主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和睪丸中表達(dá)(Konishi等，1995)。
Akt與AKT/PKB家族的其他成員一樣，位于未活化細(xì)胞的細(xì)胞液中，并在被幾種配體(包括分裂素和生存因子)刺激后轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上(Meier等，1997)。該活化過(guò)程要經(jīng)過(guò)對(duì)渥曼青霉素敏感的PI3激酶(Franke等，1997)。Akt結(jié)合到PI3激酶的脂產(chǎn)物上，借助蛋白內(nèi)的普列克底物蛋白同源結(jié)構(gòu)域(PH)通過(guò)引導(dǎo)Akt轉(zhuǎn)位到膜上使它呈遞給其上游激活子。Akt的磷酸化是其活化所必需的，并且已確定造成該活化的激酶是PDK1(Cohen等，1997)。一旦定位到膜上，Akt能介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的幾種功能，包括胰島素的代謝效應(yīng)(Walker等，1998)。Akt活化(例如，增強(qiáng)的磷酸化Akt表達(dá))的癌癥很難治療，并且包括了卵巢、乳腺、前列腺、腦、結(jié)腸癌和其他癌癥。
另一組現(xiàn)有技術(shù)基本上沒(méi)有研究的癌癥是那些其中的前細(xì)胞凋亡因子p38被下調(diào)的癌癥。絲氨酸-蘇氨酸激酶蛋白p38也是一種分裂素激活性蛋白激酶(MAPK)。p38的磷酸化是其活化所必需的。還知道p38是一種細(xì)胞因子抑制性抗炎藥物結(jié)合蛋白(CSBP)和RK。開(kāi)始p38分離自轉(zhuǎn)染了脂多糖(LPS)受體CD14并用LPS進(jìn)行誘導(dǎo)的鼠科前B細(xì)胞。從那時(shí)起已對(duì)p38以及人和鼠中編碼它的cDNA進(jìn)行了分離和測(cè)序。
已經(jīng)確定p38是與造成DNA損傷的事件有關(guān)的早期脅迫反應(yīng)的MAPK。在被脅迫，比如脂多糖(LPS)、UV、茴香霉素或者滲透壓休克處理時(shí)，以及細(xì)胞因子(比如IL-1和TNF)刺激的細(xì)胞中曾觀察到p38的活化。
已經(jīng)證實(shí)p38 MAPK是p53應(yīng)答UV輻射和某些抗癌藥物的顯著激活子。p38與p53在關(guān)鍵絲氨酸殘基上物理結(jié)合并使后者磷酸化。這與p53介導(dǎo)的最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的轉(zhuǎn)錄級(jí)聯(lián)有關(guān)。因此，p38是一種前細(xì)胞凋亡因子，它能導(dǎo)致DNA損傷的細(xì)胞發(fā)生凋亡。
雖然E1A的作用在導(dǎo)致某些類型癌癥(比如neu-介導(dǎo)的癌癥)中的分子途徑已有描述，仍需要系統(tǒng)地研究和鑒定由E1A調(diào)控的其他基因和蛋白，它們可能參與其他類型癌癥的發(fā)生和發(fā)展。Hung的專利或者Frisch的專利都沒(méi)有概括出Akt和/或p38在各種癌癥中的作用，而且沒(méi)有論及指向這些癌癥的特殊療法。因此，對(duì)于與Akt癌基因活化(例如，增強(qiáng)的磷酸化Akt表達(dá))相關(guān)的癌癥，或者涉及到p38失活(例如磷酸化p38下調(diào))的癌癥，或者有這兩種情況的癌癥仍沒(méi)有特別成功的抑制方法。因此，需要治療這些類型的癌癥的方法。
本發(fā)明提供了基于E1A的癌癥基因療法，所述癌癥或者是癌基因Akt的磷酸化水平上調(diào)，或者前細(xì)胞凋亡基因產(chǎn)物p38的磷酸化水平下調(diào)，或者具有這兩種情況。這類癌癥的例子，包括但不限于，乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、卵巢癌、結(jié)腸直腸癌、大細(xì)胞淋巴瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤等。
本發(fā)明人首次闡述通過(guò)E1A基因產(chǎn)物來(lái)調(diào)整以上靶物質(zhì)，E1A基因產(chǎn)物在此以E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸為例。
因此，本發(fā)明提供了使細(xì)胞內(nèi)的Akt失活的方法，包括使細(xì)胞與E1A蛋白、肽或多肽接觸。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是過(guò)表達(dá)活化Akt的細(xì)胞?；罨疉kt是Akt癌基因的磷酸化形式。在另一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是癌細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是乳腺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、腦癌細(xì)胞或直腸癌細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞在體外。再其他的實(shí)施方案中，所述癌細(xì)胞包含在腫瘤中。還有另外一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞包含在動(dòng)物中。特殊方面中該動(dòng)物是人。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法定為癌癥治療方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法定為預(yù)防癌癥的方法。在某些方面中，所述細(xì)胞的轉(zhuǎn)化被抑制。在另一些方面中，所述細(xì)胞的生長(zhǎng)被抑制。所述細(xì)胞的生長(zhǎng)可以是轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)。
在所述方法的其他實(shí)施方案中，所述細(xì)胞進(jìn)一步具有p38失活的特征?；罨膒38包括磷酸化形式的p38前細(xì)胞凋亡蛋白。因此，失活的p38對(duì)應(yīng)p38的非磷酸化形式。在所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，與E1A蛋白、肽或者多肽進(jìn)行接觸導(dǎo)致p38活化。
在所述方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，用E1A蛋白、肽或者多肽與細(xì)胞進(jìn)行接觸包括提供編碼E1A蛋白、肽或者多肽的核酸以及表達(dá)E1A蛋白、肽或者多肽。E1A蛋白、肽或者多肽的表達(dá)發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)。
在某些方面，E1A蛋白、肽或者多肽由一個(gè)核酸載體編碼。在特殊方面，所述載體是病毒載體，可以是腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或者慢病毒載體。
在其他特殊方面，E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸包含在脂質(zhì)體中。
所述脂質(zhì)體可以包含任何脂類化合物，但是在一個(gè)具體實(shí)施方案中，脂質(zhì)體包含DOTMA、DOPE或者DC-Chol。在具體實(shí)施方案中，脂質(zhì)體包含DC-Chol。在另一些具體實(shí)施方案中，脂質(zhì)體包含DC-Chol和DOPE。
在某些方面，所述接觸包括將E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸給藥于動(dòng)物。在這些方面中，可將E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸局部給藥。例如，可以通過(guò)直接腫瘤內(nèi)注射或者注射到腫瘤脈管系統(tǒng)來(lái)給予E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸。
可選擇地，可以系統(tǒng)地給予E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸。例如，可以靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)給予E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸。
本發(fā)明人還預(yù)見(jiàn)了與本發(fā)明聯(lián)合應(yīng)用的癌癥療法。因此，在某些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括使細(xì)胞與化療劑接觸。所述化療劑可以是gemcitabine、novelbine、taxtere、紫杉酚、順鉑、阿霉素、VP16、TNF、大黃素、柔紅霉素、更生霉素、米托蒽醌、甲基芐肼、絲裂霉素、碳鉑、博來(lái)霉素、依托泊苷、替尼泊苷、氮芥、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、抗瘤氨酸、苯丁酸氮芥、異環(huán)磷酰胺、抗瘤氨酸、六甲密胺、thiopeta、白消安、卡氮芥、羅氮芥、司莫司汀、鏈唑霉素、氮烯米胺、羥基柔紅霉素、5-氟尿嘧啶(5FU)、喜樹(shù)堿、放線菌素-D、過(guò)氧化氫、亞硝基脲、普卡霉素(plicomycin)、他莫昔芬、反鉑、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、TRAIL或甲氨蝶呤。
E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸與化療劑可以同時(shí)給藥或者，可以不同時(shí)間給藥。例如，可以在給予化療劑之前或之后給予E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸。
本發(fā)明還提供了活化細(xì)胞中的p38的方法，包括使E1A蛋白、肽或多肽與細(xì)胞接觸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是活化p38表達(dá)不足的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是癌細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，癌細(xì)胞是乳腺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞或者結(jié)腸癌細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞在體外。再一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌細(xì)胞包含于腫瘤中。還有的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞包含在動(dòng)物內(nèi)。特殊方面中，所述動(dòng)物是人。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法定為癌癥治療方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法定為預(yù)防癌癥的方法。在某些方面中，所述細(xì)胞的轉(zhuǎn)化被抑制。在另一些方面中，所述細(xì)胞的生長(zhǎng)被抑制。所述細(xì)胞生長(zhǎng)可以是轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)。
在其他實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步定為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法。
在一個(gè)方面，細(xì)胞進(jìn)一步具有Akt活化的特征。在這些方面中，與E1A蛋白、肽或者多肽進(jìn)行接觸導(dǎo)致Akt失活。
在所述方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，用E1A蛋白、肽或者多肽與細(xì)胞接觸包括提供編碼E1A蛋白、肽或者多肽的核酸以及表達(dá)E1A蛋白、肽或者多肽。E1A蛋白、肽或者多肽的表達(dá)發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)。
在某些方面，E1A蛋白、肽或者多肽由一個(gè)核酸載體編碼。在特殊方面，所述載體是病毒載體，可以是腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或者慢病毒載體。
在其他特殊方面，E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸包含在脂質(zhì)體中。
所述脂質(zhì)體可以包含任何脂類化合物，但是在一個(gè)具體實(shí)施方案中，脂質(zhì)體包含DOTMA、DOPE或者DC-Chol。在具體實(shí)施方案中，脂質(zhì)體包含DC-Chol。在另一些具體實(shí)施方案中，脂質(zhì)體包含DC-ChoI和DOPE。
在某些方面，所述接觸包括將E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸給藥于動(dòng)物。在這些方面中，可以將E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸局部給藥。例如，可以通過(guò)直接腫瘤內(nèi)注射或者注射到腫瘤脈管系統(tǒng)來(lái)給予E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸。
可選擇地，可以系統(tǒng)地給予E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸。例如，可以靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)給予E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸。
本發(fā)明人還預(yù)見(jiàn)了與本發(fā)明聯(lián)合應(yīng)用的癌癥療法。因此，在某些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括使細(xì)胞與化療劑接觸。所述化療劑可以是gemcitabine、novelbine、taxtere、紫杉酚、順鉑、阿霉素、VP16、TNF、大黃素、柔紅霉素、更生霉素、米托蒽醌、甲基芐肼、絲裂霉素、碳鉑、博來(lái)霉素、依托泊苷、替尼泊苷、氮芥、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、抗瘤氨酸、苯丁酸氮芥、異環(huán)磷酰胺、抗瘤氨酸、六甲密胺、thiopeta、白消安、卡氮芥、羅氮芥、司莫司汀、鏈唑霉素、氮烯米胺、羥基柔紅霉素、5-氟尿嘧啶(5FU)、喜樹(shù)堿、放線菌素-D、過(guò)氧化氫、亞硝基脲、普卡霉素(plicomycin)、他莫昔芬、反鉑、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、TRAIL或甲氨蝶呤。
E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸與化療劑可以同時(shí)給藥或者，可以不同時(shí)間給藥。例如，可以在給予化療劑之前或之后給予E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸。
本發(fā)明還提供了在細(xì)胞內(nèi)下調(diào)磷酸化Akt表達(dá)和上調(diào)磷酸化p38表達(dá)的方法，其包括使E1A蛋白、肽或多肽與細(xì)胞接觸。
在具體實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是癌細(xì)胞，可以是乳腺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、睪丸癌細(xì)胞、腦癌細(xì)胞、淋巴癌細(xì)胞、皮膚癌細(xì)胞、腦癌細(xì)胞、骨癌細(xì)胞、直腸癌細(xì)胞或者血癌細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞在體外。再一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌細(xì)胞包含于腫瘤。還有的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞包含在動(dòng)物內(nèi)。特殊方面中，所述動(dòng)物是人。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法定為癌癥治療方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法定為預(yù)防癌癥的方法。在某些方面中，所述細(xì)胞的轉(zhuǎn)化被抑制。在另一些方面中，所述細(xì)胞的生長(zhǎng)被抑制。所述細(xì)胞生長(zhǎng)可以是轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)。
在其他實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步定為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法。
在所述方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，用E1A蛋白、肽或者多肽與細(xì)胞接觸包括提供編碼E1A蛋白、肽或者多肽的核酸以及表達(dá)E1A蛋白、肽或者多肽。E1A蛋白、肽或者多肽的表達(dá)發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)。
在某些方面，E1A蛋白、肽或者多肽由一個(gè)核酸載體編碼。在特殊方面，所述載體是病毒載體，可以是腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或者慢病毒載體。
在其他特殊方面，E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸包含在脂質(zhì)體中。
所述脂質(zhì)體可以包含任何脂類化合物，但是在一個(gè)具體實(shí)施方案中，脂質(zhì)體包含DOTMA、DOPE或者DC-Chol。在具體實(shí)施方案中，脂質(zhì)體包含DC-Chol。在另一些具體實(shí)施方案中，脂質(zhì)體包含DC-ChoI和DOPE。
在某些方面，所述接觸包括將E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸給藥于動(dòng)物。在這些方面中，可以E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸局部給藥。例如，可以通過(guò)直接腫瘤內(nèi)注射或者注射到腫瘤脈管系統(tǒng)來(lái)給予E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸。
可選擇地，可以系統(tǒng)地給予E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸。例如，可以靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)給予E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸。
本發(fā)明人還預(yù)見(jiàn)了與本發(fā)明聯(lián)合應(yīng)用的癌癥療法。因此，在某些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括使細(xì)胞與化療劑接觸。所述化療劑可以是gemcitabine、novelbine、taxtere、紫杉酚、順鉑、阿霉素、VP16、TNF、大黃素、柔紅霉素、更生霉素、米托蒽醌、甲基芐肼、絲裂霉素、碳鉑、博來(lái)霉素、依托泊苷、替尼泊苷、氮芥、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、抗瘤氨酸、苯丁酸氮芥、異環(huán)磷酰胺、抗瘤氨酸、六甲密胺、thiopeta、白消安、卡氮芥、羅氮芥、司莫司汀、鏈唑霉素、氮烯米胺、羥基柔紅霉素、5-氟尿嘧啶(5FU)、喜樹(shù)堿、放線菌素-D、過(guò)氧化氫、亞硝基脲、普卡霉素(plicomycin)、他莫昔芬、反鉑、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、TRAIL或甲氨蝶呤。
所述E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸與化療劑可以同時(shí)給藥或者，可以不同時(shí)間給藥。例如，可以在給予化療劑之前或之后給予E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸。
本發(fā)明還提供了細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法，包括使E1A蛋白、肽或多肽與細(xì)胞接觸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是p38表達(dá)不足的細(xì)胞。細(xì)胞還可以包括癌細(xì)胞。在這些方面，癌細(xì)胞可以包含于腫瘤中。還有的實(shí)施方案中，細(xì)胞包含于動(dòng)物中。特殊方面中，所述動(dòng)物是人。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用E1A蛋白、肽或者多肽與細(xì)胞接觸包括提供編碼E1A蛋白、肽或者多肽的核酸以及表達(dá)E1A蛋白、肽或者多肽。特殊方面中，E1A蛋白、肽或者多肽的表達(dá)發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)。
一個(gè)方面中，E1A蛋白、肽或者多肽由一個(gè)核酸載體編碼。其他實(shí)施方案中，E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸包含于脂質(zhì)體。在該方法的其他實(shí)施方案中，所述接觸包括將E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸給予動(dòng)物。
根據(jù)專利法的慣例，在本說(shuō)明書(shū)，包括權(quán)利要求書(shū)中，詞語(yǔ)“一個(gè)”與“包含”一起使用時(shí)意味著“一或多個(gè)”。
以下各圖構(gòu)成本說(shuō)明書(shū)的一部分，包含在此用來(lái)進(jìn)一步闡述本發(fā)明的某些方面。參照這些附圖中的一或多個(gè)，并結(jié)合文中具體實(shí)施方案的詳細(xì)說(shuō)明可以更好地理解本發(fā)明。


圖1A和圖1B乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞中，E1A下調(diào)Akt的磷酸化，上調(diào)p38的磷酸化。
圖2E1A抑制MDA-MB-231細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞中胰島素誘導(dǎo)的Akt磷酸化。
圖3A、圖3B、圖3C和圖3DAkt和p38沒(méi)有直接結(jié)合，但相互調(diào)節(jié)。
圖4E1A體外抑制細(xì)胞生長(zhǎng)需要Akt的失活或p38的活化。
圖5A和圖5BE1A抑制Akt活化的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞在軟瓊脂中的錨依賴性和錨獨(dú)立性細(xì)胞生長(zhǎng)。
圖6E1A抑制Akt活化乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的體內(nèi)腫瘤發(fā)生。
鑒定導(dǎo)致癌癥病理的關(guān)鍵基因和過(guò)程能給癌癥治療提供新的和特異性的治療方法。雖然已經(jīng)知道一些導(dǎo)致其抗癌作用的E1A功能的機(jī)理，例如在神經(jīng)膜(neu)介導(dǎo)的癌癥中，仍需要去鑒定由E1A調(diào)控的其他分子成分。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)E1A基因的表達(dá)能下調(diào)癌基因Akt，其參與促進(jìn)細(xì)胞存活，并已知它在幾種癌癥中是過(guò)表達(dá)的。此外，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)E1A的表達(dá)上調(diào)另一個(gè)蛋白質(zhì)p38，其是一個(gè)細(xì)胞死亡啟動(dòng)子，同樣已經(jīng)知道它在幾種人癌癥中被下調(diào)。因此，本發(fā)明提供了基于E1A的癌癥治療方法，所述癌癥包括Akt被上調(diào)或者p38被下調(diào)或者具有兩種情況的癌癥。這樣的癌癥可以，但不限于，乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、胰腺癌、腦癌和直腸癌為例。
Akt蛋白和p38蛋白的活性形式均包含其蛋白的磷酸化形式。使用抗Akt的磷特異性抗體，本發(fā)明人闡明了，在轉(zhuǎn)染了表達(dá)E1A的構(gòu)建體的乳腺癌細(xì)胞中磷酸化Akt(活化Akt)的水平下降。E1A表達(dá)構(gòu)建體在此定為編碼并表達(dá)E1A蛋白、肽或多肽的核酸。另外，抗p38的磷特異性抗體顯示，轉(zhuǎn)染了E1A表達(dá)構(gòu)建體的乳腺癌細(xì)胞中磷酸化p38(活化p38)的水平顯著增加。這些體外結(jié)果進(jìn)一步被體內(nèi)研究證實(shí)，所述研究使用Akt活性增強(qiáng)和/或p38活性減弱或者具有兩種情況的直生鼠乳腺癌模型。用E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸進(jìn)行治療能降低活化Akt(癌基因)的水平并提高活化p38(前細(xì)胞凋亡蛋白)的水平，從而能抑制裸鼠中的誘導(dǎo)性腫瘤發(fā)生。
本發(fā)明人還進(jìn)行了幾項(xiàng)實(shí)驗(yàn)來(lái)研究Akt和/或p38的作用機(jī)理。例如，利用合成化合物SB203580阻斷p38的活性，提高了E1A穩(wěn)定表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞中的Akt活性。相反，當(dāng)利用渥曼青霉素阻斷Akt的活性時(shí)，p38的活性增強(qiáng)。因此，Akt和p38是反向調(diào)節(jié)的。在利用遺傳學(xué)阻斷p38或Akt活性的實(shí)驗(yàn)中也見(jiàn)到了類似的結(jié)果。
E1A對(duì)涉及Akt和/或p38的癌癥的化學(xué)敏感性的影響也被實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示除了下調(diào)Akt和上調(diào)p38的活性，E1A還能夠介導(dǎo)對(duì)化療劑(比如紫杉酚)的敏感性。E1A的這些作用是其目前已眾所周知的下調(diào)神經(jīng)膜(neu)癌基因的能力之外的再一發(fā)現(xiàn)。這些實(shí)驗(yàn)是在穩(wěn)定的人癌細(xì)胞系中進(jìn)行的，這些細(xì)胞系在低的神經(jīng)膜(neu)本底水平下，高水平表達(dá)野生型E1A蛋白。使用直生鼠癌癥模型的體內(nèi)研究也證實(shí)了體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即與對(duì)照相比，導(dǎo)入E1A能明顯地提高癌細(xì)胞對(duì)紫杉酚細(xì)胞毒性的敏感性；顯著增強(qiáng)腫瘤衰退；以及延長(zhǎng)鼠的存活。
此外，利用化學(xué)抑制劑，比如SB203589，或者遺傳學(xué)手段，比如使用誘導(dǎo)性顯性陰性p38突變體，來(lái)阻斷p38的活性，并且導(dǎo)入組成性活化Akt能夠部分地消除E1A使細(xì)胞對(duì)紫杉酚介導(dǎo)的細(xì)胞毒性敏感的能力。而且，導(dǎo)入p38或阻斷癌細(xì)胞中的Akt活性也能增強(qiáng)對(duì)紫杉酚誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性。盡管通過(guò)免疫沉淀沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Akt和p38之間的直接結(jié)合，但觀察到了這兩個(gè)途徑之間的交叉調(diào)節(jié)。因此，本發(fā)明人已證實(shí)，通過(guò)在乳腺癌細(xì)胞中下調(diào)Akt和上調(diào)p38活性來(lái)調(diào)整細(xì)胞凋亡的閾值，可以實(shí)現(xiàn)E1A介導(dǎo)的化學(xué)敏感性。這些結(jié)果提供了一種有力的人類癌癥的輔助化療策略，它包括通過(guò)將E1A基因治療與化療聯(lián)合使用，使Akt下調(diào)和/或p38上調(diào)。
因此，本發(fā)明提供了基于腺病毒5型E1A的基因療法，用于與Akt活化或p38失活有關(guān)的腫瘤/癌癥患者。
A.E1A蛋白、肽和多肽本發(fā)明通過(guò)提供一或多種E1A基因產(chǎn)物給那些Akt活性/表達(dá)增強(qiáng)或者p38活性/表達(dá)下降或者有兩種情況的癌癥患者提供了一種基因療法，其中的基因產(chǎn)物在此定為腺病毒E1A蛋白、肽或多肽或者編碼該E1A蛋白、肽或多肽的核酸。預(yù)計(jì)可用于本發(fā)明的E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸，可以編碼多種蛋白質(zhì)。這里的論述描述了許多具體的E1A基因產(chǎn)物，它們可以用于本發(fā)明述及的療法。
一般來(lái)說(shuō)，最方便的是直接簡(jiǎn)單地使用野生型E1A基因。但是，預(yù)計(jì)專門(mén)使用E1A基因的特定區(qū)域，而不用整個(gè)野生型E1A基因。預(yù)計(jì)最終優(yōu)選的是使用抑制Akt基因所需的最小區(qū)域和/或活化p38基因所需的最小區(qū)域，這樣就不會(huì)將不必要的DNA導(dǎo)入接受E1A基因構(gòu)建體的細(xì)胞中。
在一些實(shí)施方案中，預(yù)計(jì)使用13S產(chǎn)物或者12S產(chǎn)物。稱為13S和12S產(chǎn)物的E1A基因產(chǎn)物反映編碼這些產(chǎn)物的兩個(gè)mRNA的沉降值)。這兩個(gè)mRNA來(lái)自共有前體的不同剪接方式，分別編碼有289和243個(gè)氨基酸的相關(guān)蛋白質(zhì)。所述蛋白質(zhì)的內(nèi)在不同在于13S蛋白所特有的46個(gè)氨基酸。本發(fā)明人先前的研究已經(jīng)表明12S和13S E1A基因產(chǎn)物能抑制神經(jīng)膜(neu)基因表達(dá)(參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5,814,315、5,651,964、5,641,484和5,643,567，這些專利均全文引入本文作為參考文獻(xiàn))。實(shí)施本發(fā)明時(shí)，建議可以將兩種產(chǎn)物交換使用，或者一起使用。
在另外一些實(shí)施方案中，預(yù)計(jì)可以使用許多其他種類E1A蛋白，這些蛋白是對(duì)初級(jí)翻譯產(chǎn)物進(jìn)行廣泛的翻譯后修飾產(chǎn)生的，通過(guò)PAGE分析可以看到(Harlow等，1985)。
再一些實(shí)施方案中，還可以使用一種小E1A基因產(chǎn)物，在美國(guó)專利6197754(其全文引用在此作為參考文獻(xiàn))和1998年3月19日提交的待審美國(guó)專利申請(qǐng)序號(hào)08/809,021(其全文引用在此作為參考文獻(xiàn))中描述了這種基因產(chǎn)物。所述小基因包含E1A蛋白的羧基端區(qū)域，其包括與13S E1A大約209-289位氨基酸對(duì)應(yīng)的羧基端大約80個(gè)氨基酸殘基。這個(gè)較小的羧基端區(qū)域在體內(nèi)顯示出明顯的腫瘤抑制活性。此外，還可以使用位于13S E1A基因產(chǎn)物209-289部分內(nèi)的更小片段，該片段保持抑制腫瘤發(fā)生的能力，它由去掉或改變這個(gè)結(jié)構(gòu)域內(nèi)的殘基衍生出。
因此，可以用于治療癌癥的小E1A基因產(chǎn)物可包含位于E1A的第2個(gè)外顯子內(nèi)的E1A羧基端片段。所述小E1A基因產(chǎn)物可以缺少部分氨末端片段。預(yù)計(jì)小E1A基因產(chǎn)物可以缺少E1A氨末端片段中至少有一10、15、20、25或30個(gè)氨基酸部分。
其他一些實(shí)施方案涉及E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸，其中去掉了CR1區(qū)域?？蛇x擇地，E1A基因產(chǎn)物可以是從中去掉了CR2區(qū)域的E1A基因產(chǎn)物。還可以選擇的是，所述E1A基因產(chǎn)物可以是從中去掉了CR1和CR2區(qū)域的E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸。
所述E1A基因產(chǎn)物還可以包含具有E1A基因產(chǎn)物中大約第4位氨基酸和大約第25位氨基酸之間的氨基酸序列的氨末端片段。所述E1A基因產(chǎn)物還可以包含具有E1A基因產(chǎn)物中大約第40位氨基酸和大約第80位氨基酸之間的氨基酸序列的氨末端片段。
E1A蛋白、肽或多肽可以另外包含一個(gè)間隔區(qū)，它位于E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸的CR1結(jié)構(gòu)域的羧基端。該間隔區(qū)可以包含一個(gè)氨基酸片段，其包含E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸中大約81位氨基酸和大約101位氨基酸之間氨基酸序列。
由這些討論很顯然，可以使用編碼E1A蛋白的整個(gè)E1A基因或者蛋白；或者E1A基因或其蛋白的任何部分，這些部分具有適合用于Akt和/或p38相關(guān)癌癥之治療的腫瘤抑制特性。
B.體內(nèi)遞送和治療方案當(dāng)利用基因本身來(lái)導(dǎo)入基因產(chǎn)物時(shí)，方便的導(dǎo)入方法是借助帶有所需基因的重組載體，基因通常與有關(guān)調(diào)控序列連接在一起，該調(diào)控序列能啟動(dòng)和/或調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。制備這類重組載體以及使用各種調(diào)控序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，在許多參考文獻(xiàn)中有描述，比如，例如Sambrook等(1989，特地在此引用本文作為參考文獻(xiàn))。
在載體中，可以理解，編碼待表達(dá)序列的DNA(在此情形下其編碼抑制癌發(fā)生的基因產(chǎn)物)通常鄰近并受控于一個(gè)啟動(dòng)子。本領(lǐng)域都知道要使編碼序列受控于這樣一個(gè)啟動(dòng)子，一般將待表達(dá)基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄讀碼框的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)5’端定位在所選啟動(dòng)子的下游(即，其3’方向)。正如本領(lǐng)域已知的，改變啟動(dòng)子和鄰近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)間的空間經(jīng)常可以用來(lái)影響轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平。當(dāng)使用異源啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)基因的表達(dá)時(shí)(即，對(duì)E1A基因是一個(gè)非E1A啟動(dòng)子)，可以首先采用與異源啟動(dòng)子和它正常情況下調(diào)控的基因之間的空間相類似的空間(通常少于100到幾百堿基對(duì))。但是，優(yōu)化表達(dá)可能包括將啟動(dòng)子從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)移近或移遠(yuǎn)。如果原來(lái)插入的DNA中未含有的話，有人還可能希望向載體的轉(zhuǎn)錄單元中并入一個(gè)合適的多腺苷酸化位點(diǎn)(例如，5′-AATAAA-3′)。通常，將這些多腺苷酸(poly A)附加位點(diǎn)置于轉(zhuǎn)錄終止子前面，編碼序列下游大約30到2000個(gè)核苷酸的一個(gè)位置。
采用特定基因的調(diào)控序列(即，E1A啟動(dòng)子)時(shí)，也可以使用細(xì)胞中發(fā)揮功能的其他調(diào)控序列。許多這類啟動(dòng)子，包括組成型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，在本領(lǐng)域已有描述，并且一般有多種來(lái)源，包括例如ATCC和商業(yè)來(lái)源。因此，可以通過(guò)舉例的方式提及其他有用的啟動(dòng)子，包括，例如SV40早期啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子、來(lái)自逆轉(zhuǎn)錄病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)啟動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、熱震啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子等。
為了導(dǎo)入E1A基因，一般希望采用還能協(xié)助將所需基因遞送到侵襲細(xì)胞的載體構(gòu)建體，這可能需要將構(gòu)建體遞送到患者體內(nèi)的目標(biāo)腫瘤細(xì)胞(例如，乳腺、卵巢、胰腺、結(jié)腸、前列腺或其他腫瘤細(xì)胞)。協(xié)助遞送的一個(gè)方法是利用病毒載體攜帶E1A序列以便有效地感染腫瘤或前腫瘤組織。病毒載體的例子包括腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、痘苗病毒和腺相關(guān)病毒載體。這些和/或其他病毒載體已成功地用于將所需序列以高感染效率遞送到細(xì)胞。
常使用的表達(dá)載體的病毒啟動(dòng)子來(lái)源于多瘤(polyma)、巨細(xì)胞病毒、腺病毒和猴病毒40(SV40)。SV40病毒的早期和晚期啟動(dòng)子尤其有用，因?yàn)樗鼈兌寄芎苋菀椎貜牟《局幸砸粋€(gè)還含有SV40病毒復(fù)制原點(diǎn)的片段形式得到。此外，使用正常情況下與所需基因序列連在一起的啟動(dòng)子或調(diào)控序列，也是可能，并且經(jīng)常是有益的，只要這些調(diào)控序列與宿主細(xì)胞體系相容。
可以通過(guò)構(gòu)建載體包括一個(gè)外源原點(diǎn)，比如來(lái)源于SV40或其他病毒(例如多瘤、腺病毒、VSV、BPV)的原點(diǎn)，或者通過(guò)宿主細(xì)胞的染色體復(fù)制機(jī)制，來(lái)提供復(fù)制原點(diǎn)。
可以用來(lái)作為構(gòu)建起點(diǎn)的載體的例子是一個(gè)含有E1A的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，稱為pSVXE1A-G，Robert等描述過(guò)(1985)。該載體包含受控于SV40早期啟動(dòng)子的E1A基因。本發(fā)明人建議實(shí)施本發(fā)明時(shí)，可以直接使用該載體或E1A構(gòu)建體，或者可以將它們作為起點(diǎn)來(lái)導(dǎo)入其他更需要的啟動(dòng)子，比如上面討論過(guò)的。
(i)腺病毒 體內(nèi)遞送本發(fā)明所述抑瘤基因的一個(gè)方法涉及使用腺病毒載體?！跋俨《颈磉_(dá)載體”意味著包括那些含有腺病毒序列的構(gòu)建體，這些序列足以(a)支持構(gòu)建體的包裝和(b)表達(dá)克隆在里面的多核苷酸。腺病毒轉(zhuǎn)移EIA非常方便，因?yàn)镋1A本身就是腺病毒基因。因此，需要在腺病毒載體中插入非病毒基因序列來(lái)完成E1A的腺病毒遞送。
一個(gè)示范性的表達(dá)載體包含遺傳工程化的腺病毒。對(duì)腺病毒基因結(jié)構(gòu)(36kb，線性雙鏈DNA病毒)的了解，使得能用高達(dá)7kb的外來(lái)序列替代大段的腺病毒DNA。與逆轉(zhuǎn)錄病毒不同，腺病毒DNA感染宿主細(xì)胞不會(huì)發(fā)生染色體整合，因?yàn)橄俨《綝NA能以外實(shí)體方式復(fù)制，沒(méi)有潛在的基因毒性。同時(shí)，腺病毒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，大量擴(kuò)增后沒(méi)有檢測(cè)到基因組重排。事實(shí)上腺病毒可以感染所有上皮細(xì)胞，并能感染許多其他細(xì)胞。
腺病毒是一種特別合適的基因轉(zhuǎn)移載體，因?yàn)樗兄械却笮〉幕蚪M，易于操作，滴度高，廣泛的靶細(xì)胞范圍和高感染性。病毒基因組的兩端都含有100-200個(gè)堿基對(duì)的反向重復(fù)(ITR)，其是病毒DNA復(fù)制和包裝所需的順式元件?；蚪M的早期區(qū)(E)和晚期區(qū)(L)含有不同的轉(zhuǎn)錄單位，其在病毒DNA復(fù)制時(shí)分開(kāi)。E1區(qū)(E1A和E1B)編碼那些負(fù)責(zé)調(diào)控病毒基因組和某些細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。E2區(qū)(E2A和E2B)的表達(dá)導(dǎo)致合成用于病毒DNA復(fù)制的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)參與DNA復(fù)制、晚期基因的表達(dá)和宿主細(xì)胞關(guān)閉(Renan，1990)。晚期基因的產(chǎn)物，包括大多病毒衣殼蛋白，僅在主要晚期啟動(dòng)子(MLP)驅(qū)動(dòng)產(chǎn)生的一單一初級(jí)轉(zhuǎn)錄物被有效加工后才被表達(dá)。位于16.8mμ的MLP在感染晚期尤其高效，所有產(chǎn)生自該啟動(dòng)子的mRNA都有一個(gè)5’三聯(lián)前導(dǎo)(TL)序列，這使它們成為翻譯的優(yōu)選mRNA。
在一個(gè)現(xiàn)有的體系中，重組腺病毒產(chǎn)生自穿梭載體和前病毒載體之間的同源重組。由于兩個(gè)前病毒載體之間可能發(fā)生重組，可從該過(guò)程制備到野生型腺病毒。因此，從單獨(dú)一個(gè)噬斑中分離病毒單克隆并檢查其基因組結(jié)構(gòu)，是非常關(guān)鍵的。使用YAC系統(tǒng)是制備重組腺病毒的替代做法。
將E1A基因?qū)雱?dòng)物的優(yōu)選方法是導(dǎo)入一個(gè)含有E1A基因的復(fù)制缺陷的腺病毒。這種腺病毒的一個(gè)例子是Ad.E1A(+)。由于腺病毒是自然界中一種感染人類的常見(jiàn)病毒，E1A基因是存在于天然腺病毒中的基因的一部分，利用復(fù)制缺陷型E1A病毒來(lái)導(dǎo)入基因，可以有效地影響E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸的遞送和在靶細(xì)胞中的表達(dá)。
通過(guò)例如缺失E1B和E3制備的復(fù)制缺陷型E1A病毒，還能避免病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并轉(zhuǎn)移到其他細(xì)胞，這意味著病毒感染活性被有效地限制在第一次感染的靶細(xì)胞中。E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸仍會(huì)在這些細(xì)胞中表達(dá)。同時(shí)，與只能感染正在增殖的細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒不同，腺病毒能將E1A基因轉(zhuǎn)移到正在增殖的細(xì)胞中，以及可能是通過(guò)刺激未增殖細(xì)胞而轉(zhuǎn)移到未增殖細(xì)胞中。此外，腺病毒在被感染細(xì)胞中位于染色體外減少了受處理動(dòng)物的細(xì)胞內(nèi)癌基因活化的機(jī)會(huì)。
復(fù)制型腺病毒可以直接用來(lái)將E1A基因轉(zhuǎn)移到癌細(xì)胞中，但是復(fù)制型病毒能在人體內(nèi)產(chǎn)生大量腺病毒，因此可能會(huì)由于野生型腺病毒的可復(fù)制性而帶來(lái)潛在的副作用。因此使用復(fù)制缺陷型腺病毒，比如E1B和E3缺失突變體Ad.E1A(+)來(lái)防止這些副作用是有益的。事實(shí)上，許多對(duì)天然腺病毒的修飾能產(chǎn)生適用于本發(fā)明目的的修飾過(guò)的病毒。對(duì)腺病毒的進(jìn)一步修飾，比如E2A缺失可提高E1A產(chǎn)物的表達(dá)效率并減少副作用。對(duì)天然或修飾過(guò)的腺病毒的唯一要求是它應(yīng)當(dāng)能夠遞送可在靶細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的E1A基因，以利用本發(fā)明。
將含有腫瘤抑制基因(例如E1A基因)的腺病毒導(dǎo)入合適的宿主，通常是通過(guò)注射包含在緩沖液中的病毒來(lái)完成的。正如上面討論過(guò)的，如果腺病毒載體是復(fù)制缺陷型的或者至少是條件缺陷型，是很有利的。腺病毒可以是42種不同的已知血清型或亞群A-F中的任一種。腺病毒C亞群5型目前是獲得用于本發(fā)明的條件復(fù)制缺陷型腺病毒的優(yōu)選起始材料。這是因?yàn)橄俨《?型是一種人的腺病毒，其多數(shù)生化和遺傳學(xué)信息是已知的，一直用于采用腺病毒為載體的多數(shù)構(gòu)建過(guò)程。
在腺病毒載體中使用了E1A基因的情況下，它可以占據(jù)正常情況下E1A基因占據(jù)的位置，或者可以將其放置在腺病毒構(gòu)建體中的另一個(gè)位置。
腺病毒易于生長(zhǎng)和操作，并且顯示出廣泛的體內(nèi)和體外宿主范圍。這群病毒可以獲得高滴度，例如109-1011噬斑形成單位/ml，而且它們有高感染性。腺病毒的生命周期不需要它整合到宿主細(xì)胞基因組中。免疫接種野生型腺病毒的研究沒(méi)有報(bào)道任何副作用(Couch等，1963；Top等，1971)，顯示了它們的總體安全性和作為體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移載體的治療潛力。
腺病毒已用于真核基因表達(dá)(Levrero等，1991；Gomez-Foix等，1992)和開(kāi)發(fā)疫苗(Grunhaus和Horwitz，1992；Graham和Prevec，1992)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示重組腺病毒可以用于基因治療(Stratford-Perricaudet和Perricaudet，1991；Stratford-Perricaudet等，1990；Rich等，1993)。將重組腺病毒給藥于不同組織的研究包括氣管滴注(Rosenfeld等，1991；Rosenfeld等，1992)、肌肉注射(Ragot等，1993)、外周靜脈內(nèi)注射(Herz和Gerard，1993)和立體定位(stereotactic)接種到腦中(Le Gal La Salle等，1993)。
(ii)逆轉(zhuǎn)錄病毒 逆轉(zhuǎn)錄病毒是一群?jiǎn)捂淒NA病毒，特征在于它們能通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程將其RNA轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA給感染細(xì)胞(Coffin，1990)。所得的DNA能夠穩(wěn)定地整合到細(xì)胞染色體中成為原病毒，并引導(dǎo)病毒蛋白質(zhì)的合成。整合導(dǎo)致病毒基因序列存留在受納細(xì)胞及其后代中。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組含有三個(gè)基因，蓋奇基因(gag)、聚合酶基因(pol)和包膜基因(env)，它們分別編碼衣殼蛋白、聚合酶和包膜成分。已有人構(gòu)建了蓋奇基因上游的一段稱為“PSI成分”的序列(Mann等，1983)。當(dāng)含有人cDNA和逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR以及PSI序列的重組質(zhì)粒被導(dǎo)入該細(xì)胞系時(shí)(例如通過(guò)磷酸鈣沉淀)，PSI序列使重組質(zhì)粒的RNA轉(zhuǎn)錄物包裝到病毒顆粒中，后者然后分泌到培養(yǎng)基中(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann等，1983)。之后收集含有重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)基，可選擇性地經(jīng)過(guò)濃縮，用于基因轉(zhuǎn)移。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒能感染多種細(xì)胞類型。但是，整合和穩(wěn)定表達(dá)需要宿主細(xì)胞發(fā)生分裂(Paskind等，1975)。
一種設(shè)計(jì)來(lái)使逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能特異尋靶的新方法是在對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行化學(xué)修飾的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的，所述修飾經(jīng)過(guò)向病毒包膜上化學(xué)添加乳糖殘基。這種修飾使得能經(jīng)由唾液酸糖蛋白受體特異地感染肝細(xì)胞。
還設(shè)計(jì)了另一種重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的尋靶方法，其中使用了生物素化抗體抵抗逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白和抵抗特異細(xì)胞受體的。這些抗體利用鏈親合素偶聯(lián)上了生物素成分(Roux等，1989)。利用抗主要組織相容性復(fù)合I類和II類抗原的抗體，研究人員證明用嗜親性病毒在體外能感染多種帶有這些表面抗原的人細(xì)胞(Roux等，1989)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的用途有某些潛在的限制。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通常整合到細(xì)胞基因組的隨機(jī)位點(diǎn)。這會(huì)通過(guò)打斷宿主基因或插入可能干擾旁側(cè)基因的功能的病毒調(diào)控序列，導(dǎo)致插入誘變(Varmus等，1981)。使用缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的另一個(gè)考慮是在包裝細(xì)胞中可能出現(xiàn)野生型可復(fù)制的病毒。這可能源于某些重組事件，其中來(lái)自重組病毒的完整序列插入整合在宿主細(xì)胞基因組中的蓋奇基因(gag)、聚合酶基因(pol)和包膜基因(env)序列的上游。但是，現(xiàn)在有新的包裝細(xì)胞系，能大大降低重組的似然(Markowitz等，1988；Hersdorffer等，1990)。體內(nèi)使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的一個(gè)限制是產(chǎn)生大于106感染U/mL的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體滴度的能力有限。許多體內(nèi)應(yīng)用需要比這高10至1000倍的滴度。
Paul和Overell(Targeted Genetics Corporation)在美國(guó)專利5,736,387中描述了利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體來(lái)引導(dǎo)基因遞送到特定靶細(xì)胞(比如癌細(xì)胞)的更新的方法，這些方法能避免許多這樣的局限性。
(iii)慢病毒載體 慢病毒是復(fù)雜的逆轉(zhuǎn)錄病毒，除了常見(jiàn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因蓋奇基因(gag)、聚合酶基因(pol)和包膜基因(env)，它還含有其他具有調(diào)控或結(jié)構(gòu)功能的基因。更高的復(fù)雜性使這種病毒能調(diào)整它的生命周期，與在潛伏感染過(guò)程中一樣。慢病毒的一些例子包括人免疫缺陷病毒HIV-1、HIV-2和猴免疫缺陷病毒SIV。已經(jīng)由多重減毒的HIV毒性基因制備了慢病毒載體，例如將包膜基因、vif基因、vpr基因，vpu基因和nef基因刪除使載體達(dá)到是生物學(xué)上的安全。
重組慢病毒載體能感染未分裂細(xì)胞，可以用于體內(nèi)和來(lái)自體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)移以及核酸序列的表達(dá)。慢病毒基因組和原病毒DNA有三個(gè)可發(fā)現(xiàn)于逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因蓋奇基因(gag)、聚合酶基因(pol)和包膜基因(env)，它們側(cè)接兩個(gè)長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)序列。蓋奇基因基因編碼內(nèi)部結(jié)構(gòu)(基質(zhì)、衣殼和核衣殼)蛋白；聚合酶基因編碼RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)、一蛋白酶和一整合酶；包膜基因編碼病毒包膜糖蛋白。5′和3’LTR用于提高轉(zhuǎn)錄以及毒粒RNA的聚腺苷酸化。LTR含有病毒復(fù)制所需的所有其他順式作用序列。慢病毒具有的附加基因包括vif、vpr、tat、rev、vpu、nef和vpx基因。
鄰近5′LTR的是基因組逆轉(zhuǎn)錄所需的(tRNA引物結(jié)合位點(diǎn))以及將病毒RNA有效地包裹到顆粒中(Psi位點(diǎn))所需的序列。如果病毒基因組中缺少殼體化(或者將逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA包裝到感染性毒粒中)所需的序列，順式(cis)缺陷會(huì)阻止基因組RNA的殼體化。但是，得到的突變體仍能引導(dǎo)所有毒粒蛋白質(zhì)的合成。
慢病毒載體是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，參見(jiàn)Naldini等，(1996)；Zufferey等(1997)；美國(guó)專利6,013,516和5,994,136。通常，載體是基于質(zhì)?；虿《镜?，設(shè)定成攜有使外來(lái)核酸結(jié)合、核酸選擇和轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中的必要序列。目的載體中的蓋奇基因(gag)、聚合酶基因(pol)和包膜基因(env)也是本領(lǐng)域已知的。因此，將有關(guān)基因克隆到所選的載體中，然后用它轉(zhuǎn)化感興趣的靶細(xì)胞。
在美國(guó)專利5,994,136(在此引用作為參考文獻(xiàn))中描述了能夠感染未分裂細(xì)胞的重組慢病毒，其中用攜有包裝功能的兩個(gè)或多個(gè)載體(即蓋奇基因、聚合酶基因和包膜基因，以及rev和tat)轉(zhuǎn)染合適的宿主細(xì)胞。該文描述了能提供編碼病毒蓋奇和聚合酶基因的核酸的第一載體，以及能提供編碼病毒包膜基因以便產(chǎn)生包裝細(xì)胞的核酸的另一個(gè)載體。將提供異源基因，比如本發(fā)明所述E1A基因，的載體導(dǎo)入包裝細(xì)胞中得到一個(gè)生產(chǎn)細(xì)胞，該細(xì)胞能釋放攜有目的外來(lái)基因的感染性病毒顆粒。包膜基因是優(yōu)選的一個(gè)雙嗜性包膜蛋白，能夠保證它轉(zhuǎn)導(dǎo)人和其他物種的細(xì)胞。
可以通過(guò)將包膜蛋白與抗體或者與能尋靶到一個(gè)特定細(xì)胞型的受體的獨(dú)特配體連接在一起來(lái)尋靶所述的重組病毒。通過(guò)將目的序列(包括調(diào)控區(qū))和另一個(gè)基因插入病毒載體，例如該基因編碼特定靶細(xì)胞上的受體的配體，這個(gè)載體就是靶特異性的。
提供病毒包膜基因(env)核酸序列的載體可操縱地連接著調(diào)控序列(例如啟動(dòng)子或增強(qiáng)子)。所述調(diào)控序列可以是任何真核啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，包括例如，Moloney鼠白血病病毒啟動(dòng)子-增強(qiáng)子元件、人巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子或者痘病毒P7.5啟動(dòng)子。在某些情況中，比如Moloney鼠白血病病毒啟動(dòng)子-增強(qiáng)子元件，啟動(dòng)子-增強(qiáng)子元件位于LTR序列內(nèi)或者鄰近LTR序列。
異源或者外來(lái)核酸序列，比如文中的編碼E1A蛋白、肽或多肽的多核苷酸序列可操縱地連接著調(diào)控核酸序列。優(yōu)選地，所述異源序列連接了啟動(dòng)子，形成一個(gè)嵌合基因。異源核酸序列還可以受控于病毒LTR啟動(dòng)子-增強(qiáng)子信號(hào)或者內(nèi)部啟動(dòng)子，逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR中保留下來(lái)的信號(hào)仍能使轉(zhuǎn)基因有效地表達(dá)?？梢岳脴?biāo)記基因來(lái)檢驗(yàn)載體的存在，從而證實(shí)發(fā)生了感染和整合。有標(biāo)記基因存在能保證僅有那些表達(dá)插入片段的宿主細(xì)胞被挑選出來(lái)并生長(zhǎng)。典型的選擇基因編碼某些賦予對(duì)抗生素和其他有毒物質(zhì)(例如，組氨醇、嘌呤霉素、潮霉素、新霉素、甲氨蝶呤等)的抗性的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞表面標(biāo)記。
通過(guò)轉(zhuǎn)染或感染可將載體導(dǎo)入包裝細(xì)胞系。包裝細(xì)胞系產(chǎn)生含有載體基因組的病毒顆粒。轉(zhuǎn)染和感染的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。將包裝載體和轉(zhuǎn)移載體共轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞系中之后，從培養(yǎng)基中回收重組病毒，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員使用的常規(guī)方法測(cè)定滴度。這樣，可以通過(guò)磷酸鈣轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體感染或電穿孔，將包裝構(gòu)建體通常與有顯性選擇標(biāo)記(neo、DHFR、Gln合成酶或ADA)一起導(dǎo)入人細(xì)胞系中，隨后在有適當(dāng)?shù)乃幬锎嬖诘那闆r下進(jìn)行挑選并分離克隆。選擇標(biāo)記可以與構(gòu)建體中的包裝基因直接連接。
慢病毒轉(zhuǎn)移載體(Naldini等，1996)已用于感染體外生長(zhǎng)停滯的人細(xì)胞，以及在直接注射到成年大鼠的腦中之后轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)元。該載體能有效地將標(biāo)記基因體內(nèi)轉(zhuǎn)移到神經(jīng)元中，并實(shí)現(xiàn)了在沒(méi)有可發(fā)覺(jué)的病理現(xiàn)象的情況下長(zhǎng)期表達(dá)。一次注射載體10個(gè)月后的動(dòng)物分析顯示，轉(zhuǎn)基因表達(dá)的平均水平?jīng)]有下降，沒(méi)有組織病理征兆或者免疫反應(yīng)(Blomer等，1997)。因此，在本發(fā)明中，用編碼核酸表達(dá)E1A蛋白、肽或多肽的重組慢病毒、來(lái)自體內(nèi)地轉(zhuǎn)染細(xì)胞，或者直接體內(nèi)感染細(xì)胞。
(iv)其他作為表達(dá)構(gòu)建體的病毒載體 在本發(fā)明中可以采用其他病毒載體作為表達(dá)構(gòu)建體?？梢圆捎脕?lái)源于諸如痘病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988)、腺相關(guān)病毒(AAV)(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Hermonat和Muzycska，1984)和嗜肝DNA病毒等病毒的載體。它們?yōu)楦鞣N哺乳動(dòng)物細(xì)胞提供了幾個(gè)有吸引力的特征(Friedmann，1989；Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等1988；Howrich等，1990)。
一公司(Targeted Genetics Corporation及其合作者)曾描述過(guò)用AAV載體進(jìn)行基因遞送的各種優(yōu)點(diǎn)，以及制備這些載體的方法和組合物，參見(jiàn)例如，Allen等，W096/17947；Flotte等，美國(guó)專利5,658,776。其他描述可以用于本發(fā)明所述方法的AAV載體的參考文獻(xiàn)包括Carter，B.，1990；Carter，1992；Muzyczka，1992；Flotte，1992；Chatteijee等，1995；Kotin，1994；Flotte，1995；以及Du等，1996。
隨著對(duì)缺陷型乙肝病毒的認(rèn)識(shí)，對(duì)不同病毒序列的結(jié)構(gòu)-功能之間的關(guān)系有了新的看法。體外研究顯示，即使將其基因組的80％刪除，病毒也能維持輔助病毒依賴性包裝和逆轉(zhuǎn)錄的能力(Hoiwich等，1990)。這提出了基因組的一大部分可以被外來(lái)遺傳物質(zhì)所取代。趨肝性和持續(xù)性(整合)對(duì)于肝指導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移尤有吸引力。Chang等將氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因?qū)滕喿右腋尾《净蚪M中聚合酶、表面和前表面編碼序列的位置。它與野生型病毒共轉(zhuǎn)染鳥(niǎo)肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系。用含有高滴度重組病毒的培養(yǎng)基來(lái)感染初級(jí)小鴨子肝細(xì)胞。至少轉(zhuǎn)染后24天能檢測(cè)到穩(wěn)定的CAT基因表達(dá)(Chang等，1991).
(v)基于脂類的基因遞送 在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)構(gòu)建體可以與一或多種脂類結(jié)合在一起。這在本領(lǐng)域內(nèi)稱為基于脂類的基因遞送，這類核酸-脂類復(fù)合體可以采取多種不同的形式，通常取決于所使用的脂類的特性、核酸與脂類和/或其他可能成分的比率、以及復(fù)合體形成方法。示范型的復(fù)合體包括形成一定結(jié)構(gòu)的復(fù)合體，比如脂質(zhì)體和膠粒，以及比較沒(méi)有固定結(jié)構(gòu)的復(fù)合體，比如脂類分散體。為了說(shuō)明，脂質(zhì)體是泡狀結(jié)構(gòu)，通常具有雙層膜，這種磷脂雙層包圍著內(nèi)部的水基質(zhì)。多層脂質(zhì)體有多重被水基質(zhì)分開(kāi)的脂類層。當(dāng)磷脂懸浮在過(guò)量的水溶液中時(shí)，自動(dòng)形成脂質(zhì)體。在形成封閉結(jié)構(gòu)之前，脂類成分進(jìn)行自我重排，捕獲水分和脂質(zhì)雙層之間的溶解物(Ghosh和Bachhawat，1991)。同樣考慮到的是脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑-DNA復(fù)合體。因此本發(fā)明還提供了特別有用的方法來(lái)向細(xì)胞中導(dǎo)入E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸。一個(gè)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)的基因?qū)崿F(xiàn)表達(dá)的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移方法包括利用脂質(zhì)體。脂質(zhì)體可以用于體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染。脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移似乎在某些動(dòng)物體內(nèi)應(yīng)用方面有很大的潛力(Nicolau等，1987)。研究表明靜脈注射的脂質(zhì)體主要通過(guò)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞被肝和脾攝取。攝取所注射的脂質(zhì)體的特異細(xì)胞部位似乎主要是脾的巨噬細(xì)胞和肝的枯否氏細(xì)胞。靜脈注射脂質(zhì)體/DNA復(fù)合體可以導(dǎo)致DNA被這些細(xì)胞位點(diǎn)攝取，從而導(dǎo)致DNA所編碼的基因產(chǎn)物的表達(dá)(Nicolau，1983)。本發(fā)明人考慮可以利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，將E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸導(dǎo)入細(xì)胞。建議這些構(gòu)建體可以按照Nabel等的描述(1990)偶聯(lián)上脂質(zhì)體，直接經(jīng)導(dǎo)管導(dǎo)入。采用這些方法，本發(fā)明的腫瘤抑制基因產(chǎn)物可以在體內(nèi)特定部位有效表達(dá)，而不僅在能通過(guò)靜脈注射可到達(dá)的肝和脾細(xì)胞。因此，本發(fā)明還包括的編碼E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸的DNA構(gòu)建體的組合物，其配制成DNA/脂質(zhì)體復(fù)合體，以及利用這些構(gòu)建體的方法。
可以利用多種脂類成分(和可能的其他成分)中的任何一種來(lái)制備脂質(zhì)體、膠粒和脂類分散體，所述脂類能與核酸發(fā)生復(fù)合或者能捕獲例如包含核酸的水結(jié)構(gòu)。可以采用的分子的例子包括卵磷脂(PC)、磷脂酰絲氨酸(PS)、膽固醇(Chol)、N-[1-(2，3-dioleyloxy)丙基)-N，N三甲基氯化銨(DOTMA)、dioleoyl磷脂酰乙醇胺(DOPE)和/或3.β[N-(N′，N′-二甲基氨基-乙烷)-氨基甲酰膽固醇(DC-Chol)，以及其他本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的脂類。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到有許多基于脂類的轉(zhuǎn)染技術(shù)可以用于本發(fā)明。其中的一些技術(shù)有Nicolau等(1987)、Nabel等(1990)和Gao等(1991)描述的。本發(fā)明人在包含DC-Chol的脂類/DNA復(fù)合體尤其成功。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明人按照L.Huang及其合作者的技術(shù)(參見(jiàn)，例如Gao等，1991；Epand等，PCT/US92/07290和美國(guó)專利5,283,185)成功制備了包含DC-Chol和DOPE的脂質(zhì)/DNA復(fù)合體。也可以使用包含DOTMA的脂質(zhì)復(fù)合體，比如一公司(Vical，Inc.，San Diego，Calif.)出售的商標(biāo)為L(zhǎng)ipofectin.TM.的商品。L.Huang及其同事(Deshmukh el aL，PCT/US97/06066；Liu等人，PCT/US96/15388，和Huang等人，PCT/US97/12544)公開(kāi)了多種以脂類為基礎(chǔ)的基因遞送的改良技術(shù)，這些技術(shù)可以用于遞送基因，例如遞送本發(fā)明公開(kāi)的基因。
可以引入脂類/核酸復(fù)合物與用多種方法轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接觸。細(xì)胞培養(yǎng)中，只是將所述復(fù)合物簡(jiǎn)單地分散在所述的細(xì)胞培養(yǎng)液中。就體內(nèi)使用而言，該復(fù)合物典型地采用注射途徑。靜脈內(nèi)注射可以使復(fù)合化后的DNA脂類介導(dǎo)轉(zhuǎn)染入，例如，肝及脾內(nèi)。為了使得DNA轉(zhuǎn)染入經(jīng)靜脈注射無(wú)法進(jìn)入的細(xì)胞中，可將所述的脂類-DNA復(fù)合物直接注射入動(dòng)物體內(nèi)的特定位置。例如，Nabel等人教導(dǎo)通過(guò)一導(dǎo)管將脂質(zhì)體注射入動(dòng)脈壁。另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明人已使用腹膜內(nèi)注射脂類/DNA復(fù)合物從而將基因轉(zhuǎn)移入小鼠。
本發(fā)明還提供了含有脂類復(fù)合物的組合物。該脂類組合物通常包括一種脂類成分和編碼腫瘤抑制基因的DNA片段。脂類復(fù)合物中使用的所述腫瘤抑制基因可以是，例如E1A基因。可以類似地將一E1A基因與脂類復(fù)合形成脂類/DNA復(fù)合物用于基因遞送。
用于制備脂類復(fù)合物的脂類可以是任一種上述脂類。具體地，可以用DOTMA、DOPE和/或DC-Chol形成脂類復(fù)合物的全部或部分。本發(fā)明人用含有DC-Chol的復(fù)合物已經(jīng)取得了相當(dāng)?shù)某晒?。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的脂類復(fù)合物包括DC-Chol和DOPE。盡管DC-Chol與DOPE之間的多種配比都可以使用，但是其中含有DC-Chol∶DOPE之比為1∶20～20∶1的脂類復(fù)合物有著明顯的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)按照DC-Chol∶DOPE之比約1∶10～約1∶5制備的脂類復(fù)合物從穩(wěn)定性和有效性角度看都是特別有用的。可以用來(lái)與E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸組合遞送的脂類和脂質(zhì)體也已公開(kāi)于美國(guó)專利號(hào)5,922,688、5,814,315、5,651,964、5,641,484和5,643,567中，在此引用所有文獻(xiàn)的全文作為參考；還可參見(jiàn)1998年3月19日提交的序號(hào)為08/809,021的待審美國(guó)專利申請(qǐng)，其在此引用作為參考。
在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，也可以將所述脂類與血凝病毒(HVJ)復(fù)合在一起。其已顯示促進(jìn)與細(xì)胞膜的融合并且加速了脂質(zhì)體包裹的DNA進(jìn)入細(xì)胞(Kaneda等人，1989)。在其他實(shí)施方案中，所述脂類與核無(wú)組蛋白染色體蛋白(HMG-1)(Kato等人，1991)復(fù)合或者偶聯(lián)在一起。在另外的其他實(shí)施方案中，所述脂類與HVJ和HMG-l二者復(fù)合或偶聯(lián)在一起。Huang及其同事也已提供了多種脂類為基礎(chǔ)的基因遞送復(fù)合物，其中一些包括核酸縮合劑和其他成分；并且進(jìn)一步詳細(xì)地描述了可用于制備這類基因遞送復(fù)合物的技術(shù)(參見(jiàn)，例如，目標(biāo)基因公司PCT/US97/12544以及上述Huang等人其他參考文獻(xiàn))。
由于此類表達(dá)構(gòu)建體都已成功地應(yīng)用于核酸的體內(nèi)及體外轉(zhuǎn)移及表達(dá)，因而它們可以用于本發(fā)明。如本領(lǐng)域所知，基因遞送復(fù)合物中還可含有其他成分，包括蛋白質(zhì)和/或其他分子，它們有利于所遞送DNA靶向特定細(xì)胞、被靶細(xì)胞結(jié)合并吸收、在特定亞細(xì)胞腔室(例如，核及細(xì)胞溶質(zhì))中的定位、及其整合和/或表達(dá)。目標(biāo)基因公司在PCT′US95/04738中描述了多種這樣的單個(gè)成分及其結(jié)合體。
(vi)其他非病毒載體 為了實(shí)現(xiàn)正義或含義基因構(gòu)建體的表達(dá)，通常必須將所述表達(dá)構(gòu)件體遞送到細(xì)胞中。這種遞送可以用實(shí)驗(yàn)室用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的方法在體外來(lái)實(shí)現(xiàn)，或者象治療特定疾病那樣在體內(nèi)或來(lái)自體內(nèi)細(xì)胞系(exvivo)(見(jiàn)下文)來(lái)實(shí)現(xiàn)。如上所述，遞送可以通過(guò)病毒感染實(shí)現(xiàn)，其中所述的表達(dá)構(gòu)建體包裹入一感染性的病毒顆粒中。
本發(fā)明還提供了用于將表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的幾種非病毒方法。這些方法包括磷酸鈣沉淀(Graham和Van Der Eb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe el aL，1990)DEAE-葡聚糖(Gopal，1985)、電穿孔(Tur-Kaspa等人g 1986；Pouer er aL，1984)、直接微注射(Harland和Weintraub～1985)、DNA運(yùn)載脂質(zhì)體(Nicolau和Sene，1982；Fraley et al.，1979)和脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺(lipofectamine)-DNA復(fù)合物、細(xì)胞聲波化(Fechheimer等人，1987)、高速微?；蜣Z擊(Yang等人，1990)、以及受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染(Wu和Wu，1987；Wu和Wu，1988)。這些技術(shù)可以經(jīng)調(diào)整后成功用于體內(nèi)或來(lái)自體內(nèi)細(xì)胞系的用途。
使用基因遞送融合蛋白(GDFPs)的非病毒基因遞送改良法已由Overell和Weisser(目標(biāo)基因公司)于PCT/US95/04738。
一旦表達(dá)構(gòu)建體被遞送到細(xì)胞中，那么編碼目的基因的核酸就可以在不同位點(diǎn)定位并表達(dá)。在特定實(shí)施方案中，編碼該基因的核酸可以作為分離的附加DNA片段穩(wěn)定地保留在細(xì)胞中。這類核酸片段或“附加體”編碼序列足以允許獨(dú)立于宿主細(xì)胞循環(huán)之外保留并復(fù)制，或者與其同步化。表達(dá)構(gòu)建體如何遞送入細(xì)胞以及該核酸停留在細(xì)胞內(nèi)何處，這些取決于所用表達(dá)構(gòu)建體的類型。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)構(gòu)建體可以僅由裸露的重組DNA或質(zhì)粒簡(jiǎn)單地構(gòu)成。所述構(gòu)建體的轉(zhuǎn)移可以采用上述的任一種方法，這些方法利用物理或化學(xué)原理使細(xì)胞膜通透化。這特別適用于體外轉(zhuǎn)移但也可以體內(nèi)使用。Dubensky等人(1984)成功地將多瘤病毒DNA以磷酸鈣沉淀物的形式注射入成年或新生小鼠的肝或脾內(nèi)，顯示了活躍的病毒復(fù)制及急性感染。Benvenisty等人，(1986)也表明磷酸鈣沉淀質(zhì)粒直接腹膜內(nèi)注射可以導(dǎo)致所轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)?？梢灶A(yù)見(jiàn)編碼一目的基因(例如，E1A基因)的DNA也可以類似方式進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)移并表達(dá)基因蛋白。
本發(fā)明中將裸露DNA表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的另一實(shí)施例，可以采用顆粒轟擊。該方法取決于能否將DNA包裹的微粒加速到一高速度從而使得它們可以穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞且并未殺死細(xì)胞(Klein等人，1987)?，F(xiàn)已發(fā)展了幾種加速小顆粒的裝置。一種所述裝置依賴于一能產(chǎn)生電流的高電壓放電，該電流反過(guò)來(lái)提供動(dòng)力。所使用的微粒由鎢或金珠等生物惰性物質(zhì)組成。
已經(jīng)選用器官包括大鼠和小鼠的肝、皮膚及肌肉組織，進(jìn)行體內(nèi)轟擊(Zelenin等人，1991)。為了去除槍與目標(biāo)器官之間的任一干擾組織，可能需要將所述組織或細(xì)胞外科方法暴露，即來(lái)自體內(nèi)處理。另外，編碼一特定基因的DNA可以通過(guò)該方法遞送，并且也被包括在本發(fā)明中。
可以用來(lái)將編碼特定基因的核酸遞送入細(xì)胞的其他表達(dá)構(gòu)建體為受體介導(dǎo)遞送介質(zhì)。這些構(gòu)建體利用幾乎所有真核細(xì)胞中通過(guò)受體介導(dǎo)內(nèi)吞選擇性吸收大分子。鑒于各種受體的細(xì)胞型特異性分布，所述遞送可以實(shí)現(xiàn)高度特異性(Wu和Wu，1987；1988；Overell和Weisser(目標(biāo)基因公司)，PCT/US95/04738)。
受體介導(dǎo)的基因靶向介質(zhì)通常由兩種成分組成細(xì)胞受體特異性配體以及DNA結(jié)合試劑?，F(xiàn)已有幾種配體用于受體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移。最有代表性的配體是脫唾液酸血清類粘蛋白(ASOR)(Wu和Wu，1987)以及運(yùn)鐵蛋白(Wagner等人，1990)。一種合成的新糖蛋白與ASOR識(shí)別同一受體，它已被用作基因遞送介質(zhì)(Ferkol等人，1993；Perales等，1994)，且表皮生長(zhǎng)因子(EGF)也已被用來(lái)將基因遞送給磷狀癌細(xì)胞(squamous carcinoma cells)(Myers，EPO 0273085)。
在其他實(shí)施方案中，所述遞送介質(zhì)可包括一配體和一脂類復(fù)合物。例如，Nicolau等人(1987)將乳糖苷神經(jīng)酰胺，一種半乳糖端asialganglioside，引入脂質(zhì)體，并且觀察到肝細(xì)胞胰島素基因攝入量的增加。因此，可以通過(guò)任意數(shù)目的含或不含脂類的受體-配體系統(tǒng)，將編碼某一特定基因的核酸特異地遞送到諸如肺、表皮或腫瘤等類型的細(xì)胞中，這樣是切實(shí)可行的。例如表皮生長(zhǎng)因子可以用作受體用于將編碼基因的核酸介導(dǎo)遞送到多種呈現(xiàn)上調(diào)EGF受體的腫瘤細(xì)胞中?？梢杂酶事短菍⒏事短鞘荏w靶向肝細(xì)胞。另外，也可類似地將抗CD5(CLL)，CD22(淋巴瘤)、CD25(T細(xì)胞白血病)及MAA(黑素瘤)的抗體用作靶向基元。
在特定實(shí)施方案中，基因轉(zhuǎn)移在離體條件下更容易進(jìn)行。離體基因治療是指從動(dòng)物中分離出細(xì)胞，將核酸體外遞送到細(xì)胞中，以及然后將修飾后的細(xì)胞送回到動(dòng)物體。這涉及到從動(dòng)物體外科摘取組織/器官或者細(xì)胞及組織原代培養(yǎng)。參見(jiàn)，例如，Anderson等人，美國(guó)專利5,399,346。
C.藥用組合物及給藥途徑本發(fā)明的組合物將有效量的基因用于治療給藥，任選地與有效量的第二種試劑聯(lián)合使用，例如一種化療試劑或任一種上述的其他抗癌試劑。通常所述組合物溶于或分散于藥物學(xué)上可接受的載體或含水介質(zhì)中。
術(shù)語(yǔ)“藥物學(xué)或藥理學(xué)上可接受”是指當(dāng)施用給動(dòng)物或人時(shí)不會(huì)產(chǎn)生負(fù)作用、過(guò)敏或其他不良反應(yīng)分子組成和組合物。如在此所用的“藥物學(xué)上可接收的載體”包括任一種或所有溶劑、分散介質(zhì)、包被劑、抗菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。這些介質(zhì)及試劑用于藥物活性物質(zhì)為本領(lǐng)域眾所周知。任一種常規(guī)介質(zhì)或試劑除非與活性成分是不相容的，都可以嘗試用于所述治療組合物中。補(bǔ)充活性組分，例如其他抗癌試劑，也可以引入所述組合物中。
除配制成非腸道給藥的化合物外，例如靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射之外，其他藥物學(xué)上可接受的方式包括，例如片劑或其他用于口服的固體；緩釋膠囊；以及當(dāng)前使用的任一種其他形式，包括乳劑、洗劑、漱劑、吸入劑等。
本發(fā)明所述的表達(dá)載體及遞送介質(zhì)可以包括經(jīng)典的藥物制劑。根據(jù)本發(fā)明所述的這些組合物的給藥方式，可是任一種常規(guī)途徑，只要目標(biāo)組織通過(guò)該途徑可以獲得。這包括通過(guò)口腔、鼻腔、頰、直腸、陰道、或表面給藥?？蛇x擇性地，可以通過(guò)，例如，常位、皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)，腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注射給藥。通常，該類組合物可以作為藥物學(xué)上可接受的組合物施用，如上所述。
本發(fā)明所述的載體優(yōu)選以可注射組合物的方式給藥，可以液體溶液或懸液。也可以配制成適于注射前才溶于或懸浮于液體中的固體形式。也可以將這些制劑乳化。用于此目的的典型組合物包括濃度為每毫升磷酸緩沖鹽水含50mg～約100mg的人血清白蛋白。其他的藥用可接受載體包括水溶液、非毒性賦形劑、包括鹽、防腐劑、緩沖液等。無(wú)水溶劑的實(shí)例包括丙二醇，聚乙二醇、植物油以及可注射用有機(jī)酯，例如theyloleate。含水載體包括水、醇/水溶液、鹽水溶液、非腸道介質(zhì)例如氯化鈉、葡萄糖鹽水(Ringer′s dextrose)等。靜脈內(nèi)介質(zhì)包括流體及營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑。防腐劑包括抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑以及惰性氣體。藥物組合物中各種成分的pH值及精切的濃度根據(jù)眾所周知的參數(shù)來(lái)調(diào)節(jié)。
另外的制劑適合口服?？诜苿┌ǖ湫偷馁x形劑，例如藥用級(jí)甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。所述組合物可以采用溶液、懸液、片劑、丸劑、膠囊、緩釋制劑或粉末。當(dāng)采用表面局部給藥方式時(shí)，所述形式可以是乳劑、油膏、油藥膏或噴劑。
治療藥物的有效劑量是根據(jù)期望目標(biāo)確定的。術(shù)語(yǔ)“單位劑量”是指適用目標(biāo)體的物理形態(tài)上離散的單元，每個(gè)單元包括預(yù)定量的治療組合物，經(jīng)計(jì)算能夠產(chǎn)生與其施用，即合適的途徑及治療方案相關(guān)的預(yù)期反應(yīng)。所述的給藥量，根據(jù)治療次數(shù)及單位劑量，取決于所要治療的目標(biāo)體、目標(biāo)體的狀態(tài)以及期望的保護(hù)。治療組合物的確切的量也取決于臨床醫(yī)師的判斷并且因個(gè)體而異。
抑制腫瘤細(xì)胞增殖所需要的所有主要物質(zhì)及試劑都可以裝配于試劑盒中。當(dāng)試劑盒中的成分以一種或多種液體溶液提供時(shí)，所述的液體溶液優(yōu)選地是一種含水溶液，特別優(yōu)選滅菌后的水溶液。
就體內(nèi)使用而言，化療試劑可以配制成單一或分離的藥理學(xué)上可接受的注射用組合物。這種情況下，所述包裝形式本身可以是一種吸入、注射、移液瓶、滴眼液瓶或其他類似容器，所述制劑由這些容器而出施用到肌體的患處，例如肺，注射入動(dòng)物體，或者甚至使用并與試劑盒中的其他成分混合。
試劑盒中的成分還可以干燥或凍干的形式提供。當(dāng)試劑或成分以干燥后的形式提供時(shí)，通常通過(guò)另外加入合適的溶劑重配。還可以將所述溶劑以另外的包裝形式提供，這也是行得通的。本發(fā)明所述的試劑盒還可以包括解釋所述基因治療和/或化療藥物如何使用的說(shuō)明書(shū)頁(yè)。
本發(fā)明所述的試劑盒典型地還可以包括一種用于以密閉形式盛裝小瓶的器皿以利于出售，例如注射或吹脹器皿，內(nèi)裝合乎需要的小瓶。拋開(kāi)器皿的數(shù)目或類型不說(shuō)，本發(fā)明所述的試劑盒還可以包括一種有助于最終的復(fù)合組分在動(dòng)物體內(nèi)注射/施用或者停留的裝置，或者用該裝置來(lái)包裝。這樣的裝置可以為吸入、注射、移液管、鑷子、量匙、滴眼瓶或者其他任一種醫(yī)學(xué)上適合的送遞器具。
非腸道施用 本發(fā)明所述的活性化合物通常配制成非腸道使用的制劑，例如配制成通過(guò)靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下，或者甚至腹膜內(nèi)途徑注射的形式。閱讀本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獲知配制任選含有用作活性成分的第二種試劑的含水組合物的方法。典型地，將所述組合物配制成可注射形式，如液體溶液或懸浮液；也可以配制成適于注射前才另加液體制備成溶液或懸液的固體形式；也可以將這些制劑乳化。
可以將活性化合物以游離基或藥學(xué)上可接受鹽形式在水中與羥丙基纖維素等表面活性劑適當(dāng)?shù)鼗旌吓渲瞥扇芤骸Ｒ部梢栽诟视?、液態(tài)聚乙二醇及其混合物以及油類中制備分散體系。在一般的存儲(chǔ)及使用條件下，這些制劑含有一種旨在防止微生物生長(zhǎng)的防腐劑。適于注射使用的藥用形式包括滅菌的水溶液或分散體系；含有芝麻油、花生油或含水丙二醇的制劑；以及適于現(xiàn)用現(xiàn)配成滅菌注射液或分散體系的無(wú)菌粉末。在所有情況下，所述形式都必須是無(wú)菌的并且是一定程度上易于注射排出的流體。它還必須在制備及存儲(chǔ)條件下是穩(wěn)定，以及必須能防止微生物，例如細(xì)菌和真菌的污染。
可以將所述活性化合物以中性或鹽的形式配制成組合物。藥物學(xué)上可接受的鹽包括酸加成鹽(與蛋白質(zhì)的游離氨基形成)、與無(wú)機(jī)酸例如鹽酸或磷酸或者乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等有機(jī)酸形成。也可以從無(wú)機(jī)堿或有機(jī)堿衍生出的物質(zhì)與游離的羧基基團(tuán)形成的鹽，所述無(wú)機(jī)堿例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵等，所述有機(jī)堿可以是異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等。
所述載體也可以是含有下列物質(zhì)的溶劑或分散介質(zhì)例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液態(tài)聚乙二醇等)、及其合適的混合物、以及植物油?？梢酝ㄟ^(guò)下述操作來(lái)保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性例如用卵磷脂等包被、保持分散狀態(tài)下所需的顆粒大小以及使用表面活性劑。可以通過(guò)各種抗菌或抗真菌劑防止微生物的作用，例如parabens、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。多數(shù)情況下，優(yōu)選地包括等滲劑，例如糖或氯化鈉。通過(guò)在組合物中使用延遲吸收的試劑來(lái)實(shí)現(xiàn)注射組合物的延遲吸收，例如單硬脂酸鋁及明膠。
可以通過(guò)下述操作制備無(wú)菌注射液將所需量的活性化合物引入到已含有上述其他成分的適當(dāng)溶劑中，按照要求，然后過(guò)濾除菌。通常通過(guò)下述操作制備分散體系將各種無(wú)菌活性成分引入到一無(wú)菌載體中，該載體中含有堿性分散介質(zhì)和上述的所需的其他成分。就用于制備無(wú)菌注射液的無(wú)菌粉末而言，優(yōu)選的制備方法為真空干燥及凍干技術(shù)，這些技術(shù)可以制備出活性成分粉末外加來(lái)自其上述消毒過(guò)濾溶液的任一附加的需要的成分。在某些情況下，本發(fā)明的治療制劑還可以配制成適合局部給藥的形式，例如乳劑和洗劑。這些形式可以用于治療皮膚相關(guān)疾病，例如各種肉瘤。
配制時(shí)，溶液可以與劑量制劑形式相容的方式給藥，并采用治療有效量。所述制劑很容易按照多種劑量形式來(lái)給藥，例如上述類型的注射溶液，藥物緩釋膠囊等。
就含水溶液的非腸道給藥而言，例如如有必要應(yīng)將溶液適當(dāng)緩沖處理，并且首先用足量的鹽或葡萄糖液態(tài)稀釋使其等滲。這些特定的含水溶液特別適合于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下以及腹膜內(nèi)給藥。在這種情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容中獲知可以使用的無(wú)菌含水介質(zhì)。例如，可以將一份劑量溶解在1mL等滲的NaCl溶液中，以及要么加入1000ml皮下灌注液要么在預(yù)定的灌注位點(diǎn)注射(參見(jiàn)例如，″Remington′s Pharmaceutical Sciences″15th Edition，pp.1035-1038和1570-1580)。必要時(shí)可根據(jù)接受治療的患者的情況對(duì)劑量進(jìn)行一些調(diào)整。無(wú)論何種情況下，負(fù)責(zé)給藥的人員都應(yīng)當(dāng)確定適于患者個(gè)體的合適劑量。
從多種方式中任選一種都可以實(shí)現(xiàn)癌組織的靶向。通過(guò)質(zhì)粒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體以及其他現(xiàn)有的病毒及非病毒載體都可靶向人體癌癥部位。本發(fā)明人已相當(dāng)成功地實(shí)現(xiàn)了使用以脂類為基礎(chǔ)的復(fù)合物將E1A基因靶向癌細(xì)胞。可以通過(guò)靜脈內(nèi)注射將基因?qū)蚣?xì)胞，包括轉(zhuǎn)化細(xì)胞。直接注射復(fù)合物到癌癥鄰近部位也可以用來(lái)將所述復(fù)合物靶向一些形式的癌癥。例如通過(guò)將脂類混合物直接注射入患有卵巢癌患者的腹膜腔中，可以實(shí)現(xiàn)卵巢癌的定位。當(dāng)然，被癌細(xì)胞群選擇性吸收的脂類復(fù)合物也可以如上所述那樣用來(lái)將腫瘤抑制基因選擇性地靶向特定的癌細(xì)胞。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到簡(jiǎn)單地就能夠確定用E1A抑制癌癥的最佳方案。這并非一個(gè)試驗(yàn)性問(wèn)題，而是一個(gè)最優(yōu)化的問(wèn)題，常規(guī)上是在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域完成。本發(fā)明所述的體內(nèi)研究提供了一個(gè)開(kāi)始點(diǎn)，可以從此對(duì)劑量和遞送方案進(jìn)行優(yōu)化。最初的注射頻度是一周一次，在小鼠試驗(yàn)中是這樣。然而，根據(jù)最初臨床試驗(yàn)得到的結(jié)果以及特定患者的需要，可以將這種頻度從一天優(yōu)化調(diào)整到以月來(lái)計(jì)算。最初確定人用量是從小鼠使用E1A的量推算出來(lái)的，大約每50g體重15μg。因此，一位50kg的婦女需要的治療劑量為每劑量中含15mgDNA。當(dāng)然，所述劑量可以上下調(diào)整，如這類治療方法中常規(guī)操作的那樣，這要視最初臨床試驗(yàn)的結(jié)果和特定患者的需要而定。
D.配合治療為了增強(qiáng)與本發(fā)明所述的E1A為基礎(chǔ)的基因治療配合治療的效果，可以期望將這些組合物與其他能有效治療癌癥的藥物配合。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，因此嘗試將E1A為基礎(chǔ)的基因治療與其他本領(lǐng)域已知的抗癌治療配合使用以治療涉及Akt活化和/或p38滅活的癌癥。涉及Akt和p38的多種癌癥，包括前期癌、腫瘤、惡性癌癥，都可以用本發(fā)明所述的方法進(jìn)行治療?？梢杂帽景l(fā)明所述方法進(jìn)行治療的一些癌癥包括乳腺、前列腺、肝、骨髓瘤、膀胱、血、骨、骨髓、腦、結(jié)腸、食管、胃腸、頭、腎、肺、鼻咽、頸、卵巢、皮膚、胃以及子宮癌。
其他抗癌治療方法可以在以E1A為基礎(chǔ)的基因治療之前或隨后進(jìn)行，間隔為幾分鐘至幾天至幾周。在將另一抗癌治療方法和E1A為基礎(chǔ)的基因治療一起進(jìn)行的實(shí)施方案中，通常應(yīng)當(dāng)確保間隔的時(shí)間段不超過(guò)每一送遞的時(shí)間。這些情況下，預(yù)計(jì)用這兩種模式對(duì)病人給藥，每種模式的給藥時(shí)間為12-24小時(shí)，優(yōu)選為6-12小時(shí)，其最優(yōu)選的延遲時(shí)間只有約12小時(shí)的。在一些情況下，為了顯著治療可以超過(guò)時(shí)間段，但是，此時(shí)每一次治療之間應(yīng)當(dāng)間隔幾天(2、3、4、5、6或7)至幾周(1、2、3、4、5、6、7或8)。
另外可以相信的是，需要用另一抗癌治療和E1A為基礎(chǔ)的基因治療其中之一進(jìn)行不止一次的治療直至實(shí)現(xiàn)癌癥的痊愈。各種配合都可以使用，其中所述另一種抗癌治療藥物為“A”，E1A為基礎(chǔ)的基因治療為“B”，例示如下A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/BA/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/AA/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B其他配合也可以試用。每一藥劑的確切劑量及方案可由本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。
使用的其他抗癌治療的一些實(shí)例如下所述。
a)化療藥物能夠破壞DNA的藥物為化療藥物。這些可以是，例如直接交聯(lián)DNA的藥物，嵌入DNA的藥物，以及通過(guò)影響核酸合成引發(fā)染色體及有絲分裂異常的藥物。直接交聯(lián)核酸，特別是DNA的藥物是可以見(jiàn)到的，以順鉑，以及其他DNA烷基化試劑為代表。破壞DNA的藥物也可以包括干擾DNA復(fù)制、有絲分裂以及染色體分離的化合物。
化療藥物的一些實(shí)例包括抗生化療藥物，例如阿霉素，道諾霉素，絲裂霉素(也稱為絲泰霉素和/或絲裂霉素-C)，放線菌素D，博來(lái)霉素，普卡霉素(plicomycin)，植物生物堿，例如紅豆杉醇、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿，烷基化試劑，例如，卡氯芥、苯丙氨酸氮芥(又稱左旋溶內(nèi)瘤素、L-苯基丙氨酸芥、苯基丙氨酸芥、L-PAM、或L-sarcolysin，其是氮芥的一種苯基丙氨酸衍生物)、環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、白消安(又稱myleran)、羅氮芥；以及混溶劑(miscellaneousagents)，例如順鉑(CDDP)，碳化鉑，甲基芐肼，二氯甲基二乙胺，喜樹(shù)堿，異環(huán)磷酰胺，亞硝基脲，Etoposide(VP16)，他莫昔芬，腫瘤壞死因子，雷諾昔芬，雌激素受體結(jié)合劑，Gemeitabine，Navelbine，法尼基-轉(zhuǎn)移酶抑制劑，反鉑，5-氟尿嘧啶，以及甲氨蝶呤，Temazolomide(DTIC的含水形式)，或者上述物質(zhì)的任一類似物或衍生變體。
(i)抗生素阿霉素 阿霉素鹽酸鹽，5，12-萘醌，(8s-順式)-10-[(3-氨基-2，3，6-三乙氧基a-L-來(lái)蘇(lyxo)-六吡喃基)氧代]-7，8，9，10-四氫-6，8，11-三羥基-8-羥乙基)-1-甲氧基-氫氯化物(羥基化道諾霉素氫氯化物，亞德里亞霉素)是一種廣譜的抗腫瘤藥物。它可結(jié)合DNA并抑制核酸合成，抑制有絲分裂并促進(jìn)染色體異常。
單獨(dú)使用時(shí)，它是治療甲狀腺瘤和初期肝細(xì)胞瘤的首選藥物。它是治療下列腫瘤的31種首選配合中的一種成分卵巢、子宮內(nèi)膜和乳腺癌、支氣管原燕麥細(xì)胞癌、非小葉細(xì)胞肺癌、胃腺癌、眼癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、蕈樣霉菌病、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、骨髓瘤、擴(kuò)散的組織細(xì)胞淋巴瘤、維耳姆斯氏瘤、何杰金氏病、腎上腺腫瘤，骨源性肉瘤、軟組織肉瘤、尤因、氏瘤，橫紋肌肉瘤以及急性淋巴細(xì)胞白血病。它是治療島細(xì)胞、子宮頸、睪丸和腎上腺皮質(zhì)癌的替代藥物。它還是一種免疫抑制劑。
阿霉素吸收程度很低，其必須經(jīng)靜脈內(nèi)給藥。藥物動(dòng)力學(xué)為多間隔的。分布相的半衰期為12分鐘和3.3小時(shí)。清除半衰期約為30小時(shí)。其中的40～50％分泌到膽汁中。大部分殘余物在肝脹中代謝，部分為活性代謝產(chǎn)物(阿霉素)，而其中的百分之幾排放到尿中。當(dāng)有肝損傷存在時(shí)，應(yīng)當(dāng)減小劑量。
合適的劑量是，靜脈內(nèi)，成人，60～75mg/m2間隔21天，或者20～30mg/m2或者每隔3～4周重復(fù)連續(xù)2或3天連續(xù)給藥，或者20mg/m2每周一次。當(dāng)此前的化療或腫瘤性轉(zhuǎn)化的骨髓發(fā)作造成骨髓抑制，或者在與其他骨髓形成的抑制性藥物聯(lián)用的情況下，老年患者應(yīng)當(dāng)采用最低量。如果血清膽紅素為1.2～3mg/dL，則應(yīng)將劑量減少50％，如果高于3mg/dL，則減少75％。心臟功能正常的患者的終生總劑量不能超過(guò)550mg/m2，接受過(guò)縱膈照射的人該用量為400mg/m2。替代地，每隔4周連續(xù)3天給藥一次，用量為30mg/m2。例舉劑量可以為10mg/m2、20mg/m2、30mg/m2、50mg/m2、100mg/m2、150mg/m2、175mg/m2、200mg/m2、225mg/m2、250mg/m2、275mg/m2、300mg/m2、350mg/m2、400mg/m2、425mg/m2、450mg/m2、475mg/m2、500mg/m2。當(dāng)然，所有這些劑量都是列舉的，任一落入這些點(diǎn)之間的劑量也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
道諾霉素 道諾霉素鹽酸鹽，5，12-萘醌，(8s-順式)-8-乙酰基-10-[(3-氨基-2，3，6-三乙氧基a-L-來(lái)蘇(lyxo)-六吡喃基)氧代]-7，8，9，10-四氫-6，8，11-三羥基-10-甲氧基-氫氯化物；又稱柔紅霉素。道諾霉素嵌入DNA，阻斷DNA引導(dǎo)的MA聚合酶，并抑制DNA的合成?？梢圆捎媚茏柚辜?xì)胞分裂但不干擾核酸合成的劑量。
與其他藥物聯(lián)用時(shí)，它可以納入成人急性髓細(xì)胞性白血病(引起緩解)、急性淋巴細(xì)胞白血病以及慢性髓細(xì)胞性白血病的急性期首選化療中?？谇晃招圆?，必須靜脈注射。分布半衰期為45分鐘，清除半衰期為約19小時(shí)。其活性代謝物道諾霉素的半衰期為約27小時(shí)。道諾霉素大部分在肝脹內(nèi)代謝，還有分泌到膽汁中(ca40％)。肝或腎功能不全則者必須減少用量。
合適劑量為(基本量)，成人靜脈內(nèi)，小于60歲，45mg/m2/天(就大于60歲患者而言為30g/m2)每隔3或4周給藥1、2或3天，或者0.8mg/kg/天每隔3或4周給藥3～6天；終生用量應(yīng)不超過(guò)550mg/m2，如已接受過(guò)胸部照射只為450mg/m2；兒童，25mg/m2每周一次，小于2歲的患兒或者體表面積小于0.5m的除外，這種情況下可以使用以重量為基礎(chǔ)的成人方案。注射劑量形式可獲得(基本量)20mg(作為相對(duì)21.4mg鹽酸的基本量)。例舉劑量可以為10mg/m2、20mg/m2、30mg/m2、50mg/m2、100mg/m2、150mg/m2、175mg/m2、200mg/m2、225mg/m2、250mg/m2、275mg/m2、300mg/m2、350mg/m2、400mg/m2、425mg/m2、450mg/m2、475mg/m2、500mg/m2。當(dāng)然，所有這些劑量都是列舉，任一落入這些點(diǎn)之間的劑量也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
絲裂霉素 絲裂霉素(又稱絲泰霉素和/或絲裂霉素-C)是一種分離自新生頭狀鏈霉菌的抗生素，現(xiàn)已表明其具有抗腫瘤活性。該化合物是熱穩(wěn)定性的，具有一高熔點(diǎn)，可自由溶解于有機(jī)溶劑中。
絲裂霉素可選擇性地抑制脫氧核糖核酸(DNA)的合成。鳥(niǎo)嘌呤及胞核嘧啶的含量與絲裂霉素介導(dǎo)的交聯(lián)程度相關(guān)。當(dāng)藥物高濃度時(shí)，細(xì)胞RNA及蛋白質(zhì)的合成也受到抑制。
在人體內(nèi)，靜脈給藥后絲裂霉素迅速地從血清中清除。30mg批量注射后血清濃度減少50％所需時(shí)間為17分鐘。靜脈注射30mg、20mg或10mg后，最大血清濃度分別為2.4mg/mL、1.7mg/mL和0.52mg/mL。清除主要受肝內(nèi)代謝的影響，但是其他組織內(nèi)也發(fā)生代謝。清除速率與最大血清濃度成反比，這是由于降解途徑的飽和的原因。
約占劑量10％的絲裂霉素完整地排泄入尿中。由于代謝途徑在相對(duì)低劑量時(shí)飽和，所以排放入尿中的劑量的百分隨劑量的增大而增加。就兒童而言，靜脈內(nèi)注射的絲裂霉素的排泄情況也是類似的。
放線菌素D 放線菌素D[50-76-0]；C62H86N12O16(1255.43)，一種抗能夠抑制DNA依賴性RNA聚合酶的抗癌藥。它是用于治療下列腫瘤的首選聯(lián)用方案的一種成分絨膜癌、胚橫紋肌肉瘤、睪丸腫瘤和維耳姆斯氏瘤。對(duì)全身治療無(wú)應(yīng)答的腫瘤有時(shí)會(huì)應(yīng)答局部灌注的腫瘤，放線菌素D可增強(qiáng)放療效果。它是次級(jí)(傳導(dǎo))免疫抑制劑。
放線菌素D用于與初期手術(shù)治療、放療以及其他藥物聯(lián)用，具體為長(zhǎng)春新堿和環(huán)磷酰胺?？拱┗钚栽谟纫蚴狭觥⒖ú?jì)氏肉瘤和軟組織肉瘤中也已觀察到了。放線菌素D對(duì)患有進(jìn)行性絨膜癌的婦女也有效。與苯丁酸氮芥和甲氨蝶呤聯(lián)用可以對(duì)患有轉(zhuǎn)移性睪丸癌的患者有持續(xù)的作用。有時(shí)在患有何杰金氏疾病和非何杰金氏淋巴組織瘤的患者中也可以觀察到應(yīng)答。放線菌素D也可以用于抑制免疫應(yīng)答，尤其是腎抑制排異反應(yīng)。
劑量的一半完整地排放到膽汁中，10％入尿；半衰期為約36小時(shí)。該藥物不通過(guò)血腦屏障。放線菌素D以凍干粉末的形式提供(每小管0.5mg)。常規(guī)每日劑量為10～15mg/kg；靜脈內(nèi)給藥5天；如無(wú)毒性反應(yīng)，隔3～4周后給另外的療程。兒童的每日注射量為100～400mg，共10～14天；在其他方案中，已經(jīng)使用，3～6mg/kg，總共為125mg/kg，每周保留劑量為7.5mg/kg。盡管將藥物使用到靜脈灌注的小管中更為安全，但是也已給出了直接靜脈注射，為了避免皮下反應(yīng)，應(yīng)當(dāng)注意要將從小管中取液用過(guò)的針頭丟棄。例舉劑量為100mg/m2、150mg/m2、175mg/m2、200mg/m2、225mg/m2、250mg/m2、275mg/m2、300mg/m2、350mg/m2、400mg/m2、425mg/m2、450mg/m2、475mg/m2、500mg/m2。當(dāng)然，所有這些劑量都是列舉，任一落入這些點(diǎn)之間的劑量也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
博來(lái)霉素 博來(lái)霉素是一種從一株輪枝鏈霉菌中分離的細(xì)胞毒性的糖肽類抗生素的混合物。其可以無(wú)限制地溶于水。盡管博來(lái)霉素確切的作用機(jī)制還是未知的，但是現(xiàn)有證據(jù)表明主要的作用模式是抑制DNA的合成，一些證據(jù)表明較少地抑制RNA和蛋白質(zhì)的合成。
就小鼠而言，高濃度博來(lái)霉素被發(fā)現(xiàn)于皮膚、肺、腎、腹膜和淋巴管?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)皮膚和肺的腫瘤細(xì)胞有著高濃度的博來(lái)霉素，而造血組織中的濃度較低。骨髓中博來(lái)霉素濃度較低，這與該組織中發(fā)現(xiàn)的高水平的博來(lái)霉素降解酶有關(guān)。
每分鐘肌酸酐清除大于35ml的患者，博來(lái)霉素的血清或血漿終末清除半衰期為約115分鐘。每分鐘肌酸酐清除小于35ml的患者，博來(lái)霉素的血清或血漿終末清除半衰期隨著肌酸酐清除的減小而指數(shù)級(jí)的增大。就人而言，使用劑量的60％～70％可作為活性博來(lái)霉素從尿中回收。
博來(lái)霉素被認(rèn)為是一種緩和治療?？梢元?dú)自或與治療鱗狀細(xì)胞癌的化療藥物聯(lián)用治療下列癌癥例如頭及頸部(包括口腔、舌頭、扁桃腺、鼻咽、口咽竇、上腭、唇、口腔黏膜、齒齦、會(huì)厭、喉)、皮膚、莖、子宮頸以及陰戶。它還可以用于治療淋巴瘤和睪丸癌。
由于可能出現(xiàn)抗過(guò)敏反應(yīng)，淋巴瘤患者前兩個(gè)劑量應(yīng)該用兩個(gè)單元或更少量來(lái)治療淋巴瘤患者。如無(wú)急性反應(yīng)發(fā)生，那么就可以采用常規(guī)的劑量方案。
何杰金氏疾病和睪丸腫瘤的療效是明顯的，在兩周內(nèi)就可顯效。如果此時(shí)未見(jiàn)效果，則不可能出現(xiàn)效果。磷狀細(xì)胞癌的應(yīng)答是更加緩慢，有時(shí)在出現(xiàn)效果前需要長(zhǎng)達(dá)3周的時(shí)間。博來(lái)霉素可以經(jīng)肌內(nèi)，靜脈內(nèi)，或皮下途徑給藥。
(ii)混溶劑順鉑 順鉑已廣泛地用于治療癌癥例如轉(zhuǎn)移性睪丸或卵巢癌，進(jìn)行性膀胱癌、頭頸癌、子宮頸癌、癌或者其他腫瘤。順鉑可以單獨(dú)使用，也可與其他試劑聯(lián)用，臨床使用的有效劑量為15-20mg/m2每隔3周用藥5天，共3個(gè)療程。例舉劑量可以為0.50mg/m2、1.0mg/m2、1.50mg/m2、1.75mg/m2、2.0mg/m2、3.0mg/m2、4.0mg/m2、5.0mg/m2、10mg/m2。當(dāng)然，所有這些劑量都是列舉，任一落入這些點(diǎn)之間的劑量也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
順鉑無(wú)法通過(guò)口服吸收，因此必須通過(guò)靜脈內(nèi)、皮下、腫瘤內(nèi)或腹膜內(nèi)注射來(lái)遞送。
順鉑可以與大黃素或大黃素類化合物聯(lián)合用來(lái)治療非小葉細(xì)胞肺癌。順鉑與大黃素或大黃素類化合物聯(lián)用也可以用來(lái)治療任一種神經(jīng)-介導(dǎo)的癌癥。
VP16 VP16又稱依托泊苷主要用于治療睪丸腫瘤，與博來(lái)霉素和順鉑聯(lián)用，以及與順鉑聯(lián)用用來(lái)治療肺的小葉細(xì)胞癌。它還具有抗下述病癥的活性非-何杰金氏淋巴瘤，、急性非淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、乳腺癌以及與獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)有關(guān)的卡波濟(jì)氏肉瘤。
VP16可以作為溶液形式(20mg/ml)用于靜脈內(nèi)給藥，以及制成口服用的5mg充滿脂類膠囊。就小葉細(xì)胞肺癌而言，所述靜脈內(nèi)劑量(聯(lián)合治療)可以多達(dá)100mg/m2或者低至2mg/m2，常規(guī)為35mg/m2，每天用藥共4天，也可以采用每天用藥50mg/m2共5天。當(dāng)口服給藥時(shí)，所述劑量可以加倍。因此小葉細(xì)胞肺癌的劑量可以高達(dá)200～250mg/m2。睪丸癌的靜脈用量(聯(lián)合治療)為每日用藥50～10mg/m2共5天，或者100mg/m2隔天使用，共三個(gè)劑量。通常每隔3～4周重復(fù)治療周期。為了避免高血壓和支氣管痙攣應(yīng)當(dāng)在30～60分鐘輸注過(guò)程中緩慢給藥，這有可能是由于制劑中使用的溶劑引發(fā)的。
腫瘤壞死因子 腫瘤壞死因子[TNF；Cachectin]是一種糖蛋白，它能夠殺死某些類型癌細(xì)胞、活化細(xì)胞因子的生成、活化巨噬細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞、促進(jìn)膠原及膠原酶的生成，是一種炎性介質(zhì)，還是一種腐敗性休克的介質(zhì)，并且可以加速分解代謝、促進(jìn)發(fā)熱和睡眠。一些感染因子由于TNF生成的刺激會(huì)導(dǎo)致腫瘤回歸。當(dāng)以有效量單獨(dú)使用時(shí)TNF毒性很強(qiáng)，因此最佳方案可能可能采取低劑量并聯(lián)用其他藥物。它的免疫抑制作用可以通過(guò)γ干擾素增強(qiáng)，因此這種聯(lián)用有潛在的危險(xiǎn)性。另外發(fā)現(xiàn)一種TNF與干擾素α的雜合體具有抗癌活性。
(iii)植物生物堿紅豆杉醇 紅豆杉醇是一種實(shí)驗(yàn)性抗有絲分裂劑，其分離自灰樹(shù)的樹(shù)皮，短葉紫杉(Taxus brevifolia)。它能結(jié)合微管蛋白(其位點(diǎn)與長(zhǎng)春蔓生物堿所使用的位點(diǎn)不同)并能促進(jìn)微管的組裝。紅豆杉醇目前正在臨床評(píng)估階段；它還具有抗惡性黑素瘤和卵巢癌的活性。每天的最大劑量為30mg/m2使用5天或者210-250mg/m2每隔3周給藥一次。當(dāng)然，所有這些劑量都是列舉，任一落入這些點(diǎn)之間的劑量也在本發(fā)明使用范圍之內(nèi)。
長(zhǎng)春新堿 長(zhǎng)春新堿能夠阻斷有絲分裂并出現(xiàn)中期停頓。這種藥物的上述生物活性的大部分可以從它能夠特異性結(jié)合微管蛋白并能夠阻斷蛋白質(zhì)多聚化為微管的能力得到解釋。通過(guò)有絲分裂器微管的破裂，細(xì)胞分裂在中期停頓。有絲分裂期間不能正確分離染色體可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
長(zhǎng)春新堿對(duì)于正常骨髓細(xì)胞及表皮細(xì)胞相對(duì)低的毒性使得該抗腫瘤藥物與不同于其他抗腫瘤藥物，而且它常常與其他髓抑制藥物(myclosuppressiveagents)聯(lián)用。
長(zhǎng)春堿或長(zhǎng)春新堿口服用藥之后的非預(yù)期吸收已有報(bào)道。常規(guī)臨床用量時(shí)每種藥物的濃度峰值都約為0.4mM。
長(zhǎng)春堿和長(zhǎng)春新堿結(jié)合血漿蛋白。它們廣泛地濃縮于血小板中，并且較少部分濃集于淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞中。
長(zhǎng)春新堿從血漿中的清除方式為多階段方式；終末半衰期約為24小時(shí)。該藥物在肝中代謝，但是還未鑒定到任何具有生物活性的衍生物。肝功能異常的患者應(yīng)該減小劑量。如果血漿中膽紅素的濃度大于3mg/dl(約50mM)，則建議減少至少50％的劑量。
長(zhǎng)春新堿的硫酸鹽可以溶液形式(1mg/ml)靜脈注射。將與皮質(zhì)甾類聯(lián)用是目前減少兒童白血病免除的治療選擇；這些藥物的最佳劑量為長(zhǎng)春新堿，靜脈內(nèi)，2mg/m2體表面積，每周用藥，以及脫氫皮質(zhì)(甾)醇，口服，40mg/m2，每日用藥?；加泻谓芙鹗霞膊』蚍呛谓芙鹗狭馨土龅某赡昊颊咄ǔＷ鳛閺?fù)合方案的一部分收到長(zhǎng)春新堿。當(dāng)用于MOPP治療方案時(shí)，長(zhǎng)春新堿的建議用量為1.4mg/m2。高劑量長(zhǎng)春新堿似乎對(duì)于患有白血病的兒童來(lái)說(shuō)似乎比成年人能更好的耐受，成年人可能經(jīng)受嚴(yán)重的神經(jīng)毒性。以比每隔7天更高的頻度或以更大劑量施用時(shí)會(huì)增加毒性程度但反應(yīng)速率并沒(méi)有相應(yīng)加快。靜脈施用長(zhǎng)春新堿時(shí)應(yīng)當(dāng)注意避免溢出。長(zhǎng)春新堿(以及長(zhǎng)春堿)可以輸注到為腫瘤提供的動(dòng)脈血中，其劑量可比那些帶有相應(yīng)毒性靜脈輸注的藥物的劑量大數(shù)倍。
長(zhǎng)春新堿在何杰金氏疾病及其他淋巴瘤中已經(jīng)顯示了療效。盡管單獨(dú)用于何杰金氏疾病時(shí)其效果略差于長(zhǎng)春堿，但是當(dāng)與氮芥、脫氫皮質(zhì)(甾)醇，及甲基芐肼聯(lián)用(即所謂的MOPP治療方案)時(shí)，它是該病后期(III和IV期)的優(yōu)選治療藥物。就非何杰金氏淋巴瘤而言，長(zhǎng)春新堿是一種重要的藥物，特別是與環(huán)磷酰胺、博來(lái)霉素、阿霉素和脫氫皮質(zhì)(甾)醇聯(lián)用時(shí)。在淋巴細(xì)胞性白血病中長(zhǎng)春新堿比長(zhǎng)春堿更有效?；加卸喾N其他腫瘤的患者，特別是維耳姆斯氏瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、腦瘤、橫紋肌肉瘤、和乳腺癌、膀胱癌、男性或女性生殖系統(tǒng)的患者已經(jīng)報(bào)道了良好的療效。
長(zhǎng)春新堿的用量由臨床醫(yī)師根據(jù)患者個(gè)體需要來(lái)確定?？梢允┯?.01～0.03mg/kg或者0.4～1.4mg/m2或者也可以按1.5～2mg/m2施用。替代地，可以連續(xù)靜脈輸注的方式按下列劑量給藥0.02mg/m2、0.05mg/m2、0.06mg/m2、0.07mg/m2、0.08mg/m2、0.1mg/m2、0.12mg/m2、0.14mg/m2、0.15mg/m2、0.2mg/m2、0.25mg/m2。當(dāng)然，所有這些劑量都是列舉，任一落入這些點(diǎn)之間的劑量也在本發(fā)明使用范圍之內(nèi)。
長(zhǎng)春堿 當(dāng)用長(zhǎng)春堿溫育細(xì)胞時(shí)，發(fā)生微管分解。已經(jīng)報(bào)道了口服長(zhǎng)春堿或長(zhǎng)春新堿后的非預(yù)期吸收。常規(guī)臨床用量時(shí)每種藥物的濃度峰值都約為0.4mM。長(zhǎng)春堿和長(zhǎng)春新堿結(jié)合血漿蛋白。它們廣泛地濃縮于血小板中，并且較少部分濃集于淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞中。
靜脈注射后，長(zhǎng)春堿從血漿中的清除方式為多階段方式；分布后，藥物從血漿中消失的半衰期約為1～20小時(shí)。
長(zhǎng)春堿在肝內(nèi)代謝成生物活性衍生物脫乙?；L(zhǎng)春堿。約占施用劑量15％可以在尿中完整地檢測(cè)到，并且膽汁排泄后約10％可從糞便中回收。肝功能異常的患者應(yīng)該減小劑量。如果血漿中膽紅素的濃度大于3mg/dl(約50mM)，則建議減少至少50％的劑量。
長(zhǎng)春堿的硫酸鹽可以制成注射液的制劑形式。該藥物靜脈給藥；特別注意要防止皮下溢出，由于這會(huì)導(dǎo)致發(fā)炎和潰瘍。這種藥物不要注射到引發(fā)損害循環(huán)的極點(diǎn)。0.3mg/kg體重的單劑量后，髓抑制7～10天到達(dá)最大。如果不能將白細(xì)胞保持在中等水平(約3000細(xì)胞/mm3)，那么就可以通過(guò)0.05mg/kg體重的增量來(lái)逐漸增加每周劑量。在為治愈睪丸癌而設(shè)計(jì)的方案中，無(wú)論血細(xì)胞數(shù)量或毒性如何，長(zhǎng)春堿的劑量都為每3周0.3mg/kg。
長(zhǎng)春堿最重要的用途是與博來(lái)霉素及順鉑聯(lián)用于轉(zhuǎn)移性睪丸腫瘤的治療中。各種淋巴瘤，特別是何杰金氏疾病中已取得了良好的療效，其中50～90％的病例有了顯著的改善。當(dāng)淋巴瘤對(duì)烷基化劑有抗性時(shí)，長(zhǎng)春堿在大部分淋巴瘤中的效果都不會(huì)減弱。它在卡波濟(jì)氏肉瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、以及累-賽二氏疾病(組織細(xì)胞增多病x)、以及婦女的胸腺及絨(毛)膜癌中都具有活性。
長(zhǎng)春堿的用量由臨床醫(yī)師根據(jù)患者個(gè)體需要來(lái)確定?？梢允┯?.1～0.3mg/kg或者也可以施用1.5～2mg/m2。替代地，可以按照0.1mg/m2、0.12mg/m2、0.14mg/m2、0.15mg/m2、0.2mg/m2，、0.25mg/m2、0.5mg/m2、1.0mg/m2、1.2mg/m2、1.4mg/m2、1.5mg/m2、2.0mg/m2、2.5mg/m2、5.0mg/m2、6mg/m2、8mg/m2、9mg/m2、10mg/m2、20mg/m2給藥。當(dāng)然，所有這些劑量都是列舉，任一落入這些點(diǎn)之間的劑量也在本發(fā)明使用范圍之內(nèi)。
(iv)烷基化劑卡氯芥 卡氯芥(無(wú)菌的卡氯芥)是一種用于治療某種腫瘤疾病的亞硝基脲。它是1，3-二(2-氯乙基)-1-亞硝基脲。它為凍干的淺黃色絮片或分子量約214.06的凝塊。在乙醇和脂類中高度可溶，微溶于水?？冉姘凑照f(shuō)明書(shū)重配后靜脈輸注給藥。通常，無(wú)菌卡氯芥的包裝為凍干形式裝于100mg的單劑量小瓶中。
盡管通常認(rèn)為卡氯芥會(huì)將使DNA和RNA烷基化，但是它并不與其他烷基化劑交互抵觸。如同其他亞硝基脲一樣，它也可以通過(guò)將蛋白質(zhì)中的氨基酸氨甲酰化來(lái)抑制幾種酶促過(guò)程。
卡氯芥被認(rèn)為是一種緩和治療作為單一藥物或者與其他在腦瘤中顯效的化療藥物聯(lián)用建立聯(lián)合治療，例如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、星細(xì)胞瘤、室鼓膜瘤、以及轉(zhuǎn)移性腦瘤。還可以與脫氫皮質(zhì)(甾)醇聯(lián)用治療多發(fā)性骨髓瘤。現(xiàn)已證明卡氯芥可以用于治療何杰金氏疾病和非-何杰金氏淋巴瘤，作為次級(jí)治療與其他在下述患者中顯效的藥物聯(lián)用初級(jí)治療時(shí)會(huì)復(fù)發(fā)的患者，或者對(duì)初級(jí)治療不應(yīng)答的患者。
卡氯芥作為單一藥物用于此前未接受任何處理的患者時(shí)，其建議用量為150～200mg/m2每隔6周靜脈內(nèi)給藥。這既一次性給藥也可以分成每日注射，例如連續(xù)兩天施用75～100mg/m2。當(dāng)卡氯芥與其他髓抑制藥物聯(lián)用或者用于骨髓儲(chǔ)量耗盡的患者時(shí)，應(yīng)對(duì)劑量相應(yīng)調(diào)整。初始劑量之后的用量應(yīng)當(dāng)根據(jù)患者對(duì)于在前劑量的血液學(xué)反應(yīng)進(jìn)行調(diào)整。當(dāng)然可以理解到其他劑量也可以用于本發(fā)明，例如10mg/m2、20mg/m2、30mg/m2、40mg/m2、50mg/m2、60mg/m2、70mg/m2、80mg/m2、90mg/m2、100mg/m2。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以參考“Remington′s Pharmaceutical Sciences”第15版，第61章。必要時(shí)根據(jù)所要治療對(duì)象的情況對(duì)劑量做一些改變。無(wú)論何種情況，負(fù)責(zé)給藥的人員都應(yīng)當(dāng)根據(jù)對(duì)象個(gè)體來(lái)確定合適的劑量。
美法侖 美法侖又稱左旋溶肉瘤素、L-苯基丙氨酸芥、苯基丙氨酸芥、L-PAM或L-溶肉瘤素，其是氮芥的苯基丙氨酸衍生物。美法侖是一種雙功能的烷基化試劑，具有抗選擇性人腫瘤疾病的活性?；瘜W(xué)上稱為4-[二(2-氯乙基)氨基]-L-苯基丙氨酸。
美法侖是該化合物的活性L-異構(gòu)體，由Bergel和Stock于1953年首次合成；D-異構(gòu)體，稱為抗瘤氨酸，具有較低的抗動(dòng)物腫瘤活性，其影響染色體的需要量要比L-異構(gòu)體大。消旋的(DL-)形式稱為抗瘤氨酸(merphalan)或溶肉瘤素(sarcolysin)。美法侖不溶于水，其pKa1的值為-2.1。美法侖可以制成口服的片劑，已經(jīng)用于治療多發(fā)性骨髓瘤。
現(xiàn)有證據(jù)表明，約1/3～1/2患有多發(fā)性骨髓瘤的患者口服該藥后都表現(xiàn)出了良性應(yīng)答。
美法侖已經(jīng)用于治療上皮細(xì)胞卵巢癌。用于治療卵巢癌常規(guī)方案為單一療程、共5天、每天用量為0.2mg/kg。每隔4～5周重復(fù)療程，視血液學(xué)耐受程度而定(Smith和Rutledge，1975；Young等，1978)。替代地，美法侖使用量可以低至0.05mg/kg/天或者高達(dá)3mg/kg/天或者落在這些劑量之間或者超過(guò)這些劑量的任一劑量。必要時(shí)根據(jù)所要治療對(duì)象的情況對(duì)劑量做一些改變。無(wú)論何種情況，負(fù)責(zé)給藥的人員都應(yīng)當(dāng)根據(jù)對(duì)象個(gè)體來(lái)確定合適的劑量。
環(huán)磷酰胺 環(huán)磷酰胺是2H-1，3，2-Oxazaphosphorin-2-胺、N，N-二(2-氯乙烯基)四氫-2-氧化物、一水合物；購(gòu)自Mead Johnson的名為癌得散(Cytoxan)的產(chǎn)品；購(gòu)自Adria的名為Neosar的產(chǎn)品。環(huán)磷酰胺是在三乙胺催化的條件下由3-氨基-1-丙醇與N，N-二(2-氯乙基)二氯氨基磷酸[(ClCH2CH)2N-POCl2]在二氧雜環(huán)己烷溶液中縮合合成。縮合反應(yīng)是雙相的，涉及羥基和氨基，因此會(huì)影響環(huán)化。
與其他β-氯乙胺烷基化劑不同，在肝細(xì)胞酶活化之前它不易環(huán)化成活性的乙基ethyleneimonium形式。因此，該物質(zhì)在胃腸道中是穩(wěn)定的，口服或非腸道給藥的耐受性好并且有效，而且不會(huì)引起局部起皰、壞死、靜脈炎或者甚至疼痛。
成人的合適用量包括，口服，1～5mg/kg/天(通常聯(lián)用)，根據(jù)胃腸道耐受程度而定；或者1～2mg/kg/天；靜脈內(nèi)，2～5天期間分割劑量初始為40～50mg/kg或者每隔7～10天、10～15mg/kg/天或每周2次3～5mg/kg或1.5～3mg/kg/天?？梢杂?50mg/kg/天的劑量抗腫瘤。由于胃腸道的副作用，所以優(yōu)選靜脈內(nèi)途徑。保持期間，通常期望的白細(xì)胞數(shù)目為3000～4000/mm3。該藥物也可以肌內(nèi)給藥，通過(guò)滲透或進(jìn)入體腔。劑量形式還可以采用注射100、200及500mg，以及片劑25及50mg，有關(guān)用量的細(xì)節(jié)本領(lǐng)域技術(shù)人員可以參考″Remington′s Pharmaceutical Sciences″第15版，第61章，在此引入作為參考。
苯丁酸氮芥 苯丁酸氮芥(又稱瘤可寧)由Everett等人(1953)首次合成。是一種雙功能的烷基化試劑，具有抗選擇性人腫瘤疾病的活性?；瘜W(xué)上稱為4-[二(2-氯乙基)氨基]-苯丁酸。
苯丁酸氮芥可以采取口服給藥，它可被胃腸道迅速并完全地吸收。單一口服劑量為0.6-1.2mg/kg，血漿苯丁酸氮芥水平服藥后1小時(shí)達(dá)到峰值，parentdrug藥物的終末半衰期為1.5小時(shí)?？梢园凑?.1～0.2mg/kg/天或3～6mg/m2/天或替代地0.4mg/kg的量用于抗腫瘤治療。治療方案為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，可參見(jiàn)“Physicians Desk Reference”和”Remingtons Pharmaceutical Sciences”作為參考。
苯丁酸氮芥可用于治療慢性淋巴(淋巴細(xì)胞)白血病、惡性淋巴瘤包括淋巴肉瘤、巨淋巴小結(jié)的淋巴瘤以及何杰金氏疾病。雖然該藥物不能治療上述的任一病癥，但是可以臨床上起到減緩的作用。
白消安 白消安(又稱馬勒蘭)是一種雙功能烷基化劑，化學(xué)上稱為1，4-丁二醇二甲基磺酸鹽(dimethanesulfonate)。
白消安是氮芥的一種結(jié)構(gòu)類似物。白消安可以片劑形式口服。每一片中含2mg白消安以及非活性成分硬脂酸鎂和氯化鈉。
白消安對(duì)于慢性骨髓性(骨髓瘤、骨髓細(xì)胞、粒細(xì)胞)白血病有指示。盡管沒(méi)有治療意義，但是白消安可以減少粒細(xì)胞的量、減輕疾病癥狀和改善患者的臨床狀態(tài)。慢性骨髓性白血病此前未經(jīng)治療的成年患者中約90％通過(guò)使用白消安后內(nèi)臟巨大退化或穩(wěn)定而獲得了血液緩解。表明從存活時(shí)間和血球蛋白水平保持的角度來(lái)看，該藥物優(yōu)于脾臟照射，等效于對(duì)照用脾大上的照射。
洛莫司汀 洛莫司汀是一種用于治療某種腫瘤疾病的亞硝基脲。它是1-(2-氯-乙基)-3-環(huán)己基-1亞硝基脲。它是一種黃色粉末，實(shí)驗(yàn)式為C9H16ClN3O2，分子量為233.71。洛莫司汀可溶于10％乙醇(0.05mg/mL)以及無(wú)水酒精(70mg/mL)。洛莫司汀相對(duì)不溶于水(＜0.05mg/mL)。相對(duì)統(tǒng)一為生理pH值。洛莫司汀膠囊中的非活性成分是硬脂酸鎂和甘露醇。
盡管通常認(rèn)為洛莫司汀會(huì)將DNA和RNA烷基化，但是它并不與其他烷基化劑交互抵觸。如同其他亞硝基脲一樣，它也可以通過(guò)將蛋白質(zhì)中的氨基酸氨甲?；瘉?lái)抑制幾種酶促過(guò)程。
其可以口服，口服劑量為30mg/m2～100mg/m2的放射性洛莫司汀后，所給的降解活性約一半在24小時(shí)內(nèi)以降解產(chǎn)物的形式排泄。
代謝物的血清半衰期為16小時(shí)～2天。靜脈給藥15分鐘后，組織水平與血漿水平相當(dāng)。
除其他治療形態(tài)外，洛莫司汀可以用作單一藥劑，或者用于已有的聯(lián)合治療，與其他在原發(fā)及轉(zhuǎn)移性腦瘤顯效的化療藥物聯(lián)用，用于已經(jīng)接受了外科手術(shù)和/或放療的患者?，F(xiàn)已證明洛莫司汀在抗何杰金氏疾病的次級(jí)治療中有效，與其他在下述患者中顯效的藥物聯(lián)用初級(jí)治療時(shí)會(huì)復(fù)發(fā)的患者，或者對(duì)初級(jí)治療不應(yīng)答的患者。
當(dāng)洛莫司汀對(duì)預(yù)先未接受治療的患者單獨(dú)用藥時(shí)，建議劑量為每隔6周單一口服劑量130mg/m2。就骨髓功能易受損害的患者而言，該劑量應(yīng)當(dāng)減小至每隔6周100mg/m2。當(dāng)洛莫司汀與其他骨髓抑制藥物聯(lián)用時(shí)，應(yīng)對(duì)劑量進(jìn)行調(diào)整。應(yīng)當(dāng)理解到的是可以使用其他劑量，例如20mg/m2、30mg/m2、40mg/m2、50mg/m2、60mg/m2、70mg/m2、80mg/m2、90mg/m2、100mg/m2、120mg/m2或其他任一位于這些數(shù)值之間的劑量，這需要由臨床醫(yī)師根據(jù)接受治療個(gè)體的情況來(lái)決定。
b)放療試劑放療試劑及因素包括放射以及能夠?qū)е翫NA損傷的波，例如γ-照射、X-射線、UV-照射、微波、電子發(fā)射、放射性同位素等。通過(guò)用上述的照射形式對(duì)定位后的腫瘤位點(diǎn)進(jìn)行照射可以達(dá)到治療的目的。最大可能是所有這些因素會(huì)大范圍地?fù)p傷DNA、破壞DNA前體、影響DNA的復(fù)制及修復(fù)，以及染色體的組配及維持。
X-射線的劑量范圍為從每日劑量50～200倫琴，長(zhǎng)時(shí)間段(3～4周)，到單劑量2000～6000倫琴。放射性核素的用量差異很大，這取決于核素的半衰期、放射發(fā)射強(qiáng)度及類型以及腫瘤細(xì)胞的攝入。
c)外科治療大約60％的癌癥患者都會(huì)接受某種類型的外科治療，其中包括預(yù)防性、診斷及分類性、治療及減緩性手術(shù)。治療性手術(shù)是一種可以與其他治療手段聯(lián)用的癌癥治療手段，例如與本發(fā)明所述治療方法、化療、放療、激素療法，基因治療、免疫治療和/或替代療法。
治療性外科手術(shù)包括切除術(shù)，在此過(guò)程中全部或部分癌組織被物理性地去除、切割和、或破壞。腫瘤切除術(shù)是指機(jī)械地除去至少部分腫瘤。除腫瘤切除術(shù)外，外科治療方法還包括激光手術(shù)、冷凍手術(shù)，電外科以及纖維控制手術(shù)(莫爾式手術(shù))。進(jìn)一步表明本發(fā)明可以與表面癌、前期癌或者偶然量的正常組織的摘除配合使用。
當(dāng)將一部分癌細(xì)胞、組織或者腫瘤切除時(shí)，體內(nèi)會(huì)形成一個(gè)空腔。通過(guò)灌注、直接注射或局部使用結(jié)合另外的抗癌治療手段達(dá)到治療目的。這些治療手段可以重復(fù)，間隔1、2、3、4、5、6或7天，或者間隔1、2、3、4和5周或者間隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)月。這些治療在劑量上也可以不同。
d)免疫治療免疫治療通常依賴于免疫效應(yīng)細(xì)胞及分子來(lái)定位并破壞癌細(xì)胞。所述免疫效應(yīng)物可以是，例如特異于某一腫瘤細(xì)胞表面的某一標(biāo)記的抗體。該抗體本身可以用作治療的效應(yīng)物，或者它可以征集其他實(shí)際上具有殺死細(xì)胞能力的細(xì)胞。還可以將所述抗體偶合到一種藥物或毒素(化療、放射性核素、蓖麻毒蛋白A鏈、霍亂毒素、百日咳毒素等)上并且僅作為一種靶向試劑來(lái)使用。替代地，所述效應(yīng)物可以是一帶有表面分子的淋巴細(xì)胞，該表面分子能夠直接或間接地與腫瘤細(xì)胞的靶位相互作用。各種效應(yīng)細(xì)胞包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞和NK細(xì)胞。免疫治療也可以用作聯(lián)合治療的一部分，與基于以E1A為基礎(chǔ)的基因治療上的治療手段聯(lián)用。
接下來(lái)討論聯(lián)合治療的常規(guī)方法。一方面，所述免疫治療可以用來(lái)定位腫瘤細(xì)胞。存在著許多的腫瘤標(biāo)記，它們中的任一種都適于本發(fā)明所述的定位。常見(jiàn)的腫瘤標(biāo)記包括癌胚抗原、前列腺特定抗原、尿腫瘤相關(guān)抗原、胎兒抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、Sialyl Lewis抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激素受體、層粘連蛋白受體、erb B以及p155。還有交替免疫刺激分子，包括細(xì)胞因子例如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN、趨化因子(chemokine)例如MIP-1、MCP-1、IL-8以及生長(zhǎng)因子例如FLT3配體。將免疫刺激分子與本發(fā)明所述的基于以E1A為基礎(chǔ)的基因治療的聯(lián)合治療方法聯(lián)用，將會(huì)增強(qiáng)抗腫瘤的效果。
(i)被動(dòng)免疫治療 現(xiàn)有多種不同被動(dòng)免疫治療癌癥的方法。廣義上可以分為下列類型單獨(dú)注射抗體；注射抗體與毒素或化療藥物偶聯(lián)在一起；注射偶聯(lián)有放射性核素的抗體；注射抗獨(dú)特型抗體；以及最終，凈化骨髓中的腫瘤細(xì)胞。
(ii)主動(dòng)免疫治療 主動(dòng)免疫治療中，施用一種抗原性肽、多肽或蛋白、或者一種自身或異源腫瘤細(xì)胞組合物或“疫苗”，通常配以一獨(dú)特的細(xì)菌佐劑(Ravindranath和Morton，1991；Morton和Ravidranath，1996；Morton等人，1992；Mitchell等人，1990；Mitchell等人，1993)。
(iii)獲得性免疫治療 在獲得性免疫治療中，體外分離患者的循環(huán)淋巴細(xì)胞、或其浸潤(rùn)細(xì)胞，用IL-2活化或用腫瘤壞死基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，然后重新給予(Rosenberg等人，1988；1989)。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，將免疫有效量的活化淋巴細(xì)胞與本發(fā)明所述的引入佐劑的抗原性肽組合物聯(lián)用，給予動(dòng)物。所述的活化淋巴細(xì)胞最優(yōu)選為患者自身的細(xì)胞，這樣就更容易從血液或腫瘤樣品中分離，并體外活化(或“膨脹”)。
e)基因治療在另一個(gè)實(shí)施方案中，將其他基因治療手段與本發(fā)明所述的以E1A為基礎(chǔ)的基因治療聯(lián)用。根據(jù)該實(shí)施方案適合使用的基因?yàn)榫幋a下列物質(zhì)的基因腫瘤抑制因子(p53、Rb、p16)、反義癌基因(ras、myc、erb)、凋亡誘導(dǎo)物(Bcl-2、Bax)、激酶以及其他這類基因。
f)其他試劑還提了供可以與本發(fā)明聯(lián)用以增強(qiáng)療效的其他試劑。一種適于與化療聯(lián)用的治療形式包括高熱，它是一種將患者組織暴露于高溫(達(dá)106°F)。外源或內(nèi)源性供熱裝置可以提供局部、區(qū)域或者全身高熱。局部高熱是指向一小的面積例如腫瘤供熱。熱量可以由從肌體之外的裝置靶向腫瘤的高頻波從外部提供。內(nèi)熱使用的是一根滅菌探針，其中包括細(xì)的加熱金屬絲或者充滿熱水的中空管、植入微波天線或者射頻(radiofrequency)電極。
患者器官或四肢的加熱為局部治療，它可以利用能產(chǎn)生高能的裝置實(shí)現(xiàn)，例如磁鐵。替代地，可以在灌注入將要內(nèi)源加熱的區(qū)域前取出少量患者的血液并加熱。當(dāng)癌癥擴(kuò)散到全身時(shí)還要進(jìn)行全身加熱。熱水敷層、熱蠟、感應(yīng)線圈以及溫盒都可以用于該目的。
激素治療也可以與本發(fā)明聯(lián)用。激素可以用于某些癌癥例如乳腺、前列腺、卵巢、或子宮頸的治療中，從而降低某些激素，例如睪丸激素或雌激素的水平或者阻斷其作用，這樣可以減小轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)。
E.實(shí)施例給出下列實(shí)施例是為了對(duì)優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行說(shuō)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是實(shí)施例中公開(kāi)的技術(shù)是本發(fā)明人為了能很好地實(shí)施本發(fā)明而提供的代表性技術(shù)，因而可以認(rèn)為是實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選模式。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的特定實(shí)施例所做的任何變化，以及同樣或類似的結(jié)構(gòu)，皆不超過(guò)本發(fā)明的精神和范圍。
實(shí)施例1材料和方法細(xì)胞系和培養(yǎng)人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞在添加10％胎牛血清的杜拜克改進(jìn)的Eagle’s培養(yǎng)基/F-12(Life Technologies，Inc.)中生長(zhǎng)。用pSV-E1A-neo質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞建立E1A穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，同時(shí)將pSV-neo載體轉(zhuǎn)染到上述細(xì)胞中作為轉(zhuǎn)染對(duì)照。通過(guò)G418篩選(750μg/ml)分離穩(wěn)定的細(xì)胞系，并通過(guò)western印跡分析驗(yàn)證。胸苷整合分析該分析如前所述進(jìn)行。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將細(xì)胞用胰蛋白酶消化，在96-孔板上鋪板(3×103個(gè)細(xì)胞/孔)，然后于各孔中加入0.5μCi[3H]胸苷培養(yǎng)5小時(shí)。然后除去標(biāo)記培養(yǎng)基，并用PBS沖洗。用50μl的1％的胰蛋白酶/PBS使各孔中的細(xì)胞釋放出來(lái)，然后用自動(dòng)細(xì)胞收獲儀溶解細(xì)胞，將DNA吸附到玻璃纖維濾膜上。干燥濾膜，封進(jìn)含有10ml閃爍體的樣品管中。通過(guò)在Betaplate液體閃爍記錄儀中進(jìn)行閃爍記數(shù)測(cè)定濾膜上存在的放射性。
MTT分析利用活細(xì)胞接觸紫杉酚后將四唑鹽(MTT)代謝轉(zhuǎn)化為甲對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行間接測(cè)定。將細(xì)胞(3×103/孔)在每孔含0.2ml培養(yǎng)基的96-孔培養(yǎng)板上接種三次，使細(xì)胞粘附24小時(shí)。接觸紫杉酚一定時(shí)間后，向各孔加入20μl的MTT。細(xì)胞再次培養(yǎng)2小時(shí)，然后加入100μl的提取緩沖液(20％SDS在50％的N，N-二甲基甲酰胺中，pH4.7)。將細(xì)胞在37℃培養(yǎng)過(guò)夜，測(cè)定平板在570nm的吸收度。
制備總-細(xì)胞溶解液，Western印跡分析和抗體將細(xì)胞用磷酸鹽緩沖的鹽水沖洗一次，在含20mM Tris-HCl(pH 7.5)、150mM NaCl、5mM EDTA、10mM NaF、1％Nonidet P-40、1mM PMSF(苯甲基磺?；?、1mM NaVO3(原釩酸鈉)、和1.5％抑肽酶的溶胞緩沖液中溶解細(xì)胞。離心分離細(xì)胞提取物，通過(guò)Bio-Rad蛋白質(zhì)分析試劑測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度，利用BSA(牛血清白蛋白，Sigma，St.Louis，WA)作為蛋白標(biāo)準(zhǔn)品在分光光度計(jì)中分析，然后用標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)25微克蛋白質(zhì)液進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PEGE)分析，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上(Millipore Corp.，Bedford，MA)。然后對(duì)膜進(jìn)行Western印跡，用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(ECL)系統(tǒng)(Amersham)對(duì)印跡顯影。
用下列抗體進(jìn)行免疫印跡抗E1A蛋白的單克隆抗體M58(PharMingen)被用于在穩(wěn)定細(xì)胞克隆中篩選E1A蛋白的表達(dá)。從Santa Cruz Biotechnology，Inc.(Santa Cruz，CA)購(gòu)買(mǎi)兔抗-Bax多克隆抗體和倉(cāng)鼠抗-人Bcl-2單克隆抗體。從NEB購(gòu)買(mǎi)兔抗磷酸-特異性p38(p38-p)、磷酸-特異性Akt(Akt-p)、和總p38或Akt多克隆抗體。為了檢測(cè)HA-標(biāo)記的p38和Akt，使用單克隆抗-HA抗體(Boerhinger和Mannheim)。
瞬時(shí)轉(zhuǎn)染在該研究中使用用于HA-標(biāo)記的p38MAPK(pMT2T，HA-p38)、HA-myr-Akt(組成性地被激活的Akt，CA-Akt)或HA標(biāo)記的顯性陰性Akt(DN-Akt)的表達(dá)載體，以及細(xì)胞巨化病毒(CMV)啟動(dòng)子-熒光素酶表達(dá)載體(pCMV-luc)。如以前所述應(yīng)用DC-Chol陽(yáng)離子脂質(zhì)體，用2.2μg總DNA轉(zhuǎn)染直徑60mm平皿中的1×105個(gè)細(xì)胞。再次生長(zhǎng)48小時(shí)后，將細(xì)胞分成三組，一組細(xì)胞用于接觸或不接觸紫杉酚24小時(shí)后，進(jìn)行熒光素酶分析，另一組用于分析Akt和38蛋白的表達(dá)，第三組進(jìn)行FACS分析。
免疫沉淀用HA-標(biāo)記的p38和/或CA-Akt瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，用10μM胰島素刺激細(xì)胞15分鐘，然后于4℃在含50mM HEPES、pH7.6、150mM NaCl、10mM EDTA、2mM原礬酸鈉、100mM NaF、0.5mM PMSF、1mM抑肽酶和1％tritonX-100的緩沖液中溶解細(xì)胞15min，制備細(xì)胞提取物。在14,000rpm下離心細(xì)胞溶解液30分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到新試管中。加入正常小鼠或兔IgG，清除蛋白質(zhì)，用抗-p38、抗-Akt、或抗-HA抗體免疫沉淀。免疫沉淀物在10％SDS-PEGE上溶解分散，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。通過(guò)Western印跡檢測(cè)Akt和p38。用抗-IKK-a抗體作為探針通過(guò)Western印跡對(duì)同樣的膜進(jìn)行分析，作為Akt免疫沉淀的陽(yáng)性對(duì)照。
常位乳腺癌模型的建立為了在裸鼠中建立常位乳腺癌模型，將人MDA-MB-231細(xì)胞接種到小鼠乳腺脂肪墊(m.f.p.)中。監(jiān)測(cè)腫瘤大小，每周測(cè)量尺寸。
實(shí)施例2Akt和p38在癌細(xì)胞中的表達(dá)Akt的磷酸鹽形式代表活化/過(guò)表達(dá)的Akt。在篩選中發(fā)現(xiàn)，與在不死的NIH3T3非-癌細(xì)胞中相比，活化Akt水平在大多數(shù)癌細(xì)胞中增加。一些被篩選的代表性人癌細(xì)胞類型包括乳腺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、和結(jié)腸癌細(xì)胞系。相比較而言，代表p38活性形式的磷酸化p38蛋白在大多數(shù)癌細(xì)胞中未檢測(cè)到。然而，在相同蛋白質(zhì)含量條件下，在不死NIH3T3非-癌細(xì)胞中檢測(cè)到磷酸化p38蛋白。這證明大多數(shù)癌上調(diào)或激活了Akt致瘤蛋白，并下調(diào)或滅活原-細(xì)胞凋亡因子p38。
實(shí)施例3E1A下調(diào)乳腺癌細(xì)胞中的Akt和上調(diào)p38磷酸化用單獨(dú)載體(V)(作為對(duì)照)或用E1A(E)轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7，然后生長(zhǎng)到指數(shù)生長(zhǎng)期、收獲、制備全細(xì)胞溶解液。通過(guò)分別抗磷酸-p38和磷酸-AktS437(New England Biolab，NEB)的多克隆抗-磷酸-特異性抗體檢測(cè)活化磷酸化p38(p38-p)和磷酸化Akt(Akt-p)(圖1A)。同時(shí)利用來(lái)自NEB的抗p38和Akt的多克隆抗體檢測(cè)總p38和Akt蛋白(圖1A)。為了驗(yàn)證E1A在穩(wěn)定細(xì)胞中的表達(dá)，使用抗E1A(M58)的單克隆抗體(也參見(jiàn)圖1A)。用單獨(dú)載體轉(zhuǎn)染的兩種細(xì)胞系中磷酸-p38蛋白水平均在可檢測(cè)范圍內(nèi)，然而，導(dǎo)入E1A蛋白，磷酸p-38的水平上調(diào)。相比較而言，基礎(chǔ)磷酸-Akt水平在用單獨(dú)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中比在用E1A轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中高，雖然總p38和Akt蛋白水平在不同轉(zhuǎn)染體中是可比較的。
通過(guò)用密度計(jì)量?jī)x轉(zhuǎn)化圖3A中顯示的色帶密度(下面將詳細(xì)描述)，比較載體和E1A穩(wěn)定細(xì)胞之間的比較量差異。分別描記相對(duì)p38活性(p38-p對(duì)p38-c)和相對(duì)Akt活性(Akt-p/Akt-c)。結(jié)果在圖1B中顯示。
應(yīng)用抗p38和Akt的抗-磷酸特異性抗體得到的結(jié)果一致，通過(guò)應(yīng)用GST-ATF-2融合蛋白作為p38激酶的底物，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)E1A在MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)顯著增強(qiáng)p38激酶的活性。同時(shí)，通過(guò)應(yīng)用GST-GSK-3-β作為底物進(jìn)行的Akt-激酶分析檢測(cè)到，在這些E1A表達(dá)細(xì)胞中Akt激酶活性顯著被抑制。
分析了E1A抑制胰島素誘導(dǎo)的Akt激活的能力。細(xì)胞在血清饑渴條件下培養(yǎng)過(guò)夜，然后用或不用10μM胰島素刺激15分鐘。然后收獲細(xì)胞，應(yīng)用抗磷酸-特異性Akt多克隆抗體檢測(cè)Akt的磷酸化(其是Akt的活性形式)。還檢測(cè)了總Akt水平，作為蛋白質(zhì)含量的對(duì)照。結(jié)果在圖2中顯示。
實(shí)施例4Akt和p38被反向調(diào)節(jié)為了確定Akt途徑和p38途徑之間的關(guān)系，用這兩個(gè)途徑的抑制劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用渥曼青霉素抑制Akt途徑。渥曼青霉素是抑制PI3K的藥物，其是Akt途徑中Akt直接上游的信號(hào)蛋白。一種合成化合物，SB203580，用作p38特異性抑制劑。細(xì)胞在血清饑渴條件下過(guò)夜，然后用SB203580(20μM)或渥曼青霉素(0.1μM)處理4小時(shí)、8小時(shí)、16小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)。在E1A穩(wěn)定表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞中，當(dāng)用SB203580處理8小時(shí)阻斷p38活性時(shí)，Akt活性約增加3倍。而當(dāng)渥曼青霉素處理4小時(shí)阻斷Akt活性時(shí)，p38活性約增加6倍。相對(duì)p38活性(p38-p對(duì)p38-c)和相對(duì)Akt活性(Akt-p對(duì)Akt-c)分別在圖3A、圖3B和圖3C中顯示。
實(shí)施例5Akt和p38非物理相連為了檢測(cè)p38和Akt是否物理相連，進(jìn)行免疫沉淀分析。用HA-標(biāo)記的組成性活化Akt和野生型p38共轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞(231)和293T細(xì)胞。溶解細(xì)胞，轉(zhuǎn)染36小時(shí)后收獲。分別用抗Akt和p38的多克隆抗體與細(xì)胞溶解液共同培養(yǎng)。用蛋白A-瓊脂糖小珠沉淀后，沖洗下小珠上的蛋白質(zhì)，溶解于30ml 2x裝樣緩沖液，然后進(jìn)行10％SDS-PEGE。轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上后，用抗-Akt(1∶500)和抗-p38(1∶500)抗體作為探針?lè)治瞿?。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在圖3D中顯示說(shuō)明。
實(shí)施例6E1A在體外抑制細(xì)胞生長(zhǎng)需要磷酸-Akt的下調(diào)或磷酸-p38的上調(diào)親代MDA-MB-231和E1A穩(wěn)定細(xì)胞在六孔板中鋪板三次，生長(zhǎng)24小時(shí)后，用顯性陰性Akt(DN-Akt)或活化的p38加pcDNA3-熒光素酶報(bào)告物共轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞，而用pcDNA3-熒光素酶報(bào)告物或組成性活化Akt(CA-Akt)表達(dá)構(gòu)建體，加pcDNA3-熒光素酶報(bào)告物基因共轉(zhuǎn)染231-E1A穩(wěn)定細(xì)胞。細(xì)胞再次生長(zhǎng)48小時(shí)，之后收獲。然后測(cè)定熒光素酶活性，用蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)化，將這些值與親代MDA-MB-231細(xì)胞相比較。應(yīng)用SB203580(以20μM的濃度加入培養(yǎng)基)，抑制p38的活性。在存在SB203580的條件下，使細(xì)胞生長(zhǎng)24小時(shí)，之后收獲用于熒光素酶分析。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在圖4中顯示，結(jié)果證明Akt的滅活或p38的激活對(duì)于E1A抑制細(xì)胞生長(zhǎng)是必要的。
實(shí)施例7體外抑制腫瘤發(fā)生用野生型E1A或突變E1A轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)，通過(guò)MTT分析(參見(jiàn)圖SA)和軟瓊脂分析(圖5B)測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)。對(duì)照包括單獨(dú)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中的pSV-neo載體；WTE1A包括野生型E1A穩(wěn)定細(xì)胞；12S包括12S E1A穩(wěn)定細(xì)胞；dlNT包括N-末端缺失突變的穩(wěn)定細(xì)胞；dlCR1包括CR1區(qū)缺失突變的穩(wěn)定細(xì)胞；dlCR2包括CR2區(qū)缺失突變的穩(wěn)定細(xì)胞；dlDM包括N-末端加CR2區(qū)缺失突變的穩(wěn)定細(xì)胞。因此，這些實(shí)驗(yàn)分析了各種不同E1A蛋白、肽、或多肽，或者編碼E1A蛋白、肽、或多肽(包括E1A突變體)的核酸對(duì)過(guò)表達(dá)Akt的癌細(xì)胞的影響。因此，在Akt-活化的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中，E1A抑制軟瓊脂中的固定物-依賴性和固定物-獨(dú)立性細(xì)胞的生長(zhǎng)。
實(shí)施例8體內(nèi)抑制腫瘤發(fā)生如前面實(shí)施例1所述，在裸鼠中建立常位乳腺癌模型。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將人MDA-MB-231細(xì)胞接種到小鼠乳腺脂肪墊(m.f.p.)中。每只小鼠接種兩次，一次在乳腺脂肪墊(mfp)上部，另一次在下部，對(duì)于每組轉(zhuǎn)染體接種5只小鼠。每只mfp接種2x106個(gè)細(xì)胞。接種后八天監(jiān)測(cè)腫瘤體積，然后每4天監(jiān)測(cè)一次，連續(xù)八周。用下面的公式計(jì)算腫瘤重量腫瘤重量(mg)＝1/2lw2，其中l(wèi)代表長(zhǎng)度，w代表寬度。
如圖6所示，野生型E1A和12S EIA顯著抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)，而CR1區(qū)或CR2區(qū)加N-末端區(qū)的突變消除了E1A在MDA-MB-231細(xì)胞中的腫瘤抑制活性。
實(shí)施例9E1A基因治療和其它化療的組合
E1A的表達(dá)增強(qiáng)了化療藥紫杉酚在裸鼠體內(nèi)的抗腫瘤作用，延長(zhǎng)了動(dòng)物的存活率。在用單獨(dú)載體(對(duì)照)轉(zhuǎn)染的231細(xì)胞和形成腫瘤的231-E1A穩(wěn)定細(xì)胞中，紫杉酚治療均抑制腫瘤生長(zhǎng)，然后在紫杉酚處理的231-E1A細(xì)胞中觀察到更顯著的治療效果。用或不用紫杉酚處理的腫瘤組織中凋亡細(xì)胞的TUNEL標(biāo)記液證實(shí)了這一點(diǎn)。治療組包括SN載體、SN-脂質(zhì)體-E1A、紫杉酚、和紫杉酚加SN-E1A。每組至少包括7只動(dòng)物。
也嘗試使用其它的化療劑，例如但不限于順鉑、gemcitabine、novelbine、阿霉素、VP16、TNF、大黃素、柔紅霉素、更生霉素、米托蒽醌、甲基芐肼、絲裂霉素、碳鉑、博來(lái)霉素、依托泊苷、替尼泊苷、氮芥、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、抗瘤氨酸、苯丁酸氮芥、異環(huán)磷酰胺、抗瘤氨酸、六甲密胺、thiopeta、白消安、卡氮芥、羅氮芥、司莫司汀、鏈唑霉素、氮烯米胺、羥基柔紅霉素、5-氟尿嘧啶(5FU)、喜樹(shù)堿、放射菌素-D、過(guò)氧化氫、亞硝基脲、普卡霉素(plicomycin)、他莫昔芬、反鉑、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、TRAIL、或甲氨蝶呤。
實(shí)施例10人的治療方案在上述體內(nèi)動(dòng)物研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解并預(yù)測(cè)用可能與脂類或脂質(zhì)體復(fù)合的E1A蛋白、肽、或多肽或者編碼E1A蛋白、肽、或多肽的核酸治療人類癌癥的巨大潛力。事實(shí)上，如前面的說(shuō)明，在動(dòng)物模型中的成功已經(jīng)得以承認(rèn)并開(kāi)始一期人類臨床實(shí)驗(yàn)，這些實(shí)驗(yàn)?zāi)壳罢诤芏嘀行倪M(jìn)行著。期望這些臨床實(shí)驗(yàn)將證實(shí)E1A、和其它腫瘤抑制基因產(chǎn)品在治療人類癌癥中的用途。劑量和給藥頻率方案將首先以上述體內(nèi)動(dòng)物研究得到的數(shù)據(jù)為依據(jù)。
通過(guò)導(dǎo)入E1A基因治療人類癌癥是可能的。可以更優(yōu)選地通過(guò)應(yīng)用病毒或非-病毒載體導(dǎo)入所需基因，以便運(yùn)載E1A序列以有效感染腫瘤、或前-腫瘤組織，治療人類癌癥。病毒載體將優(yōu)選為腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、牛痘病毒載體或腺相關(guān)病毒(Muro-cacho等，1992)。這些載體是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈円呀?jīng)成功地用于將所需序列傳送到細(xì)胞中，并可能表現(xiàn)高感染效率。Hung等進(jìn)行的研究表明，天然腺病毒可以用于轉(zhuǎn)移本發(fā)明的E1A基因。然而，特別優(yōu)選的腺病毒類型是復(fù)制-缺陷腺病毒組。
如上所述，人Akt致癌基因的過(guò)表達(dá)(或活化)和/或人p38的下調(diào)(或滅活)在很多類型的人癌癥中經(jīng)常出現(xiàn)，包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等。
該實(shí)施例描述了促進(jìn)E1A蛋白、肽、或多肽或者編碼E1A蛋白、肽、或多肽的核酸在上述癌癥治療中的方案。表現(xiàn)癌癥的患者可以用下列方案治療。患者可以，但不是必需，已經(jīng)接受了前期的化療、放療、或基因治療處理。任選地患者將表現(xiàn)足夠的骨髓功能(定義為外周絕對(duì)粒細(xì)胞數(shù)＞2,000/mm3，血小板數(shù)為100,000/mm3，足夠的肝功能(膽紅素1.5mg/dl)，以及足夠的腎功能(肌氨酸酐1.5mg/dl)。
對(duì)于過(guò)表達(dá)Akt的腫瘤，可以在治療前、治療中、和治療后監(jiān)測(cè)Akt的表達(dá)水平?？梢酝ㄟ^(guò)測(cè)定免疫學(xué)方法，測(cè)定Akt的表達(dá)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，切下3至4mm厚的原發(fā)腫瘤和細(xì)胞阻滯制品切片，在二甲苯中脫蠟(deparaffinize)，在濃度遞減(100-70％)的乙醇中再水化。用3％過(guò)氧化氫的甲醇液封閉內(nèi)源性過(guò)氧化酶活性。用蒸餾水和磷酸鹽緩沖的鹽水中沖洗幾次后，將切片置于1∶10稀釋度的正常馬血清中培養(yǎng)，以便使背景染色降至最低。然后用一級(jí)抗體在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)。過(guò)氧化酶染色程序應(yīng)用ABC Elite Kits(Vector Laboratories，Burlingame，Calif.)。用3-氨基-9-乙基咔唑作為色原體使免疫染色反應(yīng)顯色。切片和/或cytospin制劑用甲苯胺藍(lán)染色，在permount中制成標(biāo)本。同時(shí)制備免疫染色的陽(yáng)性和陰性對(duì)照。
對(duì)于不足表達(dá)p38的腫瘤，將在治療前、治療中、和治療后監(jiān)測(cè)p38的表達(dá)水平?？梢酝ㄟ^(guò)測(cè)定類似于上述的免疫學(xué)方法，用抗-p38抗體或抗-磷酸p38抗體測(cè)定p38的表達(dá)。
切片由病理學(xué)家評(píng)價(jià)。將用一種半定量標(biāo)準(zhǔn)記錄免疫反應(yīng)的兩個(gè)特征陽(yáng)性細(xì)胞的相對(duì)數(shù)目(0％、＜10％、10-50％和＞50％)和反應(yīng)深度(0-3)。分別記錄免疫染色的模式(膜的，細(xì)胞質(zhì)的)。如果任何腫瘤細(xì)胞分別表現(xiàn)對(duì)抗磷酸-Akt抗體染色陽(yáng)性和/或?qū)沽姿?p38抗體染色陰性，則認(rèn)為腫瘤為Akt陽(yáng)性和/或p38陰性。因強(qiáng)陽(yáng)性膜染色著稱的乳腺癌將用作陽(yáng)性對(duì)照?？梢杂肧AMBA 4000 Cell Image Analysis System(Image Products International，Inc.，Chantilly，Va.)應(yīng)用計(jì)算機(jī)成像分析結(jié)合基于Windows的軟件，定量測(cè)定磷酸-Akt和/或磷酸-p38的免疫染色。強(qiáng)烈染色的腫瘤組織切片將用作陽(yáng)性對(duì)照。將用同種型-匹配的相關(guān)抗體替換一級(jí)抗體，以得到陰性對(duì)照閾值，其為平均十個(gè)照射野得到的結(jié)果。
應(yīng)用E1A基因產(chǎn)品治療癌癥的方案本發(fā)明的組合物通常以含標(biāo)準(zhǔn)品、已知的非毒性生理可接受載體、輔料、和必要賦形劑的單劑量制劑形式非腸道或口服給藥。本文使用的術(shù)語(yǔ)“非腸道”包括皮下注射、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)注射、或灌輸方法。E1A蛋白、肽、多肽、或者編碼E1A蛋白、肽、或多肽的核酸，和/或其它腫瘤抑制產(chǎn)品可以在使用其它抗癌藥之前、之后或同時(shí)施用。常規(guī)療程可以包括在7到21天的時(shí)間段內(nèi)約給藥六個(gè)劑量?；谂R床醫(yī)生的判斷，可以每三周或以間隔更長(zhǎng)的頻率(每月、每?jī)稍?、每季度?進(jìn)行連續(xù)六個(gè)劑量的給藥方案。當(dāng)然，這僅是治療的舉例說(shuō)明的時(shí)間，有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)踐人員將容易認(rèn)識(shí)到其它一些時(shí)間-療程也是可能的。
臨床腫瘤學(xué)的一個(gè)主要挑戰(zhàn)是一些腫瘤細(xì)胞對(duì)化學(xué)試劑治療有抗性。本發(fā)明人的一個(gè)努力目標(biāo)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了改善化療效果的方法。在本發(fā)明的情況下，E1A蛋白、肽、或多肽，或者編碼E1A蛋白、肽、或多肽的核酸可以與一些常規(guī)化療方案組合。
為了應(yīng)用本發(fā)明所述的方法和組合物殺死癌細(xì)胞，通常將使目標(biāo)細(xì)胞與E1A蛋白，肽，或多肽或者編碼E1A蛋白、肽、或多肽的核酸，以及至少一種化療藥(第二藥物)接觸，所述化療藥的例子為前面描述的那些。這些組合物將以殺死或抑制細(xì)胞增殖的混合有效量提供。該方法可以是用E1A蛋白，肽，或多肽或者編碼E1A蛋白、肽、或多肽的核酸，以及第二藥物同時(shí)接觸細(xì)胞。或者，該方法可以是用包括兩種藥物的的單一組合物或藥理學(xué)制劑接觸細(xì)胞，或者同時(shí)用兩種不同組合物或制劑接觸細(xì)胞，其中一種組合物包括E1A蛋白，肽，或多肽或者編碼E1A蛋白、肽、或多肽的核酸，另一種包括第二藥物。
或者，可以在第二藥物給藥之前或之后間隔幾分鐘到幾周，施用E1A蛋白，肽，或多肽或者編碼E1A蛋白、肽、或多肽的核酸。在E1A蛋白，肽，或多肽或者編碼E1A蛋白、肽、或多肽的核酸和第二化合物分別施用的實(shí)施方式中，確信每次給藥時(shí)間之間的有效時(shí)間段將不會(huì)到期，以便第二藥物和E1A蛋白、肽、或多肽或者編碼E1A蛋白、肽、或多肽的核酸仍將能對(duì)癌癥發(fā)揮有利的組合作用。在該例子中，考慮用兩種藥物以彼此間隔約6小時(shí)到一周接觸細(xì)胞，更優(yōu)選彼此間隔24-72小時(shí)內(nèi)。然后，在某些情況下，期望延長(zhǎng)有效治療的時(shí)間段，其中分別給藥之間間隔幾天(2，3，4，5，6，7或更多)到幾周(1，2，3，4，5，6，7或更多)。
E1A蛋白、肽、或多肽或者編碼E1A蛋白、肽、或多肽的核酸區(qū)域性遞送將是一種遞送治療有效劑量以抑制臨床疾病的有效方法。同樣，可以向特定效應(yīng)區(qū)實(shí)施化療?；蛘?，一種或二種藥物的系統(tǒng)遞送也是合適的。本發(fā)明的治療組合物直接施用到患者的腫瘤部位。這是癌癥表面局部治療的關(guān)鍵。組合物的量通常應(yīng)當(dāng)足以確保腫瘤的全部表面接觸到E1A蛋白、肽、或多肽或者編碼E1A蛋白、肽、或多肽的核酸和第二藥物。在一個(gè)實(shí)施方式中，給藥僅局限于將治療組合物注射到腫瘤中。在另一個(gè)實(shí)施方式中，將導(dǎo)管插入腫瘤區(qū)中，管腔可以在所需時(shí)間內(nèi)連續(xù)灌注。
可以通過(guò)可接受的測(cè)量判定臨床反應(yīng)。例如，全部可測(cè)定的疾病至少消失一個(gè)月判定為完全反應(yīng)。而部分反應(yīng)判定為所有可評(píng)價(jià)的腫瘤體的垂直直徑乘積的總和減少50％或更多，或者至少1個(gè)月腫瘤區(qū)沒(méi)有表現(xiàn)增大。與其類似，混合反應(yīng)可以定義為在一個(gè)或多個(gè)部位所有可測(cè)量損傷的垂直直徑的乘積減少50％或更多。
當(dāng)然，上述治療方案可以按照臨床實(shí)驗(yàn)例如本文所述的臨床實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果改變。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠掌握本說(shuō)明書(shū)中公開(kāi)的資料，在說(shuō)明書(shū)所述的臨床實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上優(yōu)化治療方案。
實(shí)施例11臨床實(shí)驗(yàn)該實(shí)施例涉及單獨(dú)應(yīng)用E1A蛋白、肽、或多肽或者編碼E1A蛋白、肽、或多肽的核酸，或者與其他抗癌藥物組合，建立人類治療方案。E1A蛋白、肽、或多肽或者編碼E1A蛋白、肽、或多肽的核酸，以及抗癌藥治療將用于臨床治療各種與Akt激活或p38滅活有關(guān)的、其中轉(zhuǎn)化細(xì)胞或癌細(xì)胞發(fā)揮重要作用的癌癥。該治療將成為抗腫瘤治療中特別有用的工具，例如，在對(duì)常規(guī)化療方案產(chǎn)生抗性的卵巢、乳腺、前列腺、胰腺、腦、結(jié)腸、和肺癌患者的治療中。
本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容的指教下，將掌握進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)的各要素，包括患者的治療和檢測(cè)。下列內(nèi)容將作為建立E1A蛋白、肽、或多肽或者編碼E1A蛋白、肽、或多肽的核酸的臨床實(shí)驗(yàn)的一般性指導(dǎo)原則。
表現(xiàn)高級(jí)的、轉(zhuǎn)移性的乳腺、上皮性卵巢癌、胰腺、結(jié)腸或選擇用于臨床研究的其他癌癥的患者通常將不能對(duì)至少一個(gè)療程的常規(guī)治療反應(yīng)。在一個(gè)臨床方案的例子中，將坦克霍夫?qū)Ч埽蚱渌m當(dāng)裝置放置到患者胸膜或腹膜腔中，并接受連續(xù)胸膜/腹膜滲出物取樣。通常，期望確定胸膜或腹膜腔無(wú)已知的分室、肌氨酸酐水平在2mg/dl以下，膽紅素水平在2mg/dl以下?；颊邞?yīng)當(dāng)表現(xiàn)正常的凝固曲線。
關(guān)于E1A蛋白、肽、或多肽或者編碼E1A蛋白、肽、或多肽的核酸和其他抗癌藥物的給藥，可以將坦克霍夫?qū)Ч芑蚱渌b置置于胸膜腔或腹膜腔中，除非該裝置已經(jīng)在前期手術(shù)的位置。可以得到胸膜內(nèi)液或腹膜內(nèi)液的樣品，從而可以評(píng)價(jià)和記錄基線細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞學(xué)、LDH、和液體中(CEA、CA15-3、CA125、PSA、p38(磷酸化和非-磷酸化型)、Akt(磷酸化和非磷酸化型)和細(xì)胞中(E1A蛋白、肽、或多肽或者編碼它們的核酸)的適當(dāng)?shù)臉?biāo)志物。
在相同的程序中，可以單獨(dú)給藥E1A蛋白、肽、或多肽或者編碼E1A蛋白、肽、或多肽的核酸，或者與其它抗癌藥組合給藥。可以在胸膜/腹膜腔內(nèi)直接施用到腫瘤中，也可以以系統(tǒng)方式給藥。起始劑量可以為0.5mg/kg體重?？梢砸圆淮笥?級(jí)毒性的各劑量水平處理三位患者?？梢砸?00％的增量增加劑量(0.5mg，1mg，2mg，4mg)，直到檢測(cè)到藥物相關(guān)的2級(jí)毒性。之后可以以25％的增量增加劑量。如果測(cè)定的多種E1A蛋白、肽、或多肽或者編碼E1A蛋白、肽、或多肽的核酸和多種抗-癌藥的組合內(nèi)毒素水平對(duì)于任何給定患者都超過(guò)5EU/kg，則給藥劑量可以等分成兩次灌輸，間隔六小時(shí)。
可以以較短灌輸時(shí)間施用E1A蛋白、肽、或多肽或者編碼E1A蛋白、肽、或多肽的核酸，和/或其它抗癌藥的組合，或者在7到21天的時(shí)間內(nèi)以穩(wěn)定速率灌輸。E1A蛋白、肽、或多肽或者編碼E1A蛋白、肽、或多肽的核酸的灌輸可以單獨(dú)施用，也可以與抗癌藥和/或大黃素樣酪氨酸激酶抑制物組合施用。以任何劑量水平進(jìn)行的灌輸將依賴于每次灌輸后得到的毒性而定。因此，如果任何單次灌輸或在一個(gè)特定時(shí)間內(nèi)的穩(wěn)速灌輸后得到II級(jí)毒性，則應(yīng)當(dāng)停止進(jìn)一步的劑量，或者中止穩(wěn)速灌輸，除非毒性改善。將給若干組患者施用增加劑量的E1A蛋白、肽、或多肽或者編碼E1A蛋白、肽、或多肽的核酸和一種抗癌藥的組合，直到約60％的患者表現(xiàn)不能接受的任何類型的III級(jí)或IV級(jí)毒性。該劑量的2/3劑量可以確定為安全劑量。
在治療前和治療后約間隔3-4周，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行身體檢查、腫瘤測(cè)量、和實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)室研究應(yīng)當(dāng)包括CBC、差異因子和血小板記數(shù)、尿分析、SMA-12-100(肝和腎功能實(shí)驗(yàn))、凝結(jié)曲線、和任何其它適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)研究，以便確定疾病的進(jìn)程，或確定存在癥狀的原因。同樣也應(yīng)當(dāng)監(jiān)測(cè)血清中適當(dāng)?shù)纳飳W(xué)標(biāo)記物，例如CEA、CA 15-3、p38(磷酸化和非磷酸化形式)和Akt(磷酸化和非磷酸化形式)、p185等。
為了監(jiān)測(cè)疾病病程和評(píng)價(jià)抗-腫瘤反應(yīng)，應(yīng)當(dāng)考慮每4周檢查患者的合適的腫瘤標(biāo)記物，如果開(kāi)始即異常，則每周兩次進(jìn)行CBC、差異因子和血小板記數(shù)，連續(xù)4周；然后，如果沒(méi)有觀察到骨髓抑制，則每周檢查。如果患者表現(xiàn)延時(shí)的骨髓抑制，建議進(jìn)行骨髓檢查，以排除腫瘤侵入骨髓成為全血細(xì)胞減少的原因的可能性。每4周應(yīng)當(dāng)記錄凝結(jié)曲線。SMA-12-100應(yīng)當(dāng)每周進(jìn)行。第一個(gè)劑量后72小時(shí)可以對(duì)胸膜/腹膜內(nèi)滲出液取樣，之后每周取樣，前兩個(gè)療程均如此，然后每4周取樣直至推進(jìn)或中止研究。可以評(píng)價(jià)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞學(xué)、LDH、和液體中(CEA，CA15-3，CA125，p185，p38，Akt)和細(xì)胞中(p38，Akt)的適當(dāng)標(biāo)志物。當(dāng)存在可測(cè)定的疾病時(shí)，將每4周進(jìn)行腫瘤測(cè)量。適當(dāng)?shù)姆派湫匝芯繎?yīng)當(dāng)每8周重復(fù)一次，以便評(píng)價(jià)腫瘤反應(yīng)。肺活量測(cè)定和DLCO可以在開(kāi)始治療后和研究接近末期每4和8周重復(fù)。尿分析可以每4周進(jìn)行。
臨床反應(yīng)可以通過(guò)可接受的測(cè)定確定。例如，所有可測(cè)定疾病至少消失一個(gè)月判定為完全反應(yīng)。而部分反應(yīng)判定為所有可評(píng)價(jià)的腫瘤體的垂直直徑的乘積的總和減少50％或更多，或者至少1個(gè)月腫瘤區(qū)沒(méi)有表現(xiàn)增大。與其類似，混合反應(yīng)可以定義為在一個(gè)或多個(gè)部位所有可測(cè)量的損傷的垂直直徑的乘積減少50％或更多。
根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)和要求的所有組合物和方法可以制備和實(shí)施，而無(wú)不適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)。因?yàn)楸景l(fā)明的組合物和方法已經(jīng)以優(yōu)選實(shí)施方式的形式描述，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以不偏離本發(fā)明的概念、本質(zhì)和范圍調(diào)整該組合物和方法，和改變本發(fā)明所述方法的步驟或連續(xù)步驟，這是顯而易見(jiàn)的。更具體地說(shuō)，某些無(wú)論化學(xué)還是生理均相關(guān)的試劑可以取代本發(fā)明所述的藥物，而得到同樣或類似的結(jié)果，將是顯而易見(jiàn)的。所有對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的上述類似取代和修飾，注定在本發(fā)明權(quán)利要求的本質(zhì)、概念和范圍內(nèi)。
參考文獻(xiàn)再此特別引用下列文獻(xiàn)作為參考合并到本發(fā)明中，在某種程度上它們提供了作為示例的程序性的或其它詳細(xì)的資料，以補(bǔ)充說(shuō)明本發(fā)明闡述的內(nèi)容。Abu-Abid等，“用腫瘤壞死因子灌注單獨(dú)肢體用于治療肢體惡性腫瘤”摘要，Harefuah，131(7-8)227-232，295-296，1996；Ames等(1990)病毒學(xué)雜志，64，4115-4122；Ames等，“通過(guò)腺病毒E1A引導(dǎo)的對(duì)α腫瘤壞死因子的細(xì)胞毒作用的敏感性獨(dú)立于轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)錄活性”，病毒學(xué)雜志，64(9)4115-4122，1990；Barbacid，“ras基因”，生化年度綜述，56779-827，1987；Barbeau等(1994)致癌基因，9，359-373；Barbeau等，“腺病毒E1A蛋白復(fù)合物之間的功能相互作用”致癌基因，9359-373，1994；Bargmann和Weinberg，“與活化neu致癌基因編碼的蛋白質(zhì)相關(guān)的酪氨酸激酶活性的增強(qiáng)″美國(guó)國(guó)立科學(xué)院學(xué)報(bào)，855394-5398，1988；Bargmann等，“由改變p185跨膜區(qū)的點(diǎn)突變引起的neu致癌基因的多種獨(dú)立活化”，細(xì)胞，45649-657，1986。Bargmann等，“neu致癌基因編碼表皮生長(zhǎng)因子受體相關(guān)蛋白”，自然，319
226-230，1986；Bellacosa A，de Feo D，Godwin AK，Bell DW，Cheng JQ，Altomare DA，Wan M，Dubeau L，Scambia G，Masciullo V，等，“卵巢和乳腺癌中AKT2致癌基因的分子改變”，國(guó)際癌癥雜志，1995年8月22日；64(4)280-515；Berk和Sharp，“腺病毒2早期mRNAs的結(jié)構(gòu)”，細(xì)胞，14695-711，1978；Berk，“腺病毒啟動(dòng)子和E1A的反式激活”，遺傳學(xué)年度綜述，2045-79，1986；Bems，“第62章微小病毒科和它們的復(fù)制”，病毒學(xué)，1743-1764，1990；Bems，病毒學(xué)，1743-1764頁(yè)(Raven Press)1990。Bokemeyer等，“順鉑、依托泊苷和博來(lái)霉素(PEB)對(duì)碳鉑、依托泊苷和博來(lái)霉素(CEB)對(duì)具有“良好-風(fēng)險(xiǎn)”的轉(zhuǎn)移性非精原細(xì)胞瘤性胚細(xì)胞瘤患者的隨機(jī)實(shí)驗(yàn)”，摘要，年度腫瘤學(xué)，7(10)1015-1021，1996；Brunet和Burk，“在含可誘導(dǎo)E1A的人細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄反式激活的濃度依賴”，細(xì)胞分子生物學(xué)，8(11)4799-4807，1988；Buchman，等，附錄A“SV40的核苷酸序列”，腫瘤病毒的分子生物學(xué)，第2部分，第2版，799-813，1980；Carter，“腺相關(guān)病毒載體”，3533-539，1992；Carter，“第11章AAV DNA復(fù)制、整合和遺傳學(xué)″，微小病毒科手冊(cè)，1169-228，1990；Carter，B.，生物技術(shù)當(dāng)前觀點(diǎn)，3533-539，1992；Carter，B.，微小病毒科手冊(cè)，vol.1，pp.169-228，1990；Chan等，“大黃素對(duì)Ras-轉(zhuǎn)化的人支氣管上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的選擇性抑制，一種蛋白-酪氨酸抑制劑”，生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊，193(3)，1152-58，1993；Chang等，″腺相關(guān)病毒P5啟動(dòng)子含有一種腺病毒E1A-可誘導(dǎo)元件和一個(gè)主要晚期轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)”，病毒學(xué)雜志，63(8)3479-88，1989；Chang等，“E1A的系統(tǒng)遞送抑制Intatracheal肺癌形成”，致癌基因131405-12，1996；Chatterjee等，“有效地將基因轉(zhuǎn)移到造血細(xì)胞中的策略”，紐約科學(xué)年鑒，77079-90，1995；Chatterjee等，紐約科學(xué)年鑒，77079-90，1995；Chen等，“白血癥細(xì)胞體外接觸依托泊苷后細(xì)胞毒性和位點(diǎn)特異性DNA重組之間的關(guān)系”，摘要，國(guó)家癌癥研究院雜志，88(24)1840-1847，1996；Chen等，“通過(guò)neu的轉(zhuǎn)錄抑制，負(fù)責(zé)抑制neu-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化功能的腺病毒5E1A結(jié)構(gòu)域的作圖”，致癌基因，141965-1971，1997；Cheng JQ，Altomare DA，Klein MA，Lee WC，Kruh GD，Lissy NA，Testa JR，“AKT2致癌基因轉(zhuǎn)化活性和與有絲分裂有關(guān)的表達(dá)證據(jù)表明細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和腫瘤形成之間的關(guān)系”，致癌基因，1997年6月12日；14(23)2793-801；Cheng JQ，Ruggeri B，Klein WM，Sonoda G，Altomare DA，Watson DK，TestaJR，“AKT2在人胰腺細(xì)胞中的增殖和AKT2表達(dá)的抑制以及反義RNA的致腫瘤性”，美國(guó)國(guó)立科學(xué)院學(xué)報(bào)，1996年4月16日；93(8)3636-41；Cohen等，F(xiàn)EBS Lett.，1997，410，3-10；Cook和Lewis，“感染非致癌性或致癌性腺病毒的倉(cāng)鼠細(xì)胞的分化NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞殺傷”，科學(xué)，224612-15，1984；Cook等，“α腫瘤壞死因子在E1A致癌基因誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞對(duì)自然殺傷細(xì)胞和激活巨噬細(xì)胞的易感性中的作用”，免疫學(xué)雜志，142(12)4527-34，1989；Corbeil和Branton，“通過(guò)E1A保守區(qū)2突變分析確定的眼癌腫瘤抑制物家族和腺病毒E1A蛋白之間復(fù)雜構(gòu)型的功能重要性”，病毒學(xué)雜志，68(10)
6697-6709，1994；Coussens等，“與EGF受體具有廣泛同源性的酪氨酸激酶受體與neu致癌基因具有相同染色體位置”，科學(xué)，2301132-1139，1985；Datta等，“細(xì)胞生存三種Akt的作用”，基因和發(fā)展，132905-2927；Davies MA，Koul D，Dhesi H，Berman R，McDonnell TJ，McConkey D，YungWK，Steck PA，“MMAC/PTEN對(duì)前列腺癌細(xì)胞Akt/PKB活性的調(diào)節(jié)，細(xì)胞生長(zhǎng)、和細(xì)胞凋亡的影響”，癌癥研究，1999年6月1日；59(11)2551-6；DeCaprio等，“SV40大腫瘤抗原與眼癌敏感基因產(chǎn)物形成的特定復(fù)合物”，細(xì)胞，54275-283，1988；DiGiovanni J，Bol DK，Wilker E，Beltran L，Carbajal S，Moats S，Ramirez A，Jorcano J，Kiguchi K，“胰島素樣生長(zhǎng)因子1在轉(zhuǎn)基因小鼠表皮基底細(xì)胞中的組成性表達(dá)導(dǎo)致自發(fā)腫瘤增大”，癌癥研究，2000年3月15日；60(6)1561-70；Dobashi等，“neu/c-erbB-2蛋白特異性激活因子的特征”，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)，888582-86，1991；Dougall等，“neu-致瘤基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、轉(zhuǎn)化機(jī)制和相關(guān)治療”，致癌基因，92109-23，1994；Douglas等，“Ad5 E1A12S基因第二外顯子對(duì)原發(fā)性表皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化調(diào)節(jié)”，致癌基因，62093-2103，1991；Downward等，“表皮生長(zhǎng)因子受體和v-erb-B致癌基因蛋白質(zhì)序列的密切相似性”，自然，307521-527，1984；Doyle等，“順鉑與依托泊苷磷酸鹽醚的組合在小細(xì)胞肺癌中的藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)評(píng)價(jià)”，摘要，23(6 Suppl 13)51-60，1996；Du等，“腺相關(guān)病毒載體有效轉(zhuǎn)導(dǎo)人神經(jīng)元”，摘要，基因治療，3254-261，
1996；Du等，基因治療3254261，1996.Earp等，“EGF受體家族成員之間的異二聚體化和功能相互作用與乳腺癌研究有關(guān)的新的信號(hào)傳導(dǎo)模式”，乳腺癌研究和治療，35115-32，1995；Edlund等，“大鼠胰島素基因的細(xì)胞特異性表達(dá)兩種不同5’旁側(cè)元件的作用證據(jù)”，科學(xué)，230912-16，1985；Egan等，“編碼蛋白激酶的致癌基因的轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移性表型”，科學(xué)，238202-205，1987；Evan，等，″c-myc蛋白誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡”，細(xì)胞，69119-28，1992；Fattaey等，“腺病毒E1A的獨(dú)立區(qū)對(duì)于結(jié)合和分解E2F-蛋白復(fù)合物是必要的”，細(xì)胞分子生物學(xué)，13(12)7267-7277，1993；Felgner和Rhodes，“基因治療討論了純化基因在體內(nèi)的直接遞送和它們作為藥物的應(yīng)用，未應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒”，自然，349351-52，1991；Felgner和Ringold，“陽(yáng)離子脂質(zhì)體-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染”，自然，337387-88，1989；Figge和Smith，“細(xì)胞-差異性序列基元”，自然，334189，1988；Figge等，“病毒40大T，腺病毒E1A，和myc致癌蛋白中相似轉(zhuǎn)化區(qū)域的預(yù)測(cè)”，病毒學(xué)雜志，62(5)1814-18，1988；Flint和Shenk，“腺病毒E1A蛋白示范病毒反式激活物”，遺傳學(xué)年度綜述，23141-61，1989；Flotte等，“用于基因治療的腺相關(guān)病毒載體”，基因治療，2357-362，1995；Flotte等，“腺相關(guān)病毒載體在呼吸道上皮細(xì)胞中的基因表達(dá)”，Am.J.Respir.
Cell Mol.Biol.，7349-356，1992；Flotte，T.R.等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.7349-356，1992。；Flotte，T.R.等，基因治療2357-362，1995；Franke等，科學(xué)，1997，275，665-668；Freedman和Shin，“應(yīng)用裸鼠研究動(dòng)物細(xì)胞的腫瘤發(fā)生學(xué)”，裸鼠在實(shí)驗(yàn)和臨床研究中的作用，F(xiàn)ogh和Gavinella，eds.，Academic Press，pp.354-84，1978；Frisch，“腺病毒E1A在人腫瘤細(xì)胞中的抗癌形成作用”，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)，889077-81，1991；Frisch等，“腺病毒E1A抑制蛋白酶表達(dá)和抑制人腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移”，致癌基因，575-83，1990；Fung等，“LTR的插入引起細(xì)胞致癌基因c-erbB的激活鳥(niǎo)類白血性增生病毒誘導(dǎo)的骨髓成血紅細(xì)胞增多癥的分子基礎(chǔ)”，細(xì)胞，33357-68，1983；Gao，X和Huang，L，“有效轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的新的陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑”，生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊，179(1)280-85，1991；Gazit等，“人結(jié)腸直腸癌和黑素瘤細(xì)胞系移植的裸鼠的化學(xué)-接受性免疫治療”，Cancer Immunology Immunotherapy，35135-44，1992；Greco和Hainsworth，“Paclitaxel，碳鉑和口服依托泊苷治療小細(xì)胞肺癌”，摘要，Semin.Oncol.，23(6 Suppl 16)7-10，1996；Griffin等，“多瘤病毒DNA的序列和分析”，腫瘤病毒的分子生物學(xué)，2ndEdition，Part 2，ed.J.Tooze，831-846，1980；Haley等，“差異表達(dá)E1A蛋白、肽、或多肽或編碼E1A蛋白、肽、或多肽的核酸的5型腺病毒突變體的轉(zhuǎn)化性質(zhì)″，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，815734-38，1984；Handke，“癌癥化療中藥物設(shè)計(jì)的重要依托泊苷作為例子“，摘要，腫瘤學(xué)家，1(4)234-239，1996；Harlow等，“特異于腺病毒早期1A區(qū)蛋白的單克隆抗體早期1A區(qū)產(chǎn)物中的廣泛異質(zhì)性”，病毒學(xué)雜志，55(3)533-46，1985；Hearing等，“腺病毒5型E1A轉(zhuǎn)錄單元的序列-獨(dú)立性自動(dòng)調(diào)節(jié)”，細(xì)胞分子生物學(xué)，5(11)3214-21，1985；Holmes等，“Heregulin的鑒定，一p185erbB2的特異性激活物”，科學(xué)，2561205-10，1992；Horikoshi等，“與TATA結(jié)合蛋白和腺病毒13S E1A蛋白相互作用的p53的兩個(gè)區(qū)域破壞結(jié)合，導(dǎo)致p53介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制”，分子和細(xì)胞生物學(xué)，15(1)227-34，1995；Houghton等，“在結(jié)腸癌和橫紋肌肉瘤的異種移植模型中藥署與5-氟尿嘧啶或依托泊苷組合的評(píng)價(jià)″摘要，臨床癌癥研究，2(1)107-118，1996；Houweling等，“腺病毒5DNA最左邊4.5％片段對(duì)原代大鼠細(xì)胞的部分轉(zhuǎn)化”，病毒學(xué)雜志，105537-50，1980；Huang和Huang，“來(lái)自牛腎的neu/erb B2配體-生長(zhǎng)因子的純化和特征鑒定”，生物化學(xué)雜志，267(16)11508-12，1992；Hudziak等，“HER2/ERBB2致癌基因的擴(kuò)增表達(dá)導(dǎo)致NIH 3T3細(xì)胞中α腫瘤壞死因子的抗性”，Proc.Nati.Acad.Sci.USA，855102-06，1988；Hung，“neu原-致癌基因和乳腺癌”，Cancer Bull.，40(5)300-303，1988；Hung等，“c-erbB-2/neu原致癌基因在卵巢癌中的異常表達(dá)″，Cancer Letters，6195-103，1992；Hung等，“單點(diǎn)突變引起的原neu致癌基因的闊增促進(jìn)致癌活性”，Proc.Natl.
Acad.Sci.USA，862545-48，1989；Hung等，“HER-2/neu-靶向基因治療—綜述”，基因，15965-71，1995；Hung等，“neu基因的分子克隆致癌等位基因中不含全結(jié)構(gòu)改變”，Proc.
Natl.Acad.Sci.USA，83261-64，1986；Hung等，“來(lái)自DNA腫瘤病毒的轉(zhuǎn)化致瘤基因引起HER-2/neu原致癌基因的轉(zhuǎn)錄抑制”，美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)研究進(jìn)展，81次年會(huì)，3113，1990年3月；Inoue等，“同步組合化療的考慮—在Dunn骨肉瘤和NR纖維肉瘤中應(yīng)用靈敏實(shí)驗(yàn)，通過(guò)內(nèi)部-實(shí)驗(yàn)管接觸腫瘤細(xì)胞懸浮液，和皮下接種”，J.Jpn.Soc.
Cancer Ther.25(12)2781-89，1990；Jayasuriya等，“大黃素，來(lái)自Polygonum Cuspidatum的蛋白酪氨酸激酶抑制劑″，天然產(chǎn)物雜志，55(5)696-98，1992；Jelsma等，“應(yīng)用刪除和點(diǎn)突變跨越腺病毒5 E1A基因的編碼區(qū)，以確定轉(zhuǎn)錄活性關(guān)鍵區(qū)域”，病毒學(xué)，164494-502，1988；Jelsma等，“細(xì)胞轉(zhuǎn)化必需的人腺病毒5 E1A蛋白中的序列，轉(zhuǎn)錄強(qiáng)化因子的抑制，和增殖性細(xì)胞核抗原的誘導(dǎo)″，病毒學(xué)，171120-30，1989；Jiang K，Coppola D，Crespo NC，Nicosia SV，Hamilton AD，Sebti SM，ChengJQ，“磷酸肌醇3-OH激酶/AKT2途徑作為法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑-誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的重要目標(biāo)“，分子細(xì)胞生物學(xué).2000年1月；20(1)139-48；Johnson等，“表皮生長(zhǎng)因子受體基因的啟動(dòng)子”，生物化學(xué)雜志，263(12)5693-99，1988；Juliusson和Liliemark，“高劑量環(huán)磷酰胺和依托泊苷和高劑量阿霉素(CDE)的劑量增加和低風(fēng)險(xiǎn)非-Hodgkin′s淋巴瘤的fligrastim”摘要，年度腫瘤學(xué)，7(10)1037-1041，1996；Kalderon和Smith，SV40 Large-T的推測(cè)的DNA結(jié)合區(qū)的體外誘變，病毒學(xué)，139109-37，1984；Karlsson等，″利用腺病毒載體的人球蛋白基因的穩(wěn)定基因轉(zhuǎn)移和組織特異性表達(dá)″，The EMBO Journal，5(9)2377-85，1986；Kiyokawa等″p18.sup.neu的細(xì)胞周期-依賴性調(diào)節(jié)該調(diào)節(jié)中斷和轉(zhuǎn)化之間的關(guān)系″，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，921092-96，1995；Konishi等，“生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊”，1995，216，526-534；Kotin，″應(yīng)用腺相關(guān)病毒作為基因治療載體的展望″，人類基因治療，5793-801，1994；Kraus等，“EGF受體-相關(guān)性原-致癌基因erbB-2在人哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞系中經(jīng)不同分子機(jī)制的過(guò)表達(dá)”，EMBO J.，6(3)605-10，1987；Kuppuswamy和Chinnadurai，“腺病毒2 E1a致癌基因的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能之間的關(guān)系”，病毒學(xué)，15931-8，1987；Land等，“細(xì)胞致癌基因和多步致癌作用”，科學(xué)，222771-76，1983；Land等，“原代胚成纖維細(xì)胞的腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)化需要至少兩個(gè)共同作用的致癌基因”，自然，304596-602，1983；Leclere等，“來(lái)自致癌和非致癌腺病毒的E1A基因在細(xì)胞轉(zhuǎn)化(Ad E1A保守區(qū))中的比較”，Arch.Virol.，132343-357，1993；Lehvaslaiho等，“嵌合的EGF-R-neu原致癌基因能夠使EGF調(diào)節(jié)neu酪氨酸激酶和細(xì)胞轉(zhuǎn)化”，EMBO Journal，8(1)159-66，1989；Leibiger等，“脂質(zhì)體介導(dǎo)的體內(nèi)轉(zhuǎn)染后外源DNA在大鼠肝細(xì)胞中的表達(dá)”，生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊，174(3)1223-31，1991；Lillie等，“轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)錄抑制必需的腺病毒E1a蛋白區(qū)”，細(xì)胞，461043-51，1986；Liu和Green，“腺病毒通過(guò)與不同細(xì)胞DNA-結(jié)合區(qū)相互作用的啟動(dòng)子靶向”，自然，368520-25，1994；Lowis和Newell，“依托泊苷治療兒科腫瘤什么是最好的方法？”，摘要，歐洲癌癥雜志，32A(13)2291-2297，1996；Lupu等，“erbB2致癌基因產(chǎn)物的配體與EGF受體和p185.sup.erbB2的直接相互作用”，科學(xué)，24911552-54，1990；Matin和Hung，“SV40 Large T抗原對(duì)neu啟動(dòng)子的負(fù)調(diào)節(jié)”，細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，41051-56，1993；Matin，“猿病毒40 large T抗原和腫瘤抑制劑Rb和p53對(duì)neu基因表達(dá)的調(diào)節(jié)”，Diss.Abstr.Int.B，54(5)2365，1993，只是摘要；McGrath等，“人Ki-ras原致癌基因和處理的一種相關(guān)假基因的結(jié)構(gòu)和組成”，自然，304501-06，1983；Meier等，生物化學(xué)雜志，1997，272，30491-30497；Mitchell和Tjian，“序列特異性DNA結(jié)合蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)”，科學(xué)，245371-78，1989；Miyake H，Nelson C，Rennie PS，Gleave ME在人前列腺LNCaP腫瘤模型中胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-5的過(guò)表達(dá)通過(guò)激活磷酯酰肌醇3′激酶途徑加速雄性激素獨(dú)立的進(jìn)程，內(nèi)分泌學(xué)，2000年1月；141(6)2257-65；Montell等，“腺病毒2的完全轉(zhuǎn)化需要兩種E1A蛋白”，細(xì)胞，36951-61，1984；Moran等，“腺病毒E1A基因各產(chǎn)物的細(xì)胞溶解和轉(zhuǎn)化功能”，病毒學(xué)雜志，57(3)765-75，1986；Moran等，“腺病毒E1A基因中的多種功能區(qū)”，細(xì)胞，48177-78，1987；Muller等，“小鼠出生前和出生后發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞致癌基因的差異表達(dá)”，自然，299640-44，1982；Muzyczka，“腺相關(guān)病毒作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞的一般轉(zhuǎn)導(dǎo)載體的應(yīng)用”，Curr Top.
Microbiol.Immunol.，15892-129，1992；Mymryk，“腺病毒5 E1A致癌基因的腫瘤抑制性質(zhì)”，致癌基因，131581-1589，1996；Nabel等，“直接將基因轉(zhuǎn)移到動(dòng)脈壁的體內(nèi)位點(diǎn)-特異性基因表達(dá)”，科學(xué)，2491285-88，1990；Nakaichi等，“天然人腫瘤壞死因子對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性腦瘤的抗腫瘤活性”，摘要，J.Vet.Med.Sci.，58(9)885-891，1996；Nelson等，“腺病毒基因在OTF963胚癌細(xì)胞中的E1a-獨(dú)立性表達(dá)E1a-誘導(dǎo)的分化作用”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，878041-45，1990；Nicolau等，“用于體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)的脂質(zhì)體”，膠體和表面，14325-37，
1985；Nicolau等，“脂質(zhì)體作為體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的載體”，細(xì)胞生物學(xué)，47121-130，1983；Nicolau等，“脂質(zhì)體作為體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)的載體”，酶學(xué)方法(Methodsin Enzymology)，149157-177，1987；Offringa等，“E1a的轉(zhuǎn)化區(qū)的新功能抑制AP-1活性”，細(xì)胞，62527-38，1990；Page C，Lin HJ，Jin Y，Castle VP，Nunez G，Huang M，Lin J“Akt/AKT的過(guò)表達(dá)能夠調(diào)節(jié)化療-引起的細(xì)胞凋亡”，抗癌研究，2000年1月-2月；20(1A)407-16；Peles等，“Neu/HER-2刺激配體的分離一種誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞分化的44 kd糖蛋白”，細(xì)胞，69205-16，1992；Pozzatti等，“一種或兩種致癌基因轉(zhuǎn)化的原代大鼠胚細(xì)胞表現(xiàn)不同的轉(zhuǎn)移潛力”，科學(xué)，232223-27，1986；Pozzatti等，“腺病毒2型E1a基因降低ras-轉(zhuǎn)化的大鼠胚細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛力”，細(xì)胞分子生物學(xué)，8(7)2984-88，1988；Rao等，“腺病毒E1A蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，其被E1B 19-kDa和Bc12蛋白抑制”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，897742-46，1992；Roberts等，“各腺病毒5型早期1A區(qū)基因產(chǎn)物誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)和基因表達(dá)的不同改變”，病毒學(xué)雜志，56(2)404-13，1985；Ruggeri BA，Huang L，Wood M，Cheng JQ，Testa JRAKT2致癌基因在人胰管腺癌亞群中的增殖和過(guò)表達(dá)，Mol Carcinog.1998年2月；21(2)81-6；Ruley，″腺病毒早期1A區(qū)能夠使病毒和細(xì)胞轉(zhuǎn)化基因轉(zhuǎn)化培養(yǎng)中的原代細(xì)胞”，自然，304602-06，1983；Rustgi等，“c-mye和N-myc蛋白的氨基-末端區(qū)介導(dǎo)與眼癌G基因產(chǎn)物的結(jié)合”，自然，352541-44，1991；Sanchez-Prieto等，“腺病毒E1A基因的表達(dá)使癌細(xì)胞系對(duì)DNA-破壞試劑敏感”，致癌基因，131083-92，1996；Sanchez-Prieto等，“E1a基因的表達(dá)使人和鼠癌細(xì)胞系對(duì)DNA-破壞試劑敏感”，癌癥治療2，Suppl.1，S26，1995；Sasajima等，“惡性giloma中腦血液循環(huán)的正電子發(fā)射層析成像評(píng)價(jià)和糖代謝，以及隨后的頸動(dòng)脈內(nèi)重組人腫瘤壞死因子-α治療”，摘要，神經(jīng)腫瘤學(xué)雜志(J.Neurooncol)，23(1)67-73，1995；Sassone-Corsi和Borrelli，“腺病毒早期1A區(qū)產(chǎn)物對(duì)原致癌基因c-fos和c-myc，而非c-Ha-ras的啟動(dòng)子反式激活作用”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，846430-33，1987；Sawada等，“腺病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞的致腫瘤性腺病毒12的E1A區(qū)賦予對(duì)自然殺傷細(xì)胞的抗性”，病毒學(xué)，147413-21，1985；Schecter等，“neu基因來(lái)自erbB-同源基因區(qū)且不與編碼EGF受體的基因連接”，科學(xué)，229976-78，1985；Schecter等，“neu致癌基因一種編碼185,000腫瘤抗原的erb-B-相關(guān)基因”，自然，312513-16，1984；Schneider等，“腺病毒E1a基因的突變分析在轉(zhuǎn)化中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用”，TheEMBO Journal，6(7)2053-60，1987；Segouffin-Cariou C，Billaud MMEN2A-RET的轉(zhuǎn)化能力需要磷酯酰肌醇3-激酶/AKT信號(hào)途徑的激活”，生物化學(xué)雜志，2000年2月4日；275(5)3568-76；Semba等，“v-erbB-相關(guān)原致癌基因，c-erbB-2，與c-erbB-1/表皮生長(zhǎng)因子受體基因不同，并在人唾液腺癌中增殖”，Proc.Natl.Acad Sci.USA，826497-501，1985；Senear和Lewis，“腺病毒2型E1a基因的高水平表達(dá)對(duì)建立的嚙齒動(dòng)物細(xì)胞系的形態(tài)轉(zhuǎn)化”，細(xì)胞分子生物學(xué)，6(4)1253-60，1986；Shih等，“癌和成神經(jīng)細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)化基因?qū)胄∈蟪衫w維細(xì)胞”自然290261-64，1981；Shin，“應(yīng)用裸鼠進(jìn)行致腫瘤性實(shí)驗(yàn)和腫瘤塊增殖”，酶學(xué)方法，58370-379，1979；Slamon等，“人乳腺癌HER-2/neu致癌基因增殖的復(fù)發(fā)和生存的關(guān)系”，科學(xué)，235177-181，1987；Slamon等，“HER-2/neu原致癌基因在人乳腺癌和卵巢癌中的研究”，科學(xué)，244707-12，1989；Smith和Zifl，“當(dāng)在原代幼大鼠腎細(xì)胞中表達(dá)時(shí)腺病毒血清型5 E1a蛋白的氨基末端區(qū)發(fā)揮兩種獨(dú)立功能”，細(xì)胞分子生物學(xué)，8(9)3882-90，1988；Steeg等，“在腺病毒2 E1a抑制實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移過(guò)程中，NM23，一種與低腫瘤轉(zhuǎn)移潛力有關(guān)的基因的改變表達(dá)”，癌癥研究，486550-54，1988；Stern等，“p185，neu原致癌基因產(chǎn)物，是一種與酪氨酸激酶活性有關(guān)的受體樣蛋白”，細(xì)胞分子生物學(xué)，6(5)1729-40，1986；Suen和Hung，“c-myc通過(guò)轉(zhuǎn)錄抑制逆轉(zhuǎn)neu-誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化形態(tài)”，細(xì)胞分子生物學(xué)，11(1)354-62，1991；Suen和Hung，“neu基因調(diào)節(jié)中涉及的多種cis-和trans-作用元件”，細(xì)胞分子生物學(xué)，10(12)6306-15，1990；Suen等，“neu致癌基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)”，乳腺癌研究和治療，14(1)摘要213，1989；Tainuma M，Gu J，Danen EH，Takino T，Miyamoto S，Yamada KMPTBN與病灶激酶相互作用和胞外基質(zhì)獨(dú)立性磷酯酰肌醇3-激酶/Akt細(xì)胞生存途徑的抑制，生物化學(xué)雜志，1999 Jul 16；274(29)20693-703；Teramota等，“檢測(cè)e-erbB-2致癌蛋白的血清酶免疫分析試劑盒”，Annual AACIMeeting，摘要#1446，1991；Terlikowski等，“人重組腫瘤壞死因子對(duì)大鼠Morris肝細(xì)胞瘤生長(zhǎng)的抑制作用”，摘要，Exp.Toxicol.Pathol.，47(1)81-87，1995；Thompson FH，Nelson MA，Trent JM，Guan XY，Liu Y，Yang JM，Emerson J，Adair L，Wymer 3，Balfour C，Massey K，Weinstein R，Alberts DS，TaetleR19q13.1-q13.2序列在卵巢癌中的增殖，G-band，F(xiàn)ISH和molecularstudies，Cancer Genet Cytogenet，1996 Mar；87(1)55-62；Tsai等，“HER-2/neu-轉(zhuǎn)染的人肺癌細(xì)胞中，p185.sup.neu水平的升高增強(qiáng)化學(xué)抗性”，國(guó)家癌癥研究所雜志，87(9)682-84，1995；Tsai等，“非-小-細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的固有抗化性與HER-2/neu基因表達(dá)有關(guān)，但不與ras基因突變相關(guān)”，國(guó)家癌癥研究所雜志，85(11)897-901，1993；Tzeng等，“在乳清酸性蛋白SV40T抗原(WAP-SV-T)雜交基因誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中乳腺癌的形成”，致癌基因，81965-71，1993；U.S.專利5,643,567，Hung等；U.S.專利5,651,964，Hung和Yu；U.S.專利5,814,315，Hung等；U.S.專利5,948,885，Stein等；U.S.專利No.4394448，Jul.，1983 Szoka，Jr.等；U.S.專利No.4920211，Apr.，1990 Tibbetts等；U.S.專利No.5516631，May，1996 Frisch；U.S.專利No.5578482，Nov.，1996 Lippman等；U.S.專利No.5641484，Jun.，1997 Hung；U.S.專利No.5643567，Jul.，1997 Hung；U.S.專利No.5658776，Aug.，1997 Flotte等；U.S.專利No 5677178，Oct.，1997 McCormick；U.S.專利No.5736387，Apr.，1998 Paul等；U.S.專利No.5776743，Jul.，1998 Frisch；U.S.專利No.5801029，Sep.，1998 McCormick；U.S.專利No.5837484，Nov.，1998 Trempe等；U.S.專利No.5846945，Dec.，1998 McCormick；U.S.專利No.5851818，Dec.，1998 Huang等；U.S.專利No.5856181，Jan.，1999 McCormick；U.S.專利No.5972706，Oct.，1999 McCormick；Vousden和Jat，“HPVI6 E7，SV40 Large T和腺病毒E1a蛋白之間的功能相似性”，致癌基因，4153-58，1989；Walewski等，“接受廣泛化療的小細(xì)胞肺癌患者中GM-CSF[Leucomax]的耐受性和效果”，摘要，醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)，13(4)199-205，1996；Walker等，生物化學(xué)，1，1998，331，299-308；Wallich等，“H-2K抗原全程表達(dá)及隨后H-2基因轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移性質(zhì)的消除”，自然，315301-05，1985；Wang Q，Ding Q，Dong Z，Ehlers RA，Evers BM在人結(jié)腸癌中有絲分裂-激活的蛋白激酶的下調(diào)，抗癌研究(Anticancer Res.)，2000 1月-2月；20(1A)75-83；Wang等，“E1A誘導(dǎo)E1A和眼癌產(chǎn)物間直接物理結(jié)合的眼癌蛋白獨(dú)立磷酸化”，細(xì)胞分子生物學(xué)，11(8)4253-65，1991；Weinberg，R.A.，“致癌基因?qū)?xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的作用”，科學(xué)，230770-76，1985；Weng LP，Smith WM，Dahia PL，Ziebold U，Gil B，Lees JA，Eng CPTEN通過(guò)磷酸酶活性-獨(dú)立性G1的抑制導(dǎo)致隨后細(xì)胞死亡抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，癌癥研究，1999 Nov 15；59(22)5808-14；Whyte等，“致癌基因和抗-致癌基因間的結(jié)合腺病毒E1A蛋白結(jié)合眼癌基因產(chǎn)物”自然，334124-29，1988；Whyte等，“腺病毒E1A蛋白對(duì)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞靶向”，細(xì)胞，5667-75，1989；Whyte等，“腺病毒早期1A區(qū)蛋白區(qū)對(duì)于轉(zhuǎn)化是必需的”，病毒學(xué)雜志，62(1)257-65，1988；WO 90/15595 Dec.，1990；WO 93/03769 Mar.，1993；WO 94/18992 Sep.，1994；WO 94/21115 Sep.，1994；WO 94/27643 Dec.，1994；WO 95/13365 May，1995；WO 95/13392 May，1995；WO 95/16051 Jun.，1995；WO 96/07322 Mar.，1996；WO 96/17947 Jun.，1996；WO 97/27848 Aug.，1997；WO 97/30732 Aug.，1997；WO 98/29555 Jul.，1998；Wolff等，“猿病毒40早期基因?qū)Σ溉閯?dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)、形態(tài)、和基因表達(dá)的不同作用”，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞研究(Experimental Cell Research)，20267-76，1992；Xie和Hung，“p185.sup.NEU酪氨酸激酶的核定位和其與轉(zhuǎn)錄反式激活的關(guān)系”，生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊，203(3)1589-98，1994；Xing等，“突變SV40 Large T抗原作為HER-2/neu-過(guò)表達(dá)卵巢癌的治療劑”，癌癥基因治療，3(3)168-74，1996；Yamamoto等，“由c-erb-B-2基因編碼的蛋白與表皮生長(zhǎng)因子受體的相似性”，自然，319230-32，1986；Yarden和Peles，“neu致癌受體配體的生化分析”，生物化學(xué)，303543-50，1991；Yarden和Weinberg，“假定激素的實(shí)驗(yàn)性研究neu原致癌基因可能配體的檢測(cè)”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，863179-83，1989；Yeh等，“Polygonum cuspidatum的蒽醌對(duì)HL-60細(xì)胞的作用”，Planta medica，413-14，1988；Yu等，“腺病毒5型E1A蛋白、肽、或多肽或編碼E1A蛋白、肽、或多肽的核酸作為neu致瘤基因的轉(zhuǎn)化抑制劑作用”，細(xì)胞分子生物學(xué)，11(3)1745-1750，1991；Yu等，“c-crbB-2/neu在人卵巢癌細(xì)胞中的增強(qiáng)表達(dá)與E1A抑制的更嚴(yán)重惡性的關(guān)系”，癌癥研究，53891-98，1993；Yu等，“在3T3細(xì)胞中激活的大鼠neu的表達(dá)足以誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移”，致癌基因，51991-96，1991；Yu等，“脂質(zhì)體介導(dǎo)的體內(nèi)E1A基因轉(zhuǎn)移抑制過(guò)表達(dá)HER-2/neu的卵巢癌細(xì)胞的擴(kuò)散”，致癌基因，111383-88，1995；Yu等，“c-erbB2/neu致癌基因誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移的機(jī)制和腺病毒5 E1A蛋白、肽、或多肽或者編碼E1A蛋白、肽、或多肽的核酸的轉(zhuǎn)移抑制性質(zhì)”，致癌基因，72263-70，1992；Yu等，“眼癌基因產(chǎn)物經(jīng)neu的轉(zhuǎn)錄抑制來(lái)抑制neu致癌基因誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化”，生物化學(xué)雜志，267(15)10203-206，1992；Yu等，“neu原致癌基因通過(guò)腺病毒5 E1A蛋白、肽、或多肽或者編碼E1A蛋白、肽、或多肽的核酸的轉(zhuǎn)錄抑制作用”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，874499-503，1990；Zerler等，“能使ras和pmt致癌基因轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的原代細(xì)胞腺病毒E1A編碼序列″，細(xì)胞分子生物學(xué)，6(3)887-99，1986；Zerler等，“腺病毒E1A基因的不同功能區(qū)域與宿主細(xì)胞周期產(chǎn)物的調(diào)節(jié)”，細(xì)胞分子生物學(xué)，7(2)821-29，1987；Zhang和Hung，“酪氨酸抑制劑大黃素使HER-2/neu-過(guò)表達(dá)的非-小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感”，致癌基因，12571，576，1996；Zhang等，“c-erb B原致癌基因在女性生殖道癌中的增殖和重新整理”，致癌基因，4985-89，1989；Zhang等，“通過(guò)腺病毒-介導(dǎo)的E1A傳遞實(shí)現(xiàn)在動(dòng)物模型中HER-2/neu-靶向癌癥治療”，101947-54，1995；Zhau等，“c-erbB-2/neu原致癌基因在人膀胱癌中的增殖和表達(dá)”，化學(xué)文摘，114(21)205—摘要No.114200732Z，1991；Zhou BP，Hu MC，Miller SA，Yu Z，Xia W，Lin SY，Hung MCHER-2/neu經(jīng)Akt/NF-kappaB途徑阻斷腫瘤壞死因子-誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡“，生物化學(xué)雜志，2000 Mar 17；275(11)8027-31；Zhou等，“高效轉(zhuǎn)導(dǎo)功能性雌激素受體基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體”，分子內(nèi)分泌學(xué)(Mol.Endocrinology)，3(7)1157-64，1989。
權(quán)利要求
1.一種使細(xì)胞內(nèi)的Akt失活的方法，其包括使細(xì)胞與E1A蛋白、肽或多肽進(jìn)行接觸。
2.一種使細(xì)胞內(nèi)的p38活化的方法，其包括使細(xì)胞與E1A蛋白、肽或多肽進(jìn)行接觸。
3.一種使細(xì)胞內(nèi)的磷酸-Akt表達(dá)下調(diào)和磷酸p38表達(dá)上調(diào)的方法，其包括使細(xì)胞與E1A蛋白、肽或多肽進(jìn)行接觸。
4.一種誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)凋亡的方法，其包括使細(xì)胞與E1A蛋白、肽或多肽進(jìn)行接觸。
5.如權(quán)利要求1、2、3或4的方法，其中所述細(xì)胞是過(guò)表達(dá)的活化Akt細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求1、2、3或4的方法，其中與E1A蛋白、肽或多肽進(jìn)行接觸導(dǎo)致Akt失活。
7.如權(quán)利要求1、2、3或4的方法，其中所述細(xì)胞是p38活化水平下降的細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求1、2、3或4的方法，其中與E1A蛋白、肽或多肽進(jìn)行接觸導(dǎo)致p38活化。
9.如權(quán)利要求1、2、3或4的方法，其中所述細(xì)胞是活化p38表達(dá)不足的細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求1、2或3的方法，其進(jìn)一步限定為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法。
11.如權(quán)利要求1、2、3或4的方法，其中所述細(xì)胞是癌細(xì)胞。
12.如權(quán)利要求1、2、3或4的方法，其中所述細(xì)胞是乳腺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、睪丸癌細(xì)胞、腦癌細(xì)胞、淋巴癌細(xì)胞、皮膚癌細(xì)胞、腦瘤細(xì)胞、骨癌細(xì)胞、直腸癌細(xì)胞或者血癌細(xì)胞。
13.如權(quán)利要求1、2、3或4的方法，其中所述細(xì)胞在體外。
14.如權(quán)利要求1、2、3或4的方法，其中所述癌細(xì)胞包含于腫瘤。
15.如權(quán)利要求1、2、3或4的方法，其中所述細(xì)胞包含于動(dòng)物體內(nèi)。
16.如權(quán)利要求15的方法，其中所述動(dòng)物是人。
17.如權(quán)利要求15的方法，其進(jìn)一步限定為癌癥治療方法。
18.如權(quán)利要求15的方法，其進(jìn)一步限定為預(yù)防癌癥的方法。
19.如權(quán)利要求1、2、3或4的方法，其中細(xì)胞的轉(zhuǎn)化被抑制。
20.如權(quán)利要求1、2、3或4的方法，其中細(xì)胞的生長(zhǎng)被抑制。
21.如權(quán)利要求20的方法，其中所述生長(zhǎng)是轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)。
22.如權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞的特征在于p38失活。
23.如權(quán)利要求1、2、3或4的方法，其中細(xì)胞與E1A蛋白、肽或多肽進(jìn)行的接觸，其包括提供編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸以及表達(dá)E1A蛋白、肽或多肽。
24.如權(quán)利要求1、2、3或4的方法，其中表達(dá)E1A蛋白、肽或多肽發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)。
25.如權(quán)利要求24的方法，其中所述E1A蛋白、肽或多肽由核酸載體編碼。
26.如權(quán)利要求25的方法，其中所述載體是一個(gè)病毒載體。
27.如權(quán)利要求26的方法，其中所述病毒載體是一個(gè)腺病毒載體、。
28.如權(quán)利要求26的方法，其中所述載體是一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
29.如權(quán)利要求26的方法，其中所述載體是一個(gè)慢病毒載體。
30.如權(quán)利要求1、2、3或4的方法，其中所述E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸包含在脂質(zhì)體內(nèi)。
31.如權(quán)利要求30的方法，其中所述脂質(zhì)體包含DOTMA、DOPE或DC-Chol。
32.如權(quán)利要求30的方法，其中所述脂質(zhì)體包含DC-Chol。
33.如權(quán)利要求30的方法，其中所述脂質(zhì)體包含DC-Chol和DOPE。
34.如權(quán)利要求1、2、3或4的方法，其中所述接觸包括將E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸給予動(dòng)物。
35.如權(quán)利要求34的方法，其中局部給予E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸。
36.如權(quán)利要求35的方法，其中通過(guò)直接腫瘤內(nèi)注射給予E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸。
37.如權(quán)利要求35的方法，其中通過(guò)注射到腫瘤脈管系統(tǒng)給予E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸。
38.如權(quán)利要求34的方法，其中系統(tǒng)地給予E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸。
39.如權(quán)利要求38的方法，其中靜脈內(nèi)給予E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸。
40.如權(quán)利要求38的方法，其中動(dòng)脈內(nèi)給予E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸。
41.如權(quán)利要求38的方法，其中腹膜內(nèi)給予E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸。
42.權(quán)利要求1、2、3或4的方法，其進(jìn)一步包括使細(xì)胞與化療劑進(jìn)行接觸。
43.如權(quán)利要求42的方法，其中所述化療劑是gemcitabine、novelbine、taxtere、紫杉酚、順鉑、阿霉素、VP16、TNF、大黃素、柔紅霉素、更生霉素、米托蒽醌、甲基芐肼、絲裂霉素、碳鉑、博來(lái)霉素、依托泊苷、替尼泊苷、氮芥、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、抗瘤氨酸、苯丁酸氮芥、異環(huán)磷酰胺、抗瘤氨酸、六甲密胺、thiopeta、白消安、卡氮芥、羅氮芥、司莫司汀、鏈唑霉素、氮烯米胺、羥基柔紅霉素、5-氟尿嘧啶(5FU)、喜樹(shù)堿、放線菌素-D、過(guò)氧化氫、亞硝基脲、普卡霉素(plicomycin)、他莫昔芬、反鉑、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、TRAIL或甲氨蝶呤。
44.如權(quán)利要求43的方法，其中E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸與化療劑是同時(shí)給藥。
45.如權(quán)利要求43的方法，其中E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸和化療劑在不同時(shí)間給藥。
46.如權(quán)利要求43的方法，其中E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸在給予化療劑之前給藥。
47.如權(quán)利要求43的方法，其中E1A蛋白、肽或多肽或者編碼E1A蛋白、肽或多肽的核酸在給予化療劑之后給藥。
全文摘要
本發(fā)明提供了基于E1A基因的癌癥治療方法,該方法針對(duì)那些涉及磷酸化Akt表達(dá)(和/或Akt活化)和/或磷酸化p38下調(diào)(和/或p38失活)的癌癥和腫瘤。
文檔編號(hào)A61K51/00GK1375332SQ0111178
公開(kāi)日2002年10月23日 申請(qǐng)日期2001年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月21日
發(fā)明者洪明奇, 廖勇 申請(qǐng)人:得克薩斯州立大學(xué)董事會(huì)